CN107033283A - 一种近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物及其制备方法及应用 - Google Patents

一种近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物及其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物及其制备方法及应用，通过化合物名称为聚(2Z,2’Z)‑3,3’‑(2,5‑二(二苯胺基)‑1,4‑苯基)二(2‑(3,5‑二(三氟甲基)苯基)丙烯腈‑共聚(N‑(2‑羟丙基)甲基丙烯酰胺)‑共聚(甲基丙烯酸‑2‑氨基乙酯)的聚合物，和一种无机上转换纳米粒子，化合物名称为镱铥共掺杂的氟化钇钠；在水溶液中，二者制备的纳米光敏剂，在波长980nm的激光照射下产生活性氧，可有效杀死细胞。为以后的肿瘤细胞的光动力治疗的研究和应用提供了一种新型高效的纳米光敏剂材料。

Description

一种近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物及其制备方法 及应用
技术领域
本发明涉及基于荧光光敏剂的光动力治疗技术，特别是一种近红外激光驱动、高聚集态发光、线粒体靶向的有机荧光聚合物包覆无机上转换纳米粒子的纳米光敏剂的制备方法。
背景技术
光动力疗法又称光敏疗法、光化学疗法，是20世纪70年代末开始形成的一种肿瘤治疗新技术。光动力疗法是将特定波长的激光照射，使组织吸收的光敏剂受到激发，而激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。目前在不少国家已经获得国家政府相关部门的正式批准，成为治疗肿瘤的一项常规手段。这是一种有氧分子参与的伴随生物效应的光敏化反应，是现代肿瘤微创领域的最新进展。通过临床观察，该项技术具有创伤小、毒性低、选择性好、可重复治疗、可姑息治疗、可协同手术提高疗效、可消灭隐性癌病灶、可保护容貌及重要器官功能、治疗肿瘤范围较广等特点，尤其适宜年老体弱、不堪手术或其他治疗的病人，如膀胱癌、食管癌、支气管癌、皮肤癌、鼻咽癌、喉癌等。
与肿瘤传统手术、化疗和放疗方法相比，光动力治疗的优点是能选择性地消灭局部的原发和复发肿瘤，而不伤及正常组织；可与化疗和放疗同时进行，且均具有一定的协同作用；可缩小手术的范围和改善患者的愈后。光动力治疗已成为肿瘤防治研究中的一个十分活跃的领域。近年来美国的FDA、日本、荷兰和加拿大等国的卫生部门已相继确认了这一肿瘤新疗法的治疗标准，结合食管癌支架的疗法已被美国综合癌症网络作为晚期食管癌的首选方法；而且，随着半导体激光器研发和临床广泛应用，使光动力治疗进入新的阶段，在国内也逐渐成为新的研究热点。
光动力治疗是在光敏剂参与下，在光的作用下，使有机体细胞或生物分子发生机能或形态变化，严重时导致细胞损伤和坏死作用，而这种作用必须有氧的参与，所以又称光敏化-氧化作用，在化学上称这种作用为光敏化作用，在生物学及医学上称之为光动力作用，用光动力作用治病的方法，称为光动力疗法。光动力疗法是以光、光敏剂和氧的相互作用为基础的一种新的疾病治疗手段，光敏剂(光动力治疗药物)的研究是影响光动力治疗前景的关键所在。光敏剂是一些特殊的化学物质，其基本作用是传递能量，它能够吸收光子而被激发，又将吸收的光能迅速传递给另一组分的分子，使其被激发而光敏剂本身回到基态。但是传统的光敏剂寿命短、扩散范围小，易聚集诱导淬灭效应，并且激发光大多为具有浅的组织透过性的紫外光或可见光。因此，研究具有近红外激光(高的组织透射深度)激发特性和高效的聚集态光敏剂的光动力治疗在癌症治疗方面的应用具有重要意义。
聚集诱导发光(aggregation-induced emissionAIE)现象是生色团聚集时发生的另一种光学现象。2001年，唐本忠院士课题组首先发现了AIE现象(Chem.Commun.2001,1740)。在AIE进程中，发光体由于聚集而发射荧光，具有AIE性质的发光体被称之为AIEgens。他们发现1-甲基-1,2,3,4,5-五苯基噻咯(MPPS)在完全溶于溶液中时，基本没有荧光发射，而聚集态或固态表现出非常强的荧光发射，因此提出了“聚集诱导发光”的概念。AIE分子在聚集态或固态条件下优异的发光性质，为彻底解决传统有机荧光材料的荧光自淬灭问题提供了一个全新的途径。此后，国内外众多研究者对于AIE现象进行了深入的研究探索，利用AIE分子构筑新型化学/生物荧光探针的研究已成为研究热点，并且取得一些颇有意义的研究成果。在荧光生物成像方面，利用AIE分子构筑的荧光标记材料不仅解决了传统荧光分子的聚集荧光淬灭问题，并且通过增加荧光分子负载浓度的方法，可以极大地提高荧光标记材料的荧光强度和抗光漂白能力。在光动力治疗方面，发展新型近红外发光，荧光量子效率高的AIE分子将其用于恶性肿瘤的光敏剂，能够减小生物组织的背景干扰，提高荧光成像的信号强度和信噪比，增强有毒的活性氧产生，提高光动力治疗效果。
上转换纳米材料因其量子产率高、发光性能稳定、生物毒性低、高的组织透射深度等一系列优良性能，受到广泛的研究。在近红外光激发下，上转换纳米粒子能发射紫外光或可见光。与下转换材料相比，上转换材料具有许多优点，包括对生物体光学损害低，降低生物体自发荧光的影响，高的检测灵敏度，高的组织透射深度。因此，上转换材料在生物学应用方面有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种高聚集态荧光发射的荧光聚合物及其制备方法，同时公开了该聚合物的用途，该光敏剂具有聚集诱导发光特性和肿瘤亚细胞器靶向性的优点，在水溶液中包覆无机上转换材料，所制备的荧光纳米粒子可在近红外激光照射下产生活性氧进行光动力治疗，并且荧光纳米粒子发射的深红/近红外光能进行生物细胞成像，其发光亮度高、生物相容性好、光动力学治疗效果好。
本发明的技术方案：
一种近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物，化合物名称为聚(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二(二苯胺基)-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈-共聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)-共聚(甲基丙烯酸-2-氨基乙酯)的聚合物(简称PAIE-TPP)，在波长为365nm的紫外灯照射下发出红色荧光，该化合物PAIE-TPP的分子结构式为：
一种近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物的制备方法，步骤如下：
1)将1,4-二溴-2,5-二甲醛基苯、3,5-二(三氟甲基)苯乙腈与无水乙醇均匀混合，得到混合液；
2)将NaOH溶解于无水乙醇中，得到NaOH-乙醇溶液；
3)在N2保护下将NaOH-乙醇溶液滴加到混合液中，室温下搅拌反应1小时，冷却至室温后过滤，将所得固体用水、乙醇交替清洗三次，干燥后用氯仿重结晶，得到黄色晶体(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈；
4)将4-羟基二苯胺、3,4-二氢-2H-吡喃溶解于干燥的二氯甲烷中，向体系中加入吡啶对甲苯磺酸盐，室温下反应12小时；
5)混合物用5％的氢氧化钠溶液洗，最后用水萃取，所得有机相除去溶剂后通过硅胶层析柱进行提纯，石油醚/乙酸乙酯(v/v＝10/1)作为洗脱剂。得到白色固体N-苯基-4–((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯胺；
6)将(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈、2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、三(二亚苄基丙酮)二钯、磷酸钾和N-苯基-4–((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯胺均匀混合，在N2保护下逐滴加入甲苯，110℃下回流24小时，得到反应液；
7)待体系冷却后，加入氯仿，用水萃取三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，粗产物通过硅胶层析柱进行提纯，石油醚/二氯甲烷(v/v＝1/1)作为洗脱剂，之后用氯仿/乙醇重结晶得到红色固体3；
8)化合物3溶解于四氢呋喃中，再加入甲醇和2N盐酸水溶液混合物，于室温下反应12小时；
9)反应结束后，除去溶剂，粗产物通过硅胶层析柱进行提纯，石油醚/乙酸乙酯(v/v＝5/1)作为洗脱剂。得到紫红色固体4；
10)将化合物4溶解在DMF中，加入碳酸钾，在搅拌的状态下逐滴加入碘乙烷，混合溶液在60℃下反应12小时；
11)反应结束后，过滤除去反应体系内的沉淀，得到滤液，旋干后通过硅胶层析柱进行提纯，石油醚/乙酸乙酯(v/v＝5/1)作为洗脱剂，得到红色固体5；
12)将化合物5溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，在0℃下逐滴滴加甲基丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，半小时后于室温反应12小时；
13)反应结束后，过滤除去反应体系内的沉淀，得到滤液，旋干后通过硅胶层析柱进行提纯，石油醚/乙酸乙酯(v/v＝10/1)作为洗脱剂，得到红色固体AIEM；
14)N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(简称HPMA)，甲基丙烯酸-2-氨基乙酯(简称AEMA)，AIEM和AIBN溶解于DMF中，混合溶液通过三次冷冻-抽真空过程除去体系内的氧气，在氮气保护下65℃聚合24小时；
15)反应结束后，产物用截留分子量3500DaMw透析袋对水透析20小时，继续用乙醇透析4小时，除去溶剂后，真空干燥24小时得聚合物PAIE；
16)将双(2-溴乙基)醚和三苯基膦溶于乙腈中，混合溶液回流12小时，待反应结束后冷却至室温，除去溶剂后用二氯甲烷/乙酸乙酯重结晶得到白色固体6；
17)将聚合物PAIE和化合物6溶解在DMF中，加入碳酸钾，在60℃搅拌12h，随后，产物用截留分子量3500DaMw透析袋对水透析20小时，继续用乙醇透析4小时,除去溶剂后，真空干燥24小时得聚合物PAIE-TPP。
步骤1)中所述1,4-二溴-2,5-二甲醛基苯、3,5-二(三氟甲基)苯乙腈与无水乙醇的用量比为1.130mmol：2.260mmol：20mL。
步骤2)中所述NaOH-乙醇溶液中NaOH与无水乙醇的用量比为16.70mmol：10mL。
步骤4)中所述4-羟基二苯胺、3,4-二氢-2H-吡喃、吡啶对甲苯磺酸盐的用量比是5.39mmol：8.65mmol：0.28mmol。
步骤6)中所述(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈、2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、三(二亚苄基丙酮)二钯、磷酸钾、N-苯基-4-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯胺与甲苯的用量比为0.2mmol：0.06mmol：0.03mmol：2mmol：1mmol：1mL。
步骤8)中所述化合物3、四氢呋喃、甲醇、2N盐酸水溶液的用量比为3.0mmol：100mL：5mL：10mL。
步骤10)中所述化合物4、DMF、碳酸钾、碘乙烷的用量比为0.2mmol：3mL：0.3mmol：0.2mmol。
步骤12)中所述化合物5、二氯甲烷、三乙胺、甲基丙烯酰氯的用量比为0.2mmol：5mL：0.24mmol：0.24mmol。
步骤14)中所述HPMA、AEMA、AIEM、AIBN、DMF的用量比为1.0mmol：0.1mmol：0.06mmol：0.02mmol：1mL。
步骤16)中所述双(2-溴乙基)醚、三苯基膦、乙腈的用量比为1.0mmol：1.0mmol：3mL。
步骤17)中所述聚合物PAIE、化合物6、DMF、碳酸钾的用量比为30mg：20mg：1mL：5mg。
所述聚合物荧光光敏剂分子PAIE-TPP的合成路线表示如下：
一种无机上转换纳米粒子，化合物名称为[ytterbium and thulium co-dopedsodium yttrium fluoride,简称UCNP]，分子式为NaYF4:Yb/Tm(30/0.5mol％)，在波长为980nm的红外光照射下发出紫外和可见光。
一种所述无机上转换纳米粒子的制备方法，步骤如下：
1)将Y2O3、Yb2O3、Tm2O3溶于盐酸溶液中，加热至全部溶解，冷却，干燥，制得其氯代物；
2)将上述制得的YCl3、YbCl3、TmCl3分散在油酸和1-十八烯中，160℃加热30min，形成均一溶液后冷却至室温；
3)然后加入NaOH和NH4F的甲醇溶液，快速搅拌30min，加热至100℃蒸出甲醇和水，再将体系升温至295℃，在氮气保护下反应90min，后冷却至室温；
4)加入乙醇，析出沉淀，离心，用环己烷和乙醇洗，最后再分散在四氢呋喃中，在4℃储存。
所述Y2O3、Yb2O3、Tm2O3、油酸、1-十八烯：NaOH：NH4F：甲醇的用量比为0.798mmol：0.200mmol：0.002mmol：8mL：18mL：2.5mmol：4mmol：10mL。
一种近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物的应用，将高聚集态荧光发射的荧光聚合物和无机上转换纳米粒子在水溶液中进行包覆，得到高聚集态深红/近红外有机荧光聚合物包覆无机上转换纳米粒子的纳米光敏剂，所制备的纳米粒子在波长980nm的激光照射下产生活性氧，用于杀死肿瘤细胞，方法是：
1)将聚合物分子PAIE-TPP和上转换纳米粒子UCNP溶解于二甲基亚砜中形成均一溶液，聚合物分子、上转换纳米粒子与二甲基亚砜的用量比为5mg：0.5mg：50μL；
2)将上述二甲基亚砜溶液缓慢滴加至水中，聚合物分子与水的用量比为1mg：1mL，超声30min，搅拌2h，通过自组装制得纳米粒子，简称UCNP@PAIE-TPP；
3)将上述纳米粒子离心，除去水，溶在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，加入5mg的PEG-CHO，在37℃下反应10min，得到连接了PEG的纳米光敏剂，简称UCNP@PAIE-TPP-PEG；
4)用纳米粒子UCNP@PAIE-TPP或UCNP@PAIE-TPP-PEG的浓度为60μg/mL做下述实验；
5)细胞荧光成像实验：
细胞的共聚焦成像实验在NikonA1型荧光共聚焦显微镜上进行，选取对数生长期的A549细胞-人体肺腺癌上皮细胞，按每个皿接种100000个细胞接种于培养皿中，培养24h，然后吸出培养液，加入荧光纳米粒子细胞培养液，并保持纳米粒子的浓度为60μg/mL，继续培养5小时，用PBS缓冲溶液清洗2次，加入50nmol/L的线粒体靶向试剂Mito-Tracker Green培养液，培养15分钟，最后换上新鲜的细胞培养液，在荧光共聚焦显微镜下观察，荧光纳米粒子激发波长为488nm，在500-530nm范围收集图像；Mito-Tracker Green激发波长为488nm，在662-737nm范围收集图像；
6)以PAIE-TPP包覆UCNP所制备的纳米粒子对A549细胞的细胞毒性实验：
实验采用MTT法来评价PAIE-TPP包覆UCNP荧光纳米粒子对A549细胞的毒性作用。
本发明的积极效果是：
该高聚集态深红/近红外纳米粒子具有聚集诱导发光特性和细胞内线粒体靶向性，进行荧光标记，并且能产生活性氧，杀死细胞。该纳米粒子用980nm的激光作为激发光源，该光源具有高的组织透射深度，对生物体光学损害低，降低生物体自发荧光的影响。在纳米粒子表面修饰的靶向分子能够靶向细胞内的线粒体，将纳米粒子高效地运送到细胞中的线粒体处，实现在线粒体中释放活性氧，引起线粒体变异，导致细胞凋亡。另外，pH响应的PEG外壳会降低其被蛋白质非特异性吸附的风险，实现血液长循环和内吞。该纳米粒子用于肿瘤细胞的治疗具有操作简单、特异性好、疗效显著等优点，并且可有效避免生物组织自发荧光的干扰，提高光动力学治疗效果，为以后的肿瘤细胞的光动力学治疗提供新型材料。同时，该纳米粒子用作光动力治疗试剂，光学可控、副作用小，生物组织透射性强，提高了光动力治疗效果。
附图说明
图1为荧光单体分子AIEM和聚合物PAIE的紫外-可见吸收光谱图。
图2为荧光分子单体AIEM在不同比例的二甲基亚砜-水混合溶液中的荧光光谱图。
图3为纳米光敏剂的透射电镜图。
图4为近红外激光驱动下，纳米光敏剂的活性氧释放随照射时间的曲线。
图5为以PAIE-TPP包覆UCNP所制备的纳米光敏剂标记A549细胞的线粒体靶向性激光共聚焦照片。
图6为以PAIE-TPP包覆UCNP所制备的纳米光敏剂对A549细胞的毒性的研究实验(无光照射)。
图7为以PAIE-TPP包覆UCNP所制备的纳米光敏剂对A549细胞的毒性的研究实验(近红外激光照射)。
具体实施方式
下面通过实施例具体的说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。
实施例：
一种近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物，化合物名称为聚(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二(二苯胺基)-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈-共聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)-共聚(甲基丙烯酸-2-氨基乙酯)的聚合物(PAIE-TPP)，在波长为365nm的紫外灯照射下发出红色荧光，该化合物PAIE-TPP的分子结构式为：
其制备方法，步骤如下：
1)在100mL圆底烧瓶中，将0.3300g(1.130mmol)1,4-二溴-2,5-二甲醛基苯、0.5718g(2.260mmol 3,5-二(三氟甲基)苯与20mL无水乙醇均匀混合，得到混合液；
2)将6.0g(16.70mmol)NaOH溶解于10mL无水乙醇中，得到NaOH-乙醇溶液；
3)利用恒压低液漏斗，在N2保护下将NaOH-乙醇溶液滴加到混合液中，室温下搅拌反应1小时，冷却至室温后过滤，将所得固体用水、乙醇交替清洗三次，干燥后用氯仿重结晶，得到黄色晶体(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈；
4)在50mL圆底烧瓶中，将1.000g(5.39mmol)4-羟基二苯胺、0.728g(8.65mmol)3,4-二氢-2H-吡喃溶解于干燥的二氯甲烷中，向体系中加入0.071g(0.28mmol)吡啶对甲苯磺酸盐，室温下反应12小时；
5)混合物用5％的氢氧化钠溶液洗，最后用水萃取，所得有机相除去溶剂后通过硅胶层析柱进行提纯，石油醚/乙酸乙酯(v/v＝10/1)作为洗脱剂。得到白色固体N-苯基-4–((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯胺；
6)干燥好的带有冷凝管和恒压滴液漏斗的25mL两口瓶中，将0.1520g(0.2mmol)(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈、27.6mg(0.06mmol)2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、17.5mg(0.03mmol)三(二亚苄基丙酮)二钯、0.4245g(2mmol)磷酸钾和0.269g(1mmol)N-苯基-4-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯胺均匀混合，在N2保护下逐滴加入1mL甲苯，110℃下回流24小时，得到反应液；
7)将10mL上述反应液倒入100mL水中，用氯仿萃取三次，合并萃取液用饱和食盐水清洗后用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发后得粗产品；
8)将上述粗产品用体积比为1：1的二氯甲烷-石油醚混合液作洗脱剂柱层析，然后用氯仿/乙醇重结晶得到红色固体3；
9)将341.7mg(0.3mmol)化合物3溶解于10mL四氢呋喃中，再加入0.5mL甲醇和1mL2N盐酸水溶液混合物，于室温下反应12小时；
10)反应结束后，除去溶剂，粗产物用体积比为5：1石油醚-乙酸乙酯混合液作为洗脱剂柱层析，干燥后得到紫红色固体4；
11)将194mg(0.2mmol)化合物4溶解在3mL DMF中，加入42mg(0.3mmol)碳酸钾，在搅拌的状态下逐滴加入32mg(0.2mmol)碘乙烷，混合溶液在60℃下反应12小时；
12)反应结束后，过滤除去反应体系内的沉淀，得到滤液，旋干后用体积比为5：1石油醚-乙酸乙酯混合液作为洗脱剂，干燥后得到红色固体5；
13)将200mg(0.2mmol)化合物5溶解在3mL二氯甲烷中，加入24mg(0.24mmol)三乙胺，在0℃下逐滴滴加25mg(0.24mmol)甲基丙烯酰氯的2mL二氯甲烷溶液，半小时后于室温反应12小时；
14)反应结束后，过滤除去反应体系内的沉淀，得到滤液，旋干后用体积比为10：1的石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂提纯，干燥后得到红色固体AIEM；
15)将79mg(0.5mmol)HPMA，32mg(0.03mmol)AEMA，8.3mg(0.05mmol)AIEM和3.3mg(0.02mmol)AIBN溶解于1mL DMF中，混合溶液通过三次冷冻-抽真空过程除去体系内的氧气，在氮气保护下65℃聚合24小时；
16)反应结束后，产物用截留分子量3500DaMw透析袋对水透析20小时，继续用乙醇透析4小时，除去溶剂后，真空干燥24小时得聚合物PAIE；
17)将232mg(1.0mmol)双(2-溴乙基)醚和262mg(1.0mmol)三苯基膦溶于3mL乙腈中，混合溶液回流12小时，待反应结束后冷却至室温，除去溶剂后用二氯甲烷/乙酸乙酯重结晶得到白色固体6；
18)将30mg聚合物PAIE和20mg化合物6溶解在1mL DMF中，加5mg入碳酸钾，在60℃搅拌12h，随后，产物用截留分子量3500Da Mw透析袋对水透析20小时，继续用乙醇透析4小时，除去溶剂后，真空干燥24小时得聚合物PAIE-TPP。
该高聚集态荧光发射的聚合物的基本数据：
AIEM：1H NMR(400MHz,DSMO-d6,TMS,ppm):δ1.14-1.29(m,3H),1.95(s,3H),3.86(q,J＝6.9Hz,2H),5.87(s,1H),6.20(s,1H),6.78-6.81(d,J＝9.2Hz,2H),6.98-7.00(d,J＝7.7Hz,4H),7.05-7.09(m,8H),7.21-7.28(m,4H),7.58-7.61(d,J＝9.8Hz,2H),7.86-7.87(d,J＝6.1Hz,4H),8.16(s,4H)；
PAIE：1H NMR(400MHz,DMSO-d6,TMS,ppm)δ7.20-8.13(broad,aromaticprotons),5.33(broad),4.72(broad),3.65(broad),2.89(broad,-CH2CO-),1.24(broad,),1.00(broad)；
PAIE-TPP：1H NMR(400MHz,DMSO-d6,TMS,ppm)δ7.20-8.13(broad,aromaticprotons),5.33(broad),4.72(broad),3.65(broad),2.89(broad),1.24(broad),1.00(broad)。
该荧光聚合物的光物理性质：
1)荧光单体AIEM及聚合物PAIE-TPP的紫外-可见吸收光谱：
将荧光单体AIEM或荧光聚合物PAIE溶于二甲基亚砜/水(v:v＝5/95)的溶液中，至终浓度分别为200μΜ和1mg/mL，如图1所示：测得其紫外-可见吸收光谱的最大吸收310nm左右，并且在515nm左右也有一较小的吸收峰，吸收范围为300-600nm。
2)荧光单体AIEM在不同比例的二甲基亚砜-水混合溶液中的荧光光谱：
荧光单体AIEM在二甲基亚砜溶液中，几乎没有荧光，当溶液中水含量为80％时，荧光强度明显增强，并且荧光强度随着水含量的提高而逐渐增强。从图2中可以看出，当混合溶液中水含量小于80％时，溶液几乎没有荧光，这时的溶液是澄清的，没有聚集体产生；当水含量达到80％时，荧光单体AIEM开始聚集，荧光强度明显增强，当水含量为95％时，溶液的荧光强度是其纯二甲基亚砜溶液荧光强度的870倍。由此可见，荧光单体AIEM具有典型的AIE性能。
由此可见，荧光单体AIEM具有典型的AIE性能。
一种无机上转换纳米粒子，化合物名称为镱铥共掺杂的氟化钇钠[ytterbium andthulium co-doped sodium yttrium fluoride,简称UCNP]，分子式为NaYF4:Yb/Tm(30/0.5mol％)，在波长为980nm的红外光照射下发出紫外和可见光。
一种所述无机上转换纳米粒子的制备方法，步骤如下：
1)将90.1mg(0.798mmol)Y2O3、39.4mg(0.200mmol)Yb2O3、0.4mg(0.002mmol)Tm2O3溶于盐酸溶液中，加热至全部溶解，冷却，干燥，制得其氯代物；
2)将上述制得的YCl3、YbCl3、TmCl3分散在8mL油酸和18mL 1-十八烯中，160℃加热30min，形成均一溶液后冷却至室温；
3)然后加入0.1g(2.5mmol)NaOH和0.148g(4mmol)NH4F的甲醇溶液10mL，快速搅拌30min，加热至100℃蒸出甲醇和水，再将体系升温至295℃，在氮气保护下反应90min，后冷却至室温；
4)加入乙醇，析出沉淀，离心，用环己烷和乙醇洗，最后再分散在四氢呋喃中，在4℃储存。
图3为聚合物PAIE-TPP包覆无机上转换纳米的纳米光敏剂的透射电镜照片，聚合物与无机上转换纳米粒子间形成了很好的纳米结构，并且二者互溶良好。这有利于无机上转换纳米粒子与聚合物间的能量转换，即无机上转换纳米粒子吸收近红外激光的能量，并通过荧光共振能量转移机制将该能量转移给聚合物，使其产生活性氧。
图4为该包覆后的纳米光敏剂，在980nm激光照射下的活性氧产生情况，由图可见，随着照射时间的延长，活性氧指示剂的荧光强度不断增加。再照射540秒后，荧光强度增到无光照时的8倍。
一种高聚集态发光、线粒体靶向的有机荧光聚合物包覆无机上转换纳米粒子的纳米光敏剂的应用，该光敏剂具有聚集诱导发光特性和亚细胞器靶向性的优点，将高聚集态荧光发射的荧光聚合物在水溶液中包覆无机上转换材料，所制备的荧光纳米粒子可在近红外激光照射下产生活性氧进行光动力治疗，并且荧光纳米粒子发射的深红/近红外光，可进行细胞生物成像。方法是：
1)将聚合物分子PAIE-TPP和上转换纳米粒子UCNP溶解于二甲基亚砜中形成均一溶液，聚合物分子、上转换纳米粒子与二甲基亚砜的用量比为5mg：0.5mg：50μL；
2)将上述50μL二甲基亚砜溶液加入1mL水中，超声30min，搅拌2h，通过自组装制得纳米粒子，简称UCNP@PAIE-TPP，其中纳米粒子的浓度为1mg/mL；
3)将上述纳米粒子离心，除去水，溶在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，加入5mg的PEG-CHO，在37℃下反应10分钟，得到连接了PEG的纳米光敏剂，简称UCNP@PAIE-TPP-PEG；
4)用纳米粒子UCNP@PAIE-TPP或UCNP@PAIE-TPP-PEG的浓度为60μg/mL做下述实验；
5)细胞荧光成像实验：
细胞的共聚焦成像实验在NikonA1型荧光共聚焦显微镜上进行，选取对数生长期的A549细胞-人体肺腺癌上皮细胞，按每个皿接种100000个细胞接种于培养皿中，培养24h，然后吸出培养液，加入荧光纳米粒子细胞培养液，并保持纳米粒子的浓度为60μg/mL，继续培养5h，用PBS缓冲溶液清洗2次，加入50nmol/L的Mito-Tracker Green(线粒体靶向试剂)培养液，培养15min，最后换上新鲜的细胞培养液，在荧光共聚焦显微镜下观察。荧光纳米粒子激发波长为488nm，在500-530nm范围收集图像；Mito-Tracker Green激发波长为488nm，在662-737nm范围收集图像。
如图5所示，PAIE-TPP包覆UCNP的纳米粒子能够被A549细胞所吞噬，在细胞中，纳米粒子都可以发出明亮的红色荧光(大于660nm)，说明荧光纳米粒子具有细胞近红外荧光标记功能，可以作为一种新型的成像试剂应用于细胞成像的研究中。
6)以PAIE-TPP包覆UCNP所制备的纳米粒子对A549细胞的细胞毒性实验：
实验采用MTT法来评价PAIE-TPP包覆UCNP荧光纳米粒子对A549细胞的毒性作用。图6为无光照射条件下以PAIE-TPP包覆UCNP所制备的纳米光敏剂对A549细胞的毒性的研究实验，在含有100μg/mL的PAIE-TPP包覆UCNP荧光纳米粒子的培养基中培养5小时，分别在无光照条件和用980nm的激光(3W cm-2)光照10分钟条件下，测得A549细胞的存活率。如图6所示，无光照条件下，纳米光敏剂UCNP@PAIE-TPP和UCNP@PAIE-TPP-PEG在10-200μg/mL的范围内，都没有表现出明显的细胞毒性，生物相容性良好。其中，纳米粒子UCNP@PAIE与UCNP@PAIE-TPP的区别在于其没有靶向基团TPP，该纳米粒子在100，200μg/mL的浓度下，表现了一定的细胞毒性，而在激光照射下的光动力学疗效却不理想(如图7)，因此，该材料不具有肿瘤细胞光动力学治疗的可能。
如图7所示，在近红外激光照射下，纳米光敏剂UCNP@PAIE-TPP和UCNP@PAIE-TPP-PEG对细胞的杀伤作用明显，并随着光敏剂浓度的增加而增加。在纳米光敏剂浓度100，200μg/mL时，光照10分钟后，仅有大约10％的细胞幸存下来。数据表明，该类纳米光敏剂可以通过近红外光激活，产生的活性氧杀伤细胞效果明显，可以作为肿瘤细胞光动力治疗的光敏剂使用。

Claims (5)

1.一种近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物，其特征在于：化合物名称为聚(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二(二苯胺基)-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈-共聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)-共聚(甲基丙烯酸-2-氨基乙酯)的聚合物(PAIE-TPP)，在波长为365nm的紫外灯照射下发出红色荧光，该化合物PAIE-TPP的分子结构式为：
2.一种权利要求1所述近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物的制备方法，其特征在于步骤如下：
1)将1,4-二溴-2,5-二甲醛基苯、3,5-二(三氟甲基)苯乙腈与无水乙醇均匀混合，得到混合液；
2)将NaOH溶解于无水乙醇中，得到NaOH-乙醇溶液；
3)在N2保护下将NaOH-乙醇溶液滴加到混合液中，室温下搅拌反应1小时，冷却至室温后过滤，将所得固体用水、乙醇交替清洗三次，干燥后用氯仿重结晶，得到黄色晶体(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈；
4)将4-羟基二苯胺、3,4-二氢-2H-吡喃溶解于干燥的二氯甲烷中，向体系中加入吡啶对甲苯磺酸盐，室温下反应12小时；
5)混合物用5％的氢氧化钠溶液洗，最后用水萃取，所得有机相除去溶剂后通过硅胶层析柱进行提纯，石油醚/乙酸乙酯(v/v＝10/1)作为洗脱剂，得到白色固体N-苯基-4–((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯胺；
6)将(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈、2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、三(二亚苄基丙酮)二钯、磷酸钾和N-苯基-4-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯胺均匀混合，在N2保护下逐滴加入甲苯，110℃下回流24小时，得到反应液；
7)待体系冷却后，加入氯仿，用水萃取三次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，粗产物通过硅胶层析柱进行提纯，石油醚/二氯甲烷(v/v＝1/1)作为洗脱剂，之后用氯仿/乙醇重结晶得到红色固体3；
8)化合物3溶解于四氢呋喃中，再加入甲醇和2N盐酸水溶液混合物，于室温下反应12小时；
9)反应结束后，除去溶剂，粗产物通过硅胶层析柱进行提纯，石油醚/乙酸乙酯(v/v＝5/1)作为洗脱剂。得到紫红色固体4；
10)将化合物4溶解在DMF中，加入碳酸钾，在搅拌的状态下逐滴加入碘乙烷，混合溶液在60℃下反应12小时；
11)反应结束后，过滤除去反应体系内的沉淀，得到滤液，旋干后通过硅胶层析柱进行提纯，石油醚/乙酸乙酯(v/v＝5/1)作为洗脱剂，得到红色固体5；
12)将化合物5溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，在0℃下逐滴滴加甲基丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，半小时后于室温反应12小时；
13)反应结束后，过滤除去反应体系内的沉淀，得到滤液，旋干后通过硅胶层析柱进行提纯，石油醚/乙酸乙酯(v/v＝10/1)作为洗脱剂，得到红色固体AIEM；
14)HPMA，AEMA，AIEM和AIBN溶解于DMF中，混合溶液通过三次冷冻-抽真空过程除去体系内的氧气，在氮气保护下65℃聚合24小时；
15)反应结束后，产物用截留分子量3500DaMw透析袋对水透析20小时，继续用乙醇透析4小时，除去溶剂后，真空干燥24小时得聚合物PAIE；
16)将双(2-溴乙基)醚和三苯基膦溶于乙腈中，混合溶液回流12小时，待反应结束后冷却至室温，除去溶剂后用二氯甲烷/乙酸乙酯重结晶得到白色固体6；
17)将聚合物PAIE和化合物6溶解在DMF中，加入碳酸钾，在60℃搅拌12h，随后，产物用截留分子量3500DaMw透析袋对水透析20小时，继续用乙醇透析4小时,除去溶剂后，真空干燥24小时得聚合物PAIE-TPP。
3.根据权利要求2所述近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述1,4-二溴-2,5-二甲醛基苯、3,5-二(三氟甲基)苯乙腈与无水乙醇的用量比为1.130mmol：2.260mmol：20mL；
步骤2)中所述NaOH-乙醇溶液中NaOH与无水乙醇的用量比为16.70mmol：10mL；
步骤4)中所述4-羟基二苯胺、3,4-二氢-2H-吡喃、吡啶对甲苯磺酸盐的用量比是5.39mmol：8.65mmol：0.28mmol；
步骤6)中所述(2Z,2’Z)-3,3’-(2,5-二溴-1,4-苯基)二(2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)丙烯腈、2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯、三(二亚苄基丙酮)二钯、磷酸钾、N-苯基-4-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)苯胺与甲苯的用量比为0.2mmol：0.06mmol：0.03mmol：2mmol：1mmol：1mL；
步骤8)中所述化合物3、四氢呋喃、甲醇、2N盐酸水溶液的用量比为3.0mmol：100mL：5mL：10mL；
步骤10)中所述化合物4、DMF、碳酸钾、碘乙烷的用量比为0.2mmol：3mL：0.3mmol：0.2mmol；
步骤12)中所述化合物5、二氯甲烷、三乙胺、甲基丙烯酰氯的用量比为0.2mmol：5mL：0.24mmol：0.24mmol；
步骤14)中所述HPMA、AEMA、AIEM、AIBN、DMF的用量比为1.0mmol：0.1mmol：0.06mmol：0.02mmol：1mL；
步骤16)中所述双(2-溴乙基)醚、三苯基膦、乙腈的用量比为1.0mmol：1.0mmol：3mL；
步骤17)中所述PAIE、化合物6、DMF、碳酸钾的用量比为30mg：20mg：1mL：5mg。
4.一种权利要求1所述近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物的应用，其特征在于：高聚集态荧光发射的荧光聚合物和无机上转换纳米粒子在水溶液中进行包覆，得到高聚集态深红/近红外有机荧光聚合物包覆无机上转换纳米粒子的纳米光敏剂，在波长980nm激光照射下产生活性氧，用于杀死肿瘤细胞，方法是：
1)将聚合物分子PAIE-TPP和上转换纳米粒子UCNP溶解于二甲基亚砜中形成均一溶液，聚合物分子、上转换纳米粒子与二甲基亚砜的用量比为5mg：0.5mg：50μL；
2)将上述二甲基亚砜溶液缓慢滴加至水中，聚合物分子与水的用量比为1mg：1mL，超声30min，搅拌2h，制得纳米粒子，简称UCNP@PAIE-TPP，其中纳米粒子的浓度为1mg/mL；
3)将上述纳米粒子离心，除去水，溶在pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，加入5mg的PEG-CHO，在37℃下反应10min，得到连接了PEG的纳米光敏剂，简称UCNP@PAIE-TPP-PEG；
4)用纳米粒子UCNP@PAIE-TPP或UCNP@PAIE-TPP-PEG的浓度为60μg/mL做下述实验；
5)细胞荧光成像实验：
细胞的共聚焦成像实验在NikonA1型荧光共聚焦显微镜上进行，选取对数生长期的A549细胞-人体肺腺癌上皮细胞，按每个皿接种100000个细胞接种于培养皿中，培养24h，然后吸出培养液，加入荧光纳米粒子细胞培养液，并保持纳米粒子的浓度为60μg/mL，继续培养5小时，用PBS缓冲溶液清洗2次，加入50nmol/L的线粒体靶向试剂Mito-Tracker Green培养液，培养15分钟，最后换上新鲜的细胞培养液，在荧光共聚焦显微镜下观察，荧光纳米粒子激发波长为488nm，在500-530nm范围收集图像；Mito-Tracker Green激发波长为488nm，在662-737nm范围收集图像；
6)以PAIE-TPP包覆UCNP所制备的纳米粒子对A549细胞的细胞毒性实验：
实验采用MTT法来评价PAIE-TPP包覆UCNP荧光纳米粒子对A549细胞的毒性作用，在近红外激光照射下，纳米光敏剂UCNP@PAIE-TPP和UCNP@PAIE-TPP-PEG对细胞的杀伤作用明显，并随着光敏剂浓度的增加而增加。
5.根据权利要求4所述近红外激光驱动的线粒体靶向荧光聚合物的应用，其特征在于：所述的无机上转换纳米粒子的制备方法，步骤如下：
1)将Y2O3、Yb2O3、Tm2O3溶于盐酸溶液中，加热至全部溶解，冷却，干燥，制得其氯代物；
2)将上述制得的YCl3、YbCl3、TmCl3分散在油酸和1-十八烯中，160℃加热30min，形成均一溶液后冷却至室温；
3)然后加入NaOH和NH4F的甲醇溶液，快速搅拌30min，加热至100℃蒸出甲醇和水，再将体系升温至295℃，在氮气保护下反应90min，后冷却至室温；
4)加入乙醇，析出沉淀，离心，用环己烷和乙醇洗，最后再分散在四氢呋喃中，在4℃储存；
所述Y2O3、Yb2O3、Tm2O3、油酸、1-十八烯：NaOH：NH4F：甲醇的用量比为0.798mmol：0.200mmol：0.002mmol：8mL：18mL：2.5mmol：4mmol：10mL。
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