ES2330519T3 - Inducion de la transicion de permeabilidad mitocondrial. - Google Patents

Inducion de la transicion de permeabilidad mitocondrial. Download PDF

Info

Publication number
ES2330519T3
ES2330519T3 ES03810339T ES03810339T ES2330519T3 ES 2330519 T3 ES2330519 T3 ES 2330519T3 ES 03810339 T ES03810339 T ES 03810339T ES 03810339 T ES03810339 T ES 03810339T ES 2330519 T3 ES2330519 T3 ES 2330519T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
group
alkyl
aryl
hydrogen
cycloalkyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES03810339T
Other languages
English (en)
Inventor
Philip John Hogg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NewSouth Innovations Pty Ltd
Original Assignee
NewSouth Innovations Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2002952526A external-priority patent/AU2002952526A0/en
Priority claimed from AU2003906109A external-priority patent/AU2003906109A0/en
Application filed by NewSouth Innovations Pty Ltd filed Critical NewSouth Innovations Pty Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2330519T3 publication Critical patent/ES2330519T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/285—Arsenic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/06—Aluminium compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/66—Arsenic compounds
    • C07F9/70—Organo-arsenic compounds
    • C07F9/74—Aromatic compounds
    • C07F9/78—Aromatic compounds containing amino groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/66—Arsenic compounds
    • C07F9/70—Organo-arsenic compounds
    • C07F9/80—Heterocyclic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/66—Arsenic compounds
    • C07F9/70—Organo-arsenic compounds
    • C07F9/80—Heterocyclic compounds
    • C07F9/82—Arsenic compounds containing one or more pyridine rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
    • G01N33/5079—Mitochondria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

Un proceso in vitro para identificar un compuesto que induzca selectivamente la transición de permeabilidad mitocondrial (MPT) en células en proliferación, donde dicho proceso comprende poner en contacto una célula o extracto celular con un compuesto, determinar si el compuesto se une al translocador de nucleótidos de adenina (ANT) y determinar si el compuesto induce selectivamente la MPT en células en proliferación.

Description

Inducción de la transición de permeabilidad mitocondrial.
Campo técnico
La presente invención se refiere a la modificación de la permeabilidad de membrana mitocondrial en células y, en particular, la identificación y uso de compuestos que induzcan selectivamente la MPT en células en proliferación.
Antecedentes de la intención
La mitocondria proporciona ATP para apoyar la función celular normal y su alteración conduce a muerte celular apoptótica y necrótica (Crompton, 1999). Un factor importante en la apoptosis y necrosis es la transición de permeabilidad mitocondrial (MPT) que se produce como resultado de una sobrecarga de calcio. La causa de la MPT es la apertura de un poro inespecífico en la membrana mitocondrial interna, conocido como el poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP) (Crompton et al, 1987). El estrés oxidativo, el agotamiento de nucleótidos de adenina y el fosfato inorgánico elevado aumentan enormemente la sensibilidad del poro a la concentración de calcio. La apertura del MPTP se acompaña del equilibrado de todos los solutos pequeños (<1,5 kD) a través de la membrana mitocondrial interna. La alta concentración de proteína resultante en la matriz ejerce una presión osmótica coloidal que es responsable de un hinchamiento importante de la mitocondria y, en última instancia, apoptosis o
necrosis.
El translocador de nucleótidos de adenina (ANT) es una proteína de 30 kD que atraviesa la membrana mitocondrial interna y es fundamental para el MPTP (Crompton et al, 1988).
Existe la necesidad de inducir selectivamente la MPT, particularmente en células en proliferación, como un medio para inducir la apoptosis. J. Biol. Chem. (1996) 271, págs. 6746-6751 por Constantini et al es un ejemplo de una publicación que describe un método para identificar compuestos que inducen la MPT pero que no contiene ninguna sugerencia de que dicho método debería usarse en células en proliferación.
La presente invención se refiere a un proceso para identificar compuestos que se unan a ANT en la mitocondria e induzcan selectivamente la MPT en células en proliferación respecto a células que no están en proliferación o de crecimiento en estado quiescente.
Sumario de la invención
De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un proceso in vitro para identificar un compuesto que induzca selectivamente la transición de permeabilidad mitocondrial (MPT) en células en proliferación, donde el proceso comprende poner en contacto una célula o extracto celular con un compuesto, determinar si el compuesto se une al translocador de nucleótidos de adenina (ANT) y determinar si el compuesto induce selectivamente la MPT en células en proliferación.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención se proporciona un proceso in vitro para explorar una pluralidad de compuestos para identificar un compuesto que induzca selectivamente la MPT en células en proliferación, donde el proceso comprende poner en contacto una célula o un extracto celular con la pluralidad de compuestos, determinar si cualquiera de los compuestos se une a ANT y si es así, determinar por separado para cada uno de la pluralidad de compuestos si el compuesto induce selectivamente la MPT en células en proliferación.
Con referencia al primer y segundo aspectos de la invención, puede determinarse la selectividad para células en proliferación, por ejemplo, comparando el efecto de compuestos que se ha identificado que se unen a ANT sobre la MPT en células en proliferación con el efecto sobre la MPT en células que no están en proliferación o de crecimiento en estado quiescente.
También con referencia al primer y segundo aspecto de la invención, en una realización, la determinación de la inducción de la MPT puede implicar medir cambios en la liberación de Citocromo C. En otra realización, la determinación de la inducción puede implicar medir cambios en la concentración de superóxido celular.
Con respecto a cualquiera del primero y segundo aspectos de la invención, en una realización el compuesto puede ser un compuesto reactivo de ditiol.
En otra realización, el compuesto puede tener un resto arsenóxido (o equivalente de arsenóxido).
En una realización más, el compuesto arsenóxido (o equivalente de arsenóxido) puede tener la fórmula (I):
(I)A-[(XBX')_{n}B'-Y]_{p}
\newpage
en la que
A comprende al menos un grupo colgante sustancialmente impermeable de membrana celular;
(XBX')_{n}B' comprende un grupo enlazador adecuado, donde n es un número entero seleccionado entre 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20;
Y comprende al menos un arsenóxido O equivalente de arsenóxido; y
p es un número entero seleccionado entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, el compuesto de fórmula (I) puede tener más de 8 átomos de carbono.
Las siguientes características se refieren a la Fórmula (I):
En una realización, A puede seleccionarse entre el grupo que consiste en aminoácidos naturales, no naturales y sintéticos, aminas hidrófilas, péptidos y polipéptidos, incluyendo dipéptidos tripéptidos, tetrapéptidos, pentapéptidos, restos de azúcar tales como monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos (incluyendo variantes sustituidas) y proteínas que contienen tiol, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, A puede seleccionarse entre el grupo que consiste en glutatión, glucosamina, cisteinilglicina, ácido cisteico, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina y arginina, donde el átomo de azufre de cada compuesto que contiene azufre puede estar opcionalmente oxidado para formar un sulfóxido o sulfona. En otras realizaciones, A puede comprender un resto de azúcar, un resto disacárido u oligosacárido tal como, por ejemplo, glucosa, fructosa, manosa, xilosa, lixosa, galactosa, hexosa, sacarosa, sorbosa, galactosil-sucnosa, sorbitol, manitol, xilitol, etc. En otras realizaciones, A puede ser una amina hidrófila tal como una alquil- aril- o aralquil-amina primaria, secundaria o terciaria, o una amina heterocíclica tal como piridina, pirrol, imidazol, etc.
Los aminoácidos son conocidos por los especialistas en la técnica y se muestran, por ejemplo, en libros de referencia convencionales, tales como King and Stansfield, A Dictionary of Genetics, 4ª Edición, Oxford University Press, 1990, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia. Por ejemplo, los aminoácidos pueden ser aminoácidos \alpha, \beta o \gamma. La presente invención también incluye las formas de aminoácidos L y D. Los ejemplos de aminoácidos incluyen glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina, triptófano, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina e histidina.
En una realización, A puede seleccionarse entre el grupo que consiste en ureas tri-ácidas y péptidos que incluyen dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos. Por ejemplo, glutatión, Cys-Glu-Gly, Arg-Gly-Asp-Cys, Val-Thr-Cys-Gly, Gly-Gly-Cys, Lys-Glu-Gly, Arg-Gly-Asp-Lys, Val-Thr-Lys-Gly, Gly-Gly-Lys, Ser-Glu-Gly, Arg-Gly-Asp-Ser, Val-Thr-Ser-Gly, Gly-Gly-Ser, Asp-Glu-Gly, Arg-Gly-Asp-Asp, Val-Tbr-Asp-Gly, Gly-Gly-Asp, Glu-Glu-Gly, Arg-Gly-Asp-Glu, Val-Thr-Glu-Gly, Gly-Gly-Glu, etc, ácido preslonoico, moléculas ácidas pequeñas tales como ácido 3-mercapto-1-propanosulfónico, ácido mercaptopropiónico, ácido mercaptosuccínico; alcoholes pequeños tales como 1-tio-beta-D-glucosa, 3-mercapto-1,2-propanodiol; aminas pequeñas, incluyendo, por ejemplo, alquil-, aril- y aralquil-aminas sustituidas primarias, secundarias y terciarias; y compuestos heteroaromáticos tales como ácido 5-mercapto-1-tetrazolacético, 2-mercaptopiridina y 2-aminopiridina.
En una realización, A es un tripéptido. Por ejemplo, A puede ser una glutatión y en una forma el compuesto puede representarse por la Fórmula (II):
1
en la que (XBX')_{n}B' comprende cualquier grupo enlazador adecuado, e Y comprende un arsenóxido o un equivalente de arsenóxido.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, p es un número entero seleccionado de 1 a 5. Por ejemplo, p puede ser 1, 2, 3, 4 ó 5. En una realización, p es 1 ó 2. En otra realización, p es 1.
En una realización, n es un número entero de 0 a 15. Por ejemplo, n puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15, en una realización n es un número entero seleccionado de 0 a 10. En otra realización n es un número entero seleccionado de 0 a 5, por ejemplo, n puede ser 0, 1, 2, 3, 4 ó 5.
\newpage
En una realización, X se selecciona entre el grupo que consiste en -NR, -S(O)-, -S(O)O-, -S(O)_{2}-, -S(O)_{2}O-,
-C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -C(S)S-, -P(O)(R_{1})- y -P(O)(R_{1})O-, o está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{10}, alquenileno C_{2}-C_{10}, alquinileno C_{2}-C_{10}, cicloalquileno C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno C_{6}-C_{10}, heterocicloalquileno C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenileno C_{6}-C_{10}, arileno C_{6}-C_{12}, heteroarileno y acilo C_{2}-C_{10};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en -NR-, -O-, -S-, -Se-, -S-S-, S(O)-, -OS(O)-, OS(O)O-, -OS(O)_{2}- -OS(O)_{2}O, -S(O)O-, -S(O)_{2}-, -S(O)_{2}O-, -OP(O)(R_{1})-, -OP(O)(R_{1})O-, -OP(O)(R_{1})OP(O)(R_{1})O-, -C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -C(S)S-, -P(O)(R_{1})-, P(O)(R_{1})O- y 2 , o está ausente; donde E es O, S, Se, NR o N(R)_{2}^{+};
n es 0, 1 ó 2; y
B' se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{10}, alquenileno C_{2}-C_{10}, alquinileno C_{2}-C_{10}, cicloalquileno C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno C_{5}-C_{10}, heterocicloalquileno C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenileno C_{5}-C_{10}, arileno C_{6}-C_{12} y heteroarileno o está ausente; y donde
cada R se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, OR_{2} y acilo C_{2}-C_{10};
R' es igual que R o dos R' pueden tomarse junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos para formar un anillo heterocíclico, saturado o insaturado, de 5 o 6 miembros;
cada R_{1} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, halo, OR_{2} y N(R)_{2};
cada R_{2} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo y -C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alcoxi C_{1}-C_{10}, alqueniloxi C_{1}-C_{10}, alquiniloxi C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio C_{1}-C_{10}, alqueniltio C_{3}-C_{10}, alquiniltio C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, heteroariltio, OH, SH y N(R)_{2};
donde para cada caso en el que B y/o B' es arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de arsenóxido) pueden estar en cualquier posición disponible, y, por ejemplo, pueden estar en una relación para-, meta- u orto-; y
donde cada alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, cicloalquenileno, heterocicloalquileno, heterocicloalquenileno, arileno, heteroarileno y acilo puede estar sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, ciano, cianato, isocianato, OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3}, -OS(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -OS(O)_{2}R_{3}, -P(O)R_{4}R_{4}, -OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2}, -NRC(O)(CH_{2})_{m}Q, -C(O)R_{5};
3
donde
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2}, N(R)_{2} y -C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alcoxi C_{1}-C_{10}, alqueniloxi C_{3}-C_{10}, alquiniloxi C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio C_{1}-C_{10}, alqueniltio C_{3}-C_{10}, alquiniltio C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, heteroariltio y N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alcoxi C_{1}-C_{10}, alqueniloxi C_{3}-C_{10}, alquiniloxi C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio C_{1}-C_{10}, alqueniltio C_{3}-C_{10}, alquiniltio C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{6}-C_{10}, heterocicloalquiltio C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio C_{6}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, heteroariltio, halo y N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alquiltio C_{1}-C_{10}, alqueniltio C_{3}-C_{10}, alquiniltio C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, heteroariltio, -S(O)R_{3}, SU(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es igual que R o dos R'' tomados junto con el átomo de N al que están unidos pueden formar un sistema de anillo heterocíclico saturado, insaturado o aromático;
Q se selecciona entre halógeno y -OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo, fenilo, p-metilfenilo; y
m es 1, 2, 3, 4 ó 5.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, X se selecciona entre el grupo que consiste en una atmósfera de NH, -C(o)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O- y -C(S)S- o está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{5}, alquenileno C_{2}-C_{5}, alquinileno C_{2}-C_{5}, cicloalquileno C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno C_{5}-C_{10}, arileno C_{6}-C_{12} y acilo C_{2}-C_{5};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en -O-, -S-, -NR-, -S-S-, -S(O)-, -S(O)_{2}-, -P(O)(R_{1})-, -OP(O)(R_{1})-, OP(O)(R_{1})O-, OP(O)(R_{1})OP(O)(R_{1})O-, -C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -C(S)S-, -Se-,
4, o está ausente; donde E es O, S o N(R)_{2}^{+};
n es 0,1 ó 2; y
B' se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{5}, alquenileno C_{2}-C_{5}, alquinileno C_{2}-C_{5}, cicloalquileno C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno C_{5}-C_{10} y arileno C_{6}-C_{12}, o está ausente; y donde
cada R se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, OR_{2} y acilo C_{2}-C_{10};
R' es el mismo que R;
cada R_{1} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, halo, OR_{2} y N(R)_{2};
cada R_{2} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{6}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12} y -C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, alqueniloxi C_{3}-C_{5}, alquiniloxi C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{6}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{6}, alqueniltio C_{3}-C_{5}, alquiniltio C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12} , OH, SH y N(R)_{2};
donde para cada caso en el que B y/o B' es arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de arsenóxido) pueden estar en cualquier posición, y, por ejemplo, pueden estar en una relación para-, meta- u orto-, y
donde cada alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, cicloalquenileno, arileno y acilo puede estar sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, ciano, halo, cianato, isocianato, OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3}, -OS(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -OS(O)_{2}R_{3}, -P(O)R_{4}R_{4}, -OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2}, NRC(O(CH_{2})_{m}Q, -C(O)R_{6},
5
donde
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2}, N(R)_{2} y -C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, alqueniloxi C_{3}-C_{5}, alquiniloxi C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, alqueniltio C_{3}-C_{5}, alquiniltio C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12} y N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, alqueniloxi C_{3}-C_{5}, alquiniloxi C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{5}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, alqueniltio C_{3}-C_{5}, alquiniltio C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{5}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, halo y N(R)_{2};
R_{6} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, alqueniltio C_{3}-C_{5}, alquiniltio C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que R;
Q se selecciona entre el grupo que consiste en halógeno y -OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo C_{1}-C_{4}, fenilo, p-metilfenilo; y
m es 1, 2, 3, 4 ó 5.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, X está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{5}, arileno C_{6}-C_{12} y acilo C_{2}-C_{5};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en -O-, -S-, -NR-, -S-S-, -S(O)-, -S(O)_{2}-, -P(O)(R_{1})-, -C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)-, -Se- y
6 o está ausente; donde E es 0, S o N(R)_{2}^{+};
n es 0, 1 ó 2; y
B' es alquileno C_{1}-C_{5}, arileno C_{6}-C_{12} o está ausente; y donde
cada R se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, OR_{2} y acilo C_{2}-C_{5};
R' es el mismo que R;
cada R_{1} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, halo, OR_{2} y N(R)_{2};
\newpage
cada R_{2} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12} y -C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, alqueniloxi C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, alqueniltio C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio C_{1}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, OH, SH y N(R)_{2};
donde para cada caso en el que B y/o B' es arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de arsenóxido) pueden estar en cualquier posición del anillo o anillos respectivos y, por ejemplo, pueden estar en una relación para-, meta- u orto-, y
donde cada alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, cicloalquenileno, arileno y acilo puede estar sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, halo, ciano, cianato, isocianato, OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3}, -OS(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -OS(O)_{2}R_{3}, -P(O)R_{4}R_{4}, -OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2}, -NRC(O)(CH_{2})_{m}Q, -C(O)R_{5},
7
donde
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2} y -C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12} y N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, halo y N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{6}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que R;
Q se selecciona entre halógeno y -OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo C_{1}-C_{4}, fenilo, p-metilfenilo; y
m es 1, 2, 3, 4 ó 5.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más, X está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{5}, arileno C_{6}-C_{12} y acilo C_{2}-C_{5};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en -O-, -S-, -NR-, -C(O)- y -C(O)O-, o está ausente;
n es 1; y
B' es alquileno C_{1}-C_{5}, arileno C_{6}-C_{12} o está ausente; y
R se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12} y acilo C_{2}-C_{5};
donde para cada caso en el que B y/o B' es arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de arsenóxido) pueden estar en cualquier posición disponible del anillo o anillos respectivos y, por ejemplo, puede estar en una relación para-, meta- u orto-, y
\newpage
donde cada alquileno, arileno y acilo puede estar sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{6}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, halo, ciano, cianato, isocianato, OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -P(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2}, -NRC(O)(CH_{2})_{m}Q, -C(O)R_{5},
8
donde
cada R se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12} y acilo C_{2}-C_{5};
R_{2a} se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2} y -C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5} y ariltio C_{6}-C_{12};
cada R_{4} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, ariltio C_{6}-C_{12}, halo y N(R)_{2};
cada R_{5} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, ariltio C_{6}-C_{12}, OH, SH y N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{6}, ariltio C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que el R anterior;
Q se selecciona entre halógeno y -OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo C_{1}-C_{4}, fenilo, p-metilfenilo; y
m es 1, 2, 3, 4 ó 5.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización más, X está ausente
B es acilo C_{2}-C_{5};
X' es NR;
n es 1;
B' es fenileno; y
R es H;
donde los sustituyentes unidos directamente al anillo de fenileno pueden estar en cualquier posición disponible, como se ilustra, por ejemplo, por la Fórmula (III);
9
en la que R_{7} a R_{10} se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, halógeno, hidroxi, amino, nitro, carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5}, -OS(O)_{2}R_{3} y -NHC(O)CH_{2}Q donde Q es halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3}, -OS(O)_{2}C_{6}H_{5} y -OS(O)_{2}-p-tolilo; y donde, cuando uno cualquiera de R_{7} a R_{10} es alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, -OS(O)_{2}R_{3}, es capaz de formar un anillo condensado con el fenileno; y donde, además, al menos uno de R_{7} a R_{10} es alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5} o -OS(O)_{2}R_{3}, junto con al menos otro cualquiera de R_{7} a R_{10}, es capaz de formar un anillo condensado con el fenileno.
\vskip1.000000\baselineskip
Más típicamente, de R_{7} a R_{10} se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, nitro, ciano, carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5}, metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo, fenilo y -NHC(O)CH_{2}Q donde Q es halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3}, -OS(O)_{2}C_{5}H_{6} y -OS(O)_{2}-p-tolilo.
Por ejemplo, cuando el grupo colgante A es glutatión, el compuesto de fórmula (III) puede representarse como
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
Además, cuando B' es arileno, los sustituyentes unidos al anillo de arileno pueden estar en cualquier posición disponible del anillo de arileno. Por ejemplo, los sustituyentes pueden estar en una relación meta- o para- con respecto al grupo -As=O.
En otra realización, un compuesto de arsenóxido identificado de acuerdo con la presente invención se selecciona entre los siguientes compuestos:
\vskip1.000000\baselineskip
11
12
13
14
El compuesto "GSAO" (4-(N-(S-glutationilacetil)amino)-fenilarsenóxido) se ha descrito previamente en la solicitud de patente internacional WO 01/21628.
Otros compuestos que pueden interactuar con ANT incluyen compuestos de acuerdo con la fórmula (V) que se ilustra a continuación:
15
en la que Q es cualquier halógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra forma de un compuesto de arsenóxido que puede interactuar con ANT es un compuesto de acuerdo con la Fórmula (VI):
16
en al que G se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, nitro, ciano, carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5}, alquilo C_{1}-C_{5} y arilo C_{6}-C_{12} y -NHC(O)CH_{2}Q, donde Q es halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3}, -OS(O)_{2}C_{6}H_{3} o -OS(O)_{2}-p-tolilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Típicamente, G se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, nitro, carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5}, metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo, fenilo y -NHC(O)CH_{2}Q, donde Q es el grupo que consiste en halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3}, -OS(O)_{2}C_{6}H_{5} y -OS(O)_{2}-p-tolilo.
En una realización, en un compuesto de Fórmula VI, G es hidroxi, flúor, amino o nitro.
\newpage
En otra realización, el grupo G está en una relación orto-, meta- o para- con el grupo arsenóxido. Por ejemplo, en otra realización, G está en una relación orto- o para- con el grupo arsenóxido.
Típicamente, la actividad del átomo de arsénico puede modificarse por el grupo G, cuando G y el átomo de arsénico están en una relación orto o para entre sí. Por ejemplo, cuando G es un grupo donador de electrones tal como OH (ionizado en O^{-} a pH fisiológico), el átomo de arsénico puede desactivarse hacia ditioles y puede hacerse más selectivo, por ejemplo, únicamente reaccionando con ditioles muy reactivos. Como alternativa, cuando G es un grupo de extracción de electrones, tal como NO_{2}, la densidad de electrones puede apartarse del átomo de arsénico, haciendo que sea más reactivo a los ditioles. La inhibición selectiva de algunas proteínas redox y no de otras puede conseguirse por manipulación de G.
Típicamente, en los compuestos de arsenóxido capaces de interactuar con ANT, el grupo arsenóxido (-As=O) puede reemplazarse por un equivalente de arsenóxido
Un equivalente de arsenóxido se define en la presente memoria como cualquier especie reactiva a ditiol que muestra esencialmente la misma afinidad para ditioles que para -As=O. Típicamente, el equivalente de arsenóxido incluye entidades reactivas a ditiol, tales como especies As, Ge, Sn y Sb. Más típicamente, un equivalente de arsenóxido puede representarse por -D(Z_{1})(Z_{2}). Se espera que los equivalentes de arsenóxido muestren una actividad idéntica o sustancialmente idéntica a la del arsenóxido correspondiente.
Típicamente, para equivalentes de arsenóxido de la forma -D(Z_{1})(Z_{2}), D será, por ejemplo, As, RSn, Sb o RGe, y Z_{1} y Z_{2} serán grupos lábiles (es decir, grupos desplazados fácilmente en condiciones fisiológicas). Z_{1} y Z_{2} pueden ser iguales o diferentes, y pueden estar conectados o ser independientes entre sí (unidos sólo al átomo de arsénico).
Los equivalentes de arsenóxido adecuados incluyen los siguientes:
-D(Z_{1})(Z_{2}),
donde Z_{1} y Z_{2} se seleccionan entre el grupo que consiste en OH, alcoxi C_{1}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{10}, alquilseleno C_{1}-C_{10}, arilseleno C_{6}-C_{10}, F, Cl, Br e I;
17
donde E_{1} = E_{2} = O, E_{1} = O y E_{2} = S o E_{1} = E_{2} = S; M es R''' y R'''' se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, halógeno, alcoxi C_{1}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{10}, hidroxi y carboxi; y n = 1 a 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Para equivalentes de arsenóxido de la forma D(Z_{1})(Z_{2}), cuando D es As y Z_{1} y Z_{2} son OH, el equivalente de arsenóxido puede estar en equilibrio con especies poliméricas, como se representa a continuación.
18
Con respecto al equilibrio representado anteriormente, el arsénico es uno de muchos elementos cuyas especies hidroxi existen en equilibrio con los anhídridos poliméricos correspondientes (Doak & Freedman, 1970). Por lo tanto, los compuestos de arsenóxido pueden existir en realidad como polímeros de bajo o medio peso molecular (por ejemplo, n = 3 a 6). Sin embargo, la reacción de deshidratación es reversible, y por lo tanto se espera que los anhídridos poliméricos solubles se comporten como equivalentes de arsenóxido, es decir, se espera que se unan a ditioles muy espaciados sustancialmente de la misma manera que las especies monoméricas -AS(OH)_{2}.
19
donde X_{3} = NH, Y_{1} = O; X_{3} = Y_{1} = O o X_{3} = S, Y_{1} = O, y R' se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12} y carboxi, o es una de las cadenas laterales de veinte aminoácidos:
20
donde X_{3} = Y_{1} = O; X_{3} = NH, Y_{1} = O; X_{3} = S, Y_{1} = O; X_{3} = Y_{1} = NH; o X_{3} = S, Y_{1} = NH; o X_{3} = S, Y_{1} = NH y R_{11} a R_{14} se seleccionan entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12} y CO_{2}H;
21
donde X3 = Y_{1} = O o X_{3} = NH, Y_{1} = O; y R_{11} a R_{14} se seleccionan entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, halógeno, alcoxi C_{1}-C_{10} y CO_{2}H. Típicamente, (XBX')B' es como se ha definido anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Abreviaturas y definiciones
En el contexto de esta memoria descriptiva, la abreviatura MPT representa la Transición de Permeabilidad Mitocondrial.
En el contexto de esta memoria descriptiva, la abreviatura MPTP representa el Poro de Transición de Permeabilidad Mitocondrial.
En el contexto de esta memoria descriptiva, la abreviatura ANT representa el translocador de nucleótidos de adenina.
En el contexto de esta memoria descriptiva, el EGTA es ácido etilenglicol-bis (beta-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetraacético.
En el contexto de esta memoria descriptiva, PAO representa arsenóxido de fenilo.
En el contexto de esta memoria descriptiva, el término "arsenóxido" se refiere al grupo -As=O.
En el contexto de esta memoria descriptiva, los grupos escritos como -As=O y -As(OH)_{2} deben considerarse sinónimos.
En el contexto de esta memoria descriptiva, la expresión "equivalente de arsenóxido" se refiere a cualquier especie reactiva de ditiol que muestra esencialmente la misma afinidad hacia ditioles que -As=O o As(OH)_{2}, y la expresión incluye, por ejemplo, grupos que comprenden un elemento de transición y cualquier arsenical trivalente que se hidrolice a -As=O o -As(OH)_{2} cuando se disuelva en un medio acuoso (tal como tampones de cultivo de células y los líquidos contenidos en el organismo que se esté tratando).
En el contexto de esta memoria descriptiva, la expresión "grupo sustancialmente impermeable de membrana celular" se refiere a cualquier grupo que limite la velocidad a la que pasa un compuesto a través de una membrana celular y hacia el interior de la célula. Un grupo sustancialmente impermeable de membrana celular puede limitar la velocidad de entrada de un compuesto en una célula en virtud de una o más propiedades tales como, por ejemplo, carga, tamaño (peso molecular), polaridad, lipofilia, hidrofilia, etc.
El término "arsenical", como se usa en la presente memoria, incluye cualquier compuesto que contenga arsénico.
El término "acilo", como se usa en la presente memoria, incluye restos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo y cicloalquenilo monovalentes y divalentes que poseen un sustituyente carbonilo terminal donde puede producirse la unión en el resto hidrocarburo, el resto carbonilo o ambos.
El término "alquilo", como se usa en la presente memoria incluye en su significado radicales hidrocarburo monovalentes, saturados, de cadena lineal y ramificada.
El término "alquenilo", como se usa en la presente memoria incluye en su significado radicales hidrocarburo monovalentes, de cadena lineal y ramificada, que tienen al menos un doble enlace.
El término "alquinilo", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo monovalentes, de cadena lineal y ramificada, que tienen al menos un triple enlace.
El término "alquileno", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo divalentes, saturados, de cadena lineal.
El término "alquenileno", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo divalentes, de cadena lineal, que tienen al menos un doble enlace.
El término "alquinileno", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo divalentes, de cadena lineal, que tienen al menos un triple enlace.
El término "arilo" como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo aromáticos monovalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y condensados.
El término "arileno", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo aromáticos divalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y condensados.
La expresión "ditioles estrechamente separados", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado tioles que están químicamente próximos así como tioles que se ponen en yuxtaposición espacial en virtud de su conformación molecular.
El término "cicloalquilo", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo monovalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policiclícos o policíclicos condensados.
El término "cicloalquileno", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo divalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o policíclicos condensados.
El término "cicloalquenilo", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo monovalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o policíclicos condensados que tienen al menos un doble enlace.
El término "cicloalquenileno", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo divalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o policíclicos condensados que tienen al menos un doble enlace.
El término "halo", como se usa en la presente memoria, incluye flúor, cloro, bromo y yodo.
El término "heteroarilo", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales aromáticos monovalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y condensados, que tienen de 1 a 12 átomos, donde de 1 a 6 átomos son heteroátomos seleccionados de O, N y S.
El término "heteroarileno", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales aromáticos conjugados y condensados divalentes, sencillos, polinucleares que tienen de 1 a 12 átomos, donde de 1 a 6 átomos son heteroátomos seleccionados de O, N y S.
El término "heterocicloalquilo", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales monovalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o condensados donde de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados de O, N o S.
El término "heterocicloalquileno", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales divalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o policíclicos condensados donde de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados de O, N o S.
El término "heterocicloalquenilo", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales monovalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o policíclicos condensados que tienen al menos 1 doble enlace y en el que de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados de O, N o S.
El término "heterocicloalquenileno", como se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales divalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o policíclicos condensados que tienen al menos un doble enlace y en el que de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados de O, N o S.
La expresión "ácido fenilarsénico", como se usa en la presente memoria, debe considerarse sinónimo al "ácido bencenarsénico".
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. El GSAO desencadenaba la apertura del MTP por reacción con y alteración del ANT. A Estructura de GSAO, GSAA y GSCA. B GSAO desencadenó el hinchamiento de la mitocondria. El hinchamiento se midió por control de la disminución asociada de la dispersión de luz a 520 nm a lo largo de 60 min. Las señales son representativas de un mínimo de tres experimentos en al menos dos preparaciones mitocondriales diferentes. En la parte i, se incubaron mitocondrias con nada (\medbullet), GSAO 25 (\medcirc), 50 (\ding{115}), 100 (\Delta) o 200 (\blacksquare) \muM. El control positivo para la apertura de poros era Ca^{2+} 150 \muM y Pi 6 mM (\boxempty). En la parte ii, se incubaron mitocondrias con nada (\medbullet), GSCA 100 \muM (\Delta), GSAA 100 \muM (\ding{115}) o GSAO 100 \muM (\blacksquare). El control positivo para la apertura de poros era PAO 25 \muM (\medcirc). En la parte iii, se incubaron mitocondrias con GSAO 100 \muM en ausencia (\blacksquare) o presencia de Mg^{2+} 3 mM (\ding{116}), EGTA 100 \muM (\Delta), BKA 10 \muM (\ding{115}), CsA 5 \muM (\nabla) o ADP 8 mM (\medcirc). Se muestra sin tratamiento (\medbullet) para una comparación. C El aumento de la concentración de Ca^{2+} sensibiliza el MPTP a GSAO. Se incubaron mitocondrias con GSAO 50 (\medbullet), 75 (\medcirc), 100 (\blacksquare) o 200 \muM (\boxempty) en ausencia o presencia de una concentración creciente de Ca^{2+} y se midió el tiempo para un hinchamiento semimáximo. D Marcaje de ANT con GSAO-B. Se marcaron mitocondrias de rata aisladas con GSAO-B en ausencia (carril 1) o presencia (carril 2) de un exceso molar de 4 veces de 2,3-dimercaptopropanol (DMP) y las proteínas marcadas con biotina se recogieron en perlas de estreptavidina-agarosa, se resolvieron en un SDS-PAGE y se sometieron a una transferencia de Western para ANT. E El GSAO competía por la alquilación de Cys^{160} en ANT por eosina-maleimida. Se marcaron partículas submitocondriales de rata con eosina-5-maleimida en ausencia (carril 1) o presencia (carril 2) de GSAO y el ANT marcado con eosina se resolvió en un SDS-PAGE y se detectó por transiluminación.
Figura 2. El GSAO se concentraba en mitocondrias en células viables. Microscopía confocal de células BAE incubadas con GSAO-F (i) y Mitotracker Red (II), que muestra la colocalización de los compuestos en las mitocondrias de una célula individual. El GSAO-F no teñía células cuando se incubaban con DMP (iii y iv). El arsenical pentavalente, GSAA-F, tampoco teñía las células (v y vi).
Figura 3. El GSAO desencadenaba la despolarización mitocondrial y la apoptosis en células endoteliales en proliferación pero no de crecimiento en estado quiescente. A El GSAO reducía la viabilidad de células endoteliales en proliferación, pero no de crecimiento en estado quiescente. Por el contrario, el PAO era igualmente tóxico para ambos tipos de células. Las células BAE se detuvieron durante 24 h en medio que contenía suero a 0,25%, después se cultivaron durante 48 h adicionales en medio que contenía suero a 0,25% o a 10% con GSAO (i) o PAO (ii). Se midió el número de células unidas después de un tratamiento de 48 h. Los resultados son la media \pm ET de tres experimentos. B El GSAO desencadenaba la despolarización mitocondrial e inducía la apoptosis en células BAE. Las células se cultivaron durante 48 h en medio que contenía suero a 10% y GSAO y después se marcaron con JC-1 o anexina V. El porcentaje de células positivas para despolarización de membrana mitocondrial (fluorescencia verde/roja de JC-1) y se midió la inducción de apoptosis (unión a anexina V). Se observó el mismo resultado en dos experimentos diferentes.
Figura 4. El GSAO inhibía la producción de ATP y aumentaba los niveles de superóxido en células endoteliales en proliferación pero no de crecimiento en estado quiescente. A Se cultivaron células BAE durante 24 h en medio que contenía suero a 0,5% o a 10% y después 24 h adicionales en presencia de GSAO. En la parte I, se midieron los niveles de ATP celular usando un ensayo de luciferina/luciferasa. Los resultados son la media \pm ETM de cuatro experimentos. En la parte II, se midió la masa mitocondrial a partir de la captación de naranja de nonil acridina (NAO). Los resultados son la media \pm intervalo de dos experimentos. B. Nivel de superóxido medido con dihidroetidina en células BAE que se habían cultivado durante 24 h en medio que contenía suero a 0,5% o 10% y después durante 24 h adicionales en presencia de GSAO. Los resultados son la media \pm el intervalo de dos experimentos. C Medición simultánea de O_{2} (eje y) en células BAE cultivadas en medio que contiene suero a 10% y GSAO durante 24 h. El porcentaje de células en cada cuadrante se muestra en la esquina más externa.
Figura 5. El GSAO inducía la liberación del citocromo c desde la mitocondria. Se incubaron mitocondrias de hígado de rata durante 0-60 min con GSAO 100 \muM y se midió el citocromo c liberado hacia el medio por transferencia de Western. Se muestra la transferencia de Western y la cuantificación correspondiente. B se incubaron mitocondrias de hígado de rata durante 30 min con nada, GSAO 100 \muM, GSAO 100 \muM y ciclosporina (CsA) 5 \muM, o Ca^{2+} 150 \muM y Pi 6 mM como control positivo. Se midió el citocromo c liberado hacia el medio por transferencia de Western.
Figura 6. Comparación de la inducción de MPTP por análogos de GSAO y GSAO.
Figura 7. Correlación de la inducción de MPTP y peso molecular para GSAO y análogos relacionados.
Figura 8. Correlación de la inducción de MPTP y Log P para GSAO y análogos relacionados.
Figura 9. Comparación de la actividad antiproliferativa en células BAE e inducción de MPTP.
Figura 10. Inducción de la transición de permeabilidad mitocondrial por GSAO o o-GSAO. Se midió el hinchamiento por disminución de la dispersión de luz a 520 nm. Se incubaron mitocondrias aisladas con diferentes concentraciones de GSAO (parte A) o o-GSAO (parte B). El semi-tiempo para el hinchamiento en función de la concentración de GSAO o o-GSAO en dos experimentos diferentes se muestra en la parte C. El semi-tiempo para el hinchamiento en función de la concentración de GSAO o PAO se muestra en la parte D. El control positivo en las partes A y B era Ca^{2+} 150 \muM y Pi 6 mM (\blacksquare).
Figura 11. Dependencia de calcio del efecto de GSAO o o-GSAO sobre la transición de permeabilidad mitocondrial. Se incubaron mitocondrias con diferentes concentraciones de GSAO (parte A) o o-GSAO (parte B) a concentraciones crecientes de Ca^{2+} y se midió el tiempo para un hinchamiento semimáximo.
Figura 12. Los ligandos de ANT bloquean la inducción de la transición de permeabilidad mitocondrial por o-GSAO. Se incubaron mitocondrias con o-GSAO 200 \muM en ausencia o presencia de EGTA, Mg^{2+}, CSA o ADP. El control positivo era Ca^{2+} 150 \muM y Pi 6 mM (\blacksquare).
Descripción detallada
La presente invención se refiere a procesos in vitro para identificar compuestos que se unen a ANT en mitocondrias e inducen selectivamente la MPT en células en proliferación respecto a células que no están en proliferación.
El ANT es una proteína de 30 kD que atraviesa la membrana mitocondrial interna y es fundamental para el MPTP (Crompton et al., 1988). Existen tres cisteínas no emparejadas en el lado de la matriz de ANT-Cys^{57}, Cys^{160} y Cys^{257}. (Halestrap et al., 1997). La actividad de ANT está controlada por la unión de Ca^{2+}, ciclofilina D y nucleótidos adenina. La ciclofilina D (Crompton et al., 1988) y los nucleótidos de adenina (Haworth y Hunter, 1979a, b; Haworth y Hunter, 2000) se unen al lado de la matriz de ANT mientras que aún no se ha determinado el sitio o sitios para la interacción del Ca^{2+}. Existen varios reguladores conocidos del MPTP que parecen actuar modulando la unión de estos tres compuestos. El desencadenamiento primario para la apertura del MPTP es un aumento en la concentración de Ca^{2+}. La quelación de Ca^{2+} con EGTA bloquea la apertura de poros. La especificidad del sitio de desencadenamiento (presumiblemente en ANT) para Ca^{2+} parece ser absoluta, ya que otros iones de metales divalentes tales como Mg^{2+} actúan como inhibidores (Haworth y Hunter, 1979a). La unión de ciclofilina D a ANT es necesaria para la apertura de poros a concentraciones de Ca^{2+} submilimolares (Halestrap et al., 2002). La ciclosporina A (CsA) bloquea la apertura de poros por unión a ciclofilina D y desplazamiento de la misma del ANT (Crompton et al., 1988). El ADP de la matriz también es un modulador importante de la apertura de poros que se une a ANT y disminuye la sensibilidad del sitio de desencadenamiento a Ca^{2+} (Haworth y Hunter, 1979a, b). El ácido bonkrékico (BKA) también interacciona con ANT y disminuye la sensibilidad a Ca^{2+} (Hunter y Haworth, 1979).
Generalmente, el proceso para identificar un compuesto que induzca la MPT en células en proliferación de acuerdo con la invención comprende poner en contacto una célula o extracto celular con un compuesto candidato, determinar si el compuesto se une a ANT y después determinar si el compuesto induce selectivamente la MPT en células en proliferación. La evaluación de si un compuesto induce selectivamente la MPT en las células en proliferación puede determinarse por comparación del efecto de un compuesto que se ha identificado que se une a ANT sobre la MPT en células en proliferación con el efecto del compuesto sobre la MPT en células que no están en proliferación o de crecimiento en estado quiescente.
Puede realizarse el control de la inducción de MPT usando técnicas convencionales conocidas por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, controlando espectrofotométricamente el cambio en la dispersión de la luz a una longitud de onda dada para diferentes concentraciones de compuesto. Una longitud de onda adecuada es típicamente de
520 nm.
La detección de la captación de un compuesto hacia la mitocondria de una célula puede realizarse usando técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden usarse compuestos marcados fluorescentes o puede unirse un fluoróforo a un compuesto. Los ejemplos de fluoróforos adecuados incluyen fluoresceína y Cy^{TM}5.5. La localización subcelular de compuestos puede detectarse por técnicas convencionales, incluyendo microscopía de fluorescencia confocal. Como alternativa, los compuestos pueden unirse a otros grupos detectables, por ejemplo, biotina, y detectarse por tinción con estreptavidina, tal como Estreptavidina-Alexa Fluor 488.
Puede evaluarse el potencial transmembrana mitocondrial usando técnicas convencionales, incluyendo, por ejemplo, colorantes tales como JC-1 y tinciones, tales como anexina V-FITC. Mediante dichas técnicas es posible determinar si las células han experimentado la MPT y evaluar si se ha inducido la apoptosis.
Se generan especies de oxígeno reactivo tales como anión superóxido (O_{2}) y peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) como subproducto de la producción de ATP y desempeñan un papel importante como intermedios de señalización en la proliferación celular, pero a elevadas concentraciones detienen la proliferación e inducen la apoptosis dañando los lípidos, proteínas, ADN y ARN (Zanetti et al. 2001). El O_{2} se convierte en la mitocondria en H_{2}O_{2} mediante la Mn superóxido dismutasa (SOD) pero también puede liberarse de la mitocondria a través de canales aniónicos, donde se dismuta en H_{2}O_{2} mediante la Cu/Zn SOD citosólica (Vanden Hoek et al., 1998).
La invención se ilustrará ahora con referencia a los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Síntesis de Compuestos Métodos Síntesis de GSAA
Se preparó BRAA por una modificación del método descrito en Donoghue et al (2000) y en el documento WO 01/21628. Se añadió en porciones ácido p-arsanílico (20,6 g, 95 mmol) a una solución de carbonato sódico (20 g, 189 mmol) en agua (200 ml). Cuando se disolvieron todos los sólidos, se descubrió que el pH de la solución era 10, y se enfrió a 4ºC durante 2 horas. Se añadió en dos porciones bromuro de bromoacetilo (15 ml, 173 mmol) en diclorometano seco (35 ml), cada porción seguida de agitación vigorosa durante 2 a 3 min. La mezcla se dejó en reposo durante unos minutos, y la capa orgánica inferior se retiró por drenaje. Se precipitó ácido 4-(N-(bromoacetil)amino)bencenoarsónico (BRAA) por acidificación de la solución a aproximadamente pH 2-3 con la adición gota a gota de ácido sulfúrico al 98%, se recogió por filtración al vacío y se secó, dando BRAA en forma de un sólido de color blanco.
Se mezclaron juntos BRAA (3,38 g, 10 mmol), glutatión reducido (3,23 g, 10,5 mmol) y bicarbonato sódico (3,15 g, 37,5 mmol) y la mezcla sólida se disolvió en porciones en tampón bicarbonato 0,5 M (100 ml). Se descubrió que la solución transparente tenía un valor de pH de 9, se mezcló minuciosamente y se dejó durante una noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, la solución se acidificó hasta alcanzar pH neutral con la adición gota a gota de ácido clorhídrico al 32% y el producto se precipitó en etanol absoluto (1 l) mediante la adición gota a gota de la solución acidificada al alcohol bien agitado. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se dejó durante 3 horas hasta que el precipitado se sedimentó. La solución etanólica transparente se decantó hasta que quedaron \sim300 ml y después se agitó vorticialmente y se centrifugó a 2000 g durante 5 min. El producto ácido 4-(N-((S-glutationil)acetil)amino)-bencenoarsónico (GSAA) se lavó por re-suspensión en etanol absoluto reciente recién preparado y se centrifugó de nuevo. El lavado se repitió dos veces más y la suspensión final se secó para dar un sólido de color blanco, GSAA, por evaporación rotatoria. El GSAA se caracterizó por ^{1}H RMN (D_{2}O 300 MHz) y ^{13}C RMN (D_{2}O, 75 MHz) y tiene un peso molecular de 564.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de GSAO
El análisis completo de GSAO se describe en la solicitud de patente internacional WO 01/21628, cuyo contenido entero se incorpora en la presente memoria como referencia cruzada. Se preparó BRAA como se ha descrito anteriormente. Después, BRAA se convirtió en ácido 4-(N-(bromoacetil)amino)-bencenoarsonoso (BRAO) usando el método descrito en Donoghue et al. (2000). El procedimiento para la conversión de BRAO en GSAO es una modificación del descrito en Donoghue et al. (2000), como se indica a continuación. Se disolvió glutatión reducido (16 g, 52 mmol) en agua desoxigenada (1 l) en una atmósfera de nitrógeno (se preparó agua desoxigenada por ebullición seguido de refrigeración a temperatura ambiente, todo el tiempo en una atmósfera de nitrógeno). Se suspendió BRAO (25 g, 77 mmol) en la solución y se aplicó agitación vigorosa de la mezcla hasta que el BRAO no disuelto había perdido toda la tendencia a flotar, momento en el que se disminuyó la velocidad de agitación. Se añadió trietilamina (16 ml, 11,6 g, 115 mmol) y la mezcla se agitó durante al menos 18 horas, todo el tiempo en una atmósfera de nitrógeno. Se retiró algún sólido incoloro por filtración rápida al vacío y el filtrado se concentró para dar un gel viscoso en un evaporador rotatorio. El gel se diluyó con etanol (250 ml), la velocidad de agitación se aumentó y después se añadió acetona (250 ml), con formación de un sólido de color blanco. Después de agitar durante 2 horas en una atmósfera de nitrógeno, el sólido se recogió por filtración al vacío y se secó a temperatura ambiente al vacío hasta alcanzar un peso constante. El análisis del material por ^{1}H RMN permitió determinar la cantidad de trietilamina. Se añadió una cantidad equivalente de hidróxido sódico (es decir, 1 mmol de NaOH por mmol de trietilamina) en forma de una solución acuosa 10 M a una solución del material en la cantidad mínima de agua desoxigenada. La solución se agitó en una atmósfera de nitrógeno durante 2 horas y se obtuvo GSAO (en forma de la sal sódica) por retirada del disolvente en un evaporador rotatorio. El GSAO se caracterizó por los siguientes métodos: ^{1}H RMN (D_{2}O 400 MHz), ^{13}C RMN (D_{2}O, 100 MHz), HPLC y espectroscopía de infrarrojos (nujol mull). El análisis elemental era coherente con una composición de GSAO\cdot2H_{2}O, y el espectro de masas dio el ión molecular parental a 549,1 m.u. [GSAO+H]^{+}. La pureza de GSAO fue >94% por HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de GSCA
Se preparó GSCA de una manera similar a GSAA, usando ácido 4-aminobenzoico en lugar de ácido p-arsanílico como se indica a continuación. Se preparó una solución alcalina fría de ácido 4-aminobenzoico (13 g, 95 mmol) como se ha descrito anteriormente ara p-arsanílico y se hizo reaccionar de una manera idéntica con bromuro de bromoacetilo. La capa orgánica inferior se retiró por drenaje y se precipitó ácido 4-(N-(bromoacetil)amino)-benzoico (BRCA) directamente de la solución por sí mismo. Siguiendo el resto del procedimiento para GSM de forma exacta usando BRCA (2,58 g, 10 mmol) en lugar de BRAA se dio GSCA en forma de un sólido de color blanco después de la evaporación rotatoria. El GSCA se caracterizó por ^{1}H RMN (D_{2}O, 300 MHz) y ^{13}C RMN (D_{2}O 75 MHz) y la sal disódica tiene un peso molecular de 528.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de biotina y derivados de fluoresceína de GSAO y GSAA
Se produjo GSAO-B como se describe por Donoghue et al. (2000) y tiene un peso molecular de 1001. Se añadió una solución de fluorescein-5-EX succinimidil éster (Molecular Probes, Eugene, OR) (2,4 mg, 4,1 \mumol) en DMSO (240 \mul) a GSAO o GSM (33,8 mM) en tampón Mes, pH 5,5 (5 mM, 473 \mul), la mezcla se diluyó con tampón bicarbonato, pH 9 (0,5 M, 3,287 ml) y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 80 min. Después, la reacción se diluyó con glicina (100 mM) en PBS (4 ml) y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante una noche La solución final contenía arsénico trivalente (2,0 mM) y glicina (50 mM). La proporción molar de fluorescein-5X a GSAO o GSAA era \sim1,5:1. Los pesos moleculares de GSAO- y GSAA-fluoresceína (GSAO-F y GSAA-F) son 1024 y 1040, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de ácido 2-(2-bromoacetil-o-amino)bencenoarsónico
Se disolvió ácido o-arsanílico (4,70 g, 21,7 mmol) en KOH 1,85 M (25 ml) y después se hizo reaccionar con Na_{2}CO_{3} (6 g) y se diluyó con H_{2}O (25 ml). La solución se enfrió en hielo durante 30 min y después se añadió a un embudo de decantación de 250 ml. Al embudo de decantación se le añadió cuidadosamente una solución de bromuro de bromoacetilo (4 ml, 46,0 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (20 ml) durante aproximadamente 30 min con agitación frecuente y liberación de CO_{2} (g). Después de que cesara el desprendimiento de CO_{2}, el CH_{2}Cl_{2} se separó y la capa acuosa se acidificó con H_{2}SO_{4} conc. Se produjo como resultado un precipitado de color blanco que se recogió por filtración
(6 g, 82% de rendimiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de ácido 2-(2-bromoacetil-o-amino)bencenoarsonoso
Se disolvió ácido 2-(2-bromoacetilamino)bencenoarsónico (6 g, 17,8 mmol) en HBr/MeOH (1:1), se añadió NaI (80 mg) y la reacción se purgó con N_{2} y se enfrió a 0ºC. Se burbujeó SO_{2} a su través a aprox. 4 burbujas/segundo y después de 15 min comenzó a formarse un precipitado de color blanco. Se burbujeó SO_{2} a su través durante 2,5 h más según se calentaba la reacción a temperatura ambiente. La reacción se purgó con N_{2} durante 10 min y el sólido se recogió por filtración lavando con H_{2}O (x 3) y éter (x 2) para dar 1,35 g de ácido 2-(2-bromoacetilamino)bencenoarsonoso. Se obtuvieron 0,25 g más a partir del filtrado inicial. Rendimiento total (1,60 g, 28%).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsónico
Se disolvió ácido p-arsanílico (20 g, 92 mmol) en KOH 1,85 M (100 ml) y después se trató con Na_{2}CO_{3} (30 g) y H_{2}O (100 ml). La solución se enfrió en hielo durante 30 min y después se añadió a un embudo de decantación de 500 ml. Al embudo de decantación se le añadió cuidadosamente una solución de bromuro de bromoacetilo (18 ml, 184 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (60 ml) con agitación frecuente y liberación de CO_{2} (g). La adición duró aproximadamente 2 h. Después de que cesara el desprendimiento de CO_{2} (g), el CH_{2}Cl_{2} se separó y la capa acuosa se acidificó con H_{2}SO_{4} al 98%. Se produjo como resultado un precipitado de color blanco que se recogió por filtración y se secó durante 18 h en un desecador. Se obtuvieron 24 g (72 mmol, 78% de rendimiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
Se disolvió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsónico (15 g, 45 mmol) en 150 ml de HBr al 48% (ac.)/
MeOH (1:1). Se añadió NaI (200 mg, 13 mmol) y la reacción se purgó con N_{2} y se enfrió sobre hielo. Se burbujeó SO_{2} (g) a su través a aprox. 2 burbujas/segundo y después de 5 h comenzó a formarse un precipitado de color blanco. Se burbujeó SO_{2} (g) a su través durante 2 h más según se calentaba la reacción a 25ºC. La reacción se purgó con N_{2} durante 10 min y el sólido se recogió por filtración lavando con H_{2}O (x 3) y éter (x 2) para dar 1,35 g de ácido 2-(2-bromoacetilamino)bencenoarsonoso. Se obtuvieron 5,5 g (17 mmol, 38% de rendimiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de NH_{2}-Glu-Cys-(CH_{2}CONH-C_{6}H_{4}-o-As{OH}_{2})-Gly-OH "o-GSAO" (1)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetilamino)bencenoarsonoso (288 m, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (5 ml). Se añadió Net_{3} (250 \mul, 1,7 mmol) seguido de glutatión (160 mg, 0,521 mmol). Se confirmó que el pH de la mezcla de reacción era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 20 h. La reacción se filtró a través de un filtro vitrificado y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. El sobrenadante se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se decantó y se secó adicionalmente al vacío. El o-GSAO polvoriento seco se disolvió en H_{2}O (4 ml) y se inyectó en la HPLC semi-preparativa, columna C_{18} Vydac Protein & Peptide. Tampón A: TFA al 0,1% en agua filtrada y desgasificada, Tampón B: TFA al 0,1% en acetonitrilo filtrado y desgasificado-agua filtrada y desgasificada (9:1). Las fracciones se recogieron y se liofilizaron. La estructura de o-GSAO se confirmó por LC-MS (M^{+} 548,4) y por ^{1}H RMN. La pureza por HPLC fue de 96,9% a 98,8% para 4 extracciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de retro-HO-Cys-(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-carbonil-Glu-OH (3)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (80 mg, 0,25 mmol) en H_{2}O desgasificado (2 ml). Se añadió Net_{3} (70 \mul, 0,5 mmol) seguido de retro-HO-Cys-carbonil-Glu-OH (50 mg, 0,17 mol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el
speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de retro-HO-Cys-(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-carbonil-Glu-OH (4)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (80 mg, 0,25 mmol) en H_{2}O desgasificada (2 ml). Se añadió HEU (70 \mul, 0,5 mmol) seguido de retro-HO-Cys-carbonil-Glu-OH (50 mg, 0,17 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 18 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el
speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de H-Arg-Gly-Asp-Cys(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-OH (6)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (80 mg, 0,25 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió Net_{3} (70 \mul, 0,5 mmol) seguido de H-Arg-Gly-Asp-Cys-OH (50 mg, 0,11 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el
speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de H-Gly-Gly-Cys(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-OH (7)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió Net_{3} (220 \mul, 1,6 mmol) seguido de H-Gly-Gly-Cys-OH (141,2 mg, 0,8 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el
speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de H-Val-Thr-Cys(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-Gly-OH (8)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (80 mg, 0,25 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió Net_{3} (70 \mul, 0,5 mmol) seguido de H-Val-Thr-Cys-Gly-OH (50 mg, 0,13 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de H-Cys-(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-OH (9)
Reducción de ácido preslonoico: disolver el péptido en 10 ml de bicarbonato sódico 0,1 M, solución de DTT (99 mg, 0,65 mmol) desgasificada con N_{2}. Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8 y proteger la mezcla con N_{2}. Después de 2 h, acidificar la solución con AcOH y liofilizar la mezcla. Purificar por RP-HPLC semi-preparativa después de disolver en una solución acuosa al 0,1% de TFA. Liofilizar.
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (26 mg, 0,081 mmol, 14 equiv.) en H_{2}O desgasificada (3 ml). Se añadió Net_{3} (20 \mul, 0,14 mmol) seguido de ácido preslonoico (22 mg, 0,028 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 18 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el nitrato se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,0 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de ácido 3-S-(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-1-propanosulfónico (10)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió Net_{3} (220 \mul, 1,6 mmol) seguido de ácido 3-mercaptopropanosulfónico (108,9 mg, 0,6 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de ácido 3-S-(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-1-propiónico (11)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió Net_{3} (210 \mul, 1,5 mmol) seguido de ácido mercaptopropiónico (53 \mul, 0,6 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH 8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de ácido 1-S-(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-mercaptosuccínico (13)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió Net_{3} (210 \mul, 1,5 mmol) seguido de ácido mercaptosuccínico (90 mg, 0,6 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 15 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de 1-S-(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-\beta-D-glucosa (14)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (288 mg, 0-90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió Net_{3} (210 \mul, 1,5 mmol) seguido de 1-tio-\beta-D-glucosa (130,9 mg, 0,6 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de 3-S-(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-1,2-propanodiol (15)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió Net_{3} (210 \mul, 1,5 mmol) seguido de 3-mercapto-1,2-propanodiol (65 \mul, 0,6 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,5 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de ácido 5-S-(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-p-As{OH}_{2})-1-tetrazolacético (21)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso (288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (5 ml). Se añadió Net_{3} (210 \mul, 1,5 mmol) seguido de ácido 5-mercapto-tetrazolacético (110 mg, 0,6 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el
speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de H-Gly-Gly-Cys(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-o-As{OH}_{2})-OH (22)
Se suspendió ácido 2-(2-bromoacetil-o-amino)bencenoarsonoso (180 mg, 0,5 mmol) en H_{2}O desgasificada (1 ml). Se añadió Net_{3} (140 \mul, 1,0 mmol) seguido de H-Gly-Gly-Cys-OH (61 mg, 0,26 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 20 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de H-Val-Thr-Cys(CH_{2}CONHC_{6}H_{4}-o-As{OH}_{2})-Gly-OH (23)
Se suspendió acido 2-(2-bromoacetil-o-amino)bencenoarsonoso (80 mg, 0,25 mmol) en H_{2}O desgasificada (1 ml). Se añadió Net_{3} (70 \mul, 0,50 mmol) seguido de H-Val-Thr-Cys-Gly-OH (50 mg, 0,13 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2} durante 20 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por RP-HPLC semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de concentración de arsénico
Las concentraciones de GSAO, GSAO-B y GSAO-F se midieron por valoración con dimercaptopropanol y calculando los tioles libres restantes con ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (Sigma, St Louis, MO) (Donoghue et al., 2000). Los conjugados se filtraron mientras permanecían estériles y se almacenaron a 4ºC en la oscuridad hasta su uso. No hubo ninguna pérdida significativa en la concentración activa de soluciones madre de los arsenicales durante al menos una semana cuando se almacenaron en estas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 El GSAO desencadenaba la apertura de MTP por reacción con y alteración del ANT Métodos Ensayo de hinchamiento de mitocondrias
Se aislaron mitocondrias de los hígado de ratas Wistar macho de \sim250 g usando centrifugación diferencial como se ha descrito anteriormente (Schnaitman y Greenawalt, 1968). El sedimento mitocondrial final se resuspendió en tampón HEPES-KOH 3 mM, pH 7,0 que contenía manitol 213 mM, sacarosa 71 mM y succinato de sodio 10 mM a una concentración de 30 mg de proteína por ml. La inducción de MPT se evaluó espectrofotométricamente suspendiendo las mitocondrias de hígado a 0,5 mg de proteína por ml a 25ºC en tampón HEPES-KOH 3 mM, pH 7,0, que contiene manitol 75 mM, sacarosa 250 mM, succinato de sodio 10 mM y rotenona 2 \muM. Todos los componentes de tampón eran de Sigma, St Louis, MO. Los derivados arsenicales y el GSCA se disolvieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene glicina 100 mM. Los compuestos de unión a ANT empleados eran CsA, BKA y ADP (Sigma, St. Louis, MO). Las concentraciones de reactivo se indican en las leyendas de la figuras. Se midió el hinchamiento por control de la disminución asociada de la dispersión de luz a 520 nm usando un lector de microplacas Molecular Devices Thermomax Plus (Palo Alto, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Unión de GSAO a ANT
Se suspendieron mitocondrias de hígado de rata a 1 mg de proteína por ml a 25ºC en tampón HEPES-KOH 3 mM, pH 7,0 que contenía manitol 213 mM, sacarosa 71 mM y succinato de sodio 10 mM y se incubaron con GSAO-B 100 \muM en ausencia o presencia de 2,3-dimercaptopropanol 400 \muM (Fluka, Buchs, SG, Suiza) a temperatura ambiente en una rueda giratoria durante 1 h. Las mitocondrias marcadas se lavaron tres veces con PBS y se sonicaron en 0,3 ml de tampón Tris 25 mM, pH 7,4 enfriado en hielo que contenía NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Triton X-100 a 0,5%, Tween-20 a 0,05%, leupeptina 10 \muM, aprotinina 10 \muM, fluoruro de 4,2- (aminoetil)-benceno sulfonilo 50 \mug.ml^{-1} y EDTA 5 mM. El lisado se aclaró por centrifugación a 18000 g durante 10 min a 4ºC y se incubó con 30 \mul de estreptavidina-Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) durante 60 min a 4ºC en una rueda giratoria para aislar las proteínas marcadas con biotina. Las perlas se lavaron 5 veces con tampón de sonicación y las proteínas marcadas con biotina se liberaron de las perlas por ebullición en 30 \mul de tampón SDS-Laemmli durante 2 minutos. Las muestras se resolvieron en iGels de gradiente de 8-16% en condiciones reductoras y se transfirieron a una membrana de PVDF. Las proteínas se detectaron mediante transferencia de Western usando una dilución 1:500 de anticuerpo policlonal de cabra anti-ANT humano (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y una dilución 1:2000 de anticuerpos de conejo anti-cabra conjugados con peroxidasa (Dako, Carpinteria, California).
\vskip1.000000\baselineskip
Marcaje de ANT con eosin-5-maleimida
Se prepararon partículas submitocondriales de hígado de rata por sonicación y centrifugación diferencial de acuerdo con Majima et al. (1998). Las partículas se suspendieron a 20 mg de proteína por ml en tampón Tris 10 mM pH 7,2 que contenía sacarosa 250 mM y EDTA 0,2 mM y se incubaron sin o con GSAO 200 nmol por mg de proteína durante 10 min a 25ºC, seguido de 20 nmol de eosin-5-maleimida por mg de proteína durante 1 min a 0ºC en la oscuridad. El marcaje se terminó por adición de 10 \mumol de ditiotreitol por mg de proteína. Las proteínas se resolvieron en iGels de gradiente de 4-20% y el ANT marcado con eosina se visualizó por transiluminación UV usando un Fluor-S^{TM} Multilmager (Bio-Rad, Hercules, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
El GSAO (Fig. 1A) desencadenaba el hinchamiento de mitocondrias de hígado de rata aisladas (Fig. 1B). La velocidad de hinchamiento aumentaba con el aumento de la concentración de GSAO y del tiempo de incubación. El resto arsenical trivalente de GSAO era responsable de su actividad ya que los compuestos arsenical pentavalente (ácido 4-(N-((S-glutationil)acetil)amino)bencenarsénico, GSAA) o de ácido carboxílico (ácido 4-(N-((S-glutationil)acetil)amino)benzoico, GSCA) correspondientes (Fig. 1A) no tenían efecto (Fig. 1Bii). Los controles positivos para apertura de poros eran iones Ca2+ y Pi (Fig. 1Bi) y PAO (Fig. 1Bii).
La actividad de ANT se controla por la unión de Ca2+, ciclofilina D y nucleótidos de adenina. La ciclofilina D (Crompton et al., 1988) y los nucleótidos de adenina (Haworth y Hunter, 1979a,b) se unen al lado de la matriz de ANT mientras que aún no se ha determinado el sitio o sitios para la interacción de Ca^{2+}. El desencadenamiento primario para la apertura del MPTP es un aumento en la concentración de Ca^{2+} en la matriz. La quelación de Ca^{2+} con EGTA bloquea la apertura del poro. La especificidad del sitio de desencadenamiento para Ca^{2+} parece ser absoluta ya que otros iones de metales divalentes tales como Mg^{2+} actúan como inhibidores (Haworth y Hunter, 1979a). La unión de ciclofilina D a ANT es necesaria para la apertura de poros a concentraciones de Ca^{2+} submilimolares (Halestrap et al., 2002). La ciclosporina A (CsA) bloquea la apertura de poros por unión a ciclofilina D y desplazamiento de la misma del ANT (Crompton et al., 1988). El ADP de la matriz también es un modulador importante de la apertura de poros que se une a ANT y disminuye la sensibilidad del sitio de desencadenamiento a Ca^{2+} (Haworth y Hunter, 1979a,b). El ácido bonkrékico (BKA) también interacciona con ANT y disminuye la sensibilidad a Ca^{2+} (Hunter y Haworth, 1979).
El Mg^{2+}, EGTA, CsA, ADP y BKA bloquean todos el efecto del GSAO sobre la apertura de poros (Fig. 1Biii). Estas observaciones concuerdan con un efecto específico del GSAO sobre la apertura de poros y confirman al ANT como su diana.
El semi-tiempo para el hinchamiento de la mitocondria mediado por GSAO se redujo por Ca^{2+} añadido (Fig. 1C). Este resultado concuerda con que el GSAO entrecruza dos de los tres restos cisteína en el ANT que sobresalen hacia la matriz mitocondrial.
La interacción directa del ANT con un GSAO marcado con biotina (fenilarsenóxido de 4-(N-(S-(N-(6-((6-((bioti-
noil)amino)hexanoil)amino)hexanoil)-glutationil)acetil)amino), GSAO-B, se muestra en la Figura 1D. El marcaje de ANT con GSAO-B era específico ya que presentaba competición con un exceso molar de 4 veces del ditiol sintético pequeño, dimercaptopropanol. La eosina-maleimida alquila la Cys^{160} en el ANT (Majima et al., 1998) y bloquea la unión a ADP (Halestrap et al., 1997). El GSAO competía por la alquilación por eosina-maleimida de la Cys^{160} del ANT (Fig. 1E), que implicaba que el GSAO entrecruza Cys^{160} y Cys^{257}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 El GSAO se concentraba en mitocondrias en células viables Métodos Cultivo Celular
Se cultivaron células endoteliales aórticas bovinas (BAE) (ATCC, Rockville, MD) en DMEM complementado con suero fetal de ternera a 10% (FCS), L-glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina 5 U.ml^{-1} (Gibco, Galthersburg, MD). La línea celular endotelial microvascular humana, HMEC-1 (Ades et al., 1992), se cultivó en medio MCDB131 (Gibco) complementado con FCS al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina 5 U.ml^{-1}, factor de crecimiento epidérmico 10 ng.ml^{-1} (Sigma, St. Louis, MO) e hidrocortisona 1 \mug.ml^{-1} (Sigma). Se adquirió material de plástico de cultivo de células en Coming Costar (Corning, NY). La solución de tripsina/EDTA era de Gibco.
\vskip1.000000\baselineskip
Inmunocitoquímica y microscopía confocal
Se sembraron células BAE a una densidad de 10^{4} células por pocillo en portaobjetos de cámara de vidrio Labtek de 8 pocillos (Nunc, Naperville, IL) y se dejó que se adhirieran durante una noche. Las células se lavaron una vez y el medio se sustituyó con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (Gibco). Las células se incubaron después durante 1 h con GSAO-F 50 \muM, GSAO-F 50 \muM y dimercaptopropanol 250 \muM o GSAA-F 50 \muM. Todas las células se contratiñeron con Mitotracker^{TM} Red CMXRos 100 nM (Molecular Probes, Eugene, OR). Las células se lavaron después tres veces con HBSS, se fijaron durante 10 min con acetona a 80% y metanol a 20% y se lavaron tres veces con HBSS. Los portaobjetos se montaron en agente protector de fluorescencia VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se sellaron con laca de uñas. Las imágenes se capturaron usando un microscopio invertido Leica DM IRB y un sistema confocal con el programa informático confocal de Leica.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
Una característica sorprendente del GSAO era que se localizaba rápidamente en mitocondrias en células endoteliales microvasculares aórticas bovinas (BAE) (Figura 2) y dérmicas humanas (HMEC-1) (no se muestran los datos). El GSAO se conjugó con fluoresceína (GSAO-F) y se determinó su localización subcelular por microscopía de fluorescencia confocal. La tinción mitocondrial se confirmó por colocalización de GSAO-F con la sonda Mitotracker roja fluorescente que se acumula en la mitocondria de células con respiración activa (Figuras 2ii, iv y vi). La acumulación mitocondrial de GSAO-F era específica para la reactividad ditiol del GSAO ya que se suprimía en presencia de un exceso molar de cinco veces del ditiol sintético pequeño dimercaptopropanol (Figura 2iii) y el arsenical pentavalente correspondiente, GSAA-F, no teñía las células (Figura 2v). La localización mitocondrial también se observó en células BAE incubadas con GSAO-B seguido de tinción con estreptavidina-Alexa Fluor 488 (no se muestran los datos).
El ANT es abundante en la membrana mitocondrial interna. El secuestro de GSAO en el lado de la matriz del ANT dirigiría la importación entrópica del GSAO hacia la matriz. Este mecanismo se confirma por el descubrimiento de que el GSAA, que tiene de hecho la misma carga y tamaño que el GSAO, no reacciona con el ANT ni se acumula en la mitocondria.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 El GSAO inhibía la producción de ATP, aumentaba los niveles de superóxido y desencadenaba la despolarización mitocondrial y la apoptosis en células endoteliales en proliferación pero no de crecimiento en estado quiescente Métodos Ensayos de ATP
Se detuvieron células BAE en placas de cultivo de seis pocillos durante 24 h en suero a 0,5% o se dejaron en suero a 10%, después se trataron durante 24 h con GSAO 0, 60 ó 150 \muM. Las células se lavaron una vez, después se resuspendieron en PBS a 0,4 ml que contenía albúmina de suero bovino a 0,3%. Una muestra de 50 \mul de células se mezcló con 50 \mul de agua y 100 \mul de agente liberador de ATP (Sigma) y se midió la concentración de ATP usando una mezcla de ensayo de ATP con luciferina/luciferasa. Las unidades de luz se convirtieron a concentraciones de ATP usando un patrón de ATP en lugar de los 50 \mul de agua. Se realizó un recuento del número de células usando un contador Beckman Coulter y los moles de ATP se expresaron por millón de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayos de proliferación celular
Se sembraron células BAE o HMEC-1 a una densidad de 10^{4} células por célula en placas de 96 pocillos y se dejó que se adhirieran durante una noche y después se trataron como se indica. Para los experimentos que implicaban la detención de la proliferación celular en suero a 0,25%, las células se sembraron en medio que contenía suero a 10%, se dejó que se adhirieran durante una noche, después se lavaron con PBS y se detuvieron durante 24 h en medio que contenía suero a 0,25%. Las células que permanecían unidas después de los tratamientos se midieron usando azul de metileno (Oliver et al., 1989).
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayos de superóxido, potencial de membrana mitocondrial, masa mitocondrial y apoptosis
Para mediciones de niveles de superóxido con dihidroetidina, potencial de membrana mitocondrial con JC-1, masa mitocondrial con naranja de nonil acridina y apoptosis con anexina V, se trataron células BAE en proliferación o de crecimiento en estado quiescente durante 24 o 48 h con GSAO en placas de cultivo de seis pocillos, después se despegaron con tripsina/EDTA, se lavaron una vez y se resuspendieron a 2 x 10^{6} células por ml en medio sin suero. Después las células se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente con dihidroetidina (5 \muM, Molecular Probes) o 30 min a temperatura ambiente con JC-1 (0,5 \mug.ml^{-1}, Molecular Probes), anexina V-FITC (50 \mul.ml^{-1}) (Pharmingen, La Jolla, CA, Estados Unidos) o 10-nonil bromuro de naranja de acridina (5 \muM, Molecular Probes). Después las células se lavaron una vez, se resuspendieron en 0,5 ml de medio sin suero, se transfirieron a hielo y se cuantificó la fluorescencia inmediatamente por citometría de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
El GSAO se concentraba en mitocondrias en células viables y alteraba la función mitocondrial y la viabilidad celular. Teniendo las células en proliferación una mayor masa mitocondrial y respiración que las células de crecimiento en estado quiescente. Para ensayar si el GSAO podía tener efectos selectivos sobre células en proliferación, se incubaron células BAE en proliferación o de crecimiento en estado quiescente durante 48 h con concentraciones crecientes de GSAO.
Las CI_{50} de GSAO para la reducción de la viabilidad de células BAE en proliferación era de \sim75 \muM (Figura 3Ai), mientras que el compuesto tenía escaso efecto sobre células de crecimiento en estado quiescente. Los compuestos de control, GSAA y GSCA, no tenían efectos significativos sobre la viabilidad de células BAE en proliferación a concentraciones de hasta 1,0 mM (no se muestran los datos). El efecto del GSAO sobre la viabilidad células en proliferación dependía del tiempo. La CI_{50} del GSAO disminuía de \sim75 \muM a \sim25 \muM cuando el tiempo de incubación aumentaba de 48 a 72 h (no se muestran los datos). El PAO, por el contrario, era igualmente tóxico para células BAE tanto en proliferación como de crecimiento en estado quiescente con una CI_{50} de \sim200 nM (Figura 3A(ii)). Los mismos resultados se observaron con células HMEC-1 (no se muestran los datos). El efecto del GSAO sobre la viabilidad de células endoteliales en proliferación estaba estrechamente asociado con la pérdida de potencial transmembrana mitocondrial y apoptosis (Figura 3B). Estos parámetros se midieron usando el colorante JC-1 y anexina V conjugada con FITC, respectivamente. La proporción de distribución de JC-1 entre el citosol (fluorescencia verde) y la mitocondria (fluorescencia roja) refleja el potencial transmembrana mitocondrial (Smiley et al., 1991), mientras que la anexina V se une a la fosfatidilserina expuesta en la superficie de células apoptóticas.
La unión de GSAO a ANT en células endoteliales en proliferación afectaba a la producción de ATP. El contenido de ATP de células BAE en proliferación era aproximadamente el doble que el de células de crecimiento en estado quiescente y la incubación con GSAO 150 \muM durante 24 h reducía los niveles de ATP en células en proliferación hasta el de células de crecimiento en estado quiescente (Figura 4ai). Este resultado refleja los efectos selectivos del GSAO sobre la viabilidad de células en proliferación (Figura 4ai). Para confirmar que el ATP celular disminuido se debía a un efecto del GSAO sobre la síntesis de ATP mitocondrial más que a la biogénesis mitocondrial, se midió la masa mitocondrial usando naranja de nonil acridina. El colorante se une a cardiolipina en la membrana mitocondrial (Petit et al., 1992). La masa mitocondrial de células en proliferación era aproximadamente el doble que la de células de crecimiento en estado quiescente, que no cambiaba por tratamiento con GSAO (Figura 4aii).
A altas concentraciones, las especies de oxígeno reactivo tales como anión superóxido (O_{2}) pueden detener la proliferación celular e inducir la apoptosis. Para ensayar el efecto del GSAO sobre los niveles celulares de O_{2}, se trataron células BAE durante 24 h con GSAO y se midieron los niveles celulares de O_{2} y H_{2}O_{2} usando los colorantes dihidroetidio y CM-H_{2}-DCFDA, respectivamente. Los niveles celulares de O_{2-} aumentaban linealmente con la concentración de GSAO en células BAE en proliferación pero no en las de crecimiento en estado quiescente (Figura 4b). Este efecto del GSAO no se debía a la inhibición de la actividad de la SOD ya que solo había una pequeña disminución en los niveles de H_{2}O_{2} (Figura 4c). Por ejemplo, el tratamiento con GSAO 120 \muM durante 24 h dio como resultado una disminución de 30% en H_{2}O_{2} pero un aumento de 100% en el nivel de O_{2}. Este descubrimiento se confirmó usando un análisis citométrico de flujo de dos canales de los niveles celulares de O_{2} y H_{2}O_{2}. Los niveles de O_{2} se aumentaron en la mayoría de las células sin una disminución correspondiente en el H_{2}O_{2} (no se muestran los datos). Por el contrario, el GSAA no tenía efecto sobre los niveles de O_{2} o H_{2}O_{2}. El aumento lineal en los niveles de O_{2} con tratamiento con GSAO concuerda con una alteración de la integridad mitocondrial.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 El GSAO desencadena la liberación de Citocromo C desde la mitocondria Métodos
Se suspendieron mitocondrias de hígado de rata a 1 mg de proteína por ml a 25ºC en tampón HEPES 3 mM, pH 7,0 que contenía manitol 75 mM, sacarosa 250 mM, succinato de sodio 10 mM y rotenona 2 \muM y se trataron con los compuestos de unión a ANT durante de 0 a 60 min. Las concentraciones de reactivo se indican en las leyendas de las figuras. Las mitocondrias en 0,25 ml de reacción se sedimentaron por centrifugación a 8000 g durante 5 min y los sobrenadantes se concentraron 10 veces por ultrafiltración a través de una membrana Microcon YM-3 (Millipore, Bedford, MA). Los sobrenadantes concentrados se resolvieron en iGels de gradiente de 8-16% de Gradipore (Sydney, Australia) en condiciones no reductoras y se transfirieron a una membrana de PVDF. Las proteínas se detectaron mediante transferencia de Western usando anticuerpos policlonales anti- citocromo c humano (Producto 556433, BD Pharmingen) y anticuerpos anti-conejo conjugados con peroxidasa (Dako, Carpinteria, California). Se analizaron películas de quimioluminiscencia usando un densitómetro de formación de imágenes GS-700 y el programa informático Multi-Analyst (Bio-Rad, Hercules, California).
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
La incubación de mitocondrias aisladas con GSAO desencadenaba la liberación dependiente del tiempo de Citocromo C hacia el medio (Figura 5A). El ligando de ANT, la ciclosporina A, inhibía parcialmente esta liberación (Figura 5B).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Efecto del GSAO y análogos relacionados sobre la inducción de la transición de poro mitocondrial Métodos
La exploración se realizó usando mitocondrias de hígado de rata congeladas durante 1 ó 2 días a -80ºC después del aislamiento. El hinchamiento de las mitocondrias se midió por control de la disminución de la dispersión de luz a 520 nm usando un lector de microplacas.
En todos los experimentos se determinó el tiempo necesario para un hinchamiento semimáximo para cada compuesto. Después, se calcularon las velocidades de hinchamiento y se compararon con el GSAO. El aumento de la velocidad de hinchamiento en comparación con el GSAO se calculó de la forma siguiente:
Factor de aumento de hinchamiento = Velocidad de hinchamiento_{\text{(análogo de GSAO)}} / Velocidad de hinchamiento_{(GSAO)}
Los resultados se resumen en la Tabla 1 y se presentan en la Figura 6.
TABLA 1 Efecto del GSAO y análogos relacionados sobre la inducción de MPTP
22 
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los compuestos se ensayaron al menos 2 veces en preparaciones mitocondriales diferentes para determinar sus propiedades de inducción de MPTP, excepto el compuesto 15 que se ensayó solamente una vez.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
Todos los compuestos mostraban una actividad de inducción similar o mejor que el GSAO. Los compuestos más activos eran el 1, 4, 22 y 23, que mostraban una actividad aumentada respecto al GSAO que variaba de 5,4 a 16,3 veces (Tabla 1; Figura 6). Para la inducción de MPTP, como para la actividad antiproliferativa sobre células BAE, los compuestos de orto-arsenóxido (1, 4, 22 y 23) tenían una actividad aumentada respecto a los compuestos de para-arsenóxido correspondientes (GSAO, 3, 7 y 8, respectivamente).
Se presenta una comparación de la inducción de MPTP frente al peso molecular de los compuestos en la Figura 7.
Se presenta una comparación de la inducción de MPTP frente al Log P del compuesto ensayado en la Figura 8.
La actividad antiproliferativa del GSAO y análogos relacionados se comparó con la capacidad de esos compuestos para inducir la MPT. Los resultados se presentan en la Figura 9. Los compuestos que mostraban una actividad aumentada respecto al GSAO en ambos ensayos eran los compuestos de orto-arsenóxido 1, 4, 22 y 23.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 Comparación de GSAO y o-GSAO - Ensayo de Hinchamiento Mitocondrial Método
Se aislaron mitocondrias a partir de los hígados de ratas Wistar macho de \sim250 g usando centrifugación diferencial como se ha descrito anteriormente (Don et al., 2003). El sedimento mitocondrial final se resuspendió en tampón HEPES-KOH 3 mM, pH 7,0 que contenía manitol 213 mM, sacarosa 71 mM y succinato de sodio 10 mM a una concentración de 30 mg de proteína por ml. Se evaluó la inducción de transición de permeabilidad mitocondrial espectrofotométricamente por suspensión de las mitocondrias de hígado a 0,5 mg de proteína por ml a 25ºC en tampón HEPES-KOH 3 mM pH 7,0 que contenía manitol 75 mM, sacarosa 250 mM, succinato de sodio 10 mM y rotenona 2 mM. El hinchamiento se midió por control de la disminución asociada de la dispersión de luz a 520 nm usando un lector de microplacas.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
El semi-tiempo para el hinchamiento máximo de mitocondrias aisladas era 3-5 veces más rápido para una concentración dada de o-GSAO en comparación con GSAO (Figura 10). De hecho, el o-GSAO era casi tan eficaz como el PAO lipófilo en la inducción de la transición de permeabilidad mitocondrial (Figura 17D).
La formación de poros por el ANT está controlada por la unión de Ca^{2+}, ciclofilina D y nucleótidos de adenina en condiciones fisiológicas. El desencadenamiento primario para la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial es un aumento en la concentración de Ca^{2+} en la matriz. La quelación de Ca^{2+} con EGTA bloquea la apertura de poros, al igual que un exceso de otros iones de metales divalentes tales como Mg^{2+}. Tanto el EGTA como el Mg^{2+} bloquearon el hinchamiento dependiente de GSAO (Figura 11). La unión de ciclofilina D a ANT es necesaria para la apertura de poros a concentraciones de Ca^{2+} submilimolares. La ciclosporina A (CsA) bloquea la apertura de poros por unión a ciclofilina D y desplazamiento de la misma del ANT. Además, el ADP inhibe la apertura de poros por unión a ANT y disminución de la sensibilidad del sitio de desencadenamiento a Ca^{2+}. El CsA y el ADP bloqueaban el efecto del o-GSAO sobre la apertura de poros (Figura 12).
\vskip1.000000\baselineskip
Bibliografía
Ades, E. W., Candal, F. J., Swerlick, R. A., George, V. G., Summers, S. Bosse, D. C., y Lawley, T. J. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J. Invest. Dermatol. 99, 683-890, 1992.
Carmeliet, P. y Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 407, 249-257, 2000.
Crompton, M. The mitochondiial permeability transition pore and its role in cell death. Biochem. J. 341, 233-249, 1999.
Crompton, M.; Costi, A. y Hayat, L Evidence for the presence of a reversible Ca^{2+}-dependent pore activated by oxidative stress in heart mitochondria. Biochem. J. 248, 915-918, 1987.
Crompton, M., Ellinger, H. y Costi, A. inhibition by cyclosporin A of a Ca^{2+} dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress. Biochem. J. 255, 357-360, 1988.
Donoghue, N., Yam, P. T. W., Jiang, X., y Hogg, P. J. Presence of closely spaced protein thiols on the surface of mammalian cells. Protein Sci. 9, 2438-2445, 2000. Folkman, J. Angiogenesis and its inhibitors. En Important Advances in Oncology, DeVita, V. T., Hellman, S., y Rosenbeig, S., eds. (J. B. Lippincott Company, PD) págs. 42-62, 1985.
Halestrap, A. P., McStay, G. P., Clarke, S. J. The permeability transition pore complex: another view. Biochimie 84, 153-66, 2002.
Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y. y Connem, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. J. Biol. Chem, 272, 3346-3354, 1997.
Hanahan, D. y Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumourigenesis. Cell 86, 353-364, 1996.
Haworth, R. A. y Hunter, D. R. Control of the mitochondrial permeability transition pore by high-affinity ADP binding at the ADP/ATP translocase in permeabilized mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr. 32, 91-96, 2000.
\newpage
Haworth, R. A. y Hunter, D. R. The Ca^{2+}-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca^{2+} trigger site. Arch. Biochem. Biophys. 195, 460-467, 1979.
Holmgren, L, O'Reilly, M.S., y Folkman, J. Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression. Nature Med. 1,149-153, 1995.
Hunter, D. R, y Haworth, R. A. The Ca^{2+}-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch. Biochem. Biophys. 195, 453-459, 1979.
Majima, E. Yamaguchi, N., Chuman, H., Shinohara, Y., Ishida, M., Goto, S. y Terada, H. Binding of the fluorescein derivative eosin Y to the mitochondrial ADP/ATP carrier: characterization of the adenine nucleotide binding site. Biochemistry 37, 424-432, 1998.
Nguyen, M., Shing, Y., y Folkman, J. Quantitation of angiogenesis and antiangiogenesis in the chick embryo chorioallantoic membrane. Microvascular Res. 47, 31-40, 1994.
Oliver, M. H., Harrison, N. K., Bishop, J. E, Cole, P. J., y Laurent, G. J. A rapid and convenient assay for counting cells cultured in microwell plates: application for assessment of growth factors. J. Cell Sci. 92, 513-518, 1989.
O'Reilly, M.S., Boehm, T., Shing, Y., Fukai, N., Vaslos, G., Lane, W. S., Flynn, E., Birkhead, J. R., Olsen, B. R., y Folkman J. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumour growth. Cell 88, 277-285, 1997.
Petit, J. M., Maftah, A., Ratinaud, M. H., y Julien, R. 10N-nonyl acridine orange interacts with cardiolipin and allows the quantification of this phospholipid in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 209, 267-273, 1992.
Schnaitman, C. y Greenawalt, J. W. Enzymatic properties of the inner and outer membranes of rat liver mitochondria. J. Cell Biol. 38, 158-75, 1968.
Smiley, S. T., Reers, M., Mottola-Hartshom, C., Lin, M, Chen, A., Smith, T. W., Steele, G. D., y Chen, L. B. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3671-3675, 1991.
Vanden Hoek, T. L., Becker, L. B., Shao, Z., Li C., y Schumacker, P. T. Reactive oxygen species released from mitochondria during brief hypoxia induce preconditioning in cardiomyocytes. J. Biol. Chem. 29, 18092-18098, 1998.
Zanetti, M., Zwacka, R. M., Engelhardt, J. F., Katusic, Z. S., y O'Brien, T. Superoxide anions and endothelial cell proliferation in normoglycemia and hyperglycemia. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21, 195-200, 2001.

Claims (25)

1. Un proceso in vitro para identificar un compuesto que induzca selectivamente la transición de permeabilidad mitocondrial (MPT) en células en proliferación, donde dicho proceso comprende poner en contacto una célula o extracto celular con un compuesto, determinar si el compuesto se une al translocador de nucleótidos de adenina (ANT) y determinar si el compuesto induce selectivamente la MPT en células en proliferación.
2. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 1 para explorar una pluralidad de compuestos para identificar un compuesto que induzca selectivamente la MPT en células en proliferación, donde dicho proceso comprende poner en contacto una célula o un extracto celular con la pluralidad de compuestos, determinar si cualquiera de los compuestos se une a ANT y, si es así, determinar por separado para cada uno de la pluralidad de compuestos si el compuesto induce selectivamente la MPT en células en proliferación.
3. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la selectividad por células en proliferación se determina por comparación del efecto de compuestos que se ha identificado que se unen a ANT sobre la MPT en células en proliferación con el efecto sobre la MPT en células que no están en proliferación o de crecimiento en estado quiescente.
4. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha determinación de la inducción de la MPT implica medir cambios en la liberación de Citocromo C.
5. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha determinación de la inducción de la MPT implica medir cambios en la concentración celular de superóxido.
6. Un proceso in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que el compuesto es un compuesto reactivo de ditiol.
7. Un proceso in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el compuesto tiene un resto arsenóxido (o equivalente de arsenóxido).
8. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el compuesto es de la fórmula (I):
(I)A-[(XBX')_{n}B'-Y]_{p}
en la que
A comprende al menos un grupo colgante;
(XBX')_{n}B' comprende un grupo enlazador adecuado, donde X se selecciona entre el grupo que consiste en -NR,
-S(O)-, -S(O)O-, -S(O)_{2}-, -S(O)_{2}O-, -C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -C(S)S-, -P(O)(R_{1})- y -P(O)(R_{1})O-, o está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{10}, alquenileno C_{2}-C_{10}, alquinileno C_{2}-C_{10}, cicloalquileno C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno C_{5}-C_{10}, heterocicloalquileno C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenileno C_{5}-C_{10}, arileno C_{6}-C_{12}, heteroarileno y acilo C_{2}-C_{10};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en -NR-, -O-, -S-, -Se-, -S-S-, S(O)-, -OS(O)-, OS(O)O-, OS(O)_{2}, -OS(O)_{2}O-, -S(O)O-, -S(O)_{2}-, -S(O)_{2}O-, -OP(O)(R_{1})-, -OP(O)(R_{1})O-, -OP(O)(R_{1})OP(O)(R_{1})O-, -C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -C(S)S-, -P(O)(R_{1})-, -P(O)(R_{1})O-, y
24 o está ausente; donde E es O, S, Se, NR o N(R)_{2}^{+};
B' se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{10}, alquenileno C_{2}-C_{10}, alquinileno C_{2}-C_{10}, cicloalquileno C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno C_{5}-C_{10}, heterocicloalquileno C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenileno C_{5}-C_{10}, arileno C_{6}-C_{12} y heteroarileno o está ausente; y donde
cada R se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, OR_{2} y acilo C_{2}-C_{10};
R' es igual que R o dos R^{1} pueden tomarse junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos para formar un anillo heterocíclico saturado o insaturado de 5 ó 6 miembros;
\global\parskip0.900000\baselineskip
cada R_{1} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, halo, OR_{2} y N(R)_{2};
cada R_{2} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo y -C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alcoxi C_{1}-C_{10}, alqueniloxi C_{3}-C_{10}, alquiniloxi C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio C_{1}-C_{10}, alqueniltio C_{3}-C_{10}, alquiniltio C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, heteroariltio, OH, SH y N(R)_{2};
donde para cada caso en el que B y/o B' es arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de arsenóxido) pueden estar en una relación para-, meta- u orto-; y
donde cada alquileno, alquenileno, alquinileno, -cicloalquileno, cicloalquenileno, heterocicloalquileno, heterocicloalquenileno, arileno, heteroarileno y acilo puede estar sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, ciano, cianato, isocianato, OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3}, -OS(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -OS(O)_{2}R_{3}, -P(O)R_{4}R_{4}, -OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2}, -NRC(O)(CH_{2})_{m}Q, -C(O)R_{5};
25
donde
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2}, N(R)_{2} y -C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alcoxi C_{1}-C_{10}, alqueniloxi C_{3}-C_{10}, alquiniloxi C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio C_{1}-C_{10}, alqueniltio C_{3}-C_{10}, alquiniltio C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, heteroariltio y N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo. alcoxi C_{1}-C_{10}, alqueniloxi C_{3}-C_{10}, alquiniloxi C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio C_{1}-C_{10}, alqueniltio C_{3}-C_{10}, alquiniltio C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, heteroariltio, halo y N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo C_{2}-C_{10}, alquinilo C_{2}-C_{10}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alquiltio C_{1}-C_{10}, alqueniltio C_{3}-C_{10}, alquiniltio C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, tetracicloalquiltio C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, heteroariltio, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5};
R'' es igual que R o dos R'' tomados junto con el átomo de N al que están unidos pueden formar un sistema de anillo heterocíclico saturado, insaturado o aromático;
Q se selecciona entre halógeno y -OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo C_{1}-C_{4}, fenilo, p-metilfenilo; y
m es de 1 a 5,
n es un número entero de 0 a 20
Y comprende al menos un arsenóxido o equivalente de arsenóxido;
p es un número entero de 1 a 10, y donde el compuesto de fórmula (I) tiene más de 6 átomos de carbono.
\global\parskip1.000000\baselineskip
9. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 8, en el que A se selecciona entre
el grupo que consiste en aminoácidos naturales, no naturales y sintéticos, aminas hidrófilas, péptidos, polipéptidos, restos de azúcar, oligosacáridos, y proteínas que contienen tiol, restos de ácidos pequeños, restos que contienen hidroxilo, o una combinación de los mismos.
10. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha amina hidrófila se selecciona entre alquilaminas primarias, arilaminas primarias, aralquilaminas primarias, alquilaminas secundarias, arilaminas secundarias, aralquilaminas secundarias, terciarias alquilaminas, arilaminas terciarias y aralquilaminas terciarias y aminas heterocíclicas.
11. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, en el que A se selecciona entre el grupo que consiste en dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos, pentapéptidos, glutatión, glucosamina, sacáridos, disacáridos, oligosacáridos, donde el átomo de azufre de cada resto que contiene azufre puede estar opcionalmente oxidado para formar un sulfóxido o sulfona.
12. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 11, en el que A se selecciona entre un péptido que comprende uno o más de cisteinilglicina, ácido cisteico, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina y arginina; glucosa, fructosa, manosa, xilosa, lixosa, galactosa, hexosa, sacarosa, sorbosa, galactosil-sacarosa, sorbitol, manitol y xilitol.
13. Un proceso in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que
X se selecciona entre el grupo que consiste en -C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O- y -C(S)S-, o está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{5}, alquenileno C_{2}-C_{5}, alquinileno C_{2}-C_{5}, cicloalquileno C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno C_{5}-C_{10}, arileno C_{6}-C_{12} y a;
X' se selecciona entre el grupo que consiste en-O-, -S-, -NR-, -S-S-, -S(O)-, -S(O)_{2}-, -P(O)(R_{1})-, -OP(O)(R_{1})-, OP(O)(R_{1})O-, -OP(O)(R_{1})OP(O)(R_{1})O-, -C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -C(S)S-,
26, o está ausente; donde E es O, S o N(R)_{2}^{+};
n es 0, 1 ó 2; y
B' se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{5}, alquenileno C_{2}-C_{5}, alquinileno C_{2}-C_{5}, cicloalquileno C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno C_{5}-C_{10} y arileno C_{6}-C_{12}, o está ausente; y donde
cada R se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, OR_{2} y acilo C_{2}-C_{10};
R' es el mismo que R;
cada R_{1} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, halo, OR_{2} y N(R)_{2};
cada R_{2} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12} y -C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, alqueniloxi C_{3}-C_{5}, alquiniloxi C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{1}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, alqueniltio C_{3}-C_{5}, alquiniltio C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, OH, SH y N(R)_{2};
donde para cada caso en el que B y/o B' es arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de arsenóxido) pueden estar en una relación para-, meta- u orto-, y
donde cada alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, cicloalquenileno, arileno y acilo puede estar sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, ciano, halo, cianato, isocianato, OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3}, -OS(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -OS(O)_{2}R_{3}, -P(O)R_{4}R_{4}, -OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2}, NRC(O)(CH_{2})_{m}Q, -C(O)R_{5},
27
donde
\global\parskip0.950000\baselineskip
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2}, N(R)_{2} y -C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, alqueniloxi C_{3}-C_{5}, alquiniloxi C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, alqueniltio C_{3}-C_{5}, alquiniltio C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12} y N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno , alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, alqueniloxi C_{3}-C_{5}, alquiniloxi C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, alqueniltio C_{3}-C_{5}, alquiniltio C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{5}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, halo y N(R)_{2};
R_{6} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, alqueniltio C_{3}-C_{5}, alquiniltio C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que R;
Q se selecciona entre el grupo que consiste en halógeno y -OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo C_{1}-C_{4}, fenilo, p-metilfenilo;
m es de 1 a 5.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Un proceso in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 en el que
X está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{5}, arileno C_{6}-C_{12} y acilo C_{2}-C_{5};;
X' se selecciona entre el grupo que consiste en -O-, -S-, -NR-, -S-S-, -S(O)-, -S(O)_{2}-, -P(O)(R_{1})-, -C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -Se- y
28, o está ausente; donde E es O, S o N(R)_{2}^{+};
n es 0, 1 ó 2; y
B' es alquileno C_{1}-C_{5}, arileno C_{6}-C_{12} o está ausente; y donde
cada R se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, OR_{2} y acilo C_{2}-C_{5};
R' es el mismo que R;
cada R_{1} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, halo, OR_{2} y N(R)_{2};
cada R_{2} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12} y -C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, alqueniloxi C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi C_{5}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, alqueniltio C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio C_{5}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, OH, SH y N(R)_{2};
\global\parskip1.000000\baselineskip
donde para cada caso en el que B y/o B' es arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de arsenóxido) pueden estar en una relación para-, meta- u orto-, y
donde cada alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, cicloalquenileno, arileno y acilo puede estar sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, halo, ciano, cianato, isocianato, OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3}, -OS(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -OS(O)_{2}R_{3}, -P(O)R_{4}R_{4}, -OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2}, -NRC(O)(CH_{2})_{m}Q_{1}, -C(O)R_{5},
29
donde
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{3}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2} y -C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12} y N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{3}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, cicloalquiloxi C_{3}-C_{10}, ariloxi C_{6}-C_{12}, halo y N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, cicloalquiltio C_{3}-C_{10}, ariltio C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que R;
Q se selecciona entre halógeno y -OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo C_{1}-C_{4}, fenilo, p-metilfenilo;
m es de 1 a 5.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Un proceso in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 14 en el que
X está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en alquileno C_{1}-C_{5}, arileno C_{6}-C_{12} y acilo C_{2}-C_{5};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en -O-, -S-, -NR-, -C(O)- y -C(O)O-, o está ausente;
n es 1; y
B' es alquileno C_{1}-C_{5}, arileno C_{6}-C_{12} o está ausente; y
R se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12} y acilo C_{2}-C_{5};
donde para cada caso en el que B y/o B' es arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de arsenóxido) pueden estar en una relación para-, meta- u orto-, y
donde cada alquileno, arileno y acilo puede estar sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo C_{2}-C_{5}, cicloalquilo C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo C_{5}-C_{10}, arilo C_{6}-C_{12}, halo, ciano, cianato, isocianato, OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -P(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2}, -NRC(O)(CH_{2})_{m}Q, -C(O)R_{5},
30 
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
donde
cada R se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12} y acilo C_{2}-C_{5};
R_{2a} se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2} y -C(O)R_{5}:
cada R_{3} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, y ariltio C_{6}-C_{12};
cada R_{4} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, ariltio C_{6}-C_{12}, halo y N(R)_{2};
cada R_{5} se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, ariloxi C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, ariltio C_{6}-C_{12}, OH, SH y N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alquiltio C_{1}-C_{5}, ariltio C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que el R anterior;
Q se selecciona entre halógeno y -OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo C_{1}-C_{4}, fenilo, p-metilfenilo; y
m es 2, 3, 4 ó 5.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Un proceso in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en el que
X está ausente
B es acilo C_{2}-C_{5};
X' es NR;
n es 1;
B' es fenileno; y
R es H;
donde los sustituyentes unidos directamente al anillo de fenileno pueden estar en una relación para-, meta u orto-.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 16 en el que dicho compuesto es:
31
donde R_{7} a R_{10} se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, halógeno, hidroxi, amino, nitro, carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5}, -OS(O)_{2}R_{3} y -NHC(O)CH_{2}Q donde Q es halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3}, -OS(O)_{2}C_{6}H_{5} y -OS(O)_{2}-p-tolilo; y donde, cuando uno cualquiera de R_{7} a R_{10} es alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5}, -OS(O)_{2}R_{3}, es capaz de formar un anillo condensado con el fenileno; y donde, además, al menos uno de R_{7} a R_{10} es alquilo C_{1}-C_{5}, arilo C_{6}-C_{12}, alcoxi C_{1}-C_{5} o -OS(O)_{2}R_{3}, junto con al menos otro cualquiera de R_{7} a R_{10}, es capaz de formar un anillo condensado con el fenileno.
18. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 17 en el que R_{7} a R_{10} se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, nitro, ciano, carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5}, metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo, fenilo y -NHC(O)CH_{2}Q donde Q es halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3}, -OS(O)_{2}C_{6}H_{5} y -OS(O)_{2}-p-tolilo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
19. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17 en el que el grupo arsenóxido (-As=O) está en la posición 4 del anillo de fenileno.
20. Un proceso in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en el que el compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en:
32
33
34
21. Un proceso in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en el que el compuesto se representa por la Fórmula VII:
35
en el que G se selecciona entre el grupo que consiste en; hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, nitro, carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5}, alquilo C_{1}-C_{5} y arilo C_{6}-C_{12} y -NHC(O)CH_{2}Q donde Q es halógeno, OS(O)_{2}CH_{3} -OS(O)_{2}C_{6}H_{5} o -OS(O)_{2}-p-tolilo.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 21 en el que G se selecciona entre hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, nitro, carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5}, metilo, etilo, iso-propilo, terc-butilo, fenilo y -NHC(O)CH_{2}Q donde Q es halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3}, -OS(O)_{2}C_{6}H_{5} o -OS(O)_{2}-p-tolilo.
23. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, en el que G se selecciona entre hidroxi, flúor, amino y nitro.
24. Un proceso in vitro de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el grupo arsenóxido (-As=O) se reemplaza por un equivalente de arsenóxido como se define en la presente memoria.
25. Un proceso in vitro de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el equivalente de arsenóxido es cualquier especie reactiva de ditiol que muestra esencialmente la misma afinidad para ditioles que para -As=O.
ES03810339T 2002-11-07 2003-11-07 Inducion de la transicion de permeabilidad mitocondrial. Expired - Lifetime ES2330519T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002952526A AU2002952526A0 (en) 2002-11-07 2002-11-07 Induction of the mitochondrial permeability transition
AU2002952526 2002-11-07
AU2003906109 2003-11-05
AU2003906109A AU2003906109A0 (en) 2003-11-05 A Substantially Cell Membrane Impermeable Arsenoxide Compound and Use Thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2330519T3 true ES2330519T3 (es) 2009-12-11

Family

ID=32313402

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03810339T Expired - Lifetime ES2330519T3 (es) 2002-11-07 2003-11-07 Inducion de la transicion de permeabilidad mitocondrial.

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20060166208A1 (es)
EP (2) EP2088206B1 (es)
JP (1) JP4426456B2 (es)
CN (1) CN101863958B (es)
AT (1) ATE437239T1 (es)
CA (1) CA2504935C (es)
DE (1) DE60328513D1 (es)
ES (1) ES2330519T3 (es)
WO (1) WO2004042079A1 (es)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPR874601A0 (en) * 2001-11-08 2001-11-29 Unisearch Limited Selective targeting of apoptotic cells
WO2003057012A2 (en) 2002-01-07 2003-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System S-dimethylarsino-thiosuccinic acid s-dimethylarsino-2-thiobenzoic acid s-(dimethylarsino) glutathione as treatments for cancer
US20060166208A1 (en) 2002-11-07 2006-07-27 Hogg Philip J Induction of the mitochondrial permeability transition
EP1961824A4 (en) * 2005-12-14 2009-04-08 Univ Kyushu Nat Univ Corp MONITORING INTRA-CELLULAR MITOCHONDRIAL LOCALIZATION
EP2069371B1 (en) 2006-11-01 2013-03-13 NewSouth Innovations Pty Limited Organo-arsenoxide compounds and use thereof
PL2942065T3 (pl) * 2006-11-08 2018-11-30 Molecular Insight Pharmaceuticals, Inc. Heterodimery kwasu glutamowego
WO2009043114A1 (en) * 2007-10-04 2009-04-09 Newsouth Innovations Pty Limited Arsenoxide compound and method of use
EP2073004A1 (en) * 2007-12-19 2009-06-24 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Electrophoretic analysis of isolated mitochondria for the detection of cell or tissue damage
ITRM20120058A1 (it) * 2012-02-20 2013-08-21 Pisanelli Giovanni Codacci Famiglia di molecole a base di zuccheri ad uso terapeutico e relativo procedimento di produzione
CN105874319B (zh) * 2013-12-03 2019-04-09 香港科技大学 采用正电荷aie荧光团特异性检测和量化心磷脂和分离线粒体及该aie荧光团的制造方法
JP6468781B2 (ja) * 2014-10-02 2019-02-13 株式会社ヘルスケアシステムズ ミトコンドリア膜透過性の評価方法、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法、ミトコンドリア膜透過性を亢進する物質のスクリーニング方法、及びミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤
US11819489B2 (en) 2017-10-17 2023-11-21 University Of Wollongong Anti-cancer agent comprising a tumour homing peptide having arsenic bonded to cysteine residues
TWI841540B (zh) * 2018-10-29 2024-05-11 伍倫貢大學 抗癌劑及其之藥學組合物和用途
AU2020256682A1 (en) 2019-04-12 2021-11-04 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Conjugates and their use as imaging agents
EP3733197A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-04 Stephen N. Pitcher Anaerobic antioxidant composition

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2370092A (en) * 1942-05-04 1945-02-20 Parke Davis & Co Organic amine derivatives and method of obtaining same
US2409291A (en) * 1942-05-19 1946-10-15 Squibb & Sons Inc Chemotherapeutic sulfanilamide derivatives
US2465308A (en) * 1946-11-27 1949-03-22 Hoffmann La Roche Arsenoso compounds and method of preparation
US2664432A (en) * 1947-01-28 1953-12-29 Ernst A H Friedheim Heterocyclic metal and sulfur organic compounds
US2553515A (en) * 1948-12-11 1951-05-15 Hoffmann La Roche N-(p-arsenoso-benzyl)-urea
US2951766A (en) * 1957-07-15 1960-09-06 Le Roy A White Antiseptic plastic
BE786573A (fr) 1971-07-20 1973-01-22 Hoechst Ag Medicament a base de composes arsenicaux organiques et de derives du benzimidazole
FR2640269B1 (fr) * 1988-12-13 1991-03-15 Maes Ludo Composes organometalliques, leurs modes de preparation et compositions pharmaceutiques les contenant
US5270196A (en) * 1989-10-20 1993-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Arylsulfatase from streptomyces
FR2684382B1 (fr) * 1991-12-02 1994-10-21 Rhone Merieux Medicaments et preparations pures de dichlorhydrate de melarsomine, leur procede d'obtention et produits intermediaires obtenus.
CA2290005A1 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Science & Technology Corporation @ Unm Inhibition of cell surface protein disulfide isomerase
JP2001519366A (ja) 1997-10-15 2001-10-23 ポーラクス バイオファーマシュティカルズ，インコーポレーテッド ヒ素化合物を用いた、原発性および転移性の腫瘍性疾患を治療するための組成物および方法
CN1233476A (zh) 1998-04-24 1999-11-03 陆道培 治疗急性白血病的药物及其制备方法
FR2781674B1 (fr) 1998-07-31 2002-06-28 Inst Nat Sante Rech Med Utilisation de nouveaux agents inducteurs de mort cellulaire en synergie avec les interferons
IL142895A0 (en) * 1998-11-03 2002-04-21 Mitokor Adenine nucleotide translocator polyptides
US6191123B1 (en) 1999-03-19 2001-02-20 Parker Hughes Institute Organic-arsenic compounds
CA2375542A1 (en) * 1999-06-22 2000-12-28 James A. Dykens Compositions and methods for assaying subcellular conditions and processes energy transfer
AUPQ296799A0 (en) * 1999-09-20 1999-10-14 Unisearch Limited A cell-membrane impermeable trivalent organoarsenical derivative and use thereof
AUPR379801A0 (en) * 2001-03-19 2001-04-12 Unisearch Limited Use of a substantially cell membrane impermeable compound for treating arthritis
AUPR598901A0 (en) 2001-06-28 2001-07-19 Unisearch Limited Inhibition of angiogenesis by targeting protein tyrosine phosphatases
AUPR874601A0 (en) 2001-11-08 2001-11-29 Unisearch Limited Selective targeting of apoptotic cells
US20060166208A1 (en) 2002-11-07 2006-07-27 Hogg Philip J Induction of the mitochondrial permeability transition
EP2069371B1 (en) 2006-11-01 2013-03-13 NewSouth Innovations Pty Limited Organo-arsenoxide compounds and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
HK1073868A1 (en) 2005-10-21
CN101863958A (zh) 2010-10-20
DE60328513D1 (de) 2009-09-03
HK1132015A1 (en) 2010-02-12
JP4426456B2 (ja) 2010-03-03
JP2006518986A (ja) 2006-08-24
EP2088206A2 (en) 2009-08-12
EP2088206A3 (en) 2009-09-16
EP1563099B1 (en) 2009-07-22
US20060166208A1 (en) 2006-07-27
EP1563099A4 (en) 2008-03-12
ATE437239T1 (de) 2009-08-15
CA2504935A1 (en) 2004-05-21
CN101863958B (zh) 2012-07-18
EP1563099A1 (en) 2005-08-17
WO2004042079A1 (en) 2004-05-21
EP2088206B1 (en) 2013-07-03
US20140121165A1 (en) 2014-05-01
CA2504935C (en) 2012-04-10
US9353152B2 (en) 2016-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2330519T3 (es) Inducion de la transicion de permeabilidad mitocondrial.
US11084932B2 (en) Phenylethynylnaphthalene dyes and methods for their use
ES2239037T3 (es) Metodos y composiciones para inhibir la deteccion del ciclo celular en g2 y sensibilizar celulas a agentes dañinos del dna.
ES2886642T3 (es) Factor antisecretor 17
AU2006328833A1 (en) Novel compounds which interact with PEA-15
Zhang et al. Design, synthesis and bioactivity investigation of peptide-camptothecin conjugates as anticancer agents with a potential to overcome drug resistance
DiVittorio et al. Synthetic peptides with selective affinity for apoptotic cells
CN112516164B (zh) 一种抑制肿瘤转移的氨基富勒烯材料
Moller et al. Indicator dyes as probes of electrostatic potential changes on macromolecular surfaces
AU2003275772B2 (en) Induction of the mitochondrial permeability transition
AU2008200304B2 (en) Induction of the mitochondrial permeability transition
HK1073868B (en) Induction of the mitochondrial permeability transition
ES2923022T3 (es) Agentes que inhiben Ngly1 y métodos de uso de los mismos
EP1476576B1 (en) Fluorogenic dyes
Ji et al. Double-component diazeniumdiolate derivatives as anti-cancer agents
HK1132015B (en) Induction of the mitochondrial permeability transition
JPWO2015125892A1 (ja) 蛋白質の標識化合物
Li et al. A novel MMP-9 inhibitor exhibits selective inhibition in non-small-cell lung cancer harboring EGFR T790M mutation by blocking EGFR/STAT3 signaling pathway
ES2448804T3 (es) Un péptido monofosforilado aislado derivado de alfa-enolasa humana útil para diagnóstico y tratamiento del adenocarcinoma pancreático, anticuerpos dirigidos contra dicho péptido monofosforilado, y sus usos
US10941435B2 (en) Methods and compositions for detecting or measuring caspases or apoptosis
Oliveira et al. Improvement of the pharmacological properties of amidated kyotorphin by means of iodination
Eggena et al. Synthesis and characterization of a long-acting fluorescent analog of vasotocin
Anand et al. The Multicellular Effects of VDAC1 N-Terminal-Derived Peptide. Biomolecules 2022, 12, 1387
PL235564B1 (pl) Zastosowanie białek z grupy ALKBH w sposobie diagnozowania chorób nowotworowych in vitro oraz pochodne antrachinonu do zastosowania do leczenia lub zapobiegania rozwojowi nowotworu nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego
Wang Fluorescent Probes with N2O‑Type Benzopyrromethene Boron Complexes for Imaging Biological Microenvironment