CN114015791A - 基于AIE-CRISPR/cas12a对环境中病原微生物的可视化检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于AIE‑CRISPR/Cas12a对环境中病原微生物的可视化检测方法。该可视化检测方法包括以下步骤：将待测病原微生物样品进行DNA提取和特异性扩增，然后加入TTAPE后，再经过CRISPR/Cas12a处理，于紫外光下观察，即可实现可视化地检测病原微生物。该方法简单方便且速度快，应用于水体中微生物的检测具有很高的选择性、特异性和适用性，可实现病原微生物的快速、可视化检测。

Description

基于AIE-CRISPR/cas12a对环境中病原微生物的可视化检测 方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于AIE-CRISPR/cas12a对环境中病原微生物的可视化检测方法。

背景技术

病原微生物是指能够引起人或动物疾病的微生物，包括病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫等，广泛存在于人们所处的环境之中，对人类的生命健康安全造成严重的影响，并给社会带来巨大的经济负担。因此，及时准确地检测多种病原微生物，切断感染源以防止感染就显得至关重要。

常用来检测病原微生物的方法有微生物培养法(如专利CN113122423A)、酶联免疫法(如专利CN113136420A)、质谱法(如专利CN110361537A)、聚合酶链式反应(如专利CN1733936A)、流式细胞术(如专利CN101768625A)等等，但这些方法均存在着各自的局限性，例如耗时长、检测速度慢、步骤繁琐、需要大型仪器、灵敏度偏低、假阴性或假阳性严重等。在资源有限的地区，许多方法难以及时应用。因此，开发出方便快捷、特异性强、可实现快速检测的诊断方法就显得尤为迫切。

发明内容

为克服现有技术中针对病原微生物的检测方法成本高、检测速度慢及特异性低等问题，本发明的目的在于提供一种基于AIE-CRISPR/Cas12a对环境中病原微生物的可视化检测方法，结合TTAPE聚集发光的特点和CRISPR-Cas12a的切割特性，构建了TTAPE-CRISPR/Cas12a平台，可以实现对病原微生物快速、可视化检测。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于AIE-CRISPR/Cas12a对环境中病原微生物的可视化检测方法，包括以下步骤：

将待测病原微生物样品进行DNA提取和特异性RPA扩增，然后加入TTAPE和CRISPR/Cas12a，于紫外光下观察，即可实现可视化地检测病原微生物。

TTAPE(聚集诱导发光材料)是一种带正电的完全溶于水的AIE gens，它可以与核酸通过静电作用结合，尤其对富含G碱基的DNA具有高度亲和力。TTAPE在与DNA聚集后发射出蓝色荧光信号，且其荧光强度会随着核酸浓度的增加而逐渐增强。

CRISPR/Cas12a是第二类(V型)CRISPR-Cas系统，可结合和切割DNA和RNA。它由一个CRISPR RNA(crRNA)引导，crRNA可以特异性的识别DNA序列，开启Cas12a蛋白对DNA的切割活性，并且，Cas12a不仅仅能切割自身结合的DNA链，也能剪切其他它能够发现的所有的DNA。将AIE与CRISPR-Cas技术相结合不仅能够提高检测结果的准确性，而且方法更加简便快捷。

本发明的发明人经研究发现，当DNA经过特异性扩增后，带负电的DNA与带正电的TTAPE通过静电作用非特异性结合，使得TTAPE大量聚集在DNA上从而发射出强烈的荧光信号。但由于RPA扩增过程中极易形成引物二聚体，导致假阳性现象十分严重，所以直接经过RPA扩增后加入TTAPE难以达到检测效果。而在体系中引入CRISPR/Cas12a技术后，在含有特异性DNA片段的体系中，crRNA成功识别DNA后即可开启Cas12a的乱剪特性，使得所有的长链DNA均被剪短为3-5bp的短链DNA，TTAPE也会随之不再聚集，导致荧光猝灭现象。而在不含有特异性DNA片段的体系中，crRNA识别失败，未能开启cas12a的乱剪特性，溶液体系内荧光强度无明显变化。通过直接观察体系中荧光是否发生变化即可实现对病原微生物的快速检测，RPA和CRISPR/Cas12a的双重特异性极大地避免了检测结果假阳性或假阴性的出现，实现了快速准确检测。

优选地，所述病原微生物为嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌或大肠杆菌中的一种。

优选地，对于病原微生物的可视化检测方法包括以下步骤：

S1 DNA提取和扩增：对病原微生物样品进行DNA提取得到DNA提取液，然后对其进行RPA等温扩增，得到DNA扩增液；

S2病原微生物检测：将S1中得到的DNA扩增液分成等体积的两份溶液，一份中加入TTAPE，另一份中加入TTAPE和CRISPR/Cas12a，反应一段时间后，于紫外光下观察两份溶液体系的荧光效果，即可实现可视化地检测病原微生物。

优选地，S1步骤前还包括对病原微生物样品进行微生物培养以获得纯化的病原微生物阳性样本。

优选地，S1步骤中DNA提取液的OD260/OD280值为1.6～1.8。

优选地，S1步骤中RPA等温扩增体系包括RPA引物对、Primer Free Rehydration bμffer、DNA提取液、MgOAc和ddH₂O。

进一步优选地，所述RPA引物对的序列为ATTTGCGGCACAGTAACATGGAATAGTATTTC/TTGTTGATACTCAGTGCAGACCTGACCAGATG(如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)、CGAACGGTAACAGGAACGAGC/CCTCTCAGACCAGCTAGGGA(如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示)或CGGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAG/GAAGGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAAAG(如SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示)中的一种。

进一步优选地，S1步骤中RPA等温扩增体系包括：RPA引物对各2.4μL，Primer FreeRehydration buffer 29.5μL，DNA提取液2μL，MgOAc 2.5μL，加ddH₂O补充至50μL；在39℃下扩增反应15min。

优选地，根据权利要求3所述可视化检测方法，其特征在于S2步骤中将对照组和检测组于紫外光下观察两份溶液体系的荧光效果，当观察到检测组相较于对照组的荧光强度弱时，则认为检测组中含有病原微生物，进而实现可视化地检测病原微生物。

优选地，S2步骤中病原微生物检测体系包括：TTAPE、Cas12a蛋白、crRNA、1*buffer、DNA扩增液和ddH₂O。

进一步优选地，所述crRNA的序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGAUUUGAAGGCUGAUAUGG(如SEQ ID NO：7所示)、UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCGUGGACUACCAGGGUAUC(如SEQ ID NO：8所示)或UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAAUGACCCUCCACGGUUGA(如SEQ ID NO：9所示)中的一种。

进一步优选地，S2步骤中所述TTAPE的浓度为300-600μM；所述Cas12a蛋白的浓度为0.8-1.2μM。

更进一步优选地，S2步骤中所述TTAPE的浓度为500μM；所述Cas12a蛋白的浓度为1μM。

进一步优选地，S2步骤中病原微生物检测体系包括：TTAPE 5μL，Cas12a蛋白5μL，crRNA 5μL，1*buffer 5μL，DNA扩增液5μL，加ddH₂O补充至50μL。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中利用TTAPE与DNA长链结合聚集发射荧光的特点，以及CRISPR/Cas12a技术在特异性识别DNA后，开启乱剪特性导致荧光淬灭的现象，成功构建了一种基于AIE-CRISPR/Cas12a对环境中病原微生物的可视化检测方法，该方法对病原微生物的检测具有很高的选择性、特异性和适用性，可实现病原微生物的快速、可视化检测。

附图说明

图1为检测方法原理示意图。

图2为实施例1～3中对应Cas12a-RNP的活性测定凝胶电泳图。

图3为实施例1中阴性样本和阳性样本的特异性测定图；(A)嗜肺军团菌的阴性样本和阳性样本的荧光变化图；(B)A的灰度图(a：+TTAPE，b：+TTAPE+Cas12a-RNP)。

图4为实施例1中(A)嗜肺军团菌阴性样本的荧光变化光谱图；(B)嗜肺军团菌阳性样本的荧光变化光谱图。

图5为实施例2中阴性样本和阳性样本的特异性测定图；(A)大肠杆菌的阴性样本和阳性样本在紫外下的荧光变化图；(B)A的灰度图(a:+TTAPE，b:+TTAPE+Cas12a-RNP)。

图6为实施例2中(A)大肠杆菌阴性样本的荧光光谱图；(B)大肠杆菌阳性样本的荧光光谱图。

图7为实施例3中阴性样本和阳性样本的特异性测定图；(A)金黄色葡萄球菌的阴性样本和阳性样本在紫外下的荧光变化图；(B)A的灰度图(a:+TTAPE,b:+TTAPE+Cas12a-RNP)。

图8为实施例3中(A)金黄色葡萄球菌阴性样本的荧光光谱图；(B)金黄色葡萄球菌阳性样本的荧光光谱图。

图9为实施例1中对嗜肺军团菌DNA的灵敏度检测分析图；(A)不同目标物浓度下溶液的荧光图和灰度图；(B)不同目标物浓度下溶液的灰度值变化。

图10为实施例2中对大肠杆菌DNA的灵敏度检测分析图；(A)不同目标物浓度下溶液的荧光变化灰度图；(B)不同目标物浓度下溶液的灰度值变化。

图11为实施例3中金黄色葡萄球菌DNA的灵敏度检测分析图；(A)不同目标物浓度下溶液的荧光变化灰度图；(B)不同目标物浓度下溶液的灰度值变化。

图12为实施例1中环境水样检测的荧光变化灰度图和凝胶电泳图(DNA片段为291bp，1-3：空调水样，4-6：自来水样，7-10：湖水样)。

图13为实施例1中环境水样检测的荧光变化图。

图14为实施例2中环境水样检测的凝胶电泳图(DNA片段为291bp，1-3：空调水样，4-6：自来水样，7-10：湖水样)。

图15为实施例2中环境水样检测的荧光变化图。

图16为实施例3中环境水样检测的凝胶电泳图(DNA片段为291bp，1-3：空调水样，4-6：自来水样，7-10：湖水样)。

图17为实施例3中环境水样检测的荧光变化图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

下述实施例中仪器和试剂信息如下：

(1)材料：嗜肺军团菌ATCC33152，大肠杆菌ATCC 25922，金黄色葡萄球菌CMCC26003，BCYE培养基，GVPC培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，全基因组DNA提取试剂盒，

Basic RPA kit，RPA引物，琼脂粉，SYBR Green核酸染料，2000DNA Marker，TTAPE，Cas12a蛋白酶(Cas12a-RNP)，crRNA，纯水，空调水，湖水，自来水。

(2)仪器：电子天平，pH计，高压灭菌锅，恒温培养箱，恒温摇床，超净台，纯水仪，电子显微镜，离心机，漩涡振荡器，水浴锅，微波炉，电泳仪，凝胶成像仪，紫外灯，紫外-可见分光光度计，荧光分光光度计，手机。

(3)微生物培养：嗜肺军团菌标准菌株ATCC33152、大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌CMCC26003购于上海保藏中心，将菌株接种到固体培养基后，在37℃下经培养箱培养过夜后，挑取单菌落在液体培养基中用恒温摇床37℃震荡培养过夜，获得纯化的阳性样本，细菌的生长和浓度通过紫外分光光度计测量OD600。

(4)RPA引物对和crRNA的设计和合成：在NCBI数据库和Primer 5软件上设计RPA扩增引物对，引物对由生工合成；crRNA序列由广州博莱斯设计合成，嗜肺军团菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的RPA引物对和crRNA见表1。

表1 RPA扩增引物序列和crRNA序列

实施例1

本实施例提供一种基于AIE-CRISPR/Cas12a对环境中病原微生物的可视化检测方法，其检测原理如图1所示，具体包括以下步骤：

S1 DNA提取和扩增：以纯水作为阴性样本，嗜肺军团菌作为阳性样本。使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取嗜肺军团菌和纯水的基因组DNA，DNA提取液的OD260/OD280在1.6～1.8之间，提取液置于-20℃冰箱中冷冻保存。使用

Basic RPA试剂盒在39℃下对纯水和嗜肺军团菌的DNA片段进行15min的等温扩增，整个体系为50μL，具体各组分用量见表2：

表2 RPA等温扩增体系

S2 Cas12a-RNP活性检测：向嗜肺军团菌的DNA扩增液中加入Cas12a-RNP，反应大约5分钟；对经过Cas12a-RNP处理过的DNA扩增液和未经Cas12a-RNP处理的DNA扩增液同步进行凝胶电泳。

S3特异性测定：将阴性样本和阳性样本的DNA扩增溶液分别分成等体积的两份，一份中加入TTAPE，另一份同时加入TTAPE和Cas12a-RNP。在紫外灯下观察四个样品管中的荧光信号，并用荧光分光光度计测量了它们的荧光强度；其中，TTAPE-CRISPR/cas12a平台检测体系见表3：

表3 TTAPE-CRISPR/cas12a平台检测体系

S4灵敏度测定：取嗜肺军团菌DNA浓度分别为5nM、1nM、10pM、100fM、10fM、1fM、100aM的样本，按S3中构建方法分别进行处理，观察荧光变化。

S5环境水样检测：取3份空调水样、3份自来水样和3份湖水样，每份500mL，对水中的微生物进行DNA提取处理，即可获得待检测的水体样本。

按上述构建方法对各水体样本进行处理，得到各水样的荧光图，并对水体样本进行凝胶电泳检测，将荧光图与凝胶图进行比对。

实施例2

本实施例提供一种基于AIE-CRISPR/cas12a对环境中病原微生物的可视化检测方法，具体包括以下步骤：

将实施例1中嗜肺军团菌替换为大肠杆菌，其余与实施例1中一致。

实施例3

本实施例提供一种基于AIE-CRISPR/cas12a对环境中病原微生物的可视化检测方法，具体包括以下步骤：

将实施例1中嗜肺军团菌替换为金黄色葡萄球菌，其余与实施例1中一致。

结果分析

(1)Cas12a-RNP活性检测

对经过Cas12a-RNP(Cas12a和crRNA的混合物)处理过的嗜肺军团菌DNA扩增液和未经Cas12a-RNP处理的DNA扩增液同步进行凝胶电泳。如图2所示，实施例1～3中经Cas12a-RNP处理过的DNA分子量明显大幅度的减少，说明大量的DNA链已被Cas12a-RNP剪切降解，Cas12a-RNP对特异性DNA片段具有很高的剪切活性。

(2)特异性测定

实施例1中，对阴性样本(不含嗜肺军团菌DNA)和阳性样本(含嗜肺军团菌DNA)同时进行处理，以判断构建的TTAPE-CRISPR/cas12a平台是否可以实现特异性检测。为了直观的看到检测结果，准备了a、b两份完全相同的阴性样本(a：仅经TTAPE处理，b：经TTAPE和Cas12a-RNP处理)。反应五分钟后，在紫外灯下直接用肉眼观察样品管内荧光强度的变化。阳性样品用与阴性样本同样的方法处理。如图3A所示，两份阴性样本的荧光强度无明显区别，而阳性样本的b管相较于a管的荧光强度明显大幅度降低。说明Cas12a-RNP识别了阳性样本中的特定DNA片段，开启了cas12a的乱剪特性，导致荧光淬灭。通过肉眼观察荧光强度的变化，就可以区分阴性样本和阳性样本，实现对嗜肺军团菌的检测。用荧光光谱仪对阴性样本和阳性样本的荧光强度分别进行了测定，荧光光谱图分别如图4A、4B所示，与肉眼直接观察的检测结果无差异。

此外，对实施例2中大肠杆菌和实施例3中金黄色葡萄球菌也进行了荧光测定，证实了该方法的普适性，检测结果见图5～8。这些结果均证实了TTAPE-CRISPR/Cas12a平台可以对病原微生物达到很好的特异性检测效果，并且检测速度快，稳定性良好。

(3)灵敏度测定

如图9A所示，在DNA浓度为5nM-1fM的范围内，b管均会发生荧光淬灭现象，TTAPE-CRISPR/Cas12a平台对嗜肺军团菌DNA浓度的检测限可以达到1fM，而低于1fM浓度的较难直接用肉眼观测出。且随着DNA浓度的降低，a管的荧光强度也随之降低。使用手机软件将荧光图片转换成灰度图片，分析灰度值的大小即可相对定量体系中目标物的浓度，如图9B所示。

利用TTAPE-CRISPR/Cas12a平台对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灵敏度测定见图10、11，均能检测出1fM以上的目标物。

(4)环境水样检测

为了进一步验证TTAPE-CRISPR/Cas12a检测体系的实际可行性，对环境中的水样进行了测定。共测定了3份空调水样、3份自来水样和3份湖水样，利用TTAPE-CRISPR/Cas12a体系对各水体样本进行处理，得到了各水样的荧光变化图，并对9份水样进行了凝胶电泳法检测，将各水样的荧光变化图与凝胶图进行比对，如图12、13所示，发现TTAPE-CRISPR/Cas12a体系与凝胶电泳法的检测结果高度吻合。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的水样检测如图14～17所示，TTAPE-CRISPR/Cas12a平台与凝胶电泳法的检测结果均吻合，进一步验证了TTAPE-CRISPR/Cas12a平台的可行性与普适性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种基于AIE-CRISPR/Cas12a对环境中病原微生物的可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测病原微生物样品进行DNA提取和特异性扩增，然后加入TTAPE和CRISPR/Cas12a，于紫外光下观察，即可实现可视化地检测病原微生物。

2.根据权利要求1所述可视化检测方法，其特征在于，所述病原微生物为嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌或大肠杆菌中的一种。

3.根据权利要求1中所述可视化检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1 DNA提取和扩增：对病原微生物样品进行DNA提取，得到DNA提取液，然后对其进行RPA等温扩增，得到DNA扩增液；

S2病原微生物检测：将S1中得到的DNA扩增液分成等体积的两份溶液，一份中加入TTAPE作为对照组，另一份中加入TTAPE后，再加入CRISPR/Cas12a作为检测组。

4.根据权利要求3所述可视化检测方法，其特征在于，S1步骤前还包括对病原微生物样品进行微生物培养以获得纯化的病原微生物阳性样本。

5.根据权利要求3所述可视化检测方法，其特征在于，S1步骤中DNA提取液的OD260/OD280值为1.6～1.8。

6.根据权利要求3所述可视化检测方法，其特征在于，S1步骤中RPA等温扩增体系包括RPA引物对、Primer Free Rehydration buffer、DNA提取液、MgOAc和ddH₂O；所述RPA引物对的序列为ATTTGCGGCACAGTAACATGGAATAGTATTTC/TTGTTGATACTCAGTGCAGACCTGACCAGATG(如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)、CGAACGGTAACAGGAACGAGC/CCTCTCAGACCAGCTAGGGA(如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示)或CGGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAG/GAAGGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAAAG(如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示)中的一种。

7.根据权利要求3所述可视化检测方法，其特征在于，S2步骤中将对照组和检测组于紫外光下观察两份溶液体系的荧光效果，当观察到检测组相较于对照组的荧光强度弱时，则认为检测组中含有病原微生物，进而实现可视化地检测病原微生物。

8.根据权利要求3所述可视化检测方法，其特征在于，S2步骤中病原微生物检测体系包括：TTAPE、Cas12a蛋白、crRNA、1*buffer、DNA扩增液和ddH₂O。

9.根据权利要求8所述可视化检测方法，其特征在于，所述crRNA的序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGAUUUGAAGGCUGAUAUGG(如SEQ ID NO：7所示)、UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCGUGGACUACCAGGGUAUC(如SEQ ID NO：8所示)或UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAAUGACCCUCCACGGUUGA(如SEQ ID NO：9所示)中的一种。

10.根据权利要求8所述可视化检测方法，其特征在于，S2步骤中所述TTAPE的浓度为300-600μM；所述Cas12a蛋白的浓度为0.8-1.2μM。

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