CN106267368B - 西妥昔单抗与负载该物质的胶原支架在制备修复脊髓损伤药物中的应用 - Google Patents
西妥昔单抗与负载该物质的胶原支架在制备修复脊髓损伤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种西妥昔单抗与负载该物质的胶原支架在制备修复脊髓损伤药物中的应用。同时还提供了负载了Cetuximab的神经再生胶原支架材料，其制备方法，包括如下步骤：1)使神经再生胶原支架材料吸收Cetuximab，得到含有Cetuximab的神经再生胶原支架材料；2)对步骤1)中得到的负载Cetuximab的神经再生胶原支架材料进行孵育，即可得到。通过试验发现西妥昔单抗与负载该物质的胶原支架均能达到修复脊髓损伤、促进神经再生和/或减少脊髓损伤部位胶质细胞增生的效果，在未来临床脊髓损伤修复的应用具有重要的现实指导意义。
Description
技术领域
本发明属于医疗领域，具体涉及一种西妥昔单抗与负载该物质的胶原支架在制备修复脊髓损伤药物中的应用。
背景技术
脊髓是中枢神经的重要组成部分，主要功能是传送脑与外周之间的神经信息同时也是许多简单反射活动的低级中枢。脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)多见于砸伤、摔伤、交通事故、运动性损伤和一些如地震及矿难等自然灾难中。脊髓损伤后通常表现为损伤节段以下的躯体丢失感觉与自主运动功能，而与外周神经不同，脊髓神经元在损伤后很难自发再生进入或跨越损伤区[Neumann S,Bradke F,Tessier-Lavigne M,BasbaumAI.Regeneration of sensory axons within the injured spinal cord induced byintraganglionic cAMP elevation.Neuron.2002；34:885-93.；Qiu J,Cai CM,Dai HN,McAtee M,Hoffman PN,Bregman BS,et al.Spinal axon regeneration induced byelevation of cyclic AMP.Neuron.2002；34:895-903.]。影响脊髓损伤后轴突再生的抑制因素主要包括以下两类：首先，脊髓损伤后，星型胶质细胞、小胶质细胞以及少突胶质细胞等胶质细胞活化、增生以致胶质疤痕形成。研究表明，在脊髓损伤后几天之内损伤区周围的反应性星形胶质细胞大量表达硫酸软骨素蛋白聚糖类(CSPGs)这类神经再生抑制分子[Filbin MT.Recapitulate development to promote axonal regeneration:good orbad approach，Philos T R Soc B.2006；361:1565-74.]。CSPGs除了能以瘢痕的形式在空间上影响轴突再生，还能激活神经元内PKC信号通路继而活化Rho来抑制神经再生[Sivasankaran R,Pei J,Wang KC,Zhang YP,Shields CB,Xu XM,et al.PKC mediatesinhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonalregeneration.Nature neuroscience.2004；7:261-8.]。此外，髓鞘来源的髓鞘相关蛋白同样具有抑制神经轴突再生的作用，其主要包括Nogo-A，MAG和OMgp等，这三种抑制分子均可以与NgR1识别结合，与配体结合后NgR1会进一步招募p75、TROY和LINGO-1形成受体复合物，随后抑制信号传导进入细胞内引起RhoA磷酸化，细胞骨架重排最终轴突生长被抑制[HeZG,Koprivica V.The Nogo signaling pathway for regeneration block.Annualreview of neuroscience.2004；27:341-68.]。有研究表明髓鞘相关蛋白与其受体结合后，能引发胞内钙离子浓度提高，进而激活表皮生长因子信号通路，表皮生长因子受体(EGFR)激活后活化Rho-Rac信号，导致轴突生长锥塌陷，从而抑制轴突再生[Koprivica V,Cho KS,Park JB,Yiu G,Atwal J,Gore B,et al.EGFR activation mediates inhibition ofaxon regeneration by myelin and chondroitin sulfate proteoglycans.Science.2005；310:106-10.]。
目前EGFR抗体已经用于临床的药物是Cetuximab，但是该药物主要是用于临床治疗肿瘤疾病(如直肠癌，食道癌等)[Malik H,Khan AZ,Berry DP,Cameron IC,Pope I,Sherlock D,Helmy S,Byrne B,Thompson M,Pulfer A,Davidson B.Liver resectionrate following downsizing chemotherapy with cetuximab in metastaticcolorectal cancer:UK retrospective observational study.Eur J Surg Oncol.2015；41(4):499-505；Tian X,Zhou JG,Zeng Z,Shuai T,Yi LJ,Ma L,Wang Y,Cao H,SongGM.Cetuximab in patients with esophageal cancer:a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials.Med Oncol.2015；32(4):127.]，但未见有用于脊髓损伤修复的临床报道。
我们前期研制的神经再生胶原支架除了具有良好的生物相容性之外，还根据脊髓神经元细胞的神经纤维纵向有序生长的特点能够引导神经纤维有序延伸。通过大鼠及全横断脊髓损伤模型证实，神经再生胶原支架能够减少损伤面积扩散，引导神经纤维有序再生[Han QQ,Sun WJ,Lin H,Zhao WX,Gao Y,Zhao YN,et al.Linear Ordered CollagenScaffolds Loaded with Collagen-Binding Brain-Derived Neurotrophic FactorImprove the Recovery of Spinal Cord Injury in Rats.Tissue Eng Pt A.2009；15:2927-35.]。
发明内容
本发明的目的是提供Cetuximab或负载Cetuximab的神经再生胶原支架材料在制备具有如下(1)、(2)、(3)、(4)和(5)功能中至少一种的产品中的应用：(1)修复脊髓损伤；(2)促进神经再生；(3)减少脊髓损伤部位胶质细胞增生；(4)引导受损神经纤维的有序再生；(5)引导脊髓损伤后内源性的神经前体细胞和神经元向损伤区的迁移。
本发明所述的Cetuximab购自德国默克里昂制药公司，商品规格为100毫克/20毫升/瓶)。
本发明的再一个目的是提供具有如下(1)、(2)、(3)、(4)和(5)功能中至少一种的药物，该药物是负载了Cetuximab的神经再生胶原支架材料：(1)修复脊髓损伤；(2)促进神经再生；(3)减少脊髓损伤部位胶质细胞增生；(4)引导受损神经纤维的有序再生；(5)引导脊髓损伤后内源性的神经前体细胞和神经元向损伤区的迁移。
本发明所述药物中的神经再生胶原支架材料是通过如下方法而制备得到：
a)将筋膜用体积百分浓度为1-1.5％的磷酸三丁酯溶液处理24-72h；
b)再用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol/L、pH为7.6-8.5的Tris-HCl缓冲液处理24-72h；
c)最后，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml缓冲液处理48-96h，得到所述有序胶原材料，即神经再生胶原支架材料，其中，所述缓冲液为25-100mmol/L Tris-HCl，pH为7-8。
上述方法中，步骤a)中，所述磷酸三丁酯溶液的溶剂为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
所述筋膜在处理前还要去除内层粘附的肌肉组织和外层粘附的脂肪。
步骤b)和c)中，所述处理的温度均为2-8℃，优选是4℃。
步骤c)中，所述神经再生胶原支架材料还包括将其用浓度为0.5-1.5mol/L强碱溶液处理5-10min的步骤。
本发明所述药物的制备方法，包括如下步骤：
1)使神经再生胶原支架材料吸收Cetuximab，得到含有Cetuximab的神经再生胶原支架材料；
2)对步骤1)中得到的含有Cetuximab的神经再生胶原支架材料进行孵育，得到所述功能神经再生胶原支架材料，即所述药物。
上述制备方法中，步骤1)中，所述使神经再生胶原支架材料吸收Cetuximab具体可按如下步骤操作：将长度为4-6mm、直径为2-3mm神经再生胶原支架材料浸泡在20-50μL、5μg/μL的Cetuximab溶液中，使其充分吸收Cetuximab。
所述神经再生胶原支架材料吸收Cetuximab的量主要依据实验动物的体重而定的。
上述制备方法中，步骤2)中，所述孵育是在0-10℃下孵育20-30min，具体可在0℃下孵育20-30min。
本发明通过将EGFR(表皮生长因子受体)Cetuximab(西妥昔单抗)应用于大鼠的小脑颗粒神经元细胞上，发现在髓鞘蛋白抑制条件下，Cetuximab能有效促进神经元细胞神经丝伸长的作用。
本发明具体通过将神经再生胶原支架材料与EGFR Cetuximab进行复合后移植到犬T8脊髓全横断损伤模型之中，通过九个月的恢复和观察，我们的研究证明移植复合EGFRantibody(表皮生长因子受体抗体)得到的功能神经再生胶原支架能够更好地促进神经纤维再生进入损伤区，并能明显减少损伤区胶质瘢痕及其抑制分子CSPG的沉积。同时移植功能神经再生胶原支架组的犬在损伤后能自发引导神经前体细胞和神经元向损伤区迁移，这些进入损伤区的神经元包括运动和感觉神经元，它们在损伤区内能实现很好的髓鞘化，并能产生功能性的突触结果，为受损脊髓的功能性再生提供了中继的角色。另外，移植功能神经再生胶原支架组的犬术后表现出明显优于空白对照和移植单纯神经再生胶原支架组犬的运动功能恢复，这也表明本研究中的移植功能 神经再生胶原支架治疗策略具有更好的修复效果及良好的临床应用前景。
本发明通过犬全横断脊髓损伤模型发现神经再生胶原支架材料除了作为支架引导神经再生的作用，移植胶原支架材料后脊髓损伤部位的胶质瘢痕相关的标志物GFAP或CSPGs明显减少，这说明神经再生胶原支架除了为神经再生提供支撑和方向上的引导外，还可以明显抑制胶质瘢痕的形成。同时，在该研究中，我们还证明，通过将EGFRCetuximab复合神经再生胶原支架后移植到脊髓损伤区域能在髓鞘抑制分子Nogo存在的情况下有效促进神经纤维的再生。此外，拮抗EGFR信号还能调动大量内源性的神经前体细胞及(或)神经元自发迁移进入到损伤区域，并能有效地再髓鞘化及形成功能性的突出联系。综上所述，本研究中以EGFR Cetuximab与胶原支架材料复合形成的功能神经再生胶原支架在未来临床脊髓损伤修复的应用具有重要的现实指导意义。
附图说明
图1为实施例1中体外小脑颗粒神经元细胞的神经丝、髓鞘蛋白存在下的小脑颗粒神经元细胞的神经丝和EGFR Cetuximab+髓鞘蛋白存在下的小脑颗粒神经元细胞的神经丝的形态和长度图。
图2为实施例2中脊髓损伤修复的神经再生胶原支架(A)；及其与EGFR抗体复合后准备移植时的形态(B)。
图3为实施例3中(A)犬T8脊髓全横断模型建立；(B)术中电生理监测犬T8脊髓全横断模型质量。
图4为实施例3中Masson染色观察各组胶原性瘢痕沉积情况，其中，放大区域的标尺为100μm。
图5为实施例3中CSPG染色观察各组反应性星型胶质细胞及胶质瘢痕沉积情况，其中上侧含黄色框的图片内标尺为500μm，下侧放大图的标尺为50μm。图中的“Chondroitinsulfate/GFAP”为“硫酸软骨素/胶质纤维酸性蛋白”。
图6为实施例3中NF蛋白在各组的表达情况，其中左侧含黄色框的图片内标尺为500μm，右侧放大图的标尺为50μm，图中的“GFAP/NF/DAPI”为“胶质纤维酸性蛋白/神经丝蛋白/细胞核荧光染料DAPI”。
图7为实施例3中新生神经元标志物Tuj-1、成熟神经元标志物Map2以及神经前体细胞标志物Nestin蛋白在各组的表达情况，其中A、B和C内含有中文标注的图片内标尺为500μm，下侧放大图的标尺为50μm。
图8为实施例3中运动神经元标志物5-HT、感觉神经元标志物TH在移植功能神经再生胶原支架组中的具体表达情况(A和C)和在三组中表达量的比较(E)；B和D表示在移植功能神经再生胶原支架组损伤区内5-HT和TH神经纤维的再髓鞘化；F表示功能 性突触标志物SYN在各组中的表达。其中，A、C和F中的标尺表示500μm,B和D中的标尺表示50μm。
图9为实施例3中术后行为学评分情况。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用神经再生胶原支架材料是本实验室自制，方法参照专利ZL200510098731.5，具体制备步骤如下：
1)预处理筋膜：取新鲜带有白色筋膜的成年牛肌肉，用冷的去离子水冲洗3遍，用镊子和手术刀分离出筋膜，尽量去除内层粘附的肌肉组织和外层的脂肪等组织；
2)将预处理筋膜按如下步骤制备有序神经再生胶原支架：(a)1％TnBP(磷酸三丁酯)溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0，体积百分比)中处理48h；(b)50mM Tris-Cl buffer(pH＝8.0，含有1M NaCl)中处理48h；(c)1g胰蛋白酶/100ml(50mM Tris-HCl缓冲液，pH＝8.0)中处理72h；(d)1M NaOH中处理5min，充分清洗直至中性，冻干，即得到有序胶原材料(LOCS丝)，命名为神经再生胶原支架材料。
所制备得到的神经再生胶原支架材料颜色为白色，形状可根据实际情况制备，具体可为片状、管状或纤维状；神经再生胶原支架保持了天然胶原纤维的结构，其具有有序的粗糙表面结构，利于细胞的贴附；本发明采用有序神经再生胶原支架。
实施例1、EGFR(表皮生长因子受体)Cetuximab(西妥昔单抗)能促进体外小脑颗粒神经元细胞在髓鞘蛋白抑制条件下的神经丝伸长。
以新生7天大鼠的小脑颗粒神经元细胞(分离培养方法：将动物浸入75％乙醇中浸泡2-5min。在超净台中，断头，分离出小脑，取出放入预冷的PBS中，仔细地剔除血管和脑膜。弯剪剪碎，加DMEM高糖培养液，并用钝头粗口滴管轻轻吹打直到组织团块消失。然后用高温高压灭菌的400目尼龙膜过滤，离心1000rpm，5min，弃上清，按20000-30000个细胞每孔接种到含20％胎牛血清的DMEM高糖培养基的48孔板内，培养于提前铺被有200ng髓鞘蛋白(提取方法采用非连续性蔗糖密度梯度离心法。具体为从成年大鼠中取得脊髓，在0.3M蔗糖溶液中匀浆破碎，然后铺到密度梯度为1.23和0.85M蔗糖浓度上。样品于75000g离心45min。在0.85/1.23M蔗糖分界处收集提 取的鞘蛋白片段。粗提取物用渗透压休克洗两次，重悬于0.32M蔗糖溶液中，成铺到0.85M蔗糖溶液，离心，于0.32/0.85M蔗糖分界处收集鞘蛋白，除去多余的蔗糖，鞘蛋白按1：1比例溶解于DMEM培养基，匀浆后放-80℃备用)的48孔细胞培养板中，处理组加入5μg的Cetuximab，培养24h后检测神经丝的伸长情况。
其中，小脑颗粒神经元细胞的神经丝免疫荧光染色步骤如下：
(1)吸净孔板内的培养基，用PBS清洗细胞1-2次。
(2)固定：4％多聚甲醛，室温，20min后，用PBS洗3次
(3)封闭：100％FBS，室温1h后，用PBS洗1次
(4)一抗孵育：用抗βⅢTubulin(1:500，购自Millipore公司，货号05-559)，4℃，过夜，后用PBS洗3次
(5)二抗孵育：按说明稀释荧光二抗(购自invitrogen公司，货号分别为：Alexa488 Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)；CA21202s；Alexa594 Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L)，A21207)于37℃孵育40min，后用PBS洗3次
(6)核衬染：50μg/ml Hoechst 33342(购自sigma公司)，10min，PBS洗3次
(7)显微镜下观察，照相。
相应测试结果如图1所示，从图1可以看出：与对照组和髓鞘蛋白组相比，处理组(即髓鞘蛋白+EGFR抗体)在具抑制蛋白存在的情况下，Cetuximab能有效促进神经元细胞神经丝伸长的作用。
实施例2、制备含EGFR(表皮生长因子受体)Cetuximab(西妥昔单抗)的脊髓损伤功能神经再生胶原支架材料：
将用牛筋膜所制备得到的有序神经再生胶原支架材料(长度为5mm，直径为2mm)浸泡在含30μL、浓度为5μg/μL(含150μg Cetuximab)的Cetuximab液体(购自德国默克里昂制药公司，商品规格为100毫克/20毫升/瓶)中，使其全部被神经再生胶原支架吸收，冰上孵育30min即制备得到含EGFR Cetuximab的脊髓损伤功能神经再生胶原支架材料。
相应的形态如图2所示，图2(A)为有序神经再生胶原支架的形态图；图2(B)为含EGFR Cetuximab的脊髓损伤功能神经再生胶原支架的形态图，从图2可看出：有序神经再生胶原支架束经功能化后可塑形的形态。
实施例3、用含EGFR Cetuximab的脊髓损伤功能神经再生胶原支架材料治疗5mm犬T8脊髓全横断损伤：
1)制备5mm犬T8脊髓全横断损伤模型，并移植功能胶原支架材料至损伤区域：
首先制备犬脊髓T8全横断损伤模型(如图3A所示)，选择6只1周岁左右的比格犬，体重在7～9公斤左右，麻醉后，磁共振定位脊髓T8段，打开T7-T9椎板暴露脊髓组织，将T8段经游离全横断5mm，制作犬急性T8全横断损伤模型；然后将制备好的功能神经再生胶原支架材料桥接在损伤区域之内。再进行无缝连接。术中电生理检测体感诱发电位和动作电位的消失来检测全横断的模型质量(如图3B所示)，从图3B可得出：.手术前，所有实验犬的左右后肢胫神经的运动诱发电位及其体感诱发电位均能正常检测到，而在实施完成T8全横断损伤实验后，上述各种电生理活动均消失，无法被检测到，证实T8全横断损伤模型质量可靠。
2)术后九个月后经形态学染色(如图4所示)、免疫荧光染色(如图5-图8所示)和行为学评分(如图9所示)等多项检测综合评价移植功能胶原支架材料对犬脊髓全横断损伤后的修复效果：
a)胶原性瘢痕沉积染色：
术后九个月将犬处死后，迅速将脊髓取出，于4％多聚甲醛固定液中固定48小时，分别在20％和30％的蔗糖中进行沉糖脱水。然后以OCT(opti-mum cutting temperaturecompound、一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，常作为冰冻切片包埋剂)包埋组织进行冰冻切片，切片厚度为15μm；随后将切片进行Masson染色鉴定胶原性瘢痕组织的沉积情况；
具体步骤如下：(1)取出切片晾干；(2)依次用自来水和蒸馏水清洗；(3)用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min；(4)充分水洗，若过染可盐酸酒精分化；(5)蒸馏水洗；(6)用Masson丽春红酸性复红液染色5-10min；(7)以体积分数为2％的冰醋酸水溶液浸洗片刻；(8)1％磷钼酸水溶液分化3-5min；(9)不经水洗，直接用苯胺蓝或光绿液染色5min；(10)以体积分数为0.2％的冰醋酸水溶液浸洗片刻；(11)先用体积分数为95％的酒精水溶液和无水酒精清洗后，再用二甲苯透明中性树胶封固
从图4可得知：移植了单纯神经再生胶原支架材料组和功能神经再生胶原支架材料组的犬损伤处的胶原性瘢痕的沉积量要相对比空白对照组(control组)低，说明移植支架材料或功能支架材料均能一定程度降低胶原性瘢痕组织的沉积。
b)免疫荧光染色检测反应性星型胶质细胞分泌的抑制分子CSPG表达：
术后九个月，我们对犬脊髓切片进行免疫荧光染色，以确定损伤处的反应性星型胶质细胞产生的CSPGs的沉积。
做法如下：(1)将切片用PBS洗一遍后，用山羊血清封闭液封闭20-40min；(2)吸去山羊血清，PBS洗两遍，将切片周围的水用吸水纸擦净；(3)加入200μL左右混合了来源于小鼠的anti-CSPG抗体(1:200)和来源于兔的anti-GFAP(1:500)的一抗于切片组织上，使液体完全覆盖脊髓组织；(4)4℃下孵育过夜；(5)PBS洗净两三遍；(6)按照二 抗说明书稀释的荧光二抗(购自invitrogen公司，货号分别为：Alexa488 Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)，CA21202s；Alexa594 Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L),A21207)，室温孵育1小时，注意避光操作；(7)PBS洗两遍，避光自然晾干；(8)滴加含DAPI的封片剂后，封上盖玻片，显微镜下观察，照相。
从图5可得知：无论是移植单纯神经再生胶原支架材料组还是移植功能神经再生胶原支架材料组的犬，其GSPG的表达量均远远低于空白对照组(control组)犬的表达量；该结果说明我们的有序神经再生胶原支架材料能够明显抑制胶质瘢痕的沉积及其抑制分子CSPG的表达，是一种非常好的可用于脊髓损伤后修复的生物支架材料。
c)免疫荧光染色检测神经丝蛋白NF表达：
术后九个月，我们对犬脊髓切片进行神经丝蛋白NF免疫荧光染色以确定再生进入损伤区的神经纤维的数量和密度。具体染色步骤同b)中所述，所使用的一抗为鼠来源的anti-NF抗体(1:200)以及兔来源的anti-GFAP抗体(1:500)；
从图6可得知：移植功能神经再生胶原支架材料组的犬长入损伤区内的神经纤维数量明显高于移植单纯神经再生胶原支架材料组及空白对照组(control组)，此外，移植功能神经再生胶原支架材料组的NF阳性纤维在损伤区内可见较明显的纵向有序排列，说明EGFR抗体复合神经再生胶原支架材料能更好的引导受损神经纤维的有序再生。
d)免疫荧光染色检测神经前体细胞及神经元向损伤区的迁移：
术后九个月，我们对犬脊髓切片进行神经前体细胞标志物Nestin、新生神经元标志物Tuj-1以及成熟神经元标志物Map2的免疫荧光染色以确定再生进入损伤区的神经前体细胞及神经元的数量和密度；
具体染色步骤同b)中所述，所使用的一抗分别为鼠来源的anti-Nestin抗体(1:200)、anti-Tuj-1抗体(1:200)、anti-Map2抗体(1:200)以及兔来源的anti-GFAP抗体(1:500)。
结果显示：移植功能神经再生胶原支架材料组的犬长入损伤区内的新生的神经元(图7A)、成熟的神经元细胞(图7B)以及神经前体细胞(图7C)的数量明显高于移植单纯神经再生胶原支架材料组及空白对照组(control组)，且差异具有统计学意义(图7D-7F)，说明EGFR抗体复合神经再生胶原支架材料能更好的引导脊髓损伤后内源性的神经前体细胞和神经元向损伤区的迁移。
e)免疫荧光染色检测损伤区内的感觉和运动神经元及其髓鞘化以及损伤区内功能性突触的形成：
术后九个月，我们对犬脊髓切片进行运动神经元标志物5-HT、感觉神经元标志物TH以及髓鞘蛋白标志物MBP的免疫荧光染色以确定再生进入损伤区的感觉和运动神 经元细胞的数量及其髓鞘化的程度；
具体染色步骤同b)中所述，所使用的一抗分别为鼠来源的anti-5-HT抗体(1:200)、anti-TH抗体(1:200)以及兔来源的anti-GFAP抗体(1:500)和anti-MBP抗体(1:200)。
结果显示：移植功能神经再生胶原支架材料组的犬长入损伤区内的运动神经元(图8A)和运动神经元(图8C)的数量均显著高于单纯移植神经再生胶原支架材料组及空白对照组(control组)，且差异具有统计学意义(图8E)。这些再生进入损伤区的感觉和运动神经元的神经纤维均能有效地髓鞘化(图8B和8D)，上述结果说明EGFR抗体复合神经再生胶原支架材料能更好的引导脊髓损伤后运动和感觉神经元的再生，并能实现再生神经元的髓鞘化。
此外，通过对功能性突触标志物Synaptophysin(一抗为鼠来源的anti-SYN，1:200)的免疫荧光染色结果表明，移植单纯神经再生胶原支架材料组及空白对照组(control组)的犬在损伤区内功能性突触几乎不能检测到，而移植功能神经再生胶原支架材料组的犬损伤区内的SYN阳性标志横跨整个损伤区均可被检测到(图8F)，说明EGFR抗体复合神经再生胶原支架材料能具有更好的促进脊髓损伤再生的效果。
f)术后九个月犬的行为学评分：
术后零至九个月，我们每月均对犬的行为学进行评价，观测器运动功能的恢复情况。行为学评分采用Olby评分。在评估过程中，犬在一个开放的环境中自由移动，由两名观察者评分。评分分为0-14级，14分为功能正常，0分为功能完全丧失。观察者为非本组实验人员，但熟悉评分细则，Olby评分标准如下：
| 分数 | 行为 |
| 0 | 无任何后肢运动或深度疼痛 |
| 2 | 无任何后肢运动，但尾部自发运动 |
| 3 | 后肢不能承重，仅有一个关节(髋关节)运动 |
| 4 | 后肢不能承重，多于一个关节运动，运动时间小于50％ |
| 5 | 后肢不能承重，多于一个关节运动，运动时间大于50％ |
| 6 | 后肢能承重，但承重时间小于10％ |
| 7 | 后肢能承重，但承重时间在10-50％之间 |
| 8 | 后肢能承重，承重时间大于50％ |
| 9 | 后肢100％承重，但肌力没有完全恢复，步态错误时间大于90％ |
| 10 | 后肢100％承重，但肌力没有完全恢复，步态错时间在50-90％之间 |
| 11 | 后肢100％承重，但肌力没有完全恢复，步态错误时间小于50％ |
| 12 | 肌力正常，但后肢步态混乱，错误时间大于50％ |
| 13 | 肌力正常，但后肢步态混乱，错误时间小于50％ |
| 14 | 正常步态 |
行为学评分结果显示：从术后第一月开始，移植功能神经再生胶原支架材料组的犬较对照组犬均具有显著性改善(图9，带*标志)，此外，自第三月开始，移植功能神经再生胶原支架材料组的犬较单纯移植神经再生胶原支架材料组的犬表现出行为学优势(图9，带△标志)，部分犬能够偶尔后肢称重站立并能迈步行走(图9)。上述结果表明，移植功能神经再生胶原支架材料修复治疗策略能显著改善脊髓全横断后犬的运动功能恢复。
总之，我们将有序神经再生胶原支架材料与EGFR抗体(表皮生长因子受体抗体)Cetuximab进行复合后移植到犬T8脊髓全横断损伤模型之中，通过九个月的恢复和观察，我们的研究证明移植功能神经再生胶原支架材料能够更好地促进神经纤维再生进入损伤区，并能明显减少损伤区胶质瘢痕及其抑制分子CSPG的沉积。同时移植功能神经再生胶原支架材料组的犬在损伤后能自发引导神经前体细胞和神经元向损伤区迁移，这些进入损伤区的神经元包括运动和感觉神经元，它们在损伤区内能实现很好的髓鞘化，并能产生功能性的突触结果，为受损脊髓的功能性再生提供了中继的角色。另外，移植功能神经再生胶原支架材料组的犬术后表现出明显优于空白对照和单纯移植神经再生胶原支架材料组组犬的运动功能恢复，这也表明本研究中的移植功能神经再生胶原支架材料的治疗策略具有更好的修复效果及良好的临床应用前景。
Claims (6)
1.负载Cetuximab的神经再生胶原支架材料在制备具有如下（1）、（2）、（3）、（4）和（5）功能中至少一种的产品中的应用：（1）修复脊髓损伤；（2）促进神经再生；（3）减少脊髓损伤部位胶质细胞增生；（4）引导受损神经纤维的有序再生；（5）引导脊髓损伤后内源性的神经前体细胞和神经元向损伤区的迁移；
所述负载Cetuximab的神经再生胶原支架材料是由包括如下步骤的方法制备得到的：
1）使神经再生胶原支架材料吸收Cetuximab，得到含有Cetuximab的神经再生胶原支架材料；
步骤1）中，所述使神经再生胶原支架材料吸收Cetuximab按如下步骤操作：将长度为4-6mm、直径为2-3mm神经再生胶原支架材料浸泡在20-50μL 、5μg/μL的Cetuximab溶液中，吸收Cetuximab；
2）对步骤1）中得到的含有Cetuximab的神经再生胶原支架材料进行孵育，得到具有上述功能的神经再生胶原支架材料。
2.具有如下（1）、（2）、（3）、（4）和（5）功能中至少一种的药物，该药物是负载了Cetuximab的神经再生胶原支架材料：（1）修复脊髓损伤；（2）促进神经再生；（3）减少脊髓损伤部位胶质细胞增生；（4）引导受损神经纤维的有序再生；（5）引导脊髓损伤后内源性的神经前体细胞和神经元向损伤区的迁移；
所述负载Cetuximab的神经再生胶原支架材料是由包括如下步骤的方法制备得到的：
1）使神经再生胶原支架材料吸收Cetuximab，得到含有Cetuximab的神经再生胶原支架材料；
步骤1）中，所述使神经再生胶原支架材料吸收Cetuximab按如下步骤操作：将长度为4-6mm、直径为2-3mm神经再生胶原支架材料浸泡在20-50μL 、5μg/μL的Cetuximab溶液中，吸收Cetuximab；
2）对步骤1）中得到的含有Cetuximab的神经再生胶原支架材料进行孵育，得到具有上述功能的神经再生胶原支架材料。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：所述药物中的神经再生胶原支架材料是通过如下方法而制备得到：
a）将筋膜用体积百分浓度为1-1.5％的磷酸三丁酯溶液处理24-72h；
b）再用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol/L、pH为7.6-8.5的Tris-HCl缓冲液处理24-72h；
c）最后，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml缓冲液处理48-96h，得到有序胶原材料，即神经再生胶原支架材料，其中，所述缓冲液为25-100mmol/L Tris-HCl，pH为7-8。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：步骤a）中，所述磷酸三丁酯溶液的溶剂为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液；
所述筋膜在处理前还要去除内层粘附的肌肉组织和外层粘附的脂肪；
步骤b）和c）中，所述处理的温度均为2-8℃；
步骤c）中，所述神经再生胶原支架材料还包括将其用浓度为0.5-1.5mol/L 强碱溶液处理5-10 min的步骤。
5.权利要求2-4中任一项所述的药物的制备方法，包括如下步骤：
1）使神经再生胶原支架材料吸收Cetuximab，得到含有Cetuximab的神经再生胶原支架材料；
步骤1）中，所述使神经再生胶原支架材料吸收Cetuximab按如下步骤操作：将长度为4-6mm、直径为2-3mm神经再生胶原支架材料浸泡在20-50μL 、5μg/μL的Cetuximab溶液中，吸收Cetuximab；
2）对步骤1）中得到的含有Cetuximab的神经再生胶原支架材料进行孵育，得到具有上述功能的神经再生胶原支架材料，即所述药物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述孵育是在0-10℃下孵育20-30min。
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