CN101563095A - 用于防止和修复dna损伤的水溶性菠菜提取物 - Google Patents

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CN101563095A CNA2007800458450A CN200780045845A CN101563095A CN 101563095 A CN101563095 A CN 101563095A CN A2007800458450 A CNA2007800458450 A CN A2007800458450A CN 200780045845 A CN200780045845 A CN 200780045845A CN 101563095 A CN101563095 A CN 101563095A
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S·R·米斯勒
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T·拉
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Abstract

公开了包含水溶性菠菜提取物的组合物，包含水溶性菠菜提取物、脂质体、心磷脂和至少一种抗氧化剂的组合物，包含水溶性菠菜提取物、拟南芥提取物或芥菜(芸苔属)植物提取物、脂质体、心磷脂和至少一种抗氧化剂的组合物，用于获得此类组合物的方法，利用此类组合物来修复核DNA、线粒体DNA或这两者的方法，防止或减少例如活性氧类或8－羟基脱氧鸟苷对DNA的损伤的方法，和/或修复或防止线粒体损伤和膜流动性丧失的方法。可局部给予、口服给予或胃肠外给予，例如注射给予本发明组合物。局部给药时，本发明组合物可包含添加剂，例如渗透增强剂、香料、防腐剂、保湿剂和化妆品佐剂。

Description

用于防止和修复DNA损伤的水溶性菠菜提取物
本申请是2006年12月11日提交的序列号为11/636,889的美国专利申请的部分继续申请并要求其优先权，该美国专利申请的全部内容通过参考纳入本文。
背景
线粒体是细胞内产生能量的位点。由于氧化呼吸的副产物——活性氧类(reactive oxygen species)(ROS)的存在，它们也是具有大量自由基活性的位点。细胞和线粒体中的自由基活性均会造成细胞和/或线粒体损伤，导致能量产物丧失、DNA机能障碍或破坏性酶途径的上调。结果是衰老加速并丧失重要的细胞机能。
ROS-介导的DNA损伤的最重要标志物之一是8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)。具体而言，氧化剂可将鸟嘌呤转化为8-OHdG，通过使鸟嘌呤可与腺嘌呤而不是与胞嘧啶配对，在DNA中引入突变。因此，当DNA复制时，序列中的鸟嘌呤-胞嘧啶配对被腺嘌呤-胸腺嘧啶配对代替。因此，已知8-OHdG可引起碱基错配、随机点突变和核酸删除。
由于DNA编码重要的细胞肽，未被检查出来的DNA损伤可在细胞内积累并最终导致细胞机能失常或死亡。幸运的是，细胞和线粒体有修复机制来对付例如8-OHdG和活性氧类引起的DNA损伤。然而，这些修复机制尤其是线粒体本身中的修复机制不是完美的。已有报道称即使有正常的修复机制，与核DNA损伤相比，线粒体DNA(″mtDNA″)损伤仍然约大10倍。由于认识到个体一生中线粒体序列中差错的积累加剧了衰老的某些方面以及以线粒体DNA突变形式遗传下来的某些疾病，近年来线粒体中DNA的修复机制引起了人们的广泛关注。
当前主要有两种方法来解决DNA对细胞造成损伤这一问题。第一种方法是在破坏性分子损伤DNA或其他亚细胞之前增加抗氧化剂水平以除掉破坏性分子。第二种方法是直接加入负责切除和修复受损DNA链的DNA修复酶家族或使该家族表达上调。此类处理的一些例子是：得自LaboratoriesSerobiologiques的LS DNage和得自AGI Dermatics的修复酶。据报道，来自Laboratories Serobiologiques的LS DNage可上调gadd-45(生长停滞和DNA损伤)的形成。Gadd-45是一种多功能蛋白，已证明能够调节某些DNA修复酶的活性和可及性(accessibility)。AGI Dermatics提供3种修复酶。第一种修复酶是负责切除胸腺嘧啶二聚体的内切酶。第二种是能够直接使胸腺嘧啶二聚体的形成发生逆转的光活性酶。第三种是分离自拟南芥(Arabidopsisthaliana)的ogg-1(8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶)，该酶负责8-OHdG的剪切修复。虽然这些方法一定程度上能够有效地修复特定类型的DNA修复，但它们都是不完整的。具体说，这些解决方案或者使细胞变得氧化应激然后对损伤进行修复，或者它们试图防止氧化应激，但是一旦损害发生则不能进行修复。
简述
一个实例中，本发明是包含水溶性菠菜提取物的组合物，其中所述水溶性菠菜提取物防止或减少核DNA、线粒体DNA或这两者的氧化损伤；修复核DNA、线粒体DNA或这两者的损伤；和/或促进或增加ATP的产生或合成。
另一个实例中，本发明是防止或减少核DNA、线粒体DNA或这两者的氧化损伤的方法，包括给予包含水溶性菠菜提取物的组合物，其中所述水溶性菠菜提取物防止或减少核DNA、线粒体DNA或这两者的氧化损伤。
另一个实例中，本发明是修复核DNA、线粒体DNA或这两者的氧化损伤的方法，包括给予包含水溶性菠菜提取物的组合物，其中所述水溶性菠菜提取物修复核DNA、线粒体DNA或这两者的氧化损伤。
另一个实例中，本发明是增加细胞中的ATP生产或合成的方法，包括给予包含水溶性菠菜提取物的组合物，其中所述水溶性菠菜提取物增加细胞中的ATP生产或合成。
另一个实例中，本发明是包含水溶性菠菜提取物的组合物，其中所通过对菠菜的微量过滤(microfiltration)获得述水溶性菠菜提取物。
另一个实例中，本发明是包含水溶性菠菜提取物的组合物，其中通过以下方法获得所述水溶性菠菜提取物：将新鲜的、冷冻的、脱水的、或干燥的菠菜和水碾磨，以形成浆液(slurry)，将浆液的固体成分与液体成分分离，收集浆液的液体成分，将浆液的液体成分置于蒸气锅中，向蒸气锅中加入活性炭，使用蒸汽以及可能的话使用搅拌器在蒸气锅中将浆液的液体成分与活性炭混合，将液体成分从活性炭中分离并进行微量过滤(例如纳米过滤)，以获得水溶性菠菜提取物，其中所述水溶性菠菜提取物防止或减少核DNA、线粒体DNA或这两者的氧化损伤，修复核DNA、线粒体DNA或这两者的损伤，和/或促进或增加ATP的产生或合成。
另一个实例中，本发明是用上一段所述的方法步骤获得的包含水溶性菠菜提取物的组合物，其中所述方法还包括巴氏杀菌步骤和/或加入载体(例如丁二醇(1，3-丁二醇(1，3-Butanediol)；1，3-丁二醇(1，3-Butylene glycol)))和/或防腐剂的步骤。可在本发明组合物中使用的一些防腐剂的例子包括2-苯氧乙醇，例如Phenonip
Figure A20078004584500071
(Clariant Corp.Charlotte，N.C.)；和氯苯甘醚，例如Germazide
Figure A20078004584500072
M(Engelhard Corp.，Iselin，N.J.)。
另一个实例中，本发明是包含水溶性菠菜提取物、脂质体、心磷脂和至少一种抗氧化剂的组合物，其中心磷脂包埋在脂质体的磷脂双层中，另外其中所述至少一种抗氧化剂与心磷脂一起包埋在脂质体的磷脂双层中和/或含于脂质体的水性中心内。一个实例中，所述心磷脂可以是四油酰心磷脂(tetraoleoyl-cardiolipin)、四棕榈油酰心磷脂(tetrapalmitoleoyl-cardiolipin)、四肉豆蔻酰心磷脂(tetramyristoyl-cardiolipin)或源自种子油的心磷脂；所述脂质体可主要由磷脂酰胆碱构成；所述和心磷脂一起包埋在磷脂双层中的至少一种抗氧化剂可以是甲基龙胆酸酯(或龙胆酸甲酯或二羟基苯甲酸甲酯(methyldehydroxybenzoate))；含于脂质体的水性中心内的至少一种抗氧化剂可以是l-肌肽。
另一个实例中，本发明是改善、维持或恢复线粒体功能以及修复DNA氧化损伤的方法，包括给予包含水溶性菠菜提取物、脂质体、心磷脂和至少一种抗氧化剂的组合物，其中心磷脂包埋在脂质体的磷脂双层中，所述至少一种抗氧化剂包埋在脂质体的磷脂双层中和/或含于脂质体的水性中心内。另一个实例中，所述心磷脂可以是四油酰心磷脂、四棕榈油酰心磷脂、四肉豆蔻酰心磷脂或源自种子油的心磷脂；所述脂质体可主要由磷脂酰胆碱构成；所述和心磷脂一起包埋在磷脂双层中的至少一种抗氧化剂可以是甲基龙胆酸酯(或龙胆酸甲酯或二羟基苯甲酸甲酯)；所述含于脂质体的水性中心内的至少一种抗氧化剂可以是l-肌肽。
另一个实例中，本发明是包含水溶性菠菜提取物、拟南芥提取物(例如8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(一种DNA修复酶，靶向于8-OHdG的切除修复))、脂质体、心磷脂和至少一种抗氧化剂的组合物，其中心磷脂包埋在脂质体的磷脂双层中，另外其中所述至少一种抗氧化剂或与心磷脂一起包埋在脂质体的磷脂双层中和/或含于脂质体的水性中心内。一个实例中，所述心磷脂可以是四油酰心磷脂、四棕榈油酰心磷脂、四肉豆蔻酰心磷脂或源自种子油的心磷脂；所述脂质体可主要由磷脂酰胆碱构成；所述与心磷脂一起包埋在磷脂双层中的至少一种抗氧化剂可以是甲基龙胆酸酯(或龙胆酸甲酯或二羟基苯甲酸甲酯)；含于脂质体水性中心内的至少一种抗氧化剂可以是l-肌肽。本发明另一个实例是使用本段所述的组合物，例如来改善、维持或恢复线粒体功能和/或修复细胞和/或线粒体DNA的氧化损伤的方法。
另一个实例中，本发明是包含水溶性菠菜提取物、芥菜(芸苔属)植物提取物、脂质体、心磷脂和至少一种抗氧化剂的组合物，其中心磷脂包埋在脂质体的磷脂双层中，另外其中所述至少一种抗氧化剂与心磷脂一起包埋在脂质体的磷脂双层中和/或含于脂质体的水性中心内。一个实例中，所述心磷脂可以是四油酰心磷脂、四棕榈油酰心磷脂、四肉豆蔻酰心磷脂或源自种子油的心磷脂；所述脂质体可主要由磷脂酰胆碱构成；所述与心磷脂一起包埋在磷脂双层中的至少一种抗氧化剂可以是甲基龙胆酸酯(或龙胆酸甲酯或二羟基苯甲酸甲酯)；含于脂质体水性中心内的至少一种抗氧化剂可以是l-肌肽。本发明另一个实例是使用本段所述的组合物，例如来改善、维持或恢复线粒体功能和/或修复细胞和/或线粒体DNA的氧化损伤的方法。
附图简述
图1示出可用于获得本发明组合物中所用的水溶性提取物的方法的流程图。
图2是示出可用于获得水溶性提取物的方法的变化形式(以冷冻的菠菜为原料)的流程图。
图3是示出可用于获得水溶性提取物的方法的另一种变化形式(以脱水菠菜为原料)的流程图。
图4是示出使用脱水菠菜的水溶性提取物所获得的ATP产生的图，其中水溶性提取物包含约50％菠菜提取物、约49％丁二醇和约1％防腐剂(例如Phenonip
Figure A20078004584500081
或Germazide
Figure A20078004584500082
M)。结果显示，相比于未处理的对照细胞，脱水菠菜的水溶性提取物诱导细胞内ATP水平发生剂量依赖性增加。图4中，数据表示为与未处理对照细胞中的ATP水平比较得到的％对照ATP。因此，认为ATP的增加代表测试样本的积极效果(positive effect)。
图5是示出使用各种水溶性菠菜提取物获得的ATP产生的柱形图。结果显示，相比于未处理的对照细胞，水溶性菠菜提取物诱导细胞ATP水平发生剂量依赖性增加。图5中，数据表示为与未处理对照细胞中的ATP水平比较而得到的％对照ATP。因此，认为ATP的增加代表测试样本的积极效果。
详述
应理解，本发明不限于本文描述的具体组合物、方法学或方案规程。此外，除非另有定义，本文使用的所有科技术语与本发明所属领域的普通技术人员常规理解的含义相同。还应理解，本文所用术语只是出于描述具体实例的目的，并非用于限制本发明范围，本发明范围仅由权利要求限定。
通过保护细胞免受氧化应激以及修复氧化损伤的DNA(例如被8-OHdG损伤的DNA)，本发明提供更全面的方法来保护细胞功能，从而克服了现有技术在解决核和/或线粒体DNA修复方面了缺点。具体而言，本发明寻求通过增强细胞对氧化应激的抗性以及修复DNA的氧化损伤，防止核DNA和线粒体DNA受损伤，因此改善细胞功能，尤其是线粒体功能。更具体说，本发明是包含独特的水溶性菠菜提取物的组合物，其中所述水溶性菠菜提取物有助于修复氧化性DNA损伤，尤其是8-OHdG造成的损伤。一个实例中，本发明是复合体(complex)，其靶向线粒体(线粒体复合物)和/或设计用于强化细胞膜和细胞结构(即，细胞强化)。这种复合体可包含水溶性菠菜提取物、芥菜(芸苔属)种子提取物或拟南芥提取物，例如Roxisome(AGI Dermatics，Inc.，Freeport，NY)或8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(一种DNA修复酶，靶向于8-OHdG的切除修复)，以及主要由磷脂酰胆碱构成的脂质体，脂质体的磷脂双层中包埋有心磷脂和二氢苯甲酸甲酯(龙胆酸甲酯)，脂质体的水性中心内包埋有l-肌肽。
“水溶性提取物”是可溶于或能够溶解于水中的任何菠菜提取物，不管与获得该提取物的所用的方法无关。因此，可通过蒸汽蒸馏法、纳米过滤法、冷水提取法、热水提取法、用有机溶剂提取等方法来获得菠菜的水溶性提取物。本领域普通技术人员应理解，还有很多其他方法或提取工艺可用来获得水溶性提取物，这些方法或工艺都在本发明范围内。
一般认为菠菜(Spinacia oleracea)是最重要的抗氧化蔬菜之一。据估计，每1千克新鲜切割的菠菜叶含有约1000mg总类黄酮。菠菜中还存在很多不同的类黄酮，包括例如藤菊黄素(3，5，7，3′，4′-五羟基-6-甲氧基黄酮)、菠叶素、黄酮醇糖苷、葡糖苷酸、6-氧化黄酮醇的甲基化衍生物和亚甲基二氧化物衍生物的酰化二糖苷和三糖苷(acylated di-and triglycosides of methylated and methylenedioxide derivatives of 6-oxygenated flavonols)。除这些类黄酮之外，菠菜中还发现了一种强效的、水溶性、天然抗氧化混合物，称为″NAO″。NAO特异性地抑制脂肪氧合酶，已将NAO的抗氧化活性与其他已知抗氧化剂进行了比较，发现其在体外和体内均优于绿茶、N-乙酰半胱氨酸、丁羟甲苯和维生素E。Lomnitski等，″Composition，Efficacy，and Safety of Spinach Extracts.″Nutrition and Cancer，2003；46(2)：222-231。
菠菜的抗氧化特性非常重要，因为细胞和DNA的氧化损伤随年龄而增加，并且这种氧化损伤被认为是促进衰老过程和包括癌症在内的几种疾病的重要因素。DNA的氧化损伤可由激发的氧类物质造成的，这种氧类物质由辐射产生或者是有氧代谢的副产物。氧化的碱基8-OHdG是大约20种已知辐射损伤产物之一，虽然在线粒体DNA和核DNA这两种类型的DNA中均发现了8-OHdG，但线粒体DNA中比核DNA中的8-OHdG更多。Richter等，″Normal oxidativedamage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1988；85：6465-6467。线粒体DNA中高水平的8-OHdG可能是由线粒体中发生的大量氧代谢和相对低效率的线粒体DNA修复造成的，而这种高水平的8-OHdG可能导致了线粒体DNA中较高的突变率。因此，需要一种能够防止8-OHdG引起的突变的组合物和/或修复DNA(例如8-OHdG损伤的线粒体DNA)的组合物。
如上所述，氧化剂(例如ROS)可将DNA中的鸟嘌呤残基转化为8-OHdG。DNA中新的8-OHdG残基通过引起碱基配对(具体说是与腺嘌呤而非胞嘧啶配对(正常情况下胞嘧啶与鸟嘌呤配对))修饰而在DNA中引入突变。因此，当DNA复制时，序列中的鸟嘌呤-胞嘧啶配对被腺苷-胸腺嘧啶配对代替。非常重要的是，本发明水溶性菠菜提取物非常独特地能够在发生鸟嘌呤修饰的位点发挥作用。具体说，本发明的水溶性菠菜提取物能够防止鸟嘌呤转化为8-OHdG、减少鸟嘌呤转化为8-OHdG的次数、和/或修复已经转化为8-OHdG的鸟嘌呤残基。这一点非常重要，因为虽然已知菠菜具有抗氧化特性，以前也已显示菠菜能够修复一些类型的DNA损伤，但不知道水溶性菠菜提取物能够用于防止或修复鸟嘌呤残基的损伤和/或8-OHdG引起的损伤。
例如，Doetsch等1988年报道从菠菜中分离出一种新的DNA修复酶。该酶命名为核酸酶SP，其优先在腺嘌呤突变位点发挥作用。Doetsch等，″NucleaseSP：a novel enzyme from spinach that incises damaged duplex DNApreferentially at sites of adenine.″Nucleic Acids Res.1988；16(14)：6935-6952。此外，Oleykowski等已证明，1988年首先由Doetsch描述的核酸酶SP在除鸟嘌呤残基之外的所有DNA错配位点酶切。Oleykowski等，″Incision atnucleotide insertions/deletions and base pair mismatches by the SP nuclease ofspinach.″Biochem.1999；38(7)：2200-5。相反，如实施例4(讨论了对8-OHdG引起的DNA损伤的修复)所示，本发明的水溶性菠菜提取物在发生鸟嘌呤修饰的位点发挥作用。
DNA的完整性对正常的细胞运作非常重要。人线粒体含有5-10个相同的环形DNA分子。每个DNA分子由16,569个碱基对组成，携带37个编码基因，这些基因编码：2种不同的核糖体RNA(rRNA)分子；22种不同的转运RNA(tRNA)分子(每种氨基酸至少1个tRNA分子)；和13种多肽。这13种多肽是线粒体内膜中蛋白复合体的亚基，包括NADH脱氢酶、细胞色素c氧化酶和ATP合酶的亚基。衰老过程中发生的负责这些关键的辅因子和酶的线粒体DNA的损伤和不完全修复可导致严重的能量产生(energy production)损失、削弱细胞产生正常的细胞功能所需的重要蛋白质、脂类和碳水化合物的能力。因此，本领域需要一种可防止DNA(例如线粒体DNA)损伤和/或修复DNA损伤的组合物。
本发明基于这样的惊人发现：菠菜的水溶性级分，也就是水溶性菠菜提取物，既能够保护细胞，尤其是细胞中的DNA(包括核DNA和线粒体DNA)不受氧化压力应激，又能够修复ROS(例如过氧化物自由基)引起的损伤。具体说，如实施例3所述，用流式细胞术检测超氧化物的氧化，证明水溶性菠菜提取物保护DNA(核DNA、线粒体DNA或两者)不受氧化应激。如实施例4所示，证明相同的提取物有助于DNA修复。此外，如实施例2所讨论的，本发明基于这样的惊人发现：水溶性菠菜提取物有效增加ATP产量，这是保护细胞不受正常的电子过程中产生的氧化损伤的直接结果。
可通过例如利用热水和微量过滤步骤的提取方法来获得本发明的水溶性菠菜提取物。微量过滤步骤可使用各种不同的过滤技术，例如纳米过滤或超滤。也可通过蒸汽蒸馏来获得本发明的水溶性菠菜提取物。本领域普通技术人员应理解，可用多种其他方法来获得水溶性菠菜提取物，这些方法都包括在本发明范围内。可用于获得水溶性菠菜提取物的一种示例性提取方法描述于实施例1，并图示于图1中。一般地，该方法包括获得新鲜的、干燥的、脱水的或冷冻的菠菜，将菠菜和水碾磨成浆液。然后将浆液中的液体与固体分离，收集浆液的液体部分。将浆液的液体部分和活性炭一起加入蒸气锅中。打开蒸汽或加入热水，将浆液的液体部分和活性炭与蒸汽(或热水)混合，以使浆液的绿色液体部分脱色，获得无色的液体菠菜提取物。然后分离液体菠菜提取物和活性炭。通过用于进一步提取的微量过滤(例如纳米过滤或超滤(“UF”))，使液体菠菜提取物中的任何渗出物与洗涤水混合。然后，将澄清的液体菠菜提取物在蒸气锅中巴氏灭菌。在澄清的液体菠菜提取物中可加入防腐剂，例如2-苯氧乙醇如Phenonip
Figure A20078004584500121
(Clariant Corp.Charlotte，N.C.)或氯苯甘醚如Germazide
Figure A20078004584500122
M(Engelhard Corp.Iselin，N.J.)；载体，例如丁二醇(1，3-丁二醇；1，3-丁二醇)和/或其他化妆品佐剂、添加剂、赋形剂等。
应理解，上述提取过程的某些方面可变化，但这些变化仍然在本发明范围内。例如，蒸气锅的类型可变化，蒸气锅中的蒸汽温度可变化和/或热水可代替蒸汽使用，使用的防腐剂可变化，用于过滤的筛(screen)或膜可变化，用于制备浆液的水的量可变化，菠菜的来源可变化，菠菜可以是干燥的、脱水的、新鲜的或冷冻的，等等。
本发明包含水溶性菠菜提取物的组合物可以和可接受的载体、添加剂、防腐剂、赋形剂和/或化妆品佐剂一起施用。此外，本发明包含水溶性菠菜提取物的组合物可以和可接受的载体一起外部施用，施用形式是凝胶、洗剂、霜剂、强壮剂(tonic)、乳液、糊剂等。作为另一个实例，本发明包含水溶性菠菜提取物的组合物可以和可接受的载体一起内部施用，施用形式是丸剂、片剂、散剂、条形物(bar)、饮料等。因此，本文所述组合物用于多种最终产品中，包括化妆品、药品、食品和饮料组合物。使用本发明组合物的最终产品可用于修复核DNA、线粒体DNA或这两者的损伤，和/或用于防止核DNA、线粒体DNA或这两者的损伤，例如ROS或8-OHdG造成的损伤。
因此，本发明一个实例中，本发明组合物以下列形式局部施用：溶液、凝胶、洗剂、霜剂、软膏、水包油乳液、油包水乳液、棒形物(stick)、喷剂、糊剂、摩丝(mousse)、强壮剂或其他化妆品领域或局部施用合适的形式。
例如，本发明组合物可以以局部制剂形式施用，并可包含如上所讨论的水溶性菠菜提取物以及脂质体，用于改善、恢复和/或维持线粒体功能。已知脂质体是局部施用化妆品和皮肤病学产品时有效的药物递送系统。具体说，脂质体是一种球形小泡(spherical vesicle)，具有由磷脂双层构成的膜。脂质体的脂质双层可与其他双层(例如细胞膜和/或线粒体膜)融合，因此可递送脂质体的内容物。
脂质体可包含多种磷脂，所述磷脂包括具有混合脂质链的天然来源的磷脂(例如卵磷脂酰乙醇胺)，或由纯成分构成，例如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)。脂质体通常尺寸小，在约25-1000nm范围内。脂质体是一种由磷脂双层构成的封闭结构，能够在磷脂双层的水性核中包裹水溶性、亲水分子，在疏水性区域中包裹油溶性、疏水分子。通常，脂质体可以是中性(neutral)脂质体、阴离子(negative)脂质体或阳离子(positive)脂质体。例如，阳离子脂质体可形成自含有磷脂酰胆碱、胆固醇、心磷脂和磷脂酰丝氨酸的溶液。脂质体可以是多层小泡和单层小泡的混合物。
如上所述，脂质体由磷脂构成。磷脂分子具有亲水性“头部基团(headgroup)”和由两个酰基链构成的疏水性“尾部”。磷脂的水溶性取决于疏水性尾部的长度和头部基团与水的亲和性两者。例如，各酰基链含有14个或更多个直链(未分支)饱和C-C形式碳原子的纯脂质不溶于水。通常，随着脂质的酰基链长度增加，临界胶束浓度迅速降低。
用于本发明组合物中的脂质体可主要由存在于细胞膜中的脂质构成，包括磷脂、神经酰胺、鞘脂、胆固醇、甘油三酯或其他脂质，例如来自植物的植物甾醇。一个实例中，本发明组合物中使用的脂质体可主要由磷脂酰胆碱构成。磷脂酰胆碱是一种磷脂，它是细胞膜的主要组成成分。磷脂酰胆碱也称为1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、PtdCho和卵磷脂。不饱和磷脂酰胆碱含有胆碱、Ω-6不饱和脂肪酸(例如亚油酸)、Ω-3脂肪酸(例如γ-亚麻酸)，甘油酯残基含量低(或没有)。
脂质体研究的进展已使得脂质体能够避免被身体免疫系统(具体而言是网状内皮系统(RES)的细胞)探测到。此类脂质体称为“秘密(stealth)脂质体”，构建有PEG(聚乙二醇)作为涂层。在体内呈惰性的PEG涂层使药物递送系统的循环时间更长。因此，本发明的组合物可包含水溶性菠菜提取物和脂质体，所述脂质体主要由磷脂酰胆碱构成并包埋有心磷脂(例如四油酰-心磷脂)和至少一种抗氧化剂(例如龙胆酸甲酯和/或I-肌肽)，并可另外包含PEG “秘密”涂层。除PEG涂层之外，本发明组合物中使用的秘密脂质体还可连接有配体，使脂质体能够结合到递送的靶位点。
在皮肤护理产品或化妆品中，可将脂质体配制在合适的基质(例如可接受的载体)例如浆液(serum)、洗液、凝胶或霜剂中。更具体地说，用于局部施用的本发明组合物可以是霜剂、洗剂、凝胶、糊剂或其他对于化妆品和局部施用而言合适的形式，并可包含水溶性菠菜提取物、包埋有心磷脂和抗氧化剂的脂质体。一个实例中，用于局部施用的本发明组合物包含水溶性菠菜提取物、主要由磷脂酰胆碱构成并包埋有心磷脂(例如四油酰心磷脂)和至少一种抗氧化剂的脂质体。所述至少一种抗氧化剂可以是l-肌肽、龙胆酸甲酯或二者。包埋在脂质体中的心磷脂也可以是四棕榈油酰心磷脂和四肉豆蔻酰心磷脂中的一种或多种。心磷脂包埋在脂质体的磷脂双层中。所述至少一种抗氧化剂可包埋在脂质体的磷脂双层中、脂质体的水性中心内、或包埋在前述二者内。一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是水溶性抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是脂溶性抗氧化剂。另一个实例中，至少一种抗氧化剂可以是单线态氧清除剂(singlet-oxygen scavenger)。另一个实例中，包含在本发明组合物中的抗氧化剂可以是水溶性单线态氧清除剂或脂溶性单线态氧清除剂。
所述的至少一种抗氧化剂据信使心磷脂稳定，直到心磷脂被递送到细胞中，例如通过局部施用含有脂质体的组合物，所述脂质体含有心磷脂和至少一种抗氧化剂。一个实例中，所述稳定心磷脂的至少一种抗氧化剂是龙胆酸甲酯，它是一种保护心磷脂不被氧化的强抗氧化剂。此外，由于脂质体递送技术的性质，脂质体含有水性内部(water interior)。为防止心磷脂在脂质体中被氧化，可在脂质体中包含第二抗氧化剂，例如l-肌肽，它是一种基于肽的水溶性强抗氧化剂。
通过包含水溶性菠菜提取物和脂质体例如磷脂酰胆碱脂质体(所述脂质体包含心磷脂如四油酰心磷脂和至少一种抗氧化剂)的本发明组合物来实现改善细胞功能，因为此类组合物包含用于修复和恢复核DNA和线粒体DNA的菠菜提取物、用于保护细胞不受氧化损伤的抗氧化剂(例如l-肌肽)以及用于改善、维持或恢复线粒体功能和/或修复线粒体膜的心磷脂(例如四油酰心磷脂)。因此，此类本发明组合物用于改善、维持或恢复线粒体功能和用于修复DNA的氧化损伤。
心磷脂是一种具有不寻常结构，尤其富含不饱和脂肪酸的磷脂。通常，亚油酸占心磷脂中存在的不饱和脂肪酸的至少85％。因此，在一个实例中，将包含约85％亚油酸的心磷脂包埋在脂质体中，例如包埋在脂质体的磷脂双层中。在另一个实例中，将四油酰-心磷脂包埋在脂质体中。四油酰-心磷脂由四个油酸组分构成(C 18∶1，四油酰-心磷脂)，其与亚油酸心磷脂相比更不易受到氧化损伤和破坏。其它实例中，心磷脂可以来自种子油的心磷脂。可使用的心磷脂的其他例子可购自例如Avanti
Figure A20078004584500151
Polar Lipids，Inc.(Alabaster，AL)。可购自Avanti
Figure A20078004584500152
Polar Lipids，Inc.的心磷脂的例子包括如下：1’，1’，2’，2’-四肉豆蔻酰心磷脂(铵盐)(产品号770332)；1’，1’，2’，2’-四内豆蔻酰心磷脂(钠盐)(产品号750332或710335)；1’，1’-油酰-2’，2’-(12-生物素基(氨基十二烷酰))心磷脂(铵盐)(产品号860564)；心磷脂(大肠杆菌，二钠盐)(产品号841199)；心磷脂(心，牛-二钠盐)(产品号770012)；心磷脂(心，牛-二钠盐)(产品号840012)；氢化心磷脂(心，牛-二钠盐)(产品号830057)；双溶性心磷脂(Dilysocardiolipin)(心，牛-二钠盐)(产品号850082)；双溶性心磷脂(心，钠盐)；氢化心磷脂(心)；可溶性心磷脂(lysocardiolipin)；单可溶性心磷脂(Monolysocardiolipin)(心，牛-二钠盐)(产品号850081)；以及单可溶性心磷脂(心，钠盐)。另一个实例中，包埋在脂质体中的心磷脂可以是双磷脂酰甘油或更确切地讲是1，3-双(sn-3′-磷脂酰)-sn-甘油(1，3-bis(sn-3′-phosphatidyl)-sn-glycerol)。
有很多抗氧化剂可并入本发明组合物中。例如，包埋在本发明脂质体中的抗氧化剂可以是水溶性的，从而包埋在脂质体的水性中心中。另一个实例中，包埋在脂质体中的抗氧化剂可以是脂溶性的，因此包埋在脂质体的脂质双层中。另一个实例中，包埋在本发明脂质体中的抗氧化剂是单线态氧清除剂。另一个实例中，抗氧化剂可以是水溶性的并且是单线态氧清除剂，或者是脂溶性的并且是单线态氧清除剂。另一个实例中，可将超过一种抗氧化剂包埋在本发明脂质体中。例如，可将一种或多种以下抗氧化剂包埋在本发明脂质体中：龙胆酸甲酯、l-肌肽、丁羟甲苯(BHT)、叔丁基氢醌(TBHQ)、或它们的一些组合。
一个实施例中，龙胆酸甲酯用作抗氧化剂，因为龙胆酸甲酯是脂溶性的并且能够稳定心磷脂。龙胆酸甲酯具有高的氧自由基吸收能力(″ORAC″)(25,605μmol Teq/g)，表明它是一种很强的抗氧化剂。所以，有可能基于其ORAC值来选择用于本发明的抗氧化剂，例如通过选择ORAC值高的抗氧化剂。另一个实例中，l-肌肽用作本发明的抗氧化剂，因为它是水溶性的并且能够保护心磷脂不受脂质体水性中心引起的氧化损伤。因此，在一个实例中，脂质体的水性中心含有l-肌肽。另一个实例中，脂质体的磷脂双层包埋有心磷脂和龙胆酸甲酯，脂质体的水性中心含有l-肌肽。
另一个实例中，包埋在本发明脂质体中的抗氧化剂可以是在线粒体中发现的抗氧化剂，例如谷胱甘肽。已显示，当人工耗竭细胞中的谷胱甘肽时，氧化损伤增加。线粒体中的谷胱甘肽水平可能甚至比细胞其他部位中的谷胱甘肽水平更重要。相比于细胞其他部位中的谷胱甘肽水平，线粒体谷胱甘肽水平随年龄降低得更多。这种降低似乎使线粒体更易受到氧化损伤。
抗坏血酸(即维生素C)和维生素E(即生育酚)是可包埋在脂质体中的其他抗氧化剂例子，所述脂质体在既含有脂质体又含有水溶性菠菜提取物的本发明组合物中施用。应理解，很多其他抗氧化剂可包埋于在本发明组合物中施用的脂质体中。还应理解，用于本发明的脂质体，即包含心磷脂和至少一种抗氧化剂(例如龙胆酸甲酯、l-肌肽或二者)的脂质体，在约10℃-约60℃，理想为约20℃-约55℃，理想为约30℃-约50℃的温度下存贮时具有稳定和不易受到实质性的氧化损伤的优点。
适于局部施用的本发明组合物可与可接受的载体混合。可接受的载体可起各种作用，例如作为本发明组合物的组分的溶剂、载体、稀释剂或分散剂，允许各组分以合适的浓度均匀施用到皮肤表面。可接受的载体也可有助于本发明组合物渗透到皮肤中。
在一种包含本发明水溶性菠菜提取物的示例性局部施用制剂中，可接受的载体可占总组合物重量的约80％-约100％。另一个实例中，可接受的载体可以占总组合物重量的约85％-约95％。因此，一个实例中，本发明组合物可包含约0.01％-约5％的水溶性菠菜提取物，约0.01％-约5％的含有心磷脂和至少一种抗氧化剂的脂质体，和约90％-约99.99％的载体。另一个实例中，本发明组合物可包含占总组合物重量的约0.01％-约5％的水溶性菠菜提取物，和占总组合物重量的约90％-约99.99％的可接受的载体。另一个实例中，本发明组合物可包含占总组合物重量的约90％-约99.99％的可接受的载体，例如丁二醇，包括任何添加剂和/或赋形剂，例如防腐剂，如2-苯氧乙醇或Phenonip、或氯苯甘醚或GermazideM，所述防腐剂形成总组合物的约0.01重量％-5重量％；和占总组合物重量的约0.01％-约5％的水溶性菠菜提取物。本领域普通技术人员应理解，当本发明组合物包含防腐剂时，所包含的防腐剂类型将决定防腐剂的浓度。例如，Phenonip
Figure A20078004584500163
是可商购的防腐剂，当其掺入的浓度为总组合物的约0.25重量％-约1重量％时，将对化妆品和梳妆用品(toiletries)起防腐作用。另一种可使用的市售防腐剂是Germazide
Figure A20078004584500164
M，美国专利No.6,447,793对其有更充分的描述，Germazide
Figure A20078004584500171
M通常以总组合物的约0.5重量％-约2重量％使用。
在其他实例中，对于用于局部施用本发明组合物的制剂(所述制剂至少包含水溶性菠菜提取物，还可包含包埋有心磷脂和至少一种抗氧化剂的脂质体)，所述可接受的载体占总组合物的约90重量％-约99.99重量％；占总组合物的约97重量％-约99重量％；占总组合物的约91重量％-约98重量％；占总组合物的约92重量％-约97重量％；占总组合物的约93重量％-约96重量％；或占总组合物的约94重量％-约95重量％。不存在其他化妆品佐剂或添加剂时，所述可接受的载体可形成本发明组合物的余量。
用于实施本发明的水溶性菠菜提取物和其他成分可溶于或不溶于所述可接受的载体中。如果组合物的所有成分均可溶于所述可接受的载体中，则该载体充当溶剂。但是，如果组合物中所有或某些成分不溶于可接受的载体，则这些成分通过例如悬浮液、乳液、凝胶、霜剂或糊剂等形式分散在载体中。
因此，本领域技术人员将认识到，可接受的载体的可能的范围非常宽。例如，可接受的载体可以是乳液、洗剂、霜剂或强壮剂。可接受的载体可包括水、乙醇、丁二醇或有助于渗透到皮肤中的其他各种溶剂。一些合适载体的例子描述于美国专利No.6,184,247和美国专利No.6,579,516中，这些专利的全部内容通过参考纳入本文。
一般而言，根据本发明的可接受载体可包括但不限于下述任何例子：水、丁二醇、蓖麻油、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、玉米油、二甲基亚砜、乙二醇、异丙醇、大豆油、丙三醇、可溶性胶原、氧化锌、氧化钛或高岭土。
一方面中，用于实施本发明的可接受载体包括水和乙醇。任选地，可接受载体还包含丁二醇和/或frescolate MGA。例如，可接受的载体可包含占组合物重量的40-60％的水、45-55％的乙醇和5-10％的丁二醇。实施本发明时，可接受的载体与水溶性菠菜提取物混合，所述水溶性菠菜提取物占总组合物重量的约0.01％-约5％；更具体地说，占总组合物重量的约1％-约5％；更具体地说，占总组合物重量的约2％-约4％；更具体地说，占总组合物重量的约3％。
此外，用于本发明的可接受的载体可任选包含一种或多种湿润剂，包括但不限于：邻苯二甲酸二丁酯、可溶性胶原、山梨糖醇或2-吡咯烷酮-5-羧酸钠。可用于实施本发明的湿润剂的其他例子可见于CTFA(化妆品和香料协会(Cosmetic Toiletry and Fragrance Association))《化妆品成分手册》(CosmeticIngredient Handbook)中，该手册的相关部分通过参考纳入本文。
此外，本发明中的可接受载体可任选包含一种或多种润肤剂，包括但不限于：丁烷-1，3-二醇；棕榈酸十六烷酯；二甲基聚硅氧烷；单蓖麻酸甘油酯；单硬脂酸甘油酯；棕榈酸异丁酯；硬脂酸异十六烷酯；棕榈酸异丙酯；硬脂酸异丙酯；硬脂酸丁酯；月桂酸异丙酯；月桂酸己酯；油酸癸酯；肉豆蔻酸异丙酯；乳酸十二烷酯；十八烷基-2-醇(octadecan-2-ol)；三辛酸甘油酯(caprylictriglyceride)；三癸酸甘油酯(capric triglyceride)；聚乙二醇；丙烷-1，2-二醇；三甘醇；芝麻油；椰子油；红花油；月桂酸异戊酯；壬基酚聚氧乙烯(9)醚；泛醇；氢化植物油；乙酸生育酚酯；亚油酸生育酚酯；丙二醇；花生油；蓖麻油；异硬脂酸；棕榈酸；亚油酸异丙酯；乳酸十二烷酯；乳酸十四烷酯；油酸癸酯；肉豆蔻酸十四烷酯。可用于实施本发明的润肤剂的其他例子可见于《CTFA化妆品成分手册》(CTFA Cosmetic Ingredient Handbook)中，该手册相关部分通过参考纳入本文。
此外，本发明中使用的可接受载体可任选包含一种或多种渗透增强剂，包括但不限于：吡咯烷酮，例如2-吡咯烷酮；醇，例如乙醇；烷醇如癸醇；二醇如丙二醇、二丙二醇、丁二醇；表面活性剂或萜类。
可用于实施本发明的其他可接受载体对于本领域技术人员而言是显而易见的，它们包括在本发明范围内。
另一个实例中，本发明组合物以液体或固体形式口服给予。液体可以基于水、奶、茶、果汁或它们的某些组合。根据本发明，用于内部给药的固体和液体组合物还可包含增稠剂，包括黄原胶(xanthum gum)、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、淀粉、糊精、发酵乳清、豆腐、麦芽糖糊精、多元醇(包括糖醇(例如山梨糖醇和甘露醇))、碳水化合物(例如乳糖)、海藻酸丙二醇酯、结冷胶、瓜尔豆胶、果胶、黄耆胶、阿拉伯胶(gum acacia)、槐豆胶、阿拉伯树胶(gum arabic)、明胶，以及这些增稠剂的混合物。包含在本发明组合物中的这些增稠剂通常最多为约0.1％，这取决于所包含的具体增稠剂以及所需的粘度效果。
本发明的固体和液体(食品、饮料、补充剂和药物)组合物可包含并通常会包含有效量的一种或多种甜味剂，包括碳水化合物甜味剂和天然的和/或人工的低/无热量甜味剂。用于本发明组合物中的甜味剂的量可变化，但通常取决于所用甜味剂的类型和所需的甜度。
与给药方式无关，本发明组合物还可含有各种已知的常规化妆品佐剂，只要它们不不利影响对核DNA、线粒体DNA或二者的所需修复和/或对此类DNA的损伤(例如活性氧类或8-OHdG造成的损伤)的所需防止。例如，本发明组合物还可包含本领域熟知的一种或多种添加剂或其他任选成分，可包括但不限于填充剂(例如，固体、半固体或液体等)；载体；稀释剂；增稠剂；胶凝剂；维生素，视黄素(retinoids)和视黄醇(例如，维生素B3、维生素A等)；色素；香料；遮光剂(sunscreens)和防晒剂(sunblocks)；抗氧化剂和自由基清除剂；有机羟酸；去角质剂(exfoliants)；皮肤调理剂；保湿剂；神经酰胺、类神经酰胺(pseudoceramides)、磷脂、鞘脂、胆固醇、葡糖胺、药学上可接受的渗透剂(例如，正癸基甲基亚砜(n-decylmethyl sulfoxide)，卵磷脂有机凝胶、酪氨酸、赖氨酸，等)；杀菌剂；氨基酸(例如脯氨酸)、吡咯烷酮羧酸、其衍生物及盐，异构糖(saccharide isomerate)、泛醇、缓冲液连同基质(base)例如三乙醇胺或氢氧化钠；蜡，例如蜂蜡、地蜡、石蜡；植物提取物，包括但不限于例如库拉索芦荟(Aloe Vera)、矢车菊、金缕梅(witch hazel)、接骨木的花(elderflower)、黄瓜；不透明剂；悬浮剂；粘合剂；防腐剂；和它们的组合。可包含的一种示例性防腐剂是Phenonip
Figure A20078004584500191
(Clariant，Charlotte，N.C.)，它是一种包含2-苯氧乙醇和乙二醇醚的抗菌性植物提取物混合物。其他合适的添加剂和/或佐剂描述于美国专利6,184,247中，其全部内容通过参考纳入本文。
本发明组合物可包含其他非活性成分，包括但不限于表面活性剂、共溶剂和赋形剂。表面活性剂(例如亲水性表面活性剂和疏水性表面活性剂)可包含在组合物中。可基于总体组合物和希望的组合物递送来使用具体的表面活性剂。有用的表面活性剂包括聚氧乙烯(polyethoxylated)(PEG)脂肪酸、PEG-脂肪酸二酯、PEG-脂肪酸单酯和PEG-脂肪酸二酯混合物、聚乙二醇脂肪酸甘油酯(polyethylene glycol glycerol fatty acid ester)、醇-油酯交换(alcohol-oiltransesteriffcation)产物、聚甘油脂肪酸、脂肪酸丙二醇酯、丙二醇酯-甘油酯混合物、单甘油酯和二甘油酯、甾醇和甾醇衍生物、聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯(polyethylene glycol sorbitan fatty acid esters)、聚乙二醇烷基酯、聚糖酯、聚乙二醇烷基酚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、失水山梨醇脂肪酸酯、低级醇脂肪酸酯、离子型表面活性剂和它们的混合物。
可包含在本发明组合物中的其他添加剂对于本领域技术人员而言是显而易见的，它们包括在本发明范围内。
与给药模式无关，本发明组合物一般可至少以每天为基础给药。本发明组合物的给药可持续任何合适的时间。应理解，对核DNA、线粒体DNA或这两者的修复程度和/或防止例如活性氧类或8-OhdG对此类DNA损伤的程度，将直接取决于所用本发明组合物的总量和频率。
一个实例中，至少每天给予本发明组合物一次。另一个实例中，可每天给予本发明组合物两次。另一个实例中，可每天给予本发明组合物3-5次。另一个实例中，对每天给予的本发明组合物数量无限制。为获得最佳效果，本发明组合物至少以每天为基础给药，持续至少一周至几周。本发明组合物也可至少以每天为基础给药，持续几周至一个月，至几个月，至一年，至几年。应理解，对本发明组合物的给药频率和持续时间没有限制。
上文详细描述意在阐释本发明而非限制本发明。通过下文实验研究和实施例进一步阐释本发明，这些也不构成对本发明的限制。本申请中引用的所用参考文献、专利和公开的专利申请的内容均通过参考纳入本文。
实施例
实施例1：提取菠菜以获得水溶性菠菜提取物的方法
收获菠菜(例如生长在有机条件下的菠菜)，温和条件下清洗菠菜叶。然后风干洗过的叶子。干燥之后，用1/2开口(opening)的Rietz粉碎机(Hosokawa)将菠菜和水碾磨成浆液，其中水和新鲜菠菜的比例是4∶1。
然后用合适的设备例如分离器(bag press)和Liquatex装置(具有USSS 325目筛，约44微米的开口)将液体和固体分离。
将菠菜提取物液体和7.5％的活性炭加入到蒸气锅中。以热水或约140°F蒸汽的形式使用热量，以将菠菜提取物液体和7.5％的活性炭混合约30分钟。也可使用搅拌器进行搅拌。该加热步骤应使绿色的菠菜提取物液体脱色，这在将水溶性提取物加入到局部用化妆品中时可能是有用的。
采用合适的设备例如Liquatex装置(具有USSS 325目筛，约44微米的开口)将提取物液体和活性炭分离。可用合适的UF过滤设备例如#FP200膜将另外的液体从活性炭中分离并澄清。
通过UF过滤使渗出物(permeates)与洗涤的水混合。得到的液体浓缩物中的总固体的量在0.4-1.0％范围内。澄清的菠菜液体浓缩物在蒸气锅中于180°F搅拌下进行巴氏灭菌。将防腐剂例如2-苯氧乙醇(例如Phenonip
Figure A20078004584500211
(ClariantCorp.Charlotte，N.C.))或氯苯甘醚(例如GermazideM(Engelhard Corp.，Iselin，N.J.))加入到澄清的菠菜液体浓缩物中。最终的配方是(％wt/wt/)：约50％澄清菠菜液体浓缩物；约49％载体(丁二醇)和约1％防腐剂(例如Phenonip(2-苯氧乙醇)或Germazide
Figure A20078004584500214
M(氯苯甘醚))。
图2示出了上述方法的一种变化形式，其使用冷冻的菠菜作为原料可用于获得水溶性菠菜提取物。图2还显示在提取过程中何时收集如下表II提到的水溶性提取物1-4。图3也示出了上述方法的一种变化形式，其使用脱水的菠菜作为原料可用于获得水溶性菠菜提取物。图3也显示了提取过程中何时收集如下表II提到的水溶性提取物5-9。
实施例2：ATP水平的测定
细胞中ATP水平是细胞和线粒体健康的一个标志。如本实施例所阐释的，可用在ATP存在下发光的ATP依赖性荧光酶来监测ATP水平。产生的光的量与ATP存在量直接成比例。
CHO-K1(中国仓鼠卵巢)细胞购自ATCC(Manassas，VA)(细胞登录号ATCC CCL 61)。在不透明96孔板中以1×104个细胞/孔接种细胞培养物。贴壁后，将细胞转移到低葡萄糖培养基(1g/l)中，孵育过夜。在低葡萄糖培养基中培养的细胞具有降低的ATP含量。
过夜培养后，使细胞接触叔丁基过氧化物(1mM)2小时以诱导细胞应激。过氧化物比单独的葡萄糖使ATP水平降得更低，模拟了受损伤的细胞状态。接触过氧化物后，将新鲜的低葡萄糖培养基加回到细胞中。用过氧化物攻击后立即将细胞暴露于测试样本，终浓度通常是1、10、和100mg/ml。细胞和测试样本一起于37℃孵育4小时。该实施例中所用的测试样本包括获得自新鲜冷冻的菠菜浆液和脱水菠菜的样本。将上述两种菠菜原料提取获得的样本均包括粗滤菠菜提取物、纳米过滤提取物、脱色提取物、巴氏灭菌提取物和最终产品。图4和图5报告了结果。图4和图5中，数据表示为与未处理对照细胞中的ATP水平相比得到的％对照ATP。因此，认为ATP的增加代表样本的积极作用。图5的数据显示，获得自脱水菠菜的样本趋于比获得自新鲜冷冻菠菜的样本具有更大的活性。
本试验筛选在模拟受损细胞状态的应激条件(stressed conditions)之后能够恢复ATP水平的化合物。因此，受攻击的细胞与测试样本孵育之后，用购自Promega(Madison，Wl)的Cell-Titer Gio试剂按照生产商提供的说明书测定相对细胞ATP水平。简而言之，将细胞平衡到室温，此时去除孔中的培养基。将稀释的试剂加入到孔中，室温孵育板15分钟。在Wallach板读数仪上读取荧光(luminescence)。
计算各处理组的平均荧光，通过用每一个测试组的平均值除以未处理对照组的平均值来确定％未处理对照。未处理对照认为是100％，因此任何大于100％的结果都认为是细胞ATP水平净增加的阳性结果。该实验的结果报告于图4和图5中。
实施例3：测定对氧化应激的保护
本实施例中描述的试验测定发生在线粒体中的氧化应激。如上所讨论的，线粒体用于产生能量(ATP分子)的生化反应也会产生副产物即具有高度氧化性的超氧自由基。利用流式细胞术，下文实施例通过监测用各测试物质处理后线粒体内的超氧化物状态来测定各测试样本提供的针对氧化应激的保护。
MitoSOX红(MitoSOX Red)线粒体超氧化物指示剂(Invitrogencat#M36008)是一种被线粒体选择性吸收的荧光染料。一旦进入线粒体中，MitoSOX与超氧化物自由基反应形成结合于线粒体核酸的荧光产物(激发/发射最大值＝510/580nm)。较高的荧光读数对应于线粒体内存在较高水平的超氧化物自由基。
细胞培养：每个样本使用一个6孔板。可同时准备多个板。见表I中对板的描述。以1.5×106个细胞/孔的密度将THP-1单核细胞(ATCC cat# TIB-202)接种于6孔板(含有2毫升/孔的RMPI 1640培养基，补充有10％FBS)中，孵育1小时后处理。
表I：板描述
  孔   描述   内容
  1   阳性对照   加载：2ml培养基，1.5×106个细胞处理：1ml 300μM GMEE攻击：1ml 5mM H2O2
  2   阴性对照   加载：2ml培养基，1.5×106个细胞处理：1ml培养基攻击：1ml 5mM H2O2
  3   正常对照   加载：2ml培养基，1.5×106个细胞处理：1ml培养基攻击：1ml培养基
  4   样本重复#1   加载：2ml培养基，1.5×106个细胞处理：1ml 300μg/ml样本溶液攻击：1ml 5mM H2O2
  5   样本重复#2   加载：2ml培养基，1.5×106个细胞处理：1ml 300μg/ml样本溶液攻击：1ml 5mM H2O2
  6   样本重复#3   加载：2ml培养基，1.5×106个细胞处理：1ml 300μg/ml样本溶液攻击：1ml 5mM H2O2
处理：谷胱甘肽单乙酯(Glutathione monoethylester)(GMEE，100μM终浓度)用作阳性对照。更具体地说，如下制备阳性对照：将4mg谷胱甘肽单乙酯溶解在10ml培养基(补充有10％FBS的RMPI 1640培养基)中制备1.2mM储液。然后将2.5ml储液加入到7.5ml培养基中制备阳性对照工作溶液(300μM)。在板的每孔中加入1ml阳性对照工作溶液，得到终处理浓度为100μM谷胱甘肽单乙酯。
将1ml培养基(补充有10％FBS的RMPI 1640培养基)加入到板上的指定的孔中(每个对照1孔)制备阴性对照和正常对照。
可如下制备测试样本：称取100mg测试样本放入15毫升一次性(disposable)离心管中，加入10ml去离子水，从而制备浓度为10mg/ml的样本储液。本实施例中，测试样本是包含约50％的菠菜提取物、约49％丁二醇和约1％防腐剂(例如Phenonip
Figure A20078004584500241
或Germazide
Figure A20078004584500242
M)的脱水菠菜水溶性提取物。然后系列稀释样本储液，得到浓度为300μg/ml的样本工作溶液。然后在板剩余3个孔的每一个(三复孔)中加入1ml样本工作溶液，这样各样本孔中的测试样本终浓度为100μg/ml。
然后，将既含有测试样本孔又含有对照孔的板在37℃、5％CO2中孵育3小时。
攻击：孵育3小时后，通过引入攻击溶液使分别含有测试样本、阳性对照和阴性对照的孔中的细胞经受氧化应激。如下制备攻击溶液：
852μl 8.8M H2O2+4.15ml培养基(＝1.5M H2O2)
1ml1.5M H2O2+9ml培养基(＝150mM H2O2)
1ml 150mM+30ml培养基(＝5mM H2O2)
将1ml 5mM H2O2加入到板的所有孔中，但正常对照除外，正常对照孔中加入1ml培养基(补充有10％FBS的RMPI 1640培养基)。然后，板在37℃、5％CO2中孵育3小时。
染色：与攻击液一起孵育以后，将所有孔中的内容物转移到流式细胞管中，100x g离心5分钟。去除细胞上的培养基，通过各管中加入1ml MitoSOX(5μM)将细胞染色。通过使用13μL DMSO/瓶溶解两小瓶MitoSOX(50μg/瓶，Invitrogen cat#M36008)得到5mM/瓶的溶液(mw＝760克/摩尔)，由此获得MitoSOX染料。将两小瓶中的内容物均转移到26ml(5μM)培养基中。将细胞与染料室温黑暗孵育15分钟。
流式细胞术：染色后，用流式细胞仪(例如Becton-Dickinson FACS Caliber)分析样本，使用488nm激发激光和FL2588nm发射滤器。将数据线性化为曲线，该曲线由阴性对照和正常对照的响应来限定(0％保护＝未处理的/攻击的阴性对照，100％保护＝未处理的/未攻击的正常对照)。在这些条件下，阳性对照(100μM谷胱甘肽甲酯(glutathione methyl ester))提供针对氧化应激的35％的保护。
结果：该实验的结果证明，脱水菠菜的水溶性提取物提供了对氧化应激的明显保护，即平均保护为91.3±0.9％。
实施例4：8-OhdG修复的测定
本实施例中，用过氧化物和紫外线攻击细胞以增加8-OhdG(DNA氧化损伤的标志物)水平。对测试样本帮助细胞从攻击中恢复的能力、恢复的时间长度以及对DNA损伤的修复进行测定。
具体说，源自人真皮的HS27成纤维细胞和HEK001角化细胞购自美国模式培养物保藏所(ATCC)(Manassas，VA)。以4×104和8×104个细胞/孔的密度在12孔板中建立HS27和HEK001的共培养物。培养细胞过夜。过夜培养后，用含有0.5％胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水替换培养基。然后，使细胞培养物同时暴露于太阳模拟器产生的全光谱紫外光(据UVB测量仪检测为25mJ/cm2)和H2O2(5mM)以产生8-OHdG损伤。暴露于紫外光和H2O2后，轻柔地清洗细胞，加入新鲜的完全培养基。然后用测试样本处理细胞，所述测试样本包括9个液体形式的菠菜水溶性提取物(用图1所示方法获得)、Vegebios of Spinach(一种用蒸汽蒸馏的特殊方法获得的菠菜叶水提取物，可购自CEP Solabia Group(France)和例如Aston Chemicals，Aylesbury，UK等供应商)、从50mg/ml的储液中制得的终浓度为1、10和100μg/ml的阳性对照。处理后，将细胞放回37℃培养箱中，孵育1-2小时。
孵育期后，清洗细胞并通过用胰蛋白酶消化(使用Trypl E细胞解离试剂)并离心来收集。用Sigma公司的GenElute哺乳动物基因组DNA微量提取试剂盒从细胞中分离并收集DNA。分离并收集DNA后，可用Molecular Probes(Invitrogen公司)的PicoGreen
Figure A20078004584500251
dsDNA试剂盒测定各样本中的DNA量。
根据日本衰老控制研究院的推荐，用核酸酶P1和碱性磷酸酶消化等量的DNA。用ELISA试剂盒检测已消化的样本。具体说，将各样本的2mg DNA加入到获自日本衰老控制研究院的8-OHdG ELISA试剂盒(Nikken SEILCorp.，Haruoka，Fukuroi，静冈，日本)中，来检测DNA样本中的8-OhdG。
本实施例的结果报告于下表II中。结果报告为与对照细胞中存在的8-OHdG百分比进行比较得到的暴露于测试样本的细胞中存在的8-OhdG百分比。因此，任何低于100％的值认为是积极的结果，代表DNA损伤的修复。Vegebios of Spinach(一种用蒸汽蒸馏的特殊方法获得的菠菜叶水提取物，可购自CEP Solabia Group(France)，或Solabia的分销商，例如Aston Chemicals(Aylesbury，UK))显示能够明显修复DNA损伤，％对照值为63.9％。水溶性菠菜提取物1、6、7和8也显示可明显修复DNA损伤，％对照值分别为85.7％、82.1％、82.0％和80.9％。
表II：8-OHdG DNA修复
Figure A20078004584500261
上文描述了本发明优选实施方式。可进行很多改变和变化而不脱离如所附权利要求中定义的本发明的精神和本发明更广的方面，应根据专利法的原则包括等同原则来解释本发明的精神和更广的方面。权利要求中提到的任何单数形式的元素，例如“一”、“该”或“所述”不应理解为将该元素限定为单数。

Claims (26)

1.修复DNA氧化损伤的方法，包括给予包含水溶性菠菜提取物和可接受的载体的组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述氧化损伤将DNA中的至少一个鸟嘌呤残基转化为8-羟基脱氧鸟苷。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述8-羟基脱氧鸟苷在至少一个DNA碱基对中造成碱基配对修饰。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述DNA是核DNA、线粒体DNA或两者。
5.如权利要求1所述的方法，其中通过包括以下步骤的方法获得所述水溶性菠菜提取物：
形成菠菜的水性浆液，
将浆液的液体成分与浆液的固体成分分离，
使用热水或蒸汽将浆液的液体成分与活性炭混合，
将液体成分与活性炭分离，和
微量过滤所述浆液的液体成分以收集基本无色的水溶性菠菜提取物。
6.如权利要求6所述的方法，还包括对所述基本无色的水溶性菠菜提取物进行巴氏灭菌。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述方法还包括向所述基本无色的水溶性菠菜提取物中加入至少一种防腐剂。
8.如权利要求1所述的方法，其中局部给予或口服给予所述包含水溶性菠菜提取物的组合物。
9.防止或减少DNA氧化损伤的方法，包括给予包含水溶性菠菜提取物的组合物。
10.如权利要求11所述的方法，其中所述DNA是核DNA、线粒体DNA或两者。
11.如权利要求9所述的方法，其中通过包括以下步骤的方法获得所述水溶性菠菜提取物：
形成菠菜的水性浆液，
将浆液的液体成分与浆液的固体成分分离，
使用热水或蒸汽将浆液的液体成分与活性炭混合，
将液体成分与活性炭分离，和
微量过滤所述浆液的液体成分以收集基本无色的水溶性菠菜提取物。
12.如权利要求11所述的方法，还包括对所述基本无色的水溶性菠菜提取物进行巴氏灭菌。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述方法还包括向所述基本无色的水溶性菠菜提取物中加入至少一种防腐剂。
14.如权利要求11所述的方法，其中局部给予或口服给予所述包含水溶性菠菜提取物的组合物。
15.增加细胞中ATP产生或合成的方法，包括给予包含水溶性菠菜提取物的组合物。
16.如权利要求15所述的方法，其中通过包括以下步骤的方法获得所述水溶性菠菜提取物：
形成菠菜的水性浆液，
将浆液的液体成分与浆液的固体成分分离，
使用热水或蒸汽将浆液的液体成分与活性炭混合，
将液体成分与活性炭分离，和
微量过滤所述浆液的液体成分以收集基本无色的水溶性菠菜提取物。
17.如权利要求20所述的方法，还包括对所述基本无色的水溶性菠菜提取物进行巴氏灭菌。
18.如权利要求17所述的方法，其中给予所述包含水溶性菠菜提取物的组合物的方法选自局部给药、口服给药和胃肠外给药。
19.用于改善、维持或恢复线粒体功能以及修复DNA氧化损伤的组合物，其包含水溶性菠菜提取物、脂质体、心磷脂和至少一种抗氧化剂，其中所述心磷脂包埋在脂质体的磷脂双层中，所述至少一种抗氧化剂与心磷脂一起包埋在脂质体的磷脂双层中且/或含于脂质体的水性中心内。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述脂质体主要由磷脂酰胆碱构成。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述心磷脂是四油酰心磷脂。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述至少一种抗氧化剂是龙胆酸甲酯，其中龙胆酸甲酯与心磷脂一起包埋在脂质体的磷脂双层中。
23.如权利要求22所述的组合物，其还包含第二抗氧化剂，其中所述第二抗氧化剂是1-肌肤，其中1-肌肽含于脂质体的水性中心内。
24.如权利要求23所述的组合物，其还包含芥菜(芸苔属)种子提取物。
25.如权利要求23所述的组合物，其还包含拟南芥提取物。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述拟南芥提取物是8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶。
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