CN105874319A

CN105874319A - 采用正电荷aie荧光团特异性检测和量化心磷脂和分离线粒体及该aie荧光团的制造方法

Info

Publication number: CN105874319A
Application number: CN201480062369.3A
Authority: CN
Inventors: 唐本忠; 洪煜柠; 梁玮彤
Original assignee: Hong Kong University of Science and Technology HKUST
Current assignee: Hong Kong University of Science and Technology HKUST
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2014-12-03
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-12-03
Also published as: US20160299078A1; WO2015081860A1; CN105874319B; US10113968B2

Abstract

本发明涉及通过在包含样本的溶液中引入AIE发光团以及测量所述溶液的荧光强度，从而采用正电荷AIE发光团检测和量化样本中的心磷脂的一步法；以及通过采用AIE发光团染色含分离线粒体的样本以及测量荧光强度，从而采用正电荷AIE发光团量化分离线粒体的方法；以及通过向包含分离线粒体的样本中引入AIE发光团，并在显微镜下识别染色的分离线粒体，从而采用正电荷AIE发光团量化分离线粒体的方法，其中所述AIE发光团染色所述分离线粒体。与其它主要的线粒体膜脂质相比，具有聚集诱导发光特性的发光团TTAPE‑Me对心磷脂具有更高的灵敏性和杰出的选择性，因此可以用作心磷脂检测和量化、以及分离线粒体量化的颇有价值的荧光传感器。

Description

采用正电荷AIE荧光团特异性检测和量化心磷脂和分离线粒体及该AIE荧光团的制造方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2013年12月3日递交的美国临时专利申请No.61/963,393的优先权，该美国临时专利申请的申请人为本专利申请的发明人，并且其全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明主题特别涉及可量化心磷脂(cardiolipin，CL)且可量化和识别分离线粒体(特别是来自酵母菌的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株YPH 500)的化合物或盐。

背景技术

真核细胞使用其约5％的基因合成脂质。由于脂质在细胞中不可或缺的功能，很大一部分脂质得到利用。由于其独特的结构，脂质形成双层结构以将内部成分与细胞外环境分离以及将单个细胞器官分区。除了其屏障功能外，脂质也可用于脂滴中的能量储存和在信号转导和分子识别过程中作为信使。

心磷脂是仅存于线粒体内膜的双磷脂酰甘油脂。心磷脂调节参与电子传递和氧化磷酸化的酶的活性。该独特的脂质由四个不饱和的酰基链和具有双负电荷的极性头组成，其结构如下：

心磷脂与蛋白细胞色素c(cyt c)之间的相互作用激活蛋白的过氧化物酶的活性和诱发线粒体介导的凋亡。在凋亡过程中，心磷脂分布变化，从而影响线粒体中的ATP合成。同时，心磷脂水平在凋亡过程中以时间依赖地方式降低，且与细胞色素c到胞液(细胞中的可见的胞内液或细胞质基质)的释放和活性氧的生成有关。

除了在细胞凋亡途径中具有重要作用外，线粒体的心磷脂水平也具有临床意义。心磷脂损耗是衰老、Barth综合征、以及与线粒体呼吸功能相关疾病(包括心脏缺血、再灌注、脑胶质瘤相关疾病、心肌肥厚、心脏衰竭)的关键指标。丹吉尔病是心磷脂异常增生导致的疾病。已有报道指出帕金森病、HIV-1和各种癌症与心磷脂异常相关。因此，开发出检测和量化心磷脂的有效方法是非常重要的。

现有技术的各种定量心磷脂的方法包括William Kenneth Lang(US 2004/0096903A1)、Wonhwa Cho(US 2012/0225447A1)、Ruey-min Lee(US 2006/0172958A1)、Fatih M.Uckun(US 2001/0044442A1)和Robert E.Davis(US 2001/0021526A1)披露的各种方法。然而，这些现有技术示例一般都面临着诸如缺乏标准的实验方案、涉及额外的基质并且方法复杂的问题。

特别地，在众多磷脂中，心磷脂的特异性检测非常重要。近来已经开发出高分辨率的液相色谱-质谱联用(LC-MS)的脂质组学分析用于心磷脂量化分析。该有效方法需要复杂的设备和经验丰富的操作人员，因此限制了其应用范围。

荧光光学检测一方面相对简单可用，另一方面可以提供卓越的灵敏度。早在上世纪80年代初，即已经有采用荧光染料10-正壬基丫啶橙(NAO)检测心磷脂和线粒体染色的介绍了，NAO的结构如下：

NAO的绿色荧光随着心磷脂的出现减少。然而，采用NAO量化心磷脂是不可靠的，因为发光和激发最大值均取决于染料浓度，仅在NAO/心磷脂的摩尔比等于2时才能建立线性关系。为了采用NAO量化线粒体，需要采用非常复杂的步骤，包括线粒体的固定、长时间培养、离心。此外，NAO的斯托克斯位移小、水溶性差，使得其不易在生物系统中使用。NAO的工作机制尚不清楚，且性能难以改善，即使采用各种处理方法也是如此。虽然NAO有许多的缺点，甚至没有标准的实验方案，但是多年来还是一直在使用它，因为目前还没有别的选择。

发明内容

在替换方案的寻找过程中，具有聚集诱导发光(AIE)特性的发光团(luminogens)获得了广泛关注。相对于传统的染料，当以分子状态溶解时，AIE发光团是非发光的，而当其处于聚集状态时，是高荧光性的，这是由于分子内运动限制造成的。

在一个示例性实施例中，本发明描述了采用正电荷AIE发光团检测和量化样本中的心磷脂的一步法，包括：在包含样本的溶液中引入所述AIE发光团，以及测量所述溶液的荧光强度。

在另一示例性实施例中，本发明描述了采用正电荷AIE发光团量化分离线粒体的一步法，包括：采用AIE发光团染色含分离线粒体的样本，并测量荧光强度。

在第三示例性实施例中，本发明描述了采用正电荷AIE发光团量化分离线粒体的一步法，包括：在包含分离线粒体的样本中引入所述AIE发光团，其中所述AIE发光团染色所述分离线粒体；以及在显微镜下识别染色的所述分离线粒体。

附图说明

图1示出了有无囊泡和心磷脂时TTAPE-Me的发光光谱。含心磷脂的囊泡由pH 7.4的含TOCL/DOPC(1:1摩尔比)的25mM HEPES缓冲液组成，无心磷脂的囊泡由pH 7.4的含纯DOPC的25mM HEPES缓冲液组成，[染料]＝10μM；[脂质]_总＝22μM；λ_ex＝350nm。

图2A是含心磷脂的囊泡的粒度分析。含心磷脂的囊泡由pH 7.4的含TOCL/DOPC(1:1摩尔比)的25mM HEPES缓冲液组成。总脂质浓度:22μM。

图2B是无心磷脂的囊泡的粒度分析。无心磷脂的囊泡由pH 7.4的含纯DOPC的25mM HEPES缓冲液组成。总脂质浓度:22μM。

图3A是含心磷脂的囊泡和无心磷脂的囊泡在480nm的TTAPE-Me荧光增强(I/I₀-1)图谱。

图3B是I/I₀-1值的线性区域和心磷脂浓度，[染料]＝10μM；λ_ex＝350nm。

图4A是心磷脂含量不同时(2-50％TOCL)，存在LUV时的TTAPE-Me发光光谱；

图4B是在480nm的荧光增强和心磷脂含量的图谱；[染料]＝10μM；[脂质]_总＝22μM；λ_ex＝350nm。

图5示出了含心磷脂的囊泡随NaCl浓度变化的发光光谱(A)，其中[染料]＝10μM；[脂质]总＝22μM；λ_ex＝350nm；确定TTAPE-Me与含心磷脂的囊泡的结合化学计量的工作曲线(B)，其中TTAPE-Me和CL的总浓度保持在20μM；在25℃连续注入TTAPE-Me滴定含心磷脂的囊泡的量热曲线(C)；以及随[TTAPE-Me]/[脂质]_总摩尔比变化的结合等温线(D)。其中含Cl的囊泡由TOCL和DOPC(1:1摩尔比)组成。

图6示出了BSPOTPE的发光光谱，以及添加含心磷脂囊泡和无心磷脂囊泡的BSPOTPE的发光光谱。含心磷脂囊泡和无心磷脂囊泡分别由pH 7.4的含TOCL/DOPC(1:1摩尔比)或含纯DOPC的25mM HEPES缓冲液组成，其中[染料]＝10μM；[脂质]_总＝22μM；λ_ex＝350nm。

图7示出了(A)TTAPE-Me和(B)具有不同脂质含量的囊泡的NAO(从左到右：20％TOCL,100％DOPC,40％DPPE,2％大豆PI,1％DOPS,和2％SM；各类囊泡的剩余组分为DOPC)的荧光强度的变化；(C)TTAPE-Me和(D)具有含心磷脂的全组分囊泡和无CL的全组分囊泡的NAO的发光光谱；以及插图C和D中示出的荧光强度变化的条形图(E)(红色表示含心磷脂的囊泡，而蓝色表示无C的囊泡)。其中[染料]＝10μM；[脂质]_总＝22μM；对于TTAPE-Me，λ_ex＝350nm且λ_em＝480nm；对于NAO:λ_ex＝499nm且λ_em＝530nm。

图8示出了DNA含量不同时(pUC 18DNA,2686bp)TTAPE-Me的发光光谱。示出具有含心磷脂的LUV的TTAPE-Me作为对照。其中[染料]＝10μM；λ_ex＝350nm。

图9A示出了pH 7.4的25mM HEPES缓冲液中，含TOCL的全组分LUV(17％TOCL,39.5％DOPC,38.8％DPPE,1.7％大豆PI,1％DOPS和2％SM)的粒度分析。

图9B示出了pH 7.4的25mM HEPES缓冲液中，无TOCL的全组分LUV(56.5％DOPC,38.8％DPPE,1.7％大豆PI,1％DOPS和2％SM)的粒度分析。

图10A示出了SEM缓冲液(250mM蔗糖,1mM EDTA,10mM MOPS-KOH,pH 7.2)中具有不同含量的酵母线粒体的TTAPE-Me在480nm的发光强度。

图10B示出了日光下拍摄的TTAPE-ME染色的酵母线粒体的图像，其中[染料]＝10μM；λ_ex＝350nm。

图10C示出了紫外光下拍摄的TTAPE-ME染色的酵母线粒体的图像，其中[染料]＝10μM；λ_ex＝350nm。

图11示出了具有不同磷脂的LUV出现时，化合物1的发光光谱。

图12示出了具有含心磷脂和无心磷脂的全组分囊泡的化合物2的发光光谱。

图13示出了具有含心磷脂和无心磷脂的全组分囊泡的化合物3的发光光谱。

图14示出了具有不同磷脂的LUV出现时，化合物3的发光光谱。

图15示出了具有不同磷脂的LUV出现时，化合物4的发光光谱。

具体实施方式

发明人发现某些AIE发光团可以用于量化心磷脂和分离线粒体。更具体地说，这些AIE发光团可以施加到样本、细胞或囊泡，从而使细胞成像。从而可量化心磷脂或分离线粒体。

AIE发光团可以是荧光团TTAPE-ME。该TTAPE-ME可以结合脂结合蛋白，该脂结合蛋白可以是任何蛋白的脂结合片段。

心磷脂可以位于胞浆或膜中。该膜可以是细胞膜或是脂质囊泡的形式。脂质囊泡可能是大单层囊泡(LUV)，即囊泡的直径为约60nm至800nm、70至800nm、80nm至800nm、90nm至800nm、100nm至700nm、200nm至600nm、300nm至500nm、400nm至800nm、500nm至800nm、600nm至800nm、或700nm至800。

细胞膜可能是真核生物细胞膜。该真核细胞膜可能是哺乳动物细胞膜，其中该哺乳动物细胞膜可能是上皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌肉细胞或神经细胞的结构成分。

在此提供了量化心磷脂或分离线粒体的方法。AIE发光团可以施加或引入生物样本、细胞或脂质囊泡中，其中AIE发光团结合到心磷脂或分离线粒体。接着可以基于细胞或脂质囊泡的成像分析量化该AIE发光团结合的心磷脂或分离线粒体络合物。

定义

除另有规定外，在此使用的全部技术和科学术语都具有和本发明所属的领域中技术人员通常所理解的含义。为了更好地理解本发明的主题和构造附加的权利要求，提供以下定义。

在此使用的术语“聚集诱导发光(aggregation induced emission)”或“AIE”是指化合物基于在非晶或结晶(固体)状态的聚集表现出增强的发光，而在稀溶液中表现出很弱的发光甚至几乎没有发光的现象。

在此使用的术语“发光强度”是指通常由荧光光谱仪或荧光显微镜测量获得的荧光/磷光亮度。

在此使用的术语“发光团(luminogen)”是指表现发光性质的化合物。

在此使用的术语“荧光团(fluorogen)”是指表现发光性质的化合物。

在此使用的术语“片段”是指参考肽、多肽或核酸序列的一部分。

在此使用的术语“分离”或“分离的”是指从含线粒体的材料分离线粒体的过程，在该材料中包括与线粒体关联的至少一种不希望的成分或污染物。术语“分离”包括“分开”、“净化”和/或“澄清”。而不需要特定水平的线粒体分离。

术语“芳基”是指具有单环(例如苯环)、多环(例如联苯)或其中至少一个环是芳香烃环的缩合环(例如萘基、1,2,3,4-四氢化萘、蒽基、或菲基)的芳香羧酸基团，其可不被取代或者可被一个或多个其他上述取代基取代。

在此使用的术语“杂芳基”是指其中至少一个环是芳香烃环的杂环。杂环化合物可以是饱和的、不饱和的，或是具有单环、多环或多个缩合环的芳香羧酸基团，并且在其至少一个环中具有至少一个杂原子如氮、氧或硫。

在此使用的术语“烷基”是指有支链或无支链的烃链，其包含指定数量的碳原子。例如，C₁-C₆直链或支链烷基链包含1到6个碳原子，且包括但不限于例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基等的取代基。在本发明的保护范围内，“烷基”也可以指其烃链中的任何的碳原子可以任选地被O、NH、S或SO₂替换的烷基。例如，正戊基的第2位碳原子可以被O替代而形成丙氧基甲基。

在此使用的术语“不饱和烷基”是指有支链或无支链的不饱和烃链，其包含指定数量的碳原子。例如，C₂-C₆直链或支链烯基链包含具有至少一个双键的2到6个碳原子，且包括但不限于例如乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、叔丁烯基、正-戊烯基、正己烯基等的取代基。在本发明的保护范围内，“不饱和烷基”也可以指其不饱和烃链中的任何的碳原子可以任选地被O、NH、S或SO₂替换的不饱和烷基。例如，4-戊烯的第2位碳原子可以被O替换而形成(2-丙烯)氧基甲基。

在此使用的术语“环烷基”是指包含指定数量的碳原子的有机环取代基。例如，C₃-C₈环烷基包含3到8个碳原子以形成三、四、五、六、七或八元环，包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。

除另有说明外，在此使用的术语“一”或“一个”包括单数和复数。因此，术语“一”、“一个”或“至少一个”可以在该本申请中互换使用。

在本申请中，各个实施例的描述使用“包括”的描述。然而，本领域技术人员可以理解，在某些特定的情况下，一个实施例可以替代使用“基本上由…组成”或“由…组成”进行描述。

为了更好地理解本发明的教导，而非限制本发明的范围，除另有说明外，所有的表示数量、百分比或比例的数值，或其他在本发明说明书或权利要求书中使用的其他数值，在所有情况中都应该理解为是大约的数值。因此，除另有说明外，在下述说明书和后附的权利要求书中出现的数值参数是估计的，并且取决于试图获得的性质。至少，每个数值参数至少应被解释为根据记载的有效数字通过应用普通的四舍五入获得。

使用的缩写列表

AIE 聚集诱导发光

bp 碱基对

BSPOTPE 水溶性AIE发光团

CL 心磷脂

cyt c 细胞色素c

DOPC 1,2-二油锡-甘油-4-磷酸胆碱

DOPS 1,2-二油锡-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)

DPPE (1,2二棕榈锡-甘油-3-磷脂酰乙醇胺)

HEPES 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸

I/I₀ 荧光增强

ITC 等温滴定量热法

LC-MS 液相色谱质谱联用

λ_em 最大发射

λ_ex 激发波长

LUV 大单层囊泡

M 摩尔

MHz 兆赫

mL 毫升

mM 毫摩尔

mmol 毫摩尔

mtDNA 线粒体DNA

NAO 10-正壬基丫啶橙

nm 纳米

NMR 核磁共振

ppm 百万分之一

pUC 质粒克隆载体

S.cerevisiae 酿酒酵母

SEM 扫描电镜

SM N-己酰基-D-鞘磷脂

soy PI L-α-磷脂酰肌醇(Soy)(钠盐)

TOCL 1,1’,2,2’-四油酰双磷脂酰甘油脂

TPE 四苯基乙烯

TTAPE-Me 1,1,2,2-四[4-(2-三甲基氨根乙氧基)苯基]四溴化乙烯

UV 紫外光

μm 微米

施加

AIE发光团可以施加或引入生物样本、细胞或脂质囊泡中。AIE发光团可以注入样本、细胞或囊泡中。AIE发光团也可以通过蛋白转染剂转染至样本、细胞或囊泡。转染剂可以是吞噬细胞加载剂或脂质制剂，如转染剂。

样本可包括一个或多个细胞和/或一个或多个脂质囊泡。所述细胞或脂质囊泡可能来自受实验者的任何细胞类型、组织或体液，且包括用于组织学目的的组织切片例如活检和尸检样本、冰冻切片，血液，头发，粘液，血浆，唾液，血清，皮肤，痰，大便，和眼泪。细胞类型和组织还包括腹水，脑脊液，妇科液，肺组织或细胞，淋巴液，腹腔液，尿液，阴道清洗收集液，或阴道冲洗收集液。组织或细胞类型可以通过从受实验者取出细胞样本提供，但也可以通过使用以前分离的细胞，例如在其他时间、其他人和/或出于其他目地分离的细胞。档案组织，例如有治疗或结果史的档案组织也可以使用。

成像

含AIE发光团的细胞或脂质囊泡可用于成像分析。成像分析可能涉及成像显微镜系统，特别是荧光显微镜、共聚焦显微镜和/或双光子显微镜的使用。

量化

可以通过基于sFCS(荧光相关光谱扫描)的比率分析或计算量化细胞或脂质囊泡中的心磷脂。对于比率分析，可提供校准曲线。该曲线可以基于FB/FG和目标脂质，其中F值是通过对应不同的带通滤波器通道，对含FLBP(荧光脂质结合蛋白)且具有已知浓度的目标脂质(且可任选含有一种或多种其它脂质)的成像脂质囊泡或细胞进行光子计数而确定的。校准曲线接着可以用于确定目标脂质的浓度。

对于细胞和/或细胞膜测量，F_B的最小值可取自胞液，F_B的最大值可在施加过量目标脂质到细胞之后评定。接着可使用上述的校准曲线从观察的F_B/F_G值确定细胞心磷脂浓度。

紊乱

可以使用量化心磷脂和分离线粒体的方法来诊断紊乱和/或癌症。量化的心磷脂或分离线粒体与参考标准的比较值可以指示是否脂质代谢酶正常工作。该参考标准可以是来自具有或不具有紊乱的单独个体的可比样本中出现的量值。

该紊乱可包括心磷脂损耗，和与线粒体呼吸功能相关、与心磷脂异常增生和与心磷脂异常相关的疾病。特别地，该紊乱可包括衰老、Barth综合征、心脏缺血、再灌注、脑胶质瘤、心肌肥厚、心脏衰竭、丹吉尔症、帕金森病、HIV-1和各种癌症。

试剂盒 / 检验

本发明提供了一种检验方法，包括在当AIE发光团曝露于测试样本中的蛋白时，检测和/或测量AIE发光团结合的步骤。该检验可包括识别和/或分离结合到所述AIE发光团的所述蛋白的步骤。所述AIE发光团可用于从包含多种蛋白的测试样本中检测/测量/识别和/或分离多于一种心磷脂结合蛋白。多于一种AIE发光团可用于检测/测量/识别和/或分离多于一种心磷脂结合蛋白，所述测试样本可以是组织或组织培养提取物，优选裂解提取物。该测试样本可通过在包含至少一种非离子表面活性剂(例如1RITON(RTM)X-100或NP-40)的缓冲液中的裂解细胞获得。所述AIE发光团可在存在或不存在可溶性心磷脂的情况下曝露于所述测试样本。可比较多于一个测试样本间的蛋白质探针结合以确定所述样本之间的心磷脂结合蛋白变化。

本发明的检验中可使用清洁剂以减少AIE发光团的非特异性结合。在此，AIE发光团包括共价连接到微珠或其它微粒的心磷脂衍生物，可使用清洁剂增加所述微珠/微粒的可溶性。

此外，结合到闪烁剂的AIE发光团可用于识别与心磷脂反应的心磷脂结合蛋白的拮抗剂和兴奋剂。该用途特别适合候选的拮抗剂/兴奋剂的高通量筛选，特别是单步高通量筛选。测试已知与心磷脂结合的放射标记蛋白(例如氚标记的亮氨酸或35S-蛋氨酸)与本发明的探针的结合，本发明的探针在一个或多个候选拮抗剂和/或兴奋剂存在或缺失的情况下与闪烁剂结合。使用结合到闪烁剂的AIE发光团的优点在于，心磷脂结合蛋白与AIE发光团的正常结合(即，在没有任何候选拮抗剂或兴奋剂的对照样本中)、降低结合或增强结合(即，在具有兴奋剂或拮抗剂的样本中)之间的差异比没有闪烁剂时要大得多。因此，采用兴奋剂和拮抗剂更易识别。

从组织提取物中识别心磷脂结合蛋白的常用方法如下。使用标准方法均质组织，产生两种成分，胞液和细胞膜。该胞液成分按照1：1比例混合缓冲液A(50mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,10mM EDTA,1％NP-40,蛋白抑制剂)，接着采用本发明的探针在缓冲液B中(50mM Tris-HCl pH 7.5,150mM NaCl,5mM EDTA,0.1％Tween-20,0.02％叠氮化钠)均衡培育30分钟。该细胞膜成分按照1:3比例与含2％NP-40的缓冲液A在冰上混合30分钟。接着以100,000 Xg旋转1小时以产生可溶性膜提取物。该提取物与如上所述均衡和处理的心磷脂微珠(即本发明的探针，其在固相是微珠)混合。该样本在4C放入旋转器2小时，然后冷却后采用缓冲液B洗涤三次。这些清洗是非常重要的，因为它们将移除非特异结合蛋白。接下来的修饰提供了格外的特异性水平：在引入微珠之前，在多个样本中的一个样本中加入过量的可溶性心磷脂(该可溶性心磷脂溶液是通过干燥氯仿中溶解的C:12或C:8心磷脂，然后在缓冲液A中悬浮，且超声处理5分钟从而获得250mM原液制成的)。假设过量的可溶性心磷脂将与心磷脂在微珠上竞争，这样将导致回转结合到微珠的蛋白量减少。从凝胶中切取感兴趣的带，用胰蛋白酶处理。通过质谱分析从各个带产生的胰蛋白酶消化物。

本发明的AIE发光团可用作来自不同组织和体液的心磷脂结合蛋白的通用分析工具。可对任何细胞类型的胞液和细胞膜成分采用本发明的AIE发光团筛选心磷脂结合蛋白。在所有情况下，胞浆或膜成分可以进行如上所述检验。

本发明的主旨包括多个方面，下列非限制性实施例中对这多个方面进行了描述。

在一个实施例中，本发明描述了使用正电荷AIE发光团在样本中检测和量化心磷脂的一步法，包括将AIE发光团引入含所述样本的溶液中，以及测量所述溶液的荧光强度。

在另一个实施例中，本发明描述了采用正电荷AIE发光团量化分离线粒体的方法，包括：采用AIE发光团染色含分离线粒体的样本，以及测量荧光强度。

在另一个实施例中，本发明描述了采用正电荷AIE发光团量化分离线粒体的方法，包括：在包含分离线粒体的样本中引入所述AIE发光团，其中所述AIE发光团染色所述分离线粒体；以及在显微镜下识别染色的所述分离线粒体。特别地，优选在光学显微镜下，更优选在荧光显微镜下，识别染色的所述分离线粒体。

在一个实施例中，可以在任何上述方法中使用的所述AIE发光团具有选自下列组的化学式的主链结构：

其中每个R、R’、R”和R’”可分别选自：

化合物 1-4

因为AIE发光团对心磷脂的特异性探测基于探针和目标被分析物之间的静电反应，因此建议使用正电荷AIE发光团。研究的用于心磷脂检测的AIE发光团包括如下化合物1-4：

图11-15示出了化合物1-4的发光光谱。

TTAPE-Me

I心磷脂量化

在实施例，受到cyt c和心磷脂的特异性反应启发，设计和合成正电荷AIE荧光团用于心磷脂检测。该正电荷AIE荧光团设计成1,1,2,2-四[4-(2-三甲基氨根乙氧基)苯基]四溴化乙烯(TTAPE-Me)，且具有以下结构：

AIE荧光团TTAPE-Me按照如下方式合成：

基于AIE机制，TTAPE-Me染料需要在结合到含心磷脂的膜时才能激发荧光，这可以实现心磷脂的检测和量化。在其季铵基团的帮助下，TTAPE-Me是完全可溶的，因此按照AIE荧光团的一般性质，水溶液中没有荧光。如图1所示，TTAPE-Me在出现含心磷脂的囊泡时发射荧光。

TTAPE-Me的荧光随着含心磷脂的囊泡的总脂质浓度的增加而显着增加，而对于无心磷脂囊泡，TTAPE-Me的荧光发射非常弱(图3A)。TTAPE-Me在480nm的荧光增强(I/I₀-1)在心磷脂浓度为0-10μM时成线性关系，该浓度范围位于线粒体膜的心磷脂的生理范围内。心磷脂的线性检测也可以采用TOCL(2-50％TOCL)在囊泡中的含量变化获得(图4A-4B)。该研究结果表明，在CL的检测和量化中，允许灵活的TTAPE-Me和心磷脂的比例。相反地，传统的NAO在量化测量中，要求NAO/心磷脂严格遵守2:1的比例。此外，心磷脂的检测可以在将囊泡与探针混合之后就非常迅速地完成而不需要任何其它处理。

TTAPE-Me是具有四苯基乙烯(TPE)疏水核心和四季铵亲水基团的双性分子。如图5A所示，离子化强度影响TTAPE-Me的荧光强度。随着氯化钠浓度的增加，染料的荧光减弱，这证实了TTAPE-Me通过静电引力结合心磷脂。Na⁺离子与染料结合分子竞争。一旦染料在溶液中释放，分子内的运动不再受到限制，因此将停止发射荧光。

1,2-二油锡-甘油-4-磷酸胆碱(DOPC)是真核细胞膜中最丰富的磷脂，并具有以下结构：

然而，疏水性相互作用是不太可能涉及到的。虽然心磷脂均具有长烷基链，但是TTAPE-Me仅结合到心磷脂。

BSPOTPE是具有两个负电荷的水溶性AIE发光团，其具有如下结构：

BSPOTPE用作对照，因为其并没有对含CL囊泡显示出显著的荧光增强(图6)。

根据AIE原则，TTAPE-Me仅在结合时发射荧光，因此，该荧光可以报告TTAPE-Me与含心磷脂囊泡的结合。接着可记录TTAPE-Me与含心磷脂的LUV的发光强度变化率且与工作曲线关联(图5B)。该曲线在～0.67具有峰值，对应TOCL与TTAPE-Me的2：1的结合率。该结合率非常精确地匹配电荷比，从而为TTAPE-Me与心磷脂的结合主要受到静电作用提供了非常好的支持。可采用等温滴定量热法(ITC)来确定亲和力，这将指明TTAPE-Me与心磷脂的相互作用是放热过程(图5C)。该结合曲线通过对每个进样峰的面积进行积分并随后减去染料分子的稀释热而生成(图5D)。曲线拟合得到2.08×10^-6M的解离常数。

为了进一步评价TTAPE-Me对心磷脂的特异性，同样检验了TTAPE-Me对线粒体膜上出现的其他主要脂质的响应。评价的其他主要脂质是1,2二棕榈锡-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DPPE)：

L-α-磷脂酰肌醇(soy PI):

1,2-二油锡-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)：

和

N-己酰基-D-鞘磷脂(SM)：

制造六种不同的LUV，这六种不同的LUV包含超过线粒体膜含量的上述脂质和TOCL、DOPC，余量为DOPC填充的各种类型的LUV。

如图7A所示，对于TOCL囊泡，TTAPE-Me选择性发射荧光。而对于具有生理浓度的脂质组分的其他囊泡，TTAPE-Me不会产生任何的荧光变化。虽然DOPS和PI带负电荷，其每个分子可携带一个电荷，且分别仅共享1％到2％的总线粒体膜脂质(对于心磷脂～20％)。因此，少量的DOPS和大豆PI不会影响TTAPE-Me用于心磷脂检测的选择性和灵敏性。

另一方面，本领域技术人员可能认为负电荷线粒体DNA(mtDNA)干扰TTAPE-Me的心磷脂检测。然而，在对照实验中，在质粒出现时，没有观察到TTAPE-Me的荧光增强。图8显示了质粒，环状双链mtDNA模型，在很宽的浓度范围内，这意味着mtDNA的出现不会使CL量化变得复杂。

同时，为了模拟线粒体膜，制备含心磷脂或无心磷脂的全组分LUV。该含心磷脂或无心磷脂的全组分LUV由上述脂质按照其生理学比例混合的混合物组成(图9A-9B)。对于无心磷脂的全组分LUV，TTAPE-Me的发光光谱与缓冲液中的自由染料的光谱相同(图7C)。对于含心磷脂的全组分LUV，蓝绿荧光增强3倍以上(图7C&E)。采用NAO作为探针进行平行实验。NAO是关闭式传感器，其荧光在心磷脂存在时减少(图7D)。然而，心磷脂不是诱导NAO信号降低的唯一脂质，其他脂质，例如DPPE，PI或DOPS都可以诱导NAO信号降低较大程度(图7B)。除了选择性差以外，NAO的灵敏度远低于TTAPE-Me(图7E)。

II线粒体量化

除了心磷脂检测外，还验证了TTAPE-Me在线粒体量化中的使用。采用双缩脲法从酿酒酵母菌株YPH 500中分离和校准单个线粒体。如图10A所示，随着线粒体数量的增加，TTAPE-Me的荧光发射逐渐增加。在TTAPE-Me的荧光强度和线粒体浓度之间建立线性关系。采用TTAPE-Me染色的分离线粒体在荧光显微镜下可清楚可见(图10B-10C)，其结果表明，采用TTAPE-Me可以简单轻松地以高灵敏度和低背景噪声的方式完成线粒体的量化。相比之下，使用NAO量化分离线粒体费时且程序复杂。分离线粒体需要用甲醛固定，然后经过多次漂洗、离心分离和再悬浮的步骤。此外，利用NAO的信噪比要小得多，这可能是因为NAO在溶液中具备很强的背景噪声。

总之，已经研发出水溶性的AIE荧光团TTAPE-Me用于心磷脂(位于线粒体内膜的独特的磷脂)的检测和量化。TTAPE-Me荧光通过含心磷脂的囊泡选择性开启，且其强度与心磷脂的浓度或片段成比例。作为荧光开启传感器，TTAPE-Me可以用于分离线粒体的定量分析和可视化。与作为目前唯一市售的心磷脂检测染料的NAO相比，TTAPE-Me提供更高的灵敏度和选择性，以及定义良好的工作机制，而不会涉及任何困难或者不清楚的实验步骤。由于具有这些优点，在临床诊断和线粒体相关研究的一系列应用中，TTAPE-Me是用于心磷脂的特异性检测和量化的NAO的良好的替代品。

示例

TTAPE-Me 的心磷脂检测确定

为了确定TTAPE-Me能够特异性地检测心磷脂，制备直径为100-200nm的两种类型的大单层囊泡(LUV)(图2A和2B)。采用在真核细胞膜上含量最丰富的纯1,2-二油锡-甘油-4-磷酸胆碱(DOPC)制备无心磷脂的囊泡。采用1,1’,2,2’-四油酰双磷脂酰甘油脂(TOCL)和DOPC的混合物制备含心磷脂的囊泡，其中两性离子的DOPC用于固定囊泡。如图1中所示，在含心磷脂的囊泡出现时，TTAPE-Me的荧光发射开启。

TTAPE-Me 的一般合成

4,4'-二(8-溴乙氧基)二苯甲酮(B)的合成。将1,8-二溴乙烷(3.8g,14.0mmol)添加到4,4’-二羟基二苯甲酮(1.0g,4.7mmol)和碳酸钾(1.3g,9.3mmol)的丙酮(50ml)混合物中。将混合物回流搅拌12h。在过滤和溶剂蒸发后，将粗产物采用氯仿作为洗脱剂在硅胶柱洗脱纯化。获得白色粉末产物B,产率为66％(3.10g)。R_f＝0.5(氯仿)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):7.78(d,4H),6.94(d,4H),4.05(t,4H),3.42(t,4H),1.89-1.80(m,8H),1.48-1.39(m,16H)。¹³C NMR(100MHz,CDCl₃),δ(ppm):193.9,161.8,131.6,129.9,113.3,67.5,33.3,32.1,28.5,28.4,28.0,27.4,25.3。

1,1,2,2-四[4-(8-溴乙氧基)苯基]乙烯(C)的合成。在B(1.0g,1.7mmol)的50ml THF悬浮液中加入TiCl4(0.19mL,1.7mmol)和锌粉(0.22g,3.4mmol)。回流20小时，反应混合物冷却至室温，过滤。在真空中蒸发溶剂，然后将粗产品用氯仿/正己烷(1:1v/v)作为洗脱剂在硅胶柱洗脱纯化。获得黄色粘稠液体产物C，产率为62％(0.6克)。R_f＝0.5(氯仿/正己烷＝1:1)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃),δ(ppm):6.99–6.90(m,8H),6.63-6.60(m,8H),3.87-3.80(m,8H),3.41-3.39(m,8H),1.86-1.70(m,16H),1.34-1.26(m,32H)。¹³C NMR (100MHz,CDCl₃),δ(ppm):157.9,137.5,133.2,129.9,114.2,68.3,55.6,34.7,33.4,29.9,29.3,28.7,26.6。

1,1,2,2-四[4-(2-三甲基氨根乙氧基)苯基]四溴化乙烯(TTAPE-Me)的合成。采用过量的三甲胺季铵化C生成TTAPE-Me。获得浅黄色粉末产物，产率为85％。¹H NMR(400MHz,D₂O),δ(ppm):7.09(d,8H),6.83(d,8H),4.46(t,8H),3.80(t,8H),3.25(s,36H)。¹³CNMR(100MHz,D₂O),δ(ppm):155.4,139.2,137.4,132.3,113.7,64.8,61.6,53.7.MS(TOF),m/e 855.6561([M–2Br–3CH₃]⁺,计算值855.6725)。

基于在此包含的信息，对于本领域技术人员来说，在不偏离下述权利要求的精神和范围的情况下，对本发明的精确描述做出各种改变是显而易见的。本发明的主题不限于在此定义的步骤、性质或组分，因为这些优选的实施例以及其他描述是用于示例本发明的各个特定方面。实际上，对于化学、生物化学或相关领域的技术人员来说，可以对本发明所描述的示例做出各种修改，这些修改都落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种采用正电荷AIE发光团检测和量化样本中的心磷脂的一步法，包括：

在包含所述样本的溶液中引入所述AIE发光团，以及

测量所述溶液的荧光强度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIE发光团具有选自下列组的化学式的主链结构：

其中每个R、R’、R”和R’”分别选自：

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述AIE发光团包括具有下列通式的主链结构：

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIE发光团包括具有下列通式的主链结构：

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIE发光团通过静电作用仅结合负电荷心磷脂。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述量化的心磷脂是包含在大单层囊泡中的心磷脂的形式。

7.一种采用正电荷AIE发光团量化分离线粒体的方法，包括：

采用AIE发光团染色含分离线粒体的样本；以及

测量荧光强度。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述AIE发光团具有选自下列组的化学式的主链结构：

其中每个R、R’、R”和R’”分别选自

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述AIE发光团包括具有下列通式的主链结构：

10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述AIE发光团包括具有下列通式的主链结构：

11.根据权利要求7所述的方法，其中，所述量化的分离线粒体来自酿酒酵母菌株YPH 500。

12.一种采用正电荷AIE发光团量化分离线粒体的方法，包括：

在包含分离线粒体的样本中引入所述AIE发光团，其中所述AIE发光团染色所述分离线粒体；以及

在显微镜下识别染色的所述分离线粒体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述AIE发光团具有选自下列组的化学式的主链结构：

其中每个R、R’、R”和R’”分别选自

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述AIE发光团包括具有下列通式的主链结构：

15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述AIE发光团包括具有下列通式的主链结构：

16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述量化的分离线粒体来自酿酒酵母菌株YPH 500。