CN118165544A - 适用于细胞膜动态超分辨成像的五甲川菁染料荧光探针合成与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明开发出了一种可用于长时间细胞膜动态超分辨成像的五甲川菁染料荧光探针，该染料具有合成原料低廉，合成条件温和等优点。研究发现这类染料通过在菁染料吲哚环的3号位通过脂肪链连接磺胺结构，利用磺胺与碳酸酐酶的弱结合能力，形成缓冲池。通过缓冲策略规避了菁染料易光漂白的缺点，在不改变染料原本光谱性质的同时，对表达碳酸酐酶9的细胞膜进行长时间的超分辨动态成像，观察细胞膜的形态变化。
Description
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一种适用于长时间细胞膜动态超分辨成像的五甲川菁染料荧光探针的合成方法及其在荧光成像领域中的应用。
背景技术
细胞膜是由磷脂双分子层以及锚定在其中的多种蛋白质组成一种动态结构。在细胞间的信息传递以及调节细胞与细胞之间，细胞与外部环境之间的物质交换起着重要的作用。监测细胞膜的动态过程有利于我们了解细胞的生物活动，理解其生理学意义。荧光成像技术是现代生命科学领域强有力的工具之一，超分辨成像技术的出现更是将荧光成像的分辨率提高到了纳米尺度，使我们能够清楚观察到细胞的精细结构。而更高亮度及光稳定性的染料是实现高分辨成像的必要条件，遗憾的是，现有的荧光染料大部分都缺乏足够的亮度来进行超分辨动态成像。
五甲川菁染料因其摩尔消光系数高，吸收和发射波长调节范围宽，背景荧光低以及生物相容性好等优点在生物学领域中应用非常广泛。但是菁染料母体带正电荷，导致其比较容易靶向线粒体，同时由于其甲川链活性较高，容易被环境中的单线态氧进攻导致光漂白，导致其在超分辨成像中的应用受限。因此需要对五甲川菁染料进行合理的改造使其调节其靶向能力同时使其能够长时间进行超分辨动态成像是当下的研究关键点。
发明内容
本发明开发出了一种适用于长时间细胞膜动态超分辨成像的五甲川菁染料荧光探针，该探针在五甲川菁染料母体上引入磺胺结构，在不改变其发光性质的前提下利用让染料的缓冲池策略提升菁染料的成像稳定性。研究发现这类染料有很高的亮度、能够对细胞膜进行长时间的超分辨动态成像，观察到细胞膜上伪足的生长融合过程。
本发明所述的适用于长时间细胞膜动态超分辨成像的五甲川菁染料荧光探针，其结构式如下所示：
同时，本发明还提供了所述该种五甲川菁染料的一般合成方法，合成步骤如下：、
称取2.0-5.0g 2，3，3-三甲基-3-H-吲哚和5.0-10.0g碘甲烷加入到密封管里升温至70-100℃，反应10-20小时。将固体转移至布氏漏斗用乙醚洗涤得到1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物。
步骤二：中间体2-乙酰基-2-甲基环己酮的合成
称取2.0-5.0g 2-乙酰基环己酮以及3.0-7.0g碘甲烷加入到圆底烧瓶中，用甲醇溶解。在低温下缓慢加入1.0-3.0g氢氧化钠的水溶液。将升温至70-100℃，反应10-20小时。反应液溶于60-100ml水中，用二氯甲烷萃取，减压除去溶剂，硅胶柱层析得到中间体2-乙酰基-2-甲基环己酮。
步骤三：中间体6-甲基-7-氧代辛酸甲酯的合成
称取1.0-4.0g中间体2-乙酰基-2-甲基环己酮和0.4-1.0g甲醇锂的混合物溶于10-30ml甲醇中，加入干燥的圆底烧瓶中，室温搅拌过夜。将混合物溶解在水中并通过HCl调节至pH＝5-6。然后用二氯甲烷萃取产物，用无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂并通过柱色谱法纯化残余物得到中间体6-甲基-7-氧代辛酸甲酯。
步骤四：中间体6-甲基-7-氧代辛酸的合成
称取2.0-4.0g中间体6-甲基-7-氧代辛酸甲酯溶解于10-20ml 12-18％HCl，回流搅拌反应过夜。用二氯甲烷萃取反应液，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得到中间体6-甲基-7-氧代辛酸。
步骤五：中间体2,3-二甲基-3H-吲哚-3-戊酸的合成
称取0.4-1.0g苯肼以及0.4-1.0g中间体6-甲基-7-氧代辛酸加入到圆底烧瓶中，溶解于4 -10ml醋酸，100-120℃下搅拌回流2-4h。减压除去溶剂，硅胶柱层析得到的中间体2,3-二甲基-3H-吲哚-3-戊酸。步骤六：中间体1,2,3-三甲基-3H-吲哚-3-戊酸-碘化物(1:1)的合成称取0.1-0.3g中间体2,3-二甲基-3H-吲哚-3-戊酸，0.3-0.5g碘甲烷以及1-3ml乙腈溶解于密封管中。80-100反应12-18h。减压除去溶剂，硅胶柱层析得到中间体1,2,3-三甲基-3H-吲哚-3-戊酸-碘化物(1:1)。(比例为1：1含义为化合物中1,2,3-三甲基-3H-吲哚-3-戊酸与碘的摩尔比例为1：1)
步骤七：中间体N-[3-(苯氨基)-2-丙烯-1-亚基]苯胺的合成
称取6.0-9.0g 1,1,3,3-四乙氧基丙烷和3-8ml盐酸加入60-80mL蒸馏水中并在30-60℃下搅拌。然后将4.0-8.0ml苯胺、10-20mL盐酸和60-80mL蒸馏水的溶液逐滴加入到反应中并在50-70℃下继续搅拌1-3h。冷却、过滤和干燥后，得到中间体N-[3-(苯氨基)-2-丙烯-1-亚基]苯胺。
步骤八：中间体含羧基的五甲川菁染料的合成
称取0.2-0.4g中间体1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物和0.3-0.6g中间体N-[3-(苯氨基)-2-丙烯-1-亚基]苯胺加入5-10ml醋酸酐中，并将混合物在30-60℃搅拌3-5小时。将溶液冷却至室温，减压蒸发溶剂。然后加入5-10mL无水乙醇、0.3-0.5g中间体1,2,3-三甲基-3H-吲哚-3-戊酸-碘化物(1:1)和0.2-0.5g醋酸钠；将混合物在30-60℃搅拌1-3小时。反应完成后，将产物通过硅胶柱色谱纯化，得到中间体含羧基的五甲川菁染料。
步骤九：适用于细胞膜超分辨动态成像的五甲川菁染料的合成
称取40-70mg中间体含羧基的五甲川菁染料和60-90mg 2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的混合物加入圆底烧瓶中。将80-100uL二异丙基乙胺溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺中并添加到烧瓶中。将混合物在室温搅拌30-60分钟。然后将60-90mg4-氨甲基苯磺酰胺盐酸盐溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺并添加到烧瓶中。硅胶柱层析得到适用于细胞膜超分辨动态成像的五甲川菁染料。
步骤一中，2.0-5.0g 2,3,3-三甲基-3-H-吲哚、5.0-10.0g碘甲烷。
步骤二中，2.0-5.0g 2-乙酰基环己酮、3.0-7.0g碘甲烷、1.0-3.0g氢氧化钠的水溶液
步骤三中，1.0-4.0g中间体2-乙酰基-2-甲基环己酮、0.4-1.0g甲醇锂。
步骤四中，2.0-4.0g中间体6-甲基-7-氧代辛酸甲酯、10-20ml 12-18％HCl。
步骤五中，0.4-1.0g苯肼、0.4-1.0g中间体6-甲基-7-氧代辛酸、4 -10ml醋酸。
步骤六中，0.1-0.3g中间体2,3-二甲基-3H-吲哚-3-戊酸、0.3-0.5g碘甲烷。
步骤七中，6.0-9.0g 1,1,3,3-四乙氧基丙烷、3-8ml盐酸，4.0-8.0ml苯胺、10-20mL盐酸。步骤八中，0.2-0.4g中间体1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物、0.3-0.6g中间体N-[3-(苯氨基)-2-丙烯-1-亚基]苯胺、5-10mL无水乙醇、0.3-0.5g中间体1,2,3-三甲基-3H-吲哚-3-戊酸-碘化物(1:1)、0.2-0.5g醋酸钠。
步骤九中，40-70mg中间体含羧基的五甲川菁染料、60-90mg 2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、80-100uL二异丙基乙胺、60-90mg苯磺酰胺、4-(氨基甲基)-盐酸盐(1:1)。上述细胞膜荧光探针在活细胞内能够对细胞膜进行标记并实现长时间超分辨动态成像。
本发明具有以下特征：
这类探针拥有合成原料低廉，合成条件温和等优点。
这类探针在不改变染料原本光谱性质的同时，使其能够与碳酸酐酶9有特异性结合能力。能够对转染有碳酸酐酶膜蛋白的细胞膜进行快速的标记染色，并且能够对其进行长时间的超分辨动态成像，观察细胞膜的形态变化。
附图说明
图1：为实施例1中的产物的核磁氢谱；
图2：为实施例3中的产物的核磁氢谱；
图3：为实施例4中的产物的核磁氢谱；
图4：为实施例5中的产物的核磁氢谱；
图5：为实施例8中的产物的核磁氢谱；
图6：为实施例9中的产物的核磁氢谱；
图7：为实施例9制备的细胞膜探针S-Cy5在水中归一化荧光激发与发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化的荧光强度与吸收强度，荧光探针的浓度为2μM；
图8：为实施例9制备的细胞膜探针S-Cy5的HeLa细胞长时间超分辨动态成像图。
具体实施方式
本发明给出了一种适用于长时间细胞膜动态超分辨成像的五甲川菁染料荧光探针及其荧光成像领域的应用。
实施例1
化合物1合成路线和产物结构如下：
称取2，3，3-三甲基-3-H-吲哚(3.50ml,21.80mmol)和碘甲烷(6.77ml,0.11mol)加入到密封管里100℃加热，回流过夜。将固体转移至布氏漏斗用30ml乙醚洗涤得到浅粉色固体化合物1(5.92g，19.67mmol，90％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.94–7.88(m,1H),7.85–7.80(m,1H),7.66–7.59(m,2H),3.97(d,J＝0.4Hz,3H),2.76(s,3H),1.53(s,6H).
实施例2
化合物2合成路线和产物结构如下：
称取2-乙酰基环己酮(3ml,23.1mol)以及碘甲烷(4.32ml,69.3mol)加入到圆底烧瓶中，用甲醇(9ml)溶解。在冰浴条件下缓慢加入氢氧化钠(924mg,23.1mol)的水溶液(6ml)。将反应温度升至70℃，回流12h。反应液溶于100ml水中，用二氯甲烷萃取，再用2mol/L的NaOH(100ml)溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂，硅胶柱层析(体积比，石油醚:乙酸乙酯＝20：1)。得到化合物2(1.50ml,12.0mmol,52％)。
实施例3
化合物3合成路线和产物结构如下：
称取化合物2(2g，13.0mmol)和甲醇锂(543mg，14.3mmol)的混合物溶于10ml甲醇中，加入干燥的圆底烧瓶中，室温搅拌12h。将混合物溶解在水中并通过浓盐酸调节至pH＝5-6。然后用二氯甲烷萃取产物，用无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂并通过柱色谱法(体积比，石油醚:乙酸乙酯＝10:1)纯化残余物。化合物3为无色液体(1.30g,7.0mmol,54％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.71–3.65(m,3H),2.52(dd,J＝13.6,6.8Hz,1H),2.32(t,J＝7.4Hz,1H),2.15(s,1H),1.65(dd,J＝14.7,7.1Hz,1H),1.43–1.22(m,1H),1.14–1.06(m,1H).
实施例4
化合物4合成路线和产物结构如下：
称取化合物3(1.32g,7.0mmol)溶解于6ml质量浓度12％ HCl水溶液，回流搅拌12h。用二氯甲烷萃取反应液，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂。得到无色透明液体化合物4(0.87g,5.1mmol,73％)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.08(s,1H),2.50–2.39(m,1H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.07(s,3H),1.59(ddt,J＝22.3,14.8,7.3Hz,3H),1.35–1.16(m,3H),1.02(d,J＝7.0Hz,3H).
实施例5
化合物5合成路线和产物结构如下：
称取苯肼(432.6mg,4mmol)以及化合物4(688.4mg,4mmol)加入到圆底烧瓶中，溶解于4ml醋酸中，120℃下搅拌回流3.5h。减压除去溶剂，硅胶柱层析(体积比，二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝100:50：5)。得到的产物用乙酸乙酯-正己烷(0.6-2)重结晶。001-09为黄色晶体(324.9mg,1.33mmol,33％)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.50(s,1H),7.48(d,J＝7.6Hz,1H),7.21(td,J＝7.4,1.3Hz,1H),7.17–7.08(m,2H),2.18(s,3H),2.11(td,J＝7.4,2.0Hz,2H),1.88–1.77(m,1H),1.77–1.67(m,1H),1.48–1.35(m,2H),1.21(s,3H),0.71(dd,J＝12.5,7.3Hz,1H),0.58(dd,J＝12.6,7.4Hz,1H).
实施例6
化合物6合成路线和产物结构如下：
称取化合物5(245.1mg,0.66mmol)，碘甲烷(311uL,5mmol)以及1ml乙腈溶解于密封管中。100℃反应过夜。减压除去溶剂，硅胶柱层析(体积比，乙酸乙酯：甲醇＝100:10)得到黄色固体化合物6(184.7mg,0.48mmol,72％)。
实施例7
化合物7合成路线和产物结构如下：
称取1,1,3,3-四乙氧基丙烷(7.19ml,30mmol)和4.3ml浓盐酸加入70mL蒸馏水中并在50℃下搅拌。然后将5.47ml苯胺、10mL盐酸和70mL蒸馏水的溶液逐滴加入到反应中并在50℃下继续搅拌1h。冷却、过滤和干燥后得到化合物7，无需进一步纯化，直接进行下一步反应。
实施例8
化合物8合成路线和产物结构如下：
称取化合物1(361.2mg,1.2mmol)和化合物7(455.9mg,1.2mmol)加入(Ac)2O(5mL)中，并将混合物在60℃搅拌5小时。将溶液冷却至室温，减压蒸发溶剂。然后加入EtOH(5mL)、化合物6(387.1mg,1.0mmol)和NaOAc(246.1mg,3.0mmol)；将混合物在50℃搅拌1.5小时。反应完成后，将产物通过硅胶柱色谱(体积比，二氯甲烷：甲醇＝10:1)纯化，得到化合物8(90.3mg，0.15mmol，15％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.25(dd,J＝25.4,12.5Hz,2H),7.55–7.38(m,4H),7.28(dd,J＝17.9,9.2Hz,4H),6.64(t,J＝12.4Hz,1H),6.30(dd,J＝13.7,2.2Hz,2H),3.63(s,3H),3.61(s,3H),2.50–2.39(m,1H),2.21(td,J＝13.0,4.3Hz,1H),2.11(t,J＝7.2Hz,2H),1.73(d,J＝1.6Hz,6H),1.70(s,3H),1.46(td,J＝13.8,7.3Hz,2H),0.91(dd,J＝28.6,12.9Hz,1H),0.62(dd,J＝12.3,6.4Hz,1H).
实施例9
化合物9合成路线和产物结构如下：
称取化合物8(59.6mg，0.1mmol)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(76mg，0.3mmol)的混合物加入圆底烧瓶中。将二异丙基乙胺(87μl,0.5mmol)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(2ml)中并添加到烧瓶中。将混合物在室温搅拌30分钟。然后将4-氨甲基苯磺酰胺盐酸盐(66.8mg,0.3mmol)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(2ml)并添加到烧瓶中。硅胶柱层析得到适用于细胞膜超分辨动态成像的五甲川菁染料S-Cy5。
1H NMR(700MHz,MeOD)δ8.23(t,J＝13.1Hz,1H),8.18(t,J＝13.0Hz,1H),7.82(d,J＝8.1Hz,2H),7.49(d,J＝7.4Hz,1H),7.42(dd,J＝17.5,7.7Hz,3H),7.33(d,J＝8.1Hz,2H),7.30(d,J＝7.9Hz,1H),7.26(dd,J＝18.8,8.6Hz,3H),6.62(t,J＝12.4Hz,1H),6.29(d,J＝13.7Hz,1H),6.24(d,J＝13.6Hz,1H),4.31(q,J＝15.4Hz,2H),3.64(s,3H),3.55(s,3H),2.44(td,J＝13.4,4.4Hz,1H),2.19(td,J＝13.7,4.1Hz,1H),2.14–2.04(m,2H),1.71(s,6H),1.68(s,3H),1.57–1.42(m,2H),0.94–0.87(m,1H),0.62–0.53(m,1H).
将待测染料S-Cy5溶解于二甲基亚砜溶液中，配制2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化及细胞膜荧光成像。
实施例10
S-Cy5在水中的光谱测试。取3μL S-Cy5母液，加入3mL水中，配制成2μM的荧光探针测试液，并进行紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱(激发光为610nm)的测试。
图7中荧光探针浓度为2μM，为S-Cy5在水中的吸收光谱和荧光光谱。S-Cy5在水中摩尔消光系数达180000M-1cm-1，量子产率达到0.14，该探针具有很高的亮度。
实施例11
S-Cy5对细胞膜上表达碳酸酐酶9的HeLa染色后进行超分辨荧光成像。取0.5μL0.2mmol/L S-Cy5母液溶于1mL HeLa培养基中，室温孵育15分钟后长时间超分辨动态成像。
图8中，S-Cy5能够对HeLa细胞的细胞膜进行精准定位，并且在能够对细胞膜进行长达60min的成像并且能够观察到细胞膜上伪足的生长变化。
Claims (3)
1.适用于长时间细胞膜动态超分辨成像的五甲川菁染料，其特征在于：其结构式如下所示，
2.一种权利要求1所述的五甲川菁染料荧光探针的合成方法，其特征在于：该合成的具体方法如下：
(1)中间体1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物的合成
称取2.0-5.0g 2,3,3-三甲基-3-H-吲哚和5.0-10.0g碘甲烷加入到密封管里升温至
70-100℃，反应10-20小时；将固体转移用乙醚洗涤得到1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物；
(2)：中间体2-乙酰基-2-甲基环己酮的合成
称取2.0-5.0g 2-乙酰基环己酮以及3.0-7.0g碘甲烷加入到容器中，用5-15ml甲醇溶解；
加入0.8-3.0g氢氧化钠的4-8ml水溶液；将升温至70-100℃，反应10-20h。反应液溶于60-100ml水中，用二氯甲烷萃取，减压除去溶剂，硅胶柱层析得到中间体2-乙酰基-2-甲基环己酮；
(3)：中间体6-甲基-7-氧代辛酸甲酯的合成
称取1.0-4.0g中间体2-乙酰基-2-甲基环己酮和0.4-1.0g甲醇锂的混合物溶于10-30ml甲醇中，加入容器中，室温搅拌10-15h，将混合物溶解在水中并通过浓盐酸调节至pH＝5-6；然后用二氯甲烷萃取产物，用无水硫酸钠干燥；除去溶剂并纯化得到中间体6-甲基-7-氧代辛酸甲酯；
(4)：中间体6-甲基-7-氧代辛酸的合成
称取2.0-4.0g中间体6-甲基-7-氧代辛酸甲酯溶解于10-20ml质量浓度12-18％HCl，回流搅拌反应12-15h；用二氯甲烷萃取反应液，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得到中间体6-甲基-7-氧代辛酸；
(5)：中间体2,3-二甲基-3H-吲哚-3-戊酸的合成
称取0.4-1.0g苯肼以及0.4-1.0g中间体6-甲基-7-氧代辛酸加入到容器中，加入4-10ml醋酸，100-120℃下搅拌回流2-4h；减压除去溶剂，硅胶柱层析得到的中间体2,3-二甲基-3H-吲哚-3-戊酸；
(6)：中间体1,2,3-三甲基-3H-吲哚-3-戊酸-碘化物(1:1)的合成
称取0.1-0.3g中间体2,3-二甲基-3H-吲哚-3-戊酸，0.3-0.5g碘甲烷以及1-3ml乙腈溶解于密封管中；80-100反应12-18h；减压除去溶剂，硅胶柱层析得到中间体1,2,3-三甲基-3H-吲哚-3-戊酸-碘化物(1:1)；
(7)：中间体N-[3-(苯氨基)-2-丙烯-1-亚基]苯胺的合成
称取6.0-9.0g 1,1,3,3-四乙氧基丙烷和3-8ml浓盐酸加入60-80mL蒸馏水中并在30-60℃下搅拌；然后将4.0-8.0ml苯胺、10-20mL浓盐酸和60-80mL蒸馏水的溶液逐滴加入到反应中并在50-70℃下继续搅拌1-3h；冷却、过滤和干燥后，得到中间体N-[3-(苯氨基)-2-丙烯-1-亚基]苯胺；
(8)：中间体含羧基的五甲川菁染料的合成
称取0.2-0.4g中间体1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚鎓碘化物和0.3-0.6g中间体N-[3-(苯氨基)-2-丙烯-1-亚基]苯胺加入5-10ml醋酸酐中，并将混合物在30-60℃搅拌3-5小时；将溶液冷却至室温，减压蒸发溶剂；然后加入5-10mL无水乙醇、0.3-0.5g中间体1,2,3-三甲基-3H-吲哚-3-戊酸-碘化物(1:1)和0.2-0.5g醋酸钠；将混合物在30-60℃搅拌1-3小时；反应完成后，将产物通过硅胶柱色谱纯化，得到中间体含羧基的五甲川菁染料；
(9)：五甲川菁染料的合成
称取40-70mg中间体含羧基的五甲川菁染料和60-90mg 2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的混合物加入容器中；将80-100uL二异丙基乙胺溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺中并添加到容器中；将混合物在室温搅拌30-60分钟；然后将60-90mg 4-氨甲基苯磺酰胺盐酸盐溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺并添加到容器中；硅胶柱层析得到适用于五甲川菁染料。
3.一种权利要求1所述的五甲川菁染料在荧光成像中的应用。
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