TWI426082B - 癌症轉移的抑制 - Google Patents

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Description

癌症轉移的抑制
本發明提供抑制癌症轉移之方法。本發明亦提供原纖蛋白質組合物及其使用方法用作抗癌症轉移治療之用。
癌症轉移為涉及一系列連續步驟且需要一連串宿主-腫瘤細胞相互作用之過程(Steeg PS等人，(2007)Nature 449: 671-3)。此等步驟包括自原發性腫瘤脫離、侵入至循環系統中並在循環系統中停滯、外滲至器官之薄壁組織中；及增殖伴發血管生成(Sawyer TK等人，(2004)Expert Opin Investig Drugs 13:1-19)。對於研究腫瘤移行及侵入之機制目前正逐漸受關注，其被揭露為轉移性過程之關鍵步驟。干擾此等步驟中之任一者來阻斷轉移聯串過程，為一種防止形成轉移性腫瘤生長之具有吸引力的方法。
先前資料顯示口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)之重組鞘蛋白VP1(rVP1)，可經由整合素(Integrin)信號傳導路徑誘導數種癌細胞之凋亡(Peng JM等人，(2004)J. Biol. Chem . 279:52168-74)。已發現使用使rVP1再摺疊為水溶性形式之相同過程，可將球狀牛血清白蛋白(G-BSA)轉化為原纖BSA(F-BSA)，其類似於rVP1，可經由整合素/FAK/Akt信號傳導路徑誘發腫瘤細胞凋亡(Huang等人，(2009)BMC Biotechnol . 9:2)。
本發明提供抑制癌症轉移之方法。癌症患者治療失敗及死亡之最常見原因即為癌症轉移。在使腫瘤細胞與原纖蛋白質接觸後，腫瘤細胞侵入及/或移行受得到顯著抑制，該等原纖蛋白質包括(但不限於)rVP1、F-HSA及F-BSA。相關腫瘤細胞包括癌，例如乳癌、卵巢上皮腺癌、前列腺腺癌等。
在一態樣中，本發明係關於一種組合物，其包含治療有效劑量之原纖人類血清白蛋白及醫藥學上可接受之載劑，該組合物係用於治療患有癌症之哺乳動物，例如用於抑制癌細胞、抑制轉移等。
在本發明之一些實施態樣中，使腫瘤細胞在活體內與原纖蛋白質接觸，該接觸可為局部(例如腫瘤內引入或注射)或全身的。舉例而言，本文中顯示rVP1在活體內顯著抑制老鼠及人類乳癌轉移以及人類前列腺癌及卵巢癌轉移。已顯示F-HSA顯著抑制乳癌轉移。在一個實施態樣中，本發明係關於一種如上文所提及用於治療哺乳動物癌症的組合物，其中該癌症為選自乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌及肺癌之至少一者。
在本發明之一些實施態樣中，提供作為抗癌症轉移治療劑之原纖蛋白質組合物，其中該組合物提供作為一種醫藥調配物，其劑量可有效抑制轉移。在另一態樣中，本發明係關於一種方法，其包含製造用於治療患有癌症之患者的組合物。該方法包含：製造原纖人類血清白蛋白，及將該原纖人類血清白蛋白與醫藥學上可接受之載劑混合。在另一態樣中，本發明係關於一種方法，其包含將HSA溶解於SDS溶液中；將所溶解之HSA通過具有可分離70 kDa分子量及更大蛋白質的孔徑之凝膠過濾管柱；自該管柱溶離HSA；及以磷酸鹽緩衝生理食鹽水透析溶液以移除SDS。
 定義
在以下描述中，廣泛地使用細胞培養領域內習用之許多術語。為了對本說明書及申請專利範圍以及賦予該等術語之範疇有清楚又一致的瞭解，提供以下定義。
術語「個體(subject/individual)」及「患者」在本文中可互換地用於指正處治療評估階段及/或正被治療之哺乳動物。在一個實施態樣中，該哺乳動物為人類。因此，術語「個體」及「患者」涵蓋患有癌症(例如結腸直腸癌、卵巢或前列腺腺癌、乳癌等)之個體，包括已經歷移除癌性組織(例如癌性結腸直腸組織)之切除術(手術)或為該切除術(手術)之候選者的彼等個體。個體可為人類，而且包括其他哺乳動物，尤其適用作人類疾病之實驗室模型的彼等哺乳動物，例如小鼠、大鼠等。
如本文中所使用，術語「治療」及其類似用語係指為了獲得某種效果而投與某種藥劑或進行某種程序(例如放射療法、外科程序等)。該效果可為預防性的完全或部分預防某一疾病或其症狀且/或為治療性的部分或完全有效治癒某一疾病及/或該疾病之症狀。如本文中所使用，「治療」涵蓋哺乳動物(尤其人類)之任何轉移性腫瘤的任何治療，且包括：(a)防止疾病或疾病之症狀在可能易患該疾病但尚未經診斷患有該疾病(例如包括可能與原發性疾病相關或由其引起之疾病)之個體中出現；(b)抑制疾病，亦即阻止其發展；及(c)緩解疾病，亦即使疾病消退。在腫瘤(例如癌症)治療中，治療劑可直接減少腫瘤細胞之轉移。
術語「細胞培養」或「培養」意謂將細胞維持在人造活體外環境中。然而，應瞭解，術語「細胞培養」為通用術語，且不僅可用於涵蓋個別細胞的培育，亦涵蓋組織或器官的培育。
如本文中所使用，術語「腫瘤」係指所有贅生性細胞(惡性或良性)之生長及增殖，以及所有癌前及癌性的細胞及組織。
術語「癌症」、「贅瘤」及「腫瘤」在本文中可互換地用於指展現自發、未經調節之生長以至於展現特徵為細胞增殖明顯失控之異常生長表型的細胞。一般而言，在本申請案中，在偵測、分析、分類或治療中，相關細胞包括癌前(例如良性)、惡性、轉移前、轉移性及非轉移性細胞。癌症之實例包括(但不限於)乳癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌、肝細胞癌、胃癌、胰臟癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲狀腺癌、腎癌、癌瘤、黑色素瘤、頭頸部癌及腦癌。
視癌症性質而定，獲得適當患者樣品。如本文中所使用片語「癌性組織樣品」，係指自癌性腫瘤獲得之任何細胞。在未發生轉移之實體腫瘤的情況下，通常自外科移除之腫瘤來獲得組織樣品，並藉由習知技術來製備測試樣品。或者，可收集體液樣品(諸如淋巴液、血液或血清樣品)或滲出流體樣品(諸如癌性器官滲出液，例如乳房滲出液)並將其用作待分析之樣品。在白血病之情況下，可於獲得淋巴細胞或白血病細胞後再適當地加以製備。類似地，在任何已轉移的癌症之情況下，可自體液(諸如淋巴液、血液、血清或遠端感染器官或其滲出液)中採集細胞。
如本文中所使用，術語「轉移」係指癌性腫瘤在不直接連接於初始癌性腫瘤器官之器官或身體部分中的生長。轉移應理解為包括微小轉移(micrometastasis)，其在不直接連接於初始癌性腫瘤器官之器官或身體部分中存在不可偵測之量的癌細胞。轉移亦可被定義為一個具有數個步驟之過程，諸如癌細胞自初始腫瘤部位脫離，及癌細胞移行及/或侵入至身體其他部分。因此，本發明涵蓋一種測定一或多種癌性腫瘤在不直接連接於初始癌性腫瘤器官之器官或身體部分中進一步生長的風險及/或導致該生長之過程中的任何步驟之方法。
癌症之「病理學」包括所有損害患者健康之現象。其包括(但不限於)異常或不可控制之細胞生長、轉移、干擾相鄰細胞之正常功能、釋放異常量之細胞激素或其他分泌產物、抑制或加重發炎性或免疫性反應、腫瘤形成、癌化前期、惡性疾病、侵襲周圍或遠端組織或器官(諸如淋巴結)等。
如本文中所使用，術語「癌症復發」及「腫瘤復發」及其語法上之變化形式係指在確診有癌症後贅生性或癌性細胞有進一步的生長。特定言之，當在癌性組織中出現癌性細胞的進一步生長時，會發生復發。類似地，當腫瘤細胞散播至局部或遠端組織及器官時，發生「腫瘤擴散」；因此，腫瘤擴散涵蓋腫瘤轉移。
術語「診斷」在本文中用於指鑑別分子或病理學病況、疾病或病狀，諸如鑑別乳癌、前列腺癌或其他類型之癌症的分子亞型。
術語「預後」在本文中用於指預測可歸因於癌症之死亡或發展的可能性，包括贅生性疾病(諸如肺癌、結腸癌、皮膚癌或食道癌)之復發、轉移性擴散及抗藥性。術語「預測」在本文中用於指根據觀察、經驗或科學推理進行預言或估計的行為。在一個實例中，醫師可預測患者將在原發性腫瘤之外科移除及/或化學療法後存活一定時間而癌症不復發之可能性。
如本文中所使用，片語「無病存活」係指在診斷後患者無該腫瘤復發及/或擴散以及患者命運結果，其與癌症對患者壽命之影響有關。片語「總存活」係指在診斷後患者之命運結果，不過患者之死因可能不直接歸因於癌症之影響。片語「無病存活之可能性」、「復發風險」及其變化形式係指在確診有癌症後患者腫瘤復發或擴散之可能性，其中根據本發明之方法測定該可能性。
如本文中所使用，術語「與...有關聯」或「與...相關」及類似術語係指兩個事件情況之間的統計相關性，該等事件包括數字、資料組及其類似者。舉例而言，當事件涉及數字時，正相關(本文中亦稱為「直接相關」)意謂隨著一者增加，另一者亦增加。負相關(本文中亦稱為「逆相關」)意謂隨著一者增加，另一者將減少。
術語「分離」意欲意謂使化合物與自然界中伴隨其之所有或一些組成分分開。「分離之」亦指某一化合物(例如蛋白質)已與在製造(例如化學合成、重組表現、培養基培養及其類似者)期間伴隨其之所有或一些組成分分開的狀態。
「生物樣品」涵蓋自個體獲得之各種樣品類型。該定義涵蓋源於生物之血液及其他液體樣品；固體組織樣品，諸如活檢體或組織培養物或由其獲得之細胞及其子代。該定義亦包括在取得後已以任何方式處理(諸如用試劑處理、洗滌、或大量收集某些細胞群體(諸如癌細胞))的樣品。該定義亦包括已富集特定類型之分子(例如核酸、多肽等)的樣品。術語「生物樣品」涵蓋臨床樣品，且亦包括由外科切除術獲得之組織、由活檢體獲得之組織、培養物中之細胞、細胞上清液、細胞溶解物、組織樣品、器官、骨髓、血液、血漿、血清及其類似物。「生物樣品」包括自患者癌細胞獲得之樣品，例如自患者癌細胞所獲得包含聚核苷酸及/或多肽的樣品(例如包含聚核苷酸及/或多肽之細胞溶解物或其他細胞萃取物)；及包含來自患者之癌細胞的樣品。包含來自患者之癌細胞的生物樣品亦可包括非癌細胞。
本發明係關於一種製造原纖蛋白質之方法及使用原纖蛋白質之治療方法。該治療方法涉及癌症轉移的抑制。
治療方法
本文揭示一種抑制癌症轉移之方法。該方法涉及向有需要之患者投與治療有效量之原纖蛋白質。該方法可進一步涉及提供某一蛋白質及將該蛋白質變為原纖結構，隨後投與該原纖蛋白質之步驟。投與原纖蛋白質可抑制腫瘤細胞侵入(例如侵入至周圍組織中)及/或移行。
本發明方法可用於哺乳動物個體(尤其人類)之各種癌症療法(包括癌症預防及診斷後癌症療法)中。患有、疑患有或處於發展成腫瘤風險的個體皆為本文所述之療法所涵蓋。
根據本發明方法之抗癌症療法可特別針對具有轉移性或處於變得具有轉移性之高風險的癌細胞。因而，可治療性使用原纖蛋白質來影響/預防癌細胞在其他組織中之黏附及侵入。
舉例而言，可用本發明之方法來抑制的癌症轉移，包括(但不限於)癌，包括腺癌，尤其乳癌、前列腺腺癌及卵巢腺癌。可治療之其他轉移包括源於腎臟、肺臟、肝臟、皮膚(例如黑色素瘤)、結腸、胰臟或子宮頸中之癌性生長的彼等轉移。
用於治療癌症之原纖蛋白質可為白蛋白、纖維結合蛋白、rVP1、rVP2、rVP3、P1或包含來自VP1、VP2、VP3及/或VP4之部分的嵌合蛋白。白蛋白蛋白質可自任何相關動物獲得，例如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白等。在某些實施態樣中，原纖蛋白質可進一步藉由調節Akt信號傳導路徑來誘導癌細胞凋亡。在一些情況下，原纖蛋白質調節整合素α 5β 1或α v β 3，其導致Akt失活。在其他情況下，原纖白蛋白會結合至整合素，且主要經由整合素/FAK/Akt/GSK-3β/Caspase-3路徑引起細胞凋亡。
如上文所述，本發明方法涉及向個體(例如人類患者)投與原纖蛋白質以(例如)抑制癌細胞之侵入及移行。此可藉由向如本文所述之個體投與原纖蛋白質來實施，使該個體與未投與原纖蛋白質之個體相比，癌症轉移的情況減少。根據本發明方法之療法亦可適用於在患者中預防復發、減少癌細胞移行、減小腫瘤尺寸、降低腫瘤負荷及/或改善臨床結果。
癌症類型
本文所涵蓋之與癌症有關的方法包括例如使用原纖蛋白質療法作為抗癌症轉移療法。該等方法適用於治療或預防各種癌症之情形，諸如可能轉移之癌症(例如癌及肉瘤)。
可藉由本文所揭示之方法來治療的癌包括(但不限於)食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌(皮膚癌之一種形式)、鱗狀細胞癌(各種組織)、膀胱癌(包括移行細胞癌(膀胱惡性贅瘤))、支氣管癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌(包括小細胞癌及非小細胞肺癌)、腎上腺皮質癌、甲狀腺癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓性癌、腎細胞癌、乳腺管原位癌或膽管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威氏腫瘤(Wilm's tumor)、子宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、成骨癌、上皮癌及鼻咽癌。
可藉由本文所揭示之方法來治療的肉瘤包括(但不限於)纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤及其他軟組織肉瘤。
可藉由本文所揭示之方法來治療的其他實體腫瘤包括(但不限於)神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少枝膠質瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。
可根據本文所揭示之方法來治療的其他癌症包括非典型脊膜瘤(腦)、小島細胞癌(胰臟)、髓性癌(甲狀腺)、間充質瘤(腸道)、肝細胞癌(肝)、肝胚細胞瘤(肝)、明細胞癌(腎)及神經纖維瘤縱隔。
可使用本文所揭示之方法來治療的其他例示性癌症包括(但不限於)神經外胚層及上皮來源之癌症。神經外胚層來源之癌症的實例包括(但不限於)尤因氏肉瘤、脊椎腫瘤、腦腫瘤、嬰兒幕上原始神經外胚層腫瘤、管狀囊性癌、黏液管狀及梭形細胞癌、腎腫瘤、縱隔腫瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤及青少年及年輕成人之肉瘤。上皮來源之實例包括(但不限於)小細胞肺癌、乳癌、眼晶體、結腸、胰臟、腎臟、肝臟、卵巢及支氣管上皮。
與其他癌症療法之組合
原纖蛋白質之治療性投藥可包括作為治療性方案中一部分的投藥，該治療性方案可與或不與其他標準抗癌症治療法結合，該療法包括(但不限於)免疫療法、化學治療劑及手術(例如如下文進一步所述之彼等手術)。
另外，原纖蛋白質之治療性投藥亦可用於治療抗癌症療法治療後之個體，其中該抗癌症療法可為例如手術、放射療法、投與化學治療劑及其類似療法。使用本發明之原纖蛋白質的癌症療法亦可與免疫療法組合使用。在其他實例中，原纖蛋白質可與一或多種化學治療劑(例如環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿黴素(doxorubicin)、長春新鹼(vincristine)及潑尼松(prednisone)(CHOP))組合投與，及/或與放射治療組合及/或與外科介入(例如在移除腫瘤之手術前或手術後)組合投與。當原纖蛋白質與外科介入結合使用時，原纖蛋白質可在移除癌細胞之手術之前、期間或之後投與，且可全身投與或在外科部位局部投與。上述單獨或組合形式之原纖蛋白質可全身投與(例如藉由非經腸投藥，例如藉由靜脈內途徑)或局部投與(例如在局部腫瘤部位，例如藉由腫瘤內投藥(例如投與至實體腫瘤中、投與至淋巴瘤或白血病所涉及之淋巴結中)、投與至供應實體腫瘤之血管中等)。
各種癌症療法中之任一者可與本文所述之原纖蛋白質療法組合使用。該等癌症療法包括手術(例如癌性組織之外科移除)、放射療法、骨髓移植、化學治療性治療、生物反應調節劑治療及上述各者之某些組合。
「放射療法」包括(但不限於)來自外部施用源(諸如光束)或藉由植入小放射性源所獲得之X射線或γ射線。
化學治療劑為可減少癌細胞增殖之非肽(亦即非蛋白質)化合物，且涵蓋細胞毒性劑及細胞生長抑制劑。化學治療劑之非限制性實例包括烷基化劑、亞硝基脲、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、植物(長春花)生物鹼及類固醇激素。
用於減少細胞增殖之藥劑為此項技術所已知且廣泛使用。該等藥劑包括烷基化劑，諸如氮芥類、亞硝基脲、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸鹽及三氮烯，包括(但不限於)氮芥、環磷醯胺(CYTOXANTM )、美法侖(melphalan)(L-沙可來新(sarcolysin))、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU)、鏈佐星(streptozocin)、氯脲黴素(chlorozotocin)、尿嘧啶氮芥、鹽酸氮芥、異環磷醯胺(ifosfamide)、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷(pipobroman)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基硫代磷胺、白消安(busulfan)、氮烯唑胺(dacarbazine)及替莫唑胺(temozolomide)。
抗代謝藥包括葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷去胺酶抑制劑，包括(但不限於)阿糖胞苷(cytarabine)(CYTOSAR-U)、胞嘧啶阿拉伯糖、氟尿嘧啶(5-FU)、氮尿苷(FudR)、6-硫鳥嘌呤、6-巰基嘌呤(6-MP)、噴司他丁(pentostatin)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲胺喋呤(methotrexate)、10-炔丙基-5,8-雙去氮葉酸鹽(PDDF、CB3717)、5,8-雙去氮四氫葉酸酸(DDATHF)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、氟達拉賓磷酸鹽(fludarabine phosphate)、噴司他丁及吉西他濱(gemcitabine)。
適合之天然產物及其衍生物(例如長春花生物鹼、抗腫瘤抗生素、酶、淋巴因子及表鬼臼毒素)包括(但不限於)Ara-C、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL)、多西他賓(docetaxel)(TAXOTERE)、去氧柯福黴素(deoxycoformycin)、絲裂黴素-C(mitomycin-C)、L-天冬醯胺酶、硫唑嘌呤；布喹那(brequinar)；生物鹼，例如長春新鹼、長春鹼(vinblastine)、長春瑞賓(vinorelbine)、長春地辛(vindesine)等；鬼臼毒素，例如依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)等；抗生素，例如蒽環黴素(anthracycline)、道諾黴素鹽酸鹽(daunorubicin hydrochloride)(道諾黴素、紅比黴素(rubidomycin)、柔紅黴素(cerubidine))、黃膽素(idarubicin)、阿黴素、表柔比星(epirubicin)及N-嗎啉基衍生物等；吩噁嗪酮(phenoxizone)雙環肽，例如更生黴素(dactinomycin)；鹼性醣肽，例如博來黴素(bleomycin)；蒽醌醣苷，例如普卡黴素(plicamycin)(米拉黴素(mithramycin))；蒽醌，例如米托蒽醌(mitoxantrone)；氮雜環丙稀幷吡咯幷吲哚二酮(azirinopyrrolo indoledione)，例如絲裂黴素；大環免疫抑制劑，例如環孢靈(cyclosporine)、FK-506(他克莫司(tacrolimus)、普樂可複(prograf))、雷帕黴素(rapamycin)等；及其類似物。
其他抗增殖細胞毒性劑包括那韋比尼(navelbene)、CPT-11、阿那曲唑(anastrazole)、來曲唑(letrazole)、卡培他濱(capecitabine)、瑞洛昔芬(reloxafine)、環磷醯胺、異環磷醯胺及屈洛昔芬(droloxafine)。
具有抗增殖活性之微管影響劑亦適用且包括(但不限於)別秋水仙鹼(allocolchicine)(NSC 406042)、軟海綿素B(Halichondrin B)(NSC 609395)、秋水仙鹼(colchicine)(NSC 757)、秋水仙鹼衍生物(例如33410)、dolstatin 10(NSC 376128)、美登素(maytansine)(NSC 153858)、根瘤菌素(rhizoxin)(NSC 332598)、太平洋紫杉醇(TAXOL)、TAXOL衍生物、多西他賓(TAXOTERE)、硫代秋水仙鹼(NSC 361792)、三苯甲基半胱胺酸、硫酸長春鹼、硫酸長春新鹼、天然及合成埃坡黴素(epothilone)(包括(但不限於))埃坡黴素A、埃坡黴素B、迪斯德莫來(discodermolide)；雌莫司汀(estramustine)、諾考達唑(nocodazole)及其類似物。
適合使用之激素調節劑及類固醇(包括合成類似物)包括(但不限於)腎上腺類固醇，例如潑尼松、地塞米松(dexamethasone)等；雌激素及孕激素，例如己酸羥孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、雌二醇、氯酚(clomiphene)、他莫昔芬(tamoxifen)等；及腎上腺皮質抑制劑，例如胺魯米特(aminoglutethimide)；17α-炔雌醇；已烯雌酚、睾固酮、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、睾內酯、甲潑尼龍(methylprednisolone)、甲基-睾固酮、潑尼龍、曲安西龍(triamcinolone)、氯烯雌醚(chlorotrianisene)、羥孕酮、胺魯米特、雌莫司汀(estramustine)、乙酸甲羥孕酮、亮丙立德(leuprolide)、氟他胺(Flutamide)(Drogenil)、托瑞米芬(Toremifene)(Fareston)及ZOLADEX。雌激素刺激增殖及分化，因此結合於雌激素受體之化合物用於阻斷此活性。皮質類固醇可抑制T細胞增殖。
其他化學治療劑包括金屬錯合物，例如順鉑(cisplatin)(cis-DDP)、卡鉑(carboplatin)等；脲，例如羥脲；及肼，例如N-甲基肼；表鬼臼毒素；拓撲異構酶抑制劑；丙卡巴肼(procarbazine)；米托蒽醌；甲醯四氫葉酸；喃氟啶(tegafur)等。其他相關抗增殖劑包括免疫抑制劑，例如黴酚酸、沙力度胺(thalidomide)、去氧斯匹胍素(desoxyspergualin)、氮雜孢靈(azasporine)、來氟米特(leflunomide)、咪唑立賓(mizoribine)、氮雜螺烷(SKF 105685)；IRESSA?(ZD 1839，4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基-6-(3-(4-嗎啉基)丙氧基)喹唑啉)等。
「紫杉烷」包括太平洋紫杉醇，以及任何活性紫杉烷衍生物或前藥。「太平洋紫杉醇」(應瞭解在本文中其包括類似物、調配物及衍生物，例如多西他賓、TAXOL、TAXOTERE(多西他賓之調配物)、太平洋紫杉醇之10-去乙醯基類似物及太平洋紫杉醇之3'N-去苯甲醯基-3'N-第三丁氧羰基類似物)，其皆可容易利用熟習此項技術者已知之技術來製備。
太平洋紫杉醇應理解為不僅指化學上可得到的常見太平洋紫杉醇形式，亦指其類似物及衍生物(例如如上文所述之TAXOTERETM多西他賓)及太平洋紫杉醇結合物(例如太平洋紫杉醇-PEG、太平洋紫杉醇-葡聚糖或太平洋紫杉醇-木糖)。
在根據本發明之方法治療一些個體時，可能需要使用高劑量方案與用於非惡性細胞之救援藥劑併用。在該治療中，可使用能夠救援非惡性細胞之任何藥劑，諸如嗜橙菌因子(citrovorum factor)、葉酸鹽衍生物或甲醯四氫葉酸。該等救援藥劑為一般技術者所熟知。救援藥劑包括不會干擾本發明化合物調節細胞功能之能力的彼等藥劑。
原纖蛋白質之投藥
向身體之不同部分投與原纖蛋白質可經由各種方法達成，包括腫瘤內、靜脈內、皮內、皮下、經口(例如吸入)、經皮(亦即局部)、經黏膜、腹膜內、動脈內及經直腸投藥。其他適合之途徑包括如下方式投與組合物：經口、經頰、經鼻、經鼻咽、非經腸、經腸、經胃、局部、經皮、皮下、肌肉內、以錠劑、固體、散劑、液體、氣溶膠形式、病灶內注入腫瘤中、病灶內注入腫瘤附近、靜脈內輸注及動脈內輸注。可在添加或不添加賦形劑之情況下進行局部或全身投藥。亦可經由緩慢釋放模式在個體之腫瘤部位或腫瘤部位周圍進行投藥。
熟習此項技術者應瞭解各種適於向有需要之個體或宿主(例如患者)投與本發明之調配物的方法為可用的，且儘管一種以上途徑可用於投與特定調配物，但特定途徑可提供比另一途徑更即時及更有效的反應。
片語「治療有效量」係指在適用於任何醫學治療之合理益處/風險比下，產生某種所欲作用的量。有效量可隨各種因素而變化，諸如所治療之疾病或病狀、所投與之特定標靶構築體、個體體型或疾病或病狀之嚴重程度。一般技術者可憑經驗確定特定化合物之有效量而無需不當實驗。
根據例示性實施態樣，蛋白質可作為組合物之一部分來投與，其在下文更詳細地描述。該組合物可呈各種形式，包括散劑、乳膏、凝膠、油膏、軟膏、溶液、錠劑、膠囊、噴霧及貼片。媒劑及載劑可用於向患者傳遞組合物。該等載劑包括增溶劑、稀釋劑及分散介質。此等載劑為生物相容性、醫藥學上可接受的，且不改變原纖蛋白質之治療特徵。賦形劑、佐劑及其他成分也可包括在組合物中。
劑量
在方法中，向有需要之個體投與有效量之原纖蛋白質。詳言之，特別所欲之原纖蛋白質為當投與有效量之原纖蛋白質時可抑制宿主之癌症轉移的彼等原纖蛋白質。所投與之量視投藥目的、待治療個體之健康及身體狀況、年齡、待治療個體之分類組(例如人類、非人類靈長類、靈長類等)、所需解析度、原纖蛋白質組合物之調配、治療臨床醫師對醫學情形之評估及其他相關因素而變化。預期該量將在相對寬的範圍內，此可經由常規試驗來測定。舉例而言，用於抑制癌症轉移之原纖蛋白質的量不超過大約可另外對個體產生不可逆毒性之量(亦即最大耐受劑量)。在其他情況下，該量大約為或甚至遠低於毒性臨限值，但仍在免疫有效濃度範圍內，或甚至低至臨限劑量。
個別劑量通常不小於對個體產生可量測效果所需之量，且可根據原纖蛋白質或其副產物之吸收、分佈、代謝及排泄(「ADME」)的藥物動力學及藥理學及因此根據組合物在個體體內之分佈來確定。此包括考慮投藥途徑以及劑量，其可在局部(主要為了局部效果而直接施用於需要作用之處)、腸內(經由消化道施用以便當保留在一部分消化道中時有全身或局部效果)或非經腸(藉由除消化道外之途徑施用以達成全身或局部效果)施用中進行調整。舉例而言，通常經由注射，且經常為經靜脈內、肌肉內、腫瘤內或其組合來投與原纖蛋白質。
原纖蛋白質可藉由輸注或藉由局部注射來投與，例如藉由以約50 mg/h至約400 mg/h之速率輸注，包括約75 mg/h至約375 mg/h、約100 mg/h至約350 mg/h、約150 mg/h至約350 mg/h、約200 mg/h至約300 mg/h、約225 mg/h至約275 mg/h。可達成所欲治療劑量之輸注例示性速率為，例如每天約0.5 mg/m2 至每天約10 mg/m2 ，包括每天約1 mg/m2 至每天約9 mg/m2 、每天約2 mg/m2 至每天約8 mg/m2 、每天約3 mg/m2 至每天約7 mg/m2 、每天約4 mg/m2 至每天約6 mg/m2 、每天約4.5 mg/m2 至每天約5.5 mg/m2 。可經所需時段重複投藥(例如藉由輸注)，例如經約1天至約5天重複或每幾天(例如約五天、約1個月、約2個月等)重複一次。其亦可在其他治療性介入(諸如移除癌細胞之外科介入)之前、期間或之後投與。原纖蛋白質亦可作為組合療法之一部分來投與，其中向個體投與免疫療法、癌症化學療法或放射療法中之至少一者(如下文更詳細地描述)。
原纖蛋白質在個體體內之清除及其相應生物活性通常係藉由相對於存在於相關標靶處之原纖蛋白質的部分來量測。舉例而言，原纖蛋白質在投與後可與使物質集中於癌細胞及癌性組織中之糖結合物(glycoconjugate)或其他生物學標靶一起積累。因此，投與原纖蛋白質會隨時間積累在相關標靶中的給藥方案，可作為允許降低個體劑量之策略的一部分。此亦可意謂，例如在活體內較慢清除之原纖蛋白質的劑量可低於由活體外檢定計算之相對有效濃度(例如活體外有效量接近mM濃度，相對於活體內小於mM的濃度)。
舉例而言，劑量或給藥方案之有效量可藉由特定原纖蛋白質抑制細胞移行之IC50 來量測。「IC50 」意指在活體外50%抑制所需之藥物濃度。或者，有效量可藉由特定原纖蛋白質濃度之EC50 來量測。「EC50 」意指在活體內獲得50%最大作用所需之血漿濃度。在相關實施態樣中，劑量亦可根據ED50 (有效劑量)來確定。
一般而言，相對於本發明之原纖蛋白質，有效量通常不超過所計算之IC50 的200倍。通常，相較於所計算之IC50 ，所投與之原纖蛋白質量小於約200倍、小於約150倍、小於約100倍，且許多實施態樣小於約75倍、小於約60倍、50倍、45倍、40倍、35倍、30倍、25倍、20倍、15倍、10倍，且甚至小於約8倍或2倍。在一個實施態樣中，有效量為所計算之IC50 的約1倍至50倍，且有時為所計算之IC50 的約2倍至40倍、約3倍至30倍或約4倍至20倍。在其他實施態樣中，有效量與所計算之IC50 相同，且在某些實施態樣中，有效量為大於所計算之IC50 的量。
有效量可能不會大於所計算之EC50 的100倍。舉例而言，相較於所計算之EC50 ，所投與之原纖蛋白質量小於約100倍、小於約50倍、小於約40倍、35倍、30倍或25倍且許多實施態樣係小於約20倍、小於約15倍且甚至小於約約10倍、9倍、9倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍或1倍、有效量可為所計算之EC50 的約1倍至30倍，且有時為所計算之EC50 的約1倍至20倍或約1倍至10倍。有效量亦可與所計算之EC50 相同或大於所計算之EC50 。IC50 可藉由活體外抑制細胞移行/侵入來計算。程序可藉由此項技術中已知或如以下實例中所述之方法來進行。
劑量及/或給藥方案之有效量可易於由檢定、由安全性及不斷增加及劑量範圍試驗、個別臨床醫師-患者關係、以及活體外及活體內檢定(諸如本文所述之彼等檢定)憑經驗測定且在以下實驗章節中說明。舉例而言，用於對小鼠進行本發明方法之濃度在以小鼠之體重計約1 mg/kg至約25 mg/kg之範圍內。基於此資料，可用於人類之原纖蛋白質之濃度的一實例可在約0.083 mg/kg至約2.08 mg/kg之範圍內。其他劑量可由使用動物模型之實驗，使用此項技術中已知之方法來測定(Reagan-Shaw等人，(2007)The FASEB Journal 22:659-661)。
醫藥調配物
本發明亦提供含有用於上述治療方法中之原纖蛋白質的醫藥組合物。為了方便起見，術語「原纖蛋白質組合物」在本文中一般用於指包含本發明之原纖蛋白質、包括經結合原纖蛋白質或兩者的組合物。下文描述適用於抑制癌細胞生長及/或轉移之組合物。
如上文所述，原纖蛋白質組合物(例如呈醫藥學上可接受之鹽形式)可經調配用於經口、局部或非經腸投藥。在某些實施態樣中，例如當以液體可注射液形式投與原纖蛋白質時(諸如在將其經靜脈內或直接投與組織之實施態樣中)，以即用劑型或以由醫藥學上可接受之載劑及賦形劑構成之可復原且儲存穩定的粉末或液體形式提供原纖蛋白質調配物。
下文及在美國專利公開案第2008/0300186號(該案之揭示內容以引用的方式併入本文中)中描述製造適合於投與個體(例如人類個體)之原纖蛋白質的方法。調配原纖蛋白質之實例方法可涉及含有有效量之原纖蛋白質及醫藥賦形劑(例如生理食鹽水)的醫藥組合物。該醫藥組合物可視情況包括其他添加劑(例如緩衝液、穩定劑、防腐劑及其類似物)。有效量之原纖蛋白質可為有效使得癌症轉移(例如癌症移行及/或侵入)減少之量。治療性目的(例如降低腫瘤負荷及/或限制癌生長)可藉由根據不同給藥方案給與單次或多次劑量來完成。
醫藥調配物中原纖蛋白質之濃度可不同，亦即小於約0.1重量%、一般為約2重量%或至少約2重量%至高達20重量%至50重量%或更大，且將主要藉由流體體積、黏度等根據所選特定投藥模式及患者需要來選擇。所得組合物可呈溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、散劑、凝膠、乳膏、洗劑、軟膏、氣溶膠或其類似物之形式。製備非經腸可投與組合物之實際方法可為習知者或熟習此項技術者顯而易見者，以及詳細地描述於諸如Remington's Pharmaceutical Science，第18版，Mack Publishing Company,NY(1995)之刊物中者。
根據本發明另一態樣，原纖HSA可與可由熟習此項技術者在閱讀本發明後，所鑑別之其他活性劑、載劑、媒劑、賦形劑或助劑一起包括在醫藥或營養組合物中。
醫藥或營養組合物較佳包含至少一種醫藥學上可接受之載劑。在該等醫藥組合物中，原纖HSA或原纖HSA等效物形成「活性化合物」，亦稱為「活性劑」。如本文中所使用，措辭「醫藥學上可接受之載劑」包括溶劑、分散介質、塗層、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物，其與醫藥學投藥相容。補充性活性化合物亦可併入組合物中。醫藥組合物經調配成與其所欲投藥途徑相容。投藥途徑之實例包括非經腸投藥，例如靜脈內、皮內、皮下、經口(例如吸入)、經皮(局部)、經黏膜及經直腸投藥。用於非經腸、皮內或皮下施用之溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、生理食鹽水溶液、不揮發性油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝液，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及張力調節劑，諸如氯化鈉或葡萄糖。pH可由諸如氫氯酸或氫氧化鈉之酸或鹼調整，非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓶、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。
適於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(若可溶於水)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投藥，適合之載劑包括生理食鹽水、抑菌水、EL(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物必須無菌且應為流體，達到易於注射之程度。其在製造及儲存條件下應穩定且必須在防止諸如細菌及真菌之微生物的污染下保存。載劑可為含有例如以下之溶劑或分散介質：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液態聚乙二醇及其類似物)及其適合之混合物。可例如藉由使用諸如卵磷脂之塗層，在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。可由各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物)來達成防止微生物作用。根據實施態樣，在組合物中添加等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可藉由在組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)而使可注射組合物之吸收延長。
無菌可注射溶液可以如下方式製備：將所需量之活性化合物視需要與上述成分中之一者或組合一起併入適當溶劑中，繼而過濾滅菌。一般，藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及以上所列舉之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，製劑係藉由真空乾燥及凍乾來製備，由先前經無菌過濾之溶液產生活性成分加上任何其他所需成分之粉末。
當經口投藥時應認知到，應防止原纖蛋白質被消化。此通常藉由使原纖蛋白質與組合物複合以使其抗酸性及抗酶促水解，或藉由包裝於具有適當抗性之載劑(脂質體)中來完成。防止相關化合物被消化的方法為此項技術所熟知。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或食用載劑。出於經口治療性投藥之目的，活性化合物可與賦形劑合併且以錠劑、片劑或膠囊(明膠膠囊)形式使用。口服組合物亦可使用流體載劑製備以用作漱口劑。可包括醫藥學上相容之黏合劑及/或佐劑物質作為組合物之部分。錠劑、丸劑、膠囊、片劑及其類似物可含有任何以下成分或具有類似特性之化合物：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如海藻酸、澱粉羥基乙酸鈉或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，諸如膠態二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或草莓、櫻桃、葡萄、檸檬或橙子味調味劑。
對於藉由吸入投藥而言，化合物以氣溶膠噴霧形式自含有適合推進劑(例如氣體，諸如二氧化碳)之加壓容器或施配器傳遞。
為增加血清半衰期，所注射之原纖蛋白質製劑亦可被囊封、引入脂質體腔中、製成膠體、經聚乙二醇化(Greenwald等人，(2003)Advanced Drug Delivery Rev. 55:217-250；Pasut等人，(2004) Expert Opin. Ther. Patents 14:859-894)或可使用使得血清半衰期延長之其他習知技術。用於製備脂質體的各種方法可為，如例如Szoka等人，(1980)Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467、美國專利第4,235,871號、第4,501,728號及第4,837,028號中所述者。亦可以控制釋放或緩慢釋放形式提供製劑，以釋放及投與呈混合物形式之原纖蛋白質組合物，或以連續方式釋放及投與原纖蛋白質組合物。
根據本發明的實施態樣，使用PLGA之微粒或奈米粒子(脂質體)完成玻璃體內注射。亦可使用PEG為基礎之形式。因此，用於可注射醫藥組合物之其他方法經明確考慮後亦可用於玻璃體內注射。
亦可經黏膜或經皮進行全身性投藥。對於經黏膜或經皮投藥而言，在調配物中使用對於待滲透之障壁而言適當的滲透劑。該等滲透劑通常為此項技術所已知，且對於經黏膜投藥而言，包括例如經黏膜投藥、洗滌劑、膽汁鹽及梭鏈孢酸衍生物。可經由使用經鼻噴霧或栓劑完成經黏膜投藥。對於經皮投藥而言，可將活性化合物調配成如通常此項技術中已知之軟膏、油膏、凝膠或乳膏。化合物亦可製成栓劑(例如與諸如可可脂及其他甘油酯之習知栓劑基劑一起製備)或用於直腸傳遞之保留灌腸劑形式。
除其他形式之傳遞外，化合物可經由滴眼劑或眼內注射來傳遞。關於滴眼劑，本發明之組合物視情況包含一或多種欲局部施用於眼或鼻之賦形劑。欲局部施用於眼之醫藥組合物中常用之賦形劑(諸如溶液或噴霧)包括(但不限於)張力劑、防腐劑、螯合劑、緩衝劑、界面活性劑及抗氧化劑。合適之張力調節劑包括甘露糖醇、氯化鈉、甘油、山梨糖醇及其類似物。合適之防腐劑包括對羥基苯甲酸酯、氯苄烷銨、苯紮溴銨(benzododecinium bromide)、聚四級銨-1及其類似物。合適之螯合劑包括乙二胺四乙酸鈉及其類似物。適合之緩衝劑包括磷酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽及類似物。合適之界面活性劑包括離子性及非離子性界面活性劑，但非離子性界面活性劑為較佳，諸如聚山梨醇酯、聚乙氧基蓖麻油衍生物及乙氧基化第三辛基苯酚甲醛聚合物(泰洛沙泊(tyloxapol))。合適之抗氧化劑包括亞硫酸鹽、抗壞血酸鹽、BHA及BHT。本發明之組合物視情況包含額外的活性劑。除視情況選用之防腐劑成分(例如聚四級銨-1)外，本發明之組合物較佳不含有除聚乙烯吡咯啶酮或聚苯乙烯磺酸外之任何聚合成分。
當本發明之組合物含有聚乙烯吡咯啶酮時，較佳選擇或處理聚乙烯吡咯啶酮成分以使過氧化物含量減至最少。相對於放久了的批料，新鮮製造之聚乙烯吡咯啶酮批料為較佳。另外，尤其在組合物將含有大於0.5%聚乙烯吡咯啶酮之情況下，聚乙烯吡咯啶酮成分應在與奧洛他定(olopatadine)混合之前，經熱處理(亦即加熱至高於室溫之溫度)以減少聚乙烯吡咯啶酮成分中之過氧化物量，並使過氧化物對奧洛他定之化學穩定性的作用減至最少。雖然熱處理聚乙烯吡咯啶酮水溶液較長時間將實質上減少過氧化物之量，但其可導致聚乙烯吡咯啶酮溶液變色(由黃色變為黃棕色)。為實質上減少或消除過氧化物而不使聚乙烯吡咯啶酮溶液變色，聚乙烯吡咯啶酮水溶液之pH值應在其加熱之前調整至pH 11-13。若提高聚乙烯吡咯啶酮溶液之pH值，則需要短得多的加熱時間來達成過氧化物含量之顯著減少。
一種適於熱處理聚乙烯吡咯啶酮成分之方法如下。首先，使聚乙烯吡咯啶酮成分溶解於純水中以製備4-6%溶液，接著將該溶液之pH值升高至pH 11-13，(pH值之有效範圍為11-11.5)，接著加熱至在60-121℃、較佳65-80℃且最佳70-75℃範圍內之溫度。應維持高溫約30-120分鐘(較佳30分鐘)。使加熱之溶液冷卻至室溫後，添加HCl以將pH值調整至3.5-8，此視用於奧洛他定組合物之目標pH值而定。
特定言之，對於欲投與作為滴眼劑之組合物而言，組合物較佳含有足以使最終組合物具有眼科可接受之滲透壓度(通常150-450 mOsm，較佳250-350 mOsm)之量的張力調節劑。本發明之眼用組合物較佳具有4-8之pH值、較佳6.5-7.5之pH值且最佳6.8-7.2之pH值。
本發明之滴眼組合物較佳包裝於不透明塑膠容器中。用於眼用產物之較佳容器為已使用環氧乙烷而非γ照射滅菌之低密度聚乙烯容器。
關於眼用可注射液，本發明之醫藥組合物藉由結膜下投與來投遞至需要治療之區域。一種結膜下投與眼部之較佳方法為藉由包含本文所揭示之醫藥組合物的可注射調配物來達成。另一結膜下投藥之較佳方法為藉由包含緩慢釋放組合物之植入來達成。
根據實施例，結膜下傳遞之組合物包含含適於結膜下投藥之活性劑的眼用儲槽式調配物。根據實施態樣，眼用儲槽式調配物包含基本上純活性劑之微粒。該等微粒可包埋於生物相容性醫藥學上可接受之聚合物或脂質囊封劑中。儲槽式調配物可適合於長時間釋放所有或實質上所有活性物質。聚合物或脂質基質(若存在)可適合於在釋放所有或實質上所有活性劑後降解至足以自投藥部位轉移。儲槽式調配物可為包含醫藥學上可接受之聚合物及溶解或分散之活性劑的液體調配物。一旦注射後，聚合物在注射部位形成儲槽，例如藉由凝膠化或沈澱來達成。
適合於植入眼部之固體物件亦可依形成包含聚合物之方式設計，並可為生物可侵蝕性或非生物可侵蝕性的。可用於製備帶有本發明之組合物的眼用植入物之生物可侵蝕性聚合物包括(但不限於)脂族聚酯，諸如聚(乙交酯)、聚(丙交酯)、聚(ε-己內酯)、聚(羥基丁酸酯)及聚(羥基戊酸酯)、聚胺基酸、聚原酸酯、聚酸酐、脂族聚碳酸酯及聚醚內酯之聚合物及共聚物。適合非生物可侵蝕性聚合物的範例為聚矽氧彈性體。
根據實施態樣，可與保護化合物以免自身體快速消除之載劑一起製備活性化合物，諸如控制釋放調配物，包括植入物及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之方法對於熟習此項技術者係顯而易知者。該等物質亦可自Alza Corporation及Nova Pharmaceuticals,Inc購得。脂質懸浮液(包括靶向感染細胞特異性抗原之單株抗體之細胞的脂質體)亦可用作醫藥學上可接受之載劑。
原纖蛋白質組合物可以單一醫藥調配物形式投與。其亦可與有效量之另一藥劑(包括其他適合之化合物及載劑)一起投與，且亦可與其他活性劑組合使用。因此，本發明亦包括包含醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。
醫藥學上可接受之賦形劑包括例如任何適合之媒劑、佐劑、載劑或稀釋劑，且為公眾易於得到者。本發明之醫藥組合物可進一步含有如此項技術中所熟知之其他活性劑。醫藥學上可接受之賦形劑亦為熟習此項技術者所熟知且易於得到者。
舉例而言，原纖蛋白質組合物可與習知醫藥學上可接受之載劑及賦形劑(亦即媒劑)混合，且以水溶液、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿劑、粉片、貼片及其類似物之形式使用，但通常原纖蛋白質係以可注射液的形式提供。醫藥組合物可含有常見載劑及賦形劑，諸如玉米澱粉或明膠、乳糖、右旋糖、蔗糖、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、磷酸二鈣、氯化鈉及海藻酸。調配物中常用之崩解劑包括交聯羧甲纖維素、微晶纖維素、玉米澱粉、羥基乙酸澱粉鈉及海藻酸。亦可包括防腐劑及其類似物。此等組分各為此項技術所熟知。在某些實施態樣中，該等醫藥組合物含有約0.1重量%至約90重量%活性化合物，且更通常為約1重量%至約30重量%活性化合物。參見例如美國專利第5,985,310號，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
原纖蛋白質組合物可在醫藥學上可接受之賦形劑中提供，其可為溶液，諸如水溶液，常常為生理食鹽水溶液，或其可以散劑形式提供。原纖蛋白質組合物可含有其他組分，諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、鎂、碳酸鹽及其類似物。組合物視需要可含有醫藥學上可接受之助劑物質以接近生理條件，諸如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉及其類似物。
賦形劑之選擇將部分由特定化合物，以及由用於投與組合物之特定方法決定。因此，本發明之醫藥組合物存在各種適合的調配物。以下方法及賦形劑僅為例示性的且不以任何方式進行限制。
液體組合物通常將由化合物或醫藥學上可接受之鹽於適合之液體載劑(例如乙醇、甘油、山梨糖醇、非水性溶劑(諸如聚乙二醇、油或水))中的懸浮液或溶液，及懸浮劑、防腐劑、界面活性劑、濕潤劑、調味劑或著色劑構成。或者，液體調配物可由可復水粉末製備。
適於非經腸投藥之醫藥調配物包括水性及非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預定接受者之血液等張之溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑及增稠劑。調配物可於單位劑量或多劑量容器(例如密封安瓶及小瓶)中提供，且可在冷凍乾燥(凍乾)條件下儲存，從而僅需添加無菌液體載劑(例如注射用水)即可使用。注射溶液及懸浮液可由前述類型之無菌粉末、顆粒及錠劑製備。
當非經腸給與時具有活性的本發明之原纖蛋白質及其醫藥學上可接受之鹽可經調配用於肌肉內、鞘內或靜脈內投藥。用於肌肉內或鞘內投藥之典型組合物將為活性成分之油(例如花生油或芝麻油)懸浮液或溶液。用於靜脈內或鞘內投藥之典型組合物將為含有例如活性成分及右旋糖或氯化鈉或右旋糖與氯化鈉之混合物的無菌等張水溶液。其他實例為乳酸鹽林格氏注射液(Ringer's injection)、乳酸鹽林格氏注射液加上葡萄糖注射液、Normosol-M及右旋糖、Isolyte E、醯化林格氏注射液及其類似物。視情況，共溶劑(例如聚乙二醇)、螯合劑(例如乙二胺四乙酸)及抗氧化劑(例如偏亞硫酸氫鈉)可包括在調配物中。或者，可凍乾溶液，接著在即將投藥前用以適合之溶劑復水。
在經直腸投藥時，具有活性的本發明之原纖蛋白質及其醫藥學上可接受之鹽可調配為栓劑。典型栓劑調配物通常由活性成分與黏合劑及/或潤滑劑(諸如明膠或可可脂或其他低熔點植物或合成蠟或脂肪)組成。
在局部投藥時，具有活性的本發明之原纖蛋白質及其醫藥學上可接受之鹽可調配為經皮組合物或經皮傳遞裝置(「貼片」)。該等組合物包括例如襯底活性化合物儲集層、控制膜、襯膜及接觸黏著劑。可使用該等經皮貼片來連續或不連續輸注控制量之本發明化合物。用於傳遞藥劑之經皮貼片的構造及其使用係為此項技術所熟知者。參見例如美國專利第5,023,252號，其以引用的方式併入本文中。該等貼片可經構建用於連續、脈衝式或按需要傳遞藥劑。
本發明之調配物可製成經由吸入投與之氣溶膠調配物。此等氣溶膠調配物可置於經加壓之可接受的推進劑中，諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及其類似物。其亦可調配為用於未加壓製備之藥劑，諸如用於噴霧器或霧化器。
適於局部投藥之調配物可以除活性成分外還含有如此項技術中已知為適當之該等載劑的乳膏、凝膠、糊劑或泡沫形式呈現。
栓劑調配物亦可藉由與各種基劑(諸如乳化基劑或水溶性基劑)混合來提供。適於經陰道投藥之調配物可以子宮托、棉塞、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫形式呈現。
可提供用於經口或經直腸投藥之單位劑型(諸如糖漿、酏劑及懸浮液)，其中各劑量單位(例如一茶匙量、一湯匙量、錠劑或栓劑)含有預定量之含有一或多種原纖蛋白質之組合物。類似地，用於注射或靜脈內投藥之單位劑型可包含呈無菌水、生理食鹽水或另一醫藥學上可接受之載劑中之溶液形式的組合物中之原纖蛋白質。
如本文中所使用，術語「單位劑型」係指適用作人類及動物個體之單一劑量的物理個別單位，各單位含有預定量之本發明化合物與醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或媒劑結合，該量據計算為足以產生所需效果之量。本發明之新穎單位劑型的規格視以下因素而定：所用之特定化合物及欲達成之效果，及宿主體內與各化合物相關之藥效學。
熟習此項技術者易於瞭解，劑量可隨特定原纖蛋白質、傳遞媒劑之性質及其類似物改變。特定化合物之適合劑量可由熟習此項技術者藉由多種方法來易於測定。
該等化合物之毒性及治療功效可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥程序來測定，例如測定LD50 (使50%群體致死之劑量)及ED50 (對50%群體治療有效之劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數且其可以比率LD50 /ED50 表示。展現高治療指數之化合物為較佳。雖然可使用展現毒性副作用之化合物，但應慎重設計傳遞系統，其使該等化合物靶向受感染之組織部位以使對未感染細胞之潛在損壞減至最少並進而降低副作用。
自細胞培養物檢定及動物研究獲得之資料可用於計算用於人類之劑量範圍。該等化合物之劑量較佳在包括具有極小毒性或無毒性之ED50 的循環濃度範圍內。該劑量可視所用劑型及所用投藥途徑而在此範圍內變化。對於任何用於本發明之方法的化合物而言，治療有效劑量可最初由細胞培養檢定來評估。劑量可在動物模型中調配以達到包括如在細胞培養物中所測定之IC50 (亦即達成半數最大症狀抑制之測試化合物的濃度)的循環血漿濃度。該等資訊可用於更精確地測定適用於人類之劑量。血漿中之含量可例如藉由高效液相層析來量測。
術語「有效量」係指生物活性分子或其結合物或衍生物足以展現可偵測治療作用而無不當不良副作用(諸如毒性、刺激及過敏反應)之量，其在以本發明之方式使用時與合理的益處/風險比相當。治療作用可包括例如(但不限於)對癌細胞具有實質上細胞毒性，但對天然細胞之細胞毒性較小。用於個體之有效量將視個體類型、個體體型及健康狀況、待治療病狀之性質及嚴重程度、投藥方法、治療持續時間、同時進行之療法的性質(若存在)、所用特定調配物及其類似因素而定。因此，不可能預先規定確切「有效量」。然而，用於特定病況之有效量可由一般技術者使用常規實驗基於本文所提供之資訊來測定。
製備原纖蛋白質之方法
根據本發明，揭示一種藉由投與原纖蛋白質來治療癌症轉移之方法。該原纖蛋白質可為天然存在的，且因此可使用此項技術中已知之方法來分離，以用於上述之治療方法。原纖蛋白質亦可藉由此項技術中已知之任何方法人工製備，例如藉由將球狀蛋白質結構變為原纖蛋白質結構。在一個實例中，蛋白質之原纖化(fibrillization)可藉由無原纖晶種輔助之方法來誘導，如美國專利公開案第2008/0800186號中所揭示者，該案揭示之內容以引用的方式併入本文中。此方法具有如下優點，包括易於控制、製造均勻性及按比例擴大之可行性。此外，蛋白質之原纖化可藉由無原纖晶種輔助之此方法來誘導。即使極少量之蛋白質亦適用於此方法。如本文中所使用，「蛋白質」包括一或多種蛋白質、蛋白質片段、多肽或肽。蛋白質包括合成蛋白質與天然存在之蛋白質。
根據先前美國專利公開案第2008/0800186號中所揭示之方法，即使極少量之蛋白質亦適用於此方法。如本文中所使用，「蛋白質」包括一或多種蛋白質、蛋白質片段、多肽或肽。蛋白質包括合成蛋白質與天然存在之蛋白質。該方法可用於在不考慮序列之情況下以簡單且快速之方式將天然蛋白質轉化為原纖形式。該方法包含以下步驟：將球狀蛋白質溶解於含有洗滌劑溶液中，及將該溶液施加於可分離70kDa分子量或更大之蛋白質的分子篩分管柱上，及用含有洗滌劑之溶液溶離該蛋白質。在一例示性實施例中，該方法包含以下步驟：提供球狀蛋白質，形成含有該球狀蛋白質之溶液，將洗滌劑添加至該含有球狀蛋白質之 溶液中，及將溶液施加於具有可分離70kDa分子量及更大之蛋白質的孔徑，且視情況存在低濃度之洗滌劑之分子篩分管柱上。
球狀蛋白質為蛋白質之兩種主要三級結構類別之一。球狀蛋白質通常可溶且在水中形成球狀分子。其具有複雜二級結構，包含諸如α螺旋、β片及環結構之二級結構基元之混合物。蛋白質之其他主要三級結構類別為原纖蛋白質或纖維狀蛋白質。原纖蛋白質通常不溶且具有細長形狀。其具有更簡單的二級結構且常常僅基於一種類型之二級結構基元。在實施例之實例中，球狀蛋白質為白蛋白，例如人類血清白蛋白、纖維結合蛋白等。亦可使用用8M脲自大腸桿菌之包涵體萃取的重組展開蛋白質，例如口蹄疫病毒之重組衣殼蛋白VP1(rVP1)、口蹄疫病毒之重組鞘蛋白VP2(rVP2)、口蹄疫病毒之重組鞘蛋白VP3(rVP3)，或VP1、VP2、VP3及VP4之前驅蛋白P1。該蛋白亦可為嵌合蛋白，包含來自VP1、VP2、VP3及/或VP4(例如VP42，其包含VP2與VP4之部分)之部分。亦可使用其他球狀蛋白質(例如牛血清白蛋白)，包括天然存在之蛋白質與合成寡肽。
界面活性劑(本文中亦稱為洗滌劑)為能降低水表面張力且增加有機化合物溶解性之物質。洗滌劑可為離子性洗滌劑，包括陽離子性、陰離子性及兩性離子洗滌劑，以及非離子性洗滌劑。洗滌劑在破壞蛋白質中之非共價鍵方面起作用，由此使蛋白質變性以使得其失去其天然形狀或構 形。在例示性實施例中，所用洗滌劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)，自Sigma獲得。在其他例示性實施例中，所用洗滌劑為兩性洗滌劑3-14，自Calbiochem獲得。
澱粉狀蛋白為纖維交叉β蛋白聚集體。許多蛋白質能夠轉化為特徵包括原纖形態、原絲子結構、交叉β繞射圖案、β結構增加、剛果紅(Congo red)結合及ThT結合之澱粉狀蛋白樣原纖。在例示性實施例中，球狀蛋白質轉化形成澱粉狀蛋白樣原纖，其允許由澱粉狀蛋白樣性質鑑別所轉化之蛋白質。
用於治療癌症之蛋白質可基於疾病之嚴重程度及癌細胞所需之細胞毒性來選擇。在例示性實施例中，係選擇對癌細胞有更大細胞毒性者。原纖蛋白質可包括衍生自相同蛋白質類型或一種以上、兩種以上、三種以上或更多類型之原纖蛋白質。舉例而言，上述治療方法可以一次劑量同時投與或分別投與rVP1原纖蛋白質及原纖BSA。
根據實施例，在將球狀蛋白質結構轉化為原纖蛋白質結構並將其分離的方法中可使用層析。雖有方諸如用於薄層層析之彼等其他方法的存在，一般會使用管柱進行層析。層析技術包括尺寸排阻、親和力及離子交換。儘管可分批式製造原纖蛋白質，但利用管柱方法允許以快速、穩定、有效且連續之方式將球狀蛋白質轉化為原纖形式。在使用管柱之情況下，亦有可能按比例擴大此方法。
根據例示性實施例，使用珠粒孔徑為至少約70kDa之尺寸排阻層析。所用之珠粒孔徑可視球狀蛋白質之各種特徵 (例如其尺寸)而變化。該孔徑在允許蛋白質進入珠粒基質中方面起作用，由此產生機械力，其有助於蛋白質展開/摺疊且增強原纖生成集合(fibrillogenic ensemble)。在例示性實施例中，所用之分子篩分管柱為Superdex 200。在其他例示性實施例中，所用之分子篩分管柱為HW55S。
在管柱層析中，可使用含有低濃度洗滌劑之緩衝溶液來溶離管柱。在例示性實施例中，用含有25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.1M NaCl及0.05% SDS之緩衝溶液溶離分子篩分管柱。在其他例示性實施例中，用含有25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.1M NaCl及0.05%兩性洗滌劑3-14之緩衝溶液溶離分子篩分管柱。可將含有原纖蛋白質之溶離液收集在一起。接著可進一步過濾所收集之溶離液以純化及分離原纖蛋白質，例如相對於PBS透析以移除SDS或兩性洗滌劑3-14。
根據實施例，人類血清白蛋白(HSA)可藉由本文所揭示之用於形成原纖蛋白質的方法製成原纖人類血清白蛋白。根據實施例，已證實藉由本文所揭示之方法將人類血清白蛋白轉化為原纖形式。關於形成原纖蛋白質，美國專利第7,488,800號以引用的方式併入本文中。
出人意料地發現，原纖HSA(F-HSA)至少與口蹄疫病毒之重組鞘蛋白(rVP1)同樣有效地引起各種癌細胞凋亡。使用F-HSA替代rVP1作為癌症治療劑之優點在於HSA為人類內源性蛋白質。因此，HSA或其具有類似序列及組成之衍生物與外來蛋白質(諸如rVP1)相比，在臨床應用期間誘導 免疫原性及中和抗體的可能性會較低。
根據實施例，藉由將HSA溶解於1% SDS溶液中，通過Superdex-200凝膠過濾管柱及用含有25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.1M NaCl及0.05% SDS緩衝溶液溶離來產生F-HSA(圖1)。相對於PBS透析以移除SDS後，發現不同於HSA，自Superdex-200管柱溶離之F-HSA展現以劑量依賴性方式增強澱粉狀蛋白特異性染料ThT之螢光量。
接著測定F-HSA誘導癌細胞之細胞毒性。因為原纖血清白蛋白能結合於細胞表面上之受體(諸如整合素)，而球狀血清白蛋白不能與之結合，因此當血清白蛋白之結構自球狀變為原纖形式使得蛋白質能夠選擇性靶向與正常細胞相比表現更多整合素α5β1之癌細胞。F-HSA以劑量依賴方式分別使用0.15μM(圖13)及0.48μM(圖14)之IC50 抑制乳癌細胞生長，包括TS/A(鼠類乳腺癌)及MDA-MB-231(人類乳腺癌)細胞。F-HSA使用0.6μM之IC50 可抑制卵巢癌細胞SKOV3生長(圖15)及使用1.1μM之IC50 可抑制子宮頸癌細胞CaSki生長(圖16)。F-HSA亦分別使用0.35μM(圖17)及0.2μM(圖18)之IC50 可引發前列腺癌細胞PC-3及22Rv1之細胞毒性。另外，F-HSA亦引發許多肺癌細胞株之細胞毒性(圖19)。
因此，根據實施例，揭示一種治療癌症之方法。該方法包含以下步驟：提供HSA，將該HSA變為原纖結構，及向有需要之患者投與治療有效量之F-HSA。HSA轉化為原纖形式可增加其對標靶細胞之細胞毒性效應。
在例示性實施例中，該癌症為腎癌、乳癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、子宮頸癌或卵巢癌。在例示性實施例中，原纖HSA藉由調節Akt信號傳導路徑而在誘導癌細胞凋亡方面起作用。原纖HSA經由調節整合素α5β1或αvβ3導致Akt失活。另外，原纖HSA結合於整合素後，主要經由整合素/FAK/Akt/GSK-3β/Caspase-3路徑引起細胞凋亡。
可基於疾病之嚴重程度及對癌細胞之所需細胞毒性來選擇與用於治療癌症之HSA實質上一致的原纖HSA蛋白質、衍生物、直系同源物或其他蛋白質。在例示性實施例中，針對對癌細胞之更大細胞毒性，選擇具有RGD基元或更大分子量之蛋白質。RGD基元為整合素之配位體。已顯示原纖蛋白質經由調節整合素/Akt信號傳導路徑來誘導細胞死亡。已發現如rVP1-S200及FN-S200，具有RGD基元之原纖蛋白質之細胞毒性比無RGD基元之彼等蛋白質(諸如BSA-S200及rVP3-S200)更大。
「變異體」係指與參考聚核苷酸或多肽不同但保留基本性質之聚核苷酸或多肽。聚核苷酸之典型變異體與另一參考聚核苷酸之不同在於核苷酸序列。變異體核苷酸序列之變化可能或可能不改變由參考聚核苷酸編碼之多肽的胺基酸序列。如本文所論述，核苷酸變化可導致由參考序列編碼之多肽中的胺基酸取代、添加、缺失、融合及截短。
多肽之典型變異體與另一參考多肽之不同在於胺基酸序列。通常，因差異有限會使參考多肽及變異體之序列總體上極為類似且在許多區域一致。變異體與參考多肽之胺基酸序列的不同在於一或多個取代、添加、缺失之任何組合。取代或插入之胺基酸殘基可能或可能不是由遺傳密碼編碼之胺基酸殘基。聚核苷酸或多肽之變異體可為天然存在的，諸如對偶基因變異體，或其可為未知天然存在之變異體。聚核苷酸及多肽之非天然存在之變異體可藉由突變誘發技術或藉由直接合成而製得。
「直系同源物」表示由另一物種獲得之多肽或聚核苷酸為來自不同物種之多肽或聚核苷酸的功能對應物。直系同源物之間的序列差異為物種形成之結果。
如本文中所使用，二十種常見胺基酸及其縮寫沿用常見用法。參見Immunology-A Synthesis(第2版，E. S. Golub及D. R. Gren編，Sinauer Associates，該文獻以引用方式併入本文中。二十種常見胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸(諸如α,α-二取代之胺基酸)、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非習知胺基酸亦可為適用於本發明之多肽的組分。非常見胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文所用之多肽表示法中，根據標準用法及慣例，左手方向為胺基端方向且右手方向為羧基端方向。
術語「實質上一致」在應用於多肽時意謂兩個肽序列在諸如藉由程式GAP或BESTFIT使用預設間隙全數最佳比對時共有至少80%序列一致性、較佳是至少有90%序列一致性、更佳是至少有95%序列一致性而最佳是至少有99%序列一致性。較佳地，不一致之殘基位置的不同在於保守胺基酸的取代。保守胺基酸取代係指具有類似側鏈之殘基的可互換性。舉例而言，一組具有脂族側鏈之胺基酸為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；一組具有脂族-羥基側鏈之胺基酸為絲胺酸及蘇胺酸；一組具有含醯胺側鏈之胺基酸為天冬醯胺酸及麩醯胺酸；一組具有芳族側鏈之胺基酸為苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；一組具有鹼性側鏈之胺基酸為離胺酸、精胺酸及組胺酸；且一組具有含硫側鏈之胺基酸為半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守胺基酸取代組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺酸-麩醯胺酸。
如本文所論述，涵蓋具有細胞毒性活性之組合物之胺基酸序列的次要變化，如由本發明所涵蓋，其限制條件為HSA序列之胺基酸變化維持至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%一致性。詳言之，涵蓋保守胺基酸置換。保守置換為發生於與側鏈相關之胺基酸家族內的彼等置換。基因編碼之胺基酸通常分為以下家族：(1)酸性=天冬胺酸、麩胺酸；(2)鹼性=離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3)非極性=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及(4)極性不帶電=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。其它家族為：絲胺酸及蘇胺酸為脂族-羥基家族；天冬醯胺酸及麩醯胺酸為含有醯胺家族；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸為脂族家族；且苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸為芳族家族。舉例而言，可合理的預期，當以異白胺酸或纈胺酸置換白胺酸、以麩胺酸置換天冬胺酸、以絲胺酸置換蘇胺酸或同樣地將一個胺基酸以結構相關的胺基酸來置換將不會對所得分子之結合或性質產生較大影響，尤其若該置換不涉及構架位點內之胺基酸。胺基酸變化是否產生功能肽可易於藉由分析多肽衍生物之特定活性來判定。本發明之蛋白質或肽之片段或類似物可輕易由一般技術者製備。片段或類似物之較佳胺基及羧基端會靠近功能域之邊界。結構及功能域可藉由比較核苷酸或胺基酸序列資料與公開或專有序列資料庫來鑑別。通常會使用電腦化比較法來鑑別序列基元或所預測之存在於已知結構及/或功能之其他蛋白質中的蛋白質構形域。鑑別摺疊成已知三維結構之蛋白質序列的方法為已知的。例如：Bowie等人，發表於Science 253:164(1991)。因此，前述實例表明，熟習此項技術者可識別可用於定義本發明之結構及功能域的序列基元及結構構形。
有效胺基酸的取代如下彼等胺基酸取代：(1)不易蛋白質水解；(2)不易氧化；(3)改變形成蛋白質複合物之結合親和力；(4)改變結合親和力；及(5)賦予或改變該等類似物之其他物理化學或功能性質。類似物可包括除天然存在之肽序列外之序列的各種突變。舉例而言，單個或多個胺基酸取代(較佳為保守胺基酸取代)可在天然存在之序列中(較佳在形成分子間接觸之域以外的多肽部分中)產生。保守胺基酸取代不應實質上改變親本序列之結構特徵(例如置換胺基酸不應傾向於阻斷存在於親本序列中之螺旋或破壞其他類型之表徵親本序列的二級結構)。此項技術認可之多肽二級及三級結構的實例係描述於Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton編，W.H.Freeman及Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden及J.Tooze編，Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；及Thornton等人，Nature 354：105(1991)中，該等文獻以引用的方式併入本文中。
如本文中所使用，術語「多肽片段」係指缺失胺基端及/或羧基端之多肽，但其餘胺基酸序列與天然存在之序列中由例如全長cDNA序列所推測的相應位置一致。片段通常為至少5、6、8或10個胺基酸長，較佳為至少14個胺基酸長，更佳為至少20個胺基酸長，一般為至少50個胺基酸長，且甚至更佳為至少70個胺基酸長。
製備原纖蛋白質之方法一般涉及將蛋白質溶解於SDS或其他適合之洗滌劑溶液中；施加溶解之蛋白質通過具有能分離70kDa分子量及更大之蛋白質之孔徑的凝膠過濾管柱；自該管柱溶離該蛋白質；及相對於緩衝生理食鹽水透析溶離液以移除SDS或洗滌劑。
在第一步驟中，球狀蛋白質一般被溶解為溶液形式。在一個實例中，將球狀蛋白質溶解於含界面活性劑之PBS 中。界面活性劑(本文中亦稱為洗滌劑)為能降低水表面張力且增加有機化合物溶解性之物質。洗滌劑可為離子性洗滌劑，包括陽離子性、陰離子性及兩性離子洗滌劑，以及非離子性洗滌劑。洗滌劑在破壞蛋白質中之非共價鍵方面起作用，由此使蛋白質變性以使得其失去其天然形狀或構形。在例示性實施例中，所用洗滌劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)，自Sigma獲得。在其他例示性實施例中，所用洗滌劑為兩性洗滌劑3-14，自Calbiochem獲得。
在該方法之一些態樣中，使用珠粒孔徑為至少約70kDa之尺寸排阻層析法。所用之珠粒孔徑可視球狀蛋白質之各種特徵(例如其尺寸)而變化。該孔徑在允許蛋白質進入珠粒基質中方面起作用，由此產生機械力，其有助於蛋白質展開/摺疊且增強原纖生成集合。在例示性實施例中，所用之分子篩分管柱為Superdex 200。在其他例示性實施例中，所用之分子篩分管柱為HW55S。製造原纖蛋白質之方法的其他詳情可見於美國專利公開案第2008/0800186號中，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
闡述以下實例以便向一般技術者提供關於如何構成及使用本發明之全面揭示及描述，但不意欲限制本發明之範疇。
實驗 實例1 方法
細胞株及培養。在37℃下將SK-OV-3細胞(人類卵巢癌細胞株；ATCC HTB-77)及SK-OV-3ip.1細胞及CaSki細胞(人類子宮頸癌細胞株；ATCC CRL-1550)分別維持於麥氏5A(McCoy's 5A)及RPMI-1640培養基中。在37℃下將MDA-MB-231細胞(人類乳腺癌細胞株；ATCC HTB-26)及TS/A細胞(鼠類乳腺癌細胞株)分別維持於杜氏改良伊氏培養基(DMEM)/F12培養基及DMEM中。在37℃下將PC-3細胞(人類前列腺腺癌細胞株；ATCC CRL-1435)及22Rv1細胞(人類前列腺癌細胞株；ATCC CRL-2505)維持於RPMI-1640培養基中。所有培養基均補充有10%胎牛血清(FBS)、2 mM L-麩醯胺酸、100個單位/毫升青黴素及100 μg/ml鏈黴素。
細胞毒性檢定。藉由MTT檢定或WST-1檢定來測定細胞存活率。簡言之，將每孔1×105 個細胞之腫瘤細胞接種於96孔培養板中之無血清培養基中且培育1小時。在37℃下在無血清培養基中用一系列濃度之rVP1、F-BSA或F-HSA處理細胞，持續24小時。在處理後，向各孔中添加MTT溶液(0.5 mg/ml)，隨後培育4小時。活細胞數目與甲臢(formazan)之產生成正比，後者在用異丙醇溶解後，可用ELISA讀板器在570 nm下用分光光度法量測。數據以佔未處理狀況之百分比表示且以平均值±S.D.呈現。
根據製造商之說明書(Roche,Mannheim,Germany)進行WST-1檢定。簡言之，將2×104 個細胞添加至96孔培養板上之每孔100 μl培養基中且在37℃、5% CO2 下在含濕氣培育箱中培育隔夜。將附著於孔之細胞於無血清培養基中培育且用rVP1之連續稀釋液處理。在37℃、5% CO2 下培育16小時以使得藥物見效後，向各孔中添加10 μl WST-1試劑，接著將培養板在振動台上以150 rpm混合1分鐘。在37℃、5% CO2 下再培育2小時以使得WST-1試劑被代謝後，藉由光學密度法(450 nm測試波長、690 nm參考波長)測定存活細胞之比例。存活細胞之百分比按(O.D.處理 /O.D.對照 )×100%計算，而生長抑制之百分比按[1-(O.D.處理 /O.D.對照 )]×100%計算。IC50 為試劑對細胞活力有50%抑制時之濃度。
細胞移行及侵入檢測。根據勃頓腔室(Boyden chamber)移行及侵入檢定(Corning)進行細胞移行及侵入檢定。用20 μg/ml纖維結合蛋白(在細胞移行檢測中)或40 μg/ml Matrigel(在細胞侵入檢測中)塗佈上腔室之8 μm孔膜，置於含1 ml PBS之孔中並在37℃下培育養2小時。將癌細胞(1×105 )懸浮於無血清培養基中並放置於上腔室中1小時。將各種濃度之原纖蛋白質(諸如rVP1)添加至上腔室中，接著將培養基(含10% FBS)添加至下腔室中。在37℃下培養細胞24小時。在培育結束時，藉由用棉花擦拭來移除膜上層之細胞，且藉由使用細胞解離溶液(Sigma)來解離已遷移至膜下表面上之細胞，並以流式細胞儀(BD company)計數。
在BALB/c 小鼠中建立TS/A 乳腺癌的轉移性癌症模式植入。在37℃下在95%空氣及5% CO2 之含濕氣環境下將鼠類TS/A乳腺癌細胞培養於補充有10% FBS、2 mM L-麩醯胺酸、100 U/ml青黴素及100 μg/ml鏈黴素之DMEM中。收細胞後，將TS/A細胞(每隻小鼠3×105 細胞/100微升PBS)經靜脈內注入每組9隻小鼠之側尾靜脈中。藉由靜脈內注射途徑給與對照介質或原纖蛋白質(諸如F-HSA)，每隔一天一次，持續10次。最後，每組犧牲3隻小鼠且將其他小鼠用於存活率檢測。
在另一實驗中，首先在37℃下在95%空氣及5% CO2 之含濕氣環境下將鼠類TS/A乳腺癌細胞培養於補充有0% FBS、2 mM L-麩醯胺酸、100 U/ml青黴素及100 μg/ml鏈黴素之DMEM中，伴以進行或不進行原纖蛋白質(諸如rVP1)(0.1-0.2 μM)處理。在收細胞後，分別將經rVP1預處理或未經rVP1預處理之TS/A細胞經靜脈內注入(每隻小鼠3×105 個/100微升PBS)每組9隻小鼠之側尾靜脈中。在14天後，犧牲所有小鼠且收集肺臟。
在鼠類模型中建立人類乳癌轉移性異種移植模式。在37℃下在95%空氣及5% CO2 之含濕氣環境下將人類MDA-MB-231乳腺癌細胞培養於補充有10% FBS、2 mM L-麩醯胺酸、100 U/ml青黴素及100 μg/ml鏈黴素之DMEM/F12中。之後，將MDA-MB-231細胞(每隻小鼠3×105 /100微升PBS)經靜脈內注入每組9隻小鼠之側尾靜脈中。在腫瘤注射後一天，藉由靜脈內途徑給與原纖蛋白質(諸如F-HSA)(1 mg/Kg BW)，每隔一天一次，持續10次，而對對照組僅注射介質。此時，每組犧牲3隻小鼠且保留其餘小鼠以量測存活率。
在鼠類模型中建立人類前列腺癌原位異種移植模式。在37℃下在95%空氣及5% CO2 之含濕氣環境下將人類PC-3前列腺癌細胞培養於含有10% FBS、2 mM L-麩醯胺酸、100 U/ml青黴素及100 μg/ml鏈黴素之RPMI-1640培養基中。之後，洗滌PC-3細胞且原位注入前列腺(每隻小鼠1×105 /20微升PBS)。在一組中，在PC-3植入後4週，藉由靜脈內途徑給與原纖蛋白質(諸如rVP1)(25 mg/kg)，而在另一組中在癌症植入後10週給與rVP1。投與相同量之rVP1，每週三次，持續6週，且在rVP1處理結束時，各組犧牲3隻小鼠以偵測癌症轉移。保留其餘小鼠以量測存活率。
在鼠類模型中建立人類SK-OV-3 卵巢癌轉移性異種移植模式。按照台灣國防醫學院(National Defense Medical Center,Taiwan)之實驗動物護理及使用的準則進行動物研究。由台灣國家動物中心(National Animal Center,Taiwan)獲得8週齡BALB/cAnN-Foxn1雌性裸小鼠，藉由腹膜內注射，每隻小鼠接種5×106 SK-OV-3癌細胞，在植入SK-OV-3後6天，用原纖蛋白質(例如rVP1，15 mg/Kg BW)或PBS(對照組)處理小鼠，並每隔一日重複該等處理，持續60天。記錄存活率百分比及體重直至小鼠死亡或腫瘤植入後340天為止。
分離SK-OV-3ip.1 細胞。在SK-OV-3細胞植入後60天，藉由瞬間頸部脫臼法來安樂死小鼠。接著將3 ml PBS注入腹部且使用5 ml注射器及25G針獲得腹膜內細胞(約2 ml)。在4℃下將細胞以200×g離心5分鐘且收集細胞離心塊。為移除紅血球，添加5倍細胞體積之NH4 Cl(0.144 M)及1/2倍細胞體積之NH4 HCO3 (0.01 M)且在4℃下培育5分鐘。在4℃下將細胞以200×g離心5分鐘且收集細胞離心塊。在37℃下在5% CO2 含濕氣環境下，將細胞於含20% FBS之麥氏5A培養基中培養3天，藉由SDS-PAGE在8-16%梯度凝膠(Invitrogen)上解析，隨後使用標準西方墨點技術(Western blot technique)，對HER-2受體含量進行西方墨點分析(Western blot analysis)。
組織病理學。將器官固定於10%中性緩衝福馬林(formalin)中。將該等組織進一步包埋於石蠟中，切成4 μm切片，用蘇木精及伊紅(H&E)染色以用於光學顯微法。
統計分析。所有數據均以平均值±標準誤差表示且用Microsoft Excel估算。對於存活率資料，使用對數等級測試來測定經藥物處理或未經藥物處理之各組之間的差異。進行史都登氏(Student's)t檢驗及ANOVA以評估不同處理之間的總體差異。認為P<0.05、P<0.01及P<0.001之值為統計上顯著的。
rVP1在活體外抑制MDA-MB-231細胞、PC-3細胞、22Rv1細胞、SK-OV-3細胞、CaSki細胞及SK-OV-3ip.1細胞之細胞侵入及/或移行
為研究rVP1是否抑制腫瘤細胞侵入及/或移行，使用勃頓腔室檢定來量測細胞侵入及/或移行。在各種濃度(在人類乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞、人類前列腺腺癌細胞株PC-3細胞、人類前列腺癌細胞株22Rv1細胞中為0.1 μM至0.2 μM rVP1；在人類卵巢癌細胞株SK-OV-3細胞及SK-OV-3ip.1細胞中為0.2 μM至0.4 μM rVP1；在人類子宮頸癌細胞株CaSki細胞中為0.2 μM至0.6 μM rVP1)之rVP1處理後，細胞侵入及/或移行得到顯著抑制。應注意，此等濃度之rVP1不影響細胞活力，如藉由使用MTT檢定或WST-1檢定所測定(圖1-3)。因此，rVP1可在活體外顯著抑制人類乳癌、前列腺癌、子宮頸癌及卵巢癌細胞株之轉移。
實例2rVP1在活體內抑制腫瘤細胞轉移
A.在活體外用rVP1處理MDA-MB-231細胞，隨後經靜脈內注入BALB/c小鼠體內。接著檢查是否與未經rVP1預處理之MDA-MB-231細胞相比，MDA-MB-231人類乳腺癌細胞經rVP1預處理24小時可在活體外抑制轉移能力，接著將細胞經靜脈內注入小鼠可減少其在小鼠肺臟中之轉移。資料顯示MDA-MB-231細胞經0.1及0.2 μM rVP1處理可顯著減少癌細胞在小鼠肺臟組織中之轉移(圖4A)。與未經rVP1處理之腫瘤組相比，相關肺臟重量及肺臟內腫瘤病灶數目亦有顯著減少(圖4B-C)。
B.原位PC-3異種移植模型。亦檢查是否rVP1可在活體內抑制前列腺癌轉移。首先將PC-3人類前列腺腺癌細胞原位植入裸小鼠之前列腺中且在植入後4週或10週，接著經靜脈內注射rVP1(25 mg/kg)，每週三次，持續6週。在rVP1處理結束時，犧牲小鼠以進行屍體剖檢。結果顯示rVP1顯著抑制PC-3細胞轉移至淋巴結(表1，圖5A)及髖骨，並抑制髖骨之骨質溶解(圖5B)。
C.轉移性SK-OV-3異種移植模型。活體外結果顯示rVP1抑制SK-OV-3人類卵巢癌細胞侵入。為檢查是否rVP1亦可在活體內抑制SK-OV-3卵巢癌轉移，在人類SK-OV-3卵巢癌之鼠類模型中建立轉移性異種移植模式。發現在60天後，來自經PBS處理之帶有SK-OV-3之小鼠的肝臟被腫瘤細胞包圍。另一方面，在腹膜內注射rVP1(15 mg/kg)(每隔一日，持續60天)之帶有SK-OV-3之小鼠中，未觀察到其肝臟有任何明顯的腫瘤侵入現象(圖6)。
實例3F-HSA在活體外抑制MDA-MB-231細胞、PC-3細胞、22Rv1細胞及CaSki細胞之腫瘤細胞侵入及/或移行
為檢查是否諸如F-HSA之其他原纖蛋白質亦抑制癌細胞侵入及/或移行，藉由使用勃頓腔室檢定來檢測F-HSA對癌細胞侵入及/或移行之影響。在用各種濃度之F-HSA(對於MDA-MB-231細胞為0.1 μM至0.2 μM；對於PC-3細胞為0.025 μM至0.1 μM F-HSA；對於22Rv1細胞為0.025 μM至0.05 μM F-HSA；對於CaSki細胞為0.2 μM至0.4 μM F-HSA)處理後，各種癌細胞之侵入及/或移行能力得到顯著抑制。在此等濃度下，使用MTT檢測得知F-HSA不影響細胞活力(圖7)。
實例4F-HSA在活體內抑制腫瘤細胞轉移
為進一步檢查是否F-HSA可在活體內抑制腫瘤細胞轉移，分別將鼠類乳腺癌TS/A細胞經靜脈內注入BALB/c小鼠之側尾靜脈中或將人類乳腺癌MDA-MB-231細胞注入裸小鼠中。接著第二天經靜脈內注射F-HSA(1 mg/kg)，接著每隔一天注射一次，持續10次。在F-HSA處理結束時，犧牲小鼠以偵測肺臟之轉移。結果顯示與僅經對照介質處理且帶有TS/A或MDA-MB-231之小鼠相比，F-HSA顯著抑制TS/A細胞及MDA-MB-231細胞轉移至肺臟(圖8A及9A)。經F-HSA處理且帶有TS/A或MDA-MB-231之小鼠的相關肺臟重量及肺臟內腫瘤病灶數目顯著小於未經任何藥物處理且帶有TS/A或MDA-MB-231之小鼠(圖8B-C及9B-C)。
實例5F-BSA在活體外抑制CaSki細胞侵入
檢查是否諸如F-BSA之其他原纖蛋白質抑制CaSki人類子宮頸癌細胞侵入。藉由使用勃頓腔室檢測細胞侵入。發現在0.1 μM-0.2 μM F-BSA處理下，以MTT檢測，F-BSA不影響細胞活力，但其顯著抑制CaSki細胞侵入/移行(圖10)。
實例6F-HSA以劑量依賴性方式增強澱粉狀蛋白特異性染料ThT之螢光量。
圖12展示實驗資料之一實施例，其顯示與未藉由Superdex-200管柱處理之BSA相比，類似於澱粉狀蛋白原纖Aβ(1-42)，F-HSA以劑量依賴性方式增強澱粉狀蛋白特異性染料ThT之螢光量。此結果顯示F-HSA具有類似於Aβ(1-42)之原纖結構，而HSA具有球狀結構。(結合於ThT為澱粉狀蛋白樣蛋白質之特徵之一。)
實例7F-HSA對乳癌細胞具有細胞毒性效應。
圖13展示F-HSA對TS/A細胞之細胞毒性效應且圖14展示F-HSA對MDA-MB-231細胞之細胞毒性效應。在含各種濃度之F-HSA的無血清培養基中處理每個細胞類型16小時。藉由MTT檢測細胞活力。球狀HSA對正常細胞或癌細胞無細胞毒性效應。
實例8F-HSA對卵巢癌及子宮頸癌細胞具有細胞毒性效應。
圖15展示F-HSA對SKOV-3細胞之細胞毒性效應且圖16展示F-HSA對CaSki細胞之細胞毒性效應。在含各種濃度之F-HSA的無血清培養基中處理每個細胞類型達16小時。藉由MTT檢測細胞活力。
實例9F-HSA對前列腺癌細胞具有細胞毒性效應。
圖17展示F-HSA對PC-3細胞之細胞毒性效應且圖7展示F-HSA對22Rv1細胞之細胞毒性效應。在含各種濃度之F-HSA的無血清培養基中處理各別細胞類型16小時。藉由MTT檢定測定細胞活力。
實例10F-HSA對肺癌細胞株具有細胞毒性效應
根據圖19中所示之實施例，顯示F-HSA在以下細胞株中誘導細胞毒性：腺癌細胞株A549、CL1-0、Cl1-5、H1299、PC13及PC14；鱗狀細胞癌肺癌細胞株H520；及大細胞肺癌癌瘤細胞株H661。圖19展示各個細胞株之IC50 。
實例11F-HSA在活體外抑制腫瘤細胞侵入及移行
如根據圖20中之實驗資料的實施例所示，亦顯示F-HSA在活體外可有效地抑制腫瘤細胞侵入/移行。如圖9A、9C、9E及9G中所示，F-HSA在不影響癌細胞或正常細胞之活力的濃度下顯著降低腫瘤細胞侵入/移行能力。
實例12F-HSA在活體內抑制腫瘤細胞轉移
F-HSA在活體內抑制乳癌腫瘤細胞株TS/A及MDA-MB-231。圖21A及22A展示與未經F-HSA處理且帶有TS/A或MDA-MB-231之小鼠相比，F-HSA顯著抑制乳癌TS/A細胞及MDA-MB-231細胞轉移至肺臟。圖21B、21C、22B及22C為量測肺臟組織中腫瘤細胞病灶之重量及數目的結果，此進一步證實F-HSA之活體內功效。
根據實施例，經由個體之尾靜脈注射乳癌細胞。在肺臟組織中偵測到腫瘤細胞病灶則指示乳癌細胞已轉移至肺臟中。
材料及方法
製備F-HSA。將20毫克HSA溶解於10 ml含1% SDS(w/v)之PBS中。以超音波處理HSA溶液5分鐘且隨後施加於已預先用溶離液(25 mM Tris-HCl(pH 8.0)、1 mM EDTA、0.1 M NaCl及0.05% SDS)平衡之Superdex-200上。以1 mL/min之速率溶離該管柱且彙集含有HSA之溶離份C3至C7。將彙集之溶離份濃縮至2~3 mg/ml，接著用Cellu-Sep T4/標稱(MWCO：12,000-14,000 Da)透析膜相對於PBS透析。在室溫下每2小時更換新的PBS緩衝液，共三次。HSA-S200之產率為約75%。
硫磺素T(ThT)螢光檢定。結合於ThT為澱粉狀蛋白樣蛋白質之特徵之一。在螢光量測中，在室溫下將遞增濃度之蛋白質與20 μM ThT一起作用1小時，接著在Wallac Victor2 1420 Multilabel計數器(Perkin Elmer Life Science,Waltham,MA,USA)上量測螢光，各重複三次。激發及發射波長分別為430 nm及486 nm。自相應量測結果減去來自緩衝溶液之ThT背景信號。
藉由MTT比色檢定來測定細胞存活率。將指數生長之細胞(對於TS/A為每孔2×104 個細胞)接種於96孔培養板中之含10% FBS的培養基中且培養24小時。在37℃下在無血清培養基中用一系列濃度之蛋白質處理細胞持續16小時。在處理後，向各孔中添加MTT溶液(0.5 mg/ml)，隨後為4小時培育期。活細胞數目與甲臢(formazan)之產生成正比，後者在用異丙醇溶解後，可用ELISA讀板器在570 nm下用分光光度法量測。
細胞活力檢定。根據製造商之說明書(Roche,Mannheim,Germany)，藉由WST-1檢定量測細胞活力。簡言之，將2×104 個細胞添加至96孔培養板上之每孔100 μl培養基中且在37℃、5% CO2 下在含濕氣培養箱中培育隔夜。將附著於孔之細胞於無血清培養基中培養且用各種濃度之F-HSA處理。在37℃、5% CO2 下培養16小時以使得藥物見效後，向各孔中添加10 μl WST-1試劑。接著將該培養板置於振動台上且以150 rpm振盪1分鐘。在37℃、5% CO2 下再培養2小時以使得WST-1試劑被代謝後，藉由光學密度法(450 nm測試波長、690 nm參考波長)測定存活細胞之比例。存活細胞之百分比按(O.D.處理 /O.D.對照 )×100%計算，而生長抑制之百分比按[1-(O.D.處理 /O.D.對照 )]×100%計算。根據此實驗，IC50 為試劑對細胞活力有50%抑制時之濃度。
細胞侵入及移行檢定。藉由使用勃頓腔室侵入及/或移行檢定(Corning)來測定細胞侵入及/或移行。簡言之，用20 μg/ml纖維結合蛋白(在細胞移行檢定中)或40 μg/ml Matrigel(在細胞侵入檢定中)塗佈上腔室之8 μm孔膜且置於含1 ml PBS之孔中並在37℃下作用2小時。將含癌細胞(1×105 )之100 μl無血清培養基接種於上腔室中歷時1小時。將連續稀釋濃度之F-HSA添加至上腔室中，接著將含有10% FBS之培養基添加至下腔室中。在37℃下培養細胞24小時。在培育後，藉由用棉花擦拭來移除膜上側面上之細胞，且藉由使用細胞解離溶液(Sigma)來解離已移行至膜下表面上之細胞並藉由流式細胞儀(BD company)計數。然而，在此等濃度下，當用MTT檢測時，F-HSA不影響細胞活力，且如圖9B、9D、9F及9H中所示。使用MTT或WST-1檢定量測活力及細胞毒性。此等套組經設計用於與活細胞內之線粒體活性有關的細胞生長之分光光度量測(Roche)。
活體內乳癌細胞轉移。將TS/A鼠類乳腺癌細胞經靜脈內注入BALB/c小鼠之側尾靜脈中或將MDA-MB-231人類乳腺癌細胞靜脈注入裸小鼠中。接著第二天經靜脈內注射F-HSA(1 mg/kg)，接著每隔一天注射一次，持續10次。在F-HSA處理結束時，犧牲小鼠以偵測向肺臟之轉移。
圖1 rVP1對MDA-MB-231細胞、PC-3細胞及22Rv1細胞之細胞侵入及/或移行及細胞毒性的影響。(A及B)經rVP1處理24小時之MDA-MB-231細胞、PC-3細胞及22Rv1細胞之細胞侵入及/或移行係藉由使用勃頓(Boyden)腔室檢定來測量。rVP1顯著抑制腫瘤細胞侵入及/或移行。(C)經rVP1處理24小時之MDA-MB-231細胞、PC-3細胞及22Rv1細胞之細胞毒性係藉由使用MTT檢定來測量。0.1 μM及0.2 μM rVP1不影響腫瘤細胞活力。數據為平均值±S.D.(n =3)。相對於對照組(0 μM rVP1處理)，*：P <0.05，**：P <0.01，且***：P <0.001；
圖2 rVP1對SK-OV-3細胞及CaSki細胞之細胞侵入及細胞毒性的影響。(A)經rVP1處理24小時之SK-OV-3細胞及CaSki細胞之細胞侵襲係藉由使用勃頓腔室檢定來測量。rVP1顯著抑制腫瘤細胞侵入。(B)經rVP1處理24小時之SK-OV-3細胞及CaSki細胞之細胞毒性係藉由使用MTT檢定來測量。對於SKOV-3細胞，0.2 μM至0.4 μM rVP1不影響細胞活力，且對於CaSki細胞，0.2 μM至0.6 μM rVP1不影響細胞活力。白色條柱：SKOV-3細胞；黑色條柱：CaSki細胞。數據為平均值±S.D.(n =3)。*：P <0.05；**：P <0.01；***：P <0.001；
圖3 rVP1對SK-OV-3ip.1細胞之細胞侵入及細胞毒性的影響。(A)將SK-OV-3ip.1細胞塗於上腔室上歷時1小時，隨後用rVP1處理24小時。在培養後，自膜下表面分離細胞並進行計數。(B)用rVP1處理SK-OV-3ip.1細胞24小時，接著進行WST-1檢定。細胞存活率係藉由量測450 nm下之吸光度(以690 nm作為參照)來測定。根據(O.D處理 /O.D對照 )×100%計算細胞存活率百分比。數據為平均值±S.D.(n =3)。相對於對照組，*：P <0.05，且**：P <0.01；
圖4 在活體內用rVP1處理後MDA-MB-231細胞喪失轉移能力。在活體外用0.1 μM及0.2 μM rVP1處理MDA-MB-231細胞24小時，接著收集並經由尾靜脈經靜脈內注入小鼠體內。在14天後，犧牲小鼠。對三組不同小鼠之肺臟進行總體外觀(A)及組織病理學檢查(B及C)量測。rVP1顯著抑制MDA-MB-231細胞之轉移能力。***：P <0.001；
圖5 rVP1抑制PC-3細胞轉移至淋巴結且抑制髖骨之骨質溶解。(A)經rVP1處理或未經rVP1處理之正常小鼠及帶有腫瘤之小鼠的淋巴結。(B)經rVP1處理或未經rVP1處理之正常小鼠及帶有腫瘤之小鼠的髖骨(箭頭)；
圖6 來自植入SK-OV-3之裸小鼠的肝腫瘤轉移之活體內組織學外觀，其顯示可由rVP1防止該轉移。來自經rVP1處理及未經rVP1處理之小鼠且經H&E染色的代表性肝切片。藉由腹膜內注射向BALB/cAnN-Foxn1雌性裸小鼠體內每隻小鼠植入5×106 個SK-OV-3癌細胞。(a-b)在60天後，來自經PBS處理之帶有SK-OV-3之小鼠的肝被腫瘤細胞包圍。(c-d)在植入SK-OV-3後340天，來自經rVP1處理之小鼠的肝不顯示明顯侵入。(e-f)來自正常小鼠之肝(亦即未植入SK-OV-3)；
圖7 F-HSA對MDA-MB-231細胞、PC-3細胞、22Rv1細胞及CaSki細胞之細胞移行、侵入及細胞毒性的影響。在活體外移行及侵入檢定中，藉由使用勃頓腔室檢測得知，F-HSA顯著抑制MDA-MB-231細胞(A)、PC-3細胞(C)、22Rv1細胞(E)及CaSki細胞(G)之細胞侵入(黑色條柱)及移行(白色條柱)。藉由使用MTT檢定來測定F-HSA對MDA-MB-231細胞、PC-3細胞、22Rv1細胞及CaSki細胞之細胞毒性的影響(B、D、F及H)。以經處理之細胞與未經處理之細胞的數目之百分比表示移行及侵入。圖上顯示三個獨立實驗之平均值±S.D.，各實驗重複三次。相對於未經處理之細胞，**：P <0.01，且***：P <0.001；
圖8 F-HSA在活體內抑制TS/A腫瘤細胞轉移。(A)來自經F-HSA處理或未經F-HSA處理之小鼠之肺臟的總體外觀及組織病理學檢查結果。(B及C)來自經F-HSA處理或未經F-HSA處理之小鼠的相關肺臟重量及肺臟內腫瘤病灶數目。***：P <0.001；
圖9 F-HSA在活體內抑制MDA-MB-231腫瘤細胞轉移。(A)來自經F-HSA處理或未經F-HSA處理之小鼠之肺臟的總體外觀及組織病理學檢查結果。(B及C)在經F-HSA處理或未經F-HSA處理下的相關肺臟重量及肺臟內腫瘤病灶數目。***：P <0.001；
圖10 F-BSA對CaSki細胞之細胞侵入及細胞毒性的影響。(A)經F-BSA處理24小時之CaSki細胞的細胞侵入係藉由勃頓腔室檢定來測量。F-BSA顯著抑制腫瘤細胞侵入。(B)經F-BSA處理24小時之CaSki細胞的細胞毒性係藉由MTT檢定來測量。0.1 μM或0.2 μM濃度之F-BSA對CaSki細胞之細胞活力無影響。數據為平均值±S.D.(n =3)。*：P <0.05；**：P <0.01；
圖11 腫瘤植入以及rVP 1處理的時程圖；
圖12 為實驗資料之一實施例，其顯示在與20 μM澱粉狀蛋白特異性染料ThT一起作用1小時後遞增濃度之F-HSA、HSA及Aβ(1-42)之螢光水準的比較；
圖13 為實驗資料之一實施例，其顯示F-HSA對乳癌細胞之細胞毒性效應；
圖14 為實驗資料之一實施例，其顯示F-HSA對乳癌細胞之細胞毒性效應；
圖15 為實驗資料之一實施例，其顯示F-HSA對卵巢細胞之細胞毒性效應；
圖16 為實驗資料之一實施例，其顯示F-HSA對子宮頸癌細胞之細胞毒性效應；
圖17 為實驗資料之一實施例，其顯示F-HSA對前列腺癌細胞之細胞毒性效應；
圖18 為實驗資料之一實施例，其顯示F-HSA對前列腺癌細胞之細胞毒性效應；
圖19 為實驗資料之一實施例，其顯示F-HSA對肺癌細胞之細胞毒性效應；
圖20A-20H 為實驗資料之實施例，其顯示F-HSA有減少腫瘤細胞移行及侵入之作用，但不影響正常細胞之活力。
圖21A-21C 為實驗資料之實施例，其顯示F-HSA有抑制小鼠乳房腫瘤TS/A細胞轉移至肺臟中之作用；及
圖22A-22C 為實驗資料之實施例，其顯示F-HSA有抑制小鼠乳房腫瘤MDA-MB-231細胞轉移至肺臟中之作用。
(無元件符號說明)

Claims (11)

  1. 一種原纖蛋白質之用途，其係用於製造用以抑制個體之癌症轉移的藥劑，其中該抑制係減少該個體之癌症轉移，且其中該原纖蛋白質係為原纖白蛋白或口蹄疫病毒之原纖鞘蛋白。
  2. 請求項1之用途，其中該原纖白蛋白為原纖人類血清白蛋白。
  3. 如請求項1之用途，其中該原纖蛋白質為嵌合蛋白質。
  4. 如請求項1之用途，其中該個體為人類。
  5. 如請求項1之用途，其中該癌症為選自乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌及肺癌之至少一者。
  6. 如請求項1至5中任一項之用途，其中該藥劑係藉由選自由以下組成之群的途徑來投與：靜脈內注射、皮下注射、腹膜內注射、動脈內注射、肌肉內注射、病灶內注入腫瘤中、病灶內注入腫瘤附近、靜脈內輸注及動脈內輸注。
  7. 如請求項1至5中任一項之用途，其中該藥劑係經由緩慢釋放模式在該個體之腫瘤部位處或其腫瘤部位周圍投與。
  8. 如請求項1至5中任一項之用途，其中該藥劑係與第二治療劑組合投與。
  9. 如請求項8之用途，其中該第二治療劑為化學治療劑。
  10. 如請求項8之用途，其中該第二治療劑為放射療法。
  11. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該等原纖蛋白質係 藉由包含以下之方法來製造：將蛋白質溶解於洗滌劑溶液中以提供溶解之蛋白質；將該等溶解之蛋白質通過具有能分離70kDa分子量及更大之蛋白質之孔徑的凝膠過濾管柱；自該凝膠過濾管柱溶離該等溶解之蛋白質以提供溶離液；及自該溶離液中移除該洗滌劑。
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