CN112939960A - 羰基氮杂环丁烷取代的nbd类荧光染料及其合成方法和应用 - Google Patents

羰基氮杂环丁烷取代的nbd类荧光染料及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料及其合成和应用，该类染料的结构特点在于将羰基氮杂环丁烷共价连接到4‑氯‑7‑硝基苯并‑2‑氧杂‑1，3‑二唑(NBD)母体的4号位。这类新型荧光染料具有优异的荧光强度和光稳定性，使其在荧光检测和荧光成像等领域，特别是单分子检测和超分辨荧光成像等新兴领域具有广泛的应用前景。
Figure DDA0002311022780000011
R1为
Figure DDA0002311022780000012
或
Figure DDA0002311022780000013
或
Figure DDA0002311022780000014
其中X1为H、C1‑2烷基，X2为C1‑2烷基，
Figure DDA0002311022780000015
x3为C1‑2烷基，
Figure DDA0002311022780000016
X4为C1‑2烷基。

Description

羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于荧光染料领域，具体涉及一类新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料及其合成和应用。
背景技术
4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD-Cl)因其能够在生物化学中作为荧光标记剂，分析化学中作为衍生试剂，以及可作为荧光纳米粒子设计的组成部分，得到了广泛的应用。
有机荧光染料被广泛应用于生物分子标记，通过所见即所得的方式跟踪生物分子，研究功能生物分子的位置和作用。荧光染料的光强度和光稳定性是影响成像质量的首要因素，虽然，大量商业染料已经被开发并广泛应用，但随着以超高分辨为技术支撑的单分子荧光成像的快速发展，对荧光染料的光强度和光稳定性提出了更高的要求。四元氮杂环丁烷已经被证明可同时提高荧光染料的光亮度和光稳定性，新开发的羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料则被证明可以进一步提高其光亮度和光稳定性。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料。
本发明的另一目的是提供一类新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料的合成方法，该方法具有合成操作简便、方便提纯、易于衍生等优点。
本发明提供一类新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料，以4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)为荧光团母体，在4位通过共价连接的方式与羰基氮杂环丁烷相连，实现了该类染料的荧光量子效率的提高以及光稳定性的提升。
所述的羰基氮杂环丁烷4位取代的NBD类荧光染料，其结构式如下：
Figure BDA0002311022760000011
R1为
Figure BDA0002311022760000012
其中X1为H、C1-2烷基，
X2为C1-2烷基，
Figure BDA0002311022760000013
X3为C1-2烷基，
Figure BDA0002311022760000014
X4为C1-2烷基。
羰基氮杂环丁烷4位取代的NBD类荧光染料具体合成步骤如下：
(1)染料1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-2-羧酸甲酯的合成：
将NBD溶于乙酸乙酯中，并向其中加入氮杂环丁烷-2-甲酸甲酯盐酸盐和三乙胺；在氮气保护和室温搅拌条件下继续反应2-10h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得黄色固体1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-2-羧酸甲酯；
(2)染料1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-3-羧酸甲酯的合成：
将NBD溶于乙酸乙酯中，并向其中加入氮杂环丁烷-3-甲酸甲酯盐酸盐和三乙胺；在氮气保护和室温搅拌条件下继续反应2-10h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得黄色固体1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-3-羧酸甲酯；
(3)染料1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺的合成：
将1-Boc-L-吖啶-2-羧酸溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，并向其中依次加入二甘醇胺、1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和三乙胺，室温下搅拌12-36小时。停止反应，减压除去溶剂，硅胶柱分离，将所得产物加入二氯甲烷，并向其中加入三氟乙酸，继续搅拌过夜，停止反应，硅胶柱分离，以二氯甲烷为洗脱剂，除去溶剂，得到白色粘稠液体中间体氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺。
将NBD溶于乙酸乙酯中，并向其中加入上述得到的氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺和三乙胺；在氮气保护和室温搅拌条件下继续反应2-10h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得黄色固体1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺；
其中，步骤(1)中，NBD：氮杂环丁烷-2-甲酸甲酯盐酸盐的质量比为1:0.3-2；
NBD的质量与三乙胺的体积比为1:2-10g/mL；
NBD的质量与乙酸乙酯的体积比为1:50-300g/mL。
步骤(2)中，NBD：氮杂环丁烷-3-甲酸甲酯盐酸盐的质量比为1:0.3-2；
NBD的质量与三乙胺的体积比为1:2-10g/mL；
NBD的质量与乙酸乙酯的体积比为1:50-300g/mL。
步骤(3)中，1-Boc-L-吖啶-2-羧酸：二甘醇胺的质量比为1:1-3；
1-Boc-L-吖啶-2-羧酸：1-羟基苯并三唑的质量比为1:2-4；
1-Boc-L-吖啶-2-羧酸：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量比为1:3-6；
1-Boc-L-吖啶-2-羧酸的质量与三乙胺的体积比为1:4-10g/mL；
1-Boc-L-吖啶-2-羧酸的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:20-80g/mL；
步骤(3)中，NBD：氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺的质量比为1:1-3；
NBD的质量与三乙胺的体积比为1:2-10g/mL；
NBD的质量与乙酸乙酯的体积比为1:50-300g/mL。
一种新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料在细胞、切片荧光成像领域的应用。
本发明优点和有益效果：
本发明涉及的荧光染料拥有合成方法简单、原料廉价易得且便于功能化衍生等优点。
本发明涉及的染料结构为羰基氮杂环丁烷4位取代NBD母体，其荧光量子产率显著提高，水中可达0.08以上；此外，其同样表现出良好的光稳定性。
本发明涉及的荧光染料的亮度高，光稳定性好，共聚焦成像效果佳。
附图说明
图1为实施例1制备的NBD-Aze-1的核磁谱图氢谱。
图2为实施例2制备的NBD-Aze-2的高分辨质谱。
图3为实施例3制备的NBD-Aze-3的核磁谱图氢谱。
图4为实施例1制备的染料NBD-Aze-1在水中归一化的荧光激发谱图与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光染料的浓度为5μM。
图5为实施例2制备的染料NBD-Aze-2在水中归一化的荧光激发谱图与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光染料的浓度为5μM。
图6为实施例3制备的染料NBD-Aze-3在水中归一化的荧光激发谱图与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光染料的浓度为5μM。
图7为实施例1制备的染料NBD-Aze-1在500W钨灯照射下荧光发射强度的变化图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图8为实施例2制备的染料NBD-Aze-2在500W钨灯照射下荧光发射强度的变化图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
图9为实施例3制备的染料NBD-Aze-3的HeLa细胞活细胞荧光共聚焦成像图。
具体实施方式
实施例1
染料NBD-Aze-1的合成：
(1)中间体氮杂环丁烷-2-甲酸甲酯盐酸盐的合成：
Figure BDA0002311022760000041
在50mL单口瓶中加入甲醇10mL，冰水浴冷却至0℃，向其中缓慢滴加氯化亚砜0.19mL，保持0℃条件下继续搅拌30分钟后，向反应瓶中加入氮杂环丁烷-2-羧酸150mg，撤去冰水浴，缓慢升温至室温，搅拌过夜。停止反应，除去溶剂，所得固体用无水乙醚洗涤两次，得到淡黄色固体产物氮杂环丁烷-2-甲酸甲酯盐酸盐，产率86％。
(2)染料1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-2-羧酸甲酯的合成：
Figure BDA0002311022760000042
在25mL单口瓶中依次加入NBD 50mg、乙酸乙酯10mL，氮杂环丁烷-2-甲酸甲酯盐酸盐45mg和三乙胺0.2mL，在氮气保护和室温条件下，继续搅拌反应4h。停止反应，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得黄色固体1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-2-羧酸甲酯(NBD-Aze-1)；
其核磁谱图氢谱如图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.42(d,J＝8.6Hz,1H),5.93(d,J＝8.6Hz,1H),5.33(d,J＝24.0Hz,1H),4.52(d,J＝64.7Hz,2H),3.83(s,3H),3.16–2.97(m,1H),2.64(s,1H).
经检测，其结构如上式NBD-Aze-1所示。其荧光性能如下：
将该染料溶解于DMSO溶液中，配制成浓度为2mM的母液，每次取10μL NBD-Aze-1母液加入4mL水中，配制成5μM的荧光染料测试液，进行荧光激发与发射光谱的测试。在水中荧光激发与发射光谱图如图4所示：吸收波长为489nm，发射波长为550nm，经计算得量子产率为0.08。
实施例2
染料NBD-Aze-2的合成：
(1)中间体氮杂环丁烷-3-甲酸甲酯盐酸盐的合成：
Figure BDA0002311022760000043
在50mL单口瓶中加入甲醇10mL，冰水浴冷却至0℃，向其中缓慢滴加氯化亚砜0.19mL，保持0℃条件下继续搅拌30分钟后，向反应瓶中加入氮杂环丁烷-3-羧酸150mg，撤去冰水浴，缓慢升温至室温，搅拌过夜。停止反应，除去溶剂，所得固体用无水乙醚洗涤两次，得到淡黄色固体产物氮杂环丁烷-3-甲酸甲酯盐酸盐，产率89％。
(2)染料1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-3-羧酸甲酯的合成：
Figure BDA0002311022760000051
在25mL单口瓶中依次加入NBD 50mg、乙酸乙酯10mL，氮杂环丁烷-3-甲酸甲酯盐酸盐45mg和三乙胺0.2mL，在氮气保护和室温条件下，继续搅拌反应4h。停止反应，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得黄色固体1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-3-羧酸甲酯(NBD-Aze-2)；
其高分辨质谱如图2所示，具体数据如下：
C11H11N4O5[M+H]+理论值：279.0724，实际值：279.0718。
经检测，其结构如上式NBD-Aze-2所示。其荧光性能如下：
将该染料溶解于DMSO溶液中，配制成浓度为2mM的母液，每次取10μL NBD-Aze-2母液加入4mL水中，配制成5μM的荧光染料测试液，进行荧光激发与发射光谱的测试。在水中荧光激发与发射光谱图如图5所示：吸收波长为500nm，发射波长为562nm，经计算得量子产率为0.05。
实施例3
染料NBD-Aze-3的合成：
(1)中间体氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺的合成：
Figure BDA0002311022760000052
在25mL单口瓶中依次加入1-Boc-L-吖啶-2-羧酸100mg，干燥的N,N-二甲基甲酰胺5mL，二甘醇胺210mg、1-羟基苯并三唑270mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐380mg、三乙胺0.55mL，室温下搅拌24小时。停止反应，减压除去溶剂，硅胶柱分离，将所得产物加入10mL二氯甲烷，并向其中加入三氟乙酸0.1mL，继续搅拌过夜，停止反应，硅胶柱分离，以二氯甲烷为洗脱剂，除去溶剂，得到白色粘稠液体氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺。
(2)1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺的合成：
Figure BDA0002311022760000061
在25mL单口瓶中依次加入NBD 60mg、乙酸乙酯12mL，氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺75mg和三乙胺0.24mL，在氮气保护和室温条件下，继续搅拌反应8h。停止反应，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得黄色固体1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺(NBD-Aze-3)。
其核磁谱图氢谱如图3所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.52(d,J＝6.0Hz,1H),8.04(d,J＝28.1Hz,1H),6.09(d,J＝82.2Hz,1H),5.29(d,J＝115.1Hz,1H),4.60(t,J＝5.3Hz,1H),4.35(d,J＝20.7Hz,1H),4.03(q,J＝7.1Hz,1H),3.49(t,J＝5.2Hz,2H),3.45–3.39(m,4H),3.24(q,J＝5.6Hz,2H),2.88(s,1H),2.33(s,1H).
其高分辨质谱具体数据如下：
C14H18N5O6[M+H]+理论值：352.1252，实际值：352.1247。
经检测，其结构如上式NBD-Aze-3所示。其荧光性能如下：
将该染料溶解于DMSO溶液中，配制成浓度为2mM的母液，每次取10μL NBD-Aze-3母液加入4mL水中，配制成5μM的荧光染料测试液，进行荧光激发与发射光谱的测试。在水中荧光激发与发射光谱图如图6所示：吸收波长为486nm，发射波长为547nm。
实施例4
实施例1、2、3所述的染料NBD-Aze-1、NBD-Aze-2、NBD-Aze-3在500W钨灯照射下的荧光发射强度的变化测试。取10μL上述染料母液加入到4mL去离子水中，而后加入螺纹比色皿中，正面放置于钨灯50cm处，分别采取0，0.5，1，2，4，6，8，10小时为时间节点进行荧光发射光谱测试。
实施例1和2所述的染料NBD-Aze-1和NBD-Aze-2在500W钨灯照射下荧光发射强度的变化图如图7和8所示：上述染料的荧光强度在光照10小时后仍然能够保持较高强度。
实施例5
本发明涉及的部分染料在活细胞(RWPE、HeLa、脂肪细胞等)中的荧光共聚焦成像。取0.5μL以上染料母液溶于1mL细胞培养液中，而后置于37℃下对细胞进行孵育10-30分钟后进行荧光成像。激发波长为488nm，采集为500-550nm。
NBD-Aze-3在HeLa细胞中的荧光共聚焦成像如图9所示：染料NBD-Aze-3能够标记细胞内的脂滴，能够检测不同体积大小的脂滴，轮廓清晰，且信噪比较高。

Claims (8)

1.一种新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料，其特征在于：该类荧光染料通过将羰基氮杂环丁烷共价连接到NBD母体的4号位，该类荧光染料的结构如下：
Figure FDA0002311022750000011
R1为
Figure FDA0002311022750000012
其中x1为H、C1-2烷基，
X2为C1-2烷基，
Figure FDA0002311022750000013
X3为C1-2烷基，
Figure FDA0002311022750000014
X4为C1-2烷基。
2.一种如权利要求1所述的新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料的合成方法，其特征在于，以NBD为荧光团母体，将羰基氮杂环丁烷共价连接到NBD的4号位得到该荧光染料。
3.根据如权利要求2所述的新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料的合成方法，其特征在于具体如下：
(1)染料1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)氮杂环丁烷-2-羧酸甲酯的合成：
将NBD溶于乙酸乙酯中，并向其中加入氮杂环丁烷-2-甲酸甲酯盐酸盐和三乙胺；在氮气保护和室温搅拌条件下继续反应2-10h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-10∶1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得黄色固体1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)氮杂环丁烷-2-羧酸甲酯；
(2)染料1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)氮杂环丁烷-3-羧酸甲酯的合成：
将NBD溶于乙酸乙酯中，并向其中加入氮杂环丁烷-3-甲酸甲酯盐酸盐和三乙胺；在氮气保护和室温搅拌条件下继续反应2-10h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-10∶1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得黄色固体1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)氮杂环丁烷-3-羧酸甲酯；
(3)染料1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺的合成：
将1-Boc-L-吖啶-2-羧酸溶于干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，并向其中依次加入二甘醇胺、1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和三乙胺，室温下搅拌12-36小时；停止反应，减压除去溶剂，硅胶柱分离，将所得产物加入二氯甲烷，并向其中加入三氟乙酸，继续搅拌过夜，停止反应，硅胶柱分离，以二氯甲烷为洗脱剂，除去溶剂，得到白色粘稠液体中间体氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺；
将NBD溶于乙酸乙酯中，并向其中加入由上述得到的氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺和三乙胺；在氮气保护和室温搅拌条件下继续反应2-10h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为200-10∶1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得黄色固体1-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺。
4.根据权利要求3所述的一类新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料的合成方法，其特征在于，(1)中，NBD：氮杂环丁烷-2-甲酸甲酯盐酸盐的质量比为1:0.3-2；
NBD的质量与三乙胺的体积比为1:2-10g/mL；
NBD的质量与乙酸乙酯的体积比为1:50-300g/mL。
5.根据权利要求3所述的一种新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料的合成方法，其特征在于，(2)中，NBD：氮杂环丁烷-3-甲酸甲酯盐酸盐的质量比为1:0.3-2；
NBD的质量与三乙胺的体积比为1:2-10g/mL；
NBD的质量与乙酸乙酯的体积比为1:50-300g/mL。
6.根据权利要求3所述的一种新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料的合成方法，其特征在于，(3)中，1-Boc-L-吖啶-2-羧酸：二甘醇胺的质量比为1:1-3；
1-Boc-L-吖啶-2-羧酸：1-羟基苯并三唑的质量比为1:2-4；
1-Boc-L-吖啶-2-羧酸：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量比为1:3-6；
1-Boc-L-吖啶-2-羧酸的质量与三乙胺的体积比为1:4-10g/mL；
1-Boc-L-吖啶-2-羧酸的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:20-80g/mL。
7.根据权利要求3所述的一种新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料的合成方法，其特征在于，(3)中，NBD：氮杂环丁烷-2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)甲酰胺的质量比为1:1-3；
NBD的质量与三乙胺的体积比为1:2-10g/mL；
NBD的质量与乙酸乙酯的体积比为1:50-300g/mL。
8.一种如权利要求1所述的新型羰基氮杂环丁烷取代的NBD类荧光染料在细胞、切片荧光成像领域的应用。
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