CN111632072A - 一种治疗缺血性脑卒中的治疗液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗缺血性脑卒中的治疗液及其制备方法和应用，由体积比为1:(1‑10)的上转换纳米粒重悬液和细长聚球藻重悬液混合而成；还包括一种缺血性脑卒中治疗液的制备方法，包括以下具体步骤：S1：培养细长聚球藻，获得细长聚球藻重悬液；S2：将上转换纳米粒进行改性处理，获得上转换纳米粒重悬液；S3：将所述步骤S1中的细长聚球藻重悬液与所述步骤S2中的上转换纳米粒重悬液按比例混合，获得治疗液。本发明的有益效果是能够有效的为人体大脑提供所需氧气，可一定程度改善缺氧脑组织的细胞代谢能力，不仅改善脑部缺氧导致的功能障碍，还能避免外科开颅所带来的损伤和风险。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程与再生医学领域，具体涉及一种治疗缺血性脑卒中的治疗液及其制备方法和应用。
背景技术
脑卒中俗称脑中风，是一种急性的脑血管疾病。目前脑卒中是世界上人类死亡的第二大原因，也是导致残疾的首要原因。全球每年因为脑卒中造成的死亡人数约为650万人，新增病例1030万左右。高发病率，高死亡率和高致残率的脑卒中给个人、家庭造成极大的痛苦，也给国家和社会带来严重的负担。脑卒中主要分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中是由动脉粥样硬化、小动脉疾病或者心脏血栓等疾病造成的脑动脉供血减少或者消失导致的局部脑组织缺血或者梗死的疾病，临床上约占脑卒中的80％以上。目前在临床上治疗缺血性脑卒中的手段有限，FDA批准的治疗方式主要是以应用组织纤溶酶原激活物(tPA)的溶栓治疗为主，但是该药物应用必须在发病的4.5h内才有效果，其较短的治疗窗致使大部分脑卒中病人无法从中获益，仅有5％的患者从该疗法中得到有效的救治。除此之外，通过机械手段移除血栓达到恢复血流供应的目的也是常用的治疗手段，但是手术条件苛刻，高出血风险和低收益率制约了它的应用。
缺血性脑卒中发生后，主要发生以下几点病理变化，导致神经细胞损伤。1)缺氧；缺氧是缺血性脑卒中的重要病理特征。脑组织相对于其他组织耗氧能力高，因此对缺氧更加敏感，缺氧10分钟就会对神经细胞造成严重的损伤，缺氧是脑卒中后细胞损伤的主要原因。2)细胞酸中毒；酸中毒是另一个重要的病理特征。氧气缺乏使神经细胞能量代谢方式由有氧呼吸转变为无氧酵解，代谢产物乳酸的堆积会降低局部微环境的pH，导致神经细胞酸中毒，进而加重脑组织损伤。因此在脑卒中后及时提供氧气，改善局部微环境，可以降低神经细胞损伤，达到神经保护的作用。目前应对卒中后大脑缺氧的治疗策略非常有限。因此，使用药物或新型生物材料为卒中后脑组织提供所需氧气，改善缺氧的脑部微环境极为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种治疗缺血性脑卒中的治疗液及其制备方法和应用，旨在解决上述技术问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种缺血性脑卒中治疗液的制备方法，包括以下具体步骤：
S1：培养细长聚球藻，获得细长聚球藻重悬液；
S2：将上转换纳米粒进行改性处理，获得上转换纳米粒重悬液；
S3：将所述步骤S1中的细长聚球藻重悬液与所述步骤S2中的上转换纳米粒重悬液按体积比(1-10):1混合，获得治疗液。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述步骤S1具体包括以下步骤：
S11：将浓度为(1-5)×106个/μL的细长聚球藻培养液和BG11培养基按照3:(4-6)的体积比混合，在25-28℃进行8小时光照和16小时黑暗的循环周期持续培养；
S12：每4-6天增加3-4mLBG11培养基以抵消蒸发的量，持续培养10-15天；
S13：培养液浓度过饱和后，弃去50％的经过所述步骤S12培养后的培养液，再增加同样体积的BG11培养基继续培养20-40天，获得混合培养液；
S14：取7-15mL的混合培养液，离心后弃去上清液，然后加入200μL-800μL浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液重悬，获得细长聚球藻重悬液，其中，离心前混合培养液与磷酸缓冲盐溶液的体积比为(10-40):1。
进一步，所述步骤S14中，细长聚球藻重悬液的浓度为(4-6)x105个/μL。
进一步，所述步骤S11中，细长聚球藻培养液和BG11培养基置于锥形瓶中培养，同时采用透气滤片封住锥形瓶的瓶口。
进一步，所述步骤S14中，混合培养液在4000-8000rpm的转速下离心10-15分钟。
进一步，所述步骤S2具体包括以下步骤：
S21：将上转换纳米粒和无水乙醇按照1:(100-200)的质量比混合重悬，获得混合液一；
S22：将所述步骤S21中的混合液一和(1-4)moL/L盐酸溶液按照1:(1-5)的体积比混合后在功率500W和频率30kHZ-40kHZ条件下超声处理20-30分钟，离心，弃去上清液，获得沉淀一；
S23：将所述步骤S22中的沉淀一和所述无水乙醇按照1:(100-200)的质量比混合，离心，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀二；
S24：将所述步骤S23中的沉淀二和超纯水按照1:(100-200)的质量比混合，离心，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀三；
S25：将所述步骤S24中的沉淀三和磷酸缓冲盐溶液按照1:(20-50)的质量比混合重悬，获得上转换纳米粒重悬液。
进一步，所述步骤S22、S23以及S24中离心的条件均为14800-20000rpm条件下离心5-15分钟。
进一步，所述步骤S25中，磷酸缓冲盐溶液的浓度为0.01moL/L。
一种治疗缺血性脑卒中的治疗液，由如上所述制备方法制备而成。
一种如上所述治疗缺血性脑卒中的治疗液在治疗缺血性脑卒中的应用。
本发明的有益效果是：能够有效的为人体大脑提供所需氧气，可一定程度改善缺氧脑组织的细胞代谢能力，减少梗死面积，不仅改善脑部缺氧导致的功能障碍，还能避免外科开颅所带来的损伤和风险。
附图说明
图1为本发明中治疗液的制备流程图；
图2为本发明中小鼠实验的示意图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
如图1和图2所示，本发明提供一种缺血性脑卒中治疗液的制备方法，包括以下具体步骤：
S1：培养细长聚球藻，获得细长聚球藻重悬液；
S2：将上转换纳米粒(UCNPs)进行改性处理，获得上转换纳米粒重悬液；
S3：将所述步骤S1中的细长聚球藻重悬液与所述步骤S2中的上转换纳米粒重悬液按体积比(1-10):1混合，获得治疗液。
进一步，所述步骤S1具体包括以下步骤：
S11：将浓度为(1-5)×106个/μL的细长聚球藻培养液和BG11培养基(蓝绿培养基)按照3:(4-6)的体积比混合，在25-28℃进行8小时光照和16小时黑暗的循环周期持续培养；
S12：每4-6天增加3-4mLBG11培养基以抵消蒸发的量，持续培养10-15天；
S13：当培养液浓度过饱和后(即出现沉淀或菌膜)弃去50％的经过所述步骤S12培养后的培养液，再增加同样体积的BG11培养基继续培养20-40天，获得混合培养液；
S14：取7-15mL的混合培养液，离心后弃去上清液，然后加入200μL-800μL浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液重悬，获得细长聚球藻重悬液，其中，离心前混合培养液与磷酸缓冲盐溶液的体积比为(10-40):1。
进一步，所述步骤S14中，细长聚球藻重悬液的浓度为(4-6)x105个/μL。
进一步，所述步骤S11中，细长聚球藻培养液和BG11培养基置于锥形瓶中培养，同时采用透气滤片封住锥形瓶的瓶口。
进一步，所述步骤S14中，混合培养液在4000-8000rpm的转速下离心10-15分钟。
进一步，所述步骤S2具体包括以下步骤：
S21：将上转换纳米粒和无水乙醇按照1:(100-200)的质量比混合重悬，获得混合液一；
S22：将所述步骤S21中的混合液一和(1-4)moL/L盐酸溶液按照1:(1-5)的体积比混合后在功率500W和频率30kHZ-40kHZ条件下超声处理20-30分钟，离心，弃去上清液，获得沉淀一；
S23：将所述步骤S22中的沉淀一和所述无水乙醇按照1:(100-200)的质量比混合，离心，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀二；
需要说明的是，每次离心前上述沉淀均按照设定比例与无水乙醇混合。
S24：将所述步骤S23中的沉淀二和超纯水按照1:(100-200)的质量比混合，离心，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀三；
需要说明的是，每次离心前上述沉淀均按照设定比例与超纯水混合。
S25：将所述步骤S24中的沉淀三和磷酸缓冲盐溶液按照1:(20-50)的质量比混合重悬，获得上转换纳米粒重悬液。
进一步，所述步骤S22、S23以及S24中离心的条件均为14800-20000rpm条件下离心5-15分钟。
进一步，所述步骤S25中，磷酸缓冲盐溶液的浓度为0.01moL/L。
一种治疗缺血性脑卒中的治疗液，由体积比为(1-10):1的细长聚球藻重悬液和上转换纳米粒重悬液混合而成。
如上所述的治疗缺血性脑卒中的治疗液在治疗缺血性脑卒中的应用。
细长聚球藻(Synechococcus elongatus)是一种专性光能自养的单细胞原核微生物，广泛存在于海洋和淡水湖泊中，是研究生物节律、光合作用以及趋光性的模式生物。由于其具有细胞增殖快、二氧化碳利用率高以及容易被基因改造等优点，近年来多被研究用来通过光合作用生产生物燃料、化工原料以及药品等物质。
在生物医学领域，有学者将其应用于心梗的治疗中，通过将细长聚球藻注射到缺血心肌中再进行开胸光照时，利用它的光合作用提供心肌急需的氧气，能有效改善心脏功能。但是该方法具有很大的局限性：由于光合作用需要持续的进行光照，而可见光不能有效穿透组织，因此必须通过开胸的方式暴露手术部位进行持续给光，这样不仅扩大了手术创伤，也增加了感染风险。细长聚球藻在缺血性脑卒中治疗当中的应用尚未见到相关报道。
本发明所使用的细长聚球藻从中科院水生所购买。
上转换纳米粒(UCNPs)是一类受到长波长光激发时可以通过反斯托克斯过程发射短波长光的发光材料。相比于传统荧光材料，上转换材料的激发光多为具有较强组织穿透能力的近红外光，其目前已经被广泛地应用于生物医学领域，包括生物示踪、生物成像、生物传感、药物递送以及光动力治疗。Nd3+上转换纳米微粒是最新开发的一种上转换材料，具备良好的细胞相容性和生物安全性，它的激发光谱是800nm左右的近红外光，具有强组织穿透能力和低光热效应等特点，具有广阔的应用潜力。
本发明所使用的上转换纳米粒由华中科技大学材料科学与工程学院提供。
本发明的原理：本发明提供的细长聚球藻和上转换材料组合物经颅内注射进入大脑后，在808nm红外光照射下，上转换材料将红外光转换成使其细长聚球藻能进行光合作用的可见光，细长聚球藻经光合作用消耗缺血部位二氧化碳，释放氧气和葡萄糖，为缺氧病灶提供急需氧气，从而解决治疗缺血后脑组织缺氧的根本问题。
本发明的有益效果是：能够有效的为人体大脑提供所需氧气，可一定程度改善缺氧脑组织的细胞代谢能力，不仅改善脑部缺氧导致的功能障碍，还能避免外科开颅所带来的损伤和风险。
实施例1
本发明提供一种缺血性脑卒中治疗液的制备方法，包括以下具体步骤：
S1：将浓度为1×106个/μL的细长聚球藻培养液和BG11培养基按照3:4的体积比混合，在25℃8小时光照和16小时黑暗循环周期持续培养；
S2：每4天增加3mLBG11培养基以抵消蒸发的量，持续培养10天；
S3：当培养液浓度过饱和后(即出现沉淀或菌膜)弃去50％的所述步骤S2中的培养液，再增加同样体积的BG11培养基继续培养20天，获得混合培养液；
S4：取7mL左右的混合培养液，4000rpm的转速下离心10分钟，弃去上清液，然后加入200μL浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液重悬，获得细长聚球藻重悬液。
S5：将上转换纳米粒和无水乙醇按照1:100的质量比混合重悬，获得混合液一；
S6：将所述步骤S5中的混合液一和1moL/L盐酸溶液按照1:1的体积比混合在功率500W和频率30kHZ条件下后超声处理20分钟，14800rpm条件下离心5分钟，弃去上清液，获得沉淀一；
S7：将所述步骤S6中的沉淀一和所述无水乙醇按照1:100的质量比混合，14800rpm条件下离心5分钟，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀二；
S8：将所述步骤S7中的沉淀二和超纯水按照1:100的质量比混合，14800rpm条件下离心5分钟，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀三；
S9：将所述步骤S8中的沉淀三和浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液按照1:20的质量比混合重悬，获得上转换纳米粒重悬液；
S10：将上述细长聚球藻重悬液与上转换纳米粒重悬液按体积比1:1混合，获得治疗液。
实施例2
本发明提供一种缺血性脑卒中治疗液的制备方法，包括以下具体步骤：
S1：将浓度为2×106个/mL的细长聚球藻培养液和BG11培养基按照3:5的体积比混合，在26℃条件下进行8小时光照和16小时黑暗循环周期持续培养；
S2：每5天增加3mLBG11培养基以抵消蒸发的量，持续培养11天；
S3：当培养液浓度过饱和后(即出现沉淀或菌膜)弃去50％的所述步骤S2中的培养液，再增加同样体积的BG11培养基继续培养25天，获得混合培养液；
S4：取9mL左右的混合培养液，5000rpm的转速下离心12分钟，弃去上清液，然后加入300μL浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液重悬，获得细长聚球藻重悬液。
S5：将上转换纳米粒和无水乙醇按照1:100的质量比混合重悬，获得混合液一；
S6：将所述步骤S5中的混合液一和2moL/L盐酸溶液按照1:2的体积比混合后在功率500W和频率35kHZ条件下超声处理25分钟，14900rpm条件下离心7分钟，弃去上清液，获得沉淀一；
S7：将所述步骤S6中的沉淀一和所述无水乙醇按照1:100的质量比混合，14900rpm条件下离心7分钟，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀二；
S8：将所述步骤S7中的沉淀二和超纯水按照1:100的质量比混合，14900rpm条件下离心7分钟，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀三；
S9：将所述步骤S8中的沉淀三和浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液按照1:30的质量比混合重悬，获得上转换纳米粒重悬液；
S10：将上述细长聚球藻重悬液与上转换纳米粒重悬液按体积比3:1混合，获得治疗液。
实施例3
本发明提供一种缺血性脑卒中治疗液的制备方法，包括以下具体步骤：
S1：将浓度为3×106个/μL的细长聚球藻培养液和BG11培养基按照3:5的体积比混合，在27℃条件下进行8小时光照和16小时黑暗循环培养；
S2：每5天增加4mLBG11培养基以抵消蒸发的量，持续培养13天；
S3：当培养液浓度过饱和后(即出现沉淀或菌膜)弃去50％的所述步骤S2中的培养液，再增加同样体积的BG11培养基继续培养30天，获得混合培养液；
S4：取11mL左右的混合培养液，5000rpm的转速下离心13分钟，弃去上清液，然后加入400μL浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液重悬，获得细长聚球藻重悬液。
S5：将上转换纳米粒和无水乙醇按照1:150的质量比混合重悬，获得混合液一；
S6：将所述步骤S5中的混合液一和3moL/L盐酸溶液按照1:3的体积比混合后在功率500W和频率40kHZ条件下超声处理25分钟，15000pm条件下离心13分钟，弃去上清液，获得沉淀一；
S7：将所述步骤S6中的沉淀一和所述无水乙醇按照1:150的质量比混合，15000pm条件下离心13分钟，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀二；
S8：将所述步骤S7中的沉淀二和超纯水按照1:150的质量比混合，15000rpm条件下离心13分钟，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀三；
S9：将所述步骤S8中的沉淀三和浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液按照1:40的质量比混合重悬，获得上转换纳米粒重悬液；
S10：将上述细长聚球藻重悬液与上转换纳米粒重悬液按体积比5:1混合，获得治疗液。
实施例4
本发明提供一种缺血性脑卒中治疗液的制备方法，包括以下具体步骤：
S1：将浓度为4×106个/μL的细长聚球藻培养液和BG11培养基按照3:5的体积比混合，在28℃条件下进行12小时光照和12小时黑暗循环培养；
S2：每6天增加3mLBG11培养基以抵消蒸发的量，持续培养14天；
S3：当培养液浓度过饱和后(即出现沉淀或菌膜)弃去50％的所述步骤S2中的培养液，再增加同样体积的BG11培养基继续培养35天，获得混合培养液；
S4：取14mL左右的混合培养液，7000rpm的转速下离心15分钟，弃去上清液，然后加入600μL浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液重悬，获得细长聚球藻重悬液。
S5：将上转换纳米粒和无水乙醇按照1:200的质量比混合重悬，获得混合液一；
S6：将所述步骤5中的混合液一和4moL/L盐酸溶液按照1:4的体积比混合后在功率500W和频率37kHZ条件下超声处理30分钟，18000rpm条件下离心15分钟，弃去上清液，获得沉淀一；
S7：将所述步骤S6中的沉淀一和所述无水乙醇按照1:200的质量比混合，18000rpm条件下离心15分钟，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀二；
S8：将所述步骤S7中的沉淀二和超纯水按照1:200的质量比混合，18000rpm条件下离心15分钟，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀三；
S9：将所述步骤S8中的沉淀三和浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液按照1:50的质量比混合重悬，获得上转换纳米粒重悬液；
S10：将上述细长聚球藻重悬液与上转换纳米粒重悬液按体积比7:1混合，获得治疗液。
实施例5
本发明提供一种缺血性脑卒中治疗液的制备方法，包括以下具体步骤：
S1：将浓度为5×106个/μL的细长聚球藻培养液和BG11培养基按照3:6的体积比混合，在28℃条件下进行12小时光照和12小时黑暗循环培养；
S2：每6天增加3-4mLBG11培养基以抵消蒸发的量，持续培养15天；
S3：当培养液浓度过饱和后(即出现沉淀或菌膜)弃去50％的所述步骤S2中的培养液，再增加同样体积的BG11培养基继续培养40天，获得混合培养液；
S4：取15mL左右的混合培养液，4000-8000rpm的转速下离心15分钟，弃去上清液，然后加入800μL浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液重悬，获得细长聚球藻重悬液。
S5：将上转换纳米粒和无水乙醇按照1:200的质量比混合重悬，获得混合液一；
S6：将所述步骤S5中的混合液一和3moL/L盐酸溶液按照1:5的体积比混合后在功率500W和频率39kHZ条件下超声处理30分钟，20000rpm条件下离心15分钟，弃去上清液，获得沉淀一；
S7：将所述步骤S6中的沉淀一和所述无水乙醇按照1:200的质量比混合，20000rpm条件下离心15分钟，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀二；
S8：将所述步骤S7中的沉淀二和超纯水按照1:200的质量比混合，20000rpm条件下离心15分钟，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀三；
S9：将所述步骤S8中的沉淀三和浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液按照1:50的质量比混合重悬，获得上转换纳米粒重悬液；
S10：将上述细长聚球藻重悬液与上转换纳米粒重悬液按体积比10:1混合，获得治疗液。
动物实验：小鼠脑卒中模型的建立及治疗
(1)C57小鼠麻醉后，分离右侧头部皮肤，通过颅钻机对颅骨平行于中缝右侧1cm位置钻2个孔；
(2)分离颈部皮肤和右侧颈外动脉，通过颈外动脉进入MCAO模型专用线栓，开始计时1h；
(3)线栓到达预定位置后立即在右侧大脑通过装有上述治疗液的汉密尔顿针进行颅内注射，汉密尔顿针注射深度为1mm，通过微量注射泵控制注射速度为0.05μL/min，总注射0.5μL；
(4)治疗液注射完成后在注射孔处进行808nm近红外激光器照射，照射强度为2w/cm2，直至计时1h完成后结束照射，拔出线栓，对手术部位进行缝合。
由上述动物实验可知，本发明所提供的治疗液能降低脑缺血模型(MCAO模型)导致的脑组织梗死灶，改善梗死区缺氧状态，防止神经细胞凋亡。抑制炎性细胞的浸润，改善脑组织，从而明显改善动物(C57小鼠)神经功能。
因此，本发明能够有效结合上转换材料的物理学特性和细长聚球藻的生物学特性，将其作为材料制剂注射到梗死区域，在未开颅的情况下进行红外光照治疗，不仅改善脑部缺氧导致的功能障碍，还能避免外科开颅所带来的损伤和风险。此外，两种材料来源广泛、易获得、生物毒性小、技术操作简便，不仅在理论上创新，还具有较高的开发和推广潜力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种缺血性脑卒中治疗液的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
S1：培养细长聚球藻，获得细长聚球藻重悬液；
S2：将上转换纳米粒进行改性处理，获得上转换纳米粒重悬液；
S3：将所述步骤S1中的细长聚球藻重悬液与所述步骤S2中的上转换纳米粒重悬液按体积比(1-10):1混合，获得治疗液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括以下步骤：
S11：将浓度为(1-5)×106个/μL的细长聚球藻培养液和BG11培养基按照3:(4-6)的体积比混合，在25-28℃进行8小时光照和16小时黑暗循环周期持续培养；
S12：每4-6天增加3-4mLBG11培养基以抵消蒸发的量，持续培养10-15天；
S13：当培养液浓度过饱和后，弃去50％的经过所述步骤S12培养后的培养液，再增加同样体积的BG11培养基继续培养20-40天，获得混合培养液；
S14：取7-15mL的混合培养液，离心后弃去上清液，然后加入200μL-800μL浓度为0.01moL/L的磷酸缓冲盐溶液重悬，获得细长聚球藻重悬液，其中，离心前混合培养液与磷酸缓冲盐溶液的体积比为(10-40):1。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S14中，细长聚球藻重悬液的浓度为(4-6)x105个/μL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S11中，细长聚球藻培养液和BG11培养基置于锥形瓶中培养，同时采用透气滤片封住锥形瓶的瓶口。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S14中，混合培养液在4000-8000rpm的转速下离心10-15分钟。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括以下步骤：
S21：将上转换纳米粒和无水乙醇按照1:(100-200)的质量比混合重悬，获得混合液一；
S22：将所述步骤S21中的混合液一和(1-4)moL/L盐酸溶液按照1:(1-5)的体积比混合后在功率500W和频率30kHZ-40kHZ条件下超声处理20-30分钟，离心，弃去上清液，获得沉淀一；
S23：将所述步骤S22中的沉淀一和所述无无水乙醇按照1:(100-200)的质量比混合，离心，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀二；
S24：将所述步骤S23中的沉淀二和超纯水按照1:(100-200)的质量比混合，离心，弃去上清液，重复离心三次，获得沉淀三；
S25：将所述步骤S24中的沉淀三和磷酸缓冲盐溶液按照1:(20-50)的质量比混合重悬，获得上转换纳米粒重悬液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S22、S23以及S24中离心的条件均为14800-20000rpm条件下离心5-15分钟。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S25中，磷酸缓冲盐溶液的浓度为0.01moL/L。
9.一种治疗缺血性脑卒中的治疗液，其特征在于：由权利要求1至8任一项所述制备方法制备而成。
10.一种根据权利要求9所述治疗缺血性脑卒中的治疗液在治疗缺血性脑卒中的应用。
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