CN114163423B - 可实现癌细胞筛选的谷胱甘肽比率可逆荧光探针、制备方法与应用 - Google Patents
可实现癌细胞筛选的谷胱甘肽比率可逆荧光探针、制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种可实现癌细胞筛选的谷胱甘肽比率可逆荧光探针、制备方法与应用，具体地，本发明可用于测量、检测或筛选谷胱甘肽及活细胞荧光成像，尤其是其靶向细胞可逆比率检测谷胱甘肽，这类探针可实现如下技术效果中的至少一个：合成简单、选择性好、灵敏度高、比率检测、可逆性能优秀、细胞毒性低、对癌细胞有良好的癌细胞靶向能力和优异的癌细胞筛选能力且能快速响应谷胱甘肽、能够在生理水平条件下对谷胱甘肽进行有效测量、检测或筛选。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种基于7-二乙氨基香豆素类化合物的可实现癌细胞筛选的谷胱甘肽比率可逆荧光探针及其在测量、检测或筛选谷胱甘肽及活细胞荧光成像、癌细胞筛选中的应用；本发明还提供了制备所述荧光探针的方法。
背景技术
谷胱甘肽作为浓度最高的非蛋白质硫醇，在哺乳动物组织中的浓度为1-10 mM。其在维持细胞的氧化还原平衡中起到至关重要的作用。此外，谷胱甘肽作为氧化还原信号传导的决定性关键信号分子之一，在细胞的增殖分化、细胞凋亡和各种疾病的发生和发展中扮演中至关重要的角色，比如，谷胱甘肽的异常表达可能会导致艾尔兹海默症、免疫功能障碍、肝脏疾病等。以往研究表明很多种类的肿瘤细胞中的谷胱甘肽浓度升高，同时研究者还发现肿瘤细胞中谷胱甘肽浓度的升高会带来抗药性，增加癌症治疗的难度。虽然越来越多的癌症相关过程被归因于谷胱甘肽的作用，但是由于缺乏检测癌症中的谷胱甘肽的可靠技术，谷胱甘肽在癌症中的作用机制还没有被完全的阐明。因此，寻求一种特定的检测癌细胞中的谷胱甘肽的技术是至关重要的。
近年来，已报到道的检测谷胱甘肽的方法有分光光度比色法、高效液相色谱法、化学发光分析法、荧光探针分析法等，其中荧光探针因其高选择、合成简单、能原位成像等独特的优势而成为研究者关注的焦点。如今，已有大量的谷胱甘肽探针被报道，可惜的是，绝大多数的谷胱甘肽探针都是定性和不可逆的，这就造成了探针无法反映细胞内谷胱甘肽浓度的动态变化，严重限制了谷胱甘肽在相关病理、生理过程中承担的具体作用的研究。即使有限的谷胱甘肽可逆探针被开发出来，也存在着诸如选择性差、反应速度慢难以反映谷胱甘肽浓度实时变化以及检测浓度太低不适用实际细胞内谷胱甘肽浓度检测等问题。因此，发展高选择性高灵敏度的实时可逆检测谷胱甘肽的荧光探针成为急需研究的课题。另外，比率型荧光探针因可以消除环境因素的干扰而受到广泛关注。
此外，因每年快速增长的发病率和死亡率，癌症已成为一种严重危害人类健康的疾病。然而现有的癌症治疗手段还非常有限，且其治疗效果也有待提高。早期治疗能够大大提高治疗效果，而早期治疗的前提是能够实现早期诊断。因此，开发新的对癌细胞具有靶向性并能对癌细胞进行筛选的荧光探针可作为早期诊断的有力工具，具有非常重大的意义。总之，发展高选择性、癌细胞靶向、能对癌细胞进行筛选的谷胱甘肽比率可逆荧光探针是本领域技术人员急需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是在于提供一类可实现癌细胞筛选的谷胱甘肽比率可逆荧光探针，以及它们的制备方法和用途，具有合成简单、选择性好、灵敏度高、比率检测、可逆性能优秀、对癌细胞有良好的癌细胞靶向能力和优异的癌细胞筛选能力且能快速响应谷胱甘肽等特点，并且能够在生理水平条件下对谷胱甘肽进行有效测量、检测或筛选。
具体而言，本发明提供了一种化合物，具有式(Ⅰ)所示的结构：
其中：R1，R2，R3，R4和R5为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4和 R5可以相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的化合物是R1，R2，R3，R4和R5均为氢原子的式(Ⅱ)化合物，其结构式如下：
本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：使式(Ⅲ)化合物与氰基乙酸反应制备得式(Ⅳ)化合物，其反应式如下：
步骤2：式(Ⅳ)化合物与5-甲氧基色胺反应制备得式(Ⅰ)化合物，其反应式如下：
式(Ⅰ)、(Ⅲ)-(Ⅳ)中：R1，R2，R3，R4和R5为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4和R5可以相同或不同。
具体而言：步骤(1)：将式(Ⅱ)化合物与氰基乙酸以及催化剂吡咯烷加入到吡啶中，常温搅拌反应12h。
步骤(2)：将步骤1产物和5-甲氧基色胺及催化剂二环己基碳二亚胺和1- 羟基苯并三唑溶于N,N-二甲基甲酰胺中，常温反应一段时间，然后用二氯甲烷萃取后，减压条件下旋蒸干溶剂，从而获得含有式(I)化合物的粗产物。粗产品进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系为洗脱剂，可得到纯净的式(I)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(Ⅲ)化合物与氰基乙酸的摩尔比为1:1-1:2。
在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤1产物式(Ⅳ)化合物与5-甲氧基色胺的摩尔比为1:1-1:3。
在本发明的一些具体实施方案中，式(I)化合物制备方法步骤(1)和步骤 (2)所述反应时间分别为6-18h和6-12h。
本发明还提供一种用于测量、检测或筛选谷胱甘肽的荧光探针组合物，其包含本发明的所述式(I)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(I)化合物具有以下结构：
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物可应用于谷胱甘肽的实时可逆检测或者癌细胞的筛选。
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物可应用于谷胱甘肽的实时可逆检测或者癌细胞的筛选。
本发明还提供了用于检测样本中谷胱甘肽浓度的试剂盒，其包含本发明的所述式(I)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒还包含用于测定样本中的谷胱甘肽浓度的缓冲剂。
本发明还提供了用于检测样品中谷胱甘肽的存在或测量样品中的谷胱甘肽含量的方法，其包括：
a)使所述式(I)或式(Ⅱ)化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是化学样品或生物样品。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是包括水、血液、微生物或者动物细胞或组织在内的生物样品。
本发明还提供了所述式(I)或式(Ⅱ)化合物在细胞荧光成像中的应用。
本发明还提供了所述式(I)或式(Ⅱ)化合物在癌细胞筛选中的应用。
本发明还提供了所述式(I)或式(Ⅱ)化合物在实时定量可逆检测谷胱甘肽中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
(1)比率检测
本发明的谷胱甘肽荧光探针可以对谷胱甘肽实现比率检测，可以消除环境因素的干扰。
(2)可逆性能优秀
本发明的谷胱甘肽荧光探针具有非常理想的可逆响应率，能够为谷胱甘肽的可逆检测提供分析方法，有利于实现追踪谷胱甘肽的波动。
(3)靶向癌细胞
本发明的谷胱甘肽荧光探针可以实现靶向癌细胞，并且能够实现对癌细胞的筛选。
(4)快速响应
本发明的谷胱甘肽荧光探针可以实现对于谷胱甘肽的超快速响应，4秒左右就能够达到荧光强度最值的一半，有利于对于谷胱甘肽的快速或实时检测。
(5)选择性高
本发明的谷胱甘肽荧光探针可选择性的与谷胱甘肽发生特异性反应，生成荧光变化的产物，相较于常见的生命体内的其他物质，包括但不限于钾过氧化氢、谷胱甘肽、单线态氧、氧负离子、组氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸等，本发明荧光探针显示出了较高的选择性。
(6)灵敏度高
本发明的谷胱甘肽荧光探针与谷胱甘肽反应非常灵敏，从而有利于对谷胱甘肽的检测。
(7)可生理水平条件下应用
本发明的谷胱甘肽荧光探针可在生理水平条件下应用，并且，生物体内常见的其他物质对其干扰较小，可以应用于活细胞荧光成像，也可以应用于准确地追踪肿瘤细胞中谷胱甘肽的波动。
(8)稳定性好
本发明的谷胱甘肽荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。
(9)细胞毒性低
细胞毒性低，只有当探针浓度达到特定浓度时，对癌细胞毒性升高，但是对正常细胞依然毒性低。
(10)合成简单
本发明的谷胱甘肽荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。
附图说明
图1是探针(5μM)加入谷胱甘肽(0-15mM)前后的荧光光谱；
图2是探针(5μM)在485nm处的荧光强度和655nm处荧光强度的比值和谷胱甘肽(0-15mM)的线性关系图；
图3是探针(5μM)加入谷胱甘肽(10mM)后又加入过氧化氢(20mM) 后光谱随时间的变化情况；
图4中(a)是探针(5μM)和谷胱甘肽(15mM)反应后的溶液加入不同浓度过氧化氢(0-20mM)的荧光光谱变化图，图4中(b)是上述加入不同浓度的过氧化氢反应后的溶液在485nm处的荧光强度和655nm处荧光强度的比值和过氧化氢(0-20mM)的线性关系图；
图5是向探针溶液(5μM)中先后交替添加10mM谷胱甘肽和N-乙基马来酰亚胺(NEM，硫醇清除剂)，485nm与655nm处的荧光强度值周期变化图。
图6是不同离子分析物(除特殊表明外，都为1mM)对探针(5μM)的荧光强度的影响，柱状图代表的是不同分析物存在下探针在485nm与655nm处的比率关系的荧光强度值；
图7是探针(10μM)对癌细胞的靶向能力和筛选能力的细胞成像图和数据计算图；
图8是对经过和未经过探针孵育的正常细胞和癌细胞进行细胞荧光成像对比图，分别如a和b所示；
图9是探针(10μM)在细胞内的可逆性测试的细胞成像图和数据计算图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1式(Ⅱ)化合物的合成：
合成路线如下：
步骤1：
步骤2：
实施方案1：第一步反应为将980mg(4mmol)7-二乙氨基香豆素与408mg (4.8mmol)氰基乙酸以及催化剂吡咯烷加入到吡啶(5ml)中，常温搅拌反应 12h，然后在减压下旋蒸干溶剂，加入甲醇溶解残留物，使产物析出，过滤悬浮液，得到黑绿色的固体499mg,产率44％；第二步反应为将332mg(1mmol) 步骤1产物和190mg(1mmol)5-甲氧基色胺及催化剂二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑溶于N,N-二甲基甲酰胺中，常温搅拌反应12h，然后用二氯甲烷萃取后，减压条件下旋蒸干溶剂，从而获得含有式(I)化合物的粗产物。粗产品进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系(v/v,30:1)为洗脱剂，可得到红色的纯净的式(Ⅱ)化合物340mg，产率为70％。
实施方案2：第一步反应为将980mg(4mmol)7-二乙氨基香豆素与408mg (4.8mmol)氰基乙酸以及催化剂吡咯烷加入到吡啶(5ml)中，常温搅拌反应 12h，然后在减压下旋蒸干溶剂，加入甲醇溶解残留物，使产物析出，过滤悬浮液，得到黑绿色的固体499mg,产率44％；第二步反应为将332mg(1mmol) 步骤1产物和380mg(2mmol)5-甲氧基色胺及催化剂二环己基碳二亚胺和 1-羟基苯并三唑溶于N,N-二甲基甲酰胺中，常温搅拌反应12h，然后用二氯甲烷萃取后，减压条件下旋蒸干溶剂，从而获得含有式(I)化合物的粗产物。粗产品进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系(v/v,30:1)为洗脱剂，可得到红色的纯净的式(Ⅱ)化合物354mg，产率为73％。
实施方案3：第一步反应为将980mg(4mmol)7-二乙氨基香豆素与408mg (4.8mmol)氰基乙酸以及催化剂吡咯烷加入到吡啶(5ml)中，常温搅拌反应 12h，然后在减压下旋蒸干溶剂，加入甲醇溶解残留物，使产物析出，过滤悬浮液，得到黑绿色的固体499mg,产率44％；第二步反应为将332mg(1mmol) 步骤1产物和570mg(3mmol)5-甲氧基色胺及催化剂二环己基碳二亚胺和 1-羟基苯并三唑溶于N,N-二甲基甲酰胺中，常温搅拌反应12h，然后用二氯甲烷萃取后，减压条件下旋蒸干溶剂，从而获得含有式(I)化合物的粗产物。粗产品进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系(v/v,30:1)为洗脱剂，可得到红色的纯净的式(Ⅱ)化合物315mg，产率为65％。
实施方案4：第一步反应为将980mg(4mmol)7-二乙氨基香豆素与408mg (4.8mmol)氰基乙酸以及催化剂吡咯烷加入到吡啶(5ml)中，常温搅拌反应 12h，然后在减压下旋蒸干溶剂，加入甲醇溶解残留物，使产物析出，过滤悬浮液，得到黑绿色的固体499mg,产率44％；第二步反应为将332mg(1mmol) 步骤1产物和380mg(2mmol)5-甲氧基色胺及催化剂二环己基碳二亚胺和 1-羟基苯并三唑溶于N,N-二甲基甲酰胺中，常温搅拌反应6h，然后用二氯甲烷萃取后，减压条件下旋蒸干溶剂，从而获得含有式(I)化合物的粗产物。粗产品进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系(v/v,30:1)为洗脱剂，可得到红色的纯净的式(Ⅱ)化合物291mg，产率为60％。
实施例1制备的纯净的式(Ⅱ)化合物产品结构表征数据如下：
(E/Z,3:1).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):(E)1.226-1.270(m, 18H),3.010-3.060(m,6H),3.451-3.500(m,12H),3.677-3.752(m,3H), 5.815(d,J＝4.4Hz,9H),6.333(t,J＝5.6Hz,2H),6.466(d,J＝2Hz,2H),6.578-6.640(m,3H),6.858-6.896(m,3H),7.041-7.093(m,6H), 7.371(d,J＝7.2Hz,2H),8.007(s,3H),8.549(s,2H),8.647(s,2H)；(Z)1.226-1.270(m,18H),3.010-3.060(m,6H),3.451-3.500(m,12H), 3.677-3.752(m,3H),5.815(d,J＝4.4Hz,9H),6.395(t,J＝4Hz,1H), 6.439(d,J＝2.4Hz,1H),6.578-6.640(m,3H),6.858-6.896(m,3H),7.041-7.093(m,6H),7.332(d,J＝9.2Hz,1H),8.007(s,3H),7.720(s, 1H),8.967(s,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm):12.86,24.90, 25.48,25.80,33.82,45.01,47.98,55.82,97.04,100.66,103.33,108.25,110.81,110.90,111.56,111.84,112.47,117.28,123.77,128.04,131.86, 132.32,143.80,144.36,153.39,153.48,157.67,160.71,161.28.HRMS (ESI):Calcd for C28H28N4O4[M-H]+485.2183；Found,485.2179。
实施例2：荧光探针加入谷胱甘肽前后的荧光光谱和浓度梯度测试
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度的谷胱甘肽(0-15mM，除空白组外，谷胱甘肽浓度最低组为1mM)加入到测试体系中，摇晃均匀后，静置20min，然后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。
从图1可以清晰的看出，随着谷胱甘肽浓度的增加，485nm处的荧光强度逐渐增强，655nm处的荧光强度逐渐减弱。并且，由图2可以看出探针(5μM) 加入谷胱甘肽(0-15mM)之后，其在485nm处的荧光强度和655nm处荧光强度的比值与谷胱甘肽浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对谷胱甘肽进行定量分析，并且可以比率检测分析。
实施例3：探针先后加入谷胱甘肽后和过氧化氢的时间动力学测试
将探针(5μM)置于10mL的测试体系，然后将(10mM)的谷胱甘肽加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化；待荧光响应达到平台后，在上述溶液中加入20mM过氧化氢，摇晃均匀后，再次立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS, pH 7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。
由图3可以清楚地看到，当谷胱甘肽加入后，探针在485nm处的荧光迅速增强，655nm处的荧光强度迅速减弱(4秒左右达到荧光强度最值的一半)；加入过氧化氢后，探针在485nm处和655nm处的荧光强度也相应的迅速减弱和增强，这说明该探针与谷胱甘肽反应迅速，而且具有非常理想的可逆响应率，能够为谷胱甘肽的实时测定提供快速的分析方法。
实施例4：荧光探针加入谷胱甘肽反应后再加入不同浓度的过氧化氢的的荧光光谱及浓度梯度测试
配置多个谷胱甘肽(15mM)和探针(5μM)反应后的的平行样品于10mL 比色管中，然后将不同浓度(0-20mM)的过氧化氢加入到测试体系中，摇晃均匀后静置20分钟,用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH 7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。
从图4中(a)可以清晰的看出，随着加入甲醛浓度的增加，485nm处的荧光强度逐渐减弱，655nm处的荧光强度逐渐增强；并且，由图4中(b)可以看出，在比率F485/F655处，荧光探针(5μM)和谷胱甘肽(15mM)反应溶液加入过氧化氢(0-20mM)之后荧光强度呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对甲醛进行定量分析。
实施例4：探针可逆性能测试
向探针溶液(5μM)中先加入10mM谷胱甘肽，立即摇晃均匀，静止20分钟，测试其荧光强度；然后加入N-乙基马来酰亚胺(NEM，硫醇清除剂)，立即摇晃均匀，静止20分钟，测试其荧光强度；交替重复几次上述操作。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH 7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。
由图5可以看出，加入谷胱甘肽，485nm处的荧光强度升高，655nm处的荧光强度降低，一段时间后再向上述溶液中加入N-乙基马来酰亚胺(NEM，硫醇清除剂)，485nm处的荧光强度降低，655nm处的荧光强度升高。重复操作上述过程，荧光强度也会相应的恢复到相应的水平，由此可以看出探针具有良好的可逆性能。
实施例5：探针选择性能测试
分析物分别为空白、过氧化氢、次氯酸、单线态氧、氧负离子、组氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、甘氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、谷胱甘肽(10mM)(除特殊标明外，其他分析物浓度均为1mM)。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在F485/F655 nm的荧光强度比值。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH 7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。具体地，配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后加入一定量的分析物，摇匀，待20min后测定。
从图6可以看出，探针对可以特异识别谷胱甘肽，生物体内存在的常见物质不会明显干扰探针对谷胱甘肽的荧光强度，因此探针具有良好的选择性。
实施例6：探针的细胞毒性测试
用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测不同浓度(0、5、10、20和30μM)的探针对RAW264.7细胞、HUVEC细胞、MGC803细胞、A549细胞的细胞毒性。
所有类型的细胞使用96孔板播种，播种密度为1×106个细胞·mL-1，在 37℃，5％的二氧化碳-95％空气中孵化12h。然后用不同浓度的探针孵化相应组的细胞24h。随后，每孔板加入CCK-8溶液，2h后，在450nm处测量吸光度。
测试结果表明：在生物成像条件下，探针的细胞毒性可以忽略不计，此外，还发现了一个有趣的现象，当探针浓度增加到30μM时，探针对MGC803细胞的毒性明显高于其他细胞这种选择性毒性的特点可以有效地杀死MGC803细胞，同时保持对正常细胞的低损伤。
实施例7：探针对癌细胞的靶向能力和筛选能力测试
用两种正常细胞(HUVEC、RAW264.7)和两种癌细胞(A549、MGC803)，分别用探针(10μM)孵育20min后，细胞荧光成像，通过计算各种细胞蓝色通道和红色通道的荧光强度来验证细胞的靶向能力和筛选能力，测试数据如图7和图8中(a)所示。
为消除细胞自身背景荧光的干扰，设置对照组，对未用探针孵育的两种正常细胞(HUVEC、RAW264.7)和两种癌细胞(A549、MGC803)，进行细胞荧光成像，测试数据如图8中(b)所示。
从图8中(a)和(b)的对比可以看出，未用探针孵育的细胞未观察到荧光，而用探针孵育的细胞荧光较强。
从图7可以看出，正常细胞(HUVEC、RAW264.7)蓝色通道和红色通道的荧光强度比癌细胞(A549、MGC803)蓝色通道和红色通道的荧光强度低得多，说明探针对癌细胞有良好的癌细胞靶向能力和优异的癌细胞筛选能力。
实施例7：探针在细胞内的可逆性能测试
第一组MGC803细胞经探针孵育20分钟后细胞荧光成像；第二组MGC803 细胞先孵育过氧化氢(200μM)，20分钟再孵育探针后细胞荧光成像；第三组 MGC803细胞先孵育过氧化氢(200μM)，20分钟再孵育探针，再孵育过氧化氢后细胞荧光成像；第四组MGC803细胞先孵育过氧化氢(200μM)，20分钟再孵育探针，再孵育过氧化氢，最后再孵育谷胱甘肽后成像。细胞荧光成像图和数据计算图如图9所示。
从图9中可以看出，第一组中探针由于与细胞内原有的谷胱甘肽反应，蓝色通道与红色通道的比值较大；与第一组探针的比值相比，第二组比值下降，第三组比值进一步降低；谷胱甘肽孵育后，第四组的比值显著增加。这些结果表明，探针具有良好的细胞内可逆性能，可以准确地追踪癌细胞中谷胱甘肽的波动。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.化合物，其具有以下结构：
。
2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：使7-二乙氨基香豆素与氰基乙酸反应制备得步骤1产物，步骤1产物与5-甲氧基色胺反应制备得式（Ⅱ）化合物，其反应式分别如下：
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1）：将7-二乙氨基香豆素与氰基乙酸以及催化剂吡咯烷加入到吡啶中，常温搅拌反应12 h；
步骤（2）：将步骤1产物和5-甲氧基色胺及催化剂二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑溶于N,N-二甲基甲酰胺中，常温反应一段时间，然后用二氯甲烷萃取后，减压条件下旋蒸干溶剂，从而获得含有式（Ⅱ）化合物的粗产物，
粗产品进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系为洗脱剂，可得到纯净的式（Ⅱ）化合物。
4.一种用于测量、检测或筛选谷胱甘肽的荧光探针组合物，其包含权利要求1中所述化合物。
5.如权利要求4所述荧光探针组合物，其特征在于，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
6.一种用于非疾病诊断和治疗目的的检测样品中谷胱甘肽的存在或测定样品中的谷胱甘肽含量的方法，其包括：
a)使权利要求1中所述化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b）测定所述荧光化合物的荧光性质。
7.如权利要求6所述方法，所述样品是化学样品或生物样品。
8.权利要求1所述化合物在细胞荧光成像中的应用，所述应用用于非疾病诊断和治疗目的。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202111322792.0A CN114163423B (zh) | 2021-11-09 | 2021-11-09 | 可实现癌细胞筛选的谷胱甘肽比率可逆荧光探针、制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN202111322792.0A CN114163423B (zh) | 2021-11-09 | 2021-11-09 | 可实现癌细胞筛选的谷胱甘肽比率可逆荧光探针、制备方法与应用 |
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| KR20150104911A (ko) * | 2014-03-07 | 2015-09-16 | 고려대학교 산학협력단 | 암 진단용 마커 및 이를 이용한 암 진단 방법 |
| CN107389636A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-11-24 | 湖南科技大学 | 一种可在癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器的制备及应用 |
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2021
- 2021-11-09 CN CN202111322792.0A patent/CN114163423B/zh active Active
Patent Citations (3)
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| WO2014088512A1 (en) * | 2012-12-03 | 2014-06-12 | National University Of Singapore | Ratiometric fluorescent dye for the detection of glutathione in cell and tissue |
| KR20150104911A (ko) * | 2014-03-07 | 2015-09-16 | 고려대학교 산학협력단 | 암 진단용 마커 및 이를 이용한 암 진단 방법 |
| CN107389636A (zh) * | 2017-07-13 | 2017-11-24 | 湖南科技大学 | 一种可在癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器的制备及应用 |
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