CN111643728A

CN111643728A - 一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶及制备方法

Info

Publication number: CN111643728A
Application number: CN202010504813.XA
Authority: CN
Inventors: 吴承伟; 魏成雄; 金鑫; 张伟; 马建立
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2040-06-05
Also published as: CN111643728B

Abstract

一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶及制备方法，属于生物医用材料领域。步骤为：首先，采用水热碳化法合成微纳米碳球。其次，将微纳米碳球加入壳聚糖溶液中，搅拌均匀，得到溶液A。再次，将β‑甘油磷酸钠和透明质酸钠同时溶解到去离子水中，充分搅拌得到溶液B。最后，在冰浴环境下，将溶液B加入溶液A中，搅拌均匀，使用紫外灯灭菌消毒24h，得到可注射复合水凝胶。本发明具有良好的生物相容性；在室温下为液态，可直接注射进骨肿瘤病灶内，在体温37℃环境下可快速原位形成凝胶，实现对光热剂的有效固定和骨缺损的快速填充；可通过局部光热治疗实现对骨肿瘤细胞的杀伤，同时能够有效促进骨组织的修复，实现对骨肿瘤的全方位治疗。

Description

一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶及制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，更具体地，涉及一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶及制备方法。

背景技术

骨肿瘤是发生于骨骼或其附属组织的肿瘤，会导致人体组织异常生长。恶性骨肿瘤发病率高，通常难以治愈。值得注意的是，肺癌、前列腺癌、乳腺癌和肾癌等多数恶性肿瘤在其发展进程中容易发生癌症转移，而骨组织是以上肿瘤主要的转移位置，从而导致转移性骨肿瘤的形成。骨肿瘤通常还会伴有骨痛、骨溶解、骨折、骨畸形等严重的并发症。这些并发症给患者带来巨大的痛苦，降低了生活质量，同时造成患者家庭沉重的经济和心理负担。

目前，临床治疗骨肿瘤的主要手段包括手术治疗，放射治疗和化疗。但是，这些治疗手段均存在一定局限性。通常，手术治疗是最直接的治疗方式，但其难以确保彻底清除肿瘤组织，从而造成骨肿瘤的复发。与此同时，该治疗手段通过手术切除病灶后，会造成大面积的骨组织缺损，将严重影响患者的后期恢复。其次，放射治疗和化疗作为恶性肿瘤治疗方式，通常会引起严重的副作用，具有一定的治疗风险。

近年来，光热治疗由于其具有高选择性、低侵略性、低副作用等优势，已经迅速成为肿瘤治疗领域的研究热点。肿瘤光热治疗利用近红外光激发肿瘤部位的光热剂，使其产生光热转化效应，从而产生局部过热来杀伤肿瘤细胞。大量研究已经证明光热治疗是一种非常具有应用前景的肿瘤治疗手段，在众多类型的肿瘤光热治疗中已经表现出良好的治疗效果。但是，光热治疗用于骨肿瘤的治疗目前还处在进一步研究中，一些显著的问题亟待解决。例如，纳米光热剂作为肿瘤光热治疗的重要光热转化材料，对光热治疗效果具有显著影响，通过静脉注射递送纳米光热剂到肿瘤部位，光热剂的富集率低，达不到光热治疗效果。通过原位注射纳米光热剂，虽然能够增强局部光热治疗温度，但是由于人体代谢和血液循环，光热剂在肿瘤部位的滞留时间短，极大影响肿瘤的长期疗效。其次，要实现骨肿瘤的根治，消灭肿瘤细胞仅是治疗的一部分，后期骨组织的修复同样是临床治疗中亟待解决的问题。因此，研发一种能够使光热剂稳定存在于肿瘤部位，兼具骨肿瘤治疗和骨组织修复的多功能光热治疗手段具有十分重要的意义。

为了解决以上提到的问题，本发明以壳聚糖、β-甘油磷酸钠和透明质酸钠制备的可注射水凝胶为载体材料，将其与具有光热转化能力的纳米碳材料复合，制备了一种兼具骨肿瘤光热治疗和骨组织修复的多功能可注射水凝胶。该多功能可注射水凝胶具有良好的生物相容性、光热稳定性，能够使光热剂稳定保留在病灶部位，同时实现骨肿瘤的局部光热治疗以及对骨组织缺损的修复，为骨肿瘤治疗提供有效方案。

发明内容

基于上述问题，本发明旨在制备一种兼具骨肿瘤光热治疗和骨组织修复的多功能可注射水凝胶，该水凝胶体系由具有光热转化能力的微纳米碳球复合到可注射水凝胶中制备得到。通过调控光热剂含量，以及水凝胶组分比例，可以实现对该水凝胶体系的成胶时间、成胶温度和光热性能进行调控，从而实现骨肿瘤的有效治疗。该多功能可注射水凝胶不仅可以实现骨肿瘤的光热治疗，同时还能促进骨组织的修复，是一种有潜力的骨肿瘤治疗手段。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶，所述多功能可注射水凝胶在人体温度下可成胶，能够有效修复骨组织缺损，包括如下步骤：

步骤一：采用水热碳化法合成微纳米碳球

1)将糖类溶解到去离子水中，充分溶解后配置成一定浓度的糖溶液；其中，糖溶液的浓度为0.3～2mol/L；

2)将糖溶液置于高压反应釜中反应，在160～250℃条件下反应6～10小时，得到的反应产物分别用去离子水和无水乙醇充分清洗，离心收集，置于40～100℃下真空干燥6～24h，得到微纳米碳球。

步骤二：制备可注射水凝胶

1)室温下，将壳聚糖溶解到醋酸溶液中，充分搅拌，静置6～24h，去除未溶解的杂质和气泡，得到壳聚糖溶液；

2)将步骤一中得到的微纳米碳球加入壳聚糖溶液中，其中，每毫升壳聚糖溶液中加入0.2～8mg纳米碳球，经过超声震荡和磁力搅拌处理，使溶液混合均匀，得到溶液A；

3)将β-甘油磷酸钠和透明质酸钠同时溶解到去离子水中，充分搅拌，去除未溶解的杂质和气泡，得到溶液B；

4)在冰浴环境下，将溶液B加入溶液A中，其中，溶液B和溶液A的混合体积比为1:6～1:1，充分搅拌，混合均匀，使用紫外灯灭菌消毒24h，得到可注射复合水凝胶。

优选地，步骤一中所述的糖类包括水合葡萄糖、无水葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉中的一种。

优选地，步骤二1)中所述的醋酸溶液浓度为0.5～10％，配置后的壳聚糖溶液浓度为1～10％。

优选地，步骤二3)中所述的溶液B中β-甘油磷酸钠的浓度为40～80％，透明质酸钠的浓度为0.5～5％。

流变性能测试表明，本发明所述的多功能可注射水凝胶具有良好的温敏特性，成胶温度接近37℃，通过改变水凝胶的组分比例，可以实现对成胶温度的调控。

体外光热性能测试表明，本发明所述的多功能可注射水凝胶在近红外光加热200s后具有平稳的光热温度，通过改变近红外光强度和微纳米碳球的浓度可以实现对热疗温度的调控。

本发明所述的可注射水凝胶经过近红外光循环照射后，热疗温度稳定，能够有效保证本体系水凝胶在体内进行多次热疗，从而增强疗效。

细胞光热测试表明，本发明所述的多功能可注射水凝胶在近红外光照射下，可以实现对人体骨肉瘤细胞的有效杀伤，具有良好的光热疗效果。

将微纳米碳球浸泡于模拟人体体液中的实验结果表明碳球能够有效的诱导羟基磷灰石生长，而羟基磷灰石是人体骨骼组织重要的无机成分，具有较高的生物活性，能够有效促进骨组织的修复。纯凝胶和复合凝胶置于模拟人体体液中培养的实验结果表明本发明所述的可注射水凝胶能够有效的诱导羟基磷灰石生长，具备促进骨组织修复的能力。

Sprague-Dawley大鼠颅骨双临界缺损模型实验表明，本发明所述的多功能可注射水凝胶具有良好的生物相容性和新骨诱导性，能够有效的修复骨组织缺损。

本发明所述多功能可注射水凝胶具有如下优点和有益效果：1)本发明所述的可注射水凝胶制备原料包括壳聚糖、β-甘油磷酸钠和透明质酸钠，近红外光热转化材料为微纳米碳球，该体系具有良好的生物相容性；2)本发明所述的可注射水凝胶具有良好的凝胶性能，在室温下为液态，可通过医用注射器直接注射进骨肿瘤病灶内，在体温37℃环境下可快速原位形成凝胶，实现对光热剂的有效固定和骨缺损的快速填充；3)本发明所述的可注射水凝胶可以通过局部光热治疗实现对骨肿瘤细胞的杀伤，同时能够有效促进骨组织的修复，实现对骨肿瘤的全方位治疗。

附图说明

图1为可注射水凝胶的成胶机理图；

图2为可注射水凝胶扫描电镜观测的内部网络结构图；

图3为可注射水凝胶的流变性能测试结果，图(a)为不含碳球的水凝胶流变曲线；图(b)为含碳球0.5mg/mL的水凝胶流变曲线；图(c)为含碳球1mg/mL的水凝胶流变曲线；图(d)为含碳球2mg/mL的水凝胶流变曲线；

图4为可注射水凝胶在不同近红外光强度下的光热性能测试结果；

图5为可注射水凝胶在不同碳球浓度下的光热性能测试结果；

图6为可注射水凝胶体外循环光热性能测试结果；

图7为可注射纯凝胶和复合凝胶在不同的近红外光照射时长下对人体骨肉瘤细胞的光热消融结果；

图8为微纳米碳球在模拟人体体液中培养0、5和10天后诱导羟基磷灰石生长结果，其中，图a为傅里叶红外光谱表征结果，图b为碳球培养0天后的扫描电镜形貌图,图c为碳球培养5天后的扫描电镜形貌图,图d为碳球培养10天后的扫描电镜形貌图；

图9为可注射纯凝胶和复合凝胶在模拟人体体液中培养0和28天后诱导羟基磷灰石生长的X射线衍射表征结果；

图10为可注射水凝胶修复Sprague-Dawley大鼠颅骨双临界缺损模型实验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点表述更加清楚，以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述和说明。应当理解，以下具体实施例仅用于进一步解释本发明，并不限定本发明。此外，在以下描述中所涉及的具体实施方式及技术特征只要彼此之间未构成冲突便可相互结合，从而达到相应的效果。

实施例1

1)将水合葡萄糖溶解到去离子水中，充分溶解后配置成0.5mol/L的葡萄糖溶液；

2)将200mL葡萄糖溶液置于容积为300mL的高压反应釜中，在170℃下反应6h，得到的反应产物分别用去离子水和无水乙醇充分清洗3次，离心收集，置于50℃下真空干燥24h，得到微纳米碳球；

3)将壳聚糖溶解到1％的醋酸溶液中，充分搅拌，静置12h，去除未溶解的杂质和气泡，得到浓度为3％的壳聚糖溶液；

4)将上述得到的微纳米碳球加入壳聚糖溶液中，其中，每毫升壳聚糖溶液中加入1.25mg碳球，经过超声震荡和磁力搅拌处理，使溶液混合均匀，得到溶液A；

5)将β-甘油磷酸钠和透明质酸钠同时溶解到去离子水中，充分搅拌，去除未溶解的杂质和气泡，得到溶液B，溶液中β-甘油磷酸钠和透明质酸钠的浓度分别为60％和2％；

6)在冰浴环境下，将溶液B按照1:4的体积比加入到溶液A中，充分搅拌，混合均匀，使用紫外灯灭菌消毒24h，得到可注射复合水凝胶。

实施例2

1)将蔗糖溶解到去离子水中，充分溶解后配置成1mol/L的蔗糖溶液；

2)将200mL蔗糖溶液置于容积为300mL的高压反应釜中，在180℃下反应8h，得到的反应产物分别用去离子水和无水乙醇充分清洗3次，离心收集，置于50℃下真空干燥24h，得到微纳米碳球；

3)将壳聚糖溶解到1.5％的醋酸溶液中，充分搅拌，静置6h，去除未溶解的杂质和气泡，得到浓度为5％的壳聚糖溶液；

4)将上述得到的微纳米碳球加入壳聚糖溶液中，其中，每毫升壳聚糖溶液中加入0.2mg碳球，经过超声震荡和磁力搅拌处理，使溶液混合均匀，得到溶液A；

5)将β-甘油磷酸钠和透明质酸钠同时溶解到去离子水中，充分搅拌，去除未溶解的杂质和气泡，得到溶液B，溶液中β-甘油磷酸钠和透明质酸钠的浓度分别为50％和1％；

6)在冰浴环境下，将溶液B按照1:6的体积比加入到溶液A中，充分搅拌，混合均匀，使用紫外灯灭菌消毒24h，得到可注射复合水凝胶。

实施例3

1)将果糖溶解到去离子水中，充分溶解后配置成2mol/L的果糖溶液；

2)将200mL蔗糖溶液置于容积为300mL的高压反应釜中，在190℃下反应10h，得到的反应产物分别用去离子水和无水乙醇充分清洗3次，离心收集，置于80℃下真空干燥24h，得到微纳米碳球；

3)将壳聚糖溶解到2％的醋酸溶液中，充分搅拌，静置12h，去除未溶解的杂质和气泡，得到浓度为1％的壳聚糖溶液；

4)将上述得到的微纳米碳球加入壳聚糖溶液中，其中，每毫升壳聚糖溶液中加入8mg碳球，经过超声震荡和磁力搅拌处理，使溶液混合均匀，得到溶液A；

5)将β-甘油磷酸钠和透明质酸钠同时溶解到去离子水中，充分搅拌，去除未溶解的杂质和气泡，得到溶液B，溶液中β-甘油磷酸钠和透明质酸钠的浓度分别为80％和3％；

6)在冰浴环境下，将溶液B按照1:2的体积比加入到溶液A中，充分搅拌，混合均匀，使用紫外灯灭菌消毒24h，得到可注射复合水凝胶。

实施例4

1)将无水葡萄糖溶解到去离子水中，充分溶解后配置成0.3mol/L的果糖溶液；

2)将200mL蔗糖溶液置于容积为300mL的高压反应釜中，在230℃下反应6h，得到的反应产物分别用去离子水和无水乙醇充分清洗3次，离心收集，置于40℃下真空干燥24h，得到微纳米碳球；

3)将壳聚糖溶解到1.2％的醋酸溶液中，充分搅拌，静置24h，去除未溶解的杂质和气泡，得到浓度为10％的壳聚糖溶液；

4)将上述得到的微纳米碳球加入壳聚糖溶液中，其中，每毫升壳聚糖溶液中加入4mg碳球，经过超声震荡和磁力搅拌处理，使溶液混合均匀，得到溶液A；

5)将β-甘油磷酸钠和透明质酸钠同时溶解到去离子水中，充分搅拌，去除未溶解的杂质和气泡，得到溶液B，溶液中β-甘油磷酸钠和透明质酸钠的浓度分别为50％和0.5％；

6)在冰浴环境下，将溶液B按照1:1的体积比加入到溶液A中，充分搅拌，混合均匀，使用紫外灯灭菌消毒24h，得到可注射复合水凝胶。

图1为本发明所述可注射水凝胶的成胶机理图，当外部温度升高时，凝胶组分发生离子凝胶，形成网络结构。图2为实施例1中的可注射水凝胶扫描电镜表征的形貌图，结果表明该水凝胶具有贯穿的孔洞结构，这样的结构有利于营养成分的交换。图3a～d分别代表碳球浓度为0～2mg/mL时，水凝胶的流变性能测试结果，结果表明该水凝胶随温度升高，其力学性能逐渐增强。其次，随着碳球浓度的升高，其成胶温度由39.1℃降低到35.1摄氏度，说明改变碳球的浓度可以调控凝胶的成胶温度。图4为实例1中的水凝胶在近红外光强度为0.22～1.11W/cm²下的光热温度变化曲线，结果表明该水凝胶具有良好的光热性能，在近红外光照射200s后能够达到一个相对稳定的光热温度，近红外光越强，其达到的稳定光热温度越高。图5为该水凝胶在近红外光强度为0.37W/cm²下，碳球浓度为0～5mg/mL的光热温度变化曲线，结果表明该水凝胶可以通过调节碳球浓度实现对光热温度的调控，从而实现光热治疗的目的。图6为实例1中的水凝胶在近红外光照射4个循环的光热曲线，结果表明该水凝胶具有良好的光热稳定性，在经过4个循环的光热后，依然能够保持稳定的光热温度。图7为实例1中的复合凝胶及纯凝胶分别在近红外光照射0～30min后的人体骨肉瘤细胞死活荧光染色图，结果表明，当未照射近红外光时，复合凝胶和纯凝胶细胞成活率高，基本无死细胞，说明本发明所述凝胶具有良好的生物相容性。其次，复合凝胶随着近红外光照射时间增长，活细胞数量显著减少，死细胞数量增多，尤其在照射30min后，肿瘤细胞几乎被全部消融。作为对照组，纯凝胶在照射近红外光30min后，细胞依然存活良好。结果表明碳球作为光热剂对于肿瘤细胞消融具有显著影响，其次说明了本发明所述的可注射水凝胶能够通过光热有效消融肿瘤细胞，对于肿瘤热疗具有明显效果。图8为实例1中所制备的碳球在模拟人体体液中培养情况。图8a为傅里叶红外光谱表征结果，结果显示随着培养时间增长，碳球逐渐出现P-O官能团，预示含此官能团的物质生成。图8b～d为扫描电镜表征结果，结果显示随着培养时间增长，碳球表面逐渐生成规则的网状结晶物质，预示羟基磷灰石结构的生成。图9为实例1中复合凝胶及纯凝胶在模拟人体体液中培养0和28天后的X射线衍射表征结果，结果证明复合凝胶和纯凝胶均能有效诱导羟基磷灰石生长，预示该水凝胶能够有效促进骨组织的修复。图10为实例1中的复合凝胶及纯凝胶修复Sprague-Dawley大鼠颅骨双临界缺损模型实验结果，结果表明复合凝胶植入骨组织缺损处8周后，能够修复约80％的骨组织，相比于纯凝胶组和空白组，具有显著的骨组织修复能力。

以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：采用水热碳化法合成微纳米碳球

1)将糖类溶解到去离子水中，充分溶解后配置成浓度为0.3～2mol/L的糖溶液；

2)将糖溶液置于高压反应釜中反应，在160～250℃条件下反应6～10小时，得到的反应产物分别用去离子水和无水乙醇清洗，离心收集，真空干燥得到微纳米碳球；

步骤二：制备可注射水凝胶

1)室温下，将壳聚糖溶解到醋酸溶液中，充分搅拌，静置6～24h，去除未溶解的杂质和气泡，得到壳聚糖浓度为1～10％的壳聚糖溶液；

4)在冰浴环境下，将溶液B加入溶液A中，其中，溶液B和溶液A的混合体积比为1:6～1:1，充分搅拌，混合均匀，使用紫外灯灭菌消毒，得到可注射复合水凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的糖类包括水合葡萄糖、无水葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤一中所述干燥温度40～100℃下，干燥时间6～24h。

4.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤二1)中所述的醋酸溶液浓度为0.5～10％。

5.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤二3)中所述的溶液B中β-甘油磷酸钠的浓度为40～80％，透明质酸钠的浓度为0.5～5％。

6.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤二4)中紫外灯灭菌消毒时间为24h。

7.一种用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶，其特征在于，所述用于肿瘤光热治疗及骨组织修复的多功能可注射水凝胶是由权利要求1-6任一所述的制备方法制备得到的，在人体温度下可成胶，且能够有效修复骨组织缺损。