TWI715927B - 組合物用於製備治療癌細胞的藥物的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種組合物用於製備治療癌細胞的藥物的用途，該組合物包含羅丹明或羅丹明衍生物，以及一胜肽包含SEQ ID NO：1的序列，其中該羅丹明或該羅丹明衍生物與該胜肽複合。

Description

組合物用於製備治療癌細胞的藥物的用途
本發明係關於一種組合物用於製備治療癌細胞的藥物的用途，其中所述組合物包含羅丹明或羅丹明衍生物，以及一胜肽包含SEQ ID NO：1的序列，其中該羅丹明或該羅丹明衍生物與該胜肽複合。
口腔癌的現狀和治療方法
口腔癌是全世界10種最常見的癌症之一，估計每年診斷的新病例超過500,000例。大約95%的口腔癌是口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，並且可以發生在口腔的任何地方，包括舌頭、嘴唇、牙齦、頰粘膜和上顎。它還可以局部擴散到口周結構或轉移到區域和遠端淋巴結。
口腔癌是世界上十種最常見的癌症之一。臨床檢測的延誤，預後不良以及缺乏特定的生物標誌物限制了有效治療的選項以及昂貴治療的替代方案。迄今為止，口腔癌的治療選擇有限。OSCC的主要治療策略是手術，放射療法和化學療法包括多西紫杉醇(docetaxel)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、順鉑(cisplatin)或是可同時與一種被批准作為另一種新的治療選擇的靶向治療的西妥昔單株抗體(cetuximab)結合使用。然而，治療副 作用、毀容和疼痛的恐懼是實施治療的主要臨床障礙。目前的研究主要集中在口腔癌新療法的發現和開發，此為控制不斷上升的口腔癌相關死亡率所必需的。口腔癌的靶向治療仍然是一個相對較新的概念，因此需要更多的研究來證實這些藥物用於化療的臨床效果。光照治療採用紫外線或可見光，使用或不使用光敏劑──一種能夠吸收光能並將能量傳遞給相鄰分子的分子((Gambichler,T.,Breuckmann,F.,Boms,S.,Altmeyer,P.,and Kreuter,A.(2005).Narrowband UVB phototherapy in skin conditions beyond psoriasis.Journal of the American Academy of Dermatology 52,660-670；Paus,S.,Schmitz-Hubsch,T.,Wullner,U.,Vogel,A.,Klockgether,T.,and Abele,M.(2007).Bright light therapy in Parkinson's disease：a pilot study.Movement disorders：official journal of the Movement Disorder Society 22,1495-1498；Srinivasan,D.,Muthukrishnan,N.,Johnson,G.A.,Erazo-Oliveras,A.,Lim,J.,Simanek,E.E.,and Pellois,J.P.(2011).Conjugation to the cell-penetrating peptide TAT potentiates the photodynamic effect of carboxytetramethylrhodamine.PloS one 6,e17732)。其臨床上用於治療包括頭頸部、肺部、膀胱和特殊皮膚的惡性癌症。儘管光照治療所產生的副作用相對較少，但對於特別是口腔癌等鱗狀細胞癌的光療藥物是有限的。這進一步指出對於開發早期診斷和早期治療方法的重要性。硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate proteoglycans，HSPGs)蛋白多醣。
硫酸乙酰肝素蛋白多醣(HSPG)是具有一個或多個共價連接的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)鏈的糖蛋白，其中硫酸乙酰肝素是一種醣胺聚醣(glycosaminoglycan，GAG)。HSPG存在於細胞表面或細 胞外基質中，在那裡它們與多種的配體相互作用。最近顯現出HSPG作為細胞表面上一多種大分子蛋白、胜肽的受體。外吐小體(Exosomes)、細胞穿透胜肽(cell penetrating peptides)、多價陽離子-核酸複合物(polycation-nucleic acid complexes)、病毒(viruses)、脂蛋白(lipoproteins)、生長因子(growth factors)和形態發生素(morphogens)以及其他配體(ligands)透過HSPG介導經內吞作用進入細胞。HSPG可根據其次細胞位置的分布區分為三類：膜蛋白型態HSPG，如多配體蛋白聚醣(syndecans)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypicans)；分泌的細胞外基質型態HSPG，如：第十八型膠原蛋白(type XVIII collagen)和珍珠素(perlecan)；和分泌小泡蛋白多醣(serglycin)。此外，HSPG可以結合於生長因子、趨化因子、細胞因子和形態發生素，保護它們免於蛋白質裂解作用。這些相互作用提供一系列調節因子的儲存，可透過選擇性降解HS鏈釋放調節因子。過去的研究還報導了細胞表面HSPG促進FGF2-FGF受體複合物的形成和信號傳導。
GAG結合胜肽(GBP)
GAG結合胜肽是衍生自嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)的胜肽，其由嗜酸性粒細胞所分泌。嗜酸性粒細胞是一種顆粒狀血細胞，其為一種與炎症過程如寄生蟲感染、哮喘和過敏性疾病有關的多功能白細胞。為了反應各種不同的刺激，嗜酸性粒細胞被募集到炎性區域並分泌顆粒蛋白，包括主要鹼性蛋白(major basic proteins，MBP)、嗜酸性粒細胞過氧化物酶(eosinophil peroxidase，EPO)、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)、嗜酸性粒細胞 衍生的神經毒素(eosinophil-derived neurotoxin，EDN)和脂質介質。ECP被分類為人類RNase3，由活化的嗜酸性粒細胞釋放以促進消除入侵的微生物。除了消除入侵的微生物外，ECP還具有多種功能性，如：核糖核酸、細胞毒性、抗病毒和乙酰肝素結合的活性。
ECP和乙酰肝素之間的分子相互作用已經被描述且鑑定出其中ECP的乙酰肝素結合基序(Fan,T.C.,Chang,H.T.,Chen,I.W.,Wang,H.Y.,and Chang,M.D.(2007).A heparan sulfate-facilitated and raft-dependent macropinocytosis of eosinophil cationic protein.Traffic 8,1778-1795)。一ECP的特定序列，34RWRCK38，已被鑑定為乙酰肝素結合區域(heparan-binding motif)(Fan,T.C.,Fang,S.L.,Hwang,C.S.,Hsu,C.Y.,Lu,X.A.,Hung,S.C.,Lin,S.C.,and Chang,M.D.(2008).Characterization of molecular interactions between eosinophil cationic protein and heparin.The Journal of biological chemistry 283,25468-25474)。具體地，10殘基胜肽32NYRWRCKNQN41被鑑定為源自ECP的肝素結合基序的細胞穿透肽(在以下段落中以GBP表示)。GBP已經被證明具有硫酸乙酰肝素結合和細胞穿透活性(Fan,T.C.,Fang,S.L.,Hwang,C.S.,Hsu,C.Y.,Lu,X.A.,Hung,S.C.,Lin,S.C.,and Chang,M.D.(2008).Characterization of molecular interactions between eosinophil cationic protein and heparin.The Journal of biological chemistry 283,25468-25474)；Fang,S.L.,Fan,T.C.,Fu,H.W.,Chen,C.J.,Hwang,C.S.,Hung,T.J.,Lin,L.Y.,and Chang,M.D.(2013).A novel cell-penetrating peptide derived from human eosinophil cationic protein.PloS one 8,e57318。)。值得注意的是，GBP能夠將小螢光分子、重組蛋白、奈米顆粒和擬肽藥物遞送到細胞中(Fang,S.L.,Fan,T.C.,Fu,H.W.,Chen,C.J.,Hwang,C.S.,Hung, T.J.,Lin,L.Y.,and Chang,M.D.(2013).A novel cell-penetrating peptide derived from human eosinophil cationic protein.PloS one 8,e57318)。綜合上述，GBP對於藥物輸送上具有突出的臨床意義。
羅丹明(Rhodamine)和羅丹明衍生物
羅丹明是一個具有相關聯的化學化合物和螢光染劑的家族。它們通常用作示踪劑來觀察流動和運輸的速率和方向。羅丹明染料通常是有毒的並且可溶於水、甲醇和乙醇。有許多羅丹明衍生物用於成像目的，包括羧基四甲基羅丹明(Carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、四甲基羅丹明(Tetramethylrhodamine，TMR)及其異硫氰酸酯衍生物(isothiocyanate derivative，TRITC)。TMR是羅丹明衍生物之一，已廣泛用於蛋白質標記、寡核苷酸標記和DNA測序等領域。過去的研究報導羅丹明123是一種粒線體特異性螢光染料，已應用於特異性地定位活細胞中的粒線體(Johnson,L.V.,Walsh,M.L.,and Chen,L.B.(1980).Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 77,990-994)。
細胞死亡的機制
細胞凋亡(Apoptosis)是細胞自殺程序演化上保留的生物學過程，其為多細胞生物的正常發育和體內平衡所必需，並且也涉及在許多病理的過程中。細胞凋亡的特徵在於細胞顯著的形態變化，例如細胞膜突起(membrane blebbing)、DNA降解、核碎裂(nuclear fragmentation)、染色質濃縮和一些細胞蛋白的切割，例如：聚(ADP-核糖)聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)。細胞凋亡通常由兩種不同的信號傳導途 徑誘導，包括粒線體途徑(mitochondrial pathway)和死亡受體(death receptor pathway)途徑。粒線體途徑通常涉及粒線體細胞色素c(cytochrome c)釋放到細胞質中。此外，已知Bcl-2蛋白家族成員在控制粒線體釋放細胞色素c中扮演重要的角色。在凋亡信號後，Bax，Bak或Bid等促凋亡Bcl-2蛋白成員會被活化。相反的，Bcl-2和Bcl-XL在內的抗凋亡成員可以防止上述現象發生。
PARP參與許多如DNA修復、基因體穩定性和細胞程序性凋亡等細胞過程的蛋白質家族。細胞凋亡過程中，PARP被凋亡蛋白酶(caspase)選擇性切割而變得不能對DNA損傷做出反應。通常認為PARP裂解是由凋亡蛋白酶-3(caspase-3)催化的，但凋亡蛋白酶-7(caspase-7)對PARP的裂解亦曾被報導。儘管PARP是凋亡蛋白酶的潛在標靶分子之一，但是切割被認為是凋亡蛋白酶活化的證據，並且已被廣泛用作細胞凋亡的標誌。儘管如此，近年來的研究顯示PARP切割亦可在缺乏凋亡蛋白酶原-3(procaspase-3)或-7切割情況下進行，因此可以不依賴於凋亡蛋白酶-3或-7的活化。許多先前的研究已經顯示粒線體途徑導致的細胞凋亡涉及凋亡蛋白酶非依賴性凋亡信號傳導，並導致腫瘤細胞的替代性殺傷。(Canitano,A.,Iessi,E.,Spugnini,E.P.,Federici,C.,and Fais,S.(2016).Proton pump inhibitors induce a caspase-independent antitumor effect against human multiple myeloma.Cancer letters 376,278-283；Kurita,M.,Hanada,S.,Ichimaru,Y.,Saito,H.,Tabata,K.,Asami,S.,Miyairi,S.,and Suzuki,T.(2016).Indirubin 3'-Epoxide Induces Caspase-Independent Cell Death in Human Neuroblastoma.Biological & pharmaceutical bulletin 39,993-999；Ogura,T.,Tanaka,Y., Tamaki,H.,and Harada,M.(2016).Docetaxel induces Bcl-2-and pro-apoptotic caspase-independent death of human prostate cancer DU145 cells.International journal of oncology 48,2330-2338；Sarosiek,K.A.,and Letai,A.(2016).Directly targeting the mitochondrial pathway of apoptosis for cancer therapy using BH3 mimetics-recent successes,current challenges and future promise.The FEBS journal 283,3523-3533)。除細胞色素-c(cytochrome-c)的釋放外，粒線體外膜通透性增加導致各種蛋白質釋放造成了其他胞器的損傷。基於這些證據，進一步了解凋亡蛋白酶非依賴性的細胞凋亡的作用能提供開發有效癌症療法的新機會。
癌症中的活性氧化物質(Reactive oxygen species，ROS)
ROS是含氧的化學反應性化學物質，例如過氧化物，超氧化物，羥基和單線態氧。在生物學背景下，ROS形成為氧的正常代謝的天然副產物，並且在細胞信號傳導和體內平衡中具有重要作用。然而，在環境壓力(例如，UV或熱暴露)期間，ROS濃度可顯著增加。在幾乎所有癌症中都檢測到ROS的升高，其中它們促進腫瘤發展和進展的許多方面。代謝活性增加、過氧化物酶體活性、線粒體功能障礙、氧化酶活性增加或通過與浸潤性免疫細胞的串擾引起癌細胞中的ROS濃度上升。臨床上，ROS產生是所有非手術治療癌症的方法所共有的機制，包括放射療法、化學療法和光動力療法，因為它們涉及引發細胞死亡，因此ROS也用於殺死癌細胞。無數研究證明，癌細胞中ROS的持續或組成性產生與凋亡細胞死亡呈負相關。增加的ROS產生或降低的ROS清除能力在細胞生理學中起關鍵作用。過量的細胞ROS量會對各種細胞造成氧化損傷，導致細胞凋亡和細胞死亡。 因此，一些癌細胞對由產生細胞內ROS水平的外源性ROS產生化合物誘導的氧化應激更敏感。迄今為止，許多靶向ROS積累的天然藥物引起了人們的極大興趣並導致了臨床試驗和治療。
N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)
NAC是氨基酸L-半胱氨酸的乙酰化變體，並且廣泛用於對乙酰氨基酚過量的特異性解毒劑。NAC作為一種安全且廉價的營養補充劑或藥物，從很久以前就可以商業化獲取。NAC直接作為自由基的清除劑，特別是氧自由基。它還被推薦作為由產生游離氧自由基引起的不同疾病的潛在治療選擇。因此，NAC被認為是一種重要的抗氧化劑。豐富的穀胱甘肽(Glutathione，GSH)其作為ROS清除酶的受質的作用在調節細胞凋亡中扮演重要角色。因此，NAC已被廣泛用作細胞凋亡研究領域的研究工具，用於研究ROS在誘導細胞凋亡中的作用。
此外，NAC是良好耐受的溶解藥物，其緩和粘附粘液分泌物並增強穀胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase)活性。迄今為止，NAC已應用於治療多種疾病，如肝癌，多囊胞性卵巢症候群，慢性支氣管炎，哮喘，阿茲海默症，帕金森氏症等。作為一種藥物，NAC可能是理想的外源物，能夠通過其自身的新陳代謝直接進入內源性生化過程。對NAC的作用了解得越多，臨床應用也就越來越廣泛。NAC現在被廣泛用作粘液溶解劑和治療人類免疫缺陷病毒HIV，且已經報導其用於慢性阻塞性肺病和由造影劑引起的腎病的功效。
本發明旨在探索特異性四甲基羅丹明 (tetramethylrhodamine，TMR)-複合GAG結合肽(TMR-GBP，其在摘要中以TMR-GBP表示)在調節癌細胞移動性中的作用。
本發明公開了TMR-GBP在特定細胞株中誘導的細胞毒性。為了理解由TMR-GBP誘導的細胞毒性的性質，用肽或複合有不同化學物質的肽處理細胞，其中TMR-GBP及其類似物對特定細胞株誘導了顯著的細胞毒性作用。值得注意的是，發現TMR-GBP在不存在凋亡蛋白酶活性的情況下誘導PARP裂解。此外，在TMR-GBP處置下檢測到粒線體碎裂和細胞色素c釋放。並發現TMR-GBP誘導的細胞毒性不依賴於鈣釋放。反之，用抗氧化劑處理後，TMR-GBP誘導的細胞毒性減弱。總之，TMR-GBP誘導了不依賴於凋亡蛋白酶的細胞死亡，其由粒線體碎裂，細胞色素c釋放，PARP裂解介導，並最終導致特定細胞株中的細胞凋亡。
在本發明中，發現TMR-GBP處理誘導了細胞內ROS的產生。由於粒線體呼吸鏈功能異常而導致ROS累積。因此，根據所呈現的免疫螢光染色的數據，在TMR-GBP處置下檢測到粒線體碎裂和細胞色素c釋放。此外，細胞色素-c從粒線體中釋放是細胞凋亡過程中的主要現象。亦發現細胞色素-c誘導染色質凝聚。在本發明中，還檢測到TMR-GBP誘導DNA損傷和PRRP切割，導致口腔癌細胞凋亡。
在本發明中，TMR-GBP抑制不同口腔癌細胞的細胞活性。有趣的是，細胞活性在乳腺癌，胚胎腎，子宮頸癌，肝癌和肺癌中沒有顯著影響。此外，本發明中使用的大多數口腔癌細胞是鱗狀細胞癌，其他類型是上皮來源的。因此，GBP介導的細胞毒性限制於鱗狀細胞癌。
在本發明中，發現TMR-GBP誘導的細胞毒性被NAC部分抑 制。在本發明中，NAC處理可逆轉因TMR-GBP導致的DNA損傷和ROS產生。因此，NAC可以促進受TMR-GBP影響之口腔癌細胞的細胞活性。值得注意的是，NAC的臨床應用目前已被擴展，有些人也使用NAC作為膳食補充劑。然而，根據本發明，不推薦口腔癌患者在TMR-GBP或化療藥物治療同時攝入任何含有NAC的補充劑，這些補充劑會抑制TMR-GBP的細胞毒性。
在本發明中，意外發現了TMR-GBP對口腔癌細胞特異性地細胞毒性作用。由於化學療法和放射療法具有許多副作用和不便，因此TMR-GBP可被認為適用於開發軟膏以方便患者。此外，根據本發明，發現TMR-GBP誘導的細胞毒性是光敏感的。因此，可以通過光刺激來改善治療。
因此，本發明涉及一種組合物用於製備治療癌細胞的藥物的用途，該組合物包含：一羅丹明或羅丹明衍生物，以及一包含序列SEQ ID NO：1的胜肽，其中該羅丹明或羅丹明衍生物與該胜肽複合。
於一實施例中，SEQ ID NO：1於位置4的Xaa代表Trp或Arg。例如，胜肽變體可包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。
SEQ ID NO：2由以下序列表示：Asn Tyr Arg Trp Arg Cys Lys Asn Gln Asn
SEQ ID NO：3由以下序列表示：Asn Tyr Arg Arg Arg Cys Lys Asn Gln Asn
於一實施例中，該癌細胞是上皮細胞癌細胞。於另一實施例中，該上皮細胞癌細胞是鱗狀細胞癌細胞。
於一實施例中，該癌細胞係源自上呼吸消化道的細胞。
於一實施例中，該組合物誘導癌細胞的凋亡。在另一實施例中，該凋亡與凋亡蛋白酶活化無關。
於一實施例中，該組合物誘導癌細胞的粒線體碎裂。
於一實施例中，該組合物誘導癌細胞的ROS產生。
於一實施例中，該組合物誘導癌細胞的DNA損傷。
於一實施例中，該組合物係為光所活化。
於一實施例中，該光的波長為380nm至750nm。
於一實施例中，該光的波長為400nm至620nm。
於一實施例中，該光的波長為470nm至580nm。
本發明亦涉及一種治療癌細胞的方法，包括：將一包含有一羅丹明或羅丹明衍生物複合至一包含有一胺基酸序列SEQ ID NO：1之胜肽之組合物施用於有需求之個體，並以光活化該組合物。
於一實施例中，SEQ ID NO：1於位置4的Xaa代表Trp或Arg。例如，胜肽變體可包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。
SEQ ID NO：2由以下序列表示：Asn Tyr Arg Trp Arg Cys Lys Asn Gln Asn
SEQ ID NO：3由以下序列表示：Asn Tyr Arg Arg Arg Cys Lys Asn Gln Asn
於一實施例中，該組合物係施用至一團癌細胞中。
於一實施例中，該組合物係透過腸內施用來施用。
於一實施例中，該組合物係透過輸注至一團癌細胞中來施用。
於一實施例中，該組合物係透過注射至一團癌細胞中來施用。
於一實施例中，該組合物係施用到切除腔或瘢痕中。
於一實施例中，該癌細胞是上皮細胞癌細胞。於另一實施例中，該上皮細胞癌細胞是鱗狀細胞癌細胞。
於一實施例中，該癌細胞係源自上呼吸消化道的細胞。
於一實施例中，該組合物誘導癌細胞的凋亡。在另一實施例中，該凋亡與凋亡蛋白酶活化無關。
於一實施例中，該組合物誘導癌細胞的粒線體碎裂。
於一實施例中，該組合物誘導癌細胞的ROS產生。
於一實施例中，該組合物誘導癌細胞的DNA損傷。
於一實施例中，該光的波長為380nm至750nm。
於一實施例中，該光的波長為400nm至620nm。
於一實施例中，該光的波長為470nm至580nm。
如本文中所使用，術語「癌症」意指以最廣泛的含義解釋，並且包括實質和非實質惡性腫瘤，癌前病變以及由於其位置而為惡性的腫瘤。
如本文中所使用，術語「鱗狀細胞癌」包括但不限於頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma)，鱗狀細胞甲狀腺癌(squamous cell thyroid carcinoma)，食道癌(esophageal cancer)，肺鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the lung)，陰莖鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the penis)如波文氏症(Bowen’s disease)，奎瑞氏紅皮增生症 (Erythoroplasia of Quetrat)，以及波文樣丘疹病(Bowenoid papulosis)，前列腺鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma of the prostate)，陰道鱗狀細胞癌(vagina squamous cell carcinoma)和膀胱癌(bladder cancer)。
如本文所使用，術語「受試者」是指可以施用於本發明之醫藥組合物並且其中可以發生癌症或增殖性病症的任何活生物體。該術語包括但不限於人類，非人類動物，例如非人類靈長類動物例如黑猩猩和其他類人猿以及猴子；農場動物如牛，羊，豬，山羊以及馬，寵物如狗以及貓，實驗動物包括囓齒動物如小鼠，大鼠和天竺鼠等。該術語不表示特定年齡或性別。因此，旨在涵蓋成人和新生兒以及胎兒，無論是男性或是女性。術語「受試者」還包括易受條件或疾病狀態影響的生物體，如本說明書中通常公開的，但不限於此。受試者的實例包括人，狗，貓，牛，山羊和小鼠，包括基因轉殖物種。術語「非人動物」和「非人類哺乳動物」在本文中可互換使用，包括所有脊椎動物，例如哺乳動物，例如非-人類靈長類動物，(特別是高等靈長類動物)，綿羊，狗，囓齒動物(例如小鼠或大鼠)，豚鼠，山羊，豬，貓，兔，牛和非哺乳動物，如雞，兩棲動物，爬行動物等。於實施例中，受試者是人。於另一實施例中，受試者是實驗動物或動物替代品作為疾病模型。
如本文所用，所述腔包括但不限於任何鼻腔腫瘤切除術，鼻竇腫瘤切除術，口腔腫瘤切除術，唾液腺腫瘤切除術，咽部腫瘤切除術，喉部腫瘤切除術和瘢痕腔黑色素瘤切除術。切除後的蟹足腫疤痕床可用本發明的組合物治療，以避免在已知有此類反應風險的人群中形成蟹足腫或肥厚疤。
本發明的組合物可以以固體，溶液，乳劑，分散體，微膠粒，脂質體，以及其他如含有本發明中的一種或多種成分作為活性成分的組合物產物，或與有機或無機載體或賦形劑混合以適用於腸內或腸胃外的施用。活性成分可以被混合，例如，藥學上可接受的通常無毒性的載具如片劑，丸劑，膠囊，栓劑，溶液，乳液，懸浮液以及其他任何合適的形式以供使用。可使用的載體包括葡萄糖，乳糖，阿拉伯樹膠，明膠，甘露醇，澱粉糊，三矽酸鎂，滑石，玉米澱粉，角蛋白，膠體二氧化矽，馬鈴薯澱粉，尿素，中等鏈長的甘油三酯，葡聚醣，以及合適用於製備製劑，固體，半固體或液體形式的其他載體。另外，亦可以使用穩定劑，增稠劑和著色劑和香料作為輔助。
本發明之組合物可以口服的形式，例如作為片劑，錠劑，錠劑，水性或油性懸浮液，可分散粉末或顆粒，乳劑，硬或軟膠囊，或糖漿或酏劑。口服使用的組合物可根據各種已知的醫藥組合物製備方法加以製備，而此組合物可含有一種或多種如蔗糖，乳糖或糖精等甜味劑，如薄荷，冬青油或櫻桃等調味劑，著色劑和防腐劑以提供製藥上的美觀和口感。混合有活性成分與藥學上可接受無毒賦形劑的片劑也可藉由已知方法加以製造。可使用的賦形劑如：(1)惰性稀釋劑，如碳酸鈣，乳糖，磷酸鈣或磷酸鈉；(2)成粒劑和崩解劑，如玉米澱粉，馬鈴薯澱粉或海藻酸；(3)粘合劑，如黃蓍膠，玉米澱粉，明膠或阿拉伯膠，和(4)潤滑劑，如硬脂酸鎂，硬脂酸或滑石。片劑可為未包衣，或可以藉由已知技術進行包衣以延遲胃腸道中的崩解與吸收，從而提供較長時間的持續作用。例如延時材料如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯均可採用，亦可藉由如美國專利案號 4256108；4160452；及4,265,874所描述的技術包衣，以生成控制藥效釋放的滲透性治療片劑。
在某些情況下，口服使用的組合物可為硬明膠膠囊的形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合，例如碳酸鈣，磷酸鈣或高嶺土。它們也可為軟明膠膠囊的形式，其中活性成分與水或油介質混合，例如花生油，液體石蠟或橄欖油。
本發明的組合物可以以適於推注或連續輸注的形式存在。用於注射的製劑可以以單位劑量形式提供，例如在注射器，安瓿或多劑量容器中，加入防腐劑。該組合物可以採取諸如油性或水性載體中的懸浮液，溶液或乳液的形式，並且可以含有配製劑，例如懸浮劑，穩定劑和/或分散劑。或者，活性成分可以是粉末形式，使用前用合適的載體，例如無菌無熱原水，重構。
圖1、與羅丹明和TMR的複合誘導GBP細胞毒性。為了研究不同GBP對口腔癌的影響，以50μM GBP處理Ca922細胞48小時，並透過WST-8測定測量細胞活性。
圖2、TMR-GBP誘導細胞毒性是光敏感的。將Ca922細胞在35mm培養皿上培養過夜，然後分別用1% DMSO，12.5μM TMR，GBP，TMR-GBP處理，並透過曠時活細胞顯微鏡(time-lapse live cell microscope)監測。將細胞暴露於指示波長每4小時一次，每次持續100毫秒並持續至20小時。使用10X放大率下的顯微鏡擷取圖像並對每個實驗組的五個不同視野中的圖像計數至少300個細胞。死亡率係透過計算整個群體中死細胞的百分 比來評估。三個獨立實驗的標準偏差以條狀表示。
圖3、TMR-GBP誘導細胞毒性是具細胞類型特異性。將指示的細胞接種在96孔盤中，以TMR-GBP處理48小時，然後進行WST-8測定。指示細胞的存活率百分比如所示。
圖4、TMR-GBP誘導口腔癌細胞胞死亡。選擇代表性的微分干涉相差圖像以顯示用TMR-GBP處理的細胞的形態。時間戳指示了00：00表示”時：分”。白色箭頭表示死細胞。比例尺表示20μm。
圖5、TMR-GBPW4R誘導TMR-GBP相似的細胞毒性作用。Detroit 562，H520和H1270，但不存在於Ca922。將指示的細胞接種在96孔盤中，然後用TMR-GBP處理48小時，然後進行WST-8測定。指示細胞的存活率百分比如所示。
圖6(A)、H2O2(正向對照組)誘導Ca922中的細胞凋亡。用Annexin-V-FITC對經1%的H2O2處置之Ca922細胞進行正向標記，然後進行流式細胞儀分析。X軸表示螢光強度，Y軸表示細胞計數。
圖6(B)、TMR-GBP誘導Ca922中的細胞凋亡。TMR-GBP觸發的細胞凋亡如Annexin-V-FITC染色後進行流式細胞術分析所示。X軸表示螢光強度，Y軸表示細胞計數。
圖6(C)、TMR-GBP導致Ca922凋亡中誘導Bax活化。以25μM TMR-GBP處理的Ca922細胞，於指示的時間點檢查出促凋亡蛋白Bax的表達。以與對照組細胞的Bax值(0小時)標準化的比率將所述相對蛋白質水準呈現在所述印漬之下。
圖7、TMR-GBP處理誘導了粒線體碎裂和細胞色素c釋放。 用不同劑量的TMR-GBP處理Ca922細胞8或24小時，然後用4%甲酸固定。代表性圖像顯示粒線體標記物TOM20和細胞色素c的染色。比例尺表示為10μm。
圖8(A)、EGTA，BAPTA和NAC不影響Ca922細胞的細胞活性。將Ca922細胞接種於96孔盤中，然後用EGTA(乙二醇四乙酸)，BAPTA(1,2-雙(鄰氨基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理。透過WST-8測定評估經指示處理後Ca922的細胞存活率。指示細胞的存活率百分比如所示。
圖8(B)、TMR-GBP誘導的細胞毒性被NAC部分抑制。將Ca922細胞接種在96孔盤中，先以以EGTA，BAPTA和NAC預處理2小時後，再以GBP處置。透過WST-8測定法測量細胞活性。對於共同處以TMR-GBP和鈣螯合劑(EGTA，BAPTA-AM)或ROS清除劑NAC的Ca922細胞活性如所示。三個獨立實驗的標準差表示為條狀。
圖9、TMR-GBP誘導Ca922細胞中的ROS產生。將Ca922細胞以每孔25,000個細胞的濃度，接種在黑暗，透明的96孔微孔盤中。然後以25μM DCFDA將細胞標記45分鐘後再以25μM TMR-GB培養6小時。以1% H2O2(1小時)和55mM TBHP(4小時)處理為正向對照組，模擬ROS活性以將DCFDA氧化成螢光DCF。然後在螢光盤讀數器上分析細胞。三個獨立實驗的標準偏差表示為條狀。
圖10(A)、TMR-GBP誘導了DNA損傷。DAPI標記的細胞核(以藍色顯示)與磷酸-γH2Ax(綠色)共染色的代表性圖像如所示。用25μM TMR-GBP處理Ca922細胞12或24小時，然後進行免疫螢光染色。細胞核中 的病灶表明DNA受損。比例尺表示為10μm。
圖10(B)、TMR-GBP處理誘導了DNA損傷。條形圖顯示了細胞核訊號平均強度的百分比。每類中至少計數20個細胞。條形表示為三次獨立實驗的標準偏差。
圖11(A)、TMR-GBP在沒有凋亡蛋白酶活化的情況下誘導PARP裂解在以25μM TMR-GBP處理6小時的Ca922細胞中檢查聚(ADP-核糖)聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)的蛋白質表達。
圖11(B)、TMR-GBP在沒有凋亡蛋白酶活化的情況下誘導PARP裂解。用TMR-GBP 25μM處理的Ca922細胞的蛋白質裂解物以抗Caspase-3，Caspase-7，Caspase-9和聚(ADP-核糖)聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)的抗體印漬。代表性的印漬如所示。
圖11(C)、TMR-GBP在沒有凋亡蛋白酶活化的情況下誘導PARP裂解。用TMR-GBP處理Ca922細胞並在指示的時間點收集。然後印漬Caspase-3以觀察TMR-GBP是否觸發了Caspase非依賴性凋亡途徑(Caspase-independent apoptosis pathway)。
圖11(D)、TMR-GBP在沒有凋亡蛋白酶活化的情況下誘導PARP裂解。細胞先以Calpain抑製劑預處理細胞30分鐘後，再以TMR-GBP處理，然後印漬Caspase-3。
以下之實施例非為限定用途，僅用以呈現此發明之多種面向。
材料和方法
細胞培養
在本研究中使用人類口腔鱗狀細胞癌(Human oral squamous cell carcinoma，OSCC)細胞株，Ca922，OSC20，OECM-1，OC3，CGHNC9，HSC3，加A549，MDA-MB-231，MCF7，Huh7，HeLa-Kyoto，Detroit 562，H520，H2170和293T細胞。Ca922，CGHNC9，MDA-MB-231，MCF7，Huh7，HeLa-Kyoto，Detroit 562和293T細胞均在高葡萄糖Dulbecco's改良Eagle培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)中培養。OSC20和HSC3細胞在Dulbecco's Modified of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix(1：1)中培養。OECM-1，A549，H520和H2170細胞在RPMI-1640培養基中生長。所有培養基補充有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1%青黴素-鏈黴素。依指導將OC3細胞在提供牛垂體提取物(Bovine pituitary extract，BPE)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)的補充物下於DMEM/KSFM(角質細胞無血清培養基)(1：1混合)中培養。本研究中的所有細胞保持在37℃，含有5% CO2的潮濕空氣中。
合成胜肽的序列
本研究中使用的合成胜肽序列列於下表中：
Figure 108104150-A0202-12-0019-1
WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鹽，單鈉鹽]細胞活性測定
將細胞接種到96孔盤中並在37℃下培養過夜。TMR-GBP或藥物的終點測量透過水溶性四唑鹽(water soluble tetrazolium salt，WST-8)基比色測定進行三重複，其測量活細胞中WST-8透過粒線體脫氫酶代謝轉化為甲
Figure 108104150-A0202-12-0020-24
(formazan)。甲
Figure 108104150-A0202-12-0020-25
的生成量與活細胞的數量成正比，並表示為細胞活性。當時間結束時，除去培養基並補充含有WST-8細胞活性試劑的細胞培養基(1：10)並在37℃下作用2小時。此外，僅保留三個僅含有WST-8溶解培養基(不含細胞)的孔作為背景對照。透過ELISA讀數器在450/655nm波長的吸光度下測量細胞活性。
膜聯蛋白V(Annexin V)染色
接種細胞並在37℃培養過夜，然後用1% H2O2處理1小時(作為陽性對照)，25μM TMR和TMR-GBP處理6小時。用蒸餾水稀釋10倍緩衝液至1倍。在PBS中洗滌一次細胞，然後在1倍結合緩衝液中洗滌一次。將1倍結合緩衝液中的細胞懸浮(resuspend)於1-5×106/mL。接下來，將5μL螢光染料複合的膜聯蛋白V添加至100μL細胞懸浮液中。將樣品在室溫下溫育10-15分鐘。然後，在1倍結合緩衝液中洗滌細胞，並懸浮於200μL 1倍結合緩衝液中。於4小時內透過流式細胞儀分析，在2~8℃下在黑暗中儲存。
DCFDA細胞ROS檢測測定
在將細胞以每孔2.5×104個細胞接種於黑暗，底部透明的96孔微孔板上，並在含有10% FBS而不含酚紅的完全培養基中溫育。透過於二次水(ddH2O)中稀釋10倍緩衝液來為1倍緩衝液，並加入適量DCFDA製成 25μM DCFDA溶液。將細胞在1倍緩衝液中洗滌一次，並用25μM DCFDA在37℃下染色細胞45分鐘。然後，在1倍緩衝液或1倍PBS中洗滌細胞一次。TMR-GBP，H2O2和TBHP可以在含有10% FBS而不含酚紅的完全培養基中稀釋。以每孔100μL加入TMR-GBP，H2O2(作為陽性對照)，TBHP(作為陽性對照)並溫育所需的時段。用TBHP或其它欲測試的化合物處理後，不應洗滌細胞。其中應包含一未染色的細胞以確定背景螢光值。通過螢光板讀數器在Ex/Em：485/535nm處讀取信號。
蛋白質印漬分析
通過胰蛋白酶或直接刮取收集細胞，並於補充有1X蛋白酶抑製劑混合物的RIPA緩衝液(50mM Tris-HCl，pH 7.4,150mM NaCl，0.1% SDS，0.5%脫氧膽酸鈉，1% NP-40)中裂解。將樣品在冰上作用30分鐘並每10分鐘刮擦一次。在13,000rpm，4℃下離心15分鐘，然後收集上清液用於分析。以Bradford測定法測定蛋白質濃度。首先，將5X Bradford試劑稀釋成1X，並與RIPA(作為標準)或樣品混合。將樣本通過分光光度計測量且透過標準曲線計算出其蛋白質濃度。將等體積的含有β-ME的2X laemmli緩衝液加入蛋白質裂解物中用於達到目標的濃度。將蛋白質樣品在100℃煮沸15分鐘，並通過10% SDS-PAGE凝膠或4%-15%梯度凝膠分離。然後，通過100V或110V電壓轉移到PVDF膜1小時。首先，在室溫下與一抗作用1小時或在4℃下作用過夜。每隔5分鐘用1X PBST洗滌PVDF膜三次。接著，將膜與結合複合辣根過氧化物酶(HRP)(GE Healthcare)的第二抗體在室溫下作用30分鐘。在該分析中使用的抗體濃度為1：1000稀釋度。每隔5分鐘用1X PBST洗滌膜三次，加入改良的ECL(ddH2O，100nM Tris pH8.0，200μM對香豆 酸，1.25mM魯米那，0.001% H2O2)並用數位成相系統ImageQuant LAS 4000偵測和擷取蛋白質表現影像。
免疫螢光染色
用1X PBS洗滌在蓋玻片上生長的細胞，並以PTEMF緩衝液(20mM PIPES pH 6.8,0.2% Triton X-100,10mM EGTA，1mM MgCl 2和4%甲醛)或4%多聚甲醛固定10在室溫下分鐘。然後，用1X PBST替換固定緩衝液，並在室溫下用1X PBST再洗滌細胞10分鐘。將蓋玻片用1X PBST輕輕洗滌兩次，並在室溫下與一抗作用1小時。接下來，用PBST洗滌三次(2,2,5分鐘)。然後，蓋玻片在Alex Fluor偶聯的二抗和DAPI中在室溫下培養30分鐘，洗滌三次(2,2,5分鐘)，用ddH2O沖洗並用封固劑固定。在該分析中使用的抗體濃度為1：1000稀釋度。通過配備有HCX PL FL 100X/NA1.40物鏡和EMCCD相機的Leica DMI6000倒置顯微鏡獲得具有特定螢光波長的圖像。所有圖像均由MetaMorph軟件分析。
曠時活細胞成像
為了監測細胞形態和TMR-GBP的穩定性，將細胞在35mm培養皿或4孔培養皿中於37℃溫育過夜。以不依賴CO2的培養基，補充10%胎牛血清(FBS)和1%青黴素-鏈黴素且根據實驗用試劑(TMR，GBP，TMR-GBP)處理細胞，並於實驗指定的時間進行矌時活細胞成像。將細胞保持在37℃的顯微鏡培養箱中。使用配備有HCX PL FL 20x/NA0.4物鏡和Andor Luca R EMCCD相機的自動化Leica DMI6000倒置顯微鏡進行多位置延時成像。在不同的間隔時間拍攝細胞圖像並通過MetaMorph軟件分析。
統計分析
使用Microsoft Excel進行所有統計分析。對每種方案進行至少3次實驗。獲得的結果表示為平均值±平均值的標準誤差(standard error of the mean，SEM)。通過配對t檢驗評估統計分析。P<0.05被認為具有統計學意義。
實施例1
羅丹明複合對於GBP誘導的細胞毒性是必需的
為了比較細胞活性與不同GBP複合物的影響，細胞處理GBP、FITC-GBP、MR、羅丹明-MK或TMR-GBP，然後作用48小時並測量細胞活性。據觀察，只有結合羅丹明及其衍生物TMR的GBP才能誘導細胞毒性。單獨或與FITC結合的GBP不會誘導細胞毒性(圖1)。這些數據表明TMR複合可能是GBP介導的細胞毒性所必需的。
實施例2
TMR-GBP誘導的細胞毒性是光敏感的
為了測試光刺激是否可以增強TMR-GBP誘導的細胞毒性，將Ca922細胞培養在35mm培養皿上，然後分別用1% DMSO、12.5μM TMR、GBP、TMR-GBP處理。將細胞暴露於532nm，488nm，405nm和明視野觀察的波長，並通過矌時活細胞顯微鏡監測。20小時後，發現用DMSO或GBP處理的細胞在指定波長的光應力下仍然存活。相反，用TMR或TMR-GBP處理的細胞對532nm光應激更敏感並顯示出細胞毒性作用(圖2)。因此，這些結果表明紅光刺激可能會增加TMR-GBP誘導的細胞毒性。
實施例3
TMR-GBP誘導的細胞毒性是細胞類型特異性的
不同的細胞株，包括乳腺癌(MDA-MB-231，MCF7)，胚腎(293T)，宮頸癌(HeLa-Kyoto)，肝癌(Huh7)，肺癌(A549)和口腔癌(OECM-1，將OSC20，Ca922，OC3，CGHNC9，HSC3)接種於96孔中並暴露於不同濃度的TMR-GBP 48小時(圖3)。然後通過WST-8測定評估TMR-GBP處理對細胞活性的影響。25μM處理顯著降低了六種口腔癌細胞株(OECM-1，OSC20，Ca922，OC3，CGHNC9，HSC3)的細胞活性80-90%。相反，在TMR-GBP存在下，MDA-MB-231，MCF7,293T，HeLa-Kyoto，Huh7和A549的細胞活性沒有顯著影響。因此，將TMR-GBP用作口腔癌的有希望的細胞類型特異性治療方法是合理的。
實施例4
TMR-GBP在不同細胞株中的作用
為了研究GBP在細胞中的穩定性，用TMR-GBP處理口腔癌細胞Ca922，OECM-1，OSC20和肺癌細胞A549，然後除去未結合的TMR-GBP。接下來，通過矌時活細胞顯微鏡監測細胞。細胞以15分鐘間隔成像16小時。隨著矌時活細胞顯微鏡的應用，口腔癌細胞Ca922，OECM-1和OSC20變圓，然後大多數細胞在8小時內死亡。相反地，長期TMR-GBP處理下的肺癌細胞A549仍然存活(圖4)。這些結果意味著TMR-GBP對口腔癌的細胞毒性具有特異性。
實施例5
不同TMR-GBP複合物對細胞活性的影響
為了比較細胞活性與不同TMR-GBP結合物的影響，將不同的SCC細胞株(包括口腔癌(Ca922)，咽癌(Detroit 562)和肺癌(H520， H2170))接種於96孔中並暴露於不同的TMR-GBP、TMR-GBPW4R、TMR-GBPR3QW4R或TMR的濃度持續48小時。然後通過WST-8測定評估TMR-GBP複合物處理對細胞活性的影響。結果觀察到TMR-GBP可以在Ca922，Detroit 562，H2170和H520中誘導細胞毒性。TMR-GBPW4R可在Detroit 562，H2170和H520中誘導細胞毒性。雖然TMR-GBPR3QW4R和TMR都不能單獨誘導所有四種細胞株的細胞毒性(圖5)。
實施例6
TMR-GBP誘導細胞凋亡
在細胞凋亡開始後，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)在磷脂雙層上失去其不對稱分佈，並易位至細胞外膜。在這個階段，可以通過螢光標記的膜聯蛋白V檢測PS。為了進一步驗證TMR-GBP促使口腔癌細胞凋亡，用1% H2O2、12.5μM TMR和TMR-GBP處理Ca922細胞，然後用膜聯蛋白V-FITC染色。未處理(模擬)和1% H2O2的細胞分別作為陰性和陽性對照應用(圖6A)。發現Ca922被膜聯蛋白-V-FITC陽性標記，表明TMR-GBP誘導Ca922細胞凋亡(圖6B)。此外，在TMR-GBP處理後，促凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白(Bax)的蛋白質表達增加(圖6C)。這些數據表明TMR-GBP誘導Ca922細胞凋亡。
實施例7
TMR-GBP處理誘導粒線體片段化和細胞色素c的釋放
是否TMR-GBP在穿透細胞後攻擊粒線體以進一步探索。用不同劑量的TMR-GBP處理Ca922細胞8或24小時並進行免疫螢光染色。細胞含有特異於TOM20的抗體，TOM20是粒線體的標記，而細胞色素c是一種與 粒線體內膜鬆散相關的小血紅素蛋白。觀察到當TMR-GBP的濃度增加或延長治療時間時，粒線體的形態變得片段化。還檢測到TMR-GBP處理後的細胞色素c釋放(圖7)。
實施例8
TMR-GBP誘導的細胞毒性被N-乙酰半胱氨酸部分抑制
繼續研究粒線體斷裂和細胞死亡是否取決於鈣穩態或ROS產生的破壞。首先，將Ca922細胞暴露於不同濃度的鈣螯合劑BAPTA-AM和EGTA或ROS清除劑NAC 50小時，然後測量細胞活性(圖8A)。用1mM EGTA，2μM，5μM BAPTA-AM和0.1至8mM NAC進行共培養顯示對細胞活性沒有顯著影響。然而，10μM BAPTA-AM對Ca922細胞有點毒性。接下來，用BAPTA-AM，EGTA或NAC預處理細胞2小時，然後暴露於不同濃度的TMR-GNP(0,12.5,25或50μM)48小時並測量細胞活性(圖8B)。如果細胞死亡取決於鈣穩態的破壞，預期BAPTA-AM和EGTA處理可以挽救細胞活性。然而，NAC部分抑制了TMR-GBP誘導的細胞毒性。因此，這些結果表明TMR-GBP誘導的細胞死亡可能取決於響應TMR-GBP的ROS的存在。
實施例9
TMR-GBP誘導Ca922細胞中的ROS產生
為了進一步驗證TMR-GBP誘導的細胞死亡是否取決於ROS產生，測量ROS產生。將Ca922細胞接種到透明底96孔微孔板上，然後在黑暗中用DCFDA標記以檢測細胞內ROS。在DCFDA作用後，將細胞暴露於25μM TMR-GBP 6小時。用1% H2O2或55mM TBHP處理的細胞作為陽性對照。在減去背景後，發現與對照細胞相比，TMR-GBP處理使ROS增加了5 倍(圖9)。在沒有DCFDA標記的情況下，未檢測到TMR-GBP處理的螢光信號，表明TMR的存在對DCFDA的背景讀數沒有影響。總之，這些結果與之前的假設一致，即TMR-GBP誘導的細胞死亡依賴於口腔癌細胞中的ROS產生。
實施例10
TMR-GBP治療誘導DNA損傷
用25μM TMR-GBP處理Ca922細胞，並進行H2Ax的免疫螢光染色以研究DNA損傷。應用H2O2處理作為陽性對照。與對照細胞相比，觀察到許多病灶在H2O2和TMR-GBP處理後在細胞核中積累。相反，在對照細胞和用TMR-GBP和NAC共同處理的細胞中幾乎檢測不到任何磷酸-γ H2Ax信號(圖10A)。然後測量核H2Ax的強度，發現TMR-GBP處理的細胞中γ H2Ax的強度比用TMR-GBP和NAC共處理的對照細胞或細胞增加4倍(圖10B)。因此，通過用NAC處理可以防止TMR-GBP處理誘導的DNA損傷。
實施例11
TMR-GBP以不依賴於凋亡蛋白酶的方式誘導PARP切割。
測試了不同類型的GBP(包括TMR-GBP和GBP)對Ca922細胞的細胞毒性作用。以前已經發現TMR-GBP處理誘導Ca922細胞中的DNA損傷(圖10A，10B)。聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的蛋白質表達涉及許多細胞過程，包括DNA修復，基因組穩定性和程序性細胞死亡。收集細胞裂解物並檢查PARP的蛋白質表達。與GBP相比，只有TMR-GBP誘導PARP裂解(圖11A)。
為了研究TMR-GBP是否通過凋亡蛋白酶依賴性途徑誘導 Ca922凋亡，檢查了不同半胱天冬酶的表達。有趣的是，TMR-GBP處理不激活caspase-3，caspase-7和caspase-9，甚至將處理時間延長至48小時(圖11B，11C)。此外，在使用鈣蛋白酶抑製劑阻斷鈣蛋白酶活性後，TMR-GBP仍然在Ca922細胞中誘導PARP切割(圖11D)。因此得出結論，TMR-GBP誘導的細胞死亡與凋亡蛋白酶活化無關。
儘管已經足夠詳細地描述和舉例說明了本發明以使本領域技術人員製造和使用本發明，但是在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，各種替換，修改和改進應該是顯而易見的。
本領域技術人員容易理解，本發明非常適合於實現所述目的並獲得所提到的目的和優點，以及其中固有的目的和優點。細胞，動物和方法以及製備它們的方法是優選實施方案的代表，是示例性的，並不意圖作為對本發明範圍的限制。本領域技術人員將想到其中的修改和其他用途。這些修改包含在本發明的精神內，並由權利要求的範圍限定。
<110> 國立清華大學
<120> 組合物用於製備治療癌細胞的藥物的用途
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 1
Figure 108104150-A0305-02-0031-2
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Figure 108104150-A0305-02-0031-1
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Figure 108104150-A0305-02-0032-3
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Figure 108104150-A0305-02-0032-4

Claims (11)

  1. 一種組合物用於製備治療一癌細胞的藥物的用途，其中該組合物包含：一羅丹明或羅丹明衍生物；以及一包含序列SEQ ID NO：1的胜肽，其中該羅丹明或羅丹明衍生物與該胜肽複合；其中該癌細胞係為一頭頸鱗狀癌細胞；其中該羅丹明衍生物係為羧基四甲基羅丹明(Carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、四甲基羅丹明(Tetramethylrhodamine，TMR)或其異硫氰酸酯衍生物(isothiocyanate derivative，TRITC)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物係施用至一團頭頸鱗狀細胞癌細胞中。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該頭頸鱗狀細胞癌細胞是口腔鱗狀細胞癌細胞。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物誘導癌細胞的凋亡。
  5. 如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該凋亡與凋亡蛋白酶活化無關。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物誘導癌細胞的粒線體碎裂。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物誘導癌細胞的活性氧化物質(Reactive oxygen species，ROS)產生。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物誘導癌細胞的DNA損傷。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該光的波長為380nm至750nm。
  10. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中該光的波長為400nm至620nm。
  11. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中該光的波長為470nm至580nm。
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Srinivasan Divyamani, et al. " Conjugation to the Cell-Penetrating Peptide TAT Potentiates the Photodynamic Effect of Carboxytetramethylrhodamine" PLoS ONE, March 2011, Vol: 6, Issue 3, Page(s): 1-10

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