CN114437010A

CN114437010A - 溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子及制备方法

Info

Publication number: CN114437010A
Application number: CN202111322391.5A
Authority: CN
Inventors: 胡伟; 强涛涛; 柴丽; 王宝帅; 程飞; 梁天宇
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2021-11-09
Filing date: 2021-11-09
Publication date: 2022-05-06

Abstract

本发明公开了一种溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针及其制备方法和应用，属于溶酶体分析化学技术领域。本发明溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针的结构式如下：

Description

溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子及制备方法

技术领域

本发明属于溶酶体分析化学技术领域，尤其与溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子及制备方法及其制备方法和应用有关。

背景技术

细胞自噬作为细胞溶酶体参与的降解途径，是一个重要的自我消化的过程。细胞自噬不仅可以在细胞饥饿时为细胞提供营养，而且还帮助细胞清除受损的细胞器，错误折叠的蛋白质，以及部分入侵细胞体的微生物。

传统用于监视细胞自噬的方法包括透射电子显微镜、蛋白质印迹法等，但是这些方法昂贵且无法对自噬发生过程进行有效描述。因此，迫切需要一种实时、高效的方法来监测自噬的发生。由于自噬发生时，细胞内新产生的自噬体会与溶酶体融合形成自噬溶酶体，这一过程会导致溶酶体微环境发生变化，如极性，酸碱度，粘度等。因此，检测微环境之一的粘度是监测自噬的有效方法。由于溶酶体位于细胞内部，如何实现实时动态的分析溶酶体粘度变化成为摆在技术人员面前的技术难题。荧光成像技术尤其是基于小分子的双光子共聚焦技术具有包括原位实时分析，微创，生物损伤小，高的信噪比以及分子易于修饰等诸多优势，使其在进行活体细胞器粘度的评估中大放异彩。最重要的是，共聚焦成像技术高的时空分辨率使得该工具更有可能在亚细胞器水平探索粘度与细胞自噬导致的溶酶体应激的关系研究以及对神经退行性疾病的早期诊断提供可靠帮助。

现阶段的粘度探针由于缺少溶酶体靶向性和双光子特性，一方面对生物样品损伤较大，不利于活体成像研究。另一方面无法对自噬引起的溶酶体粘度变化进行评估，也就无法实现跟踪，展示细胞自噬的发生过程，进而无法从溶酶体粘度变化的角度对细胞自噬进行研究。

发明内容

针对上述背景技术存在的问题，本发明提出溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子及制备方法分子及制备方法，本发明解决了特定细胞器靶向性差和生物样品损伤大的问题。

为此，本发明采用以下技术方案：溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子，其结构式如下：

溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子的制备方法，包括以下步骤。

第一步，将N,N-二甲基间苯酚与丙二酸均匀分散于溶剂A中，在环化试剂B的作用下于条件a中进行加成反应，加成反应结束后将所得加成产物混合物经分离纯化后，得到中间化合物1；

第二步，将上述中间化合物1均匀分散于溶剂B中，在条件b中进行取代反应，取代反应结束后将所得产物混合物经分离纯化后，得到化合物2；

第三步，将上述化合物2与2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈均匀分散于溶剂C中，并添加吗啉在条件a中进行取代反应，取代反应结束后将所得产物混合物经分离纯化后，得到探针分子DCIC-VIS。

中间化合物1为

所述的化合物2为

所述的第一步中，所述N,N-二甲基间苯酚与所述的丙二酸的摩尔比为1： 1～2。

将中间化合物1均匀分散于溶剂B中后，加入卤化试剂三氯氧磷，中间化合物1与三氯氧磷的摩尔比为1:2～3。

所述的第三步中，化合物2与2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈的摩尔比为1:1～2；化合物2与吗啉的摩尔比为1:1～2。

所述的第一步中，加成反应的条件a为50-65℃，搅拌时间为12小时；

第二步中，取代反应的条件b为冰浴环境，搅拌1小时；

第三步中，取代反应的条件c为25-30℃，搅拌12小时。

第一步中，溶剂A为二三氯氧磷；环化试剂B为无水氯化锌；第二步中，溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺；第三步中，溶剂C为N,N-二甲基甲酰胺；

所述制备方法制得的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子及制备方法在检测溶酶体粘度变化中的应用。

本发明可以达到以下有益效果：1、本发明的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针能够实现溶酶体定位及粘度响应，进而达到研究溶酶体粘度与细胞自噬之间的关系。细胞毒性实验还表明该探针具有较低的生物毒性，双光子共聚焦显微镜成像实验表明该探针对PC12细胞渗透性好，可以有效定位细胞中的溶酶体(定位系数为0.91)。适用于细胞溶酶体粘度变化的双光子荧光成像，进而实现对细胞自噬的监测。2、本发明探针分子通过将香豆素荧光团作为探针的双光子荧光团，其具有独特的双光子性质，解决了对生物样品损伤大的问题。本发明通过将吗啉作为溶酶体的定位基团，能够实现对细胞内特定细胞器的精准定位，解决了探针靶向性差的问题。4、本发明通过双键与N,N- 二甲基香豆素相连的环己烯基丙二腈基团，在不同粘度的环境中两者旋转角度的不同，赋予探针DCIC-VIS粘度调节的光学性质，可以实现环境粘度的荧光差异性。4、本发明能够在减少样品损伤的同时，实现溶酶体内粘度变化精准的检测。解决了现有荧光探针受限于特定细胞器靶向性差和生物样品损伤大的问题。本发明制备工艺简单，产物收率高，具有工业扩大化生产推广价值

附图说明

图1本发明探针分子合成路线示意图。

图2是探针DCIC-VIS在不同极性有机溶剂中的紫外吸收光谱图以及荧光发射光谱图；其中，A为探针分子在二恶烷(Dioxane)、二氯甲烷 (Dichloromethane)、二甲基甲酰胺(Dimethylformamide)、二甲基亚砜 (Dimethyl sulfoxide)、四氢呋喃(Tetrahydrofuran)、甲苯(Toluene)、氯仿 (Chloroform)、乙醇(Ethanol)、PBS缓冲液、甘油(Glycerinum)、甲苯 (Toluene)、甲醇(Methanol)、乙醇(Ethanol)、乙腈(Acetonitrile)的紫外吸收光谱图，B为探针分子在二恶烷(Dioxane)、二氯甲烷(Dichloromethane)、二甲基甲酰胺(Dimethylformamide)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide)、四氢呋喃(Tetrahydrofuran)、甲苯(Toluene)、氯仿(Chloroform)、乙醇(Ethanol)、 PBS缓冲液、甘油(Glycerinum)、甲苯(Toluene)、甲醇(Methanol)、乙醇 (Ethanol)、乙腈(Acetonitrile)的荧光发射光谱图；

图3是探针DCIC-VIS的水溶液实验折线图。其中A为探针荧光强度与甘油浓度关系图。B为探针荧光强度与体系粘度线性关系图。

图4是探针DCIC-VIS在不同pH值条件下与荧光强度的折线图。

图5是探针DCIC-VIS在200微米生物大分子(GSH、Cys、Hcy)，200 微米RSS(Na₂S、Na₂S₂O₃、Na₂SO₃、Na₂SO₄)，200微米RNS(NaNO₂，NaNO₃， NO，ONOO^-)，200微米ROS(ClO^-，·O^2-，·OH，¹O₂，H₂O₂)中荧光强度柱状图。

图6是探针使用DCIC-VIS的生物实验图。其中A是PC12细胞在不同浓度的探溶液中存活率图；B是0-60分钟内，经由探针孵育的PC12细胞的荧光强度散点图。

图7是探针DCIC-VIS的亚细胞器共定位实验共聚焦荧光成像图；其中，(e)为溶酶体的ROI强度分布图，(j)为线粒体的ROI强度分布图，(o)为内质网的ROI强度分布图；

图8是探针DCIC-VIS与PC12细胞的成像实验在不同孵育条件下的荧光强度柱状图。

图9是PC12细胞饥饿处理及抗炎处理后的成像实验在饥饿处理及抗炎处理后的荧光强度柱状图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细描述，所描述的实施例只是对本发明的说明和解释，并不构成对本发明的唯一限定。

本发明下面通过实施例和附图对本发明做进一步说明。

实施例1：

如图1所示，溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子DCIC-VIS的合成

步骤1：在搅拌条件下，将N,N-二甲基间苯酚(6.85g，50mmol)与丙二酸 (6.24g，60mmol)均匀分散到二氯氧磷中。添加环化试剂无水氯化锌(21.964g， 161.5mmol)后，在65℃下搅拌12小时，冷却后用冰水降温，抽滤收集固体沉淀。使用碳酸钠溶解沉淀后调节pH值至3-4，再次抽滤沉淀得到黄色固体，为化合物1。

步骤2：在搅拌条件下，将化合物1(2.05g，10mmol)溶解到N,N-二甲基甲酰胺中，加入卤化试剂三氯氧磷(3.775g，25mmol)后，在冰浴环境中搅拌1 小时，抽滤所得固体沉淀得到黄色固体沉淀，即为化合物2。

步骤3：在搅拌条件下，将化合物2(2.51g，10mmol)和2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈(1.86g，10mmol)均匀分散在N,N-二甲基甲酰胺中，逐滴加入吗啉(1.74g，20mmol)后在30℃反应12小时，倒入冰水后抽滤得到固体沉淀。所得固体沉淀用1/30的甲醇/二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到红色固体。即为溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针，命名为DCIC-VIS。

实施例2：

溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子DCIC-VIS的合成

步骤1：在搅拌条件下，将N,N-二甲基间苯酚(6.85g，50mmol)与丙二酸 (5.2g，50mmol)均匀分散到二氯氧磷中。添加环化试剂无水氯化锌(21.964g， 161.5mmol)后，在60℃下搅拌12小时，冷却后用冰水降温，抽滤收集固体沉淀。使用碳酸钠溶解沉淀后调节pH值至3-4，再次抽滤沉淀得到黄色固体，为化合物1。

步骤2：在搅拌条件下，将化合物1(2.05g，10mmol)溶解到N,N-二甲基甲酰胺中，加入卤化试剂三氯氧磷(3.02g，20mmol)后，在冰浴环境中搅拌1 小时，抽滤所得固体沉淀得到黄色固体沉淀，即为化合物2。

步骤3：在搅拌条件下，将化合物2(2.51g，10mmol)和2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈(3.72g，20mmol)均匀分散在N,N-二甲基甲酰胺中，逐滴加入吗啉(0.87g，10mmol)后在25℃反应12小时，倒入冰水后抽滤得到固体沉淀。所得固体沉淀用1/30的甲醇/二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到红色固体。即为溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针，命名为DCIC-VIS。

实施例3：

溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子DCIC-VIS的合成

步骤1：在搅拌条件下，将N,N-二甲基间苯酚(6.85g，50mmol)与丙二酸(10.4g，100mmol)均匀分散到二氯氧磷中。添加环化试剂无水氯化锌(21.964g， 161.5mmol)后，在65℃下搅拌12小时，冷却后用冰水降温，抽滤收集固体沉淀。使用碳酸钠溶解沉淀后调节pH值至3-4，再次抽滤沉淀得到黄色固体，为化合物1。

步骤2：在搅拌条件下，将化合物1(2.05g，10mmol)溶解到N,N-二甲基甲酰胺中，加入卤化试剂三氯氧磷(4.53g，30mmol)后，在冰浴环境中搅拌1 小时，抽滤所得固体沉淀得到黄色固体沉淀，即为化合物2。

步骤3：在搅拌条件下，将化合物2(2.51g，10mmol)和2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈(1.86g，10mmol)均匀分散在N,N-二甲基甲酰胺中，逐滴加入吗啉(1.74g，20mmol)后在25℃反应12小时，倒入冰水后抽滤得到固体沉淀。所得固体沉淀用1/30的甲醇/二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到红色固体。即为溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针，命名为DCIC-VIS。其中，化合物2、2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈的投料摩尔比为1:1～2。化合物2、吗啉的投料摩尔比为1:1～2。

实施例4：

溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子DCIC-VIS的合成

步骤1：在搅拌条件下，将N,N-二甲基间苯酚(6.85g，50mmol)与丙二酸 (7.8g，75mmol)均匀分散到二氯氧磷中。添加环化试剂无水氯化锌(21.964g， 161.5mmol)后，在60℃下搅拌12小时，冷却后用冰水降温，抽滤收集固体沉淀。使用碳酸钠溶解沉淀后调节pH值至3-4，再次抽滤沉淀得到黄色固体，为化合物1。

步骤2：在搅拌条件下，将化合物1(2.05g，10mmol)溶解到N,N-二甲基甲酰胺中，加入卤化试剂三氯氧磷(4.228g，28mmol)后，在冰浴环境中搅拌1 小时，抽滤所得固体沉淀得到黄色固体沉淀，即为化合物2。

步骤3：在搅拌条件下，将化合物2(2.51g，10mmol)和2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈(2.79g，15mmol)均匀分散在N,N-二甲基甲酰胺中，逐滴加入吗啉(0.87g，10mmol)后在30℃反应12小时，倒入冰水后抽滤得到固体沉淀。所得固体沉淀用1/30的甲醇/二氯甲烷洗脱剂进行柱层析，得到红色固体。即为溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针，命名为DCIC-VIS。

在本发明的具体实施例中，步骤1中，N,N-二甲基间苯酚、丙二酸投料摩尔比为1：1，产率为65％-75％；为1：1.2，产率为75％-80％；为1：2，产率为70％-75％。

在本发明的具体实施例中，步骤1中，50℃时，产率为60％-65％；60℃时，产率为75％-80％；65℃时，产率为70％-80％。

在本发明的具体实施例中，步骤2中，化合物1、4-溴-1，8-萘酐的投料摩尔比为1:2，产率为60％-65％；为1:2.5，产率为70％-75％；为1:3，产率为 65％-70％。

在本发明的具体实施例中，步骤2中，常温环境25-30℃时，产率为 50％-60％；冰浴环境时，产率为70％-75％。

在本发明的具体实施例中，步骤3中，化合物2、2-(3,5,5-三甲基环己-2- 烯亚基)丙二腈的投料摩尔比为1:1，产率为40-50％；为1:2，产率为30％-40％；化合物2、吗啉的投料摩尔比为1:1时，产率为30％-40％。为1:2时，产率为 40％-50％。

在本发明的具体实施例中，步骤3中，25℃时，产率为30-40％，30℃时，产率为30-35％。

将本发明的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针溶于DMSO溶液中制得0.1mM的母液，各取5μL母液与3mL不同粘度的溶剂中，获得探针 DCIC-VIS在不同溶剂中的紫外光谱图。随后立即测试每组溶液的紫外最佳激发波长、荧光最佳发射波长以及相应的荧光量子产率。为了进一步确定探针对于粘度的响应特征，首先在不同粘度的试剂中测定探针DCIC-VIS的荧光光谱，所有的荧光检测均在激发波长为470nm处激发。同时采用双光子激发荧光法测定了探针DCIC-VIS的双光子荧光截面。随着溶剂粘度的增加，探针溶液在664nm处的荧光强度逐渐增强。而且粘度Log(η)1.0-3.0与荧光强度 Log(I)2.6-3.4之间存在良好的线性关系，线性方程为y＝2.394+0.315x， R²＝0.982。荧光强度与粘度的表征实验说明探针对于粘度检测具有优异的响应性能。

实施例6：

内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针分子的光谱测试

将本发明实施例1制得的内质网定位甲醛响应的双光子荧光探针溶于 DMSO溶液中制得0.1mM的母液，各取5μL母液与3mL不同粘度的溶剂中，获得探针DCIC-VIS在不同溶剂中的紫外吸收光谱及荧光发射光谱图，参见图 2A。如图2B中所示，在470nm波长的激发下，探针在PBS溶液中的荧光强度是最低的，在甘油中的荧光强度最高，且探针的紫外吸收波长在不同溶剂中大体一致，因此探针可以在体外环境下实现对不同粘度环境的区分。

本发明的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针能够实现溶酶体定位及粘度响应，进而达到研究溶酶体粘度与细胞自噬之间关系的目的。细胞毒性实验还表明该探针具有较低的生物毒性，双光子共聚焦显微镜成像实验表明该探针对PC12细胞渗透性好，可以有效定位细胞中的溶酶体(定位系数为 0.91).适用于细胞溶酶体粘度响应的双光子荧光成像，进而实现对细胞自噬的监测，具体实施例如下：

实施例7：

为了进一步验证探针对粘度的响应能力是否具有线性关系，将本发明实施例1制得的探针在进行体外粘度响应。如图3A所示，随着甘油含量的不断增加，探针在664nm处的荧光强度逐渐增强。因此，粘度与探针的荧光强度呈正相关。如图3B所示，粘度Log(η)1.0-3.0与荧光强度Log(I)2.6-3.4之间存在良好的线性关系，线性方程为y＝2.394+0.315x，R²＝0.982。荧光强度与粘度的表征实验说明探针对于粘度检测具有优异的响应性能。

实施例8：

溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子的双光子性能测试

测试了本发明实施例1制得的探针DCIC-VIS在乙醇以及甘油中的双光子活性截面。甘油组中探针DCIC-VIS的双光子活性截面出现在820nm处，，双光子活性截面由乙醇组的10GM增大到甘油组的65GM，两组差异明显。以上证明了探针DCIC-VIS有能力用于粘度变化的监测和双光子生物成像。

实施例9：

溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子的pH值稳定性测试

测试了本发明实施例1制得的探针DCIC-VIS在乙醇及甘油环境中，pH 值4-9范围内荧光强度的变化，在这一pH值变化范围内，探针的荧光强度保持恒定，且在甘油环境中的荧光强度远远高于乙醇环境。证明了探针适用于溶酶体内环境的荧光成像。

实施例10：

选择性实验

为了验证探针在细胞体内复杂生物环境中的对粘度的区分能力，使用200 微米生物大分子(GSH、Cys、Hcy)，200微米RSS(Na₂S、Na₂S₂O₃、Na₂SO₃、 Na₂SO₄)，200微米RNS(NaNO₂，NaNO₃，NO，ONOO^-)，200微米ROS (ClO^-，·O^2-，·OH，¹O₂，H₂O₂)等考察了探针的选择性。如图5所示，探针在其他环境中均没有表现出较高的荧光强度，仅仅在甘油这一粘度环境中表现出强的荧光发射。这表面探针具有区分及鉴别粘度环境的能力，可以在细胞体内复杂的生物环境中实现粘度检测，进而实现对细胞自噬的监测。

实施例11：

细胞毒性测试及荧光稳定性实验

用MTT(5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基四唑溴化物)方法进行了细胞毒性实验。将不同浓度的实施例1制得的探针DCIC-VIS(0，5，10，20，30μM) 与PC12细胞共同培养，如图6所示，探针DCIC-VIS整体对于PC12细胞的毒性呈现随着探针浓度增加细胞存活率有所下降，但即使探针浓度达到40μM 时，PC12细胞的存活率依旧可以达到95％。这说明探针对于细胞的毒性较低，可以用于生物样品的双光子成像实验。同时相同位置的细胞荧光强度在一小时保持恒定证明了探针具有优秀的长时间监测成像能力。

实施例12：

细胞器定位实验

为了更进一步研究探针SKD-1-HCHO的亚细胞器共定位性能，分别利用商业荧光染料ER-tracker Green、Mita-Tracker Green、Lyso-Tracker Green与实施例1制得的探针SKD-1-HCHO共染来探究探针分别在内质网、线粒体、溶酶体中的共定位性能。图中显示的是分别是ER-tracker Green、Mita-Tracker Green、Lyso-Tracker Green处理过的细胞在绿光通道、红光通道下的成像。如图7所示，可以看到探针DCIC-VIS在溶酶体的共定位性最好，绿色通道和红色通道重叠的部分面积最大，共定位系数为0.91。这些数据表明探针可以很好的定位到细胞的溶酶体中并对溶酶体中粘度的变化进行响应。

实施例13：

探针对细胞自噬过程的原位监测

探索并证明了探针对活细胞自噬过程中具有对粘度波动原位监测的能力，在420nm双光子激发下，细胞的环境温度由37℃逐渐下降至4℃的过程中(图8)，细胞中探针的荧光强度也逐渐增强。这是由于细胞在低温应激下发生自噬，导致溶酶体的粘度随着温度下降而上升。同时，使用地塞米松处理后的PC12细胞相对荧光强度也明显增强。DMSO处理后的细胞与37℃环境相比荧光强度变化微弱。这些都表明探针可以对活细胞粘度的变化做出响应。

此外，如图9中，饥饿处理后的PC12细胞显示出比对照组更高的荧光强度信号，且在红色荧光通道观察到更高的荧光信号，这是由于饥饿处理后引发了细胞的自噬反应，进而导致溶酶体粘度的增大。使用3-MA孵育饥饿处理后的细胞发现，红色荧光通道观察到的荧光强度远低于饥饿处理组，这是由于3-MA的加入抑制了细胞的自噬，导致溶酶体的粘度降低，减弱了荧光信号的产生。这表明探针荧光的增加与饥饿引发的细胞自噬有关，并且探针可以很好的通过荧光信号的强弱表达这一过程。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子，其结构式如下：

2.溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

第三步，将上述化合物2与2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈均匀分散于溶剂C中，并添加吗啉在条件a中进行取代反应，取代反应结束后将所得产物混合物经分离纯化后，得到探针分子。

3.根据权利要求2所述的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子的制备方法，其特征在于，

中间化合物1为

所述的化合物2为

4.根据权利要求3所述的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子的制备方法，其特征在于，所述的第一步中，所述N,N-二甲基间苯酚与所述的丙二酸的摩尔比为1：1～2。

5.根据权利要求4所述的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子的制备方法，其特征在于，所述的第二步中，将中间化合物1均匀分散于溶剂B中后，加入卤化试剂三氯氧磷，中间化合物1与三氯氧磷的摩尔比为1:2～3。

6.根据权利要求5所述的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子的制备方法，其特征在于，所述的第三步中，化合物2与2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈的摩尔比为1:1～2；化合物2与吗啉的摩尔比为1:1～2。

7.根据权利要求6所述的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子的制备方法，其特征在于，所述的第一步中，加成反应的条件a为50-65℃，搅拌时间为12小时；

第二步中，取代反应的条件b为冰浴环境，搅拌1小时；

第三步中，取代反应的条件c为25-30℃，搅拌12小时。

8.根据权利要求7所述的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子的制备方法，其特征在于，第一步中，溶剂A为二三氯氧磷；环化试剂B为无水氯化锌；第二步中，溶剂B为N,N-二甲基甲酰胺；第三步中，溶剂C为N,N-二甲基甲酰胺。

9.根据权利要求2～8任意一项所述的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子的制备方法，其特征在于，所述制备方法制得的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针分子及制备方法在检测溶酶体粘度变化中的应用。