CN118045060A - 一种由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒及其制备方法与应用，属于药物靶向载体技术领域。为解决乐伐替尼等药物对微创消融后HCC的治疗效果受到其在体内非特异性积累和分布限制的问题，本发明制备的负载LEN的MΦs是通过天然M1型MΦs吞噬大肠杆菌膜包被的负载LEN纳米颗粒构建的，其中大肠杆菌膜伪装增强了MΦs的吞噬效率，阻止了MΦs内部LEN的泄漏，并维持LEN@MΦs在免疫抑制肿瘤微环境内的M1型。利用消融诱导的自然炎症梯度引导装载LEN的巨噬细胞靶向肿瘤，使LEN在术后HCC体内递送效率提高10倍，该方法显著抑制肿瘤细胞增殖和新生血管生成，且这种增强的LEN递送刺激了全身免疫反应并诱导了持久的免疫记忆。

Description

一种由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物靶向载体技术领域，具体涉及一种由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒及其制备方法与应用。

背景技术

肝细胞癌（HCC）占肝癌病例总数的约90%，是临床肿瘤学中第四大最致命的癌症，尤其是多灶性HCC，具有侵袭性强、预后差的特点。局部治疗，包括微创消融，在治疗50%-60%的HCC病例中起着关键作用（Han S, Bao X, Zou Y, et al. d-lactate modulates M2tumor-associated macrophages and remodels immunosuppressive tumormicroenvironment for hepatocellular carcinoma. Science Advances 2023;9:eadg2697.）。然而，若多灶性HCC患者存在三个以上肿瘤结节，使用微创消融的方法治疗往往存在消融不充分的风险，患者5年内复发率高达52%（Zeng X, Liao G, Li S, et al.Eliminating METTL1-mediated accumulation of PMN-MDSCs prevents hepatocellularcarcinoma recurrence after radiofrequency ablation. Hepatology 2023;77:1122-1138.）。残留肿瘤细胞的持续存在将诱导免疫抑制，加速肿瘤进展，影响患者预后（HuangZ, Guo Z, Ni J, et al. Four types of tumor progression after microwaveablation of single hepatocellular carcinoma of ≤5 cm: incidence, riskfactors and clinical significance. International journal of Hyperthermia :The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, NorthAmerican Hyperthermia Group 2021;38:1164–1173.）。在临床实践中，晚期多灶性HCC患者在局部治疗后可接受常规全身治疗（Ogasawara S, Ooka Y, Koroki K, et al.Switching to systemic therapy after locoregional treatment failure:Definition and best timing. Clinical and Molecular Hepatology 2020;26:155–162.），例如使用乐伐替尼、索拉菲尼、瑞格菲尼等，特别是采用乐伐替尼（lenvatinib，LEN）。LEN是一种主要抑制肿瘤增殖和新生血管生成的多激酶抑制剂，已被应用于一线治疗。虽然LEN对部分晚期多灶性HCC患者有效（~24.1%），但LEN对微创消融后HCC的治疗效果受到其在体内非特异性积累和分布的限制（Yang C, Zhang H, Zhang L, et al.Evolving therapeutic landscape of advanced hepatocellular carcinoma. NatureReviews Gastroenterology&Hepatology 2023;20:203–222.）。因此，迫切需要更先进的治疗药物递送策略。

巨噬细胞（MΦs）凭借其装载药物和靶向肿瘤及炎症组织的能力，在精准医学中引起了人们的关注。基于单核细胞充当MΦ搭便车粒子的能力，最近开发了许多MΦ-based递送系统（Hou J, Yang X, Li S, et al. Accessing neuroinflammation sites:Monocyte/neutrophil-mediated drug delivery for cerebral ischemia. ScienceAdvances 2019;5:eaau8301.）。这种MΦ颗粒也显示出了沿梯度炎性因子的趋化运动性（Wang S, Li F, Ye T, et al. Macrophage-tumor chimeric exosomes accumulate inlymph node and tumor to activate the immune response and the tumormicroenvironment. Science Translational Medicine 2021;13:eabb6981.）。虽然在将天然免疫细胞用于生物医学方面已经取得了相当大的进展，但目前还没有报道将这种MΦ搭便车策略与微创消融结合起来用于靶向HCC（Targeting drugs to tumours using cellmembrane-coated nanoparticles. Nature Reviews Clinical Oncology 2023;20:33–48.）。

发明内容

为了解决乐伐替尼等适用于晚期多灶性HCC患者局部治疗后的全身治疗药物对微创消融后HCC的治疗效果受到其在体内非特异性积累和分布的限制的问题，本发明提供了一种由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒及基于该纳米载药颗粒的针对晚期多灶性HCC患者局部治疗后预后的更高效的药物递送策略。

为解决上述技术问题，本发明具体提供了如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒，所述纳米载药颗粒包括大肠杆菌囊泡和包裹在大肠杆菌囊泡内的药物小分子有效成分，纳米载药颗粒是将M1型巨噬细胞与包裹有药物小分子有效成分的大肠杆菌囊泡孵育获得；所述药物小分子有效成分为乐伐替尼、索拉菲尼、瑞格菲尼中的任意一种。

乐伐替尼、索拉菲尼和瑞格菲尼均是能够用于晚期多灶性HCC患者局部治疗后全身治疗的药物，且均为疏水性药物，根据药物性质及PLGA的性质，均可通过本发明所述的纳米载药颗粒的制备方法制备成由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒，并应用于治疗肝细胞癌及改善肝细胞癌消融后预后。

本发明的第二个目的是提供上述纳米载药颗粒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

S1、制备含药物小分子有效成分的纳米颗粒；

S2、将大肠杆菌囊泡与S1获得的纳米颗粒混合，通过孔径为200 nm的聚碳酸酯膜挤出至少21次，次数应为奇数次，经洗涤获得包裹有药物小分子有效成分的大肠杆菌囊泡；

S3、M1型巨噬细胞与S2获得的包裹有药物小分子有效成分的大肠杆菌囊泡于37℃孵育60 min，经洗涤获得由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒。

在本发明的一种实施方式中，S1中纳米颗粒的制备方法为将药物小分子有效成分和PLGA溶于DMSO中，混合后加入表面活性剂TPGS，混合形成油相；将油相滴加至去离子水中，室温下连续搅拌，经纯化及重悬获得含有纳米颗粒的溶液。

在本发明的一种实施方式中，药物小分子有效成分和PLGA的质量比为1:4，药物小分子有效成分在油相中的浓度为0.25 mg/mL，TPGS在油相中的浓度为2 mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，油相与水相的体积比为1:7。

在本发明的一种实施方式中，连续搅拌的时间为0.5-1 h。

在本发明的一种实施方式中，S2获得的包裹有药物小分子有效成分的大肠杆菌囊泡中药物小分子有效成分的含量为0.2~0.225 mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，S3的孵育体系中M1型巨噬细胞的浓度为2×10⁶cells/mL。

本发明的第三个目的是提供上述纳米载药颗粒在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供述纳米载药颗粒在制备用于改善肝细胞癌消融后预后的药物中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述药物具有抑制肿瘤细胞增殖和新生血管形成，或刺激全身免疫反应并诱导持久的免疫记忆的作用。

本发明的有益效果：

本发明制备了一种由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒，负载LEN的MΦs（LEN@MΦs）是通过天然M1型MΦs吞噬大肠杆菌膜包被的负载LEN的纳米颗粒构建的，其中大肠杆菌膜伪装增强了MΦs的吞噬效率，阻止了MΦs内部LEN的泄漏，并保证了LEN@MФs在免疫抑制肿瘤微环境内仍能维持巨噬细胞M1表型。

本发明基于巨噬细胞浸润肿瘤的趋化性，将LEN@MΦs用于微创消融后多灶性HCC的治疗，提供了一种名为微创消融诱导巨噬细胞搭便车（microinvasive ablation-navigated macrophage hitch，MAMH）的策略，用于HCC的靶向治疗。在本发明中，该策略利用消融诱导的自然炎症梯度引导装载LEN的巨噬细胞靶向肿瘤，使LEN在术后HCC体内的递送效率提高了约10倍。MAMH在多种HCC模型中显示出显著的抗肿瘤活性，包括水动力尾静脉注射多灶HCC小鼠模型和原位异种移植HCC兔模型，系统地抑制消融后残留肿瘤的进展，延长荷瘤小鼠的中位生存期。此外，本发明利用流式细胞术、ELISA、免疫组织化学和免疫印迹等技术探索其潜在的抗肿瘤机制，发现该策略显著抑制肿瘤细胞增殖和新生血管，并且这种增强的LEN递送刺激了全身免疫反应并诱导了持久的免疫记忆。

本发明将制备的LEN@MΦ用于微创消融后多灶性HCC的靶向治疗在不同物种间表现出卓越的治疗效果和生物相容性，在控制HCC消融后残余肿瘤进展和改善预后的临床转化方面具有广阔的前景。

此外，与乐伐替尼同为疏水性药物的索拉菲尼和瑞格菲尼由于也能用于晚期多灶性HCC患者局部治疗后的全身治疗，根据药物性质及PLGA的性质，均可通过本发明所述的纳米载药颗粒的制备方法制备成由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒，并应用于治疗肝细胞癌及改善肝细胞癌消融后预后。

附图说明

图1为LEN-NPs和LEN-EM@NPs的表征及其对细胞载体的影响结果图；其中，(A)为LEN-NPs的透射电镜图像和尺寸分布图，比例尺为200 nm，(B)为LEN-EM@NPs的透射电镜图，图中蓝色为LEN-NPs，黄色为大肠杆菌膜，左图比例尺为200 nm，右图比例尺为100 nm，(C)为LEN-NPs与大肠杆菌膜共聚焦激光扫描显微镜图像，比例尺为20 μm，(D)为在pH 5.0和7.4条件下LEN-EM@NPs和LEN-NPs中LEN的累积释放统计结果图，(E)为LEN-EM@NPs和LEN-NPs分别与MΦs共培养24 h后细胞表面CD80表达水平的流式细胞术分析结果图，(F)为MΦs和LEN@MΦs的Wright-Giemsa染色结果图，比例尺为10 μm；

图2为LEN@MΦs的表征结果图；其中，(A)为LEN@MΦs的透射电镜图，比例尺为3 μm，(B)为C6-LEN-NPs@MΦs和C6-LEN@MΦs的代表性的流式细胞直方图，(C)为RAW264.7细胞在MΦs、LEN-NPs@MΦs和LEN@MΦs中分别培养6 h内的细胞存活率统计结果图，(D)为利用MΦs、LEN-NPs@MΦs和LEN@MΦs分别处理RAW264.7细胞对细胞表面CD80表达水平的影响结果图，红色和蓝色分别代表不同处理前后CD80的表达水平，(E)为不同处理后注射到肿瘤中的细胞表面CD80表达水平相对于其注射前细胞表面CD80表达水平的倍数变化统计结果图，(F)为LEN@MΦs在循环期、趋化期和释放期三个阶段的LEN释放量分析结果图，(G)为Hepa1-6细胞分别与NPs，EM@NPs，LEN-EM@NPs，LEN@MΦs，PMA-MΦs，PMA-LEN@MΦs孵卵72 h后的细胞活力检测结果图，(H)为利用MΦs和LEN@MΦs分别处理Hepa1-6细胞后对Bcl-2，Bax和Cleaved caspase-3表达的影响结果图，(I)为利用MΦs和LEN@MΦs分别处理Hepa1-6细胞后采用Annexin V-FITC/PI染色法对Hepa1-6细胞凋亡水平进行相对定量分析的结果图，(J)为transwell实验研究了LEN@MΦs的趋化渗透行为的示意图，(K)为MΦs和LEN@MΦs分别进行transwell实验后下室MΦs的计数结果图；***P<0.001，****P<0.0001，ns表示无统计学意义；

图3为LEN@MΦs对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响结果图；其中，(A)为不同条件共培养72 h后下室Hepa1-6细胞Ki-67免疫荧光染色结果图，比例尺为10 μm，(B)为各组Hepa1-6细胞中Bcl-2、BAX、Cleaved Caspase-3蛋白相对表达量统计结果图；*P<0.05，**P<0.01；

图4为MAMH在体内分布的分析结果图；其中，(A)为hepa1-6荷瘤小鼠肿瘤组织中CCL-2、IL-1β、IL-6和TNF-α在14天内与正常组织相比的倍数变化统计结果图，(B)为MAMH在肝癌皮下移植瘤模型中的治疗方案示意图，(C)为IVIS图像显示LEN、LEN-EM@NPs、LEN@MΦs和MAMH不同处理组在肿瘤区域的生物分布图，肿瘤用蓝色点圈表示，(D)为不同处理后6 h和24 h重要器官的IVIS图像，(E)为不同处理后6 h和24 h重要器官的辐射效率统计结果图，1组为LEN处理，2组为LEN-EM@NPs处理，3组为LEN@MΦs处理，4组为MAMH处理，(F)为不同处理后6 h重要器官和肿瘤组织中的LEN浓度统计结果图；*P<0.05，****P<0.0001；

图5为MAMH在体内的治疗效果统计图；其中，(A)为IVIS图像监测不同治疗后残留肿瘤的进展图，(B)为经过不同方法处理过的小鼠的肿瘤生长曲线和数码照片，(C)为经过不同方法处理过的小鼠的肿瘤组织中VEGFR2和VEGFA mRNA相对水平统计结果图，(D)为经过不同方法处理过的小鼠肿瘤组织微血管密度定量分析结果图，(E)为经过不同方法处理过的小鼠肿瘤组织中ki-67的表达水平统计结果图，(F)为不同处理CD11b⁺F4/80⁺细胞的M1/M2比值统计结果图，(G)为不同处理后小鼠肿瘤组织中CD8⁺细胞的CTL比例统计结果图，(H)为不同处理后小鼠肿瘤组织中CD45⁺细胞的NK比例统计结果图，(I)为不同处理后小鼠肿瘤组织中CD4⁺细胞的Treg比例统计结果图，(J)为不同处理对小鼠血液生化指标的影响结果图；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns表示无统计学意义；

图6为MAMH在小鼠肝癌皮下移植瘤模型中的治疗机制和生物安全性统计结果图；其中，(A)为不同组的肿瘤组织中VEGFR2、VEGFA和p-ERK蛋白的相对表达水平统计结果图，(B)为不同组的代表性免疫组织化学和TUNEL染色图像，比例尺为100 μm，(C)为不同组的肿瘤组织中TUNEL定量分析结果图，(D)为不同处理后小鼠主要器官的HE染色结果图，比例尺为100 μm；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；

图7为小鼠在挑战模型建立示意图及MAMH对免疫记忆效应的影响结果图；其中，(A)为用MAMH完全清除小鼠所含残留肿瘤的示意图及IVIS图像监测肿瘤的生长状态图，(B)为脾脏淋巴细胞的代表性流式细胞术散点图；

图8为MAMH在体内诱导的免疫应答评价结果图；其中，(A)为PBS（1组）、微创消融(MA)（2组）、LEN（3组）、LEN+MA（4组）、LEN-EM@NPs+MA（5组）、MAMH（6组）和10倍LEN（7组）治疗后监测小鼠肿瘤进展的代表性IVIS图像，(B)为PBS（1组）、微创消融(MA)（2组）、LEN（3组）、LEN+MA（4组）、LEN-EM@NPs+MA（5组）、MAMH（6组）和10倍LEN（7组）治疗后肝脏的数码照片，比例尺为2 cm，(C)为不同处理后肿瘤组织中CD3+CD8+IFNγ+CTL细胞和CD3+CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞的代表性流式细胞术散点图和频率统计结果图，(D)为不同处理后外周血中CD3+CD8+T细胞的代表性流式细胞术散点图和频率统计结果图，(E)为不同处理后脾脏中CD3+CD8+CD44+CD62L-Tem细胞的代表性流式细胞术散点图和频率统计结果图；*P<0.05，**P<0.01，ns表示无统计学意义；

图9为不同处理后小鼠的相对肝脏重量和体重统计结果图；其中，(A)为PBS（1组）、微创消融(MA)（2组）、LEN（3组）、LEN+MA（4组）、LEN-EM@NPs+MA（5组）、MAMH（6组）、10倍LEN（7组）原位荷瘤小鼠的肝重与体质量比值统计结果图，(B)为PBS（1组）、微创消融(MA)（2组）、LEN（3组）、LEN+MA（4组）、LEN-EM@NPs+MA（5组）、MAMH（6组）、10倍LEN（7组）原位荷瘤小鼠体质量统计结果图；*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，ns表示无统计学意义；

图10为流式细胞术检测各种治疗方式引发的免疫反应的评估结果图；其中，(A)为肿瘤组织中M1和M2型MΦs代表性的流式细胞术散点图及M1与M2型MΦs比值的统计结果图，(B)为CD3⁻NK1.1在外周血中代表性流式细胞术散点图及外周血中CD45⁺细胞的NK比例统计结果图，(C)为CD3⁻NK1.1在脾脏中代表性流式细胞术散点图及脾脏中CD45⁺细胞的NK比例统计结果图，(D)为CD3⁻NK1.1在肿瘤组织中代表性流式细胞术散点图及肿瘤组织中CD45⁺细胞的NK比例统计结果图；*P<0.05，**P<0.01，ns表示无统计学意义；

图11为MAMH对小鼠多灶性肝癌的全身性肿瘤抑制作用统计结果图；其中，(A)包括尾静脉水动力注射(HDTVi)构建的多灶性肝癌示意图，HDTVi HCC肿瘤（P53敲除和MYC过表达）的图片（比例尺为0.5 cm）、HE切片图（比例尺为50 μm）和免疫印迹检测结果图，(B)为不同处理后肝脏的照片（比例尺为2 cm）和HE切片图（比例尺为500 μm），(C)为不同方法处理后小鼠的肿瘤结节数量统计结果图，(D)为不同方法处理后小鼠的生存曲线图，(E)为不同方法处理过的小鼠脾脏中Tem在CD8⁺细胞中的比例及Tem在CD4⁺细胞中的比例统计结果图，(F)为不同方法处理过的小鼠外周血中CD8⁺在CD3⁺细胞中的比例、NK在CD45⁺细胞中的比例、肿瘤坏死因子-α含量和干扰素-γ含量统计结果图，(G)为不同方法处理过的小鼠肿瘤中M1和M2型巨噬细胞的比例、NK在CD45⁺细胞中的比例、CTL在CD8⁺细胞中的比例、Treg在CD4⁺细胞中的比例统计结果图，AT为消融肿瘤，NAT为未消融肿瘤；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns表示无统计学意义；

图12为MAMH在多灶性肝癌小鼠模型中的生物安全性评价结果图；其中，(A)为不同处理后的多灶性肝癌小鼠体重统计结果图，(B)为不同处理后小鼠的血液生化指标统计结果图；

图13为流式细胞术检测外周血和脾脏组织中免疫细胞的比例结果图；其中，(A)为不同组别脾脏淋巴细胞的代表性流式细胞术散点图，(B)为外周血中CD3+CD8+T细胞的代表性流式细胞术散点图，(C)为外周血中CD3−NK1.1+NK细胞的代表性流式细胞术散点图，(D)为脾脏组织中CD3+CD8+T细胞和CD3-NK1.1+NK细胞代表性的流式细胞术散点图及对应的比例统计结果图；*P<0.05，**P<0.01；

图14为流式细胞术检测肿瘤微环境中免疫细胞的比例；其中，(A)为肿瘤组织中M1和M2 MΦs代表性的流式细胞术散点图，(B)为肿瘤组织中CD3+CD8+IFNγ+CTL细胞的代表性流式细胞术散点图，(C)为肿瘤组织中CD3+CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞的代表性流式细胞术散点图，(D)为肿瘤组织中CD3−NK1.1+NK的代表性流式细胞术散点图；

图15为MAMH在兔原位肝癌异种移植模型中的临床转化评价结果图；其中，(A)为应用MAMH的实验装置图，实验操作图及放大图像显示肝肿瘤组织消融过程的实时超声成像图，(B)为兔经不同处理后的肝脏照片，比例尺为2 cm，(C)为不同处理后的小鼠肿瘤体积和重量统计结果图，(D)为不同处理后的血液生化指标统计结果图，(E)为不同处理后的兔主要器官的HE染色结果图；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；

图16为以原位肝细胞癌模型小鼠的肿瘤、脾脏和血液样本为例，对各种免疫细胞群的代表性门控策略图；其中，(A)为肿瘤中各种免疫细胞群的代表性门控策略图，(B)为脾脏中各种免疫细胞群的代表性门控策略图，(C)为血液中各种免疫细胞群的代表性门控策略图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式及说明书附图对本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、药品和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、药品和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

本发明涉及的材料、试剂、药品及仪器如下：

抗体：Cleaved caspase-3(Asp175)抗体（产品编号：9661）、p53(7F5)兔单克隆抗体（产品编号：2527）购自Cell Signaling Technology；抗CD34抗体（产品编号：ab81289）、抗VEGFA抗体（产品编号：ab214424）、抗Bcl-2抗体（产品编号：ab182858）、抗p-ERK抗体（产品编号：ab201015）、抗c-Myc抗体（产品编号：ab185656）和抗Ki-67抗体（产品编号：ab16667）购自Abcam；抗CD45 FITC（产品编号：103108）、抗CD3ε PerCP/Cyanine5.5（产品编号：100328）、抗CD8a APC（产品编号：100712）、抗CD4 PE/Cyanine7（产品编号：100422）、抗F4/80 PE/Cyanine7（产品编号：123114）、抗CD11b PerCP/Cyanine5.5（产品编号：101228）、抗CD80 PE（产品编号：104708）、抗CD86 PE（产品编号：105008）、抗NK 1.1 PE（产品编号：108708）、抗CD25 PE（产品编号：108708）、抗FoxP3 PE（产品编号：126404）、抗IFN-γ PE（产品编号：505808）、抗CD4 Cyanine7（产品编号：100411）、抗CD44 PE/Cyanine7（产品编号：103030）、抗CD62L PE（产品编号：104408）和抗CD8a APC/Cyanine7（产品编号：100714）购自Biolegend；抗β-微管蛋白抗体（产品编号：abs830032）和抗GAPDH抗体（产品编号：abs830030）购自Absin。

试剂：聚乳酸-羟基乙酸（PLGA，产品编号：P133297）、D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS，产品编号：T110277）和香豆素6（C6，产品编号：C100929）购自阿拉丁化学有限公司有限公司；Lenvatinib（LEN，产品编号：S1164）和CFSE（产品编号：S8269）购自Selleck；胎牛血清（产品编号：10091148）、RPMI 1640（产品编号：11875093）和DMEM高糖培养基（产品编号：11995065）购自Gibco Invitrogen Corp；胶原酶IV（产品编号：C8160）、透明质酸酶（产品编号：H8030）和脱氧核糖核酸酶I（产品编号：D8072）购自Solarbio；甲酸（产品编号：F0507）、乙腈(产品编号：100029)、肉豆肉酸酯（PMA，产品编号：524400）和N-甲酰基-甲硫基-乙酰氨基-苯丙氨酸（fMLP，产品编号：F3506）购自Sigma-Aldrich。

[2H5]-乐伐替尼（产品编号：IR-18688）购自IsoReag。

质粒pT3-EFIa-MYC-IRES-luciferase，CMV睡美人13和px330-sig-p53公开于下述文章：Liu Y, Sun L, Guo H, et al. Targeting SLP2-mediated lipid metabolismreprograming restricts proliferation and metastasis of hepatocellularcarcinoma and promotes sensitivity to Lenvatinib.Oncogene. 2023;42(5):374-388. doi:10.1038/s41388-022-02551-z。

试剂盒：PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（产品编号：RR047A）均购自Takara；细胞计数试剂盒-8（CCK-8，产品编号：10K1018）购自Apexbio；TNF-α（产品编号：PMTA00B）和IFN-γ（产品编号：MIF00）ELISA试剂盒购自R&D Systems®；IL-1β（产品编号：SEA563Mu）、IL-6（产品编号：SEA079Mu）和MCP1（CCL-2，产品编号：MEA087Mu）ELISA试剂盒购自Cloud-Clone Corporation；一步TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（产品编号：C1086）购自Beyotime生物技术公司。

Avanti微型挤出机（货号：610000）、过滤器支架（货号：610014）和PC膜（货号：610005、610006、610007、610009、610010）均购自Avanti；12 mm Transwell® 0.4 µm（目录号：3401）和12 mm Transwell® 3 µm（货号：3402）购自Corning。

细胞系和动物：RAW 264.7细胞购自Procell生命科技有限公司；小鼠肝癌细胞系（Hepa1-6和Hepa1-6-luc）由肝胆外科刘连新教授（中国科大第一附属医院）慷慨提供，可在含10%胎牛血清（Gibco，MA，美国）和1%青霉素链霉素溶液（Beyotime，中国）的DMEM培养基（Gibco，MA，美国）中，于37°C，5%二氧化碳的环境中培养。兔肿瘤细胞VX2购自广州Jennio生物科技有限公司；6~8周龄C57BL/6小鼠和体重为2.5~3 kg的日本大白兔购自昌盛生物科技有限公司；肺泡巨噬细胞制备自日本大白兔。

本发明的所有动物实验均经哈尔滨医科大学实验动物委员会（HMUIRB2023034）和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（230620-01-GR）批准，并遵守实验动物管理条例。

本发明涉及的实验方法具体如下：

LEN@MΦs的细胞活力检测方法：

MΦs、LEN@MΦs、LEN-NPs@MΦ三组，每组以每孔5000个细胞的密度接种于96孔板中，（独立实验重复三次），曝光时间设置为0.5 h、1 h、2 h、4 h和6 h；随后，将细胞用含10%CCK-8的无血清培养基在黑暗中处理2 h；然后摇匀多孔板，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。通过计算从微孔板读卡器获得的光密度值来确定细胞的相对活力，GraphPad Prism用于计算细胞的相对活力。

体外细胞毒性检测方法：

采用CCK-8法定量评价不同实验组的体外细胞毒性，将Hepa1-6细胞（1×10⁴个细胞/孔）接种于96孔板，培养24 h；实验分为以下7组：对照组、空载-NPs组、空载-EM@NPs组、LEN-EM@NPs组、LEN@MΦs组、经PMA处理MΦs组和经PMA处理组LEN@MΦs组（100 nM，4 h）。其中，LEN@MΦs组、经PMA处理MΦs组和经PMA处理组LEN@MΦs分别在2000 rpm下离心5 min，将各自的纳米颗粒和上清液与Hepa1-6细胞共孵育72 h；细胞在含10% CCK-8的无血清培养基中黑暗孵育2小时，摇匀多孔板，用酶标仪测定450 nm处吸光度，随后的计算如前所述进行。

体外肿瘤细胞增殖抑制能力检测方法：

Hepa1-6细胞以10⁵个细胞/mL的密度接种于12孔板，24 h后，将0.4 µm大小的Transwell板加入PMA（作为对照，100 nM），随后将3×10⁵个细胞/mL PMA-MΦs和PMA-LEN@MΦs分别投于上部Transwell室共培养。取下Transwell板，清洗下腔Hepa1-6细胞，用4%聚甲醛固定30分钟。之后，按照制造商的说明对细胞进行Ki-67免疫荧光染色。为了评估LEN@MΦs对肿瘤细胞凋亡的影响，在不同组共培养后，将Hepa1-6细胞清洗收集，进行免疫印迹和流式细胞术检测。

体外和体内肿瘤靶向能力检测方法：

利用体外Transwell迁移实验（3 µm孔径，康宁）研究LEN@MΦs的趋化性。将10⁵个细胞/mL的浓度分别投于MΦs和LEN@MΦs（以50 μg/mL EM@NPs预处理1 h）上Transwell室共培养。下室填充新鲜DMEM培养基、Hepa1-6细胞培养48 h后从DMEM培养基中收集的Hepa1-6条件培养基或Hepa1-6条件培养基与fMLP的混合物。37℃孵育6 h后，在荧光显微镜下检测下腔Transwell中迁移的细胞（BX53，Olympus Corporation, Tokyo, Japan）。

LEN@MΦs的体内生物分布检测方法：

将MΦs与Cy5.5-LEN-EM@NPs在37℃下孵育1 h，得到MΦs携带Cy5.5-LEN-EM@NPs。考虑到C57BL/6小鼠黑毛可能影响荧光信号，将肿瘤组织区域剃除。当肿瘤生长到约200mm³时，小鼠静脉注射游离Cy5.5-LEN、Cy5.5-LEN-EM@NPs、Cy5.5-LEN@MΦs和MAMH（上述所有处理中Cy5.5-LEN的剂量均为1 mg kg⁻¹）。小鼠于注射后1、6、24 h麻醉，用IVIS光谱观察。为了进一步进行离体评价，在6 h或24 h时处死小鼠，获得肿瘤或器官。

炎性细胞因子的测定：

采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定荷瘤小鼠肿瘤组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL-2。取适量组织，用预冷PBS（pH=7.0-7.2）洗涤，去除血液。然后将称重后的组织切成小块，放入装有冰的新鲜裂解缓冲液的离心管中（质量体积比=1:50，例如，将50 mg组织样品放入1 mL裂解缓冲液中）。用超声波细胞破碎机处理组织悬浮液，直至澄清。将制备好的匀浆10000×g离心5 min，丢弃沉淀。上清液按照试剂盒专用程序进行检测或保存在-20°C。同时检测血清中TNF-α和IFN-γ的含量，以评估LEN@MΦs的抗肿瘤作用。收集不同组小鼠的血液样本，在室温下自然凝固。随后，在10000 rpm下离心20 min，获得血清。

TQ-S法测定组织样品中LEN的含量：

采用Xevo TQ-S系统进行色谱分离和分析。流动相为含有0.1%甲酸（A）和乙腈（B）的水。梯度洗脱，流速为0.4 mL/min，梯度程序为：0-0.5 min，5% B；0.5-4 min，5%-95% B；4-6 min，5% B，进样量为1 µL，进样温度为40℃。采用质谱仪进行正离子多重反应监测模式。LEN和IS的母离子和子离子的作用靶点分别为：m/z 427.1→370,m/z 432.1→370。两者的锥电压和毛细电压分别设定为30 V和2.0 kV。质谱法的其他实验条件如下：脱溶温度，350℃；脱溶气流量，650 L/h；锥气流量，150l /h；雾化器气体流量，7.0 Bar；碰撞气体流量0.25 mL/min。

C57BL/6小鼠右腋窝接种Hepa1-6细胞（1×10⁶细胞/100 μL PBS）。肿瘤体积达到约200 mm³时开始治疗，小鼠随机分组处理。具体分组为：游离LEN、LEN-EM@NPs、LEN@MΦs和MAMH（上述所有处理中LEN的剂量均为1 mg/kg）。治疗6 h后，处死小鼠，轻轻去除肝脏、肾脏和肿瘤组织。每种组织约100毫克准确称重到2 mL研磨管中，其中加入0.5 mL乙腈。使用自动组织匀浆器（70 Hz）将样品匀浆2分钟，然后以13000 rpm离心15分钟（4℃）。最后，将获得的上清液100 µL转移到自动进样器小瓶中进行分析。

动物治疗：

皮下Hepa1-6-luc荷瘤小鼠在微创消融（MA）后随机分为四组（每组n=5）：PBS、LEN、LEN-EM@NPs和MAMH。小鼠每3天静脉注射单剂量LEN（1 mg/kg），共注射3次。小鼠模型的消融功率和持续时间分别控制在5~10 W和1~1.5 min。将原位Hepa1-6-luc荷瘤小鼠随机分为7组（每组n=5）：PBS、MA、LEN、MA+LEN、MA+LEN-EM@NPs、MAMH和10倍LEN（10 mg/kg）。多灶性HCC小鼠随机分为四组（每组n=5）：PBS、MA、LEN和MAMH。为了更好地模拟潜在临床翻译的实际应用，构建了原位荷瘤兔，并随机分为四组（每组n=3）：PBS，MA，LEN+MA和MAMH（LEN，0.3 mg/kg）。MA在超声引导下进行，功率为30 W，持续时间为30-40 s。

动物模型构建：

皮下肝癌小鼠模型：

C57BL/6小鼠右腋窝区接种hepa1-6-癌细胞（1×10⁶细胞/100 μL PBS）。当肿瘤体积达到约200 mm³时开始治疗。随后，将小鼠随机分组，进行进一步处理。

原位HCC小鼠模型：

小鼠麻醉后，腹腔区域用70%酒精冲洗和聚维酮碘擦洗交替清洗。随后，在腹部中线切开，分离镰状韧带和肝胃韧带，露出肝脏。然后将25 μL基质与1×10⁶Hepa1-6-luc细胞的混合物注射到肝下腹膜，小心翼翼地防止对其他器官的损害。分别使用Vicryl 5/0缝合线完成腹壁和皮肤切口的闭合。大约5天后，根据生物发光值将小鼠随机分配到不同的治疗组。每周使用生物发光IVIS成像系统评估肿瘤体积，并在给药完成后进行安乐死。

多灶性HCC小鼠模型：

采用HDTVi小鼠HCC模型建立多灶性HCC模型。将经生理盐水稀释的质粒混合物静脉注射(i.v.)给药C57BL/6小鼠，总注射量相当于体重的10%，6-8 s通过尾侧静脉给药。质粒混合物由30 µg px330-sg-p53(sgP53)、10 µg pt3-efia-myc-ires-荧光素酶(MYC-luc)和2µg CMV睡美人13(SB13)组成。

原位HCC兔模型：

兔通过肌内注射盐酸噻嗪（0.2 ml kg^-1体重）麻醉，然后间隔5分钟后通过耳静脉静脉注射3%戊巴比妥钠（0.7 ml kg^-1）。在麻醉开始时，对剑突下方区域进行剃除和消毒。麻醉完全起效后，对剑突下方区域进行刮刀消毒，在无菌条件下进行微创剖腹手术。将无中央坏死的VX2兔肿瘤组织解剖成小碎片（1或2mm³），植入肝叶，建立单个肿瘤。随后缝合腹壁。为防止感染，每天肌内注射20万单位青霉素，连续3天。

微创消融的应用

Hepa1-6-luc荷瘤小鼠麻醉后，经皮将冷尖MWA针尖置于肿瘤长轴中间。消融参数（包括功率和持续时间）分别维持在5-10 W和0.5-1 min。随后，通过摄影和生物发光信号监测残余肿瘤负荷。对于皮下HCC模型，使用数字卡尺进行精确测量，并使用公式（长径×短径²）/2计算体积(mm³)。对于HDTVi小鼠HCC模型，采用上述功率和时间设置，选择肝左叶直径最大的肿瘤进行消融。

免疫印迹

收获经过各种处理的细胞和肿瘤组织，并使用冰冷的RIPA裂解缓冲液从培养细胞中提取总蛋白。使用BCA试剂盒对总蛋白浓度进行定量。随后，通过7.5%-15% SDS-PAGE分离蛋白裂解物，并将其转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将转移的膜用5% BSA溶液阻断90分钟。适当的膜与针对Bcl-2、Bax、Cleaved caspase 3、VEGFR2、VEGFA、p-ERK、C-myc、p53、β-微管蛋白和β-GAPDH的特异性抗体在4°C下孵育过夜。第二天，用TBST溶液洗涤后，将膜与相应的二抗在25°C下孵育1小时。最后，使用ImageJ软件进行可视化和定量分析。

组织学检查：

在指定时间点，对各处理组小鼠实施安乐死，解剖各主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）及肿瘤，在4%多聚甲醛中固定过夜。随后，对固定组织进行包埋和切片处理。部分切片采用H&E染色评估组织损伤，其余切片采用TUNEL和IHC分析。对于IHC程序，载玻片用二甲苯脱蜡，用分级醇再水合，用柠檬酸进行抗原提取和阻断。然后将切片与不同的一抗（Ki-67和CD34）在4℃下孵育过夜。随后，将载玻片与相应的二抗在25℃孵育，PBS洗涤后用二氨基联苯胺启动显色反应。最后，用苏木精反染，可视化，使用Motic EasyScan扫描系统收集。凋亡细胞鉴定使用一步TUNEL细胞凋亡测定试剂盒按照制造商的说明。细胞核用DAPI染色，荧光显微镜。

三名独立病理学家评估了所有病例，事先不知道实验数据或分组。Ki-67染色根据强度和范围进行评估。染色强度分为阴性、弱、中、强（0、1、2、3）。染色范围根据阳性细胞百分比评分：无、<25%、25-50%、50%-75%和>75%（0、1、2、3、4）。最终IHC染色评分计算为强度评分和范围评分的乘积。CD34染色后，在低倍镜下对切片进行全面观察，识别血管密度高的区域，并在高倍镜下计数微血管的数量进行评分。记录三个视场内微血管的数量，每个单个内皮细胞或内皮细胞组呈现棕色，视为一根血管；管腔直径超过8个红细胞的血管排除计数。

RT-PCR：

用Trizol试剂提取肿瘤组织总RNA。使用带有gDNA Eraser的PrimeScript™RTreagent Kit进行逆转录反应。实时PCR检测采用SYBR Green PCR试剂盒。采用比较周期阈值(Ct)法，以β-actin表达为参照，测定靶基因的表达情况。所用引物列于表1。

表1 引物信息

流式细胞术：

从小鼠身上提取的肿瘤切片成小片段。肿瘤切片在含有消化酶（胶原酶IV、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶I）的染色缓冲液中均质，生成单细胞悬液。随后，按照制造商的说明用荧光标记抗体对细胞进行染色。细胞用True-Nuclear™转录因子缓冲液处理，然后进行细胞内因子染色。使用灭菌的手术设备无菌采集脾脏。将脾混合液经过滤器过滤入50 mL锥形管中，500×g离心5 min。洗涤后，用红细胞裂解液重悬细胞颗粒5 min。然后根据制造商的方案用荧光标记抗体对细胞进行染色。用流式细胞仪分析染色细胞，并用FlowJo软件进行评估。采集小鼠血液进行血管内T细胞和NK细胞分析，并裂解红细胞。随后，按照制造商的方案用荧光标记抗体对细胞进行染色。用流式细胞仪监测染色细胞，并用FlowJo软件进行分析。不同样品（包括血液、脾脏和肿瘤组织）中不同免疫细胞亚群的流式细胞术门控策略如图16所示。

本发明所有统计分析均使用GraphPad Prism软件包（Prism 9.1.0;GraphPad软件）。本研究的结果以mean±SEM的形式呈现，来源于至少三个独立的实验。样本量没有使用统计方法预先确定，但与以前出版物中报道的样本量相当。对于涉及多个比较的场景，采用单向或双向方差分析和Tukey多重比较检验。学生t检验用于单比较。P值小于等于0.05被认为具有统计学意义。统计学意义表示如下：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns表示无统计学意义。

实施例1：由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒的制备方法

由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒的制备：

（1）LEN-NPs的制备：将LEN和PLGA按1:4的质量比溶于DMSO中，混合后加入表面活性剂TPGS，混合形成油相，油相中LEN的浓度为0.25 mg/mL，PLGA的浓度为1 mg/mL，TPGS的浓度为2 mg/mL；将该油相滴加到一定量的去离子水中，在25℃下连续搅拌30 min，促使原子核自组装，在整个实验过程中，油相和水相的体积比保持恒定在1:7；纯化时，在25℃、12000 rpm条件下离心30 min以收集LEN-NPs，随后，将LEN-NPs重悬于无菌PBS中以用于后续实验。

（2）大肠杆菌膜囊泡的提取：将大肠杆菌在营养肉汤培养基中于37℃培养12 h，然后将大肠杆菌培养液以5000 rpm离心10 min以除去大肠杆菌，并收集所得含有细菌外膜囊泡的上清液；将该上清液进一步通过0.45 μm膜过滤并使用100 kDa超滤离心管浓缩；将含有细菌外膜囊泡的浓缩悬浮液在4℃、150 g条件下离心2 h以沉淀细菌外膜囊泡，将所得细菌外膜囊泡沉淀物分散在PBS中并储存在-80℃下；使用微型挤出机将得到的细菌膜囊泡通过孔径为200 nm的聚碳酸酯膜挤出11次，得到大肠杆菌膜囊泡（EM囊泡）。

（3）LEN-EM@NPs的制备：将获得的EM囊泡与LEN-NPs混合，并使用微型挤出机通过孔径为200 nm的聚碳酸酯膜挤出21次，得到LEN-EM@NPs；随后，将LEN-EM@NPs以10000 rpm离心，用PBS洗涤沉淀3次，然后在4℃保存。制备获得的LEN-EM@NPs中LEN的含量为0.2 mg/mL。

（4）LEN@MΦs的制备：LEN@MΦs是通过将M1型MΦs与LEN-EM@NPs一起孵育来构建的，具体构建方法为将RAW 264.7细胞以10⁵个细胞/mL的密度接种于细胞培养液中，24小时后，取出培养液，用M1培养基（含10 ng/mL LPS+10 ng/mL IFN-γ的DMEM培养基）替代，再培养24小时，得到M1型MΦs；将M1型MΦs与LEN-EM@NPs在无菌管中于37℃孵育60 min，孵育体系中MΦs的浓度为2×10⁶cells/mL，LEN-EM@NPs中LEN的含量为0.2 mg/mL，用PBS洗涤两次后获得LEN@MΦs。

由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒的表征：

使用透射电子显微镜评估LEN@MΦs的形态，使用流式细胞术研究MΦs对C6-LEN-NP和C6-LEN-EM@NP的细胞摄取。孵育后，去除多余的C6-LEN-NPs或C6-LEN-EM@NPs，收集负载C6-LEN-NPs或C6-LEN-EM@NP的MΦ并进行荧光分析，将所得荧光信号与作为对照组的原始MΦs进行比较，得到不同孵育条件下MΦs的相对荧光强度。

通过透射电子显微镜观察发现，LEN-NPs为平均尺寸93.5±4.0 nm的纳米颗粒（图1中的(A)），通过共挤压法将大肠杆菌膜泡包裹在LEN-NPs上，形成直径为200 nm的纳米颗粒（LEN-EM@NPs），透射电镜图像显示，制备的LEN-EM@NPs为平均直径102.9±5.0 nm的球形几何形状和核壳结构（图1中的(B)）。共聚焦激光扫描显微镜图像显示LEN-NPs和大肠杆菌外膜成功共定位（图1中的(C)）。高效液相色谱法显示，在pH为7.4和5.0时，LEN-NPs在48 h内LEN的释放量分别为28.16%和45.45%；相比之下，LEN-EM@NPs的LEN释放量明显下降，在pH7.4和pH 5.0下，48 h内的释放量分别为9.45%和16.61%（图1中的(D)）。这些数据表明，大肠杆菌膜的完全覆盖阻止了LEN的泄漏，这对微创消融诱导的巨噬细胞搭便车至关重要。

将LEN-EM@NPs与M1型MΦs孵育，构建LEN@MΦs。超微结构分析显示，LEN@MΦs细胞质内有约18个平均大小为500 nm的聚体，考虑到吞噬前后LEN-EM@NPs浓度的变化，每个MΦ中平均装载的LEN-EM@NPs数量约为91个（图2中的(A)）。LEN的高负荷是由于在LEN-EM@NPs上覆盖了大肠杆菌膜，将LEN-NPs伪装成天然大肠杆菌，从而增加了MΦs的吞噬能力。接下来，我们量化了MΦs的吞噬效率。通过流式细胞术，我们评估了LEN-NPs和LEN-EM@NPs预培养1 h后的MΦs的负载率。结果发现，98.36%的MΦs吞噬了LEN-EM@NPs，明显高于吞噬LEN-NPs的MΦs所占百分比（41.31%）（图2中的(B)）。RAW264.7细胞在含有M1型MΦs、LEN-NPs@MΦs（吞噬了LEN-NPs的MΦs）和LEN@MΦs的体系中分别培养6 h后的细胞存活率分别为85.3%、51.0%和77.7%（图2中的(C)）。此外，流式细胞术和Wright-Giemsa染色显示，在体外培养6小时后，LEN@MΦs具有良好的细胞极性和形状（图1中的(E)和(F)）。随后，通过将LEN@MΦs注入小鼠肿瘤来评估体内细胞极性。接种MΦs和LEN-NPs@MΦs后，CD80（一种M1标记物）的表达显著降低（MΦs为85.16%~13.72%，LEN-NPs@MΦs为80.10%~11.50%）（图2中的(D)）。相比之下，LEN@MΦs接种前后肿瘤中CD80的表达变化较小，从82.33%到77.36%，相当于94%的LEN@MΦs维持肿瘤M1型（图2中的(E)）。这一现象证明了大肠杆菌膜整合在引导细胞极化中实现的高效相互作用，从而在免疫抑制的肿瘤微环境中维持抗肿瘤表型。

我们进一步研究了LEN在LEN@MΦs不同阶段的释放动力学，包括血液循环阶段（循环阶段），沿消融术诱导的炎症因子梯度向肿瘤组织趋化阶段（趋化阶段），以及局部高炎症环境下LEN的释放（释放阶段），分别以N-甲酰基-甲硫基-乙酰氨基-苯丙氨酸（fMLP）和肉豆酸酯（PMA）作为模型炎症因子。LEN@MΦs的LEN在未处理组（循环期）6 h内释放小于1.1%，而在存在10 nM fMLP（趋化期）时，6 h内释放稍高，为14.3%。在存在100 nM PMA（释放期）时，LEN@MΦs的LEN在2 h内释放较低（1.0%），在4 h内大幅增加至58.2%，最终在6 h内达到63.0%（图2中的(F)）。上述数据表明，大肠杆菌膜覆盖提高了LEN-NPs的生物相容性，防止LEN在使用前的细胞内渗漏，并保持M1型极性，为体内MAMH提供了足够的生物功能。

实施例2：由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒在用于微创消融后HCC的治疗中的应用

（1）LEN@MΦs的体外抗肿瘤能力和趋化能力检测

首先通过测定不同处理下Hepa1-6细胞的活力来评估LEN@MΦs的体外治疗效果。与直接引起癌细胞凋亡的LEN-EM@NPs处理相比（27.3%细胞活力），LEN@MΦs处理对hepa1-6细胞的毒性较低（74.1%细胞活力），而PMA诱导后细胞活力降至39.5%（图2中的(G)），说明LEN@MΦs具有可控的释放能力。相应的，共培养后Ki-67的表达降低，表明LEN@MΦs对Hepa1-6细胞的增殖有明显的抑制作用（图3中的(A)）。

对Hepa1-6细胞凋亡机制的研究发现，LEN@MΦs处理可提高Hepa1-6细胞中促凋亡BAX和Cleaved caspase-3的表达，抑制抗凋亡Bcl-2的表达（图2中的(H)和图3中的(B)）。相比之下，MΦ处理对Hepa1-6细胞凋亡的诱导作用较小。进一步流式细胞术定量分析发现，LEN@MΦs组Hepa1-6细胞的凋亡率为59.9%，而MΦs组的凋亡率为20.4%（图2中的(I)），说明LEN@MΦs的治疗效果主要是由于LEN的释放而不是MΦs。

采用transwell实验研究了LEN@MΦs的趋化渗透行为。下腔分别填充DMEM培养基、hepa1-6条件培养基和条件培养基与fMLP的混合物，观察由上腔向下腔进行趋化渗透的细胞数量（图2中的(J)）。与天然的MΦs类似，LEN@MΦs沿fMLP梯度渗透，在6小时内到达Hepa1-6细胞片。定量分析表明，与不含fMLP的条件培养基相比，在fMLP的影响下，下腔中LEN@MΦs的数量增加了约2倍，表明LEN@MΦs具有炎症趋化运动（图2中的(K)）。

（2）LEN@MΦs在用于治疗微创消融后HCC（微创消融诱导的巨噬细胞搭便车，MAMH）中的应用

采用荧光素酶转染Hepa1-6细胞（Hepa1-6 Luc）构建C57BL/6小鼠皮下异种移植HCC模型，研究MAMH对体内HCC的影响。首先采用酶联免疫吸附法测定与MΦ浸润相关的肿瘤中的原发性炎症因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6和CCL-2 (MCP-1)。这些炎症因子在消融后迅速产生，与周围健康组织形成显著的炎症梯度，并超过正常水平超过12天（图4中的(A)）。重要的是，主要由肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞产生的CCL-2在随后的几天内表现出不同程度的减少，在消融后第5天逐渐增加，可能归因于消融不足导致残留肿瘤细胞的持续和生长。因此，设计了体内HCC的MAMH治疗方案，消融后每3天静脉给药LEN@MΦs 1次，共给药3次（图4中的(B)）。值得注意的是，微创消融的手术时间较短（0.5~1.0 min，而同行消融研究中荷瘤小鼠为3~5 min），旨在触发炎症反应的同时，对HCC有较小的直接杀伤作用进行平行比较，并在临床环境中模拟局部治疗后的残余肿瘤，作为微创消融治疗的一个例子，在体内研究MAMH在HCC治疗中的作用。鉴于LEN-EM@NPs中LEN含量为0.1 pg，每个MΦ中约91 LEN-EM@NPs，根据以前的报道，LEN@MΦs的血管内给药剂量设为10⁸个细胞/kg。随后，消融手术后，将所有含HCC小鼠分为LEN组、LEN-nps组、LEN-EM@NPs组和MAMH组。

为了可视化MAMH在体内的生物分布，所有组的LEN都用Cy5.5荧光探针标记。使用活体成像系统（IVIS）获得的荧光图像显示，24小时内MAMH组肿瘤区域的荧光强度高于LEN、LEN-NPs和LEN-EM@NPs组（图4中的(C)）。重要器官归一化荧光强度分析显示，与LEN组相比，MAMH组肿瘤组织在6 h后荧光强度提高了11.5倍，24 h后荧光强度提高了8.5倍（图4中的(D)和(E)）。随后，采用三联四质谱仪定量测定肝脏、肾脏和肿瘤组织中LEN的浓度，发现MAMH组肿瘤组织中LEN浓度为392.4 ng/g，而LEN组肿瘤组织中LEN浓度为39.9 ng/g（图4中的(F)）。LEN浓度升高约10倍，表明MAMH能有效提高对肿瘤的递送效率。

在表征MAMH对HCC的递送效率后，利用C57BL/6小鼠的hepa1-6 Luc建立HCC模型来评估MAMH抑制肿瘤进展的功效。消融手术后携带Hepa1-6 luc的小鼠作为对照组，在第8天（消融手术）至第21天肿瘤荧光信号增强（图5中的(A)）。与对照组相似，LEN组和LEN-EM@NPs组荧光信号增强。相比之下，MAMH组的荧光信号变化可以忽略不计。此外，MAMH组相应的切除肿瘤比其他组要小（图5中的(B)）。特别是，发现MAMH组小鼠的肿瘤消失。对照组在第21天肿瘤体积分别增加到1459 mm³。相比之下，MAMH组的肿瘤体积维持在265 mm³，表明MAMH治疗后肿瘤得到了实质性抑制（图5中的(B)）。

LEN治疗主要通过抑制血管生成和肿瘤细胞增殖以及调节免疫反应来发挥抗肿瘤作用。检测血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）和血管内皮生长因子A（VEGFA）蛋白表达等血管生成能力相关的mRNA和蛋白表达，揭示MAMH的治疗机制。与LEN和LEN-EM@NP组相比，MAMH组VEGFR2和VEGFA的相对mRNA水平和蛋白表达均降低（图5中的(C)和图6中的(A)）。这种减少与CD34标记的微血管密度下降一致，有效反映了MAMH的抗血管生成能力（图5中的(D)和图6中的(B)）。p-ERK蛋白表达水平降低，Ki-67⁺染色棕色区域减少，TUNEL染色绿色区域增加，共同证明了MAMH抑制残余肿瘤细胞增殖的有效性（图5中的(E)和图6中的(A)、(B)、(C)）。MAMH后10天和20天对主要器官（如心、肺、脾、肝和肾）进行组织学分析，发现组织病理异常可忽略。表明没有明显的毒性作用（图6中的(D)）。

（3）MAMH的紧急系统免疫反应和免疫记忆

为了进一步研究MAMH对体内免疫功能的影响，我们对肿瘤组织内的浸润免疫细胞进行了评估。除对照组、LEN组、LEN-EM@NPs组和MAMH组外，还采用M1型MΦs组作为MΦs组进行比较。考虑到MAMH的递送效率约为10倍，采用10倍剂量的LEN作为10倍LEN组进行比较，在CD11b⁺F4/80⁺细胞的M1/M2比率和肿瘤浸润性细胞毒性t淋巴细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK)和免疫抑制调节性t细胞(Treg)的频率方面均有显著反应。例如，对照组、LEN组、LEN-EM@NP组和MΦs组CD11b⁺F4/80⁺细胞的M1/M2比值分别为1.2、1.6、1.9和1.32（图5中的(F)）。相比之下，MAMH组CD11b⁺F4/80⁺细胞的M1/M2比值为3.3，与10倍LEN组相当（3.1）。M1/M2比值的差异表明，使用MAMH传递LEN导致肿瘤微环境中MΦs从M2型向M1型转变。CD8⁺细胞的CTL和CD45⁺细胞的NK细胞表现出类似的趋势。与10倍LEN组（CTL的9.9%和NK的0.8%）相似，MAMH组的CTL（10.8%）和NK（0.8%）的频率高于其他组（图5中的(G)和(H)）。与对照组相比，具有免疫反应抑制作用的cd4细胞Treg⁺在LEN组和LEN-EM@NPs组分别下降了22%和46%。相比之下，MAMH组和10倍LEN组与对照组相比分别下降了67%和66%（图5中的(I)）。值得注意的是，这些项目中的MΦs组与对照组相似，这表明MAMH中的MΦs在肿瘤的治疗中起次要作用。

上述数据表明，MAMH诱导了对肿瘤的显著免疫反应，其可与10倍的LEN相媲美。然而，10倍LEN引起显著的肝毒性和肾毒性，特别是天冬氨酸转移酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性升高（图5中的(J)）。相反，尽管取得了实质性的治疗效果，但使用MAMH递送LEN的毒性与正常剂量的LEN相似，可以忽略不计。综上所述，将实施例1制备的LEN@MΦs用于微创消融后HCC，不仅比自由LEN的给药效率和治疗效果高10倍，而且对人体的副作用也很小。

MAMH在皮下异种移植肝癌模型中具有卓越的抗肿瘤疗效，LEN@MΦs用于微创消融后HCC，治疗后的治愈HCC小鼠的存在进一步证明了这一点（见图5）。为了探索免疫记忆的潜在激发，建立了一个再挑战模型（图7中的(A)）。结果表明，用MAMH治疗的小鼠没有出现新的肿瘤生长。收集小鼠的脾脏，显示CD8⁺和CD4⁺T细胞群中有效记忆T细胞(Tem)的百分比显着增加。这一观察结果表明，MAMH治疗策略建立了强大的长期免疫记忆效应（图7中的(B)）。

为了进一步评估MAMH在体内诱导的免疫应答，我们建立了原位异种移植HCC模型。值得注意的是，MAMH有效地抑制了残留肿瘤的生长，其效果与LEN浓度为10倍的效果相当（图8中的(A)和(B)及图9中的(A)）。10倍LEN组小鼠在治疗4天后开始出现体重减轻，表明存在潜在的毒副作用（图9中的(B)）。随后对各种治疗引发的免疫反应的评估显示，在MAMH组中，肿瘤组织中CD11b⁺F4/80⁺细胞中的M1/M2比率显著增加，这表明该策略能够促进肿瘤微环境中MΦs M2向M1表型的转变（图10中的(A)）。同时，肿瘤组织中CTL浸润显著增加，Treg细胞明显减少，这与MAMH组观察到的强大的抗肿瘤作用一致（图8中的(C)）。此外，单独接受消融术或游离LEN治疗的小鼠外周血中CD8⁺T细胞略有增加，而MAMH治疗后CD8 T细胞显著增加（图8中的(D)）。此外，给予MAMH显著增加Tem，表明其能够减少肿瘤组织复发（图8中的(E)）。NK细胞在外周血、脾脏和肿瘤组织中的比例在MAMH组中始终最高（图10中的(B)，(C)，(D)）。综上所述，MAMH显著改善了原位异种移植HCC模型的抑制性肿瘤微环境，阻碍了残留肿瘤的进展，诱导了全身和长期的抗肿瘤免疫记忆，有效地预防了肿瘤复发。

（4）MAMH治疗的全身免疫反应和免疫记忆抑制多灶性HCC

本发明研究了使用MAMH传递LEN可能促进对多灶HCC的免疫激活，其特征是复杂的肿瘤内异质性和克隆进化过程。通过尾静脉注射(HDTVi)构建的原发性肝癌模型不仅在形态学上与大多数临床HCC的多灶特征一致，而且在组织学、转录组和性质相似的人类HCC中发现的遗传改变也非常相似。其中，TP53和MYC联合诱导的HCC模型是一种免疫上的“冷”肿瘤，仍然是治疗上的挑战（图11中的(A)）。本研究将四组多灶HCC承载小鼠静脉注射等量生理盐水（对照组）、生理盐水联合微创消融（MA组）、LEN（LEN组）和LEN@MΦs联合消融（MAMH组）。对照组肿瘤照片表现为多灶性HCC，结节分离。MA组多灶性HCC结节更大、更多，证实不完全射频消融术引起的炎症加速了肿瘤进展。与对照组相比，LEN组的多灶性HCC差异较小，反映了LEN对多灶性HCC的治疗效果有限。与其他组相比，MAMH组肿瘤结节最小，较少（图11中的(B)）。苏木精和伊红(H&E)染色评价联合治疗效果显示，与对照组相比，MAMH组小鼠肝脏组织中肿瘤结节数量最少。相比之下，消融组和LEN组显示大量肿瘤结节，其中一些融合，与视觉照片一致。对照组、MA组、LEN组和MAMH组的肿瘤结节数分别为12.0、19.0、10.1和3.6个（图11中的(C)）。通过记录多灶HCC承载小鼠的生存时间，评价MAMH对多灶性HCC的治疗效果。对照组、MA组、LEN组和MAMH组的中位生存时间分别为44、30、48和73天（图11中的(D)）。与游离LEN的有限治疗效果相比，MAMH治疗下的生存期增加了65.1%，与MAMH策略的全身免疫和免疫记忆一致。此外，在MAMH治疗后，小鼠体重或肝肾功能没有明显变化，表明其具有良好的安全性（图12）。

流式细胞术研究表明，MAMH组诱导了长期免疫记忆，脾脏CD4⁺和CD8⁺T细胞中Tem的频率增加（图11中的(E)和图13中的(A)）。此外，与其他组相比，MAMH组外周血和脾脏中CD8⁺T细胞和NK细胞在MAMH组中的百分比更高，并且T细胞和NK细胞发挥抗肿瘤作用的关键细胞因子TNF-α和IFN-γ在MAMH处理的小鼠血清中水平显着增加（图11中的(F)和图13中的(B)，(C)，(D)）。此外，与对照组相比，MAMH组小鼠肿瘤组织中CTL和NK细胞显著增加，Treg细胞显著减少。值得注意的是，未消融的肝叶中浸润肿瘤的免疫细胞比例与消融的肝叶肿瘤中几乎相同，这表明MAMH系统地重塑了肿瘤免疫微环境（图11中的(G)和图14）。这些发现与宏观抗肿瘤结果一致，共同表明MAMH治疗诱导了对多灶性HCC有效的全身和持久的抗肿瘤免疫记忆。

（5）MAMH在原位异种移植性HCC兔模型中的临床翻译评价

临床MAMH系统在原位兔HCC模型中实施，以评估其临床应用潜力。原理图和实验步骤如图15中的(A)所示。在消融过程的实时超声成像中观察到肿瘤组织的变性。与小鼠实验的治疗效果相似，兔经MAMH处理后的肿瘤比其他组更小，表明MAMH对残留肿瘤的抑制作用优于游离LEN（图15中的(B)）。收获的肿瘤定量显示，MAMH组的体积和重量最大（9.5 cm³和10.3 g），分别高于对照组（49.1 cm³和49.2 g）、MA组（80.0 cm³和78.5 g）和LEN组（40.5cm³和38.8 g）（图15中的(C)）。

治疗14 d后采集组织和血液，用血清和主要器官评价MAMH的肿瘤生物安全性。在MAMH治疗组中，与未治疗对照组相比，所有血清生化物质（AST、ALT、肌酐、尿素）水平维持在正常水平（图15中的(D)）。各组重要器官均未观察到异常或炎症细胞（图15中的(E)）。这些结果证明了MAMH在兔原位HCC模型中抑制残留肿瘤的有效性，并且毒副作用最小。

为了解决HCC的临床可怕预后，我们引入了一种新颖的局部微创消融诱导MΦ搭便车系统，在该系统中，对HCC进行微创消融以指导载药MΦs的化学性递送。这种策略涉及到LEN@MΦs的形成，在那里，携带LEN的纳米颗粒与大肠杆菌膜结合在一起，被MΦs吞噬。此外，大肠杆菌膜包裹在维持M1表型的同时，提高了MΦs的载药效率，并改善了其改善肿瘤免疫微环境的能力。

考虑到消融手术直接破坏肿瘤组织，产生以消融部位为中心的炎症梯度，天然的MΦs能够沿炎症梯度进行趋化运动。为此，利用LEN@MΦs的趋化性设计了MAMH策略。手术过程中在超声成像引导下对肿瘤组织进行消融治疗，术后静脉注射LEN@MΦs。由于LEN@MΦs共享天然MΦs的趋化性，LEN@MΦs沿着消融手术产生的炎症因子梯度赋予趋化运动。LEN@MΦs的趋化及其随后释放的LEN提高了LEN的效率。总凋亡率表明，LEN的递送是治疗效果的主要原因。除了抑制血管生成的作用外，LEN还与免疫调节有关。然而，我们观察到单独施用LEN不足以激活强大的抗肿瘤免疫反应并抑制切除后HCC中的残留肿瘤，这可能是由于其在肿瘤部位的积累有限。相比之下，我们发现MAMH中药物传递效率的提高引起LEN抗肿瘤作用的质变，从而刺激全身免疫反应并诱导持久的免疫记忆。LEN在MΦ搭便车策略中对多灶性HCC小鼠模型和原位兔模型的进展均显示出显著的治疗效果。

本研究提出了一种针对各种HCC类型的通用治疗方法，利用消融术诱导的自然炎症梯度导航MΦ搭车给药。小鼠和家兔的多种HCC模型验证了其优越的靶向递送和抗肿瘤功效。目前的治疗方法，如静脉注射，治疗药物通过整个循环系统的扩散传递，导致肿瘤的递送效率较低。相比之下，MAMH方法利用天然巨噬细胞对肿瘤的趋化性，解决了目前治疗递送的局限性。LEN的使用是用于治疗HCC的临床治疗剂的一个例子。广泛的一线药物，如索拉非尼和瑞非尼，也可以用于MAMH策略的靶向递送。值得注意的是，局部微创消融作为早期HCC患者的首选，仍然具有较高的复发率。因此，我们的系统在实际临床应用中提供了一种前瞻性的治疗方法，能够预防消融后的进展和复发。在HCC患者肿瘤较大、形状不规则或接近高危部位的情况下，由于存在消融不完全的风险，微创消融通常不是首选治疗方法，这限制了其在临床实践中的广泛应用。我们在消融方法方面的策略创新可能有助于有效治疗早期HCC，最初被认为是“不可消融的”，并且在某些情况下，可能将消融标准扩展到早期HCC之外，使更多的患者能够采用治愈方法治疗。此外，通过采用更先进的系统（如冷冻消融和放疗），MΦ搭便车平台的治疗效果仍有望显著提高。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒，其特征在于，包括大肠杆菌囊泡和包裹在大肠杆菌囊泡内的药物小分子有效成分，纳米载药颗粒是将M1型巨噬细胞与包裹有药物小分子有效成分的大肠杆菌囊泡孵育获得；所述药物小分子有效成分为乐伐替尼、索拉菲尼、瑞格菲尼中的任意一种。

2.权利要求1所述纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、制备含药物小分子有效成分的纳米颗粒；

S2、将大肠杆菌囊泡与S1获得的纳米颗粒混合，通过孔径为200 nm的聚碳酸酯膜挤出至少21次，次数应为奇数次，经洗涤获得包裹有药物小分子有效成分的大肠杆菌囊泡；

S3、M1型巨噬细胞与S2获得的包裹有药物小分子有效成分的大肠杆菌囊泡于37℃孵育60 min，经洗涤获得由巨噬细胞负载的纳米载药颗粒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S1中纳米颗粒的制备方法为将药物小分子有效成分和PLGA溶于DMSO中，混合后加入表面活性剂TPGS，混合形成油相；将油相滴加至去离子水中，室温下连续搅拌，经纯化及重悬获得含有纳米颗粒的溶液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，药物小分子有效成分和PLGA的质量比为1:4，药物小分子有效成分在油相中的浓度为0.25 mg/mL，TPGS在油相中的浓度为2 mg/mL。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，油相与水相的体积比为1:7。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S2获得的包裹有药物小分子有效成分的大肠杆菌囊泡中药物小分子有效成分的含量为0.2~0.225 mg/mL。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，S3的孵育体系中M1型巨噬细胞的浓度为2×106 cells/mL。

8.权利要求1所述纳米载药颗粒的应用，其特征在于，将纳米载药颗粒用于制备治疗肝细胞癌的药物。

9.权利要求1所述纳米载药颗粒的应用，其特征在于，将纳米载药颗粒用于制备改善肝细胞癌消融后预后的药物。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述药物具有抑制肿瘤细胞增殖和新生血管形成，或刺激全身免疫反应并诱导持久的免疫记忆的作用。