CN113061259B - 用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法，包括以下步骤：步骤1、制备金属有机框架材料；步骤2、除去金属有机框架材料中未反应的原料和溶剂分子，活化所述的金属有机框架材料；步骤3、对得到的金属有机框架材料进行多巴胺修饰。本发明的金属有机框架材料本身具有的超氧化物歧化酶(SOD)，可有效地将氧自由基转化为水和氧气，同时这种新型金属有机框架材料可以上调神经细胞内源性抗氧化酶的活性，进一步实现对自由基的清除。在卒中小鼠中通过侧脑室注射的方式递送金属有机框架材料，实现了病灶微环境的改善，神经细胞死亡率降低，梗死体积减少，小鼠术后行为学功能得到了有效恢复。

Description

用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学材料技术领域，特别涉及用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法。

背景技术

脑卒中，是一种急性的脑血管疾病，脑卒中根据病理特点主要分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，缺血性脑卒中占据整体的80％以上。在缺血性脑卒中的局部脑组织坏死的病理进程中，自由基发挥了重要作用。由于血流供应发生障碍，局部神经细胞的能量和氧气缺乏，神经细胞内钙离子大量内流，线粒体功能受损，引起过量自由基的产生，如超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(.OH)和活性氮(ONOO·)等，这会进一步损伤神经细胞，引起细胞的凋亡以及坏死。因此，清除梗死部位的自由基能有效保护梗死区以及围梗死区的神经元细胞，减少梗死体积，从而达到对缺血性脑卒中治疗的目的。金属有机框架材料(MOF)主要应用于化学催化领域，近年来在生物医学领域得到越来越多的关注，研究表明金属有机框架材料可以上调神经细胞内源性抗氧化酶的活性，进一步实现对自由基的清除。

申请号CN202010811768.2的专利公开了一种有效治疗缺血性脑卒中的药物及其应用，所述有效治疗缺血性脑卒中的药物为雷公藤内酯醇。本发明通过网络药理学结合转录组学得到雷公藤内酯醇抗脑缺血再灌注损伤靶标，再通过生物信息学对获得靶标进行富集分析和代谢通路分析，并进一步做细胞实验验证，为脑缺血再灌注损伤机制的科学研究、雷公藤内酯醇的开发利用提供依据，为多靶点新药的研发提供参考。本发明通过细胞模型验证分析，揭示雷公藤内酯醇抗CIRI的作用机制及靶标，为CIRI治疗寻找新的治疗药物及治疗靶点。

申请号CN202010423712.X的专利提出了一种治疗脑卒中偏瘫的外用中药组合物及制备方法，该治疗脑卒中偏瘫的外用中药组合物包括：沉香、姜黄、当归、连翘、木瓜、干姜、花椒、葫芦巴、胡黄连、陈皮、肉桂、川芎。与现有技术相比，本发明治疗脑卒中偏瘫的外用中药组合物让患者不但可减少吃药带来的副作用，还可免除手术带来的痛苦。

但是，上述专利并未在缺血性脑卒中的局部脑组织坏死的病理进程中研究治疗脑卒中的方案，比如清除对于脑卒中发病发挥了重要作用的自由基，减少梗死体积，从而达到从根本上对缺血性脑卒中治疗的目的。

发明内容

(一)解决的技术问题

本发明的目的在于提供用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法，以解决现有技术在缺血性脑卒中的局部脑组织坏死的病理进程中研究治疗脑卒中的方案，不能从引起脑卒中发病的内部因素着手治疗疾病的问题。

(二)技术方案

为实现上述用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法解决现有技术在缺血性脑卒中的局部脑组织坏死的病理进程中研究治疗脑卒中的方案，不能从引起脑卒中发病的内部因素着手治疗疾病的问题，本发明提供如下技术方案：

用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、制备金属有机框架材料；

步骤2、除去金属有机框架材料中未反应的原料和溶剂分子，活化所述的金属有机框架材料；

步骤3、对得到的金属有机框架材料进行多巴胺修饰。

优选的，所述制备金属有机框架材料具体为：

步骤11、将氯化亚锰MnCl2、有机配体六氨基三撑苯HATP在去离子水中混合；

步骤12、向步骤12制备的液体中滴加三乙胺，然后再80℃加热回流24h后冷却；

步骤13、将步骤12所得液体离心弃上清，得到的黑色粉末状固体即为金属有机框架材料。

优选的，所述除去金属有机框架材料中未反应的原料和溶剂分子，活化所述的金属有机框架材料，具体为：

步骤21、将金属有机框架材料浸入无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，于80℃下交换3天，每天用新的无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂交换2次；

步骤22、然后在室温下浸到丙酮中，交换3天，每天用新的丙酮交换2次；

步骤23、运用超临界二氧化碳方法交换步骤22所得金属有机框架材料中剩余的残留溶剂。

优选的，所述对得到的金属有机框架材料进行多巴胺修饰，具体为：

步骤31、将步骤2活化后的金属有机框架材料Mn-HATP MOF分散在tris-HCl的缓冲溶液中，超声30min，所述tris-HCl的pH＝8.5；

步骤32、加入多巴胺，然后在95℃下回流三天后冷却；

步骤33、在12000g下离心，用去离子水和无水乙醇分别洗涤五次；

步骤34、用超临界二氧化碳方法干燥，即得多聚多巴胺修饰后的金属有机框架材料pDOPA-MOFs。

优选的，所述运用超临界二氧化碳方法，具体为

步骤41、将材料放在干燥仪样品室中；

步骤42、加入液态二氧化碳并保持1h；

步骤43、后放出二氧化碳，加入新的液态二氧化碳；

步骤44、重复步骤41-步骤43的操作3次；

步骤45、将浸入二氧化碳的材料加热到40℃，并保持此状态1h后将二氧化碳释放出来，即得干燥纯净的材料。

优选的，所述氯化亚锰MnCl2为30mg-50mg，所述有机配体六氨基三撑苯HATP为80mg-200mg，所述去离子水为80mL-200mL，所述三乙胺为0.5mL-2mL。

优选的，所述Mn-HATP MOF为30mg-100mg，所述tris-HCl为100mL-200mL，所述多巴胺为200mg-300mg。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法，具备以下有益效果：本发明的金属有机框架材料本身具有的超氧化物歧化酶(SOD)，可有效地将氧自由基转化为水和氧气，同时这种新型金属有机框架材料可以上调神经细胞内源性抗氧化酶的活性，进一步实现对自由基的清除。在卒中小鼠中通过侧脑室注射的方式递送金属有机框架材料，实现了病灶微环境的改善，神经细胞死亡率降低，梗死体积减少，小鼠术后行为学功能得到了有效恢复。

附图说明

图1为本发明用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法的整体过程示意图；

图2为本发明的pDOPA-MOFs的自由基清除实验图；

图3为本发明的pDOPA-MOFs上调神经细胞抗氧化酶基因检测实验图；

图4为本发明pDOPA-MOFs治疗脑卒中动物后行为学评价结果图；

图5为本发明治疗后动物脑组织学评价结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、制备金属有机框架材料；

步骤2、除去金属有机框架材料中未反应的原料和溶剂分子，活化的金属有机框架材料；

步骤3、对得到的金属有机框架材料进行多巴胺修饰。

本实施例中，制备金属有机框架材料具体为：

步骤11、将氯化亚锰(MnCl₂)、有机配体六氨基三撑苯(HATP)在去离子水中混合；

步骤12、向步骤12制备的液体中滴加三乙胺，然后再80℃加热回流24h后冷却；

步骤13、将步骤12所得液体离心弃上清，得到的黑色粉末状固体即为金属有机框架材料。

本实施例中，除去金属有机框架材料中未反应的原料和溶剂分子，活化的金属有机框架材料，具体为：

步骤21、将金属有机框架材料浸入无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，于80℃下交换3天，每天用新的无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂交换2次；

步骤22、然后在室温下浸到丙酮溶剂中，交换3天，每天用新的丙酮溶剂交换2次；

步骤23、运用超临界二氧化碳方法交换步骤22所得金属有机框架材料中剩余的残留溶剂。

本实施例中，对得到的金属有机框架材料进行多巴胺修饰，具体为：

步骤31、将步骤2活化后的金属有机框架材料Mn-HATP MOF分散在tris-HCl(pH＝8.5)的缓冲溶液中，超声30min；

步骤32、加入的多巴胺，然后在95℃下回流三天后冷却；

步骤33、在12000g下离心，用去离子水和无水乙醇分别洗涤五次；

步骤34、用超临界二氧化碳方法干燥，即得多聚多巴胺修饰后的金属有机框架材料MOF(pDOPA-MOFs)。

本实施例中，运用超临界二氧化碳方法，具体为

步骤41、将材料放在干燥仪样品室中；

步骤42、加入液态二氧化碳并保持1h；

步骤43、后放出二氧化碳，加入新的液态二氧化碳；

步骤44、重复步骤41-步骤43的操作3次；

步骤45、将浸入二氧化碳的材料加热到40℃，并保持此状态1h后将二氧化碳释放出来，即得干燥纯净的材料。

本实施例中，氯化亚锰(MnCl₂)为30mg-50mg，有机配体六氨基三撑苯(HATP)为80mg-200mg，去离子水为80mL-200mL，三乙胺为0.5mL-2mL。

本实施例中，Mn-HATP MOF为30mg-100mg，tris-HCl为100mL-200mL，多巴胺为200mg-300mg。

实施例2

一种如上述的金属有机框架材料的制备方法所制备的金属有机框架材料在缺血性脑卒中治疗中的应用，具体为：

1、多聚多巴胺修饰的有机金属框架材料(pDOPA-MOFs)用PBS稀释到浓度为12.5微克/毫升的治疗液。

2、C57小鼠麻醉后分离头部右侧皮肤，以前囟为原点，在向尾侧方向0.5mm，平行于中缝右侧1cm位置用颅钻机钻孔；

3、分离小鼠颈部皮肤，游离右侧颈外动脉，通过颈外动脉导入梗阻模型专用线栓，在到达指定位置后开始计时1小时倒计时；

4、开始计时后立刻用汉密尔顿针在头部钻孔位点进行深度为3mm的治疗液显微注射，用微量注射泵控制注射速度为0.5微升/分钟，注射量为5微升。

5、待到计时结束后拔出线栓，对手术伤口部位进行缝合。

实施例3

如图1所示，本申请将金属Mn与有机配体HATP通过自组装形成Mn-HATP金属有机框架化合物(Mn-MOF)，Mn-MOF表面使用多巴胺进行修饰，得到pDOPA-MOFs。

如图2所示，在体外，使用超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒检测pDOPA-MOFs抗氧化酶活性，即清除超氧阴离子以及过氧化氢等自由基的能力。将浓度为2.5、5、10、12.5、25、50、75、100μg/ml的pDOPA-MOFs与检测试验体系共孵育，通过测定检测体系(溶液)特定吸收波长对应的吸光度值，反映pDOPA-MOFs酶活性。数据证明，pDOPA-MOFs在体外具有类似SOD酶活性清除超氧阴离子(图2)。

其中，SOD酶检测原理(WST法)为：试剂盒体系中黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶(XO)反应系统产生超氧阴离子。超氧阴离子可以使WST-1反应产生水溶性甲臢染料，甲臜在450nm处有特征性吸收峰。而SOD酶可以清除超氧阴离子，从而抑制甲臢的形成。反应完成后，反应液吸光度值越高表明SOD活性越低，反之SOD活性越高。

其中，图2实验具体步骤：

1.底物应用液的配制：底物储备液与缓冲液按1：200的比例混合，配制底物应用液体；

2.酶工作液的配制：酶储备液与酶稀释液按1：10比例混匀，配制成酶工作液；

3.取96孔板，按下述操作表进行加样：

	对照孔	对照空白孔	测定孔	测定空白孔
					待测样本(μl)	-	-	20	20
蒸馏水(μl)	20	20	-	-
					酶工作液(μl)	20	-	20	-
酶稀释液(μl)	-	20	-	20
					底物应用液(μl)	200	200	200	200

表中待测样本为pDOPA-MOFs材料，加入一定量pDOPA-MOFs，使其终浓度为2.5、5、10、12.5、25、50、75、100、150μg/ml；

4.将96孔板置于37℃孵育20分钟-30分钟。

5.在450nm(420-480nm均可)处测定吸光度；

6.通过公式得出抑制百分率，从而间接反映SOD酶活性。抑制百分率＝[A_对照孔-A_{对照空白孔}]-[A_测定孔-A_{测定空白孔}]/[A_对照孔-A_{对照空白孔}]。

如图3所示，为探索pDOPA-MOFs是否具有上调细胞内抗氧化酶表达的功能，利用细胞实验和qpcr检测技术，检测经pDOPA-MOFs共处理后的神经细胞内相关抗氧化酶基因水平的表达。

实验原理：以一定量pDOPA-MOFs与神经细胞体外共培养24小时后，提取细胞RNA，逆转录，使用qpcr技术检测细胞内抗氧化酶相关基因表达水平。

图3实验具体步骤：

1、在细胞12孔板中铺神经细胞(如C17.2或N2a细胞系)。使用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液。12孔板在5％二氧化碳培养箱里37℃培养，密切观察细胞状态；

2、过夜后，细胞融合至50％-70％时，在细胞12孔板中加入不同浓度(2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，12.5μg/ml)pDOPA-MOFs与神经细胞(如C17.2或N2a细胞)共培养24小时；

3、24小时后，弃去培养基，用冷PBS溶液洗涤2-3次后，每孔加入1ml Trizol液，在冰上静置20-30min，收集后使用Trizol法提取细胞RNA；

4、逆转录，通过qpcr(定量聚合酶链式反应)技术检测抗氧化酶相关基因表达。这些基因包括SOD、CAT、GPX-1，HO-1等；

结果显示，与对照组相比，一定浓度pDOPA-MOFs共培养的神经细胞内多种抗氧化酶基因水平显著上调(图3)。

如图4所示，为治疗后动物行为学评价实验。对人为建立的脑卒中小鼠进行pDOPA-MOFs的颅内注射治疗，同时以PBS注射治疗组为对照。手术治疗结束后，进行为期4周的观察。每一周对各组小鼠进行行为学检测，包括改良神经功能缺损评分实验，圆桶实验，小鼠疲劳转棒实验等，记录相关数据，综合评估小鼠卒中后功能恢复。其具体有：建立小鼠脑卒中模型，侧脑室注射pDOPA-MOFs(同上述实施案例2)。同时设立PBS治疗组(对照组)和假手术组。上述治疗后观察四周，对各组小鼠术后存活情况进行统计并绘制生存曲线，结果显示相比PBS组，pDOPA-MOFs治疗组存活率达70.6％，高PBS组(29.4％)两倍。第1-4周，分别对各组小鼠行为学功能恢复进行检测。

涉及实验有：

1.改良神经功能缺损评分(mNSS)。这是一项反映小鼠运动和感觉功能的行为学评分实验。按照评分标准对小鼠进行评分。分数越低，表明功能恢复越好。结果显示，随着时间的推移，pDOPA-MOFs治疗组小鼠功能评分递减，功能得以恢复。

2.小鼠疲劳转棒实验。这是一项测试小鼠协调运动功能和抗疲劳能力的实验。小鼠落棒时间越长，说明运动和抗疲劳功能越好。结果显示，4周后小鼠落棒时间与假手术组小鼠相当，功能恢复良好。

3.圆桶实验。这是一项检测小鼠前肢协调运动功能的实验。小鼠置于圆桶装置后，产生自发性前肢行为。小鼠将前肢贴在圆桶壁上以支撑其身体。小鼠置于圆桶装置后记录5分钟内小鼠患侧前肢和对侧(健康侧)前肢在圆桶壁上停留的时间，从而计算自发性前肢行为不对称指数，反映前肢协调运动能力。结果显示，治疗后不对称指数减低，小鼠前肢协调运动能力逐步加强。

如图5所示，为治疗后动物脑组织学评价实验。行为学测试完成后，对小鼠进行灌流取脑，进行相关组织化学染色实验(如TTC染色和HE染色)。评估和比较pDOPA-MOFs组和PBS对照组小鼠脑梗死面积大小。

图5实验具体步骤有：

1、治疗后的小鼠，先使用生理盐水溶液进行心脏灌流；

2、待血液完全冲干净后，换用4％多聚甲醛进行心脏灌流。

3、灌流后取脑，脑组织置于-20℃冰箱进行冷冻，取出在冰上进行切片；

4、TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色。TTC染色可以和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应生成红色甲臜，而未着色的苍白处为死细胞处即梗死区域。

结果显示，图5a显示，相比PBS治疗组，pDOPA-MOFs组梗死灶明显减小。图5b为梗死体积统计图。图5c为4周后，各组小鼠脑组织大体图。

为更准确量化梗死体积，对脑组织进行石蜡包埋和切片，后进行HE染色(图5d)，并对梗死面积进行统计，绘制图5e梗死灶统计图。结果表明，pDOPA-MOFs的治疗可显著降低小鼠脑卒周后形成的梗死体积。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、制备金属有机框架材料，具体为：

步骤11、将氯化亚锰MnCl2、有机配体六氨基三撑苯HATP在去离子水中混合；

步骤12、向步骤11制备的液体中滴加三乙胺，然后再80℃加热回流24h后冷却；

步骤13、将步骤12所得液体离心弃上清，得到的黑色粉末状固体即为金属有机框架材料；

步骤2、除去金属有机框架材料中未反应的原料和溶剂分子，活化所述的金属有机框架材料Mn-HATP MOF；

步骤3、对得到的金属有机框架材料进行多巴胺修饰。

2.根据权利要求1所述的用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法，其特征在于，所述除去金属有机框架材料中未反应的原料和溶剂分子，活化所述的金属有机框架材料，具体为：

步骤21、将金属有机框架材料浸入无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，于80℃下交换3天，每天用新的无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂交换2次；

步骤22、然后在室温下浸到丙酮中，交换3天，每天用新的丙酮交换2次；

步骤23、运用超临界二氧化碳方法交换步骤22所得金属有机框架材料中剩余的残留溶剂。

3.根据权利要求1所述的用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法，其特征在于，所述对得到的金属有机框架材料进行多巴胺修饰，具体为：

步骤31、将步骤2活化后的金属有机框架材料Mn-HATP MOF分散在tris-HCl的缓冲溶液中，超声30min，所述tris-HCl的pH=8.5；

步骤32、加入多巴胺，然后在95 ℃下回流三天后冷却；

步骤33、在12000g下离心，用去离子水和无水乙醇分别洗涤五次；

步骤34、用超临界二氧化碳方法干燥，即得多聚多巴胺修饰后的金属有机框架材料pDOPA-MOFs。

4.根据权利要求2或3所述的用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法，其特征在于，所述运用超临界二氧化碳方法，具体为

步骤41、将材料放在干燥仪样品室中；

步骤42、加入液态二氧化碳并保持1h；

步骤43、后放出二氧化碳，加入新的液态二氧化碳；

步骤44、重复步骤41-步骤43的操作3次；

步骤45、将浸入二氧化碳的材料加热到40℃，并保持此状态1h后将二氧化碳释放出来，即得干燥纯净的材料。

5.根据权利要求1所述的用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法，其特征在于：所述氯化亚锰MnCl2为30mg-50mg，所述有机配体六氨基三撑苯HATP为80mg-200mg，所述去离子水为80mL-200mL，所述三乙胺为0.5mL-2mL。

6.根据权利要求3所述的用于缺血性脑卒中治疗的金属有机框架材料的制备方法，其特征在于：所述Mn-HATP MOF为30mg-100mg，所述tris-HCl为100mL-200mL，所述多巴胺为200mg-300mg。

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