CN1960747A - 用于抑制血管生成的乳清蛋白 - Google Patents

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CN1960747A CN 200580013267 CN200580013267A CN1960747A CN 1960747 A CN1960747 A CN 1960747A CN 200580013267 CN200580013267 CN 200580013267 CN 200580013267 A CN200580013267 A CN 200580013267A CN 1960747 A CN1960747 A CN 1960747A
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Abstract

一种选自HAMLET(对肿瘤细胞致命的人α－乳清蛋白)或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α－乳清蛋白生物活性复合物在制备用于治疗增殖性疾病，尤其是膀胱癌或恶性黑色素瘤等粘膜癌，以及成胶质细胞瘤等内脏肿瘤和抑制血管生成的药物中的用途。

Description

用于抑制血管生成的乳清蛋白
本发明涉及一种治疗有害的细胞或组织增生相关的人体疾病的方法，以及生物活性复合物在制备治疗此类疾病的药物中的应用。特别地，这些疾病包括膀胱癌、黑素瘤等恶性粘膜肿瘤或癌症、内脏癌症(特别是脑肿瘤)以及需要抑制血管生成的其它任何疾病(如癌症)。
血管生成是形成新的血管的过程。它通常发生在人体生长发育的特定时期。例如，胚胎需要一张巨大的动脉、静脉和毛细血管组成的血管网。血管生成过程产生血管内皮细胞的初级网，血管内皮细胞将变成较大的血管。后来，血管生成将该网重塑成小的新的血管或毛细血管，使孩子的循环系统得到完全。
在成人中也会发生新血管增生。对于妇女，每个月有几天血管生成活跃，这是月经期内在子宫内膜中形成新的血管。同样，在创伤痊愈期间，血管生成对于组织的修复或再生是必需的。
除非受到血管生成刺激，血管内皮细胞很少分裂。血管生成受到激活剂分子和抑制剂分子的调节。正常情况下阻止生长的抑制剂占优势。出现新的血管需求时，血管生成激活剂的数量增加，而抑制剂的数量减少，这样促进血管内皮细胞的生长和分裂，最终生成新的血管。
二十世纪六十年代之前，癌症研究者认为仅仅因为原始血管膨胀而使血液供应到达肿瘤。但以后试验表明癌症肿瘤维持生长和扩散必需有血管生成。
肿瘤血管生成是血管网的增生，该血管网贯穿癌细胞生长，为其供应养料和氧气，排除废物。当肿瘤细胞释放分子时，血管生成就开始了，该分子向周围正常的宿主组织发送信号，激活某些基因和蛋白质以促使新血管的生长。
癌细胞产生的小的激活剂分子在周围组织中发送血管生成信号。大量不同的蛋白质以及一些较小分子被认定为“血管源的”。这其中有血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。VEGF和bFGF由多种癌细胞生成，也可以由某些正常细胞生成。
VEGF和bFGF首先在肿瘤细胞内部合成，然后分泌到周围的组织中。VEGF或bFGF与适当的受体结合会激活信号级联放大至内皮细胞核内。该核信号最终促使一批基因产生新的内皮细胞生长所需的物质。
由VEGF或bFGF引起的内皮细胞活化启动了一系列生成新血管的步骤。首先活化的内皮细胞产生基质金属蛋白酶(MMP)，这是一种特殊的降解酶。然后这些酶由内皮细胞释放到周围的组织中。MMP破坏了填充细胞间隙的由蛋白质和多糖构成的胞外基质支持物质。该基质的破坏使得内皮细胞得以迁移。当内皮细胞迁移至周围的组织时，活化的内皮细胞开始分裂。很快它们构成空管，逐步发展成成熟的血管网。
虽然许多肿瘤产生诸如VEGF和bFGF等血管源性分子，但它们还不足以启动血管生长。为启动血管生成，这些激活剂分子必须压倒通常抑制血管生长的各种血管生成抑制剂。
几乎有一打天然存在的蛋白质能抑制血管生成。在这群分子中，名为制管张素、内皮抑制素和血小板反应蛋白的蛋白质看上去尤为重要。血管生成抑制剂浓度与VEGF和bFGF等激活剂浓度间的细致协调平衡决定了肿瘤能否诱导新的血管的生长。为引发血管生成，必须提高激活剂的生成量，同时降低抑制剂的生成量。
血管生成抑制剂的发现提出了有关这种分子是否可以治疗性地终止或抑制肿瘤生长的疑问。研究者们通过大量动物试验研究这个问题。在一个惊人的研究中，给患有几种不同癌症的小鼠注射内皮抑制素进行治疗。几个疗程后，在注射癌细胞位置上所形成的原发肿瘤几乎消失，而且动物没有出现对重复使用内皮抑制素影响的抵抗。
内皮抑制素等血管生成抑制剂能抑制原发肿瘤生长的发现增强了这种抑制剂也可以延缓肿瘤转移的可能性。
多年来已知源自原发肿瘤的癌细胞能扩散到其它器官，并形成微小的显微镜可见的肿瘤物质(转移瘤)(可保持潜伏多年)。对这种肿瘤潜伏的一种可能的解释为没有发生血管生成，因此小的肿瘤缺乏继续生长所需的新的血管。
肿瘤潜伏的一种可能的原因是一些原发肿瘤分泌抑制剂制管张素至血流中，制管张素随后循环至全身，抑制了其它部位的血管生长。这能防止显微镜可见的转移瘤长成肉眼可见的肿瘤。
对小鼠的基因研究成为阻碍血管生成过程能抑制肿瘤生长的又一证明。科学家们最近建立了缺少两种基因(称为Id1和Id3)的小鼠品种，缺少该两种基因会阻碍血管生成。给这种突变型血管生成缺陷小鼠注射鼠乳腺癌细胞，出现短期的肿瘤生长，但几个星期后肿瘤完全消退，小鼠保持健康，没有癌症征兆。相反，注射了同样乳腺癌细胞的正常小鼠在几周内死于癌症。
给相同品种的突变型血管生成缺陷小鼠注射肺癌细胞，结果略有不同。在突变型小鼠中，肺癌细胞发展成肿瘤，但肿瘤的生长比正常小鼠慢得多，而且没有扩散(转移)到其它器官。结果，突变型小鼠比注射了同种肺癌细胞的正常小鼠活得长很多。
因此，目前认为抑制血管生长能够延缓或防止癌细胞在人体内的生长和扩散。于是大量的血管生成抑制剂目前正在癌症病人中进行试验。
根据其机理和作用，将正在试验的抑制剂分为几个不同的类型。一些直接抑制内皮细胞，而另外一些抑制血管生成的信号级联放大或阻断内皮细胞破坏胞外基质的能力。
HAMLET(对肿瘤细胞致命的人α-乳清蛋白)(以前称为MAL)是一种阿尔法-乳清蛋白(也表示为α-乳清蛋白)的活性折叠变体，它诱导转化细胞的调亡，但不伤及健康的分化细胞(M.Svensson等.，(2000)Proc Natl Acad Sci USA，97，4221-6)。已发现HAMLET与肿瘤细胞的表面结合，转位进入细胞质，在细胞核中积聚并引起DNA断裂(M.Svensson等.，(2000)Proc Natl Acad Sci USA，97，4221-6)。EP-0776214等描述了这种从乳，尤其是人乳中得到的生物活性复合物以及它们作为抗菌剂的用途。
结合运用共焦显微镜法和亚细胞分级法对HAMLET的细胞靶点进行研究(Hakansson等，1999Exp Cell Res.246,451-60)。HAMLET结合到细胞表面，进入细胞质，在那里与线粒体相互作用并激活线粒体。最后该蛋白质进入细胞核，积聚于其中。
申请人发现耐受细胞和敏感细胞表面结合HAMLET的效率相同，说明这发面没有差别。相反，只在垂死细胞中出现细胞核内积聚，说明这一步将敏感的肿瘤细胞与耐受细胞区分开来。在共焦显微镜下，细胞核内积聚看上去是不可逆的，说明在核区室中存在着结合和保留HAMLET的核靶点。
迄今为止，有关HAMLET的报道显示体外转化的细胞对HAMLET敏感，这说明HAMLET可应用于癌症治疗。但是体外见到的效果与体内观察到的效果并不总是直接相关的，特别是体内发现的情况根据肿瘤的特性和位置而变化。例如，在身体不同器官发现的不同情况能影响任何治疗剂的稳定性，从而影响其功效。
但是，申请人发现HAMLET在体内保持抗人体细胞的活性，因此它是有用的抗癌治疗法，在某些情况下尤其如此。
另外，现已发现HAMLET看来还对血管生成具有抑制效果，这比单纯从以前注意到的肿瘤杀伤活性而预计的效果更强。该分子对细胞的影响具有意想不到的高度选择性。结果扩大了本复合物的潜在治疗范围。
根据本发明的第一个方面，提供了一种选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物在制备用于治疗动物，尤其是人的增殖性疾病和/或抑制血管生成的药物中的用途。
增殖性疾病的具体例子为癌症。一方面，本发明提供了一种通过给肿瘤施用HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段来治疗尤其是人体内癌症的方法。为此目的，该生物活性复合物用于制备治疗癌症的药物。
申请人发现HAMLET和该类型的复合物在用于治疗粘膜肿瘤(尤其是膀胱癌)时能产生意想不到的良好结果。
根据本发明的第二个方面，提供了一种选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物在制备用于治疗人体粘膜癌症的药物中的用途。
在pH等性质方面，粘膜表面所发现的情况很独特。特别在于鼻腔、口腔、咽喉、食道、肺、胃、结肠、阴道和膀胱中具有粘膜表面。尤其可以根据本发明治疗的粘膜表面包括长有肿瘤的咽喉、肺、结肠和膀胱的表面。本发明特别适用于治疗膀胱癌。
然而现已发现HAMET看上去还对血管生成具有抑制效果，这比单纯从以前注意到的肿瘤杀伤活性而预计的效果更强。该分子对细胞的影响具有意想不到的高度选择性。结果扩大了本复合物的潜在治疗范围。
根据本发明的第四个方面，提供了一种选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物在制备抑制血管生成的药物中的用途。
这种药物可用于治疗癌症，尤其是治疗实体癌(特别是迅速增生的实体肿瘤)。然而，此外它可用于延缓肿瘤转移。
HAMLET或其生物活性修饰达到这种效果的机理尚不清楚。可以预期某些效果受肿瘤细胞的调解。具体地，当HAMLET杀死肿瘤细胞时，血管生成激活剂分子的供应减少。但是，观察到的效果似乎显示存在着另外的效果。例如，HAMLET似乎可能对血管细胞的增殖具有直接的影响。
它也可以用于治疗需要抑制血管生成的其它疾病。
作为大量天然存在的蛋白质，HAMLET被认为比全合成药物具有更低的毒性。另外，认为该复合物的免疫原性低。
根据本发明第四个方面制备的药物适宜是适合于局部使用形式的组合物，例如乳膏剂、软膏剂、凝胶剂或水溶液或油溶液或混悬剂。这些药剂可以含有药学上可接受的载体、填充剂和/或赋形剂。
局部用溶液剂或乳膏剂适当含有蛋白质复合物用的乳化剂以及稀释剂或膏基质。
与一般的临床实践相一致，活性化合物的日剂量随着病人、治疗条件等而变化。一般的标准为每次一剂量给予2-200mg的生物活性复合物。
本发明的另一个方面，提供了一种抑制血管生成的方法，它包括给予需要用药的病人选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物。
生物活性复合物的优选例子如上所述。生物活性复合物优选以局部组合物的形式(也如上所述)给药。
这里所用的术语“HAMLET”指α-乳清蛋白生物活性复合物(可以来源于人，也可以不来源于人)，通过结合使用阴离子交换和凝胶层析，从pH4.6下沉淀的乳的酪蛋白组分中分离得到(如EP-A-0776214中实施例所述)或通过在来自人乳酪蛋白，以C18:1脂肪酸为特征的辅因子的存在下，对α-乳清蛋白进行离子交换层析获得(如WO99/26979所述)。国际专利申请No.PCT/IB03/01293中举例描述了具有相似活性的该复合物的变体或衍生物。
α-乳清蛋白可来源于各种哺乳动物，包括人乳、牛乳、绵羊乳和山羊乳，但优选人乳或牛乳，最优选人乳。也可以使用重组蛋白质。
已发现其它试剂，尤其是油酸等脂类有利于人α-乳清蛋白转变成HAMLET。特别地，先前有报道称，生产HAMLET需要油酸(顺式C18:1:9)(M.Sevensson等，(2000)Proc Natl Acad Sci USA，97，4221-6)。最近发现其它脂肪酸以相似方式发挥辅因子的作用。α-乳清蛋白转变成HAMLET的最佳辅因子是在位置9和位置11上具有双键的顺式构象的C18:1脂肪酸。
α-乳清蛋白是14.2kDa的球状蛋白质，具有四个α螺旋(残基1-34、86-123)和一个反向平行的β折叠(残基38-82)，由四个二硫键连接(61-77；73-91；28-111和6-120)(K.R.Acharya等，(1991)J Mol Biol，221，571-81)。α-乳清蛋白的天然构象确定为一个高亲和性Ca2+结合位点，与侧链Asp82、Asp87和Asp88的羧酸盐，Lys79和Asp84的羰基氧和两个水分子配位(K.R.Acharya等，(1991)J Mol Biol，221，571-81)。当暴露于低pH中或在螯合剂的存在下，该蛋白质采用HAMLET中发现的所谓的脱辅构象(apo-conformation)，释放强结合的Ca2+离子(D.A.Dolgikh等，(1981)FEBS Lett，136，311-5；K.Kuwajima，(1996)Faseb J，10，102-09)。
为形成生物活性复合物，α-乳清蛋白一般需要发生构象变化或折叠变化，还需要有脂质辅因子。从α-乳清蛋白中去除钙离子可恰当影响构象变化。在优选的方式中，用不具有功能钙结合位点的α-乳清蛋白变体适当促进了构象变化。
在这里用HAMLET的“修饰”(术语)表示含有这种变体的生物活性复合物。但是，申请人发现，一旦形成复合物，功能钙结合位点和/或钙的存在不影响其稳定性或生物活性。发现生物活性复合物保持了对钙的亲和力而没有丧失活性。因此本发明复合物可进一步含有钙离子。
因此特别地，本发明使用一种生物活性复合物，它包括α-乳清蛋白或处于apo折叠状态的α-乳清蛋白变体或它们各自的片段和使复合物稳定在生物活性形式的辅因子，条件是α-乳清蛋白或其变体的任何片段含有与形成α结构域和β结构域之间的界面的α-乳清蛋白区域相对应的区域。
合适的辅因子是顺式C18:1:9或C18:1:11脂肪酸或具有类似构型的其它脂肪酸。
一个特别适宜的实施方式中，本发明使用的生物活性复合物包括：
(i)顺式C18:1:9或C18:1:11脂肪酸或具有类似构型的其它脂肪酸；和
(ii)除去了钙离子的α-乳清蛋白或释放了钙离子或没有功能钙结合位点的α-乳清蛋白变体；或它们各自的片段，条件是任何片段含有与形成α结构域和β结构域之间的界面的α-乳清蛋白区域相对应的区域。
这里使用的术语“变体”指与基础蛋白质(合适的为人α-乳清蛋白或牛α-乳清蛋白)同源的多肽或蛋白质，但它们的碱基序列不同于衍生它们的蛋白质，其序列中有一个或更多个氨基酸选被其它的氨基酸取代。氨基酸取代可以认为是“保守的”，其中一个氨基酸被另一个具有广义相似性质的氨基酸取代。非保守取代中氨基酸被不同类型的氨基酸取代。广义上说，较少发生非保守取代有可能不改变多肽地生物活性。合适的变体有至少60％的同一性，优选至少70％的同一性，甚至更优选80％或85％和特别优选90％、95％或98％或更多的同一性。
用BESTFIT和GAP(均来自威斯康星基因计算机组(GCG)软件包)程序比较氨基酸序列以确定同一性程度。例如用BESTFIT对两个序列进行比较，并产生最相似节段的最佳对比。GAP能使序列沿其全长进行对比，并通过在序列中各自插入合适的空间来发现最佳对比。适当地，在本发明的上下文中讨论序列的同一性时，将序列沿其全长进行对比比较。
术语“其片段”指给定氨基酸序列的任何部分，它可形成与含有完整α-乳清蛋白氨基酸序列的复合物活性相似的复合物。片段可以包括来自全长蛋白质的连接在一起的一个以上部分。合适的部分包括至少5个，优选至少10个来自基础序列的连续氨基酸。
合适的片段是适当包括至少20个氨基酸，更优选至少100个氨基酸的缺失突变体。它们包括来自蛋白质的小区域或这些小区域的组合。
形成α结构域和β结构域之间的界面的人α-乳清蛋白区域在结构上定义为第34-38位和第82-86位氨基酸。这样合适的片段将包括这些区域，优选包括天然蛋白质中第34-86位氨基酸的整个区域。
在特别优选的方式中，生物活性复合物包括α-乳清蛋白变体，该变体中钙结合位点被修饰，从而降低了与钙的亲和力或该位点不再起作用。
已发现，在牛α-乳清蛋白中，钙结合位点与残基K79、D82、D84、D87和D88配位。对该位点或其在非牛α-乳清蛋白中的相当位点进行修饰(例如去除一个或更多个氨基酸残基)，能降低该位点与钙的亲和力或完全消除该功能，这种突变体是本发明中的一个优选方面。
牛α-乳清蛋白的Ca2+结合位点由一个310螺旋和一个α螺旋组成，该两个螺旋被一个短回转区域分开(Acharya K.R.等，(1991)J MolBiol 221，571-581)。它的侧翼是两个二硫键，使这部分分子相当地刚性。配位Ca2+的7个氧基中有5个来自侧链Asp82、Asp87和Asp88的羧酸盐或Lys79和Asp84的羰基氧。两个水分子提供了剩余的两个氧基(Acharya K.R.等，(1991)J Mol Biol 221，571-581)。
先前已有研究显示在第87位置上将天冬氨酸定点诱变成丙氨酸(D87A)能使强钙结合位点失去活性(Anderson P.J.等，(1997)生物化学36，11648-11654)，该突变蛋白质采用脱辅构象(apo-conformation)。
因此在一个优选方式中，在牛α-乳清蛋白序列中使第87位置上的天冬氨酸残基突变成非酸性残基，特别是一非极性或无电荷极性侧链。
非极性侧链包括丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸或半胱氨酸。特别优选的例子是丙氨酸。无电荷极性侧链包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸。
为了使突变蛋白质的结构变形最小化，D87也被天冬酰胺(N)取代(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)，天冬酰胺缺乏羧酸盐基团的非补偿负电荷，但具有相同的侧链体积和几何形状。突变蛋白(D87N)显示与钙低亲和结合(K-Ca2×105M-1)(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)。在本发明另一个优选方式中，这种突变体构成本生物活性复合物的一个因素。
因此，用于本发明复合物的特别优选的变体是α-乳清蛋白的D87A和D87N变体或包括这种突变的片段。
牛蛋白和人蛋白的分子区域之间存在差别，因为在牛α-乳清蛋白中，三个基础氨基酸中的一个(R70)变成了S70，从而丧失了一个配位侧链。因此当牛α-乳清蛋白用于本发明复合物时，优选使用S70R突变体。
来自不同种类的α-乳清蛋白中的Ca2+结合位点为100％保守的(Acharya K.R.，等，(1991)J Mol Biol 221，571-581)，说明该功能对蛋白质的重要性。它与五个不同的氨基酸和两个水分子配位。侧链D87连同D88的羧酸盐最初将钙离子填入阳离子结合域，形成稳定结构的内部氢键(Anderson P.J.等，(1997)生物化学36，11648-11654)。失去D87或D88会削弱与Ca2+的结合，使分子稳定于部分未折叠态(Anderson P.J.等，(1997)生物化学36，11648-11654)。
此外，可以使用在钙结合位点发生两个不同点突变的牛α-乳清蛋白的突变蛋白。例如，已发现在第87位置上，用丙氨酸取代天冬氨酸(D87A)完全取消了钙的结合并破坏了蛋白质的三级结构。用天冬酰胺取代天冬氨酸，蛋白质(D87N)仍与钙结合，但亲和性降低，显示丧失三级结构(虽然不象D87A突变体宣称的那样)(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)。突变蛋白的堆积体积变化最小，两者的氨基酸具有相同的平均体积，为125A3，天冬酰胺的羧酸盐侧链允许蛋白质与钙配位，但效率降低(Permyakov S.E.等，(2001)Proteins Eng 14，785-789)。在生理温度下，两种突变蛋白均稳定为脱辅构象(apo-conformation)，但尽管存在这种构象变化，它们还是没有生物活性。结果表明仅凭构象变化成脱辅构象(apo-conformation)还不足以诱导生物活性。
α-乳清蛋白的结构已为本领域所知，可以参照例如前述Anderson等和Permyakov等揭示的结构来识别这里提到的残基的氨基酸编号的准确性。
根据本发明第二个方面制备的药物适宜是药物组合物，其形式是适合于局部给药的形式，尤其对受治恶性粘膜肿瘤局部给药的形式。例如，该组合物的形式可以是适合于膀胱滴注，用于治疗膀胱癌。这些组合物可以包括药学上可接受的常用的载体、填充剂和/或赋形剂。然而适合膀胱滴注的组合物包含活性剂的无菌水溶液或生理盐水溶液。
适当含有蛋白质复合物用的乳化剂以及稀释剂或膏基的局部用溶液剂或乳膏剂，可能更适合在其它恶性粘膜肿瘤中使用。这种剂型可直接对肿瘤使用。
另外，这种局部用组合物可用于治疗恶性皮肤肿瘤，特别是黑素瘤。申请人发现HAMLET抗黑素瘤细胞特别有效。以这种方式使用这些组合物构成了本发明的又一个方面。
与一般的临床实践相一致，活性化合物的日剂量随着病人、所治疗的癌症性质等而变化。一般的标准为在至少3天，优选至少5天的时期内，每天一剂量给予200mg-1g的生物活性复合物，优选膀胱内滴注。特别地，包括每天给药750mg HAMLET，给药5天的给药方案证明是有效的。
申请人对HAMLET局部治疗膀胱癌的效果进行了研究。如下所报道的，膀胱内滴注的效果特别好。
本发明的又一个方面，提供了一种治疗粘膜癌特别是膀胱癌的方法，包括给需要用药的病人施用选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物。该复合物合适在膀胱内使用。
以上阐述了生物活性复合物的优选例子。如上所述，该生物活性复合物优选以局部用组合物形式使用。
申请人发现当直接注入体内内脏肿瘤中时，HAMLET和这类复合物产生意想不到的良好效果。特别地，发现脑中的液体不妨碍该活性。
根据本发明的第三个方面，提供了选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物在制备用于注入肿瘤内的药物中的应用。
将这种生物活性复合物直接注入肿瘤中，发现肿瘤的体积减小了，说明产生了HAMLET诱导调亡的效果，尽管存在着可能包含蛋白酶的体液。结果这种疗法特别适合于治疗脑、肝、肾、前列腺和卵巢等内脏器官的实体肿瘤以及黑素瘤。
这种复合物的选择性效果意味着，邻近的健康组织即使与该复合物接触，也不会受到影响。
本发明特别用来治疗脑肿瘤和治疗肝脏肿瘤引起的毒素。特别是，脑部的液体看来并不妨碍Hamlet产生令人吃惊的效果。
由于尚没有达到选择性而有效的治疗，恶性脑肿瘤代表了一种重大的医疗挑战。多数颅内瘤起源于神经胶质细胞，形成称为神经胶质瘤的异质型。在所有主要的脑肿瘤中它们占到60％以上，具有最不利的预后。成胶质细胞瘤(GBM)是最恶性的神经胶质瘤，平均存活时间少于1年，神经外科和神经病理学文集中提高的所有颅内肿瘤中它们占到四分之一左右。近几年来，脑肿瘤的外科治疗取得了显著的技术进步。显微外科、神经导航和新的诊断用高分辨率成像技术降低了发病率，却没有改善存活时间。由于其侵袭性质和扩散浸润生长，手术尚达不到完全去除GBM。结果对这些病人的现有治疗是治标的，涉及部分肿瘤切除术、放疗和化疗。
但是，申请人发现HAMLET等生物复合物为治疗特别是GBM提供了新的工具。HAMLET在体外以凋亡样机制杀死GBM肿瘤细胞，且该影响是选择性的，因为健康细胞不受影响。另外，HAMLET在人GBM异种移植模型的体内保持这些性质。将HAMLET局部注入建立的人GBM肿瘤中，显著延迟了肿瘤的发展和压力症状的出现。如TUNEL分析和组织病理学所显示，HAMLET也在体内以凋亡样机制杀死肿瘤细胞。没有坏死的证据，该影响是选择性的，因为在周围的未损伤脑部没有检测到组织病理学变化。对活组织检查球状体的体外治疗证实与良性脑膜瘤比较，HAMLET有效杀死了恶性细胞。从而该结果表明HAMLET可用于治疗GBM。
根据本发明的第三个方面制备的药物适宜为适合在特定的受治实体肿瘤内使用的药物组合物。例如，可以是适合于注入肿瘤形式的组合物。这些组合物可以包括常用的药学上可接受的载体、填充剂和/或赋形剂。然而用于注入的组合物包含活性剂的生理盐水溶液。
与一般的临床实践相一致，活性化合物的剂量随着病人、受治癌症的性质等而变化。一般的标准为每次一剂量向肿瘤注入2mg-200mg生物活性复合物。
这里报道的试验调查了HAMLET在人GBM异种移植模型中的治疗效力。表明虽然与脑液接触，HAMLET在体内保持了选择性诱导GBM凋亡样死亡的能力。发现肿瘤内给予HAMLET通过诱导肿瘤细胞凋亡，延长了患有人成胶质细胞瘤(GBM)的大鼠的存活。
通过异种移植人活组织检查球状体，在裸鼠中建立侵袭生长的人GBM，比较HAMLET与α-乳清蛋白(相同蛋白质的天然折叠变体)的治疗效果。
在脑内，HAMLET的对流增强传送极大减小了颅内肿瘤的体积，延迟了患肿瘤大鼠产生压力症状。HAMLET没有诱导邻近肿瘤的健康脑组织凋亡，向健康大鼠的脑内注入治疗浓度的HAMLET后没有引起毒副作用。结果表明HAMLET是癌症治疗，特别是控制GBM发展的潜在新工具。
结果还表明，在接受HAMLET和α-乳清蛋白的异种移植大鼠中，疾病的发展存在显著差异(p＜0.001)。这说明了蛋白质折叠的变化和油酸等特定辅因子的协同会引起怎样的生物活性差异。
本发明的另一个方面，提供了一种治疗癌症的方法，包括给肿瘤或其区域注入选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物。
特别地，用合适的注入设备适当使用该复合物，尤其发现对流增强传送技术(CED)特别有效。
生物活性复合物的优选例子如上所述。
根据本发明的第四个方面，提供了选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物在制备抑制血管生成药物中的用途。
这种药物可用于治疗癌症，特别是实体癌，尤其是治疗迅速增生的实体肿瘤。然而此外，它可用来延缓肿瘤转移。
HAMLET或其生物活性修饰达到这种效果的机理尚不清楚。预期某些效果受肿瘤细胞的调节。具体地，当HAMLET杀死肿瘤细胞时，减少了血管生成激活剂分子的供应。但是，观察到的效果看来显示存在着另外的效果。例如，HAMLET似乎有可能对血管细胞的增生具有直接的影响。
它也可以用于治疗需要抑制血管生成的其它疾病。
作为大量天然存在的蛋白质，HAMLET被认为比全合成药物具有更低的毒性。另外，认为该复合物的免疫原性低。
根据本发明第四个方面制备的药物适合为组合物，其形式为适合于局部使用的形式，例如乳膏剂、软膏剂、凝胶剂或水溶液或油溶液或混悬剂。这些药剂可以含有常用的药学上可接受的载体、填充剂和/或赋形剂。
局部用溶液剂或乳膏剂适当含有蛋白质复合物用乳化剂以及稀释剂或膏基。
与一般的临床实践相一致，活性化合物的日用剂量随着病人、治疗情况等而变化。一般的标准为每次一剂量给予2-200mg生物活性复合物。
本发明的另一个方面，提供了一种抑制血管生成的方法，它包括给需要用药的病人施用选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物。
生物活性复合物的优选例子如上所述。生物活性复合物优选以局部组合物(也如上所述)的形式给药。
现参照附图对本发明进行详细举例描述，其中：
图1表示依照本发明治疗前后拍摄的膀胱癌的腔内照片；
图2HAMLET-结构和在人GBM肿瘤异种移植物中的体外及体内功能。(a)通过除去Ca2+和加入C18:1，9顺式脂肪酸由天然α-乳清蛋白制成HAMLET。本图基于α-乳清蛋白的晶体结构。(b)GBM细胞系对HAMLET的敏感性。LD50＝在6/24小时内杀死50％细胞所需要的浓度。(c和d)24小时注入HAMLET(n＝10)或α-乳清蛋白(n＝10)之前一周允许建立人GBM肿瘤球状体(沿箭头注射)。注入2个月后，对α-乳清蛋白治疗的大鼠的单个肿瘤(1-4)或HAMLET治疗的大鼠的单个肿瘤(5-8)进行MRI扫描。(e)注入HAMLET的动物的平均肿瘤大小显著小于α-乳清蛋白处理组(p＜0.01)。(f)记录颅内压升高症状，α-乳清蛋白对照中两个月后出现该症状，而接受HAMLET的大鼠延迟出现压力症状(p＜0.001)。
图3HAMLET诱导凋亡。(a)在进行HAMLET或α-乳清蛋白的CED后12小时，取自患肿瘤鼠的脑组织切片。如TUNEL染色(绿色荧光，左边系列)和固缩凋亡的肿瘤细胞核(右边系列，放大600倍)所示，HAMLET在肿瘤区域内引起大量凋亡。在HAMLET处理的动物的肿瘤周围的健康脑组织或在α-乳清蛋白处理组中没有观察到凋亡。用碘化丙啶进行细胞DNA染色(红色荧光)，可见到细胞核。(b)用HAMLET或α-乳清蛋白体外处理GBM球状体，检查诱导凋亡情况。在人GBM球状体到处可见HAMLET引起的凋亡(绿色荧光)，但在来自良性脑膜瘤的球状体中没有看到(c)。α-乳清蛋白没有刺激GBM或脑膜瘤的球状体出现凋亡(放大360倍)。在HAMLET处理的球状体中发现浓染的固缩凋亡细胞(b中箭头)，但在α-乳清蛋白组中没有发现(放大450倍)。
图4用HAMLET或α-乳清蛋白预处理后异种移植GBM球状体。每组取六个动物，异种移植用HAMLET或α-乳清蛋白预处理3小时的人GBM球状体(每组4-5个)。所有接受α-乳清蛋白预处理的GBM细胞的大鼠，发展成大的肿瘤(a，1-4)。接受HAMLET预处理的球状体的六个动物中有四个没有表现出肿瘤发展的迹象，存活了至少210天(b，5-8)。HAMLET组中发展成肿瘤的两只大鼠显示的肿瘤显著较小(c，p＜0.01)，压力症状延迟出现(d，p＜0.01)。
图5放射标记的HAMLET的分布。(2-10×106PPM)注入健康大鼠的脑后(n＝3，放大90倍)。字母表示切片的位置，X表示注入点。(a)额叶、(b)基底核、(c)丘脑和(g)黑质。
图6毒性评估。用0.7mM HAMLET、α-乳清蛋白或0.15M NaCl处理健康大鼠(每组n＝5)。注入三周后分析潜在毒性。(a)MR图象中T2加权信号显示在注入点有小的膀胱损害，但没有毒性放射学信号。(b)来自注入半球的连续脑切片的组织病理学显示健康脑中没有毒性证据，但邻近注入点的一些组织遭到破坏(箭头，苏木精-曙红(htx-eosin)，放大100倍和400倍)。(c)肝功能和肾功能的生化标记没有显示显著的毒性影响(两组中p＞0.05)。(d)体重增加在组间没有差异(p＞0.5)。阴影条(hatched bars)表示注入前的体重值，填满条(filled bars)表示注入三周后的值。(e)旷场运动实验不受影响(p＞0.05，深灰＝HAMLET，浅灰＝α-乳清蛋白，白色＝NaCl)。
图7-10表示逐渐放大的组织切片，说明用HAMLET局部治疗5天后，人膀胱乳头状瘤中的血管生成解体。
实施例1
给患有膀胱癌的病人膀胱内滴注Hamlet
制备物质和随机选择病人
取非吸烟供者的母乳，在制备HAMLET之前进行HIV筛查。先后用硫酸铵沉淀法、苯基琼脂糖层析法和分子排阻色谱法从人乳乳清中纯化得到α-乳清蛋白。根据早产儿管理规则，使用来自医院乳库的过剩乳。如文献中描述的，将天然α-乳清蛋白加载到油酸调节的离子交换层析柱上，制备HAMLET。洗脱组分在蒸馏水中透析，冻干并在-20℃下保存。
另外，对HAMLET进行细菌污染物筛查，以干物质形式在-20℃下保存。
研究设计：
邀请等待手术的新诊断的或复发的膀胱尿道上皮癌病人参加研究。在得到同意后，对病人进行膀胱镜检查以估计肿瘤大小并用腔内照片证明损害情况。在治疗后手术前，重复进行膀胱镜检查再次估计肿瘤大小，并拍摄腔内照片。
在密切监督下，在门诊诊所进行膀胱内滴注HAMLET。每天滴注一次，重复五天。施行尿道导管插入术后，清空膀胱，收集尿液供分析。HAMLET(25mg/ml，30ml)沉积在膀胱中，拔除导尿管，要求病人保持滴注至少两小时。为降低多尿，要求病人避免在滴注前四小时进食流质或滴注后立即进食流质。每次滴注前取尿样，在滴注后的第一次空尿中取尿样。
HAMLET滴注日程不受对病人的日常检查的干扰或延误。
病人：七名男性病人参与研究。基于标准肿瘤分类，病人分配到三组：A、B和C。
病人A1和A2(92岁和86岁)患有低分化肌肉侵入性膀胱尿道上皮癌(T4g3)。由于高龄，对这些病人进行缓和的测定，如反复经尿道切除肿瘤术(T-TUR)，止痛法和临床观察。两位病人均频发轻微的下尿路症状，但尽管高龄，他们在其他方面健康。
病人B1、B2、B3和B4(分别为37岁、75岁、70岁和82岁)患有乳头状浅表性膀胱肿瘤(TAg1-2)。病人B1和B3为新诊断患有肿瘤，而B2和B4是复发先前已知的高分化浅表性膀胱肿瘤(TAg1)。除了肿瘤，病人B1和B4在其他方面健康，而病人B2患有高血压并发心硬化。病人B3患有高血压和慢性支气管炎。病人C1(72岁)先前已知患有多病灶表现原位膀胱癌(CIS)。在滴注前一年他已接受膀胱内滴注卡介苗(BCG)。膀胱活组织检查最初显示对BCG治疗有反应。在活组织检查样品检查诊断CIS复发之前。该病人其他方面健康。
治疗结果：
所有病人每日进行膀胱内滴注HAMLET，持续五天。没有病人遭受任何滴注副作用，没有全身炎症反应参数，如CRP、发烧或外周嗜中性粒细胞计数。
病人A1和A2由于下尿路功能障碍，难以保持膀胱中的HAMLET溶液。无法评估治疗效果。病人B1在五天滴注HAMLET后几乎完全减轻肿瘤。
病人B2表现少量减小肿瘤尺寸，但显著改变了肿瘤的特征。在治疗前，接触肿瘤会易碎而流血，但治疗后其表面“变干”。病人B3在左膀胱壁上有一个乳头状肿瘤，该肿瘤太大，不能用一张照片拍全。在膀胱内滴注HAMLET后，肿瘤尺寸视觉估计表明尺寸减小了50％左右。病人B4在左侧膀胱颈上有两个小的外生肿瘤。肿瘤的尺寸没有明显减小，但肿瘤特征明显改变，其表面萎缩。
病人C1由于缺少外生肿瘤生长，难以评价。在滴注HAMLET前，3/3膀胱活组织检查(“绘图”)显示原生癌，但治疗5天后，只有1/3活组织检查呈阳性。
TUNEL阳性，检测凋亡的癌细胞。
从病人中的五人中取显微镜检查健康的膀胱粘膜进行活组织检查。在这些活组织检查中没有发现HAMLET治疗的影响。
我们认为HAMLET治疗引起膀胱癌细胞的凋亡，显著影响了肿瘤的体积和显微镜检外观。
实施例2
HAMLET的制备
用离子交换层析在C18:1，9顺式脂肪酸预处理的DEAE-trisacrylM柱(BioSepra，法国)上从脱辅α-乳清蛋白(apo α-cactalbumin)制备HAMLET(Svensson等，Proc.Natl.Acad，Sci美国，97：4221-4226)。用乳过氧化物酶法对HAMLET(1mg/ml)进行125I标记(Hakansson等，Proc.Natl.Sci美国，92：8064-8068)。
肿瘤组织和细胞系
在Haukeland大学医院的医学伦理委员会(卑尔根，挪威)同意下，采集右额叶的GBM和矢状窦旁脑膜瘤的肿瘤活组织切片。对直径为300μm的球状体进行培养，用于移植(Bherkvig等，J.Neurosurg72：463-475)。神经胶质瘤细胞系为：ATCC CRL 2365、D-54MG和U-251MG。A549肺癌系为ATCC CRL 185。完全分化的鼠脑细胞的单细胞悬浮液的制备方法为：解剖成年鼠的脑部，用1％胰岛素(SigmaChemicals Inc.，圣路易斯，MO，美国)在DMEM培养基(GibcofBRL，生命技术有限公司，佩斯利，苏格兰)上室温下解离30分钟，加入0.24％DNase和1％FCS(Sigma Chemicals Inc.，圣路易斯，MO，美国)，然后机械中断。生存力为＞99％。
将人GBM异种移植裸大鼠
所有实验经国家动物研究局(The National Animal ResearchAuthority)同意，根据“保护用于科学目的的脊椎动物的欧洲协议”(European Convention for the Protection of Vertebrates Used forScientific Purposes)进行操作。对Haukeland医院饲养的裸大鼠(Han：rnu/rnu Rowett)腹膜内注射Equitisin进行麻醉，放置于立体定位框架中(David Kopf，模型：900，Tujunga，CA，USA)进行环钻术，在纹状体内注射入5-10μl含有5个活检球状体的PBS。每日对大鼠进行监控直至它们出现被动性、笨拙和局部麻痹等颅内压升高的症状。用带有脑分析用finger-coil的1.5Tesla Siemens MagnetomVision instrument(Erlangen，德国)，通过磁共振扫描定量肿瘤质量。从移植约1百万细胞到出现压力症状(处死动物的时间)的时间约为两个月。
加强对流传送HAMLET至完整的脑
通过与渗透性微泵(ADO1，Alzet Inc.Mountainview，CA，USA)连接的26-Gauge套管给予HAMLET或α-乳清蛋白(0.7mM溶于0.15M NaCl)。24小时内以8μl/小时注入肿瘤区域，然后去除套管。如上述方法给予125I放射标记的HAMLET(0.7mM溶于0.15M NaCl，2-10×106PPM)。通过来自整个注入半球的连续脑切片的放射自显影(autoradiography)来证实HAMLET的分布。
组织分析
把脑迅速嵌入Tissue-Tec(Sakura Finetek Inc.，Torrance，CA，USA)，在液氮中冷冻。用Reichert Jung恒冷切片机(Reichert，Vienna，奥地利)切制10μm连续轴向切片。用TUNEL分析盒(罗氏，巴塞尔，瑞士)检测凋亡细胞，用封固剂(Vectashield，Vector Labs Inc.，伯林盖姆，CA，美国)盖上盖玻片。用碘化丙啶复染(10μg/ml，30秒)细胞核，在Leica扫描器中进行检查。平行切片用苏木精-曙红染色，在Entellan(Merck，达姆施塔特，德国)中封片。切片没有冰冻假象，测得对异硫氰酸荧光素(FITC)(TUNEL)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)(碘化丙啶)具有可接受的信噪比，对来自每一个肿瘤或球状体中心的一个典型切片进行形态计量分析。FITC和TRTIC阳性核分布图清晰可见以上背景，从打印的图象上进行计数。
以TUNEL阳性占碘化丙啶阳性核的百分数表示结果。
用HAMLET进行体外处理
将建立的球状体(每组4-5个)移至无血清的培养基中，用HAMLET或α-乳清蛋白培育三小时，立即移植入裸大鼠的脑中。为了分析凋亡，将球状体移回DMEM，另培育21小时，连续切片后用TUNEL分析盒带进行形态计量法检查。按照文献(前述Hakansson等)培养细胞系、分离、收获、洗涤、与HAMLET或α-乳清蛋白接触24小时。凋亡确定为台盼蓝排斥法估计的细胞生存力丧失(％死细胞每100个计数细胞)，用电泳检测DNA断裂(Zhivotovsky等，FEBS Lett.351：150-154)。
毒性试验
在注入三周后对接受HAMLET(0.7mM)、α-乳清蛋白(0.7mM)或NaCl(0.15M)的大鼠进行分析。用带有脑分析用finger-coil的1.5Tesla Siemens Magnetom Vision instrument(Erlangen，德国)，通过磁共振扫描定量肿瘤质量。如上所述用苏木精-曙红确定组织病理学。确定肝、肾功能生化标记和CRP的数量。注入前和注入后三周记录体重。用旷场试验评估脑功能。大鼠放置在四周为黑墙(20cm)的旷场箱(100×100cm)中。用白色条纹将地板分成25个等同区域(20×20cm)。将动物放置在中心区，对其运动进行六分钟手工判分。每次运动计数表示用两个后肢穿越区界，其方向记为右或左。试验在10am-2pm，隔音室中以盲试方式进行，
统计分析
用T试验比较各组，单因子方差分析(post hoc LSD)，用卡普兰-迈耶分析(Kaplan-Meier analysis)估计存活率。
结果
GBM异种移植模型
为研究体内治疗GBM，建立了两种试验模型。神经胶质细胞系在体外有效生长，移植后总是产生脑内肿瘤；但这些肿瘤在体内没有侵袭性，因此不太适合作为人体疾病的模型。相反，人GBM活检球状体在异种移植入裸大鼠后保持其侵袭生长行为。体外球状体培养步骤是获得再生性肿瘤质量，同步出现临床表征所必需的。这样该模型提供了一种人GBM疾病的相应治疗模型，可以和治疗分子的CED结合应用于肿瘤区域。
HAMLET抑制人神经胶质瘤异种移植物的生长
将人GBM活检球状体异种移植入裸大鼠脑中，建立试验GBMs(Engebraaten等，J.Neurosurg，90：125-132)。异种移植物表现出人GBM的渗透性生长特征(图2c)，约两个月后对照大鼠出现症状(图2f)。
利用CED将HAMLET(0.7mM)传送入脑的异种移植区域。以天然的折叠的α-乳清蛋白作为对照。治疗前，肿瘤细胞用一周时间与宿主脑形成一整体。
然后通过CED给予HAMLET或α-乳清蛋白24小时。在麻醉期间每组有两只动物死亡，12小时后每组杀死四只动物。立即冷冻它们的脑用于组织学研究、TUNEL分析和形态度量分析。
每日监控剩余的动物两个月，七周后当α-乳清蛋白处理的对照动物出现症状时用MRI评估肿瘤体积。在所有α-乳清蛋白处理的动物中观察到具有高T2加权信号的大的GBM移植物，肿瘤的平均体积为456(范围292-485)mm3(图2c和e)。注入HAMLET的大鼠显示明显较小的肿瘤体积(图2d和e，平均63，范围10-131mm3，p＜0.01)。HAMLET治疗也延迟了压力症状的发生。接受α-乳清蛋白的大鼠在第59天出现症状，到第65天杀死所有的动物。此时，HAMLET处理组的所有动物保持无症状(图2f，p＜0.01)。HAMLET处理的大鼠逐渐出现压力症状，死于典型的GBM肿瘤，组织学检查表现为多态细胞类型和假栅栏状。
人GBM异种移植物中肿瘤细胞的选择性凋亡
用TUNEL分析盒检查体内引起的凋亡(标记DNA链断裂)。CED完毕后12小时得到对组织的形态计量分析，表明33±7％的HAMLET处理的GBM细胞为TUNEL阳性，与之相比，α-乳清蛋白组为2±2％(图3a，p＜0.001)。由常规组织病理学证实了凋亡效果，组织病理学显示在HAMLET处理的动物中有典型的固缩核和凝聚核(图3a)。肿瘤周围的宿主脑在HAMLET或α-乳清蛋白CED至移植半球后没有显示凋亡或坏死的证据(图3a)。
HAMLET引起体外GBM活检球状体的凋亡样死亡
在体外证实了HAMLET具有诱导GBM细胞凋亡的能力。来自相同人GBM的活检球状体在体外与HAMLET接触，通过TUNEL分析，用碘化丙啶复染显现总细胞群来识别凋亡细胞。HAMLET处理的GBM球状体显示，在遍及整个球状体中有大量的TUNEL染色(图3b)。形态计量学上，发现93±7％(平均值±SD)的细胞核凋亡。在遍及整个球状体中观察到浓度为0.35mM或更高的TUNEL阳性细胞，证明治疗研究中所选择的浓度是适当的。组织病理学上，在接触HAMLET的GBM中观察到固缩核和凝聚核(见图3b中的箭头)。
用α-乳清蛋白处理的对照GBM中看到有一些凋亡细胞从表面脱落，但在球状体内部没有看到TUNEL阳性细胞，接触α-乳清蛋白和对照培养基的GBM球状体之间没有细胞凋亡率差异。两者均显著区别于HAMLET处理的球状体(p＜0.001)。在良性脑膜瘤病人的活检球状体中，HAMLET没有引起凋亡。(图3c)
体外预处理GBM球状体证实治疗效果
GBM活检球状体体外接触HAMLET三小时，然后如上所述，异种移植入裸大鼠的脑中。用α-乳清蛋白处理的球状体作为对照。两个月后用MRI扫描估计肿瘤大小。所有接受α-乳清蛋白处理的球状体的大鼠都出现了肿瘤(图4a)。肿瘤的平均大小为496(范围286-696)mm3，第56天起大鼠出现症状(图4c和d)。这时，HAMLET处理的球状体可检测到肿瘤，这些肿瘤比α-乳清蛋白对照的小，其平均体积为31(范围28-34)mm3(图4b和c)。具有较小肿瘤的大鼠在84天后出现症状。剩余的动物在移植后第210天被处死时没有出现肿瘤和症状。(图4d，p＜0.01)
HAMLET遍布滴入半球
调查了CED给予HAMLET的效率。通过CED用针头插入纹状体滴入125I放射标记的HAMLET(2-10×106PPM)，用对连续脑切片放射自显影检测HAMLET在整个脑中的分布(图5)。发现完成CED12小时后HAMLET达到从额叶到中脑的整个滴入半球。
对健康脑组织无毒性的HAMLET治疗浓度
在CED入健康大鼠的纹状体三周后，用MRI和组织病理学检查HAMLET对脑的潜在毒性。与以前的实验类似，以α-乳清蛋白或生理盐水作为对照。在MRI下，看到在注入点有小的胞囊损伤，但在包括被滴入套管穿透的皮层在内的周围脑部没有水肿或组织损害的迹象。(见图6a中的T2加权扫描)。HAMLET组和对照组之间没有放射学差异。
滴入脑的组织病理学分析表明一些邻近滴入点的组织遭到破坏，细胞结构增多，包括反应性小胶质细胞、巨噬细胞和一些反应性星形胶质细胞。在周围脑实质中没有出现明显的神经病理学毒性征兆，HAMLET处理组和对照组之间没有差异(图6b)。
滴入后三周监控生化标记和体重。在HAMLET、α-乳清蛋白和NaCl处理的大鼠之间没有观察到差异(在所有组中，p＞0.05)(图6c和d)。
滴入后三周用旷场试验评价运动和行为变化。将大鼠放置在一个旷场跳棋盘中，记录横越到新方格的次数。没有发现明显的运动失调(图6e)。
实施例3
膀胱内滴注HAMLET对膀胱癌病人的肿瘤血液供应的影响
接着上述实施例1报道的试验，在该处理结束时制取被处理肿瘤的活检样品，其结果在图7-10中表示。从这些图中清楚表明，内皮内衬正在丢失，血球存在于整个肿瘤核心，表明抑制了血管生成。

Claims (39)

1.一种选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物在制备用于治疗动物，尤其是人的增殖性疾病和/或抑制血管生成的药物中的用途。
2.一种选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物在制备用于治疗粘膜癌的药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其中粘膜癌为膀胱癌。
4.一种选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物在制备用于注入肿瘤内的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中肿瘤为内脏实体肿瘤。
6.根据权利要求5所述的用途，其中内脏选自脑、肝、肾、前列腺和卵巢。
7.根据权利要求6所述的用途，其中内脏为脑。
8.根据权利要求7所述的用途，其中脑肿瘤为人成胶质细胞瘤。
9.一种选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物在制备用于抑制血管生成的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述药物是用于减缓肿瘤细胞转移。
11.根据上述权利要求中任何一项所述的用途，其中生物活性复合物包括α-乳清蛋白或处于apo-折叠状态的α-乳清蛋白变体或它们各自的片段和使复合物稳定在生物活性形式的辅因子，条件是α-乳清蛋白或其变体的任何片段含有与形成α结构域和β结构域之间的界面的α-乳清蛋白区域相对应的区域。
12.根据权利要求11所述的用途，其中辅因子是顺式C18:1:9或C18:1:11脂肪酸或具有类似构型的其它脂肪酸。
13.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中生物活性复合物包括HAMLET，其中结合使用阴离子交换和凝胶层析从在pH4.6沉淀的乳的酪蛋白级分中通过分离得到HAMLET，或在来自人乳酪蛋白，以C18:1脂肪酸为特征的辅因子存在下，对α-乳清蛋白进行离子交换层析得到HAMLET。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中α-乳清蛋白生物活性复合物包括：
(i)顺式C18:1:9或C18:1:11脂肪酸或具有类似构型的其它脂肪酸；和
(ii)除去了钙离子的α-乳清蛋白或除去了钙离子或没有功能钙结合位点的α-乳清蛋白的变体；或它们各自的片段，条件是任何片段含有与形成α结构域和β结构域之间的界面的α-乳清蛋白区域相对应的区域。
15.根据权利要求14所述的用途，其中生物活性复合物包括α-乳清蛋白变体，该变体中钙结合位点被修饰，从而降低与钙的亲和力或钙结合位点不再起作用。
16.根据权利要求15所述的用途，其中变体在相当于牛α-乳清蛋白的K79、D82、D84、D87和D88的一个氨基酸发生突变。
17.根据权利要求16所述的用途，其中在D87发生修饰，包括含有D87A或D87N变体的α-乳清蛋白变体。
18.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中生物活性复合物包括α-乳清蛋白或其变体的片段，该片段含有天然蛋白质的第34-86位氨基酸之间的整个区域。
19.根据上述权利要求中任一项所述的用途，其中α-乳清蛋白是人α-乳清蛋白或牛α-乳清蛋白或它们各自的变体。
20.根据权利要求19所述的用途，其中α-乳清蛋白为人α-乳清蛋白。
21.根据权利要求19所述的用途，其中α-乳清蛋白为含有S70R突变的突变型牛α-乳清蛋白。
22.一种治疗人体增殖性疾病和/或抑制血管生成的方法，包括给予所述病人选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物。
23.一种治疗粘膜肿瘤的方法，包括给需要治疗的病人体内的所述肿瘤施用选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中粘膜肿瘤为膀胱癌。
25.根据权利要求24所述的方法，其中通过膀胱内滴注法给予生物活性复合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中以单剂量单位给予200mg-1g生物活性复合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中至少5天重复给予该剂量单位。
28.根据权利要求27所述的方法，其中按天连续给予该剂量。
29.一种治疗癌症的方法，包括向肿瘤内注入选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中复合物的给药形式为进一步含有生理盐水载体的组合物。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中利用对流增强传送(CED)注入复合物。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中肿瘤为脑肿瘤、肝肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤和卵巢肿瘤。
33.根据权利要求32所述的方法，其中肿瘤为脑肿瘤。
34.根据权利要求33所述的方法，其中肿瘤为人成胶质细胞瘤。
35.抑制血管生成的方法，包括给予需要治疗的病人选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物。
36.选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物在制备用于治疗恶性皮肤肿瘤，尤其是黑素瘤的药物中的用途。
37.一种治疗恶性黑素瘤的方法，该方法包括对黑素瘤施用选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物。
38.一种治疗癌症，尤其是治疗人体癌症的方法，包括对肿瘤体内施用选自HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的α-乳清蛋白生物活性复合物。
39.包括HAMLET或其生物活性修饰物或它们各自的生物活性片段的生物活性复合物在制备用于体内治疗人体癌症的药物中的用途。
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