CN108410203B - 基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料及其制备方法和应用 - Google Patents

基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料以及该染料的制备方法。所述聚集诱导发光染料具有式Ⅰ所示结构。另外，本发明还提供了所述荧光染料对线粒体荧光标记的应用。测试表明，本发明提供的聚集诱导发光染料具有近红外发射、斯托克斯位移大、光稳定性强、细胞毒性小以及水溶性好等诸多优点，能够实现对线粒体的长时间示踪和三维可视化成像。
Figure DDA0001603962170000011

Description

基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染 料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于精细化工技术领域，具体涉及一类基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料及其制备方法和线粒体荧光标记应用。
背景技术
线粒体是一种存在于大多数真核细胞中具有双层膜结构的细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，通过氧化磷酸化作用为细胞新陈代谢活动提供能量，被称为细胞的“能量工厂”。线粒体在不同类型的细胞中表现出不同的形态，有时呈线状，有时呈颗粒状，其形态会随着代谢条件、发育阶段、以及环境刺激不同而发生改变，还可以发生分裂和融合过程，以适应细胞中正常的生理功能。相关研究表明，细胞中线粒体形貌的急剧变化(例如呈现碎裂化状态)以及线粒体数目和功能异常与多种神经退行性疾病、糖尿病、以及肿瘤密切相关(Cell Death Differ.,2003,10,870)。因此，实时观察线粒体的形态、数量以及运动状态对相关疾病的诊断和治疗具有非常重要的意义。
荧光成像技术由于其具有时空分辨率高、实时监控、以及操作简便等优点，被广泛运用于生物医学成像领域。目前，对线粒体的生物学评价主要使用一些阳离子型荧光染料(例如Rhodamine 123、JC-1、MitoTracker等)对线粒体进行染色，结合激光共聚焦显微镜等平台，通过染料发出的荧光信号，对线粒体数目、形貌、运动状态、以及膜电位(ΔΨm)进行观察和研究(Proc.Natl.Acad.Sci.,1991,88,3671；Microsc.Res.Tech.,1994,27,198)。
然而，现有线粒体荧光标记染料的发射波长较短(主要位于400-600nm区间)、斯托克斯位移小、以及光稳定性差，导致其成像时背景荧光干扰大，并且容易发生光漂白，很难实现对线粒体的长时间示踪(Proc.Natl.Acad.Sci.,1980,77,990；J.Am.Chem.Soc.,2013,135,62)；特别是，大多数商业线粒体靶向荧光探针由于其本身具有聚集荧光淬灭(aggregation-caused quenching,ACQ)现象，未能提供关于线粒体数目、形貌以及运动状态的真实信息，进一步限制其在水相环境中对线粒体的实时成像与示踪。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明首要目的在于提供一类基于聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料。该类荧光染料以三苯基膦结构单元为线粒体特异性靶向基团，具有发射波长长(位于近红外区域)、斯托克斯位移大、光稳定性强、细胞毒性小以及水溶性好等诸多优点，结合激光共聚焦显微镜，能够实现对线粒体的长时间示踪和实时三维可视化成像，从而提供关于线粒体数目、形态、以及运动状态的真实信息。
本发明还提供了上述基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料的制备方法。
本发明另一目的在于提供了上述基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料用于细胞中线粒体荧光标记的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一方面，本发明所述基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料，其结构为式Ⅰ所示：
Figure BDA0001603962150000021
式Ⅰ中，
R1、R2分别独立选自：氰基(-CN)和式Ⅱ所示基团(其中曲线标记处为取代位，下同)中的任意一种；
R3独立选自：C1～C12的烃基、苯基或对乙酰氨基取代苯基中的任意一种；
Figure BDA0001603962150000022
R4和R5是氢(-H)、氮杂环丁基、以及式Ⅲ所示基团中的任意一种与式Ⅳ所示基团的组合，并且在组合中，式Ⅳ所示基团可以是R4或者是R5，其中，R6分别独立选自：-H或C1～C4烷基中任意一种，n为1-6的整数。
另一方面，本发明还提供了一种上述基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料的制备方法，其主要步骤包括：在碱性催化剂(三乙胺)条件下，由式Ⅴ所示结构的化合物与式Ⅵ所示结构的化合物于有机溶剂(乙醇)中回流反应1～2小时，经Knoevenagel缩合生成式Ⅰ所示结构的荧光染料。
Figure BDA0001603962150000031
其中，R1～R5取代基与前文所述相同。
在本发明一个优选的技术方案中：
R1、R2分别独立选自：氰基(-CN)和式Ⅱ所示基团中的一种；
R3为C1～C12的直链或支链烷基、炔丙基、以及苯基或对乙酰氨基取代苯基中的任意一种；
R4和R5是氢(-H)、氮杂环丁基、以及式Ⅲ所示基团中的任意一种与式Ⅳ所示基团的组合，并且在组合中，式Ⅳ所示基团可以是R4或者是R5，其中，R6分别独立选自：-H或C1～C4烷基中任意一种，n为1-6的整数。
进一步优选的R1为式Ⅱ所示基团；
进一步优选的R2为式-CN；
进一步优选的R3为正十二烷基、炔丙基、以及苯基的任意一种；
进一步优选的R4和R5是氢(-H)和式Ⅲ所示基团中的一种与式Ⅳ所示基团的组合，并且在组合中，式Ⅳ所示基团可以是R4或者是R5，其中，R6为C1～C4烷基中一种，n为1-6的整数。
更进一步优选的R3为炔丙基、苯基中的一种；
更进一步优选的R4和R5是式Ⅲ所示基团与式Ⅳ所示基团的组合，并且在组合中，式Ⅳ所示基团可以是R4或者是R5，其中，R6为C1～C4烷基中一种，n为4。
再更进一步优选的R3为苯基；
再更进一步优选的R4为式Ⅳ所示基团，其中，n为4；
再更进一步优选的R5为式Ⅲ所示基团，其中R6为乙基。
本发明的基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料用于细胞中线粒体荧光标记的应用。
附图说明
图1.染料I-7(浓度为10-5mol·L-1)在聚集态的吸收和荧光光谱图；
其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为归一化吸光度或荧光强度。
图2.染料I-7与商业化染料Mitotracker Green在相同激光强度下光稳定性曲线。
图3.染料I-7细胞毒性表征。
图4.染料I-7与商业化染料Mitotracker Green在宫颈癌细胞(Hela细胞)中对线粒体荧光示踪图。
其中，图4(a)为Mitotracker Green染色的Hela细胞图片；图4(b)为I-7染色的Hela细胞图片；图4(c)为Mitotracker Green和I-7染色的Hela细胞叠加图。
图5.染料I-7与商业化染料Mitotracker Green在人肺癌细胞(A549细胞)中对线粒体荧光示踪图。
其中，图5(a)为Mitotracker Green染色的A549细胞图片；图5(b)为I-7染色的A549细胞图片；图5(c)为Mitotracker Green和I-7染色的A549细胞叠加图。
图6.染料I-7与商业化染料Mitotracker Green在人肝细胞(QSG 7701细胞)中对线粒体荧光示踪图。
其中，图6(a)为Mitotracker Green染色的QSG 7701细胞图片；图6(b)为I-7染色的QSG 7701细胞图片；图6(c)为Mitotracker Green和I-7染色的QSG 7701细胞叠加图。
图7.染料I-7与商业化染料Mitotracker Green在Hela细胞中对线粒体三维荧光成像图。其中，图7(a)为Mitotracker Green染色的Hela细胞图片；图7(b)为I-7染色的Hela细胞图片；图7(c)为Mitotracker Green和I-7染色的Hela细胞叠加图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围：
实施例1
(1)染料I-1的合成：
Figure BDA0001603962150000051
在50mL圆底烧瓶中，分别加入2-(1-十二烷基-2,6-二甲基吡啶-4(1H)-亚基)丙二腈(350mg，1.03mmol，化合物V-1)、乙醇(20mL)、(2-(2-甲酰基苯氧基)乙基)三苯基溴化膦(1.52g，3.09mmol，化合物VI-1)，三乙胺1.0mL，氩气保护下，回流反应1h。冷却，通过减压旋蒸，除去溶剂，柱层析(DCM：EA：MeOH＝4：3：2,v/v/v)，得到固体630mg(染料I-1)，产率为47.6％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.84(m,24H,phenyl-H),7.63-7.59(m,6H,phenyl-H),7.38-7.30(m,4H,phenyl-H),7.15(t,J＝10.2Hz,4H,phenyl-H),7.03-7.01(d,J＝8.0Hz,2H,alkene-H),7.17(t,J＝15.0Hz,2H,alkene-H),6.48-6.44(d,J＝16.0Hz,2H,alkene-H),4.05-3.96(m,6H,-CH2-),3.66(t,J＝14.8Hz,4H,-CH2-),1.43-1.26(m,20H,-CH2-),0.88(t,J＝8.0Hz,3H,-CH3).
Mass spectrometry(ESI-MS,m/z):[M-2Br]2+calcd for C76H77N3O2P2 2+:562.7740；found:562.7735.
(2)染料I-2的合成：
Figure BDA0001603962150000061
在50mL圆底烧瓶中，分别加入3-(2,6-二甲基-1-(丙-2-炔-1-基)吡啶-4(1H)-亚基)-2-苯基丙-1-烯-1,1,3-三腈(300mg，0.89mmol，化合物V-2)、乙醇(20mL)、(2-(4-甲酰基苯氧基)乙基)三苯基溴化膦(1.31g，2.67mmol，VI-2)，三乙胺1.0mL，氩气保护下，回流反应1h。冷却，通过减压旋蒸，除去溶剂，柱层析(DCM：EA：MeOH＝5：1：2(v/v/v)，得到固体570mg(染料I-2)，产率为50.0％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.68-7.65(m,22H,phenyl-H),7.63-7.56(m,15H,phenyl-H),7.18-7.16(d,J＝5.6Hz,2H,phenyl-H),6.95-6.93(d,J＝8.8Hz,4H,phenyl-H),6.30-6.28(dd,J＝8.8Hz,2H,alkene-H),6.09(s,2H,alkene-H),6.04-6.00(d,J＝15.6Hz,2H,alkene-H),4.00(s,4H,-CH2-),3.65(t,J＝17.6Hz,4H,-CH2-),3.39-3.37(s,2H,-CH2-),2.44(s,1H,alkyne-H).
Mass spectrometry(ESI-MS,m/z):[M-2Br]2+calcd for C76H60N4O2P2 2+:561.2090；found:561.2096.
(3)染料I-3的合成：
Figure BDA0001603962150000071
在50mL圆底烧瓶中，分别加入3-(2,6-二甲基-1-苯基吡啶-4(1H)-亚基)-2-苯基丙-1-烯-1,1,3-三腈(360mg，0.96mmol，化合物V-3)、乙醇(20mL)、(4-(4-甲酰基苯氧基)丁基)三苯基溴化膦(1.49g，2.88mmol，化合物VI-3)，三乙胺1.0mL，氩气保护下，回流反应2h。冷却，通过减压旋蒸，除去溶剂，柱层析(DCM：EA：MeOH＝5：3：2,v/v/v)，得到固体720mg(染料I-3)，产率为54.5％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.92-7.50(m,40H,phenyl-H),7.21(t,J＝9.4Hz,6H,phenyl-H),6.95(t,J＝14.0Hz,2H,phenyl-H),6.89-6.87(d,J＝8.0Hz,4H,alkene-H),6.15-6.11(d,J＝16.0Hz,2H,alkene-H),4.06(t,J＝6.2Hz,4H,-CH2-),3.65(t,J＝14.8Hz,4H,-CH2-),1.93-1.85(m,4H,-CH2-),1.70(t,J＝7.4Hz,4H,-CH2-).
Mass spectrometry(ESI-MS,m/z):[M-2Br]2+calcd for C83H70N4O2P2 2+:608.2482；found:608.2453.
(4)染料I-4的合成：
Figure BDA0001603962150000072
在50mL圆底烧瓶中，分别加入3-(2,6-二甲基-1-苯基吡啶-4(1H)-亚基)-2-苯基丙-1-烯-1,1,3-三腈(320mg，0.86mmol，化合物V-4)、乙醇(20mL)、(4-(5-(氮杂环丁烷-1-基)-2-甲酰基苯氧基)丁基)三苯基溴化膦(1.48g，2.58mmol，化合物VI-4)，三乙胺1.0mL，氩气保护下，回流反应2h。冷却，通过减压旋蒸，除去溶剂，柱层析(DCM：EA：MeOH＝5：3：1,v/v/v)，得到固体590mg(染料I-4)，产率为46.2％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.68-7.65(m,20H,phenyl-H),7.63-7.56(m,20H,phenyl-H),7.18-7.16(d,J＝5.6Hz,2H,phenyl-H),6.95-6.93(d,J＝8.8Hz,4H,phenyl-H),6.30-6.28(dd,J＝8.8Hz,2H,alkene-H),6.09(s,2H,alkene-H),6.04-6.00(d,J＝15.6Hz,2H,alkene-H),4.00(t,,4H,-CH2-),3.86(t,J＝8.0Hz,8H,-CH2-),3.65(t,J＝17.6Hz,4H,-CH2-),2.31(m,4H,-CH2-),1.71-1.70(d,J＝5.6Hz,4H,-CH2-),1.63-1.61(d,J＝6.8Hz,4H,-CH2-).
Mass spectrometry(ESI-MS,m/z):[M-2Br]2+calcd for C89H80N6O2P2 2+:663.2904；found:663.2906.
(5)染料I-5的合成：
Figure BDA0001603962150000081
在50mL圆底烧瓶中，分别加入3-(2,6-二甲基-1-苯基吡啶-4(1H)-亚基)-2-苯基丙-1-烯-1,1,3-三腈(300mg，0.80mmol，化合物V-5)、乙醇(20mL)、(6-(2-甲酰基苯氧基)己基)三苯基溴化膦(1.31g，2.40mmol，化合物VI-5)，三乙胺1.0mL，氩气保护下，回流反应2h。冷却，通过减压旋蒸，除去溶剂，柱层析(DCM：EA：MeOH＝5：4：1,v/v/v)，得到固体560mg(染料I-5)，产率为48.9％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.85(m,24H,phenyl-H),7.71-7.68(m,10H,phenyl-H),7.65-7.62(m,6H,phenyl-H),7.38-7.29(m,4H,phenyl-H),7.15(t,J＝10.2Hz,4H,phenyl-H),7.04-7.02(d,J＝8.0Hz,2H,alkene-H),7.16(t,J＝15.0Hz,2H,alkene-H),6.48-6.44(d,J＝16.0Hz,2H,alkene-H),4.03(t,J＝6.0Hz,4H,-CH2-),3.66(t,J＝14.8Hz,4H,-CH2-),1.73(m,8H,-CH2-),1.62(m,8H,-CH2-).
Mass spectrometry(ESI-MS,m/z):[M-2Br]2+calcd for C87H78N4O2P2 2+:636.2795；found:636.2798.
(6)染料I-6的合成：
Figure BDA0001603962150000091
在50mL圆底烧瓶中，分别加入N-(4-(2,6-二甲基-4-(1,3,3-三亚甲基-2-苯基亚乙烯基)吡啶-1(4H)-基)苯基)乙酰胺(340mg，0.79mmol，化合物V-6)、乙醇(20mL)、(6-(2-甲酰基苯氧基)己基)三苯基溴化膦(1.23g，2.37mmol，化合物VI-6)，三乙胺1.0mL，氩气保护下，回流反应2h。冷却，通过减压旋蒸，除去溶剂，柱层析(DCM：EA：MeOH＝5：2：1,v/v/v)，得到固体620mg(染料I-6)，产率为54.8％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ10.16(s,1H,-NH-),7.87(m,24H,phenyl-H),7.73-7.68(m,9H,phenyl-H),7.66-7.61(m,6H,phenyl-H),7.37-7.29(m,4H,phenyl-H),7.17(t,J＝10.2Hz,4H,phenyl-H),7.04-7.02(d,J＝8.0Hz,2H,alkene-H),7.17(t,J＝15.0Hz,2H,alkene-H),6.48-6.44(d,J＝16.0Hz,2H,alkene-H),4.03(t,J＝6.0Hz,4H,-CH2-),3.66(t,J＝14.8Hz,4H,-CH2-),2.03(s,3H,-CH3),1.76(t,J＝6.3Hz,4H,-CH2-),1.63(t,J＝7.1Hz,4H,-CH2-).
Mass spectrometry(ESI-MS,m/z):[M-2Br]2+calcd for C85H73N5O3P2 2+:636.7589；found:636.7587.
(7)染料I-7的合成：
Figure BDA0001603962150000101
在50mL圆底烧瓶中，分别加入3-(2,6-二甲基-1-苯基吡啶-4(1H)-亚基)-2-苯基丙-1-烯-1,1,3-三腈(300mg，0.80mmol，化合物V-7)、乙醇(20mL)、(4-(5-(二乙基氨基)-2-甲酰基苯氧基)丁基)三苯基溴化膦(1.42g，2.40mmol，化合物VI-7)，三乙胺1.0mL，氩气保护下，回流反应2h。冷却，通过减压旋蒸，除去溶剂，柱层析(DCM：EA：MeOH＝5：2：3,v/v/v)，得到固体650mg(染料I-7)，产率为53.5％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.68-7.65(m,20H,phenyl-H),7.63-7.56(m,20H,phenyl-H),7.18-7.16(d,J＝5.6Hz,2H,phenyl-H),6.95-6.93(d,J＝8.8Hz,4H,phenyl-H),6.30-6.28(dd,J＝8.8Hz,2H,alkene-H),6.09(s,2H,alkene-H),6.04-6.00(d,J＝15.6Hz,2H,alkene-H),4.00(s,4H,-CH2-),3.65(t,J＝17.6Hz,4H,-CH2-),3.39-3.37(d,J＝6.8Hz,8H,-CH2-),1.71-1.70(d,J＝5.6Hz,4H,-CH2-),1.63-1.61(d,J＝6.8Hz,4H,-CH2-),1.09(t,J＝7.0Hz,12H,-CH3).
Mass spectrometry(ESI-MS,m/z):[M-2Br]2+calcd for C91H88N6O2P2 2+:679.3217；found:679.3201.
实施例2
染料I-7在聚集态的吸收和荧光光谱
取实施例1制备的染料I-7溶于分析纯二甲基亚砜中，制成1.0×10-2M的储备液。然后制备四氢呋喃(THF)含量为99％的THF/水混合溶剂2mL。取2μL上述储备液加入到已制备的THF/水混合溶剂中，混合均匀后转移至光学石英比色皿(10×10mm)中测试其吸收和荧光光谱。如图1所示，染料I-7在350-650nm表现出宽吸收峰，且最大吸收波长位于在520nm；以520nm作为激发波长，染料I-7的最大发射峰大约位于685nm处位于近红外区域，斯托克斯位移达到165nm；并且染料I-7在混合溶剂中聚集导致其荧光增强，具有典型的聚集荧光增强特性。
实施例3
染料I-7光稳定性测试
光稳定性是评价染料在长时间成像等实际应用中重要的性能指标之一。我们对染料进行连续光照然后监测其荧光强度的方法来评价染料的光稳定性，同时选取商业化染料Mitotracker Green作为参比染料。如图2所示，随着光照时间增长，Mitotracker Green荧光强度急剧下降，当光照6min左右时，Mitotracker Green产生严重的光漂白，表明其光稳定性差；然而，在相同光照条件下，染料I-7荧光强度缓慢下降，当光照时间达到15min时，其荧光强度为初始荧光强度的75％，表明染料I-7具有优异的光稳定性。
实施例4
染料I-7细胞毒性测试
我们采用标准的MTT方法测试聚集诱导发光染料I-7的细胞毒性。具体实验步骤如下：首先将HeLa细胞铺到96孔板中，细胞密度为1×104细胞/孔，并在细胞培养箱中培养过夜。不同浓度的染料I-7(1-10μM，100μL/孔)分别加入到不同的孔中，培养基稀释的DMSO(0.5％，100μL/孔)作为阴性对照组。细胞在细胞培养箱中培养24h，然后在每孔中加入10μLMTT溶液(5mg/mL)。孵育4小时后，除去96孔板中的液体，并加入DMSO(100μL/孔)，最后用酶标仪进行测定。由图3中细胞毒性数据所示，当染料I-7的浓度增大到15μM时，细胞存活率大约为93％，表明染料I-7的细胞毒性很低。
实施例5
染料I-7对不同细胞中线粒体的荧光标记
为了研究染料I-7对不同细胞的线粒体是否具有荧光标记能力，我们选取了肿瘤细胞(HeLa细胞、A549细胞)和正常细胞(QSG 7701细胞)作为细胞模型，同时选取商业化染料Mitotracker Green作为参比染料。具体实验步骤如下：取实施例2中染料I-7储备液或者Mitotracker Green储备液(1.0×10-3M)加入到育有细胞的培养液中在细胞培养箱中孵育0.5h(染料I-7最终浓度为5μM，染料Mitotracker Green最终浓度为200nM)，再用共聚焦显微镜进行细胞成像。成像结果如图4、图5、图6所示，发现染料I-7能够清楚地对线粒体进行荧光标记，这是由于染料I-7具有线粒体特异性靶向的三苯基膦基团；相比于染料Mitotracker Green，染料I-7具有更好的灵敏度和信噪比，并且染料I-7对正常细胞和肿瘤细胞都具有线粒体示踪能力。
实施例6
染料I-7对线粒体的三维荧光成像
基于染料I-7具有近红外、大斯托克斯位移、光稳定等优点，我们进一步探究其对细胞中线粒体的三维荧光成像能力。如图7所示，相比于商业化染料Mitotracker Green，染料I-7对细胞中线粒体三维成像图具有更好的分辨率和信噪比，能够更直接地提供关于线粒体的真实信息。

Claims (7)

1.基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料，其结构如式Ⅰ所示：
Figure FDA0002462769120000011
式Ⅰ中，
R1、R2分别独立选自：氰基(-CN)和式Ⅱ所示基团(其中曲线标记处为取代位，下同)中的任意一种；
R3为炔丙基、苯基中的一种；
Figure FDA0002462769120000012
R4和R5是氢(-H)、氮杂环丁基、以及式Ⅲ所示基团中的任意一种与式Ⅳ所示基团的组合，并且在组合中，式Ⅳ所示基团是R4或者是R5；
所述R6为C1～C4烷基中一种，n为4。
2.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料，其特征在于，所述R3为苯基。
3.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料，其特征在于，所述R4为式Ⅳ所示基团，其中，n为4。
4.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料，其特征在于，所述R5为式Ⅲ所示基团，其中R6为乙基。
5.一种如权利要求1所述的基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料制备方法，其特征在于，步骤如下：
在碱性催化剂的三乙胺条件下，由式Ⅴ所示结构的化合物与式Ⅵ所示结构的化合物于乙醇有机溶剂中回流反应1～2小时，经Knoevenagel缩合生成如权利要求1所述的式Ⅰ所示结构的荧光染料；
Figure FDA0002462769120000021
其中，式中：
R1、R2分别独立选自：氰基(-CN)和式Ⅱ所示基团中的任意一种；
Figure FDA0002462769120000022
R4和R5是氢(-H)、氮杂环丁基、以及式Ⅲ所示基团中的任意一种与式Ⅳ所示基团的组合，并且在组合中，式Ⅳ所示基团是R4或者是R5；
所述R3为炔丙基、苯基中的一种；
所述R6为C1～C4烷基中一种，n为4。
6.根据权利要求5所述的基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料制备方法，其特征在于，所述步骤中将1当量的式Ⅴ所示结构的化合物与3当量的式Ⅵ所示结构的化合物溶于乙醇中，三乙胺作为催化剂，回流条件下反应1～2h；反应结束后，硅胶柱层析分离得到式Ⅰ所示结构的荧光染料。
7.根据权利要求1至4任一项所述一种基于聚集诱导发光近红外、大斯托克斯位移、光稳定的荧光染料用于细胞中线粒体荧光标记的应用，实现对线粒体的长时间示踪和实时三维可视化成像。
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