CN114262333A - 一类用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类应用于溶酶体超分辨荧光成像的近红外自闪荧光染料及其合成方法与应用，该类荧光染料通过2‑氨基吡啶衍生物对罗丹明700的羧酸位置进行修饰，从而大幅度增加染料罗丹明700的荧光暗态的比例。本发明中涉及的近红外荧光自闪染料在pH>5.0水体系中几乎是以无荧光态的螺酰胺形式存在，进而使其在细胞内偏酸环境的溶酶体中有少量的开环荧光态形式，可以实现细胞内溶酶体的近红外免洗成像的定位效果。除此之外，该类荧光染料还具有荧光态与暗态结构之间的可逆平衡，从而使得染料可以在酸性的溶酶体中自发闪烁的性能，实现细胞内溶酶体的免洗超分辨荧光成像。

Description

一类用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于荧光探针领域，具体地说，涉及一类用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料及其制备方法和应用。

背景技术

溶酶体作为真核细胞内一种重要的酸性亚细胞器，主要功能是通过内吞、自噬等作用降解细胞内生物大分子并将有用成分重新归还细胞。溶酶体作为细胞内的“消化系统”，其相关的动态研究一直是生命科学的热点之一。溶酶体行使细胞内功能时，往往伴随着溶酶体的运动，以及溶酶体与其他亚细胞器，如线粒体之间的相互作用。因此，实时精准的捕获细胞内溶酶体的行为对于更好的解析溶酶体具有重要的生理学意义。

荧光显微技术以其独特的功能优势成为目前研究细胞内溶酶体活动行为的重要分析手段。尤其是近年来超分辨成像技术的出现，使得科研工作者可以对细胞内亚细胞器进行纳米尺度的观察。同时，近红外的荧光探针与具有较短吸收和发射波长的荧光探针相比，具有光毒性低、光散射小、组织穿透能力强、受生物体自发荧光影响小、有利于进行多荧光染色等优点。然而，现有溶酶体染料无法实现纳米尺度下对活细胞内溶酶体的长时间动态监测。这主要由于这些染料所需的激发光太强或激活光波长短，因此带来较大的细胞损伤与光毒性。而自闪的荧光染料可以在基态实现荧光亮暗的转变，无需强的激发光、激活光、外加硫醇等，为纳米尺度下活细胞溶酶体长时间动态检测开辟了新道路。因此，急需近红外发射的自闪溶酶体染料，从而实现溶酶体纳米尺度下的长时间监测，为科研工作者解析细胞内溶酶体的生命行为提供重要支撑。

发明内容

本发明提供了一种一类用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料，该类荧光染料通过2-氨基吡啶衍生物对罗丹明700的羧酸位置进行修饰，从而大幅度增加染料罗丹明700的荧光暗态的比例。本发明中涉及的近红外荧光自闪染料在pH>5.0水体系中几乎是以无荧光态的螺酰胺形式存在，进而使其在细胞内偏酸环境的溶酶体中有少量的开环荧光态形式，可以实现细胞内溶酶体的近红外免洗成像的定位效果。除此之外，该类荧光染料还具有荧光态与暗态结构之间的可逆平衡，从而使得染料可以在酸性的溶酶体中自发闪烁的性能，实现细胞内溶酶体的免洗超分辨荧光成像。

本发明的内容在于提供一类基于罗丹明700母体的溶酶体荧光探针，具有长波长、信噪比高等优势。本发明的内容在于提供一类基于罗丹明700母体的溶酶体荧光探针，其羧基通过2-氨基吡啶衍生物修饰，具有在酸性条件下部分开环形成荧光态性质，可用于STORM超分辨成像。

本发明的内容提供一类基于罗丹明700母体的溶酶体超分辨荧光探针的合成方法，该方法具有原料价格低廉、制备方法简便等特点。

本发明提供一类具有分子内开关性质的溶酶体超分辨成像染料，其以罗丹明700为母体，羧基位置引入2-氨基吡啶衍生物，具体的化学结构如下：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄中若一个不为H，则其余取代基为H；具体为H、(CH₂CH₂)_nCH₃、COONH-R₅中的任何一种基团；R₅为(CH₂CH₂)_nCH₃、N,N-二甲胺基乙基、苄基嘌呤、2-吗啉基乙基。n是0-4之间的整数。

该溶酶体荧光探针以罗丹明700为母体，通过2-氨基吡啶衍生物的螺酰胺化修饰，使其在高亮度、长波长的罗丹明700基础上具有酸性条件下部分处于荧光态的开环性质。使其在细胞内酸性环境的溶酶体中部分开环，从而具有自闪性质，可以实现细胞内溶酶体的超分辨免洗成像。

一类基于罗丹明700的超分辨溶酶体荧光探针合成方法如下：

具体合成步骤如下：

称取罗丹明700溶于二氯乙烷溶液中，匀速搅拌下，再向其混合液中逐滴加入三氯氧磷，升温至80℃继续搅拌2-4h。停止搅拌，减压除去溶剂后得到绿色固体。将绿色固体溶于乙腈中，再向其反应体系中加入三乙胺和2-氨基吡啶衍生物，升温至80℃搅拌1-3h后，冷却至室温继续搅拌8-12h。减压除去溶剂后，残渣经碱性氧化铝(200-300目)柱层析，洗脱剂纯二氯甲烷得到白色固体。

罗丹明700与2-氨基吡啶衍生物的质量比为1：0.3-0.8；

三氯氧磷与二氯乙烷、乙腈、三乙胺的体积比为1:10-40:10-40:0.2-0.6；

罗丹明700与三氯氧磷的质量体积比为100-150:1(mg/mL)。

本发明提供了一类新型的具有高亮度、高稳定性的溶酶体超分辨成像荧光探针，可以应用于细胞溶酶体的共聚焦及STORM超分辨荧光成像。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1实施例1得到的溶酶体探针LysoSRMe-700的核磁氢谱

图2实施例1得到的溶酶体探针LysoSRMe-700的核磁碳谱

图3实施例1得到的溶酶体探针LysoSRMe-700的高分辨质谱

图4实施例1得到的溶酶体探针LysoSRMe-700的酸碱滴定荧光响应图

图5实施例1得到的溶酶体探针LysoSRMe-700的溶酶体STORM超分辨成像图；

图6为实施例1中染料LysoSRMe-700对单个溶酶体的超分辨成像图及强度分析图；

图7为实施例5中染料LysoSRNN-700对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的制备方法进行详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

溶酶体探针LysoSRMe-700的合成

称取60mg的罗丹明700溶于10mL的二氯乙烷溶液中，匀速搅拌下，再向其混合液中逐滴加入0.4mL的三氯氧磷，升温至80℃继续搅拌2h。停止搅拌，减压除去溶剂后得到绿色固体。将绿色固体溶于10mL的乙腈中，再向其反应体系中加入200μL的三乙胺和18mg 2-氨基-6-甲基吡啶，升温至80℃搅拌1h后，冷却至室温继续搅拌12h。减压除去溶剂后，残渣经碱性氧化铝(200-300目)柱层析，洗脱剂纯二氯甲烷得到白色固体35mg，产率58％。

其核磁氢谱如附图1所示，具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.95(d,J＝7.9Hz,2H),7.49(m,4H),7.26(d,J＝5.1Hz,1H),7.16(t,J＝7.1Hz,2H),6.83(t,J＝7.4Hz,1H),6.73(d,J＝7.5Hz,1H),6.58(d,J＝7.9Hz,1H),6.38(d,J＝8.7Hz,1H),6.33(d,J＝2.4Hz,1H),6.17(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),5.42(d,J＝12.6Hz,1H),3.66(q,J＝7.1Hz,2H),3.42–3.20(m,4H),2.43(m,2H),2.28–2.18(s,3H),1.75(s,3H),1.71(s,3H),1.58(m,4H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H),1.15(t,J＝6.9Hz,6H).

其核磁碳谱如附图2所示，具体数据如下：

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ168.13,156.32,155.31,153.21,151.81,150.15,148.32,146.91,144.63,139.05,137.05,133.10,131.44,128.13,127.67,127.55,123.78,123.26,121.60,120.97,118.99,118.66,118.36,113.14,108.51,107.45,105.49,105.37,99.99,97.76,91.85,68.75,45.44,44.32,36.69,29.71,28.18,25.34,23.80,23.24,22.67,22.25,12.58,11.02.

实施例1中得到的溶酶体探针LysoSRMe-700的高分辨质谱具体数据为：高分辨质谱理论值C₄₄H₄₇N₄O₂[M+H]⁺663.3699,实测值663.3694.

经检测，该化合物结构正确。

取本实施例得到的化合物LysoSRMe-700溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成2mM染料母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其在pH下的响应性质进行荧光检测。

LysoSRMe-700对pH响应的测试。取20μL母液置于4mL不同pH值的缓冲溶液中，配制成10μM的荧光探针测试液，而后直接用于测试不同pH条件下的荧光光谱。

实施例2

溶酶体探针LysoSREt-700的合成

称取60mg的罗丹明700溶于20mL的二氯乙烷溶液中，匀速搅拌下，再向其混合液中逐滴加入0.5mL的三氯氧磷，升温至80℃继续搅拌2h。停止搅拌，减压除去溶剂后得到绿色固体。将绿色固体溶于20mL的乙腈中，再向其反应体系中加入100μL的三乙胺和48mg 2-氨基-6-乙基吡啶，升温至80℃搅拌3h后，冷却至室温继续搅拌10h。减压除去溶剂后，残渣经碱性氧化铝(200-300目)柱层析，洗脱剂纯二氯甲烷得到白色固体33mg，产率51％。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.97(d,J＝7.9Hz,2H),7.50(m,4H),7.27(d,J＝5.1Hz,1H),7.20(t,J＝7.1Hz,2H),6.85(t,J＝7.4Hz,1H),6.73(d,J＝7.5Hz,1H),6.58(d,J＝7.9Hz,1H),6.38(d,J＝8.7Hz,1H),6.31(d,J＝2.4Hz,1H),6.21(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),5.41(d,J＝12.6Hz,1H),3.68(q,J＝7.1Hz,2H),3.40–3.17(m,6H),2.43(m,2H),2.28–2.11(s,3H),1.75(s,3H),1.71(s,3H),1.58(m,4H),1.23(m,J＝7.1Hz,6H),1.14(t,J＝6.9Hz,6H).

实施例2中得到的溶酶体探针LysoSREt-700的高分辨质谱具体数据为：高分辨质谱理论值C₄₅H₄₈N₄O₂[M+H]⁺677.3856,实测值677.3821.

经检测，该化合物结构正确。

实施例3

溶酶体探针LysoSRNH-700的合成

称取60mg的罗丹明700溶于5mL的二氯乙烷溶液中，匀速搅拌下，再向其混合液中逐滴加入0.5mL的三氯氧磷，升温至80℃继续搅拌3h。停止搅拌，减压除去溶剂后得到绿色固体。将绿色固体溶于5mL的乙腈中，再向其反应体系中加入300μL的三乙胺和40mg 2-氨基-6-甲胺酰基吡啶，升温至80℃搅拌1h后，冷却至室温继续搅拌8h。减压除去溶剂后，残渣经碱性氧化铝(200-300目)柱层析，洗脱剂纯二氯甲烷得到白色固体37mg，产率52％。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.95(d,J＝7.9Hz,2H),7.51(m,4H),7.26(d,J＝5.1Hz,1H),7.21(t,J＝7.1Hz,2H),6.81(t,J＝7.4Hz,1H),6.71(d,J＝7.5Hz,1H),6.60(d,J＝7.9Hz,1H),6.36(d,J＝8.7Hz,1H),6.31(d,J＝2.4Hz,1H),6.21(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),5.41(d,J＝12.6Hz,1H),3.68(q,J＝7.1Hz,2H),3.40–3.17(m,4H),2.85(d,3H),2.43(m,2H),2.28–2.11(s,3H),1.75(s,3H),1.71(s,3H),1.58(m,4H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H),1.14(t,J＝6.9Hz,6H).

实施例3中得到的溶酶体探针LysoSRNH-700的高分辨质谱具体数据为：高分辨质谱理论值C₄₅H₄₈N₅O₃[M+H]⁺706.3757,实测值706.3751.

经检测，该化合物结构正确。

实施例4

溶酶体探针LysoSRpM-700的合成

称取60mg的罗丹明700溶于10mL的二氯乙烷溶液中，匀速搅拌下，再向其混合液中逐滴加入0.5mL的三氯氧磷，升温至80℃继续搅拌4h。停止搅拌，减压除去溶剂后得到绿色固体。将绿色固体溶于10mL的乙腈中，再向其反应体系中加入200μL的三乙胺和52mg 2-氨基-6-甲胺酰基吡啶，升温至80℃搅拌2h后，冷却至室温继续搅拌10h。减压除去溶剂后，残渣经碱性氧化铝(200-300目)柱层析，洗脱剂纯二氯甲烷得到白色固体38mg，产率62％。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.94(d,J＝7.8Hz,2H),7.48(m,4H),7.29(d,J＝5.3Hz,1H),7.22(t,J＝7.2Hz,2H),6.84(d,J＝7.4Hz,1H),6.75(d,J＝7.7Hz,1H),6.60(d,J＝7.9Hz,1H),6.37(d,J＝8.8Hz,1H),6.32(d,J＝2.3Hz,1H),6.23(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),5.42(d,J＝12.5Hz,1H),3.71(q,J＝7.1Hz,2H),3.45–3.22(m,4H),2.86(d,3H),2.41(m,2H),2.27–2.12(s,3H),1.76(s,3H),1.72(s,3H),1.57(m,4H),1.22(t,J＝7.2Hz,3H),1.15(t,J＝7.1Hz,6H).

实施例3中得到的溶酶体探针LysoSRNH-700的高分辨质谱具体数据为：高分辨质谱理论值C₄₅H₄₈N₅O₃[M+H]⁺663.3699,实测值663.3705.

经检测，该化合物结构正确。

实施例5

溶酶体探针LysoSRNN-700的合成

称取60mg的罗丹明700溶于10mL的二氯乙烷溶液中，匀速搅拌下，再向其混合液中逐滴加入0.5mL的三氯氧磷，升温至80℃继续搅拌2h。停止搅拌，减压除去溶剂后得到绿色固体。将绿色固体溶于10mL的乙腈中，再向其反应体系中加入200μL的三乙胺和40mg 2-氨基4-(二甲氨基乙氨基)羰基吡啶，升温至80℃搅拌1h后，冷却至室温继续搅拌12h。减压除去溶剂后，残渣经碱性氧化铝(200-300目)柱层析，洗脱剂纯二氯甲烷得到白色固体14mg，产率20％。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.97(d,J＝8.1Hz,2H),7.54(m,4H),7.23(d,J＝5.0Hz,1H),7.19(t,J＝7.2Hz,2H),6.80(t,J＝7.3Hz,1H),6.74(d,J＝7.5Hz,1H),6.60(d,J＝7.9Hz,1H),6.35(d,J＝8.8Hz,1H),6.31(d,J＝2.4Hz,1H),6.22(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),5.42(d,J＝12.5Hz,1H),3.68(q,J＝7.2Hz,2H),3.40–3.17(m,4H),2.86(d,3H),2.45(m,2H),2.33(d,J＝8.2Hz,2H),2.28–2.11(m,5H),2.05(s,6H),1.74(s,3H),1.72(s,3H),1.58(m,4H),1.22(t,J＝6.9Hz,3H),1.13(t,J＝7.2Hz,6H).

实施例3中得到的溶酶体探针LysoSRNH-700的高分辨质谱具体数据为：高分辨质谱理论值C₄₅H₄₈N₅O₃[M+H]⁺763.4336,实测值763.4331.

经检测，该化合物结构正确。

实施例6

实施例1合成的荧光染料LysoSRMe-700在不同pH值下的荧光测试。取实施例1得到的溶酶体探针LysoSRMe-700配制成2mmol的DMSO母液，取20μL的母液加入到4mL不同pH缓冲液中(pH范围2-8)，测试其荧光曲线。

图3即溶酶体探针LysoSRMe-700在不同pH值下的荧光响应曲线，该探针在pH值4.5以上几乎完全处于闭环状态，未出现开环的荧光；而当pH值4.5以下，分子逐渐由无荧光的闭环结构变为开环的荧光结构。LysoSRMe-700的开环形式荧光最大发射峰位于742nm左右。随着pH值的逐渐降低，该探针进一步开环，荧光增强，pH值约在2.75左右荧光达到最强。随着进一步降低pH值，荧光开始降低。

实施例7

实施例1中合成的染料LysoSRMe-700对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。取0.5μL母液加入含1mL培养液的细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂下孵育1h，而后在超分辨显微镜下进行长时间荧光成像。

如下图5左侧所示，染料LysoSRMe-700能够对溶酶体进行精准的定位，并在长时间内跟踪溶酶体运动。

如下图5右侧所示，染料LysoSRMe-700对两个溶酶体进行精准的定位后长时间跟踪单个溶酶体的运动，发现其在第8s到40s之间运动了0.73μm。

如图6所示，(a)为染料LysoSRMe-700对单个溶酶体的超分辨成像；(b)为单个溶酶体的强度分析，可见染料LysoSRMe-700对单个溶酶体分辨率可达76nm。

实施例8

实施例5中合成的染料LysoSRNN-700对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。取0.5μL母液加入含1mL培养液的细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂下孵育1h，而后在超分辨显微镜下进行长时间荧光成像。

如图7所示，染料LysoSRNN-700能够对溶酶体进行精准的定位，并在长时间内跟踪溶酶体运动，可清晰看到溶酶体分布。

Claims (8)

1.一类用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料，其特征在于，其结构式具体如下：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄中若一个不为H，则其余取代基为H；具体为H、(CH₂CH₂)_nCH₃、COONH-R₅中的任何一种基团；R₅为(CH₂CH₂)_nCH₃、N,N-二甲胺基乙基、苄基嘌呤、2-吗啉基乙基；n是0-4之间的整数。

2.根据权利要求1所述的用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料，其特征在于，该类荧光染料通过2-氨基吡啶衍生物对罗丹明700的羧酸位置进行修饰得到。

3.一种如权利要求1所述的用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料的制备方法，其特征在于，该类荧光染料通过2-氨基吡啶衍生物对罗丹明700的羧酸位置进行修饰得到。

4.如权利要求3所述的用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料的制备方法，其特征在于，该方法按如下步骤进行：

称取罗丹明700溶于二氯乙烷溶液中，匀速搅拌下，再向其混合液中逐滴加入三氯氧磷，升温至80℃继续搅拌2-4h；停止搅拌，减压除去溶剂后得到绿色固体；将绿色固体溶于乙腈中，再向其反应体系中加入三乙胺和2-氨基吡啶衍生物，升温至80℃搅拌1-3h后，冷却至室温继续搅拌8-12h；减压除去溶剂后，残渣经碱性氧化铝(200-300目)柱层析，洗脱剂纯二氯甲烷得到白色固体。

5.如权利要求4所述的用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料的合成方法，其特征在于，罗丹明700与2-氨基吡啶衍生物的质量比为1：0.3-0.8。

6.如权利要求4所述的用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料的合成方法，其特征在于，所述三氯氧磷与二氯乙烷、乙腈、三乙胺的体积比为1:10-40:10-40:0.2-0.6。

7.如权利要求4所述的用于溶酶体超分辨成像的近红外荧光染料的合成方法，其特征在于，所述罗丹明700与三氯氧磷的质量体积比为100-150:1(mg/mL)。

8.一种如权利要求1所述的用于细胞内溶酶体动态的超分辨自闪荧光染料在荧光成像及开关材料领域的应用。

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