CN102711806A - 癌症转移的抑制 - Google Patents

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Abstract

提供了用于移植癌症转移的方法。癌症转移是癌症患者中治疗失败和死亡的最常见的原因。体外纤维状蛋白(rVP1、F-HSA和F-BSA)处理之后肿瘤细胞侵袭和/或迁移被显著抑制。此外，rVP1可体内显著抑制小鼠和人类乳癌转移以及人类前列腺癌和卵巢癌转移，而F-HSA可显著抑制小鼠乳癌转移。本文提供了作为抗癌症转移的治疗的纤维状蛋白的组合物和使用其的方法。

Description

癌症转移的抑制
背景技术
癌症转移是包含一系列连续步骤并需要一连串的宿主-肿瘤细胞相互作用的过程(Steeg PS等人(2007)Nature 449：671-3)。这些步骤包括从原发肿瘤分离，侵入并在循环系统中停滞，渗入器官的薄壁组织；以及与血管生成相关的增殖(Sawyer TK等人(2004)Expert Opin Investig Drugs 13：1-19)。人们对迁移和侵袭机制的研究越来越感兴趣，它们被公布是转移过程的关键性步骤。干涉这些步骤中的任意一个以阻止转移级联代表了防止转移性肿瘤生长的形成的一种具有吸引力的方法。
我们先前的数据显示，口蹄疫病毒(FMDV)的重组衣壳蛋白VP1(rVP1)在多种癌症细胞中通过整联蛋白信号传导通路诱导了细胞凋亡(Peng JM等人(2004)J.Biol.Chem.279：52168-74)。已经发现，使用用于将rVP1重折叠至水溶性形式的相同的工艺，球状牛血清白蛋白(G-BSA)可被转化为纤维状BSA(F-BSA)，其与rVP1一样，通过整联蛋白/FAK/Akt信号通路诱导肿瘤细胞凋亡(Huang等人(2009)BMC Biotechnol.9：2)。
发明内容
提供用于抑制癌症转移的方法。癌症转移是在癌症患者中治疗失败和死亡的最常见的原因。将肿瘤细胞与纤维状蛋白接触后肿瘤细胞迁移和/或侵袭被显著抑制，所述纤维状细胞包括但不限于，rVP1、F-HSA和F-BSA。感兴趣的肿瘤细胞包括癌(carcinomas)，例如乳腺癌、上皮性卵巢癌、前列腺腺癌等。
一方面，本发明涉及用于在治疗患有癌症的哺乳动物中使用的，例如用于抑制癌症细胞，抑制转移等的，包含治疗有效量的纤维状人血清白蛋白和药学上可接受的载体的组合物。
在本发明的一些实施方案中，肿瘤细胞在体内与纤维状蛋白接触，所述接触可以是局部的，例如，瘤内引入或注射，或全身的。例如在本文中rVP1显示在体内显著抑制小鼠和人类乳腺癌转移以及人类前列腺和卵巢癌转移。F-HSA显示显著抑制乳腺癌转移。在一个实施方案中，本发明涉及上述用于在哺乳动物中治疗癌症的组合物，其中所述癌症为选自乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌和肺癌的至少一种。
在本发明的一些实施方案中，提供了作为抗癌症转移治疗的纤维状蛋白的组合物，其中所述组合物提供了有效抑制转移的剂量的药物制剂。另一方面，本发明涉及包括制造用于治疗患有癌症的患者中使用的组合物的方法。所述方法包括制造纤维状人血清白蛋白，并且将所述纤维状人血清白蛋白与药学上可接受的载体混合。另一方面，本发明涉及一种方法，包括将HSA溶解在SDS溶液中；将所述溶解的has应用通过具有一定孔径的凝胶过滤色谱柱以分离70kDa及以上分子量的蛋白；将所述HSA从色谱柱洗脱；并将所述溶液对磷酸盐缓冲盐水透析以去除SDS。
附图说明
图1是在MDA-MB-231细胞、PC-3细胞和22Rv1细胞中rVP1对细胞侵袭/迁移和细胞毒性的影响。(A&B)通过使用博伊登室测定测量用rVP1处理24小时的MDA-MB-231细胞、PC-3细胞和22Rv1细胞的细胞侵袭/迁移。rVP1显著抑制了肿瘤细胞侵袭/迁移。(C)通过使用MTT测定测量用rVP1处理24小时的MDA-MB-231细胞、PC-3细胞和22Rv1细胞的细胞毒性。0.1μM和0.2μM rVP1没有影响肿瘤细胞生活力。数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*：P＜0.05，**：P＜0.01和***：P＜0.001是相对于对照(0μM rVP1治疗)的。
图2是在SK-OV-3细胞和CaSki细胞中rVP1对细胞侵袭和细胞毒性的影响。(A)通过使用博伊登室测定测量用rVP1处理24小时的SK-OV-3细胞和CaSki细胞的细胞侵袭。rVP1显著抑制了肿瘤细胞侵袭。(B)通过使用MTT测定测量用rVP1处理24小时的SK-OV-3细胞和CaSki细胞的细胞毒性。在SKOV-3细胞中0.2μM至0.4μM rVP1和在CaSki细胞中0.2μM至0.6μM rVP1没有影响细胞生活力。白色柱，SKOV-3细胞；黑色柱，CaSki细胞。数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001。
图3是在SK-OV-3ip.1细胞中rVP1对细胞侵袭和细胞毒性的影响。(A)由rVP1处理24小时后将SK-OV-3ip.1细胞置于较高的室上1小时。孵育之后，将细胞从较低的膜表面解离并计数。(B)用rVP1处理SK-OV-3ip.1细胞24小时然后进行WST-1测定。通过测量450nm的吸光度测定细胞存活率(690nm作为参照)。细胞存活的百分比以(O.D治疗/O.D对照)×100％计算。数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*，P＜0.05和**，P＜0.01是相对于对照的。
图4表示在体内rVP1处理后MDA-MB-231细胞失去转移能力。之后将0.1μM和0.2μM rVP1体外处理24小时的MDA-MB-231细胞收获并通过尾部静脉静脉注射入小鼠体内。14天后，进行处死。测量不同三组小鼠的肺的总体表现(A)和组织病理学试验(B和C)。rVP1显著抑制了MDA-MB-231细胞的转移能力。***：P＜0.001。
图5表示在骨盆骨中rVP1抑制PC-3细胞转移至淋巴结并抑制骨质溶解。(A)用或不用rVP1处理的正常和负载肿瘤的小鼠的淋巴结。(B)用或不用rVP1处理的正常和负载肿瘤的小鼠的骨盆骨(箭头)。
图6表示在体内rVP1防止来自于植入SK-OV-3的裸鼠的肝脏肿瘤转移的组织学表象。用H&E染色的有代表性的肝脏切片来自于rVP1处理的和未处理的小鼠。通过腹膜内注射，BALB/cAnN-Foxn1雌性裸鼠被植入5×106个SK-OV-3癌症细胞每只小鼠。(a-b)60天后，来自于PBS处理的负载SK-OV-3的小鼠的肝脏被肿瘤细胞包围。(c-d)植入SK-OV-3340天后，来自于rVP1处理的小鼠的肝脏没有显示明显的侵袭。(e-f)来自于正常小鼠的肝脏(即，没有植入SK-OV-3)。
图7表示在MDA-MB-231细胞、PC-3细胞、22Rv1细胞和CaSki细胞中F-HSA对细胞迁移、侵袭和细胞毒性的影响。通过使用博伊登室测定，在体外迁移和侵袭分析中，F-HSA在MDA-MB-231细胞(A)、PC-3细胞(C)、22Rv1细胞(E)和CaSki细胞(G)中显著抑制细胞侵袭(黑色柱)和迁移(白色柱)。使用MTT测定，F-HSA对MDA-MB-231细胞、PC-3细胞、22Rv1细胞和CaSki细胞中细胞毒性的影响。(B，D，F和H)。迁移和侵袭被表示为处理的细胞数量相对于未处理的细胞的数量的百分比。显示的是三个独立的试验并且每个试验三次重复的平均值±标准差。**：P＜0.01和***：P＜0.001是相对于未处理的细胞的。
图8.表示F-HSA在体内抑制TS/A肿瘤细胞迁移。(A)来自于用或不用F-HSA处理的小鼠的肺的总体表现和组织病理学试验。(B&C)来自于用或不用F-HSA处理的肺中的相关的肺重量和肿瘤灶的数量。***：P＜0.001。
图9表示F-HSA在体内抑制MDA-MB-231肿瘤细胞迁移。(A)来自于用或不用F-HSA处理的小鼠的肺的总体表现和组织病理学试验。(B&C)用或不用F-HSA处理的肺中的相关的肺重量和肿瘤灶的数量。***：P＜0.001。
图10表示在CaSki细胞中F-BSA对细胞侵袭和细胞毒性的影响。(A)通过博伊登室测定测量用F-BSA处理24小时的CaSki细胞的细胞侵袭。F-HSA显著抑制了肿瘤细胞侵袭。(B)通过MTT测定测量用F-BSA处理24小时的CaSki细胞的细胞毒性。0.1μM或0.2μM浓度的F-HSA对CaSki细胞的细胞生活力没有影响。数据表示为平均值±标准差(n＝3)。*：P＜0.05；**：P＜0.01。
图11是用rVP1处理的肿瘤植入的时间表。
图12是实验数据的实行，其显示逐渐增加浓度的F-HSA、HSA和Aβ(1-42)用20μM淀粉样蛋白特异性染料ThT孵育1小时后的荧光水平的比较。
图13是显示F-HSA对乳腺癌症细胞的细胞毒性作用的实验数据的实行。
图14是显示F-HSA对乳腺癌症细胞的细胞毒性作用的实验数据的实行。
图15是显示F-HSA对卵巢细胞的细胞毒性作用的实验数据的实行。
图16是显示F-HSA对子宫颈癌细胞的细胞毒性作用的实验数据的实行。
图17是显示F-HSA对前列腺癌细胞的细胞毒性作用的实验数据的实行。
图18是显示F-HSA对前列腺癌细胞的细胞毒性作用的实验数据的实行。
图19是显示F-HSA对肺癌细胞的细胞毒性作用的实验数据的实行。
图20A-20H是显示F-HSA对减少肿瘤细胞迁移和侵袭的影响同时不影响正常细胞的生活力的实验数据的实行。
图21A-21C是显示F-HSA对抑制小鼠乳腺肿瘤TS/A细胞向肺迁移的影响的实验数据的实行。
图22A-22C是显示F-HSA对抑制小鼠乳腺肿瘤MDA-MB-231细胞向肺迁移的影响的实验数据的实行。
定义
在以下的描述中，在细胞培养领域惯用的许多术语被广泛应用。为了提供说明书和权利要求书的清楚并一致的理解，以及给予所述术语的范围，提供了以下定义。
所述术语“受治疗者”“个体”和“患者”在本文中可交换使用以指将被评估治疗和/或将被治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人类。所述术语“受治疗者”“个体”和“患者”因此包括患有癌症(例如大肠癌、卵巢或前列腺腺癌、乳腺癌等等)的个体，包括已经经历过切除(手术)以去除癌组织(例如癌性大肠癌组织)或是切除(手术)以去除癌组织(例如癌性大肠癌组织)的候选人的那些人。受治疗者可以是人类，但也包括其它哺乳动物，特别是作为实验模型对人类疾病有用的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠等等。
如在本文中所使用的，所述术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”以及类似术语，指为了得到一种作用，施用剂或执行程序(例如辐射、外科手术等)。所述作用可以是就完全或部分防止疾病或其症状而言预防性的和/或可以是就影响对疾病和/或所述疾病症状的部分或全部治疗而言治疗性的。如在本文中所使用的，“治疗”覆盖哺乳动物体内，特别是人类体内，任何转移的肿瘤的任何治疗，并包括：(a)防止疾病或疾病的症状发生在受治疗者体内，所述受治疗者可能有所述疾病的倾向但还没有被诊断为患有此病(例如，包括与原发疾病有关或由原发疾病引起的疾病；(b)抑制所述疾病，即，阻止其发展，和(c)减轻所述疾病，即，引起所述疾病的消退。在肿瘤(例如癌症)治疗中，治疗剂可直接减少肿瘤细胞的转移。
所述术语“细胞培养”或“培养”意为细胞在人工或体外环境中的保持。然而，它可以被理解为所述术语“细胞培养”是一个通用术语并且可被用于包含不仅是单个细胞还有组织或器官的培养。
如在本文中所使用的，所述术语“肿瘤”指所有赘生性细胞生长和增殖，不管是恶性的或良性的，以及所有癌前和癌细胞和组织。
所述术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”在本文中可交换使用，指表现出自发的、失调的生长以致它们表现出由细胞增殖的显著失控所表征的异常的生长表现得细胞。通常，在本申请中用于检测、分析、分类或治疗的感兴趣的细胞包括癌前的(例如良性的)、恶性的、转移前的、转移的和未转移的细胞。癌症的例子包括但不限于，乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌，胰腺癌，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，泌尿系癌，甲状腺癌，肾癌，癌、黑色素瘤，头颈部癌和脑癌。
根据癌症的性质，获得适当的患者样本。如在本文中所使用的，所述短语“癌组织样本”指从癌变肿瘤得到的任何细胞。在还没有转移的实体瘤的实例中，通常可获得并制备来自于外科手术去除的肿瘤的组织样本用于通过常规技术测试。可选地，体液样本，例如淋巴、血液或血清样本，或渗出液样本例如癌变器官渗出液(例如，来自于乳腺的渗出液)可被采集并用作待分析的样本。在白血病的实例中，可获得并适当制备淋巴细胞或白血病细胞。同样的，在任一种转移性癌症的实例中，可从体液例如淋巴液、血液、血清或远癌感染(distallyinfected)的器官或其渗出液提取细胞。
如在本文中所使用的，所述术语“转移”指在器官或身体部分中癌变肿瘤的生长，所述器官或身体部分不与原发性癌变肿瘤的器官直接相连。转移被理解为包括微转移，其是在不与原发性癌变肿瘤的器官直接相连的器官或身体部分中无法检测到的量的癌变细胞的存在。转移还可被定义为一个过程的很多步骤，例如，癌症细胞从一个原发性肿瘤部位的离开，以及癌症细胞向身体的其它部分的迁移和/或侵袭。因此，本发明预期一种在不与原发性癌变肿瘤的器官直接相连的器官或身体部分中测定一种或更多种癌变肿瘤进一步生长的风险和/或在导致这一生长的过程中的任一步骤测定一种或更多种癌变肿瘤进一步生长的风险的方法。
癌症的所述“病理学”包括有损患者健康的所有现象。这包括但不限于，异常的或不可控的细胞生长、转移、干扰临近细胞的正常功能、细胞因子或其它分泌物异常水平的释放、炎性或免疫响应的抑制或加剧、肿瘤形成、初癌、恶性肿瘤、周围或远癌组织或器官(例如淋巴结)的侵袭等等。
如本文中所使用的，所述术语“癌症复发”和“肿瘤复发”及其语法上的变体，是指在癌症诊断后赘生或癌变细胞的进一步生长。具体地，在进一步癌变细胞的生长发生在癌变组织中时，复发可能发生。同样地，当肿瘤细胞扩散入局部或远癌组织和器官中时，“肿瘤扩散”发生；因此肿瘤扩散包括肿瘤转移。
本文中所用的所述术语“诊断”是指分子或病理状况、疾病或病况的鉴定，例如乳腺癌、前列腺癌或其它类型癌症的分子亚型的鉴定。
本文中所用的所述术语“预后”是指可归因于癌症的死亡或进行的可能性的预测，包括赘生性疾病(例如肺、结肠、皮肤或食道癌)的复发、转移性扩散和抗药性。本文中所用的所述术语“预测”是指基于观察、经验或科学推论的预言或预估的行为。在一个实例中，医师可以在原发性肿瘤的手术切除和/或化疗一段特定时间而没有癌症复发后，预测病人将存活的可能性。
如在本文中所使用的，所述短语“无病存活”指诊断后没有出现所述肿瘤的复发和/或扩散和患者的命运(考虑到癌症对患者寿命的影响)。所述术语“整体存活”指的是诊断后患者的命运，尽管可能患者死亡的原因不是直接归因于癌症的影响。所述术语“无病存活的可能性”“复发的风险”及它们的变体是指继癌症的诊断之后患者体内肿瘤复发或扩散的机率，其中所述机率根据本发明的方法测定。
如在本文中所使用的，所述术语“相关”或“与......相关”及类似术语指两个事件的实例之间的统计学关系，其中事件包括数目、数据集等等。例如，当所述事件含有数目，正相关(在本文中也被称为“直接相关”)意为当一个增加时，另一个也增加。负相关(在本文中也被称为“反相关”)意为当一个增加时，另一个减少。
所述术语“分离的”意在表示将化合物从在自然界伴随它的所有或部分成分分离。“分离的”也指将化合物(例如蛋白)从制造(例如，化学合成、重组表达、培养基等等)期间伴随它的所有或部分成分分离的状态。
“生物样本”包含从个体得到的各种样本类型。该定义包含血液和生物学来源的其它液态样本、固态组织样本例如活检标本或组织培养物或从它们获得的细胞及其后代。该定义还包括获得后以任何方式处理(例如用试剂处理、洗涤、富集某些细胞种群例如癌症细胞)的样本。该定义还包括已对特定类型的分子(例如核酸、多肽等等)富集的样本。所述术语“生物样本”包含临床样本，并还包括通过手术切除得到的组织、通过活检得到的组织、培养中的细胞、细胞培养上清、细胞裂解液、组织样本、器官、骨髓、血液、血浆、血清以及类似样本。“生物样本”包括从患者的癌症细胞获得的样本，例如从患者的癌症细胞获得的包括多核苷酸和/或多肽的样本(例如，包括多核苷酸和/或多肽的细胞裂解液或其它细胞抽提物)；和包括来自于患者的癌症细胞的样本。包括来自于患者的癌症细胞的生物样本还可包含非癌细胞。
具体实施方案的描述
本公开内容涉及生产纤维状蛋白的方法和使用纤维状蛋白治疗的方法。所述治疗的方法包含癌症转移的抑制。
治疗的方法
在本文中公开用于抑制癌症转移的方法。所述方法包含将治疗有效量的纤维状结构蛋白施用于需要它的患者。所述方法可进一步包含以下步骤：提供蛋白，并在施用纤维状蛋白之前将所述蛋白转化为纤维状结构。所述纤维状蛋白的施用抑制肿瘤细胞侵袭(例如，侵袭至周围组织中)和/或迁移。
本方法具有在哺乳动物受治疗者中，尤其是人类中的各种癌症疗法(包括癌症的预防和诊断后的癌症的治疗)中的应用。患有肿瘤、疑似患有肿瘤或具有肿瘤发展风险的受治疗者被考虑本文中描述的治疗。
依照本主题方法的抗癌疗法可特别定向于转移性的或处于变为转移性的高风险之中的癌细胞。像这样，纤维状蛋白可被在治疗上用于影响/预防癌症细胞在其它组织中的粘附和侵袭。
例如，可通过本公开的方法抑制的癌症转移包括但不限于，癌，包括腺癌，并且尤其是乳腺癌、前列腺腺癌和卵巢腺癌。可被治疗的其它转移包括起源于肾脏、肺、肝脏、皮肤(例如黑色素瘤)、结肠、胰腺或子宫颈中的癌性生长的那些转移。
用于治疗癌症的纤维状结构蛋白可以是白蛋白、纤连蛋白、rVP1、rVP2、rVP3、P1或包含来自于VP1、VP2、VP3和/或VP4的部分的嵌合蛋白。白蛋白可以从感兴趣的任一种动物获得，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白等。在特定实施方案中，所述纤维状蛋白还通过调节Akt信号通路引起癌症细胞凋亡。在某些实例中，所述纤维状蛋白调节导致Akt失活的整联蛋白α5β1或αvβ3。在其它实例中，纤维状白蛋白结合整联蛋白并主要通过整联蛋白/FAK/Akt/GSK-3β/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3通路引起细胞凋亡。
如上文所记录的，本方法包含施用纤维状蛋白至受治疗者(例如人类患者)，例如，以抑制癌细胞的侵袭和迁移。这可通过施用纤维状蛋白至本文中描述的受治疗者以便提供与没有被施用所述纤维状蛋白的受治疗者相比癌症转移的减少来实现。依照所述主题方法的疗法还可以用于在患者中防止复发、减少癌症细胞的迁移、减小肿瘤尺寸、减少肿瘤负荷和/或改善临床结果。
癌症类型
本文中涵盖的与癌症有关的方法包括，例如，将纤维状蛋白治疗用作抗癌症转移治疗。所述方法在治疗或预防多种癌症(例如可转移的癌症(例如癌和肉瘤))的背景中有用。
可适合由本文中公开的方法治疗的癌包括但不限于，食管癌、肝细胞癌、基底细胞癌(皮肤癌症的一种形式)、鳞状细胞癌(不同组织)、膀胱癌、包括移行细胞癌(膀胱的一种恶性肿瘤)、支气管癌、结肠癌、大肠癌、胃癌、包括肺小细胞癌和非小细胞肺癌的肺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肾细胞癌、导管原位癌或胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、成骨性癌(osteogeniccarcinoma)、上皮癌和鼻咽癌。
可适合由本文中公开的方法治疗的肉瘤包括但不限于，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其他软组织肉瘤。
可适合由本文中公开的方法治疗的其它实体瘤包括但不限于，胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
可适合根据本文中公开的方法治疗的其它癌症包括非典型脑膜瘤(脑)、胰岛细胞癌(胰腺)、髓样癌(甲状腺)、间叶瘤(小肠)、肝细胞癌(肝)、肝母细胞瘤(肝)、透明细胞癌(肾)和纵隔神经纤维瘤。
可适合使用本文中公开的方法治疗的其它典型癌症包括但不限于，神经外胚层来源性和上皮来源性癌。神经外胚层来源性(neuroectodermal origin)癌症的例子包括但不限于，尤文氏肉瘤、脊柱肿瘤、脑肿瘤、婴儿期幕上原始神经外胚层肿瘤、管状囊性癌、黏液性小管状和梭形细胞癌、肾肿瘤、纵隔肿瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤和在青少年和青年中的肉瘤。上皮来源性的例子包括但不限于、小细胞肺癌、乳腺癌、眼晶状体癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、卵巢癌和支气管上皮癌。
与其它癌症疗法组合
纤维状蛋白的治疗性施用包括作为治疗方案的一部分施用，所述治疗方案可以联合或不联合另外的标准抗癌疗法，所述标准抗癌疗法包括但不限于免疫疗法、化疗剂和外科手术(例如，下文进一步描述的那些)。
此外，所述纤维状蛋白的治疗性施用还可以是受治疗者采用抗癌症疗法治疗后的治疗，其中所述抗癌症疗法可以是，例如，外科手术、放射疗法、化疗剂的施用以及类似疗法。使用本发明公开内容的纤维状蛋白的癌症治疗还可以与免疫疗法组合使用。在其它实例中，所述纤维状蛋白可与一种或多种化疗剂(例如环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松(CHOP))组合施用和/或与放射疗法组合施用和/或与外科手术组合施用(例如，手术去除肿瘤之前或之后)。当所述纤维状蛋白与外科手术联合使用时，所述纤维状蛋白可在手术去除癌细胞之前、同时或之后施用，并且可被全身施用或在手术位置局部施用。如前所述单独或组合中的所述纤维状蛋白可被全身(例如，通过胃肠外施用，例如，通过静脉途经)或局部(例如，在局部肿瘤位置，例如，通过肿瘤内施用(例如，至实体瘤内，至淋巴瘤或白血病中相关的淋巴结内)，施用至供应实体瘤的血管内，等等)施用。
多种癌症疗法的任一种可与本文中描述的纤维状蛋白疗法组合使用。所述癌症疗法包括手术(例如，癌组织的手术去除)、放射疗法、骨髓移植、化疗治疗、生物应答调节剂疗法和前述疗法的某些组合。
放射疗法包括但不限于，自外部应用源例如光束或通过小型放射源的植入产生的X射线或伽马射线。
化疗剂是减少癌症细胞的增殖的非肽的(即非蛋白的)化合物，并且包括细胞毒性剂和细胞抑制剂。化疗剂的非限制性的例子包括烷化剂、亚硝基脲类、抗代谢药物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱和类固醇激素。
作用以减少细胞增殖的试剂在本领域内是已知的并被广泛应用。所述试剂包括烷化剂，例如氮芥类(nitrogen mustard)、亚硝基脲类、乙撑亚胺衍生物、烷基磺酸盐和三氮烯类，包括但不限于，氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺(CYTOXANTM)、马法兰(L-sarcolysin)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链脲菌素、氯脲霉素、乌拉莫司汀、氮芥(chlormethine)、异磷酰胺、苯丁酸氮芥、胍血生、三乙撑蜜胺、三乙撑硫代磷胺(triethylenethiophosphoramine)、白消安，达卡巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢剂包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于，阿糖胞苷(cytarabine)(CYTOSAR-U)、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、氟脲嘧啶(5-FU)、氟尿苷(FudR)、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤(6-MP)、喷司他丁、5-氟脲嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤、10-炔丙基-5，8-二脱氮杂叶酸盐(dideazafolate)(PDDF、CB3717)、5，8-二去氮四氢叶酸(dideazatetrahydrofolic)酸(DDATHF)、亚叶酸钙、磷酸氟达拉滨、喷司他丁和吉西他滨。
合适的天然产品和它们的衍生物，(例如，长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶类、淋巴因子和表鬼臼毒素)，包括但不限于、阿糖胞苷-C、紫杉醇
Figure BPA00001563027200111
多西紫杉醇去氧助间型霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤；布喹那；生物碱例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛等；足叶草毒素例如依托泊苷、替尼泊苷等；抗生素例如蒽环类药物，盐酸柔红霉素(道诺霉素、柔毛霉素、正定霉素)，去甲氧柔红霉素，阿霉素，表阿霉素和吗啉衍生物等；酚恶嗪酮二环肽(phenoxizone biscyclopeptides)例如放线菌素；碱性糖肽(basic glycopeptide)例如博莱霉素；蒽醌甙例如普卡霉素(mithramycin)；蒽二酮类药物例如米托蒽醌；azirinopyrroloindoledione类例如丝裂霉素；大环的免疫抑制剂例如环孢素，FK-506(他克莫司、普乐)，雷帕霉素等；以及类似物。
其它的抗增殖细胞毒性剂为诺维本(navelbene)、CPT-11，阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosamide)、屈洛昔芬(droloxafine)。
具有抗增殖活性的微管影响剂(microtubule affecting agents)也适用并且包括但不限于别秋水碱(NSC406042)，软海绵素B(NSC609395)，秋水仙碱(NSC757)，秋水仙碱衍生物(如NSC 33410)，多拉司他汀(dolstatin)10(NSC376128)，美登素(NSC153858)，根霉菌素(NSC332598)，紫杉醇
Figure BPA00001563027200113
衍生物，多西紫杉醇硫代秋水仙碱(NSC361792)，trityl cysterin，硫酸长春碱，长春新碱硫酸盐，天然和合成的埃博霉素(包括但不限于，埃博霉素(eopthilone)A、埃博霉素B、discodermolide)，雌二醇氮芥，噻氨酯哒唑以及类似物。
适用的激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)包括但不限于，肾上腺皮质类固醇，例如强的松、地塞米松等；雌激素和孕酮，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、甲地孕酮、雌二醇、克罗米芬、他莫昔芬等；和肾上腺皮质抑制剂，例如氨鲁米特；17α-炔雌醇，己烯雌酚，睾酮，氟羟甲基睾酮，屈他雄酮丙酸酯，睾内酯，甲基强的松龙，甲基睾丸酮，强的松龙，曲安西龙，氯烯雌醚，羟孕酮，氨鲁米特，雌莫司汀，醋酸甲羟孕酮，亮丙瑞林，氟他胺(Drogenil)，托瑞米芬(Fareston)和
Figure BPA00001563027200121
雌激素刺激增殖和分化，因此与雌激素受体结合的化合物被用于封闭这一活性。皮质类固醇可抑制T细胞增殖。
其它的化疗剂包括金属配合物，例如顺铂(cis-DDP)、卡铂等；尿素，例如羟基脲；和肼类，例如N-甲基肼；表叶毒素(epidophyllotoxin)；拓扑异构酶抑制剂；甲基苄肼；米托蒽醌，亚叶酸钙，替加氟等。其他感兴趣的抗增殖剂包括免疫抑制剂，例如霉酚酸，沙利度胺，脱氧精胍菌素，azasporine，来氟米特，咪唑立宾，azaspirane(SKF 105685)；
Figure BPA00001563027200122
(ZD1839，4-(3-氯-4-氟苯胺)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉)丙氧基)喹唑啉)等。
“紫杉烷类”包括紫杉醇，以及任一种活性的紫杉烷衍生物或前体药物。“紫杉醇”(在本文中应当被理解为包括类似物、制剂和衍生物诸如，例如多西紫杉醇，TAXOL，TAXOTERE(一种多西紫杉醇制剂)，紫杉醇的10-去乙酰类似物和紫杉醇的3′N-去苯甲酰-3′N-叔丁氧羰基类似物)可使用所属领域技术人员已知的技术容易地制备。
紫杉醇应该被理解为指不仅是通常化学上可获得的紫杉醇的形式，还有类似物和衍生物(例如，TAXOTERETM多西紫杉醇，如上文所提到的)以及紫杉醇轭合物(例如，紫杉醇-PEG、紫杉醇-葡聚糖或紫杉醇-木糖)。
根据本公开内容的方法的一些个体的治疗中，将高剂量方案与救援剂(rescue agent)结合用于非恶性细胞可能是所期望的。在这样的治疗中，能够拯救非恶性细胞的任一种试剂都可使用，例如嗜橙菌因子、叶酸衍生物或亚叶酸。所述救援剂是所属领域一般技术人员熟知的。救援剂包括不干扰本发明化合物调节细胞功能的能力的那些
所述纤维状蛋白的施用
所述纤维状蛋白的施用可通过向身体的不同部分的各种方法实现，包括肿瘤内、静脉内、皮内、皮下、口服(例如、吸入)、透皮(即局部)、透粘膜、腹腔内、动脉内、直肠施用。其它合适的路径包括口服，含服(bucally)，经鼻，鼻咽部(nasopharyngeally)，胃肠外，经肠，经胃，局部，透皮，皮下，肌肉内，以片剂，固体，粉末，液体，气溶胶的形式，肿瘤内注射到肿瘤，肿瘤附近的肿瘤内注射，静脉输注和动脉输注施用组合物。施用可以是局部或全身进行，用或不用另外的赋形剂。施用也可通过缓释方式在受治疗者的肿瘤处或附近进行。
所属领域技术人员应该理解的是将本公开内容的制剂施用至对其有需要的受治疗者或宿主(例如患者)的各种合适的方法是可获得的，并且，虽然多于一种的途径可被用于施用特定制剂，但是特定的途径可提供比其它途径更直接并更有效的反应。
短语“治疗有效量”指以适用于任一种医学治疗的合理的收益/风险比产生一些期望的效果的量。所述有效量可根据一些因素而变化，如被治疗的疾病或病况、所施用的特定靶向构建物(construct)、受治疗者的体型或所述疾病或病况的严重程度。所属领域的一般技术人员可以按照经验决定特定药物的有销量，而不用被迫进行过度实验。
根据示例性的实行，所述蛋白可作为组合物的一部分被施用，其更详细的描述于下文。所述组合物可以为各种形式包括粉末，霜剂，凝胶，药膏，软膏剂，溶液，片剂，胶囊，喷雾剂和贴片。媒介物和载体可被用于将所述组合物递送至患者。所述载体包括增溶剂、稀释剂和分散介质。这些载体是生物相容的、药学上可接受的，并且不会改变所述纤维状蛋白的治疗表征。赋形剂、佐剂和其它成分也可包含在所述组合物中。
剂量
在本方法中，有效量的纤维状蛋白被施用至需要它的受治疗者。特别地，特别让人感兴趣的纤维状蛋白是当所述纤维状蛋白被以有效量施用时能抑制宿主体内癌症转移的那些。施用的量根据施用的目标、将被治疗的个体的健康和身体状态、年龄、将被治疗的个体的分类组(例如，人类、非人灵长类、灵长类等)、期望解决的程度、所述纤维状蛋白组合物的制剂、治疗的临床医师的医学情况的评估和其它相关因素而变化。预期所述量将落在在一个相当宽的范围(其可通过常规实验测定)内。例如，用来抑制癌症转移的纤维蛋白的量不多于约能够另外对受治疗者有不可逆毒性的量(即，最大耐受量)。在其它情况下所述量在毒性阈值附近或远低于毒性阈值，但是仍然在免疫有效浓度范围内，或甚至低至阈值剂量。
个体剂量通常不少于要求对受治疗者产生可测的效果的量，并且可基于纤维状蛋白或其副产物的吸收、分布、代谢和排出(“ADME”)的药物动力学和药理学，并因此基于在受治疗者体内组合物的分布来确定。这包括对施用途经以及剂量的考虑，其可针对局部(直接应用，其作用被期望主要是局部效果)，肠内(经消化道应用，当保留在消化道的一部分中时得到全身或局部效果)或胃肠外(通过消化道以外的路径应用以得到全身或局部效果)应用调整。例如，所述纤维状蛋白的施用通常通过注射并经常是静脉内的、肌肉内的、肿瘤内饿或它们的组合。
所述纤维状蛋白可通过输注或通过局部注射施用，例如以约50mg/h至约400mg/h、包括约75mg/h至约375mg/h、约100mg/h至约350mg/h、约150mg/h至约350mg/h、约200mg/h至约300mg/h、约225mg/h至约275mg/h的速度输注示例性速度的输注可获得例如，约0.5mg/m2/天至约10mg/m2/天，包括约1mg/m2/天至约9mg/m2/天、约2mg/m2/天至约8mg/m2/天、约3mg/m2/天至约7mg/m2/天、至约4mg/m2/天至约6mg/m2/天、约4.5mg/m2/天至约5.5mg/m2/天的期望的治疗剂量。经施用(例如，通过输注)可在所期望的时间段重复例如在约1天至约5天的时间段重复，或每几天一次例如约五天、超过约1个月、约2个月等重复。其还可在其它治疗性干预(例如，手术干预以去除癌细胞)之前、同时或之后施用。所述纤维状蛋白也可作为组合治疗的一部分被施用，其中免疫治疗、癌症化疗或放射治疗中的至少一种被施用于受治疗者(如下文中更加详细的描述)。
常将受治疗者体内所述纤维状蛋白的分布及其相应的生物活性相对于在感兴趣的靶存在的所述纤维状蛋白分数来精确计量。例如，纤维状蛋白一旦被施用可随复合糖或在癌症细胞和癌组织中浓缩物质的其它生物靶而累积。因此在其中所述纤维蛋白被施用以便在感兴趣的靶中随时间累积的给药方案可以是允许降低个体剂量的策略的一部分。这还意味着，例如，在体内被更慢的清除的纤维状蛋白的剂量相对于由体外测定计算出的有效浓度可以被降低(例如，在体外有效量接近于mM浓度，相比之下在体内少于mM浓度)。
作为一个实例，剂量或给药方案的有效量或可由给定纤维蛋白对抑制细胞迁移的IC50来精确计量。“IC50”意指在体外50％抑制所需要的药物浓度。可选地，所述有效量可由给定纤维状蛋白浓度的EC50来精确计量。通过“EC50”意指获得在体内最大效果的50％所需要的血药浓度。在相关实施方案中，剂量也可基于ED50(有效剂量)确定。
通常，对于本公开内容的纤维状蛋白，有效量一般不多于计算出的IC50的200×。通常，施用的纤维状蛋白的量比计算出的IC50少约200×、少约150×、少约100×，并且许多实施方案少约75×、少约60×、50×、45×、40×、35×、30×、25×、20×、15×、10×，以及甚至少约8×或2×。在另一个实施方案中，所述有效量为计算出的IC50的约1×至50×，并且有时为计算出的IC50的约为2×至40×、约3×至30×或约4×至20×。在其它实施方案中，所述有效量等于计算出的IC50，并且在某些实施方案中，所述有效量为多于计算出的IC50的量。
有效量可以为不多于100×所计算出的EC50。比方说，被施用的纤维状蛋白的量为比计算出的EC50少约100×、少约50×、少约40×、35×、30×或25×，并且许多实施方案少约20×、少约15×，以及甚至少约10×、9×、9×、7×、6×、5×、4×、3×、2×或1×。所述有效量可以是所计算出的EC50的约1×至30×，并且有时为所计算出的EC50的约1×至20×或约1×至10×。所述有效量还可等于所计算出的EC50或多于所计算出的EC50。所述IC50可通过在体内抑制细胞迁移/侵袭计算。所述过程可通过所属领域已知的方法或如下文实施例中的描述实行。
剂量和/或给药方案的有效量可从测定，从安全性和放大和剂量范围测试、个体的临床医师-患者关系、以及体外和体内测定例如在本文中描述的和下文实施方案部分举例说明的那些经验性地确定。例如，用于在小鼠中实行所述主体方法的浓度范围为基于小鼠的体重约1mg/kg至约25mg/kg。基于这个数据，可用于人类的纤维状蛋白的浓度的实例范围可以为约0.083mg/kg至约2.08mg/kg。其它的剂量可使用本领域内已知的方法从使用动物模型的实验确定(Reagan-Shaw等人(2007)The FASEB Journal 22：659-661)。
药物制剂
还提供了包含在上文描述的治疗方法中所用的纤维状蛋白的药物组合物。所述术语“纤维状蛋白组合物”在本文中被用作便于泛指组合物的术语，所述组合物包含本公开内容的纤维状蛋白，包括轭合的纤维状蛋白，或两者都包括。对抑制癌症细胞的生长和/或转移有用的组合物在下文中被描述。
所述纤维状蛋白组合物，例如为药学上可接受的盐的形式，可以被配制用于空腹、局部或胃肠外施用，如上文所描述的。在某些实施方案中，例如，当纤维状蛋白作为液态可注射剂施用时(例如在那些它们被静脉注射施用或直接施用至组织中的实施方案中)，纤维状蛋白制剂被提供为即用型剂型或由药学上可接受的载体和赋形剂组成的可重构的储藏稳定的粉末或液体。
用于生产适于施用至受治疗者(例如人类受治疗者)的纤维状蛋白的方法在下文中被描述并且也在美国专利公开第2008/0300186号中描述，其公开内容通过引用并入本文。配制纤维状蛋白的示例方法可包括含有有效量纤维状蛋白和药学赋形剂(例如，生理盐水)的药学组合物。所述药学组合物可任选地包括其它添加剂(例如，缓冲剂、稳定剂、防腐剂以及类似物)。纤维状蛋白的有效量可以是有效提供癌症转移(例如癌症迁移和/或侵袭)的减少的量。治疗目标(例如，肿瘤负荷的减少和/或癌性生长的限制)可通过变化的给药方案下的单个或多个剂量实现。
在药物制剂中纤维状蛋白的浓度按重量计算，可从少于约0.1％，通常为2％或至少约2％变化至多达20％至50％或更多，并且主要通过流体体积、粘度等，根据选择的施用的特定方式和患者的需要选择。所获得的组合物可以为溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊，粉末，凝胶，霜剂，洗剂，软膏，气溶胶以及类似的形式。用于制备胃肠外施用的组合物的实际方法对所属领域技术人员来说是已知的或显而易见的并且在出版物Remington′s Pharmaceutical Science(雷明顿药学)，第18版，Mack Publishing Company，NY(1995)中被更加详细的描述。
根据本公开内容的另一方面，纤维状HAS可与所属领域技术人员在阅读本公开内容时可确认的另外的活性剂、载体、媒介物、赋形剂或助剂一起被包括在药物或营养组合物中。
所述药物或营养组合物优选含有至少一种的药学上可接受的载体。在所述药物组合物中，所述纤维状HAS或纤维状HAS的等价形式“活性化合物”还被称为“活性剂”。如在本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂，分散介质，涂层，抗菌剂和抗真菌剂，等渗和吸收延缓剂以及类似物。补充的活性化合物也可被掺入所述组合物。配制药物组合物以与其预期的施用的途经相容。施用途经的例子包括胃肠外，例如，静脉、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、透皮(局部)、透粘膜和直肠施用。用于胃肠外、皮内或皮下使用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂例如注射用水，生理盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或甲基苯甲酸酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸酯，柠檬酸盐，或磷酸盐和用于调节张度的剂例如氢氧化钠或葡聚糖。可用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠调节pH。胃肠外制剂可被包装于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或分散相以及用于无菌注射溶液或分散相的临时制备的无菌的粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、EL(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的并且是以易于注射的流动程度存在。它在制造和储存状态下应当是稳定的并且必须抗微生物例如细菌和真菌的污染活动来保存。所述载体可以是含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇以及类似物)及其适合的混合物的溶剂或分散介质。合适的流动性可例如通过涂层例如卵磷脂的使用、在分散相的情况下通过所需要的颗粒尺寸的维持以及通过表面活性剂的使用保持。微生物活动的预防可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂实现，例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞以及类似物。根据实施方案，等渗剂，例如，糖，多元醇诸如甘露醇、山梨醇，或氯化钠被加入到组合物中。可注射组合物的延长吸收大约可通过在组合物中包括延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)获得。
无菌注射溶液可通过将所述活性化合物以所需的量与上文列举的成分中的一种或组合(如果需要的话)一起掺入合适的溶剂中，然后过滤杀菌来制备。通常，分散相通过将所述活性化合物掺入含有基本分散介质和来自于上文列举的那些的所需的其它成分的无菌媒介物来制备。在用于无菌注射溶液的制备的无菌粉末的实例中，所述制品通过真空干燥或冷冻干燥制备，其从它们之前无菌过滤的溶液生产活性成分和任何另外所期望的成分的粉末。
公认的是当口服施用时纤维状蛋白应该被保护以免于消化。这通常通过将所述纤维状蛋白与使其抗酸的和酶的水解作用的组合物混合或包装在合适的抗性载体例如脂质体中实现。保护感兴趣的化合物免于消化的方法是所属领域熟知的。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。为了口服治疗施用，所述活性化合物可与赋形剂混合并以片剂，含片或胶囊例如明胶胶囊的形式使用。口服组合物还可使用流体载体制备用作漱口水。药学可相容的结合剂或辅助材料可作为所述组合物的一部分被包括。片剂、丸剂、胶囊、含片以及类似形式可包含以下成分中的任一种或相似性质的化合物：结合剂例如微晶纤维素，黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如藻酸，Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷，水杨酸甲酯，或草莓、樱桃、葡萄、柠檬或橙调味剂。
对于通过吸入施用，所述化合物以来自于含有适当的推进剂(例如气体，诸如二氧化碳)的加压的容器或分配器或者喷雾器的气溶胶喷雾形式递送。
为了提高血清半衰期，被注射的纤维状蛋白制剂还可被装入胶囊、引入至脂质体内腔、制成胶体、聚乙二醇化(Greenwald等人(2003)Advanced DrugDelivery Rev.55：217-250；Pasut等人(2004)Expert Opin.Ther.Patents14：859-894)或可使用提供延长的血清半衰期的其它常规技术。用于制备脂质体的多种方法是可获得的，如在例如Szoka等人(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467，美国专利第4,235,871、4,501,728和4,837,028号中所描述的。所述制剂还可以控释或缓释形式被提供用于以混合物或连续方式释放和施用所述纤维状蛋白。
根据实施方案，使用PLGA基微球或纳米粒子(脂质体)实现玻璃体内注射。PEG基配方也可被使用。因此，用于可注射的药物组合物的其它方法也被明确的考虑用于玻璃体内注射。
全身施用也可以是透粘膜或透皮的。对于透粘膜或透皮施用，适于透过屏障(barrier)的渗透剂也被用于所述制剂。所述渗透剂在所属领域是众所周知的，并且包括例如，对于透粘膜施用，去污剂，胆盐和夫西地酸衍生物。透粘膜施用可以通过鼻腔喷雾或栓剂的使用实现。对于透皮施用，所述活性化合物被配制为软膏，药膏，凝胶或霜剂，如所属领域内众所周知的。所述化合物还可以栓剂(例如，与常规栓剂基质例如可可脂和其它甘油酯一起)或保留灌肠剂的形式被制备用于直肠递送。
除其它递送形式外，所述化合物是可通过滴眼剂或眼内注射递送的。关于滴眼剂，本公开的组合物任选地包括预期用于对眼或鼻的局部施用的一种或更多种赋形剂。预期用于对眼局部应用的药物组合物(例如溶液或喷雾)中的通常所用的赋形剂，包括但不限于，张度剂(tonicity agents)，防腐剂，螯合剂，缓冲剂，表面活性剂和抗氧化剂。合适的张度调节剂包括甘露醇、氯化钠、甘油、山梨醇以及类似物。合适的防腐剂包括对羟基苯甲酸酯、苯扎氯铵、十二烷基二甲基苄基溴化铵、聚季铵盐-1以及类似物。合适的螯合剂包括乙二胺四乙酸钠以及类似物。合适的缓冲剂包括磷酸盐，硼酸盐，柠檬酸盐，醋酸盐以及类似物。合适的表面活性剂包括离子型和非离子型表面活性剂，然而优选非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物和乙氧基三辛基苯酚甲醛聚合物(泰洛沙泊)。合适的抗氧化剂包括亚硫酸盐、抗坏血酸盐、BHA和BHT。本公开内容的组合物可选地含有另外的活性剂。除了任选的防腐成分(例如，聚季铵盐-1)，本公开内容的组合物优选不含有除了聚乙烯吡咯烷酮或聚苯乙烯磺酸外的任何聚合物成分。
当本公开内容的组合物含有聚乙烯吡咯烷酮时，所述聚乙烯吡咯烷酮成分优选被选择或处理以使过氧化物含量最小化。新鲜生产批次的聚乙烯吡咯烷酮比时间长的批次更优选。此外，特别是在所述组合物将含有高于0.5％的聚乙烯吡咯烷酮的情况下，所述聚乙烯吡咯烷酮成分应在与奥洛他定混合之前被热处理(即，加热至高于室温的温度)以减少在聚乙烯吡咯烷酮成分中过氧化物的量并使过氧化物对奥洛他定的化学稳定性的影响最小化。当长时间热处理聚乙烯吡咯烷酮的水溶液充分减少过氧化物的量时，它会导致聚乙烯吡咯烷酮溶液的变色(黄色至黄棕色)。为了充分减少或消除过氧化物而不使聚乙烯吡咯烷酮溶液变色，聚乙烯吡咯烷酮水溶液在加热之前其pH应当被调节至pH 11-13。如果聚乙烯吡咯烷酮溶液的pH被提高，需要更短的时间来实现过氧化物水平的显著减少。
热处理聚乙烯吡咯烷酮成分的合适的方法如下。首先，将聚乙烯吡咯烷酮成分溶解在纯净水中以制成4-6％溶液，然后提高溶液的pH至pH 11-13，(有效的pH范围为11-11.5)，然后加热至60-121℃温度范围，优选65-80℃并且最优选70-75℃。所述被升高的温度应当保持大约30-120分钟(优选30分钟)。在被加热的溶液冷却至室温后，加入HCl以调节pH至3.5-8，取决于奥洛他定组合物的目标pH。
特别是对于预期作为滴眼剂施用的组合物，所述组合物优选包含足以引起最终组合物具有眼科上可接受的渗透压度的量(通常150-450mOsm，优选250-350mOsm)的张度调节剂。本公开内容的所述眼用组合物优选具有4-8的pH，优选6.5-7.5的pH，并且最优选6.8-7.2的pH。
本公开内容的滴眼剂组合物优选地包装在不透明的塑料容器内。用于眼用产品的优选的容器是已经使用环氧乙烷而不是γ辐射灭菌的低密度聚乙烯容器。
就眼用注射剂而言，通过结膜下施用将本公开内容的药物组合物施用至需要治疗的区域。结膜下施用至眼部的一个优选的方法是通过包含本文公开的药物组合物的可注射的制剂。结膜下使用的另一个优选的方法是通过包含缓释组合物的植入。
根据实施方案，结膜下递送的组合物包括包含用于结膜下施用的活性剂的眼用储库制剂(depot formulation)。根据实施方案，眼用储库制剂包括基本上纯的活性剂的微粒。所包含的微粒可被包埋在生物相容的药学上可接受的聚合物或液体成胶囊剂中。储库制剂可适应于在延长的时间段释放基本上所有的活性物质的全部。聚合物或液体基质，如果存在，可适应于在释放所有或基本上所有的活性物质后充分降解而从施用位点运出。储库制剂可以是液体制剂，包含药学上可接受的聚合物和溶解的或分散的活性剂。当注射时，聚合物在注射位点形成储库，例如通过凝胶化或沉淀。
也可以这样的方式设计适于在眼中植入的固体物品以包含聚合物并且可以是生物蚀解或非生物蚀解的。可用于制备运送本公开内容的组合物的眼用埋植剂的生物蚀解的聚合物包括但不限于脂肪族聚酯，例如聚(乙交酯)、聚(丙交酯)、聚(ε-己内酯)、聚(羟基丁酸酯)和聚(羟基戊酸酯)、聚氨基酸、聚原酸酯、聚酐，脂肪族聚碳酸酯和聚醚内酯的聚合物或共聚物。示例性的适合的非生物蚀解聚合物是硅酮弹性体。
根据实施方案，活性剂与将避免化合物从体内迅速清除的载体一起制备，例如控制释放制剂，包括埋植剂和微胶囊包埋的递送系统。可使用生物可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯，聚酐，聚乙醇酸，胶原蛋白，聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这些制剂的方法对本领域的技术人员来说是显而易见的。所述材料也可商业地从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc获得。脂质体悬浮液(包括用细胞特异性抗原的单克隆抗体靶向感染的细胞的脂质体)也可被用作药学上可接受的载体。
纤维状蛋白可作为单一的药物制剂施用。其还可与有效量的包括其他适合的化合物和载体的其他的剂一起施用，并且可与其他活性剂组合使用。因此本公开内容还包括包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
药学上可接受的赋形剂包括例如任何适合的媒介物、佐剂、载体或稀释剂并且是公众可容易地获得的。本公开内容的药物组合物还可包括本领域中熟知的其他的活性剂。药学上可接受的赋形剂也是本领域中技术人员熟知的并且可容易地获得的。
例如，纤维状蛋白组合物可与常规的药学上可接受的载体和赋形剂(即媒介物)混合并以水溶液、片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄片剂、贴片以及类似形式使用，但是通常将纤维状蛋白提供为可注射的。药学组合物可包含某些常见的载体和赋形剂例如玉米淀粉或明胶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢二钙、氯化钠和褐藻酸。常用于制剂中的崩解剂包括交联甲羧纤维素、微晶纤维素、玉米淀粉，淀粉羟乙酸钠和褐藻酸。还可以包括防腐剂和类似物。这些组分中的每一种都是本领域中熟知的。在某些实施方案中，这些药物组合物包含从约0.1至约90％重量的活性化合物和更通常地从约1至约30％重量的活性化合物。参见，例如美国专利第5,985,310号，其公开内容通过引用并入本文。
纤维状蛋白组合物可提供于可以是溶液例如水溶液通常是盐水溶液的药学上可接受的赋形剂中，或者它们可以粉末的形式提供。纤维状蛋白组合物可包含其他组分，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐和类似物。组合物可包含相似的生理学条件所需要的药学上可接受的辅助物质例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂和类似物，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠和类似物。
赋形剂的选择将部分取决于特定的化合物以及用于施用所述组合物的特定的方法。相应地，有本公开内容的药物组合物的各种各样的适合的制剂，下列方法和赋形剂仅为示例性的而不以任何方式进行限制。
液体组合物将通常由化合物或药学上可接受的盐与悬浮剂、防腐剂、表面活性剂、润湿剂、调味剂或着色剂一起在适当的液体载体例如乙醇、甘油、山梨醇、非水性溶剂诸如聚乙二醇、油或水中的悬浮液或溶液构成。可选择地，液体制剂可从可重构的粉末制备。
适于胃肠外施用的制剂包括可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得制剂与预期接受者的血液等渗的溶质的水性和非水性的等渗无菌注射溶液以及可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性的无菌悬浮液。制剂可存在于单位剂量或多剂量密封的容器例如安瓿和小玻璃瓶中并且可在冻干(冷冻干燥)的情况下储存，其仅需要在使用前即时加入用于注射的无菌液体赋形剂例如水。
本公开内容的纤维状蛋白和它们的肠胃外给予时有活性的药学上可接受的盐可被配制用于肌肉内、鞘内或静脉内施用。用于肌肉内或鞘内施用的典型的组合物是活性成分在油例如花生油或芝麻油中的悬浮液或溶液。用于静脉内或鞘内施用的典型的组合物将是包含例如活性成分和葡萄糖或氯化钠或者葡萄糖和氯化钠的混合物的无菌等渗水溶液。其他的实例是乳酸林格氏注射液，加葡萄糖的乳酸林格氏注射液、Normosol-M和葡萄糖、Isolyte E、酰化林格氏注射液和类似物。任选地，共溶剂例如聚乙二醇、螯合剂例如乙二胺四乙酸和抗氧化剂例如焦亚硫酸钠可包含在制剂中。可选择地，溶液可被冻干并且之后在施用前即时用适合的溶剂重构。
本公开内容的纤维状蛋白和在直肠施用时有活性的它们的药学上可接受的盐可被配制为栓剂。典型的栓剂制剂通常由活性成分与结合剂和/或润滑剂例如明胶或可可脂或者其他低熔点的植物或合成蜡或脂肪一起组成。
本公开内容的纤维状蛋白和它们的在局部施用时有活性的药学上可接受的盐可被配制为经皮组合物或经皮递送装置(“贴片”)。这些组合物包括例如背衬、活性化合物贮器，控制膜、衬里和接触粘着剂。这些经皮贴片可被用于以控制的量提供本公开内容的化合物的连续或不连续的输注。用于药用剂的递送的经皮贴片的构建和使用是本领域中熟知的。参见，例如美国专利第5,023,252号，其通过引用全文并入本文。可构建这些贴片用于药用剂的连续的、脉动的或应求的递送。
本公开内容的制剂可被制成经由吸入施用的气溶胶制剂。这些气溶胶制剂可被放入加压的可接受的推进剂例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气以及类似物中。它们还可被配制为用于非加压制品的药物制剂例如在喷雾或雾化器中使用。
适于局部施用的制剂可以霜剂、凝胶、糊剂或泡沫存在，包括除了活性成分外适合的本领域中已知的这些载体。
栓剂制剂还通过与各种基底例如乳化基底或可水溶的基底混合来提供。适于阴道施用的制剂可以阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫存在。
可提供用于口服或直肠施用的单位剂量形式，例如糖浆剂、酏剂和悬浮剂，其中每种给药单位，例如一茶匙、一汤匙，药片或栓剂包含含有一种或多种纤维状蛋白的预定的量的组合物。相似地，用于注射或静脉施用的单位剂量形式可在组合物中包含纤维状蛋白作为无菌水、生理盐水或另一种药学上可接受的载体中的溶液。
术语“单位剂量形式”如本文所用的，是指适于作为用于人类和动物受治疗者的单一给药的物理上不连续的单位，每个单位含有以连同药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物一起足以产生所期望的效果的量计算的预定的量的本公开内容的化合物。本公开内容的新的单位剂量形式的规格取决于所使用的特定的化合物和有待获得的效果以及宿主中与每种化合物有关的药效动力学。
本领域中的技术人员将容易地理解剂量水平可作为特定的纤维状蛋白，递送媒介物的性质以及类似因素的函数而变化。对于给定的化合物的适合的给药可由本领域那些技术人员通过不同的方法来容易地确定。
这些化合物的毒性和治疗效力可在细胞培养或实验性动物中通过标准的药学程序确定，例如确定LD50(对种群的50％致死的剂量)和ED50(对种群的50％治疗上有效的剂量)。毒性效果和治疗效果的剂量比率是治疗指数并且其可表示为LD50/ED50。表现高治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用表现毒性副作用的化合物，但是应当谨慎设计将这些化合物靶向受影响的组织的位点的递送系统以便将对未感染的细胞的可能的伤害最小化，由此，减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可被用于制定在人类中使用的剂量的范围。这些化合物的给药优选地在包括具有几乎没有或没有毒性的ED50的循环浓度范围中。给药可取决于所使用的剂量形式和所用的施用途径在这一范围中变化。对于本公开内容的方法中所用的任一种化合物，可从细胞培养测定初始估计治疗上有效的剂量。可在动物模型中制定剂量以获得包括如在细胞培养中确定的IC50(即获得症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围，这些信息可被用于更准确地确定人类中有用的剂量。可测量血浆中的水平，例如，通过高效液相色谱。
术语“有效的量”是指当以本发明的方式使用时，足以表现出可检测的治疗效果而无过度的副作用(例如毒性、刺激和变态响应)同时具有合理的利益/风险比的生物活性分子或轭合物或其衍生物的量。治疗效果可包括，例如但不限于，对癌症细胞的相当大的细胞毒性但是对天然细胞较少细胞毒性。对于受治疗者的有效的量将取决于受治疗者的类型、受治疗者的体型和健康、有待治疗的病况的性质和严重度、施用的方法、治疗的持续时间、同时使用的疗法(如果有的话)的种类、所使用的特定的制剂以及类似因素。因此，预先说明精确的有效的量是不可能的。然而，对于给定的情况的有效的量可由本领域中的技术人员使用以本文提供的信息为基础的常规的实验来确定。
制造纤维状蛋白的方法
根据本公开内容，公开了用于通过使用纤维状蛋白治疗癌症转移的方法。纤维状蛋白可以是天然存在的以及像这样可以是使用本领域中已知的方法分离用于上文描述治疗的方法中的。纤维状蛋白还可通过本领域已知的任何方法人工制得，例如通过将球状蛋白结构变为纤维状蛋白结构。在一个实例中，蛋白的纤维化可通过无需原纤维种的辅助的工艺来诱导，如美国专利公开第2008/0800186号中所公开的，其公开内容通过引用并入本文。这一过程具有包括容易控制、产物的均质性以及按比例放大的可行性的好处。而且蛋白的纤维化可通过无需纤维原种辅助的这一工艺来诱导。如本文所述的，“蛋白”包括一种或多种蛋白、蛋白片段、多肽或肽。蛋白包括合成的和天然存在的蛋白两者。.
根据先前由美国专利公开第2008/0800186号公开的方法，甚至微量的蛋白也是可应用于这一工艺的。如本文所用的，“蛋白”包括一种或多种蛋白、蛋白片段、多肽或肽。蛋白包括合成的和天然存在的蛋白两者。所述方法可被用于以简单并且迅速的方式将天然蛋白，无论它们的序列，转化为纤维状形式。所述方法包括将球状蛋白在含有去污剂的溶液中溶解并且将所述溶液应用于可分离70kDa及以上分子量的蛋白的分子筛分柱并用包含去污剂的溶液将蛋白洗脱的步骤。在一个示例性的实行中，所述方法包括提供球状蛋白，形成包含球状蛋白的溶液，向包含球状蛋白的所述溶液加入去污剂并将所述溶液应用于具有可分离70kDa及以上分子量的蛋白的孔大小的分子筛分柱的步骤，任选地在低浓度的去污剂存在的条件下。
球状蛋白，也称为球形蛋白，是蛋白的两种主要三级结构类型中的一种。球状蛋白通常是可溶的并且在水中形成球体分子。它们具有包含二级结构基序例如α-螺旋、β-折叠和环结构的混合物的复杂的二级结构。蛋白的其他的主要的三级结构类型是纤维状蛋白或纤维形蛋白。纤维状蛋白通常不可溶并且具有伸长的形状。它们具有比较简单的二级结构并且常常仅以一种类型的二级结构基序为基础。在实行的实例中，球状蛋白是白蛋白，例如人类血清白蛋白、纤连蛋白等。使用8M尿素从大肠杆菌(E.coli)的包涵体提取的重组的未折叠的蛋白也可使用，例如口蹄疫病毒的重组衣壳蛋白VP1(rVP1)，口蹄疫病毒的重组衣壳蛋白VP2(rVP2)，口蹄疫病毒的重组衣壳蛋白VP3(rVP3)或VP1、VP2、VP3和VP4的前体蛋白P1。蛋白还可以是包含来自VP1、VP2、VP3和/或VP4的部分的嵌合蛋白，例如VP42，其包含VP2和VP4两者的部分。其他的球状蛋白(例如牛血清白蛋白)也可使用，包括天然存在的蛋白和合成的寡肽两者。
表面活性剂，本文也称为去污剂，是将水的表面张力降低并且增加有机化合物的溶解度的物质。去污剂可以是离子的，其包括阳离子、阴离子和两性离子去污剂，以及非离子的。去污剂在破坏蛋白中的非共价键中起作用由此将蛋白变性以使它们失去它们的天然形状或构象。在示例性的实行中，所用的去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)，从Sigma获得。在其他的示例性实行中，所用的去污剂是Zwittergent 3-14，从Calbiochem获得。
淀粉样蛋白是纤维形的交联β蛋白聚集体。多种蛋白能够转化为淀粉样原纤维，具有包括纤维状形态、原丝结构、交联β衍射图样，β-结构的增加，刚果红结合和ThT结合的表征。在示例性的实行中，球状蛋白被转化形成淀粉样原纤维，其允许所转化的蛋白通过其淀粉样特性来鉴定。
用于治疗癌症的蛋白可以疾病的严重度和所期望的对癌症细胞的细胞毒性为基础来选择。在示例性的实行中，选择对癌症细胞的更大的细胞毒性。纤维状蛋白可包括来源于相同细胞类型或多于一种、多于两种、多于三种或更多种类型的纤维状蛋白。例如，上文描述的治疗的方法可以在一次给药中或分别地施用rVP1纤维状蛋白和纤维状BSA。
根据实行，可在过程中使用色谱以将球状蛋白结构转化为纤维状蛋白结构并且将它们分离。通常，使用柱完成色谱，尽管其他方法例如用于薄层层析的那些也是可能的。层析技术包括尺寸排阻、亲和和离子交换。尽管纤维状蛋白的批次式生产是可能的，但使用柱工艺允许球状蛋白以迅速、稳定、有效并且连续的方式转化为纤维状形式。使用柱将这一工艺按比例放大同样是可能的。
根据示例性的实行，使用具有至少约70kDa的珠孔尺寸的尺寸排阻层析。所使用的珠孔尺寸可取决于球状蛋白的不同表征例如其大小而变化。孔尺寸在允许蛋白进入小珠基质中起作用因此产生有助于蛋白去折叠/折叠并且增强原纤维组装的机械力。在示例性的实行中，所使用的分子筛分柱是Superdex 200。在其他示例性实行中，所使用的分子筛分柱是HW55S。
对于柱层析，可使用包含低浓度去污剂的缓冲溶液洗脱柱。在示例性的实行中，分子筛分柱用包含25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.1M NaCl和0.05％SDS的缓冲溶液洗脱。在其他的示例性实行中，分子筛分柱用包含25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.1M NaCl和0.05％Zwittergent 3-14的缓冲溶液洗脱。可将洗脱液收集为组分，并且所述组分包含随后混合在一起的纤维状蛋白。混合的组分之后可被进一步过滤以纯化并且分离纤维状蛋白，例如对PBS透析以除去SDS或Zwittergent 3-14。
根据实行，人血清白蛋白(BSA)可通过本文公开的用于产生纤维状蛋白的工艺制为纤维状人血清白蛋白。根据实行，人血清白蛋白已经被确认通过本文描述的工艺转化为纤维状形式。关于所产生的纤维状蛋白，美国专利第7,488,800号通过引用并入。
出乎意料地发现纤维状HSA(F-HSA)在导致不同癌症细胞的凋亡上至少与口蹄疫病毒的重组衣壳蛋白(rVP1)一样有效。使用F-HSA代替rVP1作为癌症治疗的优点包括HSA是人类内源蛋白。因此，HSA或其具有相似序列和组成的衍生物与外来蛋白rVP1相比在临床应用期间较不可能引发免疫原性和中和抗体。
根据实行，F-HSA经由将HSA溶解在1％SDS溶液中，通过Superdex-200凝胶过滤柱并用包含25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.1M NaCl和0.05％SDS的缓冲溶液洗脱来产生(图1)。在对PBS透析以除去SDS之后，发现与HSA不同，从Superdex-200柱洗脱的F-HSA以剂量依赖性方式表现出淀粉样蛋白特异性染料ThT的增强的荧光水平。
之后确定F-HSA在癌症细胞中诱导细胞毒性。因为纤维状血清白蛋白与受体例如细胞表面的整联蛋白结合而球状血清白蛋白不能，所以据信血清白蛋白的结构从球状变化为纤维状形式使蛋白能够选择性地靶向比正常细胞表达更多整联蛋白α5β1的癌症细胞。F-HSA分别以0.15μM(图13)和0.48μM(图14)的IC50剂量依赖性地抑制包括TS/A(小鼠乳腺癌)和MDA-MB-231(人类乳腺癌)细胞的乳癌细胞生长。F-HSA以0.6μM(图15)的IC50抑制卵巢癌细胞SKOV3生长并以1.1μM(图16)的IC50抑制子宫颈癌细胞CaSki生长。F-HSA还分别以0.35μM(图17)和0.2μM(图18)的IC50在前列腺癌细胞PC-3和22Rv1中诱导细胞毒性。此外，F-HSA在多个肺癌细胞系中诱导细胞毒性(图19)。
因此，根据实行，公开了用于治疗癌症的方法。所述方法包括提供HSA、将HSA变为纤维状结构并且向需要其的患者施用治疗上有效的量的F-HSA的步骤。HSA转化为纤维状形式增加了其对靶细胞的细胞毒性效果。
在示例性的实行中，癌症是肾癌、乳癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、子宫颈癌或卵巢癌。在示例性的实行中，纤维状HSA在通过调节Akt信号通路诱导癌症细胞凋亡中起作用。在一些实例中，纤维状HSA调节导致Akt失活的整联蛋白α5β1或αvβ3。在其他的实例中，纤维状HSA与整联蛋白结合并且主要通过整联蛋白/FAK/Akt/GSK-3β/半胱天冬酶-3通路导致细胞凋亡。
可根据疾病的严重度和所期望的对癌症细胞的细胞毒性来选择纤维状HSA蛋白、衍生物、直系同源物或具有与HSA的基本同一性的其他蛋白。在示例性的实行中，为了对癌症细胞的更大的细胞毒性，选择具有RGD基序或更大分子量的蛋白。RGD基序是整联蛋白的配体。已经显示纤维状蛋白通过调节整联蛋白/Akt信号通路诱导细胞死亡。已经发现具有RGD基序的纤维状蛋白例如rVP1-S200和FN-S200比不具有RGD基序的那些例如BSA-S200和rVP3-S200更具有细胞毒性。
“变体”是指与参照多核苷酸或多肽不同但是保留基本特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型的变体在核酸序列上不同于另一个，参照多核苷酸。变体的核苷酸序列上的变化可以改变或可以不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化将导致由参照序列编码的多肽中的氨基酸取代、加入、缺失、融合和截短，如本文所讨论的。
多肽的典型的变体在氨基酸序列上不同于另一个，参照多肽。通常，差异是有限的以使参照多肽和变体的序列整体上非常相似并且在许多区域相同。变体和参照多肽在氨基酸序列上可具有任何组合的一个或多个取代、加入和缺失的差异。取代的或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的一个氨基酸残基。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的例如等位基因变体或其可以是并非已知为天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术或通过直接合成制得。
“直系同源物”是指从另一个物种获得的多肽或多核苷酸，其为来源于不同物种的多肽或多核苷酸的功能相似物。直系同源物中的序列差异是物种形成的结果。
如本文中使用的，二十种常规氨基酸和它们的缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis(免疫学-一种综合)(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其通过引用并入本文。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)，非天然氨基酸例如α-，α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他的非常规氨基酸也可以是本发明的多肽的适合的组分。非常规的氨基酸的实施例包括：4-羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸，N-乙酰丝氨酸，N-甲酰甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸以及其他相似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽标记中，左手方向是氨基末端方向而右手方向是羧基末端方向，与标准用法和惯例一致。
当用于多肽时，术语“基本同一性”是指两个肽序列，当最佳比对时(例如通过使用缺省缺口权重的程序GAP或BESTFIT)共有至少百分之80的序列同一性，优选地至少百分之90的序列同一性，更优选地至少百分之95的同一性以及最优选地至少百分之99的同一性。优选地，不相同的残基位点因常规氨基酸取代而不同。常规氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸的组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸的组是丝氨酸和苏氨酸；具有含有酰胺的侧链的氨基酸的组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸的组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸以及具有含硫侧链的氨基酸的组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的常规氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所讨论的，具有细胞毒性活性的组合物的氨基酸序列上的较小的变化预期是本发明所涵盖的，条件是HSA的氨基酸序列上的变化保持至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。特别地，常规的氨基酸取代是预期的。常规取代发生于在它们的侧链上相关的氨基酸家族中。遗传编码的氨基酸通常分为以下家族：(1)酸性的＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性的＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸(3)非极性的＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电荷的极性的＝甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族是：丝氨酸和苏氨酸是脂肪族-羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是含有酰胺的家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂肪族家族以及苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸是芳香族家族。例如，有理由期望用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸或用结构上相关的氨基酸相似地取代氨基酸将对所获得的分子的结合或特性不具有主要影响，特别是如果取代不涉及骨架位点内的氨基酸。氨基酸变化是否导致功能肽可通过测定多肽衍生物的比活来容易地确定。本发明的蛋白或肽的片段或类似物可以由本领域的那些一般技术人员容易地制备。片段或类似物的优选的氨基和羧基末端位于功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可通过将核苷酸或氨基酸序列信息与公共或专有序列信息库比较来确定。优选地，计算机化的比较方法被用于确定序列基序或预计具有已知的结构或功能的其他蛋白中存在的蛋白构象结构域。确定折叠为已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等人，Science 253：164(1991)。因此，前述实例证实本领域中的技术人员能够识别可被用于定义根据本发明的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。
有效的氨基酸取代是：(1)降低对蛋白酶水解的敏感性；(2)降低对氧化的敏感性；(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和性；(4)改变结合亲和性和(5)给予或改变这些类似物的其他物理化学或功能特性的那些。类似物可包括天然存在的肽序列之外的序列的不同突变。例如，单个或多个氨基酸取代(优选地常规氨基酸取代)可在天然存在的序列中形成(优选地在形成细胞间接触的结构域之外的多肽的部分中)。常规氨基酸取代不应当本质上改变母本序列的结构表征(例如取代氨基酸应当不易于破坏母本序列中存在的螺旋或破坏表征母本序列的其他类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures和Molecular Principles(蛋白，结构和分子原理)(Creighton编辑，W.H.Freeman和Company，New York(1984))；Introduction to ProteinStructure(蛋白结构介绍)(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing，NewYork，N.Y.(1991))和Thornton等人Nature 354：105(1991)中，其每一个通过引用并入本文。
如本文所用的术语“多肽片段”是指具有氨基末端或羧基末端缺失但是保留与从全长cDNA序列推出的天然存在的序列中的相应位置相同的氨基酸序列的多肽。片段通常是至少5、6、8或10个氨基酸长，优选地至少14个氨基酸长，更优选地至少20个氨基酸长，通常至少50个氨基酸长以及甚至更优选地至少70个氨基酸长的。
通常，制造纤维状蛋白的方法包括将蛋白溶解于SDS或其他适合的去污剂溶液中，将溶解的蛋白应用通过具有可分离70kDa及以上分子量的孔尺寸的凝胶过滤柱，将所述蛋白从柱洗脱并且将洗脱液对缓冲盐水透析以除去SDS或去污剂。
在第一步中，通常将球状蛋白溶解为溶液形式。在一个实例中，球状蛋白溶解于具有表面活性剂的PBS中。表面活性剂，本文也称为去污剂，是将水的表面张力降低并且增加有机化合物的溶解度的物质。去污剂可以是离子的，其包括阳离子、阴离子和两性离子去污剂，以及非离子的。去污剂在破坏蛋白中的非共价键中起作用由此将蛋白变性以使它们失去它们的天然形状或构象。在示例性的实行中，所用的去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)，从Sigma获得。在其他的示例性实行中，所用的去污剂是Zwittergent 3-14，从Calbiochem获得。
在本方法的某些方面，使用具有至少约70kDa的珠孔尺寸的尺寸排阻层析。所使用的珠孔尺寸可取决于球状蛋白的不同表征例如其大小而变化。孔尺寸在允许蛋白进入小珠基质中起作用，因此产生有助于蛋白去折叠/折叠并且增强原纤维组装的机械力。在示例性的实行中，所使用的分子筛分柱是Superdex 200。在其他示例性实行中，所使用的分子筛分柱是HW55S。产生纤维状蛋白的所述方法的其他细节可以在美国专利公开第2008/0800186号中找到，其公开内容通过引用并入本文。
进行下列实施例以便为本领域中的那些普通技术人员提供如何进行和使用主题发明的完整的公开内容和描述并且并不预期限制被认为是本发明的范围。
实验
实施例1
方法
细胞系和培养。将SK-OV-3细胞(人类卵巢癌细胞系；ATCC HTB-77)和SK-OV-3ip.1细胞以及CaSki细胞(人类宫颈癌细胞系；ATCC CRL-1550)于37℃分别保持在McCoy′s 5A和RPMI-1640培养基中。将MDA-MB-231细胞(人类乳腺癌细胞系；ATCC HTB-26)和TS/A(小鼠乳腺癌细胞系)于37℃分别保持在达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)/F12培养基和DMEM中。将PC-3细胞(人类前列腺腺癌细胞系；ATCC CRL-1435)和22Rv1细胞(人类前列腺癌细胞系；ATCC CRL-2505)于37℃保持在RPMI-1640培养基中。所有的培养基补充10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
细胞毒性测定。细胞存活率通过MTT测定或WST-1测定来确定。简单的说，将1×105个细胞/孔的肿瘤细胞于无血清培养基中接种在96孔板上并且孵育1小时。使用一系列浓度的rVP1、F-BSA或F-HSA的对细胞的处理在无血清培养基中于37℃进行24小时。处理之后，MTT溶液被加至每个孔(0.5mg/ml)，之后是孵育4小时。有活力的细胞数目与甲臜的产生成正比，其在用异丙醇溶解之后可于570nm通过ELISA板读数器分光光度测量。数据表示为未处理的情况的百分比并且表示为平均值±标准差。
根据制造商的说明书来进行WST-1测定(Roche，Mannheim，Germany)。简单地说，在96孔板上将2×104个细胞加至100μl培养基每孔并且在增湿的孵育箱中于37℃在5％CO2中孵育过夜。将附着于孔的细胞在无血清的培养基中孵育并且用系列稀释的rVP1处理。于37℃在5％CO2中孵育16小时以允许药物起作用后将10μl WST-1试剂加入每个孔，并且之后将板于150rpm在摇床上混合1分钟。于37℃在5％CO2中孵育另外2小时以允许WST-1试剂被代谢之后，通过光密度测定存活的细胞的比例(450nm测试波长，690nm参照波长)。存活的细胞的百分比被计算为(O.D.处理/O.D.对照)×100％，而生长抑制的百分比被计算为[1-(O.D.处理/O.D.对照)]×100％。IC50是试剂产生细胞生活力的50％抑制的浓度。
细胞迁移和侵袭测定。按照博伊登室迁移和侵袭测定进行细胞迁移和侵袭测定(Corning)。将较高的室的8-μm孔膜用20μg/ml纤连蛋白包被用于细胞迁移测定或用40μg/ml基质胶包被用于细胞侵袭测定并且放置于具有1ml的PBS的孔中并且于37℃孵育2小时。癌症细胞(1×105个)被重新悬浮在无血清培养基中并且放置在较高的室中1小时。将不同浓度的纤维状蛋白例如rVP1加至较高的室中之后将培养基(10％PBS培养基)加至较低的室中。将细胞于37℃孵育24小时。在孵育结束时，膜的较高侧面的细胞通过用棉头拭子擦拭除去并且将已经迁移至较低膜表面上的细胞通过使用细胞解离溶液(Sigma)来解离并且通过流式细胞计来计数(BD company)。
BALB/c小鼠中TS/A乳腺癌的小鼠模型中转移植入的建立。将小鼠TS/A乳腺癌细胞于37℃在95％空气和5％CO2的增湿的气氛中在补充10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中培养。收获之后，将TS/A细胞(3×105/100μl PBS/小鼠)静脉内注射至每组九只小鼠的尾静脉中。对照培养基或纤维状蛋白例如F-HSA通过静脉内途径每两天一次给予十次。最终，将每组三只小鼠处死并且将其他的用于存活率测定。
在另一个实验中，首先将小鼠TS/A乳腺癌细胞在补充了0％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的用或不用纤维状蛋白例如rVP1(0.1-0.2μM)处理的DMEM中于37℃在95％空气和5％CO2的增湿的气氛中培养。收获之后，将用或不用rVP1预处理的TS/A细胞(3×105/100μlPBS/小鼠)分别静脉内注射在每组九只小鼠的尾部静脉中。14天后，将所有小鼠处死并收集肺。
人类乳癌的小鼠模型中转移的异种移植植入的建立。将人类MDA-MB-231乳腺癌细胞在补充了10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12中于37℃在95％空气和5％CO2的增湿的气氛中培养。收获之后，将MDA-MB-231细胞(3×105/100μl PBS/小鼠)静脉内注射在每组九只小鼠的尾部静脉中。肿瘤注射之后一天，通过静脉内途径每两天一次给予纤维状蛋白例如F-HSA(1mg/Kg BW)十次同时仅用培养基注射对照组。在同一时间点将每组三只小鼠处死并且保留其余的小鼠以测量存活率。
人类前列腺癌的小鼠模型中直生异种移植植入的建立。将人类PC-3前列腺癌细胞在补充了10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中于37℃在95％空气和5％CO2的增湿的气氛中培养。收获后，将PC-3细胞清洗并且直生注射于前列腺中(1×105/20μL PBS/小鼠)。在一组中，PC-3植入后四星期，通过静脉内途径给予纤维状细胞例如rVP1(25mg/kg)，而在其他组中，在癌症植入后给予rVP110周。每周三次施用相同量的rVP1六周并且在用rVP1处理结束时，将每组三只小鼠处死以检测癌症转移。保留其余的小鼠以测量存活率。
人类SK-OV-3卵巢癌的小鼠模型中转移的异种移植植入的建立。按照国防医学中心，台湾的实验室动物的管理与使用的指导进行动物研究。BALB/cAnN-Foxn1雌性裸鼠，8周大，从国家动物中心，台湾获得，在SK-OV-3植入后6天通过腹腔内注射用5×106个SK-OV-3癌症细胞每只小鼠孵育，用纤维状蛋白(例如rVP1，15mg/Kg BW)或PBS(对照)处理小鼠并且每两天重复处理60天。记录存活率百分比和体重直到小鼠死亡或肿瘤植入后340天。
SK-OV-3ip.1细胞的分离。在SK-OV-3细胞植入后60天通过瞬时颈脱位法处死小鼠。之后将3ml的PBS注射至腹部并且使用5-ml注射器和25号(gauge)×1’针头回收腹膜内细胞(约2ml)。将细胞于4℃以200×g离心5分钟并且收集细胞团。为了除去血红细胞。加入5倍于细胞团体积的NH4Cl(0.144M)和1/2倍于细胞团体积的NH4HCO3(0.01M)并于4℃孵育5分钟。将细胞于4℃以200×g离心5分钟并且收集细胞团。在通过8-16％的梯度凝胶(Invitrogen)上的SDS-PAGE分离后使用标准蛋白质印迹技术的HER-2受体水平的蛋白质印迹分析前将细胞在具有20％FBS的McCoy′s 5A培养基中在5％CO2增湿的氛围中于37℃培养3天。
组织病理学。将器官在10％中性缓冲福尔马林中固定。将组织进一步包埋在石蜡中，以4μm切片，使用用于光学显微镜的苏木精和伊红(H&E)染色。
统计分析。所有数据被表达为平均值±标准误差并且用Microsoft Excel估计。对于存活率数据，时序检验被用于确定用或不用药物处理的组之间的差异。进行学生t检验和ANOVA以估计不同处理之间整体上的差异。P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001的值被认为是统计学上显著的。
rVP1体外抑制MDA-MB-231细胞、PC-3细胞、22Rv1细胞、SK-OV-3细胞、
CaSki细胞和SK-OV-3ip.1细胞中的细胞侵袭和/或迁移
为了研究rVP1是否抑制肿瘤细胞侵袭和/或迁移，使用博伊登室测定测量细胞侵袭和/或迁移。在不同浓度(人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞、人类前列腺腺癌细胞系PC-3细胞，人类前列腺癌细胞系22Rv1细胞中0.1μM至0.2μMrVP1；人类卵巢癌细胞系SK-OV-3细胞和SK-OV-3ip.1细胞中0.2μM至0.4μMrVP1；人类子宫颈癌细胞系CaSki细胞中0.2μM至0.6μMrVP1)的rVP1处理之后，细胞侵袭和/或迁移被显著抑制。应注意的是，如使用MTT测定或WST-1测定所确定的这些浓度的rVP1没有影响细胞生活力(图1-3)。因此，rVP1可体外显著抑制人类乳癌、前列腺癌、子宫颈癌和卵巢癌细胞系的转移。
实施例2
rVP1体内抑制肿瘤细胞迁移
A.之后通过静脉注射至BALB/c小鼠中的rVP1体外处理的MDA-MB-231细胞。之后我们检查与未用rVP1预处理的MDA-MB-231细胞相比，用rVP1预处理MDA-MB-231人类乳腺癌细胞24小时以体外抑制转移能力之后将细胞静脉注射到小鼠中是否能够减少小鼠肺中它们的转移。数据显示0.1μM和0.2μMrVP1处理的MDA-MB-231细胞显著降低小鼠肺组织中的癌症细胞转移(图4A)。与未用rVP1处理的肿瘤组相比，相关的肺重量和肺中肿瘤灶的数目同样显著降低(图4B-C)。
B.直生的PC-3异种移植模型。我们同样检查rVP1是否可以体内抑制前列腺癌转移。首先将PC-3人类前列腺腺癌细胞直生地植入至裸鼠前列腺中并且之后植入之后4周或10周，将rVP1(25mg/kg)每周三次静脉注射六周。在rVP1处理结束时，我们将小鼠处死以进行尸检。我们的数据显示rVP1显著抑制PC-3细胞向淋巴结(表1，图5A)和骨盆骨转移并且抑制骨盆骨中的骨质溶解(图5B)。
表1.在植入PC-3的裸鼠中用rVP1处理的转移的淋巴结的百分比和位置。
Figure BPA00001563027200351
C.转移的SK-OV-3异种移植模型。我们的体外数据显示rVP1抑制SK-OV-3人类卵巢癌细胞侵袭。为了检验rVP1是否同样能够体内抑制SK-OV-3卵巢癌转移，建立了人类SK-OV-3卵巢癌的小鼠模型中的转移的异种移植植入。我们发现60天后，来自PBS处理的SK-OV-3负载小鼠的肝被肿瘤细胞包围。另一方面，在用rVP1(15mg/kg)每两天一次静脉注射60天的SK-OV-3负载小鼠中，我们没有观察到它们的肝的任何明显的肿瘤侵袭(图6)。
实施例3
F-HSA体外抑制MDA-MB-231细胞，PC-3细胞，22Rv1细胞和CaSki细胞的细胞侵袭和/或迁移
为了检验其他的纤维状蛋白例如F-HSA是否同样抑制癌症细胞侵袭和/或迁移，通过使用博伊登室测定测量F-HSA对癌症细胞侵袭和/或迁移的影响。在用不同浓度的F-HSA(MDA-MB-231细胞中0.1μM至0.2μM F-HSA；PC-3细胞中0.025μM至0.1μM F-HSA；22Rv1细胞中0.025μM至0.05μM F-HSA；CaSki细胞中0.2μM至0.4μM F-HSA)处理之后，各种癌症细胞的侵袭和/或迁移能力被显著抑制。值得注意的是通过使用MTT测定，在这些浓度，F-HSA没有影响细胞生活力(图7)。
实施例4
F-HSA体内抑制肿瘤细胞转移
为了进一步检验F-HSA是否可以体内抑制肿瘤细胞转移，分别将小鼠乳腺癌TS/A细胞静脉注射至BALB/c小鼠的尾部静脉或者将人类乳腺癌MDA-MB-231细胞注射至裸鼠中。之后在第二天静脉注射F-HSA(1mg/kg)并且之后每两天一次注射十次。在F-HSA处理结束时，将小鼠处死以检测肺的转移。我们的结果显示与仅用对照培养基处理的TS/A或MDA-MB-231负载小鼠相比，F-HSA显著抑制TS/A细胞和MDA-MB-231细胞向的肺转移(图8A和9A)。F-HSA处理的TS/A或MDA-MB-231负载小鼠的相对的肺重量和肿瘤灶数目与未用任何药物处理的TS/A或MDA-MB-231负载小鼠的那些相比显著较小(图8B-C和9B-C)。
实施例5
F-BSA体外抑制CaSki细胞侵袭
我们还检验了其他纤维状蛋白例如F-BSA是否抑制CaSki人类子宫颈癌细胞侵袭。通过使用博伊登室测定测量细胞侵袭。我们发现在0.1μM-0.2μM，尽管如MTT测定所指示的，F-BSA没有影响细胞生活力，但是其显著抑制了CaSki细胞迁移/侵袭(图10)。
实施例6
F-HSA表现出以剂量依赖性方式增强淀粉样蛋白特异性染料ThT的荧光水平
图12显示实验性数据的实行显示与未通过Superdex-200柱处理的BSA相比，F-HSA，与淀粉样原纤维Aβ(1-42)一样，表现出以剂量依赖性方式增强淀粉样蛋白特异性染料ThT的荧光水平。这一结果显示F-HSA具有与Aβ(1-42)一样的纤维状结构，而HSA具有球状结构(与ThT结合是淀粉样蛋白的表征中的一个)。
实施例7
F-HSA对乳癌细胞具有细胞毒性作用
图13显示TS/A细胞中F-HSA的细胞毒性作用而图14显示MDA-MB-231细胞中F-HSA的细胞毒性作用。每种各个细胞类型在无血清培养基中用不同浓度的F-HSA处理16小时。细胞生活力通过MTT测定来确定。球状HSA对正常细胞或癌症细胞没有细胞毒性作用。
实施例8
F-HSA对卵巢癌和子宫颈癌细胞具有细胞毒性作用
图15显示SKOV-3细胞中F-HSA的细胞毒性作用而图16显示CaSki细胞中F-HSA的细胞毒性作用。每种各个细胞类型在无血清培养基中用不同浓度的F-HSA处理16小时。细胞生活力通过MTT测定来确定。
实施例9
F-HSA对前列腺癌细胞具有细胞毒性作用
图17显示PC-3中F-HSA的细胞毒性作用并且图17显示22Rv1细胞中F-HSA的细胞毒性作用。每种各个细胞类型在无血清培养基中用不同浓度的F-HSA处理16小时。细胞生活力通过MTT测定来确定。
实施例10
F-HSA对肺癌细胞系具有细胞毒性作用
根据图19中所示的实行，在腺癌细胞系A549、CL1-0、C11-5、H1299、PC13和PC14；鳞状细胞癌肺癌细胞系H520和肺大细胞癌癌细胞系H661中，F-HSA显示诱导细胞毒性。图19显示各个细胞系中的每一个的IC50。
实施例11
F-HSA体外抑制肿瘤细胞侵袭和迁移
如根据图20中实验性数据的实行所显示的，F-HSA同样显示在体外抑制肿瘤细胞侵袭和迁移上有效。如图9A、9C、9E和9G中所示，F-HSA以不影响癌症或正常细胞的生活力的浓度显著降低肿瘤细胞侵袭/迁移能力。
实施例12
F-HSA体内抑制肿瘤细胞转移
F-HSA体内抑制乳癌肿瘤细胞系TS/A和MDA-MB-231。图21A和22A显示与未用F-HSA处理的TS/A或MDA-MB-231负载小鼠相比，F-HSA显著抑制乳癌TS/A细胞和MDA-MB-231细胞向肺转移，。图21B、21C、22B和22C测量肺组织中肿瘤细胞灶的重量和数目，其进一步确认F-HSA的体内效力。
根据实行，乳癌细胞经由受治疗者的尾部静脉注射。在肺组织中检测的肿瘤细胞灶表明乳癌细胞已经转移到肺中。
材料和方法
F-HSA的制备。将二十毫克的HSA溶解于10ml具有1％SDS(w/v)的PBS中。将HSA溶液超声处理5分钟并且随后应用于用洗脱溶液(25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.1M NaCl和0.05％SDS)预先平衡的Superdex-200。将柱以1ml/分钟的速度洗脱并且混合包含HSA的组分C3和C7。将混合的组分浓缩至2～3mg/ml之后用Cellu-Sep T4/Nominal(MWCO：12,000-14,000Da)透析膜对PBS透析。于室温每两小时更换新的New PBS缓冲液三次。HSA-S200的产率为约75％。
硫磺素T(ThT)荧光测定。与ThT的结合是淀粉样蛋白的表征中的一种。对于荧光测量，将逐渐增加浓度的蛋白与20μM ThT一起于室温孵育1小时，之后一式三份在Wallac Victor21420多标记计数器(Perkin Elmer Life Science，Waltham，MA，USA)上测量荧光。激发和发射波长分别是430nm和486nm。从相应的测量扣除来自缓冲溶液的ThT背景信号。
细胞存活率通过MTT比色测定来确定。将指数生长的细胞(2×104个细胞/孔用于TS/A)于具有10％PBS的培养基中接种于96孔板中并且孵育24小时。使用一系列浓度的蛋白的细胞处理在无血清培养基中进行于37℃16小时孵育。处理之后，MTT溶液被加至每个孔(0.5mg/ml)，之后是4小时孵育期。有活力的细胞数目与甲臜的产生成正比，其在用异丙醇溶解之后可于570nm通过ELISA板读数器分光光度测量。
细胞生活力测定。通过根据制造商的说明书的WST-1测定(Roche，Mannheim，Germany)来测量细胞生活力。简单地说，在96孔板上将2×104个细胞加至100μl培养基每孔并且在增湿的孵育箱中于37℃在5％CO2中孵育过夜。将附着于孔的细胞在无血清的培养基中孵育并且用不同浓度的F-HSA处理。于37℃在5％CO2中孵育16小时以允许药物起作用后将10μlWST-1试剂加入每个孔。并且之后将板放在摇床上并于150rpm振荡1分钟。于37℃在5％CO2中孵育另外2小时以允许WST-1试剂被代谢之后，通过光密度测定存活的细胞的比例(450nm测试波长，690nm参照波长)。存活的细胞的百分比被计算为(O.D.处理/O.D.对照)×100％，而生长抑制的百分比被计算为[1-(O.D.处理/O.D.对照)]×100％。根据这一实验，IC50是试剂产生细胞生活力的50％抑制的浓度。
细胞迁移和侵袭测定。细胞迁移和侵袭通过使用博伊登室迁移和侵袭测定(Corning)来确定。简单的说，将较高的室的8-μm孔膜用20μg/ml纤连蛋白包被(用于细胞迁移测定)或用40μg/ml基质胶包被(用于细胞侵袭测定)并且放置于具有1ml的PBS的孔中并且于37℃孵育2小时。100μl的无血清培养基中的癌症细胞(1×105个)被接种于较高的室中1小时。将系列稀释的浓度的F-HSA加至较高的室中之后将含有10％PBS的培养基加至较低的室中。将细胞于37℃孵育24小时。孵育后，膜的较高侧面的细胞通过用棉头拭子擦拭除去并且将已经迁移至较低的膜表面上的细胞通过使用细胞解离溶液(Sigma)来解离并且通过流式细胞计来计数(BD company)。然而，在这些浓度，当用MTT测定测量并且如图9B，9D，9F，和9H中所示，F-HSA没有影响细胞生活力。使用MTT或WST-1测定测量生活力和细胞毒性。设计这些套件用于作为活细胞中线粒体活性的函数的细胞生长的分光光度测量(Roche)。
体内乳癌细胞转移。将TS/A小鼠乳腺癌细胞静脉注射至BALB/c小鼠的尾部静脉或者将MDA-MB-231人类乳腺癌细胞注射至裸鼠中。之后在第二天静脉注射F-HSA(1mg/kg)并且之后每两天一次注射十次。在F-HSA处理结束时。将小鼠处死以检查肺部的转移。

Claims (41)

1.一种纤维状蛋白，所述纤维状蛋白特异性地抑制转移的癌细胞。
2.包含根据权利要求1所述的纤维状蛋白的药物组合物。
3.根据权利要求1所述的迁移的癌症细胞，其中所述癌症为乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肺癌或肝癌。
4.根据权利要求1所述的纤维状蛋白，其中所述纤维状蛋白包括纤维状白蛋白蛋白。
5.根据权利要求1所述的纤维状蛋白，其中所述纤维状蛋白包括纤维状人类血清白蛋白。
6.根据权利要求1所述的纤维状蛋白，其中所述纤维状蛋白包括口蹄疫病毒的纤维状衣壳蛋白。
7.一种抑制癌症转移的方法，所述方法包括：
向受治疗者施用有效的量的纤维状蛋白和药学上可接受的载体，其中所述施用减少所述受治疗者中的癌症转移。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维状蛋白包括纤维状白蛋白蛋白。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述纤维状蛋白包括纤维状人类血清白蛋白。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维状蛋白包括口蹄疫病毒的纤维状衣壳蛋白。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维状蛋白是嵌合的。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述受治疗者是人类。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是乳癌。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是子宫颈癌。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用选自由下列组成的组：静脉注射、皮下注射、腹腔内注射、动脉内注射、肌肉内注射、肿瘤中的损伤区注射、靠近肿瘤的损伤区注射、静脉输注和动脉内输注。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用经由在所述受治疗者的肿瘤位点处或周围的缓释方式。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用包括施用第二治疗剂。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二治疗剂是化学治疗剂。
21.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二治疗剂是放射治疗
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维状蛋白通过下列方法生产，所述方法包括：
将蛋白溶解在去污剂溶液中以提供溶解的蛋白；
将所述溶解的蛋白应用通过具有能够分离70kDa及以上分子量的蛋白的孔尺寸的凝胶过滤柱；
将所述溶解的蛋白从所述凝胶过滤柱洗脱以提供洗脱液；以及
将所述去污剂从所述洗脱液除去。
23.一种用于在受治疗者中抑制癌症转移的组合物，所述组合物包含纤维状蛋白和药学上可接受的赋形剂。
24.根据权利要求17所述的组合物，其中所述纤维状蛋白包括血清白蛋白。
25.根据权利要求17所述的组合物，其中所述纤维状蛋白包括口蹄疫病毒的衣壳蛋白。
26.一种用于在受治疗者中抑制癌症转移的套件，所述套件包括包含纤维状蛋白的药物组合物和根据权利要求1使用所述药物组合物的说明书。
27.一种组合物，所述组合物包含治疗上有效的量的纤维状人类血清白蛋白和药学上可接受的载体。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述纤维状人类血清白蛋白通过下列方法生产，所述方法包括：
将人类血清白蛋白溶解在去污剂溶液中；
将所述溶解的人类血清白蛋白应用通过具有分离70kDa及以上分子量的蛋白的孔尺寸的凝胶过滤柱；
将所述人类血清白蛋白从所述柱洗脱以获得溶于洗脱溶液的人类血清白蛋白；以及
将所述去污剂从含有所述人类血清白的所述洗脱溶液除去。
29.根据权利要求27所述的组合物，所述组合物是注射形式。
30.根据权利要求27所述的组合物。所述组合物用于抑制人类患者中的癌症转移。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述癌症是选自乳癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌和肺癌中的至少一种。
32.制造根据权利要求1所述的组合物的方法，所述方法包括：
制造纤维状人类血清白蛋白；以及
将所述纤维状人类血清白蛋白以治疗上有效的量与药学上可接受的载体混合。
33.根据权利要求32所述的方法，其中制造所述纤维状人类血清白蛋白的所述步骤还包括：
将人类血清白蛋白溶解在去污剂溶液中；
将所述溶解的人类血清白蛋白应用通过具有分离70kDa及以上分子量的蛋白的孔尺寸的凝胶过滤柱；以及
将所述人类血清白蛋白从所述柱洗脱。
34.根据权利要求33所述的方法，所述方法还包括将从所述柱洗脱的所述人类血清白蛋白浓缩。
35.根据权利要求33所述的方法，其中用包含盐和十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液将所述人类血清白蛋白从所述柱洗脱。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述同业包含选自十二烷基硫酸钠(SDS)和合成的两性离子去污剂的至少一种去污剂。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述柱是SuperdexTM-200或HW55S凝胶过滤柱。
38.一种用于治疗患有癌症的哺乳动物的组合物，所述组合物包含治疗上有效的量的纤维状人类血清白蛋白和药学上可接受的载体。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述癌症是选自乳癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌和肺癌的至少一种。
40.一种用于抑制癌症细胞的组合物，所述组合物包含治疗上有效的量的纤维状人类血清白蛋白和药学上可接受的载体。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述癌症细胞是选自乳癌细胞、卵巢癌细胞、子宫颈癌细胞、前列腺癌细胞和肺癌细胞的至少一种。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016118505A1 (en) * 2015-01-20 2016-07-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Collagen iii composition and uses
RU2637647C1 (ru) * 2016-06-29 2017-12-05 ФАНО России Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К.И. Скрябина (ФГБНУ "ВНИИП им. К.И. Скрябина") Антипролиферативное средство
WO2019070865A1 (en) * 2017-10-03 2019-04-11 Board of Supervisors for the University of Louisiana System SULFORAPHANE ACTIVATED SELF-EMULSIFIABLE MEDICATION DELIVERY SYSTEMS
EP4211154A1 (en) * 2020-09-12 2023-07-19 Academia Sinica Re-folded human serum albumin and use thereof for anti-tumor
UY39689A (es) * 2021-03-25 2022-09-30 Grifols Worldwide Operations Ltd Uso de albúmina para el tratamiento de la función defectuosa de los linfocitos b
EP4062926A1 (en) * 2021-03-25 2022-09-28 Grifols Worldwide Operations Limited Use of albumin for the treatment of defective b-cell function

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5922676A (en) * 1996-09-20 1999-07-13 The Burnham Institute Methods of inhibiting cancer by using superfibronectin
WO2009114831A2 (en) * 2008-03-13 2009-09-17 Academia Sinica Process to produce fibrillar proteins and method of treating using fibrillar proteins

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU659432B2 (en) 1991-03-08 1995-05-18 Novartis Ag A method for the inhibition or prevention of tumor cell metastasis with hirudin
US6749868B1 (en) * 1993-02-22 2004-06-15 American Bioscience, Inc. Protein stabilized pharmacologically active agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
US5981478A (en) * 1993-11-24 1999-11-09 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
GB9724879D0 (en) 1997-11-26 1998-01-21 Univ London Process for the production of protein and products thereof
FI105319B (fi) 1998-06-10 2000-07-31 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä multikomponentti-alfa-interferonin valmistamiseksi
GB9826658D0 (en) 1998-12-03 1999-01-27 Univ London Tissue repair
WO2000045858A1 (en) * 1999-02-08 2000-08-10 Collagenesis, Inc. Collagen-based delivery of radioactivity for use in brachytherapy
US7824687B2 (en) * 1999-08-20 2010-11-02 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Clustered multi-antigenic carbohydrate constructs, methods for their preparation, and uses thereof
WO2001070762A2 (en) 2000-03-21 2001-09-27 Research Foundation Of State University Of New York Adsorption of polyampholytes to charged surfaces and assays incorporating same
US20030032017A1 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Large Scale Proteomics, Corp. Quantification of low molecular weight and low abundance proteins using high resolution two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry
NZ540406A (en) 2002-11-29 2008-04-30 Campina Bv Method for improving the functional properties of a globular protein, protein thus prepared, use thereof and products containing the protein
EP1613344A2 (en) * 2003-03-31 2006-01-11 Greenville Hospital System Anti-tumor vasculature effects of human serum albumin derivatives
US8268974B2 (en) * 2003-05-29 2012-09-18 Academia Sinica Process to produce fibrillar proteins
US7338517B2 (en) 2003-06-04 2008-03-04 University Of South Carolina Tissue scaffold having aligned fibrils and artificial tissue comprising the same
MX2007002271A (es) 2004-07-23 2007-06-15 Om Pharma Terapia anticancer combinada y composiciones farmaceuticas para la misma.
US8546333B2 (en) 2007-02-01 2013-10-01 Technion Research & Development Foundation Limited Albumin fibers and fabrics and methods of generating and using same
KR20120097481A (ko) * 2009-07-20 2012-09-04 내셔날 쳉쿵 유니버시티 사람 혈청 알부민(ＨＳＡ)의 변이체와 컨쥬게이션된 αｖβ3 인테그린에 대해 선택적인 폴리펩타이드 및 이의 약제학적 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5922676A (en) * 1996-09-20 1999-07-13 The Burnham Institute Methods of inhibiting cancer by using superfibronectin
WO2009114831A2 (en) * 2008-03-13 2009-09-17 Academia Sinica Process to produce fibrillar proteins and method of treating using fibrillar proteins

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