CN101954066A - 一种促进周围神经损伤修复的药物 - Google Patents
一种促进周围神经损伤修复的药物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101954066A CN101954066A CN2009100897177A CN200910089717A CN101954066A CN 101954066 A CN101954066 A CN 101954066A CN 2009100897177 A CN2009100897177 A CN 2009100897177A CN 200910089717 A CN200910089717 A CN 200910089717A CN 101954066 A CN101954066 A CN 101954066A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- growth factor
- collagen
- nerve
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 230000008439 repair process Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title abstract 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 44
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 claims abstract description 35
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 claims description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 33
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 17
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 15
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 238000005314 correlation function Methods 0.000 claims description 4
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 claims 12
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 abstract description 36
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 6
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 abstract description 3
- 101710129634 Beta-nerve growth factor Proteins 0.000 abstract description 2
- 206010039670 Sciatic nerve injury Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 48
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 11
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 7
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 6
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 230000007830 nerve conduction Effects 0.000 description 6
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 4
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 230000009519 contusion Effects 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 3
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100028188 Cystatin-F Human genes 0.000 description 2
- 101710169749 Cystatin-F Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100025599 Microfibrillar-associated protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710147473 Microfibrillar-associated protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000013674 S-100 Human genes 0.000 description 2
- 108700021018 S100 Proteins 0.000 description 2
- 102220369447 c.1352G>A Human genes 0.000 description 2
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 description 2
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 102000002734 Collagen Type VI Human genes 0.000 description 1
- 108010043741 Collagen Type VI Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- FQXXSQDCDRQNQE-UHFFFAOYSA-N markiertes Thebain Natural products COC1=CC=C2C(N(CC3)C)CC4=CC=C(OC)C5=C4C23C1O5 FQXXSQDCDRQNQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- QKQQEIVDLRUZRP-UHFFFAOYSA-N northebaine Natural products COC1=CC=C2C(NCC3)CC4=CC=C(OC)C5=C4C23C1O5 QKQQEIVDLRUZRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000001044 sensory neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种促进周围神经损伤修复的药物。本发明提供了与胶原特异结合的神经生长因子和/或与胶原特异结合的神经生长因子的编码基因在制备周围神经损伤修复的药物中的应用。本发明提供的周围神经损伤修复药物，它的活性成分为与胶原特异结合的神经生长因子和/或与胶原特异结合的神经生长因子的编码基因。本发明将CBD-NGF应用到体内，利用内源性神经细胞外基质胶原，将其特异的结合到神经受损部位，在神经元周围形成较高的浓度，降低β-NGF的有效用量，并以提高周围神经损伤的修复效率。CBD-NGF对坐骨神经的损伤有着更好的修复效果。本发明提供的药物具有很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进周围神经损伤修复的药物。
背景技术
神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)分子量为140kDa左右，由α、β、γ3种亚基借非共价键构成，其组合比例为α2βγ2(Greene and Shooter，1980)。其中β亚基是由两条相同的单链以非共价健连接而成的同源二聚体，其单链含有118个氨基酸残基。它是唯一具有NGF生物活性的片段，可以完全表现NGF的功能效应(Bax B，Blundell TL，Murray-Rust J，McDonald NQ(1997)Structure of mouse 7S NGF：a complex of nerve growth factor with four binding proteins.Structure 5：1275-1285.)。在生理情况下NGF可以调控交感和感觉神经元的生长发育及分化。周围神经损伤后，NGF可保护神经元并促进轴突再生。因此NGF对于神经系统疾病的治疗起着重要的作用(Sofroniew MV，Howe CL，Mobley WC(2001)Nerve growth factor signaling，neuroprotection，and neural repair.Annu Rev Neurosci 24：1217-1281.)。
胶原是神经元细胞外基质的主要成分之一，广泛分布在周围神经系统中，它与其他细胞外基质共同构成了神经元生长的空间支架(Yurchenco PD，Smirnov S，&Mathus T(2002)Analysis of basement membrane self-assembly and cellular interactions with native and recombinant glycoproteins.(Translated from eng)Methods in cell biology 69：111-144(in eng).)。
专利“与胶原特异结合的神经生长因子及其编码基因与应用”(专利号：200610081506.5)中提供了一种与胶原特异结合的神经生长因子(CBD-NGF)。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进周围神经损伤修复的药物。
本发明提供了与胶原特异结合的神经生长因子(CBD-NGF)和/或与胶原特异结合的神经生长因子的编码基因在制备周围神经损伤修复的药物中的应用。
所述与胶原特异结合的神经生长因子自氨基末端至羧基末端依次含有胶原结合结构域和神经生长因子β亚基的片段；所述胶原结合结构域为序列表的序列1自氨基末端第22-28位氨基酸残基；所述神经生长因子β亚基的片段为序列表的序列1自氨基末端第42-159位氨基酸残基。
所述与胶原特异结合的神经生长因子具体可为如下(a)或(b)或(c)的蛋白质：
(a)由序列表中序列1自氨基末端第22-159位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c)将(a)或(b)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与神经生长因子相关功能的由其衍生的蛋白质。
所述与胶原特异结合的神经生长因子的编码基因具体可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)其编码序列是序列表中序列2自5′端67-480位核苷酸所示的DNA分子；
2)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
所述周围神经损伤具体可为坐骨神经损伤。
本发明还保护一种周围神经损伤修复药物，它的活性成分为与胶原特异结合的神经生长因子和/或与胶原特异结合的神经生长因子的编码基因。
所述与胶原特异结合的神经生长因子自上游至下游依次含有胶原结合结构域和神经生长因子β亚基的片段；所述胶原结合结构域为序列表的序列1自氨基末端第22-28位氨基酸残基；所述神经生长因子β亚基的片段为序列表的序列1自氨基末端第42-159位氨基酸残基。
所述与胶原特异结合的神经生长因子具体可为如下(a)或(b)或(c)的蛋白质：
(a)由序列表中序列1自氨基末端第22-159位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c)将(a)或(b)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与神经生长因子相关功能的由其衍生的蛋白质。
所述与胶原特异结合的神经生长因子的编码基因具体可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)其编码序列是序列表中序列2自5′端67-480位核苷酸所示的DNA分子；
2)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
所述周围神经损伤具体可为坐骨神经损伤。
本发明将CBD-NGF应用到体内，利用内源性神经细胞外基质胶原，将其特异的结合到神经受损部位，在神经元周围形成较高的浓度，降低β-NGF的有效用量，并以提高周围神经损伤的修复效率。CBD-NGF对坐骨神经的损伤有着更好的修复效果。本发明提供的药物具有很好的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1中CBD-NGF在胶原上的缓释能力检测结果。
图2为实施例2中CBD-N6F在体内的缓释能力检测结果；A：大鼠坐骨神经胶原含量的western blot检测；B：NGF在体内的缓释能力检测。
图3为实施例3中大鼠坐骨神经损伤修复SFI检测结果。
图4为实施例3中神经冲动传导速度的测定结果。
图5为实施例3中远端复合肌肉动作电位测定的测定结果。
图6为实施例3中大鼠神经的染色图片；A：大鼠坐骨神经石蜡切片的HE染色结果；B：大鼠坐骨神经石蜡切片的抗神经丝蛋白免疫染色结果；C：大鼠坐骨神经石蜡切片的抗S100蛋白免疫染色结果。
图7为实施例3中大鼠坐骨神经抗神经丝蛋白免疫染色统计结果。
图8为实施例3中大鼠坐骨神经抗S100免疫染色统计结果。
图9为实施例3中大鼠坐骨神经的半薄切片的甲苯胺蓝染色图片。
图10为实施例3中大鼠坐骨神经髓鞘数目的统计结果。
图11为实施例3中大鼠坐骨神经髓鞘直径大小的统计结果。
图12为实施例3中大鼠坐骨神经超薄切片的透射电镜图片。
图13为实施例3中大鼠坐骨神经髓鞘厚度的统计结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
采用专利“与胶原特异结合的神经生长因子及其编码基因与应用”(专利号：200610081506.5)中实施例1的方法制备CBD-NGF和NAT-NGF。
实施例1、CBD-NGF体外缓释能力的检测
将10μM的CBD-NGF(或10μM的NAT-NGF)分别加载在不同的胶原膜(购于烟台正海生物技术公司)，然后浸泡在PBS中，在不同时间点利用改进的ELISA实验来检测残留在胶原表面的NGF含量(Finnis ML，Gibson MA(1997)Microfibril-associated glycoprotein-1(MAGP-1)binds to the pepsin-resistant domain of the alpha3(VI)chain of type VI collagen.J Biol Chem 272：22817-22823.)，从而确定其释放速度。
图1显示的是等量的NAT-NGF和CBD-NGF在0-14天的释放量。结果显示，在相同的蛋白加载量情况下，14天内每个时间点CBD-NGF从膜上的释放速度都要显著低于NAT-NGF，也就是说CBD-NGF的释放速度明显低于NAT-NGF，在胶原上具有更好的体外缓释能力。
实施例2、CBD-NGF体内缓释能力的检测
提取大鼠坐骨神经蛋白，利用western blot检测大鼠坐骨神经细胞外基质的胶原含量。然后将CBD-NGF(或等量的NAT-NGF)和的分别注射到大鼠坐骨神经钝挫伤部位，在不同时间点(注射后3h、12h)利用western blot检测残留在大鼠坐骨神经受损部位的NGF含量。
大鼠坐骨神经细胞外基质的胶原的western blot检测结果见图2A。结果表明：大鼠的坐骨神经神经细胞外基质中胶原含量丰富。
大鼠坐骨神经受损部位的NGF含量的western blot检测结果见图2B。结果表明：CBD-NGF在坐骨神经受损部位的残留量都要明显高于NAT-NGF，表明CBD-NGF在体内的释放速度都要显著低于NAT-NGF，在体内具有更好的缓释能力。
实施例3、CBD-NGF对大鼠坐骨神经钝挫伤的修复
体内检测CBD-NGF促神经再生活性可采用经典的坐骨神经损伤修复的方法，即将CBD-NGF应用到坐骨神经损伤部位，在不同时间点做行为学、电生理学、组织化学以及透射电镜等检测，从而确定它对坐骨神经损伤的修复能力。用NAT-NGF作为对照。
选用成年雄性SD大鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)，随机分成三个处理组，每组20只大鼠。将大鼠暴露和分离坐骨神经，在距梨状肌下缘0.5cm处钳夹坐骨神经，钝挫伤宽度为5mm。然后在损伤远端用尼龙线在神经外膜上作一记号，然后分别进行如下给药处理：
第一组(CBD-NGF组)：将10μl浓度为30μM的CBD-NGF注射到损伤部位，并缝合伤口。
第二组(NAT-NGF组)：将10μl浓度为30μM的NAT-NGF注射到损伤部位，并缝合伤口。
第三组(对照组)：将10μl PBS注射到损伤部位，并缝合伤口。
1、神经功能指数(SFI)
于术后的不同时间进行足迹实验。在正常情况下，大鼠的脚趾完全伸展，但损伤后，脚趾会发生并拢。这种足迹的变化可以通过检测坐骨神经功能指数SFI评价。选实验侧足(E)及正常侧足(N)清晰的足印测量3个变量，精确到0.1mm。
①PL(足印长度)：即足跟到足尖的最长距离。
②TS(足趾宽度)：第1-5趾连线的最长距离。
③IT(中间足趾距离)：第2-4趾连线的最长距离。
将3个变量带入Bain公式计算出SFI.
SFI＝-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS-NTS)/NTS+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8。
以0为SFI的正常值，-100为神经完全断离指标。
结果见图3。结果表明：在刚损伤时，CBD-NGF、NAT-NGF和对照组之间没有显著性差异；随后的几周，NAT-NGF和CBD-NGF组的SFI数值明显增高，与对照组有显著性差异；在手术后第35、42和56天，CBD-NGF组的SFI数值显著高于NAT-NGF组。
2、神经传导速度(NCV)和远端复合肌肉动作电位(DCMAP)
在坐骨神经损伤前的大鼠，坐骨神经损伤后给药前的大鼠，以及给药后4周、8周、12周的大鼠进行电生理学检测，这一指标的检测包括两个参数，神经传导速度(nerve conduction velocity，NCV)和远端复合肌肉动作电位(distal compound muscle action potential，DCMAP)。
神经传导速度和远端复合肌肉动作电位的测定方法：实验采用英国OXFORD公司生产的Medelec Synergy型肌电诱发电位仪描记CMAP及NCV。测定CMAP参数为：扫描时间：10ms，灵敏度：100μv，滤波：3HZ～10HZ。将双极刺激电极(包括作用电极和参考电极)分别放置于近端-坐骨神经(坐骨切迹水平)和远端-胫神经(tibral nerve)(内踝水平)，记录电极放置于同侧足内肌，地电极置于记录电极和刺激电极之间，测定刺激远端神经，在足内肌记录到潜伏期和DCMAP，测量近端和远端两点之间的距离，计算NCV。计算方法如下：神经传导速度＝传导距离/传导所需时间。
结果见图4和图5。结果表明，坐骨神经损伤后，两个参数都显著降低，并随着时间的推移慢慢有所恢复。在12周，与对照组相比，NAT-NGF和CBD-NGF组的神经传导速度和远端复合肌肉动作电位都显著提高，并且CBD-NGF组明显高于NAT-NGF组。
3、免疫组化
分别对三个处理组的大鼠和未经任何处理的雄性SD大鼠坐骨神经进行免疫组化实验。实验中，使用2种抗体，抗神经丝蛋白和抗S100抗体。抗神经丝蛋白抗体可以对轴突进行特异性染色，抗S100抗体可以对施旺细胞特异性染色。
大鼠手术后8周的染色结果见图6。图6中，A：大鼠坐骨神经石蜡切片的HE染色结果；B：大鼠坐骨神经石蜡切片的抗神经丝蛋白免疫染色结果；C：大鼠坐骨神经石蜡切片的抗S100蛋白免疫染色结果。
利用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)对染色后的切片进行统计分析。图7为大鼠坐骨神经抗神经丝蛋白免疫染色统计结果。图8为大鼠坐骨神经抗S100免疫染色统计结果。
在损伤后4、8周和12周，三组之间的神经丝蛋白表达都有显著性差异，其中CBD-NGF组的蛋白表达都要明显高于其他两组。在损伤后4、8和12周，NAT-NGF和CBD-NGF组的S100蛋白表达都要显著高于对照组，并且在第8周，NAT-NGF和CBD-NGF两组之间的S100蛋白表达也有显著性差异。结果表明：在坐骨神经损伤后修复中，CBD-NGF组的轴突和施旺细胞的再生都要明显好于其他两组。
4、甲苯胺蓝染色
大鼠手术后4周、8周、12周，分别对三个处理组的大鼠和未经任何处理的雄性SD大鼠坐骨神经的半薄切片的甲苯胺蓝染色，其中大鼠手术后4周的染色结果见图9。
利用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)对大鼠手术后不同时间的染色后的半薄切片进行统计分析。图10为大鼠坐骨神经髓鞘数目的统计结果。图11为大鼠坐骨神经髓鞘直径大小的统计结果。
结果表明：NAT-NGF和CBD-NGF组的髓鞘数目都要显著高于对照组，并且在损伤后第8周和第12周，CBD-NGF组与对照组和NAT-NGF组之间都具有显著性差异。髓鞘直径大小结果如图11所示，在损伤后第4周，三组之间的髓鞘直径大小都具有显著性差异，并且在损伤后第8周，CBD-NGF组的髓鞘直径大小要显著高于对照组。
5、透射电镜
大鼠手术后4周、8周、12周，分别对三个处理组的大鼠坐骨神经的超薄切片进行透射电镜检测。图12为手术后12周大鼠坐骨神经超薄切片的透射电镜结果。
利用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics)对大鼠手术后不同时间的透射电镜结果进行统计。图13为大鼠坐骨神经髓鞘厚度的统计结果。结果表明：从第4周开始，CBD-NGF组损伤部位髓鞘的厚度要明显高于对照组，并且在第8周和12周，CBD-NGF组与NAT-NGF组之间都有显著性差异。
序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>一种促进周围神经损伤修复的药物
<130>CGGNARY92410
<160>2
<210>1
<211>159
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Gly Ser Ala Gly
20 25 30
Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly Lys Leu Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
35 40 45
His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
50 55 60
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
65 70 75 80
Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
85 90 95
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
100 105 110
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val
115 120 125
Lys Ala Leu Thr Met Asp 6ly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg
130 135 140
Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg
145 150 155
<210>2
<211>480
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgactaaga aaaccctgcg tactggtagc gcgggcagtg ctgcgggttc tggcggtaag 120
ctttcatcat cccatcccat cttccacagg ggcgaattct cggtgtgtga cagtgtcagc 180
gtgtgggttg gggataagac caccgccaca gacatcaagg gcaaggaggt gatggtgttg 240
ggagaggtga acattaacaa cagtgtattc aaacagtact tttttgagac caagtgccgg 300
gacccaaatc ccgttgacag cgggtgccgg ggcattgact caaagcactg gaactcatat 360
tgtaccacga ctcacacctt tgtcaaggcg ctgaccatgg atggcaagca ggctgcctgg 420
cggtttatcc ggatagatac ggcctgtgtg tgtgtgctca gcaggaaggc tgtgagatga 480
Claims (10)
1.与胶原特异结合的神经生长因子和/或与胶原特异结合的神经生长因子的编码基因在制备周围神经损伤修复的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述与胶原特异结合的神经生长因子自氨基末端至羧基末端依次含有胶原结合结构域和神经生长因子β亚基的片段；所述胶原结合结构域为序列表的序列1自氨基末端第22-28位氨基酸残基；所述神经生长因子β亚基的片段为序列表的序列1自氨基末端第42-159位氨基酸残基。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述与胶原特异结合的神经生长因子为如下(a)或(b)或(c)的蛋白质：
(a)由序列表中序列1自氨基末端第22-159位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c)将(a)或(b)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与神经生长因子相关功能的由其衍生的蛋白质。
4.如权利要求1至3中任一所述的应用，其特征在于：所述与胶原特异结合的神经生长因子的编码基因为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)其编码序列是序列表中序列2自5′端67-480位核苷酸所示的DNA分子；
2)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
5.如权利要求1至4中任一所述的应用，其特征在于：所述周围神经损伤为坐骨神经损伤。
6.一种周围神经损伤修复药物，它的活性成分为与胶原特异结合的神经生长因子和/或与胶原特异结合的神经生长因子的编码基因。
7.如权利要求6所述的药物，其特征在于：所述与胶原特异结合的神经生长因子自氨基末端至羧基末端依次含有胶原结合结构域和神经生长因子β亚基的片段；所述胶原结合结构域为序列表的序列1自氨基末端第22-28位氨基酸残基；所述神经生长因子β亚基的片段为序列表的序列1自氨基末端第42-159位氨基酸残基。
8.如权利要求7所述的药物，其特征在于：所述与胶原特异结合的神经生长因子为如下(a)或(b)或(c)的蛋白质：
(a)由序列表中序列1自氨基末端第22-159位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c)将(a)或(b)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与神经生长因子相关功能的由其衍生的蛋白质。
9.如权利要求6至8中任一所述的药物，其特征在于：所述与胶原特异结合的神经生长因子的编码基因为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)其编码序列是序列表中序列2自5′端67-480位核苷酸所示的DNA分子；
2)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
10.如权利要求6至9中任一所述的药物，其特征在于：所述周围神经损伤为坐骨神经损伤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100897177A CN101954066A (zh) | 2009-07-21 | 2009-07-21 | 一种促进周围神经损伤修复的药物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100897177A CN101954066A (zh) | 2009-07-21 | 2009-07-21 | 一种促进周围神经损伤修复的药物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101954066A true CN101954066A (zh) | 2011-01-26 |
Family
ID=43481822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009100897177A Pending CN101954066A (zh) | 2009-07-21 | 2009-07-21 | 一种促进周围神经损伤修复的药物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101954066A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103127552A (zh) * | 2013-02-05 | 2013-06-05 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架及其应用方法 |
| CN104001212A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-08-27 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 含双因子的外周神经损伤修复胶原材料及其制备方法 |
| CN105561300A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-05-11 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种用于促进颅脑损伤后神经功能修复的组合物及其制备方法和用途 |
| CN111214651A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-06-02 | 中山大学附属第一医院 | 六型胶原蛋白在制备能提高再生神经有序性相关药物及移植物中的应用 |
-
2009
- 2009-07-21 CN CN2009100897177A patent/CN101954066A/zh active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103127552A (zh) * | 2013-02-05 | 2013-06-05 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架及其应用方法 |
| CN103127552B (zh) * | 2013-02-05 | 2015-01-21 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架及其应用方法 |
| CN104001212A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-08-27 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 含双因子的外周神经损伤修复胶原材料及其制备方法 |
| CN104001212B (zh) * | 2014-05-29 | 2015-08-19 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 含双因子的外周神经损伤修复胶原材料及其制备方法 |
| CN105561300A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-05-11 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种用于促进颅脑损伤后神经功能修复的组合物及其制备方法和用途 |
| CN111214651A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-06-02 | 中山大学附属第一医院 | 六型胶原蛋白在制备能提高再生神经有序性相关药物及移植物中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vilim et al. | Gene for pain modulatory neuropeptide NPFF: induction in spinal cord by noxious stimuli | |
| Illes | Modulation of transmitter and hormone release by multiple neuronal opioid receptors | |
| Sleeman et al. | The ciliary neurotrophic factor and its receptor, CNTFRα | |
| Moriarty et al. | Characterization of cholecystokininA and cholecystokininB receptors expressed by vagal afferent neurons | |
| Moody et al. | Bombesin-like peptides and associated receptors within the brain: distribution and behavioral implications | |
| KR101491860B1 (ko) | Ｍｕ-코노톡신 펩티드 및 국소 마취제로서 그의 용도 | |
| Breen et al. | Effects of fasting, leptin, and insulin on AGRP and POMC peptide release in the hypothalamus | |
| KR102052983B1 (ko) | 펩타이드 호르몬의 칼시토닌 cgrp 패밀리의 펩타이드 길항제 및 그의 용도 | |
| DE777732T1 (de) | Modulatoren von dem körpergewicht, entsprechende nukleinsaüre und proteine, und diagnostische und therapeutische anwendungen davon | |
| Stengel et al. | The role of brain somatostatin receptor 2 in the regulation of feeding and drinking behavior | |
| ZA200705031B (en) | Y4 selective receptor agonists for therapeutic interventions | |
| Sumners et al. | Angiotensin II receptor subtypes in neuronal cells | |
| CN101954066A (zh) | 一种促进周围神经损伤修复的药物 | |
| Choi et al. | ICV leptin effects on spontaneous physical activity and feeding behavior in rats | |
| Kinkead et al. | Neurotensin, schizophrenia, and antipsychotic drug action | |
| Xu et al. | New high affinity peptide antagonists to the spinal galanin receptor | |
| Ciriello et al. | Co-localization of hypocretin-1 and leucine-enkephalin in hypothalamic neurons projecting to the nucleus of the solitary tract and their effect on arterial pressure | |
| Marmigère et al. | GABA–glutamate interaction in the control of BDNF expression in hypothalamic neurons | |
| US20060025344A1 (en) | Ghrelin receptor inverse agonists for regulation of feeding behaviors | |
| Kuipers et al. | Cyclic angiotensin-(1-7) contributes to rehabilitation of animal performance in a rat model of cerebral stroke | |
| Abramov et al. | Regulation of feeding by galnon | |
| Qu et al. | Agouti-related protein is a mediator of diabetic hyperphagia | |
| Sato et al. | Effects of gender on the central actions of neuropeptide Y and norepinephrine on vasopressin and blood pressure in the rat | |
| Vasilaki et al. | The somatostatin receptor (sst1) modulates the release of somatostatin in the nucleus accumbens of the rat | |
| Xu et al. | The effects of intrathecal galanin message-associated peptide (GMAP) on the flexor reflex in rats |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110126 |