CN108144120B - 双功能胶原支架材料、其制法及在脊髓损伤修复中的应用 - Google Patents

双功能胶原支架材料、其制法及在脊髓损伤修复中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108144120B
CN108144120B CN201611096883.6A CN201611096883A CN108144120B CN 108144120 B CN108144120 B CN 108144120B CN 201611096883 A CN201611096883 A CN 201611096883A CN 108144120 B CN108144120 B CN 108144120B
Authority
CN
China
Prior art keywords
neural stem
stem cells
scaffold material
egfr
bifunctional
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611096883.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108144120A (zh
Inventor
戴建武
赵燕南
陈冰
李晓然
徐白
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Dubu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS filed Critical Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS
Priority to CN201611096883.6A priority Critical patent/CN108144120B/zh
Publication of CN108144120A publication Critical patent/CN108144120A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108144120B publication Critical patent/CN108144120B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3675—Nerve tissue, e.g. brain, spinal cord, nerves, dura mater
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3878—Nerve tissue, brain, spinal cord, nerves, dura mater
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A61L2300/256—Antibodies, e.g. immunoglobulins, vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/32—Materials or treatment for tissue regeneration for nerve reconstruction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Prostheses (AREA)

Abstract

本申请公开了一种双功能胶原支架材料、其制法及在脊髓损伤修复中的应用。所述双功能胶原支架材料包括神经再生支架以及与所述神经再生支架结合的CBD‑EGFR‑Fab抗体，所述CBD‑EGFR‑Fab抗体包含胶原结合区域以及与所述胶原结合区连接的EGFR抗体的Fab区。本申请提供的双功能胶原支架材料在体外可以促进外源性神经干细胞结合以及挽救髓鞘蛋白存在时被抑制的神经干细胞向神经元的分化，在体内可以有效减少外源性神经干细胞从移植部位的扩散，以及通过促进神经干细胞分化成功能性神经元从而重建神经元回路，最终促进脊髓损伤后运动功能恢复。

Description

双功能胶原支架材料、其制法及在脊髓损伤修复中的应用
技术领域
本申请具体涉及一种生物支架材料，特别涉及一种双功能胶原支架材料、其制备方法及在脊髓损伤修复中的应用。
背景技术
脊髓损伤通常会引起损伤截面以下永久性感觉和运动功能的障碍。近数十年来，基于神经干细胞治疗脊髓损伤的疗法发生了巨大的进步。神经干细胞具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的多向分化潜能，并且能自我更新，修复和替代脊髓损伤处死亡的神经细胞。同时，神经干细胞是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，移植后不会被宿主免疫系统所识别。除此之外，它还可以与宿主的神经组织融合良好，并在宿主体内长期存活。但是移植后损伤区很少的细胞停留以及很低的神经元分化效率都会影响神经干细胞治疗脊髓损伤的疗效。
传统方法是脊髓内或鞘内把神经干细胞注射进损伤部位，但由于脑脊髓液的存在，移植的神经干细胞趋向于扩散至周围正常脊髓组织，很少停留于损伤区。并且，由于脊髓损伤后局部抑制性微环境的形成，会导致残留于损伤区的神经干细胞会主要分化成胶质细胞。一些生物材料的支架能提供一个结构支撑来桥接脊髓损伤处的空隙，也能用于递送干细胞以改善或重建脊髓损伤后形成的局部抑制性微环境。干细胞可以被包裹或黏附在支架材料上以防移植后的快速扩散。然而，细胞和材料间非特异性的互作和低亲和性不能使干细胞很好地结合于材料上，从而停留于损伤区。此外，一些支架材料用NT3或BDNF等生物分子修饰后，可用于促进神经干细胞向神经元分化。但是细胞和功能生物分子的迅速扩散会导致脊髓损伤部位残留的神经干细胞数量不足以及不足够的神经元的分化。
发明内容
本申请的主要目的在于提供一种双功能胶原支架材料、其制备方法及在脊髓损伤修复中的应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本申请采用的技术方案包括：
本申请实施例提供了一种双功能胶原支架材料，其包括神经再生支架以及与所述神经再生支架结合的CBD-EGFR-Fab抗体，所述CBD-EGFR-Fab抗体包含胶原结合区域以及与所述胶原结合区连接的EGFR抗体的Fab区。
进一步的，所述神经再生支架至少来源于生物肌肉筋膜。
本申请实施例还提供了所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用，所述产品至少具有在体外结合外源性神经干细胞并促进神经干细胞向神经元分化的功能。
本申请实施例还提供了所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用，所述产品至少具有在体内促进神经干细胞富集并促进神经干细胞向神经元分化的功能。
本申请实施例还提供了所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用，所述产品至少具有促进脊髓损伤区功能性神经元和突触素产生的功能。
本申请实施例还提供了所述双功能胶原支架材料于制备产品中的应用，所述产品至少具有修复脊髓损伤的功能。
进一步的，在所述的应用中，所述产品还包括外源性神经干细胞。
本申请实施例还提供了所述双功能胶原支架材料作为修复脊髓损伤材料的应用。
本申请实施例还提供了一种双功能胶原支架材料的制备方法，其包括：
提供CBD-EGFR-Fab抗体，其包含胶原结合区域以及与所述胶原结合区连接的EGFR抗体的Fab区；
使所述CBD-EGFR-Fab抗体与神经再生支架结合，形成所述双功能胶原支架材料。
进一步的，所述的制备方法包括：将线性化的pPICZαB-CBD-Fab整合进重组毕赤酵母克隆的基因组，之后进行表达和纯化，获得所述CBD-EGFR-Fab抗体。
进一步的，所述神经再生支架至少来源于生物肌肉筋膜。
本申请的双功能胶原支架材料主要是通过将CBD-EGFR-Fab抗体吸附在神经再生支架上而制备形成。所述CBD-EGFR-Fab抗体是具有胶原结合区(CBD)的EGFR抗体，它是通过将一段CBD区融合于EGFR抗体的抗原结合片段(即Fab区)而形成。其中表皮生长因子受体(EGFR)是可以和表皮生长因子(EGF)结合的细胞表面的受体，可以在神经干细胞表面表达。利用EGFR抗体和EGFR的高度亲和性可以使神经干细胞结合在支架材料上，以及通过衰减EGFR信号通路促进神经干细胞向神经元分化。同时，EGFR抗体和EGFR的高度结合力会通过阻断EGFR信号通路从而抑制肿瘤细胞的增殖。同时，EGFR也参与了髓鞘相关抑制因子(MAIs)调节的神经干细胞向胶质细胞分化的过程。MAIs主要包括Nogo-A，髓鞘相关糖蛋白(MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)。MAIs不仅有抑制轴突再生的特性，也能阻碍神经干细胞向神经元分化。Nogo-A，MAG和OMgp可以结合共受体复合物p75/TROY和LINGO-1。MAIs和受体的结合会通过升高细胞内钙离子浓度激活EGFR信号通路，从而抑制轴突再生和神经干细胞向神经元分化。激活EGFR信号通路会抑制神经干细胞向神经元分化，衰减EGFR信号可能会促进神经干细胞向神经元分化。所述CBD-EGFR-Fab抗体同时可以促进神经干细胞和支架材料的结合以及促进其向神经元分化。更具体的讲，该CBD-EGFR-Fab抗体既能通过与神经干细胞表面的EGFR结合从而结合神经干细胞，也能通过CBD区使EGFR-Fab抗体和胶原支架结合。进而，通过将CBD-EGFR-Fab抗体吸附于神经再生支架上，即形成了本申请的双功能胶原支架材料。在移植进脊髓损伤部位之后，种植于双功能胶原支架材料上的神经干细胞能通过结合CBD-EGFR从而停留于材料上，并且由于EGFR抗体阻断EGFR信号通路，神经干细胞会向神经元分化。
较之现有技术，本申请提供的双功能胶原支架材料在体外可以促进外源性神经干细胞结合以及挽救髓鞘蛋白存在时被抑制的神经干细胞向神经元的分化，在体内可以有效减少外源性神经干细胞从移植部位的扩散，以及通过促进神经干细胞分化成功能性神经元从而重建神经元回路，最终促进脊髓损伤后运动功能恢复。
附图说明
图1A是本申请一实施方案中一种空白对照支架材料(Scaffold)的功能示意图，当被移植进脊髓损伤处，种植于空白对照支架材料上的神经干细胞会扩散至周围组织，且主要分化成胶质细胞。
图1B是本申请一实施方案中一种双功能胶原支架材料(Dual FunctionalScaffold)的功能示意图，当被移植进脊髓损伤处，种植于双功能胶原支架材料上的神经干细胞会结合在材料上，停留于损伤部位，并主要分化成神经元。
图2A1～图2A2是本申请一实施例中一种神经再生支架的照片和电镜照片。
图2A3是本申请一实施例中一种CBD-EGFR-Fab抗体的构建示意图。
图2A4是本申请一实施例中一种CBD-EGFR-Fab抗体的SDS-PAGE检测图。
图2B是本申请一实施例中从SD乳鼠的端脑分出神经干细胞，分别种植于空白对照支架材料和双功能胶原支架材料上，PBS缓冲液冲洗后，镜下计数神经干细胞细胞数量的示意图。
图2C1是本申请一实施例中神经干细胞增殖培养7天后形成的神经球的照片。
图2C2是本申请一实施例中神经球进行神经干细胞标志物Nestin染色的照片。
图2C3是本申请一实施例中神经球进行EGFR染色的照片。
图2D1是本申请一实施例中于空白对照支架材料上的神经干细胞免疫荧光染色照片。
图2D2是本申请一实施例中于双功能胶原支架材料上的神经干细胞免疫荧光染色照片。
图2D3是本申请一实施例中神经干细胞计数图。
图3A是本申请一实施例中将神经干细胞分别种植于空白对照支架材料、双功能胶原支架材料上，分化培养基中加入髓鞘蛋白，7天后进行免疫荧光染色的示意图。
图3B是本申请一实施例中于空白对照支架材料、双功能胶原支架材料上的神经元标志物Tuj-1和星形胶质细胞标志物GFAP免疫荧光染色照片。
图3C1～图3C2是本申请一实施例中于双功能胶原支架材料、空白对照支架材料上的神经元和星形胶质细胞计数图。
图4A是本申请一实施例中从GFP转基因大鼠端脑中分出GFP-NSC，将其分别与两种材料一起移植进脊髓损伤部位，12周后取材进行免疫荧光染色，观察神经干细胞的富集、分化和形成的功能性神经元的示意图。
图4B是本申请一实施例中绿色荧光蛋白GFP和星形细胞标志物GFAP染色图。
图4C是本申请一实施例中绿色荧光蛋白GFP和神经元标志物NF染色图。
图4D1～图4D4是本申请一实施例中于损伤边缘和损伤区的结合的神经干细胞的数量和分化成神经元的比例统计图。
图5A是本申请一实施例中各组损伤区5-HT，ChAT和SYP的染色图。
图5B1～图5B3是本申请一实施例中5-HT，ChAT和SYP阳性细胞计数图。
图6A是本申请一实施例中术后12周，各组大鼠运动诱发电位波形图。
图6B是本申请一实施例中的潜伏期统计图。
图6C是本申请一实施例中振幅差比值统计图。
图6D是本申请一实施例中BBB评分图。
图6E是本申请一实施例中斜板实验图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本申请发明人经长期研究和大量实践，通过将具有胶原特异性结合能力的CBD-EGFR-Fab抗体吸附于神经再生支架上，制备出一种双功能胶原支架材料。该双功能胶原支架材料可以联合外源性神经干细胞移植于大鼠脊髓全横断部位。通过体外和体内试验证明，该双功能胶原支架材料可以结合外源性神经干细胞，使其停留于损伤区，并促进其向神经元分化。这对脊髓损伤后神经元回路的重建以及运动功能的恢复都起到良好效果，可以有效解决现有技术中移植神经干细胞治疗脊髓损伤时，外源性神经干细胞从移植部位扩散和低效率分化成神经元等问题，
以下结合附图及典型实施案例对本申请的技术方案作进一步的详细说明。
1、神经再生支架的制备
神经再生支架从牛肌肉筋膜中获取。分离出约0.5毫米的筋膜，切成适当体积。尽量去除内层黏附的肌肉组织和外层的脂肪组织。冻干，即得到本申请的神经再生支架。
2、CBD-EGFR-Fab抗体的制备
2.1 CBD-EGFR-Fab表达载体构建
CBD-EGFR-Fab抗体Fab段的vL,cL,vH和cH1链参考US7060808；由苏州金维智生物科技有限公司合成。首先,通过overlap PCR将CBD(TKKTLRT)+vL+cL和vH+cH1拼接成两条链，顺序如下:CBD+linker+vL+cL；vH+cH1。接着，用双酶切将两条链分别插入pPICZα-B(Invitrogen)和pPIC9K(Invitrogen)两个质粒中。连接后，转化进大肠杆菌(DH5α),涂布LB平板，挑菌落，PCR筛选阳性克隆，测序后抽提质粒备用。
2.2 CBD-EGFR-Fab表达载体的转化、筛选
按照Invitrogen操作手册中的电转化方法，分别将10μg两种连接产物用SalⅠ和BstxⅠ进行线性化，再将线性化的产物电转化到对数生长期的酵母菌GS115基因中。转化后，将转化液涂布于YPDS琼脂平板上(1％yeast extract，2％peptone，2％dextrose，1Msorbitol，2％agar，100μg/mL Zeocin，1-4mg/mL G418)，30℃培养1-2周。克隆长出后，使用L和H基因片段的特异引物，鉴定L和H是否都整合到酵母菌基因组。其中，L和H的特异性引物分别为:
L：
F：CTCGAGAAAAGAACCAAGAAGACCTTACG
R：GCGGCCGCACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC；
H：
F：GAATTCCAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGG
R：GCGGCCGCGTGAGTTTTGTCACAAG。
再在含有Zeocin和G418抗生素的YPDS平板上生长,PCR鉴定阳性菌落标记为:Mut+。
2.3 CBD-EGFR-Fab在酵母菌中表达、纯化
挑取标记为Mut+的菌落，用50mL BMGY培养基(1％yeast extract，2％peptone，100mM potassium phosphate pH 6.0，1.34％YNB，4×10-5％biotin，1％glycerol),于28-30℃、250-300rpm培养,至OD600约为2-6(约培养16-18h)时,室温,1500g,离心5min,收菌。再用BMMY培养基(BMGY加0.5％methanol代替glycerol)重悬，培养至OD600为1.0左右(约100-200mL)时置于1L摇瓶中,28-30℃、250-300rpm培养。每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度为0.5％。表达后菌液用8000g、4℃高速离心20min,收集上清,0.22μm滤膜过滤,用Millipore Pellicon分子量10kDa超滤膜浓缩到合适体积，透析到20mM磷酸钠缓冲液(PH＝8.0)和0.5M NaCl中。用AKTA prime plus 5.0系统利用镍柱对目的蛋白进行纯化。SDS-PAGE电泳分析纯化后抗体的纯度。蛋白浓缩后0.22μm滤膜过滤除菌，分装，-80℃冻存。使用BCA试剂盒(碧云天)对测定抗体浓度。
3、双功能胶原支架材料的制备
将40μg CBD-EGFR-Fab抗体滴加于前述的神经再生支架上，组合成具有结合外源性神经干细胞及促进其向神经元分化的双功能胶原支架材料。
4、神经干细胞分离培养
取新生Sprague Dawley(SD)乳鼠的端脑，去除脑膜，剪碎，0.25％胰酶消化20～30min，加入血清终止消化。加入适量基础培养基，吹打，用70μm滤网过滤。500g，离心5min，弃上清，用适量神经干细胞增殖培养基重悬，装T75细胞培养瓶，37℃培养箱培养7天后备用。
5、双功能材料在脊髓损伤动物模型中的治疗效果的评价
Ⅰ、大鼠T8脊髓全横断损伤动物模型的建立
SD大鼠购买自北京维通利华有限公司，所有动物均使用180g～220g的雌性大鼠，所有动物均提前一周订购，在新环境下饲养一周适应环境。
10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，沿中线剪开皮肤和筋膜，暴露T8-T11节段棘突，减掉棘突，撬开椎板，暴露脊髓。在T8-9部位做4mm脊髓全横断。动物实验分成3组，只移植空白对照支架材料(即前述神经再生支架)，移植空白对照支架材料加106个神经干细胞以及移植双功能胶原支架材料加106个神经干细胞。
Ⅱ、双功能胶原支架材料在体外促进神经干细胞与材料结合
从SD乳鼠的端脑中分出神经干细胞，并将其分别种植于空白对照支架材料和双功能胶原支架材料上，PBS冲洗后，镜下计数两种材料上剩余神经干细胞数量。计数结果显示双功能胶原支架材料上剩余的神经干细胞数量更多，表明其对神经干细胞有更好的结合力(参阅图2A1～图2D3)。
Ⅲ、双功能胶原支架材料在体外促进神经干细胞向神经元分化
将分离出的神经干细胞分别种植于空白对照支架材料和双功能胶原支架材料上，在分化培养基中加入髓鞘蛋白，在体外模拟体内脊髓损伤后局部形成的抑制性微环境，分化培养7天后，进行神经元标志物Tuj-1和星形细胞标志物GFAP的免疫荧光染色。染色结果显示，有髓鞘蛋白时，相比于种植在空白对照支架材料上的神经干细胞，种植于双功能胶原支架材料上的神经干细胞更多地向神经元分化，更少地向星形胶质细胞分化。实验结果表明，双功能胶原支架材料在体外可以挽救被抑制的神经干细胞向神经元的分化(参阅图3A～图3C)。
Ⅳ、双功能胶原支架材料在体内促进神经干细胞的富集和分化成神经元
将空白对照支架材料和双功能胶原支架材料分别与106个神经干细胞移植进大鼠T8脊髓损伤部位，12周后取材，进行免疫荧光染色，观察损伤区神经干细胞的富集，分化以及产生的功能性神经元。首先，通过对绿色荧光蛋白标志物GFP和星形胶质细胞标志物GFAP进行共染，观察损伤区星形胶质瘢痕的形成情况。染色结果显示，空白对照支架材料+神经干细胞联合治疗组中，移植的神经干细胞主要迁移至周围组织，且主要分化成星形胶质细胞。而双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗组中，可观察到在损伤区有部分移植神经干细胞的富集，且没有分化成星形胶质细胞。其次，通过对绿色荧光蛋白标志物GFP和神经元特有的中间丝蛋白NF进行共染，观察损伤区神经元的形成情况。染色结果显示，相比于空白对照支架材料+神经干细胞联合治疗组，双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗组中损伤区可观察到明显存在移植神经干细胞，并且部分分化成神经元。染色结果表明，双功能胶原支架材料对神经干细胞有一定结合作用并且可以阻止其分化成星形胶质细胞，并促进其向神经元分化(参阅图4A～图4D4)。
Ⅴ、双功能胶原支架材料在脊髓损伤部位诱导功能性神经元的产生及突触的形成
通过对运动相关神经递质5羟色胺(5-HT)，乙酰胆碱能神经元(ChAT)和突触素(SYP)的染色，观察损伤区5羟色胺能阳性神经元，乙酰胆碱能阳性神经元和突触素阳性神经元的形成。实验结果显示，双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗组中，损伤区有5羟色胺能阳性神经元，乙酰胆碱能阳性神经元和突触素阳性神经元的产生。实验结果表明，双功能胶原支架材料能促进脊髓损伤区功能性神经元和突触素的产生(参阅图5A～图5B3)。
Ⅵ、双功能胶原支架材料促进脊髓损伤后电生理和运动功能的恢复
电生理结果显示，各组大鼠术后12周都能检测出运动诱发电位(MEP)波形，但相比另外两组，双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗组的波形更接近于正常波形。对各组大鼠MEP潜伏期和振幅差的比值进行检测，结果显示，双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗组的潜伏期显著短于其余各组，而振幅差的比值显著高于其余各组。结果表明，双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗组大鼠电生理恢复优于另外两组。
接着对各组大鼠进行行为学检测，包括BBB评分和斜板实验，通过观察各组大鼠术后12周后肢肌力的恢复，从而评价运动功能的恢复。BBB评分结果显示，前4周，各组大鼠运动功能恢复提高较快，约从第7周开始，各组大鼠恢复进入平台期。但双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗组的大鼠，约一半的时间点BBB评分显著高于另外两组。斜板实验结果显示，双功能胶原材料+神经干细胞联合治疗组的大鼠相比于另外两组大鼠，可以在更大角度的斜板上停留5s以上。行为学评分结果表明，双功能胶原支架材料+神经干细胞联合治疗组大鼠运动功能恢复显著优于另外两组(参阅图6A～图6E)。
综合分析以上结果，本发明制备的一种双功能胶原支架材料，即一种连接有CBD-EGFR-Fab抗体的神经再生支架不仅具有结合外源性神经干细胞的能力，同时能促进神经干细胞分化成神经元。进一步的动物试验结果表明，双功能胶原支架材料在体内可以更好地富集和结合移植的神经干细胞，使其停留于损伤部位，并且可以促进其向神经元分化。
应当理解，上述实施例仅为说明本申请的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本申请的内容并据以实施，并不能以此限制本申请的保护范围。凡根据本申请精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种双功能胶原支架材料的制法，其特征在于包括：
将线性化的pPICZαB-CBD-Fab整合进重组毕赤酵母克隆的基因组，之后进行表达和纯化，获得CBD-EGFR-Fab抗体，其包含胶原结合区域以及与所述胶原结合区域连接的EGFR抗体的Fab区；
将CBD-EGFR-Fab抗体滴加于神经再生支架上，组合成具有结合外源性神经干细胞及促进其向神经元分化的双功能胶原支架材料；
所述双功能胶原支架材料包括神经再生支架以及与所述神经再生支架结合的CBD-EGFR-Fab抗体，所述CBD-EGFR-Fab抗体包含胶原结合区域以及与所述胶原结合区域连接的EGFR抗体的Fab区，所述双功能胶原支架材料至少具有在体外结合外源性神经干细胞并促进神经干细胞向神经元分化的功能，所述双功能胶原支架材料至少具有在体内促进神经干细胞富集并促进神经干细胞向神经元分化的功能，所述双功能胶原支架材料至少具有促进脊髓损伤区功能性神经元和突触素产生的功能。
2.根据权利要求1所述的制法，其特征在于：所述神经再生支架至少来源于生物肌肉筋膜。
3.由权利要求 1-2中任一项所述制法制备的双功能胶原支架材料于制备产品中的应用，所述产品至少具有修复脊髓损伤的功能。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述产品还包括外源性神经干细胞。
5.由权利要求 1-2中任一项所述制法制备的双功能胶原支架材料在制备修复脊髓损伤材料中的应用。
CN201611096883.6A 2016-12-02 2016-12-02 双功能胶原支架材料、其制法及在脊髓损伤修复中的应用 Active CN108144120B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611096883.6A CN108144120B (zh) 2016-12-02 2016-12-02 双功能胶原支架材料、其制法及在脊髓损伤修复中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611096883.6A CN108144120B (zh) 2016-12-02 2016-12-02 双功能胶原支架材料、其制法及在脊髓损伤修复中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108144120A CN108144120A (zh) 2018-06-12
CN108144120B true CN108144120B (zh) 2021-03-16

Family

ID=62470425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611096883.6A Active CN108144120B (zh) 2016-12-02 2016-12-02 双功能胶原支架材料、其制法及在脊髓损伤修复中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108144120B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111978405B (zh) * 2019-05-21 2023-01-03 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 功能多肽、可特异结合胶原的红细胞载药体系及其应用
CN111978406B (zh) * 2019-05-21 2022-06-17 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 功能连接多肽、可特异性结合胶原的外泌体载药体系及其应用
CN113577108B (zh) * 2021-08-31 2023-07-07 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种多功能胶原支架、其制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103127552A (zh) * 2013-02-05 2013-06-05 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架及其应用方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103127552A (zh) * 2013-02-05 2013-06-05 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架及其应用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A collagen-binding EGFR single-chain Fv antibody fragment for the targeted cancer therapy;Hui Liang，等;《Journal of Controlled Release》;20150731;第209卷;第101-109页 *
Hui Liang，等.A collagen-binding EGFR single-chain Fv antibody fragment for the targeted cancer therapy.《Journal of Controlled Release》.2015,第209卷第101-109页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108144120A (zh) 2018-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103127552B (zh) 一种用于修复脊髓损伤的圆柱体支架及其应用方法
WO2014181886A1 (ja) 粒子状脱細胞化組織を含むハイブリッドゲル
CN104039954B (zh) 可抑制iPS细胞的肿瘤化的分化诱导方法
JP6155188B2 (ja) 方法及び組合せ
CN108144120B (zh) 双功能胶原支架材料、其制法及在脊髓损伤修复中的应用
US10406183B2 (en) Composition comprising cell and biocompatible polymer
WO2005005622A2 (en) Method of altering cell properties by administering rna
CN105597148B (zh) 一种用于神经损伤修复的神经支架、其制备方法及应用
Wang et al. Improved neural regeneration with olfactory ensheathing cell inoculated PLGA scaffolds in spinal cord injury adult rats
CN103705542A (zh) 一种脱细胞血管基质凝胶及其制备方法和应用
US20220331496A1 (en) Tissue engineering material for nerve injury repair, preparation method therefor and application thereof
Hu et al. Transplantation of neural scaffolds consisting of dermal fibroblast-reprogrammed neurons and 3D silk fibrous materials promotes the repair of spinal cord injury
ES2369259T3 (es) Células de schwann derivadas de células estrómicas de médula ósea.
Wei et al. Acellular nerve xenografts based on supercritical extraction technology for repairing long-distance sciatic nerve defects in rats
Li et al. Skin precursor‐derived Schwann cells accelerate in vivo prevascularization of tissue‐engineered nerves to promote peripheral nerve regeneration
CN109715656A (zh) 用于诱导组织形成的化合物及其用途
CN107857817B (zh) 胶原特异结合能力的egfr抗体及在脊髓损伤修复中的应用
CN109106981A (zh) 双重修饰的胶原支架及在修复脊髓损伤的产品中的应用
CN107779437A (zh) 自噬诱导剂作为微管稳定药物促进神经再生的用途
CN106011173A (zh) 一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法及其试剂盒与应用
CN103446628B (zh) 一种复合种子细胞的组织工程神经的制备方法
Niimi et al. Effectively axonal-supercharged interpositional jump-graft with an artificial nerve conduit for rat facial nerve paralysis
Mi et al. Implantation with SHED sheet induced with homogenate protein of spinal cord promotes functional recovery from spinal cord injury in rats
CN104958786B (zh) 一种负载移植性神经干细胞的PF‑127‑LV‑NFcocktail复合物及其制备方法和应用
JP7253179B2 (ja) 脳障害の治療用材料、脳障害の治療方法、脳の神経細胞の再生用材料、及び、脳の神経細胞の再生方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220129

Address after: 100000 b-1608-029, 16th floor, building 1, No. 18, Zhongguancun East Road, Haidian District, Beijing

Patentee after: BEIJING TONGJIAN REGENERATION MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 215123, Suzhou, Jiangsu province Suzhou Industrial Park alone villa lake high Parish, if the waterway 398

Patentee before: SUZHOU INSTITUTE OF NANO-TECH AND NANO-BIONICS (SINANO), CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220401

Address after: No.99, Chuqiao Road, New District, Zhenjiang City, Jiangsu Province, 212000

Patentee after: Jiangsu dubu Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 100000 b-1608-029, 16th floor, building 1, No. 18, Zhongguancun East Road, Haidian District, Beijing

Patentee before: BEIJING TONGJIAN REGENERATION MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20180612

Assignee: Dubu Wuqi Biomedical Technology (Jiangsu) Co.,Ltd.

Assignor: Jiangsu dubu Biotechnology Co.,Ltd.

Contract record no.: X2023980035226

Denomination of invention: Dual functional collagen scaffold material, its preparation method, and application in spinal cord injury repair

Granted publication date: 20210316

License type: Exclusive License

Record date: 20230504