CN101863958A - 对线粒体通透性转换的诱导 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及识别在增殖细胞中诱导线粒体通透性转换(MPT)的化合物的方法，其中所述方法包括将化合物与细胞或细胞提取物接触，测定该化合物是否与腺嘌呤核苷酸易位体(ANT)结合，并且测定该化合物是否选择性地在增殖细胞中诱导MPT。

Description

对线粒体通透性转换的诱导
本申请是申请日为2003年11月7日、申请号为200380107322.6、发明名称为“对线粒体通透性转换的诱导”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及在细胞中线粒体膜通透性的改变，特别是涉及识别和使用选择性地诱导增殖细胞中MPT(线粒体通透性转换)的化合物。
背景技术
线粒体提供ATP来维持正常的细胞功能，它们的干扰导致凋亡和坏死细胞死亡(Crompton，1999)。凋亡和坏死的一个重要因素是线粒体通透性改变(MPT)，这样的情况在钙过多时会发生。MPT的起因是在线粒体内膜打开一种非特异性孔，称为线粒体通透性转换孔(MPTP)(Crompton等人，1987)。氧化应激、腺嘌呤核苷酸损耗和高无机磷酸盐极大地增加了该孔对钙浓度的敏感性。MPTP的打开伴随着所有小溶质(＜1.5kD)在线粒体内膜两边的平衡。所得基质中的高蛋白浓度，施加了胶体渗透压，造成线粒体的广泛肿胀，并且最终导致凋亡或坏死。
腺嘌呤核苷酸易位体(ANT)是一种30kD的蛋白质，该蛋白质横跨线粒体内膜，并且位于MPTP的中心(Crompton等人，1988)。
作为诱导凋亡的方法，需要选择性地诱导MPT，尤其是在增殖细胞中。
本发明涉及一种识别在线粒体中与ANT结合的化合物的方法，该化合物选择性地在增殖细胞中而不在非增殖或生长休眠细胞中诱导MPT。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供一种识别在增殖细胞中诱导线粒体通透性转换(MPT)的化合物的方法，其中该方法包括将化合物与细胞或细胞提取物接触，测定该化合物是否与腺嘌呤核苷酸易位体(ANT)结合，并且测定该化合物是否选择性地在增殖细胞中诱导MPT。
根据本发明的第二方面，提供一种筛选多个化合物以识别在增殖细胞中诱导MPT的化合物的方法，其中该方法包括将多个化合物与细胞或细胞提取物接触，测定这些化合物中任意一个是否与ANT结合，如果是，分开测定多个化合物中的每一个是否选择性地在增殖细胞中诱导MPT。
关于本发明的第一和第二方面，在增殖细胞中选择性地诱导MPT可以通过以下方式测定，例如，对于根据本发明第一和第二方面被识别为与ANT结合的化合物，比较其对增殖细胞中MPT的影响与对非增殖或生长休眠细胞中MPT的影响。
同样关于本发明的第一和第二方面，在一个实施方式中，该方法可以包括测定过氧化物阴离子(O2 -)细胞浓度的变化。在另一个实施方式中，该方法可以包括测定细胞色素C释放的变化。
根据本发明的第三方面，提供一种识别在增殖细胞中诱导凋亡的化合物的方法，该方法包括将候选化合物与细胞或细胞提取物接触，测定细胞过氧化物阴离子(O2 -)的浓度是否增加，并且测定该化合物是否选择性地在增殖细胞中诱导凋亡。
根据本发明的第四方面，提供一种识别作为血管生成抑制剂的化合物的方法，该方法包括将候选化合物与细胞或细胞提取物接触，测定细胞过氧化物阴离子(O2 -)的浓度是否增加，并且测定该化合物是否为血管生成的抑制剂。
根据本发明的第五方面，提供一种在脊椎动物中诱导MPT的方法，其中该方法包括对脊椎动物施用有疗效量的至少一种根据本发明第一至第三方面中任何一个方法检测到的化合物，或者施用有疗效量的包括至少一种该化合物和药学可接受的载体、佐药和/或稀释剂的药物组合物。
根据本发明的第六方面，提供一种在增殖哺乳动物细胞中诱导凋亡的方法，该方法包括对哺乳动物施用凋亡诱导量的根据本发明第一至第三方面中任何一个方法识别的化合物，或者施用有疗效量的包括至少一种该化合物和药学可接受的载体、佐药和/或稀释剂的药物组合物。
根据本发明的第七方面，提供根据本发明第一至第三方面中任何一个识别的化合物在诱导凋亡的药物生产中的用途。
根据本发明的第八方面，提供一种在哺乳动物中抑制血管生成的方法，该方法包括对哺乳动物施用血管生成抑制量的根据本发明第四方面识别的化合物，或者施用有疗效量的包括至少一种该化合物和药学可接受的载体、佐药和/或稀释剂的药物组合物。
根据本发明的第九方面，提供根据本发明第四方面识别的化合物在抑制血管生成的药物生产中的用途。
关于本发明第一至第九方面中的任何一个，在一个实施方式中，该化合物可以是二硫酚反应性化合物。
在另一个实施方式中，该化合物可以具有氧化砷(或氧化砷等效物)部分。
在另一个实施方式中，该氧化砷(或氧化砷等效物)化合物可以具有通式(I)：
A-[(XBX′)nB′-Y]p    (I)
其中
A包括至少一个基本上细胞膜不渗透的侧基；
(XBX′)nB′包括一个合适的连接基团，其中n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数；
Y包括至少一个氧化砷或氧化砷等效物；以及
p是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数。
在一个实施方式中，通式(I)的化合物可以具有多于6个的碳原子。
以下特征涉及通式(I)：
在一个实施方式中，A可以选自天然、非天然和合成的氨基酸，亲水胺，包括二肽、三肽、四肽、五肽的肽和多肽，例如单糖、二糖和寡糖(包括取代的变体)的糖残基，和含有硫醇的蛋白质，或其组合。例如，A可以选自谷胱甘肽、葡糖胺、半胱氨酰甘氨酸、磺基丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、和精氨酸，其中每个含硫化合物的硫原子可以任选地氧化而形成亚砜或砜。在其它实施方式中，A可以包括糖残基，例如葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、来苏糖、半乳糖、己糖、蔗糖、山梨糖、半乳糖-蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇等的二糖或寡糖残基。在其它实施方式中，A可以是亲水胺，例如伯、仲、叔烷基-、芳基-或芳烷基-胺，或例如吡啶、吡咯、咪唑等的杂环胺。
氨基酸是本领域的技术人员所知的，并且在标准参考文献中列出，例如Kingand Stansfield，A Dictionary of Genetics(遗传学字典)，第四版，牛津大学出版社，1990，其内容在此引入作为参考。例如，氨基酸可以是α、β或γ氨基酸。本发明还包括L-和D-型氨基酸。氨基酸的例子包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
在一个实施方式中，A可以选自三酸脲、包括二肽、三肽、四肽和五肽的肽。例如，谷胱甘肽、Cys-Glu-Gly、Arg-Gly-Asp-Cys、Val-Thr-Cys-Gly、Gly-Gly-Cys、Lys-Glu-Gly、Arg-Gly-Asp-Lys、Val-Thr-Lys-Gly、Gly-Gly-Lys、Ser-Glu-Gly、Arg-Gly-Asp-Ser、Val-Thr-Ser-Gly、Gly-Gly-Ser、Asp-Glu-Gly、Arg-Gly-Asp-Asp、Val-Thr-Asp-Gly、Gly-Gly-Asp、Glu-Glu-Gly、Arg-Gly-Asp-Glu、Val-Thr-Glu-Gly、Gly-Gly-Glu等，pressinoic acid、例如3-巯基-1-丙磺酸、巯基丙酸、巯基琥珀酸的小酸分子；例如1-硫代-β-D-葡萄糖、3-巯基-1，2-丙二醇的小醇；小胺，包括例如伯、仲和叔烷基-、芳基-和芳烷基取代的胺；和例如5-巯基-1-四唑乙酸、2-巯基吡啶和2-氨基吡啶的芳香杂环化合物。
在一个实施方式中，A是三肽。例如，A可以是谷胱甘肽，并且在一种形式中该化合物可以由通式(II)代表：
Figure GSA00000096347500031
其中(XBX′)nB′包括任何合适的连接基团，Y包括氧化砷或氧化砷等效物。
在一个实施方式中，p是选自1至5的整数。例如，p可以是1、2、3、4或5。在一个实施方式中，p是1或2。在另一个实施方式中，p是1。
在一个实施方式中，n是选自0至15的整数。例如，n可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一个实施方式中，n是选自0至10的整数。在另一个实施方式中，n是选自0至5的整数，例如，n可以是0、1、2、3、4或5。
在一个实施方式中，X选自-NR、-S(O)-、-S(O)O-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、-C(S)O-、-C(S)S-、-P(O)(R1)-、和-P(O)(R1)O-、或者不存在；
B选自C1-C10亚烷基、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C3-C10环亚烷基、C5-C10环亚烯基、C3-C10杂环亚烷基、C5-C10杂环亚烯基、C6-C12亚芳基、杂亚芳基和C2-C10酰基；
X′选自-NR-、-O-、-S-、-Se-、-S-S-、S(O)-、-OS(O)-、OS(O)O-、-OS(O)2、-OS(O)2O-、-S(O)O-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-OP(O)(R1)-、-OP(O)(R1)O-、-OP(O)(R1)OP(O)(R1)O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-C(S)S-、-P(O)(R1)-、-P(O)(R1)O-、和
Figure GSA00000096347500041
或者不存在；其中E是O、S、Se、NR或者N(R)2 +；
n是0、1或2；并且
B′选自C1-C10亚烷基、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C3-C10环亚烷基、C5-C10环亚烯基、C3-C10杂环亚烷基、C5-C10杂环亚烯基、C6-C12亚芳基、和杂亚芳基或者不存在；并且其中
每个R独立地选自氢、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C3-C10杂环烷基、C5-C10杂环烯基、C6-C12芳基、杂芳基、OR2和C2-C10酰基；
R′与R相同或两个R′可以与连接其的氮原子一起形成5或6员饱和或不饱和杂环；
每个R1独立地选自氢、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C3-C10杂环烷基、C5-C10杂环烯基、C6-C12芳基、杂芳基、卤代、OR2和N(R)2；
每个R2独立地选自氢、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C3-C10杂环烷基、C5-C10杂环烯基、C6-C12芳基、杂芳基和-C(O)R5；
每个R5独立地选自氢、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C3-C10杂环烷基、C5-C10杂环烯基、C6-C12芳基、杂芳基、C1-C10烷氧基、C3-C10烯氧基、C3-C10炔氧基、C3-C10环烷氧基、C5-C10环烯氧基、C3-C10杂环烷氧基、C5-C10杂环烯氧基、C6-C12芳氧基、杂芳氧基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10环烷基硫代、C5-C10环烯基硫代、C3-C10杂环烷基硫代、C5-C10杂环烯基硫代、C6-C12芳基硫代、杂芳基硫代、OH、SH和N(R)2；
其中对于每个B和/或B′是亚芳基的例子，直接连接在各个亚芳基环上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在任何可能的位置，例如可以在对、间或邻位；并且
其中每个亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、杂环亚烷基、杂环亚烯基、亚芳基、杂亚芳基和酰基可以独立地被氢、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C3-C10杂环烷基、C5-C10杂环烯基、C6-C12芳基、杂芳基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5；
Figure GSA00000096347500051
或者
Figure GSA00000096347500052
取代；
其中R、R1和R5如上所定义；并且
R2a选自氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2、N(R)2和-C(O)R5；
每个R3独立地选自氢、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C3-C10杂环烷基、C5-C10杂环烯基、C6-C12芳基、杂芳基、C1-C10烷氧基、C3-C10烯氧基、C3-C10炔氧基、C3-C10环烷氧基、C5-C10环烯氧基、C3-C10杂环烷氧基、C5-C10杂环烯氧基、C6-C12芳氧基、杂芳氧基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10环烷基硫代、C5-C10环烯基硫代、C3-C10杂环烷基硫代、C5-C10杂环烯基硫代、C6-C12芳基硫代、杂芳基硫代、和N(R)2；
每个R4独立地选自氢、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C3-C10杂环烷基、C5-C10杂环烯基、C6-C12芳基、杂芳基、C1-C10烷氧基、C3-C10烯氧基、C3-C10炔氧基、C3-C10环烷氧基、C5-C10环烯氧基、C3-C10杂环烷氧基、C5-C10杂环烯氧基、C6-C12芳氧基、杂芳氧基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10环烷基硫代、C5-C10环烯基硫代、C3-C10杂环烷基硫代、C5-C10杂环烯基硫代、C6-C12芳基硫代、杂芳基硫代、卤代和N(R)2；
R6选自C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C3-C10杂环烷基、C5-C10杂环烯基、C6-C12芳基、杂芳基、C1-C10烷基硫代、C3-C10烯基硫代、C3-C10炔基硫代、C3-C10环烷基硫代、C5-C10环烯基硫代、C3-C10杂环烷基硫代、C5-C10杂环烯基硫代、C6-C12芳基硫代、杂芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5，
R″与R相同或者两个R″与连接其的N原子一起，可以形成饱和的、不饱和的或者芳香的杂环体系；
Q选自卤素和-OS(O)2Q1；其中Q1选自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、对甲基苯基；并且
m是1、2、3、4或者5。
在另一个实施方式中，X选自NH、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、和-C(S)S-、或者不存在；
B选自C1-C5亚烷基、C2-C5亚烯基、C2-C5亚炔基、C3-C10环亚烷基、C5-C10环亚烯基、C6-C12亚芳基和C2-C5酰基；
X′选自-O-、-S-、-NR-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-OP(O)(R1)-、-OP(O)(R1)O-、-OP(O)(R1)OP(O)(R1)O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-C(S)S-、-Se-、
Figure GSA00000096347500061
或者不存在；其中E是O、S或者N(R)2 +；
n是0、1或2；并且
B′是选自亚烷基的C1-C5、C2-C5亚烯基、C2-C5亚炔烯、C3-C10环亚烷基、C5-C10环亚烯基、和C6-C12亚芳基、或者不存在；并且其中
每个R独立地选自氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、OR2和C2-C10酰基；
R′与R相同；
每个R1独立地选自氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、卤代、OR2和N(R)2；
每个R2独立地选自氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、和-C(O)R5；
每个R5独立地选自氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C5炔氧基、C3-C10环烷氧基、C5-C10环烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C10环烷基硫代、C5-C10环烯基硫代、C6-C12芳基硫代、OH、SH和N(R)2；
其中对于每个B和/或B′是亚芳基的例子，直接连接在各个亚芳基环上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在任何可能的位置，例如可以在对、间或邻位，并且
其中每个亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基、和酰基可以独立地被氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、氰基、卤代、氰酸酯、异氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、
Figure GSA00000096347500062
或者取代；
其中R、R1和R5如上所定义；并且
R2a选自氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2、N(R)2和-C(O)R5；
每个R3独立地选自氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C5炔氧基、C3-C10环烷氧基、C5-C10环烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C10环烷基硫代、C5-C10环烯基硫代、C6-C12芳基硫代和N(R)2；
每个R4独立地选自氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C5炔氧基、C3-C10环烷氧基、C5-C10环烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C5环烷基硫代、C5-C5环烯基硫代、C6-C12芳基硫代、卤代和N(R)2；
R6独立地选自C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C5炔基硫代、C3-C10环烷基硫代、C5-C10环烯基硫代、C6-C12芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5，
R″与R相同；
Q选自卤素和-OS(O)2Q1；其中Q1选自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、对甲基苯基；并且
m是1、2、3、4或者5。
在另一个实施方式中，X不存在；
B选自C1-C5亚烷基、C6-C12亚芳基和C2-C5酰基；
X′选自-O-、-S-、-NR-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-Se-、和
Figure GSA00000096347500071
或者不存在；其中E是O、S或者N(R)2 +；
n是0、1或2；并且
B′是C1-C5亚烷基、C6-C12亚芳基或者不存在；其中
每个R独立地选自氢、C1-C5烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、OR2和C2-C5酰基；
R′与R相同；
每个R1独立地选自氢、C1-C5烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、卤代、OR2和N(R)2；
每个R2独立地选自氢、C1-C5烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基和-C(O)R5；
每个R5独立地选自氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C5烯氧基、C3-C10环烷氧基、C5-C10环烯氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C5烯基硫代、C3-C10环烷基硫代、C5-C10环烯基硫代、C6-C12芳基硫代、OH、SH和N(R)2；
其中对于每个B和/或B′是亚芳基的例子，直接连接在各个亚芳基环上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在各个环上的任何可能位置，例如可以在对、间或邻位，并且
其中每个亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、亚芳基、和酰基可以独立地被氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、卤代、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、
Figure GSA00000096347500081
或者取代；
其中R、R1和R5如上所定义；并且
R2a选自氢、C1-C5烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2和-C(O)R5；
每个R3独立地选自氢、C1-C5烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C10环烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C3-C10环烷基硫代、C6-C12芳基硫代和N(R)2；
每个R4独立地选自氢、C1-C5烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C3-C10环烷氧基、C6-C12芳氧基、卤代和N(R)2；
R6选自C1-C5烷基、C3-C10环烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷基硫代、C3-C10环烷基硫代、C6-C12芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5。
R″与R相同；
Q选自卤素和-OS(O)2Q1；其中Q1选自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、对甲基苯基；并且
m是1、2、3、4或者5。
在另一实施方式中，X不存在；
B选自C1-C5亚烷基、C6-C12亚芳基和C2-C5酰基；
X′选自-O-、-S-、-NR-、-C(O)-、和-C(O)O-、或者不存在；
n是1；并且
B′是C1-C5亚烷基、C6-C12亚芳基或者不存在；并且
R选自氢、C1-C5烷基、C6-C12芳基和C2-C5酰基；
其中对于每个B和/或B′是亚芳基的例子，直接连接在各个亚芳基环上的取代基(包括氧化砷或者氧化砷等效物)可以在各个环上的任何可能位置，例如可以在对、间或邻位，并且
其中每个亚烷基、亚芳基、和酰基可以独立地被氢、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基、C3-C10环烷基、C5-C10环烯基、C6-C12芳基、卤代、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、OR2a、SR6、硝基、氧化砷、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)R4R4、-N(R″)2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、
Figure GSA00000096347500091
或者
Figure GSA00000096347500092
取代；
其中每个R独立地选自氢、C1-C5烷基、C6-C12芳基和C2-C5酰基；
R2a选自氢、C1-C5烷基、C6-C12芳基、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2和-C(O)R5；
每个R3独立地选自氢、C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代和C6-C12芳基硫代；
每个R4独立地选自氢、C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C6-C12芳基硫代、卤代和N(R)2；
每个R5独立地选自氢、C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、C6-C12芳氧基、C1-C5烷基硫代、C6-C12芳基硫代、OH、SH和N(R)2；
R6选自C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷基硫代、C6-C12芳基硫代、-S(O)R3、-S(O)2R3和-C(O)R5，
R″与以上R相同；
Q选自卤素和-OS(O)2Q1；其中Q1选自C1-C4烷基、C1-C4全氟烷基、苯基、对甲基苯基；并且
m是1、2、3、4或者5。
在另一个实施方式中，X不存在；
B是C2-C5酰基；
X′是NR；
n是1；
B′是亚苯基；并且
R是H；
其中直接连在亚苯基环上的取代基可以在任何可能的位置，例如由通式(III)所示：
Figure GSA00000096347500093
其中R7至R10独立地选自氢、C1-C5烷基、C6-C12芳基、卤素、羟基、氨基、硝基、羧基、C1-C5烷氧基、-OS(O)2R3和-NHC(O)CH2Q，其中Q是卤素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5和-OS(O)2-对甲苯基；并且其中当R7至R10的任何一个是C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、-OS(O)2R3时，能够与亚苯基形成稠环；而且进一步的，其中R7至R10的至少一个是C1-C5烷基、C6-C12芳基、C1-C5烷氧基、或者-OS(O)2R3，与R7至R10中的其它至少任何一个结合，能够与亚苯基形成稠环。
更典型地，R7至R10独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、C1-C5烷氧基、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苯基和-NHC(O)CH2Q，其中Q是卤素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5和-OS(O)2-对甲苯基。
例如当侧基A是谷胱甘肽时，通式(III)的化合物可以表示为
Figure GSA00000096347500101
此外，当B′是亚芳基时，连在亚芳基环的取代基可以在该亚芳基环的任何可能的位置。例如，该取代基可以在相对于-As＝O基团的间位或对位。
在另一个实施方式中，根据本发明识别的氧化砷化合物选自下列化合物：
Figure GSA00000096347500102
Figure GSA00000096347500111
Figure GSA00000096347500121
化合物“GSAO”(4-(N-(S-谷胱甘肽基乙酰基)氨基)苯基氧化砷，4-(N-(S-glutathionylacetyl)amino)-phenylarsenoxide)已经在先前的国际专利申请WO01/21628中说明，其整个内容在此引入以供相互参考。
可以与ANT相互作用的其它化合物包括根据以下通式(V)说明的化合物：
Figure GSA00000096347500122
其中Q是任何卤素。
可以与ANT相互作用的氧化砷化合物的另一种形式是根据通式(VI)的化合物：
Figure GSA00000096347500123
其中G选自氢、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、羧基、C1-C5烷氧基、C1-C5烷基和C6-C12芳基和-NHC(O)CH2Q，其中Q是卤素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5或-OS(O)2-对甲苯基。
典型地，G选自氢、卤素、羟基、氨基、硝基、羧基、C1-C5烷氧基、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苯基、和-NHC(O)CH2Q，其中Q是包括卤素、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5和-OS(O)2-对甲苯基的基团。
在一个实施方式中，在通式VI的化合物中，G是羟基、氟、氨基或硝基。
在另一个实施方式中，基团G位于相对于氧化砷基团的邻、间或对位。例如，在另一个实施方式中，G在相对于氧化砷基团的邻或对位。
典型地，当基团G与砷原子在相互的邻位或对位上时，该砷原子的活性可以被G改性。例如，当G是例如OH(在生理pH下电离成O-)的供电子基团时，该砷原子可能对二硫酚失活，可能变得更具选择性，例如，只能与反应性非常强的二硫酚反应。另外，当G是例如NO2的吸电子基团时，电子密度可能从砷原子处被拉走，使它对二硫酚更加具有反应性。可以通过操纵G来选择性地抑制一些氧化还原蛋白质，而非其它。
典型地，在这种能与ANT相互作用的氧化砷化合物中，氧化砷基团(-As＝O)可以被氧化砷等效物代替。
氧化砷等效物在本文定义为任何显示出基本与-As＝O相同的对二硫酚亲和性的二硫酚反应物种。典型地，氧化砷等效物包括二硫酚反应性物质，比如As、Ge、Sn和Sb物种。更加典型地，氧化砷等效物可以表示为-D(Z1)(Z2)。期望氧化砷等效物表现出与相应的氧化砷相同的或基本相同的活性。
典型地，对于-D(Z1)(Z2)形式的氧化砷等效物，例如D是As、RSn、Sb、或者RGe，而且Z1和Z2是不稳定的基团(即在生理条件下基团容易被取代)。Z1和Z2可以相同或不同，可以相连或者彼此独立(仅与砷原子相连)。
合适的氧化砷等效物包括：
-D(Z1)(Z2)，
其中Z1和Z2选自OH、C1-C10烷氧基、C6-C10芳氧基、C1-C10烷基硫代、C6-C10芳基硫代、C1-C10烷基硒基、C6-C10芳基硒基，F、Cl、Br和I；
其中E1＝E2＝O，E1＝O并且E2＝S或者E1＝E2＝S；M是R″′，R″″独立地选自氢、C1-C10烷基、C6-C12芳基、卤素、C1-C10烷氧基、C6-C10芳氧基、羟基和羧基；而且n＝1至10。
对于D(Z1)(Z2)形式的氧化砷等效物，当D是As，而Z1和Z2是OH时，该氧化砷等效物可以与聚合的物种相平衡，如下所示。
Figure GSA00000096347500132
关于以上描述的平衡，许多元素的羟基物种与相应的聚合酐存在平衡，砷是这些元素之一(Doak & Freedman，1970)。因此，氧化砷化合物实际上可能作为低或中分子量聚合物存在(例如n＝3至6)。然而，该脱水反应是可逆的，因此可以预料到溶解的聚合酐起到了氧化砷等效物的作用，也就是说，可以预料到它们基本上通过与单体-As(OH)2物种相同的方式连接到空间相邻的二硫酚上。
Figure GSA00000096347500133
其中X3＝NH，Y1＝O；X3＝Y1＝O或者X3＝S，Y1＝O，而R′选自氢、C1-C10烷基、C6-C12芳基、和羧基，或者二十个氨基酸支链之一；
Figure GSA00000096347500141
其中X3＝Y1＝O；X3＝NH，Y1＝O；X3＝S，Y1＝O；X3＝Y1＝NH；或者X3＝S，Y1＝NH；或者X3＝S，Y1＝NH，而R11至R14选自氢、C1-C10烷基、C6-C12芳基、和CO2H；
Figure GSA00000096347500142
其中X3＝Y1＝O，或者X3＝NH，Y1＝O；而R11至R14选自氢、C1-C10烷基、C6-C12芳基、卤素、C1-C10烷氧基、和CO2H。
典型地，(XBX′)B′如上所定义。
缩略语和定义
在本说明书中，缩写MPT代表线粒体通透性转换。
在本说明书中，缩写MPTP代表线粒体通透性转换孔。
在本说明书中，缩写ANT代表腺嘌呤核苷酸易位体。
在本说明书中，EGTA是乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸。
在本说明书中，PAO代表苯基氧化砷。
在本说明书中，术语“包括”是指“主要包括，但不是必须仅有”。而且，由“包括”变化的词，例如“含有”有相一致的意义。
在本说明书中，术语“氧化砷”指的是-As＝O基团。
在本说明书中，写为-As＝O和-As(OH)的基团被认为是同义的。
在本说明书中，术语“氧化砷等效物”指的是任何对二硫酚显示出与-As＝O或As(OH)2基本相同的亲和性的二硫酚反应物种，该术语包括，例如，含有过渡元素的基团，和当溶解在水介质中(例如细胞培养缓冲液和包含于被处理的有机体中的流体)时水解成-As＝O或-As(OH)2的任何三价砷。
在本说明书中，术语“基本上细胞膜不渗透的基团”指的是任何限制化合物穿过细胞膜并进入细胞的速度的基团。基本上细胞膜不渗透的基团可以通过一个或更多例如电荷、大小(分子量)、极性、亲油性、亲水性等的性质限制化合物进入细胞的速度。
本文所使用的术语“砷化物”包括任何含砷的化合物。
本文所使用的术语“酰基”，包括具有末端羰基取代基的单价和二价烷基、烯基、炔基、环烷基和环烯基部分，其中连接可能发生在烃基部分、羰基部分或者两者上。
本文所使用的术语“烷基”，其意义包括单价、饱和、直链和支链烃基。
本文所使用的术语“烯基”，其意义包括具有至少一个双键的单价、直链和支链烃基。
本文所使用的术语“炔基”，其意义包括具有至少一个三键的单价、直链和支链烃基。
本文所使用的术语“亚烷基”，其意义包括二价、饱和、直链烃基。
本文所使用的术语“亚烯基”，其意义包括具有至少一个双键的二价、直链烃基。
本文所使用的术语“亚炔基”，其意义包括具有至少一个三键的二价、直链烃基。
本文所使用的术语“芳基”，其意义包括单价、单环、多环、共轭和稠合的芳香烃基。
本文所使用的术语“亚芳基”，其意义包括二价、单环、多环、共轭和稠合的芳香烃基。
本文所使用的术语“空间相邻的二硫酚”，其意义包括化学结构上相邻的硫醇，以及由于分子构型而空间相邻的硫醇。
本文所使用的术语“环烷基”，其意义包括单价、饱和、单环、双环、多环或稠合多环的烃基。
本文所使用的术语“环亚烷基”，其意义包括二价、饱和、单环、双环、多环或稠合多环的烃基。
本文所使用的术语“环烯基”，其意义包括具有至少一个双键的单价、饱和、单环、双环、多环或稠合多环的烃基。
本文所使用的术语“环亚烯基”，其意义包括具有至少一个双键的二价、饱和、单环、双环、多环或稠合多环的烃基。
本文所使用的术语“卤代”包括氟代、氯代、溴代和碘代。
本文所使用的术语“杂芳基”，其意义包括具有1至12个原子且其中1至6个原子是选自O、N和S的杂原子的单价、单环、多环、共轭和稠合的芳香基。
本文所使用的术语“杂亚芳基”，其意义包括具有1到12个原子且其中1至6个原子是选自O、N和S的杂原子的二价、单环、多环、共轭和稠合的芳香基。
本文所使用的术语“杂环烷基”，其意义包括单价、饱和、单环、双环、多环或稠合的基团，其中1至5个原子是选自O、N或S的杂原子。
本文所使用的术语“杂环亚烷基”，其意义包括二价、饱和、单环、双环、多环或稠合多环的基团，其中1至5个原子是选自O、N或S的杂原子。
本文所使用的术语“杂环烯基”，其意义包括具有至少一个双键的单价、饱和、单环、双环、多环或稠合多环的基团，其中1至5个原子是选自O、N或S的杂原子。
本文所使用的术语“杂环亚烯基”，其意义包括具有至少一个双键的二价、饱和、单环、双环、多环或稠合多环的基团，其中1至5个原子是选自O、N或S的杂原子。
本文所使用的术语“苯基胂酸”被认为与“苯胂酸”同义。
附图说明
图1A-E.通过与ANT反应和对其扰动，由GSAO引发的MTP打开。A GSAO、GSAA、和GSCA的结构。B GSAO引发的线粒体肿胀。肿胀是通过在60分钟过程中，监测伴随的520nm处光散射的降低来测定的。迹线代表对至少两个不同线粒体标本所做的三个试验中最低的。在部分i，线粒体与0(·)、25(о)、50(▲)、100(△)或200(■)μM GSAO一起培养。对于孔打开的阳性对照是150μM Ca2+和6mM Pi(□)。在部分ii，线粒体与0(·)、100μM GSCA(△)、100μM GSAA(▲)或者100μM GSAO(■)一起培养。孔打开的阳性对照是25μM PAO(о)。在部分iii，线粒体与100μM GSAO在没有(■)或与3mM Mg2+
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100μM EGTA(△)、10μMBKA(▲)、5μM CsA或者8mMADP(о)一起培养。未处理的(·)被作为对比。C增加Ca2+浓度使MPTP对GSAO更敏感。线粒体在没有或者在增加的Ca2+浓度下与50(·)、75(о)、100(■)或200μM(□)GSAO一起培育，并且测量半最大肿胀(half-maximal swelling)时间。D用GSAO-B标记ANT。分离的大鼠线粒体在没有(带1)或在四倍摩尔过量的2，3-二巯基丙醇(DMP)存在下(带2)用GSAO-B标记，并且在链霉抗生物素-琼脂糖珠上收集生物素标记的蛋白质，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析ANT。E GSAO与曙红-马来酰亚胺对ANT的Cys160的烷基化作用相竞争。大鼠亚线粒体颗粒在没有(带1)或在GSAO存在下(带2)用曙红-5-马来酰亚胺标记，该曙红标记的ANT通过SDS-PAGE分析，并通过透射检测。
图2.集中在活细胞线粒体中的GSAO。与GSAO-F(i)和Mitotracker Red(ii)一起培养的BAE细胞的共焦显微术，显示化合物在单细胞的线粒体中的共存(colocalisation)。当与DMP(iii和iv)一起培养时，GSAO-F不对细胞着色。五价砷、GSAA-F也不对细胞着色(v和vi)。
图3A-D.GSAO在增殖细胞中，而非生长休眠、内皮细胞中引发的线粒体去 极和凋亡。A GSAO降低了增殖细胞，而非生长休眠、内皮细胞的成活能力。相反，PAO对于两种类型的细胞具有同等的毒性。BAE细胞在含有0.25％血清的培养基中保持24h，然后与GSAO(i)或PAO(ii)一起在含有0.25％或10％血清的培养基中进一步培养48小时。经过48小时处理后，测定附着细胞的数量。结果是三个试验的平均±SE。B GSAO在BAE细胞中引发的线粒体去极和诱导的凋亡。细胞在含有10％血清和GSAO的培养基中培育48小时，然后用JC-1或膜联蛋白V标记。测量对线粒体膜去极(JC-1绿/红荧光)和诱导凋亡(与膜联蛋白V结合)有效的细胞百分数。在两个不同的试验中观察到相同的结果。
图4A-C.在增殖细胞中，而非生长休眠、内皮细胞中，由GSAO抑制ATP生 成并使过氧化物含量增加。A BAE细胞在含有0.5％或10％血清的培养基中培养24小时，然后在GSAO存在下进一步培养24小时。在部分i，细胞ATP水平通过使用荧光素/荧光素霉分析测定。结果是四个试验的平均±SEM。在部分ii，从壬基吖啶橙(NAO)的吸收测定线粒体质量。结果是两个试验的平均±范围。B在BAE细胞中用二氢乙叉基(dihydroethidine)测定的过氧化物含量，该BAE细胞在含有0.5％或10％血清的培养基中培养24小时，然后在GSAO存在下进一步培养24小时。结果是两次试验的平均±范围。C在含有10％血清和GSAO的培养基中培养24小时的BAE细胞中O2 -(y轴)的同时测量。在每一个象限中细胞的百分数显示在最外的角上。
图5A-G.相比于肿瘤细胞，GSAO对内皮细胞选择性的毒性。GSAO对两类原生内皮细胞(A和B)和五种肿瘤细胞系(C-G)的细胞增殖和成活能力的影响。测试四种人类(BxPC-3胰腺、HT1080纤维肉瘤、A549肺、和HL60红细胞白血病(erythroid leukaemia))和一种鼠科动物(LLC肺)的肿瘤细胞系。结果是三个处理的平均±SEM。
图6A-B.由GSAO诱导的线粒体中细胞色素c的释放。A大鼠肝线粒体与100μM GSAO一起培育0-60分钟，而释放到培养基中的细胞色素c通过蛋白质印迹测量。该图显示了蛋白质印迹和相应的量化。B大鼠肝线粒体与0、100μM GSAO、100μM GSAO和5μM环孢霉素A(CsA)一起培养30分钟，或者与150μM Ca2+和6mM Pi一起培养30分钟作为阳性对照。释放到培养基中的细胞色素c通过蛋白质印迹测量。
图7A-F.在小鼠中由GSAO抑制的CAM血管生成以及肿瘤血管生成和肿瘤 生长。A用含有10μg GSAA(上)或GSAO(下)的甲基纤维素盘培养48小时后，CAM的照片。虚点圈显示盘的位置。B每粒5、10或50μg GSAO在5个区域中对抑制血管生成有效的区域数量。GSAA在达到每粒50μg时不抑制CAM血管生成。C-E承受～0.1g BxPC-3(部分C)或HT1080(部分D)肿瘤的SCID小鼠，或者承受～0.1gLLC肿瘤(部分E)的C57BI6/J小鼠，被随机地分成两组(n＝4)，并且用GSAA或GSAO在含有100mM甘氨酸的0.2mL PBS中以10mg/kg/day处理。数据点是肿瘤体积的平均±SE。E部分C所示的试验中的BxPC-3肿瘤的组织切片，经过GSAA或GSAO处理31天后，分析血管生成(CD31)、增殖(PCNA)和凋亡(TUNEL)。
图8.相比于GSAO，化合物1-11、13-15和20-23对BAE细胞的抗增殖活性。
图9.在亚苯基环的邻位或对位具有氧化砷基团的化合物对BAE细胞抗增殖活性的比较。
图10.GSAO和相关类似物对BAE细胞活性与分子量之间的关系。
图11.GSAO和相关类似物对BAE细胞活性与Log P重量之间的关系。
图12.GSAO类似物和GSAO对MPTP的诱导的比较。
图13.GSAO和相关类似物对MPTP的诱导与分子量之间的关系。
图14.GSAO和相关类似物对MPTP的诱导与Log P之间的关系。
图15.对BAE细胞抗增殖活性和MPTP诱导的比较。
图16.GSAO和化合物1与DTT的相互作用的比较。
图17A-D.由GSAO或o-GSAO诱导的线粒体通透性转换。肿胀通过520nm处光散射的降低来测定。分离的线粒体与不同浓度的GSAO(部分A)或o-GSAO(部分B)一起培养。在两个不同试验中随着GSAO或o-GSAO浓度而变的肿胀的半衰期示于部分C。随着GSAO或者PAO浓度而变的肿胀的半衰期示于部分D。在部分A和部分B的阳性对照是150μM Ca2+和6mM Pi(■)。
图18A-B.GSAO或o-GSAO对线粒体通透性转变的影响对钙的依赖关系。线粒体在增加的Ca2+浓度下与不同浓度的GSAO(部分A)或o-GSAO(部分B)一起培养，并且测量半最大肿胀时间。
图19.ANT配体对o-GSAO诱导的线粒体通透性转换的阻碍。线粒体与200μMo-GSAO一起在没有或在EGTA、Mg2+、CsA或ADP存在下培养。阳性对照是150μM Ca2+和6mM Pi(■)。
图20A-B.在含有10％血清的培养基中与GSAO或者o-GSAO一起培养48小时后，附着的BAE(部分A)或者BxPC-3(部分B)细胞的保持量。每一个数据点是三重测定的平均±SE。BAE细胞的结果来自6个(GSAO)或者2个(o-GSAO)不同的试验。
图21A-B.在含有0.25％(о)或10％(·)血清的培养基中与GSAO(A)或者o-GSAO(B)一起培养48小时后，附着的BAE细胞的保持量。每一个数据点是三重测定的平均±SE。
图22.o-GSAO的毒性。Balb-C小鼠(6-8周龄，每组3只)用o-GSAO在0.1mLPBS中以1或10mg/kg/day经皮下处理。该数据点是小鼠重量的平均±SE。
图23A-D.o-GSAO相比于GSAO的抗肿瘤功效。承受～40mm3BxPC-3肿瘤的Balb-C裸鼠被随机地分成四组(每组n＝10或11)，并且用GSAO(部分A)或者o-GSAO(部分B)在0.1mLPBS中以1或10mg/kg/day进行皮下处理。部分C和D是各组小鼠的重量，其中箭头指示处理的开始。该数据点是肿瘤体积或者小鼠重量的平均±SE。由于在11只小鼠中的7只在注射点坏死和发炎(3/11是严重溃疡，4/11是中度溃疡)，用10mg/kg o-GSAO(部分B)的处理在第14天停止。在这组中(部分D)也有一些重量损失。
具体实施方式
本发明涉及识别在线粒体中与ANT结合的化合物的方法，该化合物选择性地在增殖细胞中而不在非增殖细胞中诱导MPT。
ANT是一种30kD的蛋白质，该蛋白质横跨线粒体内膜，并且位于MPTP的中心(Crompton等人，1988)。在ANT的基质一侧，有三个不成对的半胱氨酸-Cys57，Cys160和Cys257。(Halestrap等人，1997)。ANT活性通过与Ca2+、亲环蛋白D和腺嘌呤核苷酸结合来控制。亲环蛋白D(Crompton等人，1988)和腺嘌呤核苷酸(Haworth & Hunter，1979a，b；Haworth & Hunter，2000)结合到ANT的基质一侧，而对于Ca2+的作用点还没确定。有一些已知的MPTP调节剂，似乎通过调节这三种化合物的结合而起作用。主要引发MPTP打开的是基质中Ca2+浓度的升高。Ca2+与EGTA的螯合作用阻碍了孔的打开。Ca2+引发点(可能是在ANT上)的特异性似乎是绝对的，因为例如Mg2+的其它二价金属离子起到抑制剂作用(Haworth &Hunter，1979a)。在亚毫摩尔Ca2+浓度时，使亲环蛋白D与ANT结合对于孔的打开是必要的(Halestrap等人，2002)。环孢霉素A(CsA)通过与亲环蛋白D结合并且将其从ANT置换而阻碍孔的打开(Crompton等人，1988)。基质ADP也是孔打开的重要的调节剂，它与ANT结合并且降低了引发点对于Ca2+的敏感性(Haworth &Hunter，1979a，b)。米酵菌酸(Bonkrekic acid，BKA)也与ANT相互作用并且降低其对于Ca2+的敏感性(Hunter & Haworth，1979)。
一般来说，根据本发明识别在增殖细胞中诱导MPT的化合物的方法，包括将细胞或细胞提取物与候选化合物接触，测定该化合物是否与ANT结合，然后测定该化合物是否选择性地在增殖细胞中诱导MPT。评估一个化合物是否选择性地在增殖细胞中诱导MPT，可以通过比较识别为与ANT结合的化合物对增殖细胞中MPT的影响，和该化合物对非增殖或生长休眠细胞中MPT的影响来测定。
MPT的诱导可以用本领域所知的标准技术监测。例如，对于不同浓度的化合物，分光光度监测特定波长的光散射的变化。合适的波长典型地是520nm。
可以通过使用标准技术检测细胞线粒体对化合物的吸收。例如，可以使用荧光标记化合物或者可以将荧光团连接到化合物上。合适的荧光团的例子包括荧光素和CyTM5.5。化合物的亚细胞位置可以通过标准的技术检测，包括共焦荧光显微技术。此外，化合物可以连接例如生物素的其它可检测的基团，并且通过例如链霉亲和素-Alexa Fluor 488的链霉亲和素染色来检测。
线粒体跨膜电位可以用标准技术评估，包括例如JC-1的染料，和例如膜联蛋白V-FITC的着色剂。通过这些技术能够测定细胞是否经受了MPT，并且评估是否诱导了凋亡。
例如过氧阴离子(O2 -)和氢过氧化物(H2O2)的反应性氧物种，作为ATP产物的副产物而产生，并且在细胞增殖中起到信号中间体的重要作用，但是它们通过破坏脂质、蛋白质、DNA和RNA在较高浓度抑制增殖并且诱导凋亡(Zanetti等人，2001)。O2 -在线粒体中通过Mn过氧化物歧化酶(SOD)转化成H2O2，但是也能够通过阴离子通道从线粒体中释放，并在其中通过胞质Cu/Zn SOD歧化成H2O2(VandenHoek等人，1998)。
本文还公开了识别能够在增殖细胞中诱导凋亡的化合物的方法，其中该方法包括使细胞或细胞提取物与候选化合物接触，测定细胞过氧阴离子(O2 -)的浓度是否增加，然后测定该化合物是否选择性地在增殖细胞而不是非增殖或生长休眠细胞中诱导了凋亡。评估化合物是否选择性地在增殖细胞中诱导凋亡，可以由本领域的技术人员通过比较在增殖细胞中，与在非增殖或生长休眠细胞中，该化合物对细胞过氧阴离子水平的影响而容易地确定。
细胞色素C从线粒体内膜空间的释放也是已知的在细胞中引发凋亡的因素。在增殖细胞(相对于非增殖细胞)中测量细胞色素C水平的变化，可用于识别干扰线粒体功能的化合物。
本文还公开了识别可作为血管生成抑制剂的化合物的方法，其中该方法包括将细胞或细胞提取物与候选化合物接触，测定细胞过氧阴离子(O2 -)的浓度是否增加，并且由此确定该化合物是否是血管生成的抑制剂。
血管生成是指从现有血管中生出新毛细管，并且由增殖的内皮细胞所推动。血管生成在胚胎形成过程中发生，而且是在成人中(Carmeliet & Jain，2001)。普通的成年哺乳动物的血管生成，限定于雌性的生殖周期、伤口愈合和一些病理状况。血管生成是例如风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病视网膜病变和癌症的疾病的关键因素。肿瘤的扩散和转移取决于肿瘤的血管生成(Hanahan & Folkman，1996)。治疗应用
由与ANT结合的化合物干扰MPT可能诱导凋亡。例如过氧阴离子(O2 -)的反应性氧物种在细胞增殖中起到信号中间体的重要作用，然而提高的浓度可以抑制增殖并且诱导凋亡。因此，与ANT结合并且选择性地抑制线粒体功能的化合物，或者相比于非增殖细胞，在增殖细胞中增加过氧阴离子细胞水平的化合物，可能对于治疗脊椎动物的各种疾病和生理情况具有潜在的治疗作用。
此外，细胞色素C从线粒体内膜空间的释放是已知的在细胞中引发凋亡的因素。细胞色素C被认为直接促进了凋亡蛋白酶(caspases)的活化。因此，干扰线粒体功能的化合物(例如通过与ANT结合及诱导MPT)能导致在增殖细胞(相对于非增殖细胞)中细胞色素C细胞水平的增加，并且可能对于治疗脊椎动物的各种疾病和生理情况具有潜在的治疗作用。
失调和疾病的例子可以分组为如下的广泛类别：血管生成依赖性疾病、细胞增殖性疾病(例如牛皮癣、IBD、恶性肿瘤、再狭窄)、炎性失调、自身免疫性疾病、血管病、血栓症、癌症、神经变性病(例如阿兹海默症、帕金森氏病)、骨髓发育异常综合症、缺血/再灌注损伤和器官移植损伤。
典型地，癌症选自致癌肿瘤、上皮源肿瘤，例如结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、头和颈肿瘤、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、前列腺癌和泌尿/生殖道癌；例如肉瘤的间质肿瘤；和例如B细胞淋巴瘤的造血肿瘤。
典型地，癌症是造血肿瘤。更典型地，癌症是固体肿瘤。
本发明其它可能的治疗应用包括炎性失调和/或自身免疫性疾病的治疗，包括以下例子：风湿性关节炎、血清阴性关节炎性皮疹和其它炎性关节炎性皮疹、系统性红斑狼疮、多动脉炎和相关综合症、系统性硬化症、
Figure GSA00000096347500211
综合症和其它炎性眼病、混合性结缔组织病、多肌炎和皮肌炎、风湿性多肌痛症和巨细胞性动脉炎、炎性关节病、非炎性关节病和软组织风湿、反射交感性营养不良。
血管病和血栓症的例子包括：动脉粥样硬化病变进展；例如短暂性缺血、完全中风(completed stroke)和颈动脉手术后的脑血管意外；急性心肌梗死(原发性和继发性)；心绞痛；冠状动脉旁路移植闭塞；经皮经腔内冠脉成形术后闭塞；冠脉内支架术后闭塞；周边动脉血管疾病的血管闭塞；在手术后、或在怀孕中，或在固定中的静脉血栓栓塞性疾病。
小血管病的例子包括：血管球性肾炎；血栓性血小板减少性紫癜；溶血性尿毒综合症；胎盘功能不足和先兆子痫。
本发明也应用于治疗血管综合症和骨髓增生性疾病。
本发明还发现用于识别在下列情况下预防血栓形成的化合物：人工/修复的血管分流和嫁接；修复的心脏瓣；体外循环术；血液灌流和血液透析。
典型地，根据本发明识别的化合物可以与其它已知的治疗剂结合使用，例如外科和/或治疗剂，包括化学治疗剂或者放射治疗剂。例如，当用于治疗固体肿瘤时，根据本发明识别的化合物可以与化学治疗剂一起施用，例如：阿酶素、红豆杉醇、氟尿嘧啶、马法兰、顺铂、α-干扰素、COMP(环磷酰胺、长春新碱、甲氨喋呤和强的松)、依托泊苷、mBACOD(甲氨喋呤、博来酶素、亚德里亚酶素、环磷酰胺、长春新碱和地塞米松)、PROMACE/MOPP(强的松、甲氨喋呤(w/亚叶酸援救)、亚德里亚酶素、环磷酰胺、红豆杉醇、依托泊苷/二氯甲基二乙胺、长春新碱、强的松和甲苄肼)、长春新碱、长春碱、血管抑制素、TNP-470、戊聚糖聚矾、血小板因子4、血管生成抑制素、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、萨利多胺、SP-PG等。其它化学治疗剂包括烷基化剂，例如包括二氯甲基二乙胺、苯丙氨酸氮芥(melphan)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺和异环磷酰胺的氮芥；包括卡氮芥、环己亚硝脲、甲基环己亚硝脲和链脲酶素的亚硝基脲；包括白消安的烷基磺酸盐；包括氮烯唑胺的三嗪；包括噻替派和六甲基三聚氰胺的亚乙基亚胺；包括甲氨喋呤的叶酸类似物；包括5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷的嘧啶类似物；包括6-巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤的嘌呤类似物；包括放射菌素D的抗肿瘤抗生素；包括亚德里亚酶素、博来酶素、丝裂酶素C和methramycin的蒽环酶素；包括三苯氧胺和皮质类固醇的激素和激素拮抗剂，以及包括顺铂和布喹那的各种制剂。
典型地，根据本发明要治疗的生理系统(例如肝系统、胰腺系统)可以在施用本发明的体系前的手术中分离。
化合物或药物组合物的单一或多重给药，可以根据治疗医师选择的剂量水平和方式进行。不管怎样，根据本发明识别的化合物或药物组合物，应该以治疗患者足够有效的化合物的量而提供。
本领域的技术人员能够通过常规试验，确定根据本发明使用的化合物或药物组合物的有效且无毒的量，从而用于检测凋亡细胞和/或治疗或预防失调和疾病。通常，预计有效的剂量范围是每kg体重每24小时大约0.0001mg至大约1000mg；典型地，每kg体重每24小时大约0.001mg至大约750mg；每kg体重每24小时大约0.01mg至大约500mg；每kg体重每24小时大约0.1mg至大约500mg；每kg体重每24小时大约0.1mg至大约250mg；每kg体重每24小时大约1.0mg至大约250mg。更典型地，预计有效的剂量范围在每kg体重每24小时大约1.0mg至大约200mg范围内；每kg体重每24小时大约1.0mg至大约100mg；每kg体重每24小时大约1.0mg至大约50mg；每kg体重每24小时大约1.0mg至大约25mg；每kg体重每24小时大约5.0mg至大约50mg；每kg体重每24小时大约5.0mg至大约20mg；每kg体重每24小时大约5.0mg至大约15mg。
另外可选的，有效剂量可能高达大约500mg/m2。通常，预计有效的剂量范围是大约25至大约500mg/m2，优选大约25至大约350mg/m2，更优选大约25至大约300mg/m2，进一步优选大约25至大约250mg/m2，仍进一步优选大约50至大约250mg/m2，更进一步优选大约75至大约150mg/m2。
关于本文公开的氧化砷(或者氧化砷等效物)化合物，有效的剂量范围可以是每kg体重每24小时大约0.0001mg至大约100mg化合物。例如，有效的剂量范围可以是每kg体重每24小时大约0.001mg至大约100mg化合物。例如，有效的剂量范围可以是每kg体重每24小时大约0.01mg至大约50mg化合物。例如，有效的剂量范围可以是每kg体重每24小时大约0.1mg至大约20mg化合物。例如，有效的剂量范围可以是每kg体重每24小时大约0.1mg至大约10mg化合物。
关于与根据本发明识别的化合物一起使用的附加活性剂，有效的剂量范围可以是每kg体重每24小时大约0.0001mg至大约100mg制剂，优选每kg体重每24小时大约0.001mg至大约100mg制剂，更优选是每kg体重每24小时大约0.01mg至大约50mg制剂，进一步优选每kg体重每24小时大约0.1mg至大约20mg制剂，仍进一步优选每kg体重每24小时大约0.1mg到大约10mg制剂。
缓释制剂也包括在本发明的范围内。
典型地，该化合物可以在病症治疗期间施用。
此外，根据本发明使用的化合物的最佳用量和每次剂量的间隔，将通过所治疗病症的本质和程度、施药的形式、程序和施用点，以及所治疗的特定脊椎动物的本质来决定，这对于本领域的普通技术人员是显而易见的。同样，此最佳条件可以通过常规技术来确定。
最佳的疗程，例如对于特定天数每天化合物的施用剂量，可以由本领域的技术人员应用常规疗程的测定试验来确定，这对于本领域的普通技术人员也是显而易见的。
根据本发明方法识别的化合物可以单独施用，通常优选该化合物作为药物组合物/制剂而施用。可以根据本领域普通技术人员所熟知的方法制备常规药物制剂，由此可以含有药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐药。
本发明将通过以下实施例进一步举例说明。
实施例1
化合物的合成
方法
GSAA的合成
通过Donoghue等人(2000)和WO 01/21628说明的方法的改进方法制备BRAA。将对氨苯基胂酸(20.6g，95mmol)分批加入碳酸钠(20g，189mmol)的水溶液(200mL)中。当所有固体溶解后，发现该溶液的pH是10，然后在4℃冷却2小时。将溴乙酰溴(15mL，173mmol)的无水二氯甲烷(35mL)溶液分两部分加入，每次加入后强烈地摇动2～3分钟。将该混合物静置几分钟，并且将较低的有机层排出。通过滴加98％硫酸将溶液酸化至大约pH 2-3，使4-(N-(溴乙酰)氨基)苯胂酸(BRAA)沉淀，然后通过真空过滤收集并干燥，得到为白色固体的BRAA。
将BRAA(3.38g，10mmol)、还原型谷胱甘肽(3.23g，10.5mmol)和碳酸氢钠(3.15g，37.5mmol)一起混合，并将该固体混合物分批溶解于0.5M的碳酸氢盐缓冲液(100mL)中。发现该清澈溶液的pH是9，并彻底混合，在室温下过夜。第二天，滴加32％盐酸将该溶液酸化到中性pH，通过将该酸化的溶液滴加到充分搅拌的无水乙醇(1L)中使产物从醇中沉淀。将该混合物在室温下搅拌1小时，然后静置3小时直到析出沉淀。将乙醇清液倒出并保留～300mL，然后在2000g旋转离心5分钟。产物4-(N-((S-谷胱甘肽基)乙酰基)氨基)苯胂酸(GSAA)通过在新鲜的无水乙醇中重悬浮和再离心而洗涤。将此洗涤过程再重复两次，通过旋转蒸发将最终的悬浮液旋干而得到为白色固体的GSAA。GSAA通过1H-NMR(D2O，300MHz)和13C-NMR(D2O，75MHz)表征，分子量是564。
GSAO的合成
GSAO的完整合成在国际专利申请WO 01/21628中说明，其全部内容在此引入作为交叉参照。BRAA由以上描述的方法制备。然后通过Donoghue等人(2000)说明的方法，将BRAA转化成4-(N-(溴乙酰)氨基)苯亚胂酸(BRAO)。BRAO转化成GSAO的过程是Donoghue等人(2000)说明的方法的改进，该方法如下。将还原型谷胱甘肽(16g，52mmol)在氮气氛下溶解在脱氧水(1L)中(脱氧水的制备是在氮气氛下，通过煮沸然后冷却到室温而进行)。将BRAO(25g，77mmol)悬浮于该溶液中，并将该混合物强烈地搅拌直到未溶解的BRAO失去漂浮的趋势，这时降低搅拌速度。在氮气氛下，加入三乙胺(16mL，11.6g，115mmol)，并将混合物搅拌至少18小时。通过快速真空过滤将一些无色的固体除去，并将滤液在旋转蒸发仪中浓缩成粘性凝胶。用乙醇(250mL)稀释该凝胶，增加搅拌速度，然后加入丙酮(250mL)，从而形成白色固体。在氮气下搅拌2小时后，将固体用真空过滤收集，并在室温下真空干燥到恒重。通过1H-NMR分析该材料而测定三乙胺的量。以10M水溶液的形式将一当量的氢氧化钠(即每mmol三乙胺对应1mmol NaOH)加入该材料的最少量脱氧水溶液中。在氮气下将该溶液搅拌2小时，通过在旋转蒸发仪中移除溶剂而得到GSAO(作为钠盐)。通过以下方法表征GSAO：1H-NMR(D2O，400MHz)、13C-NMR(D2O，100MHz)、HPLC和红外光谱(石蜡糊)。元素分析符合GSAO.2H2O的组成，而质谱得到在549.1m.u.[GSAO+H]+的原分子离子。通过HPLC分析GSAO的纯度＞94％。
GSCA的合成
GSCA通过与GSAA相似的方法制备，如下使用4-氨基苯甲酸代替对氨苯基胂酸。通过以上说明的对氨苯基胂酸的制备方法，制备冷却的4-氨基苯甲酸(13g，95mmol)碱性溶液，并以同样的方式与溴乙酰溴反应。排出较低的有机层，而4-(N-(溴乙酰)氨基)苯甲酸(BRCA)自身直接从溶液中析出。完全按照GSAA下面的制备方法，只是用BRCA(2.58g，10mmol)代替BRAA，在旋转蒸发后获得为白色固体的GSCA。GSCA通过1H-NMR(D2O，300MHz)和13C-NMR(D2O，75MHz)表征，并且其二钠盐的分子量是528。
GSAO和GSAA的生物素和荧光素衍生物的合成
GSAO-B按照Donoghue等人(2000)说明的方法生成，其分子量是1001。将荧光素-5-EX琥珀酰亚胺酯(Molecular Probes，Eugene，OR)(2.4mg，4.1μmol)的DMSO(240μL)溶液加入含GSAO或GSAA(33.8mM)的Mes缓冲液中，pH 5.5(5mM，473μL)，将该混合物用碳酸氢盐缓冲液，pH 9(0.5M，3.287mL)稀释，并且在室温静置80分钟。然后用含甘氨酸(100mM)的PBS(4mL)稀释该反应，并在室温下静置过夜。最终的溶液含有三价砷(2.00mM)和甘氨酸(50mM)。荧光素-5X与GSAO或者GSAA的摩尔比是～1.5∶1。GSAO-和GSAA-荧光素(GSAO-F和GSAA-F)的分子量分别是1024和1040。
2-(2-溴乙酰邻氨基)苯胂酸的合成
将邻氨基苯基胂酸(4.70g，21.7mmol)溶解在1.85M KOH(25mL)中，然后用Na2CO3(6g)处理，并用H2O(25mL)稀释。该溶液在冰中冷却30分钟，然后加入250mL的分液漏斗中。将溴乙酰溴(4mL，46.0mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液经过大约30分钟小心地加入分液漏斗中，并频繁地摇动，释放出CO2(g)。在停止放出CO2后，将CH2Cl2分离，水层用浓H2SO4酸化。所得白色沉淀通过过滤收集(6g，82％产率)。
2-(2-溴乙酰邻氨基)苯亚胂酸的合成
将2-(2-溴乙酰氨基)苯胂酸(6g，17.8mmol)溶解于HBr/MeOH(1∶1)中。加入NaI(80mg)，该反应用N2换气并冷却到0℃。SO2以大约4个泡/秒的速度通入，15分钟后开始形成白色沉淀。在反应升至室温后，进一步通入SO22.5小时。随后反应用N2换气10分钟，通过过滤收集固体，并用H2O(×3)、醚(×2)洗涤，得到1.35g 2-(2-溴乙酰氨基)苯亚胂酸。从初始滤液中进一步得到0.25g。总产率(1.60g，28％)。
2-(2-溴乙酰对氨基)苯胂酸的合成
将对氨苯基胂酸(20g，92mmol)溶解在1.85M KOH(100mL)中，然后用Na2CO3(30g)和H2O(100mL)处理。该溶液在冰中冷却30分钟，然后加入500mL的分液漏斗中。往分液漏斗中小心地加入溴乙酰溴(16mL，184mmol)的CH2Cl2(60mL)溶液，并频繁地摇动，释放出CO2(g)。此过程大约经过2小时。在停止放出CO2(g)后，将CH2Cl2分离，水层用98％H2SO4酸化。所得白色沉淀通过过滤收集，并在干燥器中干燥18小时。得到24g(72mmol，78％产率)。
2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯胂酸(15g，45mmol)溶解在150mL 48％的HBr(水)/MeOH(1∶1)中。加入NaI(200mg，13mmol)，该反应用N2换气并在冰中冷却。SO2(g)以大约2个泡/秒的速度通入，5小时后，开始形成白色沉淀。反应加温到25℃后，进一步通入SO2(g)2小时。反应用N2换气10分钟，通过过滤收集固体，再用H2O(×3)、醚(×2)洗涤，得到1.35g 2-(2-溴乙酰氨基)苯亚胂酸。获得5.5g(17mmol，38％产率)。
NH2-Glu-Cys-(CH2CONH-C6H4-o-As{OH}2)-Gly-OH“o-GSAO”(1)的合成
将2-(2-溴乙酰氨基)苯亚胂酸(288mg，0.90mmol)悬浮在脱气H2O(5mL)中。加入NEt3(250μL，1.7mmol)，随后加入谷胱甘肽(160mg，0.521mmol)。该反应混合物的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌20小时。将该反应通过玻璃烧结的过滤器过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将上层清液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体移出并在真空下进一步干燥。将干燥的粉末状o-GSAO溶解在H2O(4mL)中，并注入半制备的HPLC，C18 Vydac Protein & Peptide柱中。缓冲液A：含0.1％TFA的过滤和脱气水；缓冲液B：含0.1％TFA的过滤和脱气乙腈-过滤和脱气水(9∶1)。收集馏分并冻干。o-GSAO的结构由LC-MS(M+548.4)和1H-NMR确定。分四批用HPLC纯化的纯度是96.9％～98.8％。
Retro-HO-Cys-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-羰基-Glu-OH(3)的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸(80mg，0.25mmol)悬浮于脱气H2O(2mL)中。加入NEt3(70μL，0.5mmol)，随后加入retro-HO-Cys-羰基-Glu-OH(50mg，0.17mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
Retro-HO-Cys-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-羰基-Glu-OH(4)的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸(80mg，0.25mmol)悬浮在脱气H2O(2mL)中。加入NEt3(70μL，0.5mmol)，随后加入Retro-HO-Cys-羰基-Glu-OH(50mg，0.17mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
H-Arg-Gly-Asp-Cys(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-OH(6)的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸(80mg，0.25mmol)悬浮于脱气H2O(4mL)中。加入NEt3(70μL，0.5mmol)，随后加入H-Arg-Gly-Asp-Cys-OH(50mg，0.11mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
H-Gly-Gly-Cys(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-OH(7)的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸(288mg，0.90mmol)悬浮在脱气H2O(4mL)中。加入NEt3(220μL，1.6mmol)，随后加入H-Gly-Gly-Cys-OH(141.2mg，0.6mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
H-Val-Thr-Cys(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-Gly-OH(8)的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸(80mg，0.25mmol)悬浮在脱气H2O(4mL)中。加入NEt3(70μL，0.5mmol)，随后加入H-Val-Thr-Cys-Gly-OH(50mg，0.13mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
H-Cys-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-Tyr-PHe-Gln-Asn-Cys-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-OH(9)的合成
Pressionoic acid的还原：将该肽溶解于用N2脱气的10mL 0.1M碳酸氢钠的DTT溶液(99mg，0.65mmol)中。该溶液的pH确定为pH≥8，并且用N2覆盖混合物。在用AcOH将溶液酸化2小时后，将混合物冻干。溶解于0.1％TFA水溶液中，然后通过半制备的RP-HPLC提纯。冻干。
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸(26mg，0.081mmol，1.4eq.)悬浮于脱气H2O(3mL)中。加入Net3(20μL，0.14mmol)，随后加入pressionoic acid(22mg，0.028mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
3-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-1-丙磺酸(10)的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸(288mg，0.90mmol)悬浮在脱气H2O(4mL)中。加入Net3(220μL，1.6mmol)，随后加入3-巯基丙磺酸(106.9mg，0.6mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
3-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-1-丙酸(11)的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸酸(288mg，0.90mmol)悬浮在脱气H2O(4mL)中。加入Net3(210μL，1.5mmol)，随后加入巯基丙酸(53μL，0.6mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mLEtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
1-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-巯基琥珀酸(13)的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸(288mg，0.90mmol)悬浮在脱气H2O(4mL)中。加入Net3(210μL，1.5mmol)，随后加入巯基琥珀酸(90mg，0.6mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mLEtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
1-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-β-D-葡萄糖(14)的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸(288mg，0.90mmol)悬浮在脱气H2O(4mL)中。加入Net3(210μL，1.5mmol)，随后加入1-硫代-β-D-葡萄糖(130.9mg，0.6mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
3-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-1，2-丙二醇(15)的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸(288mg，0.90mmol)悬浮在脱气H2O(4mL)中。加入Net3(210μL，1.5mmol)，随后加入3-巯基-1，2-丙二醇(65μL，0.6mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
5-S-(CH2CONHC6H4-p-As{OH}2)-1-四唑乙酸(21)的合成
将2-(2-溴乙酰对氨基)苯亚胂酸(288mg，0.90mmol)悬浮在脱气H2O(5mL)中。加入Net3(210μL，1.5mmol)，随后加入5-巯基-四唑乙酸(110mg，0.6mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌16小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mLEtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
H-Gly-Gly-Cys(CH2CONHC6H4-o-As{OH}2)-OH(22)的合成
将2-(2-溴乙酰邻氨基)苯亚胂酸(160mg，0.5mmol)悬浮在脱气H2O(1mL)中。加入NEt3(140μL，1.0mmol)，随后加入H-Gly-Gly-Cys-OH(61mg，0.26mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌20小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
H-Val-Thr-Cys(CH2CONHC6H4-o-As{OH}2)-Gly-OH(23)的合成
将2-(2-溴乙酰邻氨基)苯亚胂酸(80mg，0.25mmol)悬浮在脱气H2O(1mL)中。加入Net3(70μL，0.50mmol)，随后加入H-Val-Thr-Cys-Gly-OH(50mg，0.13mmol)。该溶液的pH确定为pH≥8。在N2下将白色悬浮液剧烈搅拌20小时。该反应通过一次性的0.45μM过滤盘过滤，滤液在旋转蒸发仪上浓缩。将残留物转移到塑料试管中，并加入2mL EtOH/丙酮(1∶1)，从而得到白色沉淀。在试管上封盖并在4℃储存1.5小时。将溶液离心并倒出而剩下白色固体，将该白色固体再溶解到MeCN-水中。粗样由RP-HPLC和LCMS分析。产品用半制备的RP-HPLC提纯。组分在旋转干燥仪上干燥。
砷浓度的分析
GSAO、GSAO-B和GSAO-F的浓度通过用二巯基丙醇滴定并用5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(Sigma，St.Louis，MO)计算剩余的自由硫醇来测量(Donoghue等人，2000)。将合成物无菌过滤，并在使用前储存于4℃的阴暗处。当在这样的条件下储存至少一周后，砷储藏液的活性浓度没有大的损失。
实施例2
GSAO通过与ANT反应和干扰ANT而引发的MTP打开
方法
线粒体肿胀分析
线粒体通过使用前述的差速离心法(Schnaitman & Greenawalt，1968)从～250g雄性Wistar大鼠的肝脏分离。最终的线粒体球以每毫升30mg蛋白质的浓度，重悬浮于含有213mM甘露醇、71mM蔗糖和10mM琥珀酸钠的3mM HEPES-KOH，pH 7.0缓冲液中。MPT的诱导，是通过在25℃将该肝脏线粒体以每毫升0.5mg蛋白质的浓度悬浮于含有75mM甘露醇、250mM蔗糖、10mM琥珀酸钠和2μM鱼藤酮的3mM HEPES-KOH，pH 7.0缓冲液中，由分光光度评估的。所有缓冲液组分来自于Sigma，St.Louis，MO。将砷衍生物和GSCA溶解于含有100mM甘氨酸的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。使用的与ANT结合的化合物是CsA、BKA和ADP(Sigma，St.Louis，MO)。试剂浓度在图注中表示。肿胀通过使用Molecular DevicesThermomax Plus(Palo Alto，CA)酶标仪，监测与肿胀相关的520nm处光散射的降低来测量。
GSAO与ANT的结合
大鼠肝脏线粒体在25℃以每毫升1mg蛋白质的浓度悬浮于含有213mM甘露醇、71mM蔗糖和10mM琥珀酸钠的3mM HEPES-KOH，pH 7.0缓冲液中，并与100μM GSAO-B一起，在没有或有400μM 2，3-二巯基丙醇(Fluka，Buchs，SG，Switzerland)存在下，在旋转轮上于室温培养1小时。该标记的线粒体用PBS洗涤三次，然后在0.3mL冰冷却的25mM Tris，pH 7.4缓冲液中经声波处理，该缓冲液含有140mM NaCl、2.7mM KCl、0.5％ Triton X-100、0.05％Tween-20、10μM亮抑酶肽、10μM抑酶肽、50μg.mL-1 4，2-(氨乙基)-苯磺酰氟和5mM EDTA。溶胞产物通过于4℃在18000g离心10分钟而澄清，然后与30μL链霉亲和素-dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)一起于4℃在旋转轮上培养60分钟，以分离该生物素标记的蛋白质。该珠粒用声波处理缓冲液洗涤5次，然后通过在30μLSDS-Laemmli缓冲液中煮沸2分钟使生物素标记的蛋白质从该珠粒中释放出来。样本在还原条件下被8-16％梯度iGels分解，并转移到PVDF膜。蛋白质通过蛋白质印迹法，使用1∶500山羊抗人ANT多克隆抗体稀释液(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)和1∶2000兔抗山羊过氧化物酶连接的抗体稀释液(Dako，Carpinteria，California)检测。
用曙红-5-马来酰亚胺标记ANT
大鼠肝脏亚线粒体颗粒根据Majima等人(1998)的方法，通过声波处理和差速离心法制备。该颗粒以每毫升20mg蛋白质的浓度悬浮在含有250mM蔗糖和0.2mM EDTA的10mM Tris，pH 7.2的缓冲液中，并于25℃在不存在或每毫克蛋白质存在200nmol GSAO的条件下培养10分钟，随后于0℃在阴暗处与每毫克蛋白质20nmol的曙红-5-马来酰亚胺一起培养1分钟。该标记通过以每毫克蛋白质加入10μmol二硫苏糖醇而终止。该蛋白质被4-20％梯度iGels分解，并且该曙红标记的ANT通过UV透照法用Fluor-STM Multilmager(Bio-Rad，Hercules，CA)显像。
结果
GSAO(图1A)引发分离的大鼠肝脏线粒体的肿胀(图1Bi)。肿胀速度随着GSAO浓度和培养时间的增加而增加。GSAO的三价砷部分是造成这种活性的原因，因为相应的五价砷(4-(N-((S-谷胱甘肽基)乙酰基)氨基)苯胂酸，GSAA)或者羧酸(4-(N-((S-谷胱甘肽基)乙酰基)氨基)苯甲酸，GSCA)化合物(图1A)是没有效果的(图1Bii)。孔打开的阳性对照是Ca2+和Pi离子(图1Bi)和PAO(图1Bii)。
ANT的活性通过与Ca2+、亲环蛋白D和腺嘌呤核苷酸的结合来控制。亲环蛋白D(Crompton等人，1988)和腺嘌呤核苷酸(Haworth & Hunter，1979a，b)与ANT的基质一侧结合，而对Ca2+的相互作用点还未确定。主要引发MPTP打开的是基质中Ca2+浓度的升高。Ca2+与EGTA的螯合作用阻碍了孔的打开。Ca2+引发点的特异性似乎是绝对的，因为例如Mg2+的其它二价金属离子起到抑制剂作用(Haworth &Hunter，1979a)。在亚毫摩尔Ca2+浓度时，使亲环蛋白D与ANT结合对于孔的打开是必要的(Halestrap等人，2002)。环孢霉素A(CsA)通过与亲环蛋白D结合并且将其从ANT置换而阻碍孔的打开(Crompton等人，1988)。基质ADP也是孔打开的重要的调节剂，它与ANT结合并且降低了引发点对于Ca2+的敏感性(Haworth &Hunter，1979a，b)。米酵菌酸(Bonkrekic acid，BKA)也与ANT相互作用并且降低其对于Ca2+的敏感性(Hunter & Haworth，1979)。
Mg2+、EGTA、CsA、ADP和BKA都阻碍了GSAO对于孔打开的效果(图1Biii)。这些结果与GSAO对于孔打开的特异影响是一致的，并支持了ANT作为其目标。
GSAO引起的线粒体肿胀的半衰期通过加入Ca2+而降低(图1C)。这个结果与GSAO交联ANT上突向线粒体基质的三个半胱氨酸残基中的两个是一致的。
ANT与生物素标记的GSAO(4-(N-(S-(N-(6-((6-((生物素酰基)氨基)己酰基)氨基)己酰基)谷胱甘肽基)乙酰基)氨基)苯基氧化砷，GSAO-B)的直接相互作用，显示在图1D中。用GSAO-B标记ANT是特效的，因为它与四倍摩尔过量的小分子合成二硫酚、二巯基丙醇竞争。曙红-马来酰亚胺在ANT中使Cys160烷基化(Majima等人，1998)，并阻碍ADP的结合(Halestrap等人，1997)。GSAO与曙红-马来酰亚胺对ANT的Cys160的烷基化作用相竞争(图1E)，这意味着GSAO交联Cys160和Cys257。
实施例3
GSAO在活细胞线粒体中集中
方法
细胞培养
牛主动脉线粒体(BAE)细胞(ATCC，Rockville，MD)在补充了10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、和5U.mL-1青霉素/链霉素(Gibco，Galthersburg，MD)的DMEM中培养。人微血管内皮细胞系HMEC-1(Ades等人，1992)，在补充了10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、和5U.mL-1青霉素/链霉素、10ng.mL-1表皮生长因子(Sigma，St.Louis，MO)和1μg.mL-1氢化可的松(Sigma)的MCDB131培养基(Gibco)中培养。细胞培养塑料皿购自Corning Costar(Corning，NY)。胰蛋白酶/EDTA溶液来自Gibco。
免疫细胞化学和共焦显微术
BAE细胞以每孔104细胞的密度植入8孔的Labtek玻璃小室载玻片(Nunc，Naperville，1L)并帖壁过夜。将细胞洗涤一次，然后用Hanks平衡盐溶液(HBSS)(Gibco)替换培养基。随后将该细胞与50μM GSAO-F、50μM GSAO-F和250μM二巯基丙醇、或50μM GSAA-F一起培养1小时。所有的细胞用100nMMitotrackerTM Red CMXRos(Molecular Probe，Eugene，OR)对染。然后用HBSS将该细胞洗涤三次，用80％丙酮和20％甲醇固着10分钟，再用HBSS洗涤三次。将载玻片安放于VectaShield抗衰减剂(Vector Laboratories，Burlingame，CA)中，并用指甲油密封。图像通过使用Leica DM IRB倒置显微镜和共焦系统，应用Leica共焦软件记录。
结果
GSAO的一个显著特征是它快速地定位到活的牛大动脉(BAE)(图2)和人真皮微脉管(HMEC-1)(数据未显示)内皮细胞的线粒体上。将GSAO接合到荧光素(GSAO-F)，而其亚细胞定位通过共焦荧光显微术确定。线粒体染色通过GSAO-F与红荧光素Mitotracker探针的共存而确认，并聚集在活性呼吸细胞线粒体上(图2ii、iv和vi)。GSAO-F线粒体的聚集对于GSAO的二硫酚反应性是特效的，它在五倍摩尔过量的小分子合成二硫酚，二巯基丙醇的存在下消除(图2iii)，而且相应的五价砷GSAA-F不对细胞染色(图2v)。线粒体定位同样在与GSAO-B一起培养然后用链霉亲和素-Alexa Fluor 488染色的BAE细胞中可见(数据未显示)。
在线粒体内膜中富有ANT。GSAO在ANT基质面上的多价螯合作用，使其熵有利于推动GSAO进入基质。与GSAO实际上具有相同电荷和大小的GSAA，不与ANT反应或在线粒体上聚集，这一发现使这个机理得到了支持。
实施例4
GSAO抑制ATP产生，增加过氧化物含量，并在增殖细胞中而不在非生长休眠、内皮细胞中引发线粒体去极和凋亡
方法
ATP分析
将6孔培养板中的BAE细胞在0.5％血清或在10％血清中保留24小时，然后用0、60或150μM GSAO处理24小时。将该细胞洗涤一次，然后重悬浮于含有0.3％牛血清白蛋白的0.4mL PBS中。将50μL的细胞样品与50μL水和100μL ATP释放剂(Sigma)混合，并且ATP的浓度用荧光素/荧光素酶ATP分析混合物(Sigma)测量。通过使用ATP标准液代替50μL水，将光亮度单位转化成ATP浓度。细胞数量使用Beckman粒子计数器计量，ATP的摩尔数表达为每百万个细胞。
细胞增殖分析
BAE或HMEC-1细胞以每孔104细胞的密度植入96孔板中，并帖壁过夜，然后如指示的处理。关于涉及在0.25％血清中抑制细胞增殖的试验，将该细胞植入含有10％血清的培养基中，使其帖壁过夜，然后用PBS洗涤，再于含有0.25％血清的培养基中保留24小时。处理后剩余的附着细胞用亚甲蓝测量(Oliver等人，1989)。过氧化物、线粒体膜电位、线粒体质量和凋亡分析
为了用二氢乙叉基测量过氧化物含量、用JC-1测量线粒体膜电位、用壬基吖啶橙测量线粒体质量、用膜联蛋白V测量凋亡，增殖或生长休眠BAE细胞用GSAO在6孔培养板中处理24小时或48小时，然后用胰蛋白酶/EDTA分离，洗涤一次，并以每毫升2×106细胞重悬浮于无血清的培养基中。然后将细胞与二氢乙叉基(5μM，Molecular Probes)一起在室温培养15分钟，或与JC-1(0.5μg.mL-1，MolecularProbes)、膜联蛋白V-FITC(50μl.mL-1)(Pharmingen，La Jolla，CA，USA)、或吖啶橙10-壬基溴(5μM，Molecular Probes)一起在室温培养30分钟。然后将细胞洗涤一次，重悬浮于0.5mL无血清的培养基中，转移到冰中，荧光直接通过流式细胞术定量。
结果
GSAO在活细胞的线粒体中聚集，并干扰线粒体功能和细胞成活力。增殖细胞比生长休眠细胞具有更大的线粒体质量和呼吸作用。为了检测GSAO是否对增殖细胞具有选择性的影响，将增殖或生长休眠BAE细胞与浓度增加的GSAO一起培养48小时。
降低增殖BAE细胞成活力的GSAO IC50是～75μM(图3Ai)，而该化合物对生长休眠细胞几乎无影响。对照化合物GSAA和GSCA，在浓度高达1.0mM时，对于增殖BAE细胞没有明显的影响(数据未显示)。GSAO对于增殖细胞成活力的影响是随时间变化的。当培养时间从48小时增长到72小时，GSAO IC50从～75μM降低到～25μM(数据未显示)。相反，PAO对于增殖和生长休眠BAE细胞具有同等毒性，其IC50是～200nM(图3A(ii))。用HMEC-1细胞也观察到相同的结果(数据未显示)。GSAO对增殖内皮细胞成活力的影响，是与线粒体跨膜电位的损失和凋亡紧密相关的(图3B)。这些参数分别用JC-1染料和FITC-接合的膜联蛋白V测量。JC-1在细胞溶质(绿荧光)和线粒体(红荧光)的分布比例，反映了线粒体跨膜电位(Smiley等人，1991)，而结合到磷脂酰丝氨酸的膜联蛋白V暴露在凋亡细胞的表面。
在增殖内皮细胞中GSAO与ANT的结合影响ATP的产生。增殖BAE细胞的ATP含量大约是生长休眠细胞的两倍，而与GSAO一起培养24小时使增殖细胞中ATP的含量降低到生长休眠细胞的水平(图4ai)。这个结果反映了GSAO对增殖细胞成活力的选择性影响(图4ai)。为了证实细胞ATP的降低是由于GSAO对线粒体ATP合成的影响而不是因为线粒体生物起因，用壬基吖啶橙测量线粒体质量。该染料在线粒体膜中结合到心磷脂(Petit等人，1992)。增殖细胞的线粒体质量大约是生长休眠细胞的两倍，该质量经过GSAO处理是不变的(图4aii)。
在高浓度时，例如过氧化阴离子(O2 -)的反应性氧物种能够抑制细胞增殖并诱导凋亡。为了测试GSAO对O2 -细胞水平的影响，将BAE细胞用GSAO处理24小时，而O2 -和H2O2的细胞水平分别用二氢溴乙非啶和CM-H2-DCFDA染料测量。在增殖的，但非生长休眠的BAE细胞中，O2 -细胞水平随着GSAO浓度线性地增加(图4b)。GSAO的这一影响不是由于抑制SOD活性，因为H2O2水平仅有很小的降低(图4c)。例如，用120μM GSAO处理24小时导致H2O2降低30％，但是O2-水平增加100％。这一发现通过使用双通道流式细胞术分析细胞O2 -和H2O2水平而证实。O2 -水平在大多数细胞中增加，而H2O2没有相应的降低(数据未显示)。相反，GSAA对O2 -或H2O2平没有影响。O2 -水平随着GSAO处理而线性地增加，与线粒体完整性的破坏相一致。
实施例5
GSAO引发细胞色素C从线粒体中释放
为了辨别GSAO的抗增殖与促凋亡效果，处理细胞用碘化丙锭(PI)染色以检测凋亡晚期或死细胞。用GSAO处理48小时后，细胞的总数量和PI-阳性的细胞比例通过流式细胞术测量。
BAE(图5a)或者原代人真皮微脉管内皮(图5b)细胞的增殖抑制的IC50分别是～10μM和～15μM。成活性的损失的IC50分别是～75μM和～35μM，这意味着相比于诱导调亡所需浓度，GSAO在较低的浓度下抑制增殖。牛血管平滑肌细胞的增殖抑制的IC50是～30μM。相反，所有测试的肿瘤细胞更耐GSAO(图5c-g)。肿瘤细胞中导致增长抑制的GSAO浓度，是内皮细胞中的3至＞32倍，肿瘤细胞中导致成活力损失的GSAO浓度，是内皮细胞中的2至9倍(表1)。GSAO处理引起Lewis肺癌细胞解聚，这是此肿瘤系细胞数量明显增加的原因(图5e)。
表1.GSAO对于内皮和肿瘤细胞增殖和成活力的影响。
细胞类型             增殖抑制IC50，μM    成活力损失IC50，μM
BAE(牛大动脉内皮)    10                   75
HDMVE(人真皮内皮)    15                   35
BxPC-3(人胰腺癌)     ＞320                ＞320
HT1080(人纤维肉瘤)   95                   130
LLC(鼠肺癌)          未确定1              140
A549(人肺癌)         80                   150
HL60(人红细胞白血病) 50                   140
1未确定。LLC细胞在培养时聚集，GSAO处理引起细胞解聚，这令总细胞数量的估算折中。
实施例6
GSAO引发细胞色素C从线粒体中释放
方法
将大鼠肝脏线粒体于25℃以每毫升1mg蛋白质的浓度，悬浮在含有75mM甘露醇、250mM蔗糖、10mM琥珀酸钠、和2μM鱼藤酮的3mM HEPES，pH7.0缓冲液中，并用ANT结合化合物处理0至60分钟。试剂浓度在图注中表示。0.25mL反应中的线粒体，通过以8000g离心5分钟压成球，上层清液通过MicroconYM-3膜(Millipore，Bedford，MA)超滤而浓缩10倍。浓缩的上层清液在非还原条件下由Gradipore公司(Sydney，Australia)的8-16％梯度iGels分解，并转移到PVDF膜。蛋白质通过使用抗人细胞色素c多克隆抗体(Product 556433，BD Pharmingen)和抗兔过氧化物酶接合的抗体(Dako，Carpinteria，California)进行蛋白质印迹而检测。化学发光膜使用GS-700 Imaging Densitometer和Multi-Analyst软件(Bio-Rad，Hercules，California)分析。
结果
将分离的线粒体与GSAO一起培养，引发细胞色素C释放进入培养基，该释放是随时间变化的(图6A)。ANT配体、环孢菌素A部分地抑制这种释放(图6B)。
实施例7
GSAO在鸡胚胎尿绒毛膜(CAM)中抑制血管生成
方法
将受精的3日龄白色Leghorn鸡蛋(Spafas，Norwich，CT)打裂，将含有完整蛋黄的晶胚放置在20×100mm培养盘中，并在37℃和3％CO2条件下培养3天(Folkman，1985)。随后将含有5、10或50μg GSAA或GSAO的甲基纤维素(FisherScientific，Fair Lawn，NJ)盘应用于个体晶胚的CAM，并在37℃和3％CO2条件下培养48小时。该盘通过使10μl 0.45％甲基纤维素中的GSAA或GSAO在聚四氟乙烯棒上干燥制得。用立体显微镜观测CAMs，并划分为无明显影响的或者定义为无血管区的对CAM血管生成抑制的区域。在一些情况下，将墨汁注入CAM血管并照相。
结果
由于GSAO在体外能够选择性地杀死增殖细胞，而非生长休眠、内皮细胞，测试GSAO以确定它是否是体内血管生成的有效抑制剂。
鸡胚胎尿绒毛膜(CAM)分析已经被用于抑制血管生成的检测和分析(Nguyen等人，1994)。GSAO以一种依赖浓度的方式抑制CAM血管生成(图7A)。对血管生成抑制的定义是，在6日龄的CAM上植入含有GSAO的甲基纤维素球48小时后的无血管区(图7Ai)。高达每个球50μg的GSAA对CAM血管生成没有影响。
实施例8
GSAO抑制小鼠肿瘤血管生成和肿瘤生长
方法
原发肿瘤生长分析
使用7至9周龄的雌性SCID或C57BI6/J小鼠(Massachusetts General Hosptial，Boston，MA)。小鼠在12小时日夜周期分成3至5组，并随意给予动物食物和水。通过吸入异氟烷使SCID或C57BI6/J小鼠麻醉，刮掉背部皮并用乙醇清洗，将2.5×106BxPC-3、HT1080或LLC细胞的0.2mL PBS悬浮液，或LLC细胞的盐水在中心线附近注入。LLC细胞根据O’Reilly等人的方法(1997)制备。肿瘤体积用关系式a.b2.0.52计算，其中a是最长直径，b是最短直径。
免疫组织化学
将肿瘤固定于Buffered Formalde-Fresh(Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ)中，插入石蜡，并切下5μm厚的切片放置在载玻片上。切片用苏木精和曙红对CD31、PCNA(Holmgren等人，1995)或片断DNA(Gavrielli等人，1992)染色。微脉管从对照和治疗组的3个肿瘤中计算，包括最小的和最大的，并且根据Weidner等人(1991)在新血管生成最活性的区域将密度分级。增殖指数通过在400倍放大下，计算细胞百分数来估计。在两个独立的切片中计算最少1000个细胞。凋亡指数通过在400倍放大下，计算细胞百分数来估计。在两个独立的切片中计算最少1500个细胞。
结果
人和鼠原发肿瘤在免疫损害和免疫活性的小鼠中的生长，通过GSAO的系统给药，都分别显著地受到抑制。对承受BxPC-3(图7C)或HT1080(图7D)肿瘤的SCID小鼠，或者承受LLC肿瘤(图7E)的C57BI6/J小鼠的治疗，通过在远离肿瘤点的皮下施用10mg/kg/day GSAO，导致肿瘤生长速度分别被抑制＞90％、～70％和～50％。与仅施用赋形剂相比(数据未显示)，对照的GSAA给药在所有试验中引起肿瘤增长速度被抑制＜20％。对SCID或C57BI6/J小鼠施用GSAO或GSAA没有明显的不利的影响。试验过程中GSAO与GSAA治疗组的平均小鼠重量是相同的，而且GSAO或GSAA处理的小鼠的心脏、肺、肝脏、肾和脾没有明显肉眼可见的不同且没有形态上的变化(数据未显示)。
图7C说明的试验中对肿瘤的免疫组织化学分析显示，在GSAO处理的肿瘤中血管密度的明显降低(p＜0.001)(图7F)。GSAA和GSAO处理的肿瘤的增殖指数是相同的，而相对于GSAA处理的肿瘤，GSAO处理的肿瘤的凋亡指数明显增加(p＝0.05)(图6F)。对肿瘤血管生成的抑制一直与肿瘤细胞凋亡的增加相关(O’Reilly等人，1997)。我们认为高速凋亡平衡了肿瘤细胞的高增殖速度，并导致肿瘤尺寸无净增加(Holmgren等人，1995)。
GSAO对肿瘤生长的影响，与对肿瘤血管生成的抑制相一致。GSAO在体内抑制内皮细胞的增殖，但是在高于30倍的浓度下对BxPC-3增殖没有影响(表1)，GSAO的系统给药显著地降低体内肿瘤血管分布，但是对BxPC-3肿瘤细胞的增殖指数没有影响(图7F)。
实施例9
GSAO和相关类似物对BAE细胞的抗增殖活性的比较
方法
化合物1-11、12-15和20-23在96孔板中经过72小时，并在第1天以1000细胞/孔在DMEM 10％FBS中筛选。在第2天细胞用不同浓度的化合物处理。细胞生长在第4天用MTT显示(MTT revelation)(于550nm读数)测定，并与未处理的细胞比较。测定IC50值，并且相比于GSAO活性的增加计算如下：
增加的活性因子＝IC50(GSAO)/IC50(GSAO类似物)
结果列于表2和图8中。
表2：GSAO和相关类似物对BAE细胞增殖的活性
  化合物   IC50(μM)*   SD   增加倍数
  GSAO   8.28   2.09   -
  1   0.16   0.02   53.2
  3   122   7.2   0.07
  4   0.84   0.31   9.9
  6   18.2   3.2   0.45
  7   19.0   5.46   0.44
  8   8.8   1.68   0.95
  化合物   IC50(μM)*   SD   增加倍数
  22   0.18   0.04   46.9
  23   0.42   0.18   19.8
  9   12.9   -   0.64
  10   39.0   11.3   0.21
  11   170   3.80   0.05
  13   43.3   10.2   0.19
  14   106   31.2   0.08
  15   7.6   6.41   1.1
  21   51.3   8.27   0.16
所有IC50值是从至少2个不同的试验中得到的，除了化合物9是一次测定的。
结果
表2所示结果说明氧化砷基团在邻位(相对于亚苯基环上连接基团的位置)的化合物，比氧化砷基团在对位的类似化合物更具活性。例如，化合物1(“o-GSAO”)比GSAO的活性高53.2倍。相似地，“邻位氧化砷”化合物4比相应的对位氧化砷类似物(化合物3)活性大约高140倍；化合物22比相应的对位氧化砷化合物7的活性高大约106倍；而化合物23比相应的对位氧化砷化合物8的活性高大约20倍。这些结果是完全没有预料到的，因为相信将砷部分置于邻位会在空间上阻碍砷残基与二硫酚的相互作用。
邻氧化砷和对氧化砷化合物对BAE细胞抗增殖活性影响的比较见图9。
不同分子量的化合物对BAE细胞抗增殖活性影响的比较见图10。
不同化合物Log P值对BAE细胞坑增殖活性影响的比较见图11。
实施例10
GSAO和相关类似物诱导线粒体孔转换的效果
方法
使用大鼠肝脏线粒体，在分离后于-80℃冷冻1或2天进行筛选。线粒体肿胀通过使用酶标仪监测520nm处光散射的降低来测量。
在所有的试验中，测定每个化合物半最大肿胀所需的时间。然后，计算肿胀速度，并与GSAO比较。相比于GSAO的肿胀速度的增加计算如下：
增加的肿胀因子＝肿胀速度(GSAO类似物)/肿胀速度(GSAO)
其结果见表3和图12。
表3：GSAO和相关类似物对MPTP诱导的效果
Figure GSA00000096347500381
所有化合物的MPTP诱导性能都在不同的线粒体制剂中至少测试2次，除了化合物15仅测试一次。
结果
所有被测试的化合物显示出与GSAO相似的或更好的诱导活性。最具活性的化合物是1、4、22和23，它们的活性相对于GSAO增加了5.4至16.3倍(表3；图12)。对于MPTP的诱导，关于对BAE细胞的抗增殖活性，邻氧化砷化合物(1、4、22和23)相对于相应的对氧化砷化合物(分别是GSAO、3、7和8)具有增加的活性。
不同分子量的化合物对MPTP诱导的比较见图13。
不同化合物测试的Log P值对MPTP诱导的比较见图14。
GSAO和相关类似物的抗增殖活性与这些化合物诱导MPT的能力相比较。这些结果显示在图15。在两个试验中显示出相比于GSAO活性增加的化合物，是邻氧化砷化合物1、4、22和23。
实施例10
邻位和对位取代的氧化砷化合物对于硫醇亲和性的比较
为了测定氧化砷部分在亚苯基环的邻位或对位是否极大地影响该化合物结合二硫酚的能力，将GSAO(对氧化砷)和化合物1(邻氧化砷)用DTT滴定。
如图16所示，GSAO和化合物1的砷反应性没有明显的不同。
实施例11
GSAO和o-GSAO的比较-线粒体肿胀分析
方法
线粒体用前述的差速离心法从～250g雄性Wistar大鼠的肝脏中分离(Don等人，2003)。最终的线粒体球以每毫升30mg蛋白质的浓度再悬浮于含有213mM甘露醇、71mM蔗糖和10mM琥珀酸钠的3mM HEPES-KOH，pH 7.0缓冲液中。对线粒体通透性转换的诱导，通过在25℃将该肝脏线粒体以每毫升0.5mg蛋白质的浓度悬浮于含有75mM甘露醇、250mM蔗糖、10mM琥珀酸钠、和2mM鱼藤酮的3mM HEPES-KOH，pH 7.0缓冲液中，从而分光光度地确定。肿胀通过使用酶标仪监测伴随的520nm处光散射的降低来测量。
结果
分离线粒体的最大肿胀的半衰期，在使用特定浓度的o-GSAO时比GSAO要快3-5倍(图17)。实际上，o-GSAO在诱导线粒体通透性转换上几乎与亲脂性PAO一样有效(图17D)。
ANT孔的形成，受生理条件下的Ca2+、亲环蛋白D和腺嘌呤核苷酸结合的控制。对于线粒体通透性转换孔打开的首要引发是基质Ca2+浓度的提高。Ca2+与EGTA的螯合作用阻碍了孔打开，例如Mg2+的其它二价金属离子的过量同样阻碍了孔打开。EGTA和Mg2+都阻碍了依赖GSAO的肿胀(图18)。亲环蛋白D与ANT的结合，在亚毫摩尔Ca2+浓度时对于孔打开是必需的。环孢菌素A(CsA)通过与亲环蛋白D结合并且将其从ANT中替换而阻碍孔的打开。此外，ADP通过与ANT结合并降低引发点对Ca2+的敏感性而抑制孔的打开。CsA和ADP阻碍了o-GSAO对孔打开的效果(图19)。
实施例12
GSAO和o-GSAO的比较-细胞增殖和成活力分析
BAE或人胰腺癌BxPC-3细胞在含有10％胎牛血清的DMEM中，以每孔103细胞的密度植入96孔板，并帖壁24小时。将细胞洗涤，并与含有10％胎牛血清的DMEM和GSAO或o-GSAO一起进一步培养48小时。一些BAE细胞在含有0.25％血清的培养基中保持24小时，并在GSAO或o-GSAO的存在下，在含有0.25％或10％血清的培养基中进一步培养48小时。活的附着细胞用MTT测定。
结果
o-GSAO在抑制BAE细胞增殖方面，比GSAO更有效～50倍。GSAO和o-GSAO对BAE细胞增殖抑制的IC50分别是8.3±2.1μM和0.16±0.03μM(图20A)。与GSAO一样，相比于对BxPC-3细胞增殖的抑制作用，o-GSAO是BAE的选择性抑制剂。GSAO和GSAO对BxPC-3细胞增殖抑制的IC50分别是＞300μM和～2μM(图20B)。然而，与GSAO相反，o-GSAO对于增殖的(血管由来的)内皮细胞没有选择性(图21)。o-GSAO同等地降低了增殖的和生长休眠内皮细胞的成活力。在这一试验中，对o-GSAO的反应与PAO非常相似(见Don等人，2003)。
实施例13a
GSAO和o-GSAO的比较-原发肿瘤生长分析
方法
使用雌性7至9周龄的Balb C裸鼠(UNSW Biological Resource Centre)。小鼠在12小时日夜周期分成3至5组，并随意给予动物食物和水。在中心线附近由皮下注射2.5×106BxPC-3细胞在0.2mL PBS中的悬浮液。在将肿瘤随机地分成4组后，将其安置并生长到～40mm3的大小。肿瘤体积用关系式a.b2.0.52计算，其中a是最长直径，而b是最短直径。动物用0.1mL PBS中的GSAO或o-GSAO，以1或10mg/kg/day的剂量处理。化合物在远离肿瘤处皮下给药。肿瘤体积和动物重量每2或3天测量一次。
结果
虽然没有观察到重量损失，但是对Balb C小鼠施用o-GSAO有短期的行为副作用。结果列于表3和图22。
表3.o-GSAO给药的副作用
  天   1mg/kg o-GSAO   10mg/kg o-GSAO
  1   无   皮毛起皱；机能亢进；轻度颤抖a
  2   皮毛起皱；轻度机能亢进b   皮毛起皱；轻度机能亢进b
  3   皮毛起皱；轻度机能亢进b   皮毛起皱；轻度机能亢进b
  4   皮毛起皱；轻度机能亢进b   皮毛起皱；轻度机能亢进b
  5   皮毛起皱；机能亢进；后肢阵挛性运动b   皮毛起皱；机能亢进；后肢阵挛性运动b
  6   皮毛起皱；机能亢进；后肢阵挛性运动b   皮毛起皱；机能亢进；后肢阵挛性运动b
  7   皮毛起皱；机能亢进；后肢阵挛性运动b   皮毛起皱；机能亢进；后肢阵挛性运动b
  8   皮毛起皱；机能亢进b   皮毛起皱；机能亢进b
  9   皮毛起皱；轻度机能亢进b   皮毛起皱；轻度机能亢进b
  10   皮毛起皱；轻度机能亢进b   皮毛起皱；轻度机能亢进b
  11   皮毛起皱；轻度机能亢进b   皮毛起皱；轻度机能亢进b
  13   无   注射点皮肤坏死
  14   无   注射点皮肤坏死
a：注射后10～25分钟表现出的行为征候并持续5-10分钟。
b：注射后10～15分钟表现出的行为征候并持续5-10分钟。
实施例13b
GSAO和o-GSAO的比较-抗肿瘤功效
方法
将承受～40mm3BxPC-3肿瘤的Balb-C裸鼠随机地分成4组(每组n＝10或11)，并且用在0.1mL PBS中的GSAO(部分A)或者o-GSAO(部分B)以1或10mg/kg/day皮下处理。部分C和部分D是各个组的小鼠重量，箭头表示处理开始。数据点是肿瘤体积或小鼠重量的平均±SE。由于11只小鼠中的7只在注射点坏死和发炎(3/11是严重溃疡，4/11是中度溃疡)，用10mg/kg o-GSAO(部分B)的处理在第14天停止。在这组中也有一些重量的损失(部分D)。
结果
在对Blab C小鼠施用o-GSAO后观察到短期的行为副作用，同时随着在相同的地方重复注射，皮肤变厚并偶尔发生坏死。在Balb C裸鼠的肿瘤试验中没有观察到行为副作用(实施例13a)，尽管在这些小鼠中皮肤坏死更严重。实际上，由于11只动物中的7只在注射点严重坏死和发炎，用10mg/kg o-GSAO的处理在第14天停止。在小鼠系中观察到的仅有的重量损失是在这组中。这些副作用没有在GSAO给药中观察到(图23)。
总之，o-GSAO在体外比GSAO更有效，但是具有副作用，该副作用在GSAO给药中不明显。与GSAO不同，相对于生长休眠内皮细胞，o-GSAO对于增殖细胞没有选择性。
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Claims (5)

1.选自下组的化合物：
Figure FSA00000096347400011
Figure FSA00000096347400021
或其药学可接受的盐。
2.一种药物组合物，所述药物组合物包括如权利要求1所述的化合物以及药学可接受的载体、佐药和/或稀释剂。
3.如权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐在制备在脊椎动物中诱导MPT的药物中的应用。
4.如权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐在制备在增殖哺乳动物细胞中诱导凋亡的药物中的应用。
5.如权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐在制备在哺乳动物中抑制血管生成的药物中的应用。
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