CN103127552A - 一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架，包括胶原海绵圆柱体支架，胶原海绵圆柱体支架交联有表皮生长因子受体抗体西妥昔；通过交联有表皮生长因子受体抗体西妥昔的胶原海绵支架担载神经干细胞以促进移植的神经干细胞向神经元分化，构建成有利于受损伤脊髓神经再生及功能修复的圆柱体支架。本发明提供的胶原海绵支架具有超高孔隙率，为细胞生长提供充足空间；更重要的是抗体西妥昔的缓释可缓解脊髓损伤后微环境中髓鞘蛋白的影响，促进移植的神经干细胞向神经元分化，抑制其向星形胶质细胞分化，并促进神经轴突的生长，以达到促进受损伤的脊髓神经再生及其功能修复。另外，本发明还提供了一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架的应用方法。

Description

一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架及其应用方法

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，涉及一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架及其应用方法。

背景技术

脊髓损伤是临床上常见的严重中枢神经系统损伤，是目前世界上公认的致残率最高的疾病之一。传统的治疗手段如注射大剂量糖皮质激素，清除致压物，消除结缔组织瘢痕等，虽然在不同程度上缓解了症状，但不能有效解决神经功能障碍的难题。

干细胞移植治疗为脊髓损伤修复提供了希望。神经干细胞是来源于神经组织，具有自我更新和多向分化潜能的一群细胞，可分化为神经元和胶质细胞，是理想的移植细胞源之一。但是单纯的神经干细胞移植难以达到理想的修复效果，面临的挑战主要源于髓鞘蛋白含有的抑制物抑制神经干细胞向神经元分化，而促进其向星形胶质细胞分化(Translating stem cell studies to the clinic for CNSrepair:current state of the art and the need for a rosetta stone.Neuron,2011,70:597)。所以促进神经干细胞移植修复脊髓损伤的关键是构建一个适用于神经干细胞向神经元分化的微环境。

在脊髓损伤修复的策略中，组织工程支架作为桥接损伤部位的支架、干细胞和活性因子的载体逐渐引起大家的关注。胶原蛋白的免疫原性低，生物相容性好，可以作为用于引导神经再生的生物材料。同时，胶原材料方便负载生物活性物质，与脊髓组织的整合性好，能够降低炎症反应以及减少星形胶质细胞增生所形成的瘢痕，在一定程度上能够促进受损伤脊髓的结构和功能恢复。在众多的支架材料中，如常见的水凝胶，胶原海绵支架不但具有大量的多孔结构，便于携带数量可观的细胞，而且具有比水凝胶更好的机械强度，同时有利于氧气和营养物质传输，提高移植干细胞的存活率。

采用拮抗剂中和髓鞘蛋白抑制物治疗中枢神经损伤是目前研究的热点之一。髓鞘相关蛋白主要包括髓鞘相关糖蛋白(MAG)，少突胶质细胞-髓鞘糖蛋白(OMgp)，Nogo-A(Myelin associated inhibitors:A link between injury-induced andexperience-dependent plasticity.Experimental Neurology,2012,235(1):43)，目前运用较多的拮抗剂为Nogo受体(NgR)抗体。有研究表明几种轴突再生抑制物与各自受体结合，都能引发胞内钙离子浓度提高，激活表皮生长因子受体（EpidermalGrowth Factor Receptor,EGFR），使EGFR磷酸化(EGFR activation mediatesinhibition of axon regeneration by myelin and chondroitin sulfate proteoglycans.Science,2005,310:106)，因此EGFR是有望促进轴突再生和神经干细胞(Neuralstem cells，NSCs)向神经元分化的另一个靶向位点。已有研究表明EGFR抗体可促进轴突再生和脊髓损伤修复，这也在我们先前的研究中得到了验证。但是联合EGFR抗体调控NSCs向神经元分化还未有报道。

研究表明，传统注射因子等给药途径取得的临床效果并不理想，因此，亟需找到一种理想的负载活性物质，且能使其在脊髓损伤处微环境一定时间内维持有效浓度的方法。

发明内容

目前，在国内外尚未见有文献资料报道缓释EGFR抗体来调控NSCs分化用于修复脊髓损伤的圆柱体支架及其应用方法。本发明的目的是克服目前临床上治疗脊髓损伤所使用方法的不足，应用我们构建的担载NSCs的交联有西妥昔的胶原（Col-cetuximab）海绵圆柱体支架治疗脊髓创伤性疾病，促进NSCs向神经元分化，促进轴突再生和运动功能修复。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架，包括胶原海绵圆柱体支架，所述胶原海绵圆柱体支架交联有表皮生长因子受体抗体西妥昔；通过交联有所述表皮生长因子受体抗体西妥昔的胶原海绵支架担载神经干细胞以促进移植的神经干细胞向神经元分化，构建成有利于受损伤脊髓神经再生及功能修复的圆柱体支架。

在本发明提供的实施例中，所述胶原海绵为孔隙结构。

在本发明提供的实施例中，所述胶原海绵圆柱体支架的横截面的直径为4mm，长度为4mm。

在本发明提供的实施例中，所述胶原海绵圆柱体支架的孔径为60μm-200μm。

在本发明提供的实施例中，所述胶原海绵圆柱体支架的孔隙率为98.6%。

另外，本发明还提供了一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架的应用方法，应用时将所述圆柱体支架移植到脊髓横断性损伤处。

采用上述技术方案，本发明的有益效果在于：

本发明提供的三维胶原海绵支架具有超高孔隙率，为细胞生长提供充足空间；更重要的是EGFR抗体西妥昔的缓释可缓解脊髓损伤后微环境中髓鞘蛋白的影响，促进移植的NSCs向神经元分化，抑制其向星形胶质细胞分化，并促进神经轴突的生长，以达到促进受损伤的脊髓神经再生及其功能修复，对危害人民健康较大的创伤性中枢神经疾病进行临床前研究，将会有力地推动整个创伤性中枢神经疾病防治研究领域的发展。

附图说明

图1为本发明实施例提供的圆柱体支架的用于脊髓损伤修复的示意图；其中，1为神经干细胞、2为EGFR抗体西妥昔、3为髓鞘蛋白、4为促进神经元细胞分化、5为EGFR受体、6为抑制星形胶质细胞分化。

图2中A为胶原海绵支架的总体形貌；B为胶原海绵支架的扫描电镜(SEM)照片；C为接种到胶原海绵支架上的NSCs荧光素双醋酸酯(FDA)染色的激光共聚焦显微镜照片；D为担载NSCs的胶原海绵支架SEM照片。

图3为采用化学交联和物理吸附法在胶原海绵支架上携带西妥昔含量的对比图。

图4为交联西妥昔海绵支架对存在髓鞘蛋白的环境中培养的NSCs分化的影响。其中，图4中A为TUj-1和GFAP免疫荧光染色照片；B为TUj-1阳性细胞比例统计结果；C为GFAP阳性细胞比例统计结果。

图5中A为支架材料植入大鼠脊髓半横断损伤部位照片；B为治疗3个月内BBB评分。

图6为用于修复脊髓损伤的圆柱体支架移植入大鼠脊髓半横断部位的NSCs的分化情况。其中，A为植入3个月后，MAP2免疫荧光染色照片显示神经干细胞向神经元分化情况；以及GFAP免疫荧光染色照片显示神经干细胞向星形胶质细胞分化情况；B为分化比例统计结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的用于修复脊髓损伤的圆柱体支架，包括胶原海绵圆柱体支架，其中，胶原海绵圆柱体支架交联有表皮生长因子受体抗体西妥昔；通过交联有表皮生长因子受体抗体西妥昔的胶原海绵支架担载神经干细胞以促进移植的神经干细胞向神经元分化，构建成有利于受损伤脊髓神经再生及功能修复的圆柱体支架。

以下结合实施例，对本发明上述用于修复脊髓损伤的圆柱体支架进行详细的说明。

实施例1-用于修复脊髓损伤的圆柱体支架的构建

1.多孔胶原海绵圆柱体支架的构建

胶原原材料溶解于0.5mol/L乙酸中并于4℃温度中静置8h，混合均匀后加入4mol/L NaOH中和，得到的均匀液体用去离子水透析5天，透析期间每3h换一次去离子水。透析后的溶液放入直径为4mm的模具中，冷冻干燥得到胶原海绵圆柱体支架。

2.交联EGFR抗体西妥昔的多孔胶原海绵支架的构建

用Traut’s Reagent（2-亚氨氢氯化硫醇）和Sulfo-SMCC（4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）两步偶联反应将西妥昔共价交联到胶原支架上。

具体步骤如下：将Traut’s Reagent和Sulfo-SMCC分别溶于PBS(PH8.0,4mmol/L EDTA)和PBS(PH7.2,4mmol/L EDTA)中，且浓度分别为2.5mg/mL和0.6mg/mL。将胶原海绵圆柱体支架浸泡于PBS(PH8.0,4mmol/L EDTA)中，用Traut’s Reagent与处理后胶原海绵圆柱体支架室温反应2h，将多余交联剂去除，并用PBS(PH7.2,4mmol/L EDTA)清洗三遍。同时将西妥昔与Sulfo-SMCC在PBS(PH7.2,4mmol/L EDTA)中室温反应1h，其中西妥昔与Sulfo-SMCC溶液的比例为8：3.7(μg/μL)。然后将上述反应产物与Traut’s Reagent处理后的胶原海绵圆柱体支架室温反应1h。反应后用PBS彻底清洗，并在5％牛血清蛋白(BSA)中浸泡1h，以中和多余反应基团，获取交联EGFR抗体西妥昔的多孔胶原海绵支架。

实施例2-用于修复脊髓损伤的圆柱体支架材料的表征

1.扫描电镜(SEM)观察胶原支架形貌及其孔径大小

将胶原海绵支架在干燥状态下喷金，在扫描电镜下观察、拍照。观察表面形貌，并在材料中取5个视野，统计孔径大小与范围。

2.Col-cetuximab海绵支架所负载西妥昔的检测

在西妥昔与胶原支架共价交联或简单吸附之后，用5％的BSA对胶原支架进行封闭，然后去除多余BSA，用PBS洗三次，加入碱磷酶标记的抗小鼠抗体，37℃孵育1h。将抗体吸除，用PBS洗三次，然后加入2mg/mL对硝基苯磷酸二钠盐(p-Npp)进行显色，p-Npp溶于AP缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，10mmol/LMgCl₂,pH9.6)。在酶标仪405nm处进行读数。

实施例3-用于修复脊髓损伤的圆柱体支架材料对NSCs的体外诱导分化作用

1.髓鞘蛋白的提取

采用非连续性蔗糖密度梯度离心法制得。从成年大鼠中取得脊髓，在0.3mol/L蔗糖溶液中匀浆破碎，然后缓慢铺到0.85mol/L的蔗糖上面。样品于27000g高速离心1h，在0.32/0.85mol/L蔗糖分界处收集提取到鞘蛋白片段。样品在去离子水中静置1h，然后于12000g离心收集样品。得到的样品用0.22μm滤膜过滤去除大团聚集物，并且灭菌，放置于-80℃待用。

2.原代NSCs的分离培养及接种到支架材料上

出生12h的SD乳鼠分离出端脑，剪碎，加干细胞培养液用钝头粗口滴管轻轻吹打直到组织团块消失，400目尼龙膜过滤，转移到培养瓶中成球培养，第四天时换液。第七天时将神经球用0.25%胰蛋白酶消化15min，消散成单细胞。将细胞接种于灭菌的胶原海绵支架中。

3.NSCs在胶原海绵支架中的存活、粘附及分布检测

胶原海绵支架接种NSCs后培养7天，进行FDA染色。

4.担载NSCs的胶原支架形貌

担载NSCs的胶原支架用4%多聚甲醛室温下固定30min后，PBS浸洗2次，使用系列梯度酒精(30%、50%、60%、70%、80%、90%和100%)进行细胞脱水，每个浓度下浸泡时间约15min。样品室温干燥，表面喷金后，用扫描电镜观察其微观形貌。

5.支架材料中NSCs分化的免疫荧光染色

担载NSCs的支架材料用4%多聚甲醛室温固定30min，PBS浸洗2次；100%FBS室温封闭1h，PBS洗1次；浸泡抗TUj-1,GFAP一抗，4℃，过夜，PBS洗3次；二抗孵育37℃，40min，PBS洗3次；50μg/mL Hoechst33342核衬染10min，PBS洗3次，最后观察拍照。

6.Western blot检测

培养7天后，收集到的细胞经蛋白裂解液处理得到的上层清液经过电泳和转膜。将膜用5%脱脂奶粉封闭1h。一抗稀释液室温下孵育1～2h,TBST室温下脱色摇床上洗六次，每次10min；二抗稀释液室温下孵育1～2h后TBST室温下洗六次，每次10min；然后进行化学发光反应。

实施例4-用于修复脊髓损伤的圆柱体支架材料对大鼠脊髓半横断损伤的修复效果

1.大鼠脊髓半横断损伤模型的建立

雌性成年SD大鼠，体重为200±25g。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，取俯卧位，大鼠腰背部脱毛，消毒，切开T13-L2皮肤和皮下，分离双侧棘突旁肌肉，拉钩拉开棘突旁肌肉，暴露出T13-L2棘突和椎板。小号持针器咬除棘突，再切除左侧椎板，内侧过中线，外侧至关节突内侧面，暴露出半侧脊髓及脊髓后正中静脉为止。用显微刀、显微拉钩、显微剪，沿后正中线纵向打开硬膜。紧贴脊髓后正中静脉在中线处纵行贯穿腹背切开脊髓，长约4mm，然后用横切刀从纵行切开处向外侧作间距2mm的由浅入深的横行切断。待止血后，将不同组的材料填充。特别注明动物实验中使用的是表达绿色荧光蛋白(GFP)的NSCs。

实验总共分为4组：

（1）胶原海绵支架材料；

（2）担载NSCs的胶原海绵支架材料；

（3）担载NSCs的加入1μg西妥昔的胶原海绵支架材料(Col-cetuximab1μg)；

（4）担载NSCs的加入5μg西妥昔的胶原海绵支架材料(Col-cetuximab5μg)。

2.动物行为学检测

所有动物于移植后1天及每周进行行为学检查，采用BBB评分等级法进行评分，分为0-21级，共22级。21分为功能正常，0分为功能完全丧失。BBB评分采用单盲检测方法，观察动物在空地上的损伤侧下肢即左侧下肢的行为，按照评分标准给分，观察时间为4分钟。

3.移植NSCs的免疫荧光染色

在手术后1个月和3个月，大鼠用4%多聚甲醛心脏灌注，将1.5cm长脊髓损伤部位取出，冰冻切片。切片在预冷丙酮中固定15min,放置于含有5%BSA和0.1%Trition X-100的PBS溶液中1h，然后用抗MAP2,GFAP，GFP一抗孵育，4℃过夜，PBS洗3次。相应的二抗Alexa488标记的驴抗兔二抗和Alexa 594标记的驴抗小鼠二抗室温孵育1h。细胞核用DAPI染色。

4.统计学分析

所有实验数据都是以Mean±SD表示，统计学差异是用SPSS软件分析，两组数据采用独立样本t检测，多组比较采用ANOVA分析，当P<0.05表示有显著差异，P<0.01表示有极显著差异。

实施例5-实验结果显示

1.圆柱体支架的用于脊髓损伤修复

请参阅图1，图1为本发明实施例提供的圆柱体支架的用于脊髓损伤修复的示意图，其中，1为神经干细胞、2为EGFR抗体西妥昔、3为髓鞘蛋白、4为促进神经元细胞分化、5为EGFR受体、6为抑制星形胶质细胞分化。

由图1所示，支架材料缓释EGFR抗体西妥昔，与髓鞘蛋白激活的EGFR受体相结合，阻断EGFR通路，以实现促进神经干细胞向神经元分化，而抑制其向星形胶质细胞分化目的。

2.胶原海绵支架的形貌及对NSCs的生物相容性

请参阅图2中A~D。其中，图2中A为胶原海绵支架的总体形貌；B为胶原海绵支架的SEM照片；C为接种到胶原海绵支架上的NSCs FDA染色的激光共聚焦显微镜照片；D为担载NSCs的胶原海绵支架SEM照片。

从图2中可以看出，胶原海绵是一种不规则、多孔隙结构材料。在本发明提供的实施例中，胶原海绵支架的孔径大小在60-200μm之间、横截面的直径为4mm，长度为4mm，孔隙率为98.6%。NSCs可在胶原海绵上很好的存活、粘附、并生长到孔隙内部。

3.交联西妥昔的海绵支架的建立

请参阅图3。图3为采用化学交联和物理吸附法在胶原海绵支架上携带西妥昔含量的对比图。

从图3中可以看出，与物理吸附法相比较，通过Traut’s Reagent和Sulfo-SMCC两步法交联到胶原支架材料上的西妥昔量明显提高。

4.交联适量西妥昔的胶原海绵支架可缓解髓鞘蛋白的抑制作用，促进NSCs向神经元分化，而抑制其向星形胶质细胞分化

请参阅图4中A~C。图4中A为TUj-1和GFAP免疫荧光染色照片；B为TUj-1阳性细胞比例统计结果；C为GFAP阳性细胞比例统计结果。

从图4中可以看出，培养基中含有髓鞘蛋白的环境下，胶原支架上NSCs向神经元分化比例为21%，向星形胶质细胞分化的比例为55%。而Col-cetuximab1μg支架上NSCs向神经元分化比例提高到34%，向星形胶质细胞分化的比例下降到48%。而Col-cetuximab2μg支架上NSCs向神经元分化比例却下降了。因此交联适量西妥昔的胶原支架可促进神经干细胞向神经元的分化，适于脊髓损伤修复。

5．担载NSCs的Col-cetuximab海绵支架可促进大鼠脊髓半横断损伤的运动能力恢复

请参阅图5。其中图5中A为支架材料植入大鼠脊髓半横断损伤部位照片；B为治疗3个月内BBB评分。

从图5中可以看出，担载NSCs的Col-cetuximab5μg海绵支架处理组老鼠的BBB评分大幅提高。

6.Col-cetuximab海绵支架可促进所担载NSCs在大鼠脊髓半横断部位向神经元分化，抑制其向星形胶质细胞分化

请参阅图6中A~B。其中，A为植入3个月后，MAP2免疫荧光染色照片显示神经干细胞向神经元分化情况，以及GFAP免疫荧光染色照片显示神经干细胞向星形胶质细胞分化情况；B为分化比例统计结果。

从图6中可以看出，治疗3个月后，移植到大鼠脊髓半横断损伤部位的胶原海绵支架中NSCs向神经元分化比例为14%，向星形胶质细胞分化比例为30%，而Col-cetuximab5μg支架组NSCs向神经元的分化比例提高到27%，向星形胶质细胞分化比例下降到16%。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架，其特征在于，包括胶原海绵圆柱体支架，所述胶原海绵圆柱体支架交联有表皮生长因子受体抗体西妥昔；通过交联有所述表皮生长因子受体抗体西妥昔的胶原海绵支架担载神经干细胞以促进移植的神经干细胞向神经元分化，构建成有利于受损伤脊髓神经再生及功能修复的圆柱体支架。

2.根据权利要求1所述的用于修复脊髓损伤的圆柱体支架，其特征在于，所述胶原海绵为多孔隙结构。

3.根据权利要求1或2所述的用于修复脊髓损伤的圆柱体支架，其特征在于，所述胶原海绵圆柱体支架的横截面的直径为4mm，长度为4mm。

4.根据权利要求1或2所述的用于修复脊髓损伤的圆柱体支架，其特征在于，所述胶原海绵圆柱体支架的孔径为60μm-200μm。

5.根据权利要求1或2所述的用于修复脊髓损伤的圆柱体支架，其特征在于，所述胶原海绵圆柱体支架的孔隙率为98.6%。

6.一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架的应用方法，其特征在于，应用时将所述圆柱体支架移植到脊髓横断性损伤处。

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