ES2239037T3 - Metodos y composiciones para inhibir la deteccion del ciclo celular en g2 y sensibilizar celulas a agentes dañinos del dna. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado o recombinante, en donde la secuencia de aminoácidos es seleccionada del grupo consistente en en dónde el polipéptido cuando es administrado o expresado en una célula interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular.

Description

Métodos y composiciones para inhibir la detección del ciclo celular en G2 y sensibilizar células a agentes dañinos del DNA.

Campo técnico

La presente invención pertenece, en general, a los campos de la medicina y la terapéutica del cáncer. En particular, esta invención proporciona nuevos genes, polipéptidos y métodos para la elaboración y el uso de los mismos. De forma específica, las composiciones y los métodos de la invención son utilizados para la preparación de agentes terapéuticos para tratar alteraciones del crecimiento celular tales como el cáncer. En particular, la invención proporciona métodos para la preparación de agentes terapéuticos para sensibilizar selectivamente a células cancerígenas con la fase G1 alterada por agentes terapéuticos y tratamientos dañinos del DNA. También se proporcionan métodos in vitro para el cribado en busca de compuestos capaces de interaccionar con, por ejemplo inhibir, las enzimas implicadas en la detención del ciclo celular en la fase G2 tales como Chk1 y/o la quinasa Chk2/Cds1.

Antecedentes

El desarrollo de agentes anticancerígenos capaces de inhibir el crecimiento de las células cancerígenas o de matarlas sin afectar a las células normales se ha convertido en un reto continuo. Los investigadores se han centrado en las mutaciones genéticas de las células cancerígenas para encontrar pistas para el descubrimiento de estos nuevos fármacos anticancerígenos.

Muchas células cancerígenas presentan mutaciones en los genes implicados en la detención del ciclo celular en la fase G1. Estos genes incluyen los genes supresores de tumor dañados, por ejemplo p53, Rb, p16^{INK4}, y p19^{ARF}. Alternativamente, estas mutaciones pueden causar la expresión de oncogenes, por ejemplo, MDM-2 y ciclina D. Adicionalmente a éstos, una señalización de factores de crecimiento excesiva puede ser causada por la sobreexpresión de los factores de crecimiento. Juntamente con estas mutaciones de ganancia de función, los receptores de los factores de crecimiento o moléculas implicadas en la transducción de señal corriente abajo pueden causar la transformación celular saltándose el punto de control G1. En contraste, pocos cánceres han interrumpido la fase de detención G2 del ciclo celular. Por lo tanto, el punto de control G2 normalmente se conserva en las células cancerígenas que presentan una alteración en el punto de control G1.

Si la fase G2 puede ser interrumpida de forma selectiva, aquellas células cancerígenas con una fase G1 alterada podrían volverse más sensibles a un tratamiento dañino del DNA en comparación con las células normales (con un G1 intacto), partiendo de que la progresión a través de G1 y G2 sin una reparación de tal daño induce la apoptosis.

El mecanismo que promueve la detención del ciclo celular en G2 después de un daño en el DNA se encuentra conservado entre las especies desde las levaduras hasta el ser humano. En presencia de DNA dañado, la quinasa Cdc2/Ciclina B se mantiene inactiva por medio de una fosforilación inhibitoria de los residuos treonina 14 y tirosina 15 de la quinasa Cdc2. Cuando empieza la mitosis, la fosfatasa dual Cdc25 quinasa elimina estos fosfatos inhibidores y activa la quinasa Cdc2/Ciclina B.

En las levaduras de fisión, la proteína quinasa Chk1 se requiere para la detención del ciclo celular en respuesta al DNA dañado. La quinasa Chk1 actúa corriente abajo sobre varios productos del gen rad y se modifica por medio de la fosforilación sobre el DNA dañado. Se conoce que las quinasas Rad53 de la levadura en germinación y Cds1 de la levadura de fisión conducen señales a partir de DNA no replicado. Parece que se produce alguna redundancia entre Chk1 y Cds1 ya que la eliminación de ambas, Chk1 y Cds1, se culmina en la interrupción de la detención G2 inducida por el DNA dañado. De forma interesante, tanto Chk1 como Cds1 fosforilan la quinasa Cdc25 y promueven la unión de Rad24 a Cdc25, lo que retiene a Cdc25 en el citosol y evita la activación Cdc2/Ciclina B. Por lo tanto Cdc25 parece ser una diana común de estas quinasas y presumiblemente un factor indispensable en el punto de control G2.

En humanos, tanto hChk1, un homólogo humano de Chk1 de la levadura de fisión, como Chk2/HuCds1, un homólogo humano de Rad53 de la levadura en germinación y de Cds1 de la levadura de fisión, fosforilan a Cdc25C en la serina 216, un lugar de regulación crítico, en respuesta al daño en el DNA. Esta fosforilación genera un lugar de unión para proteínas ácidas pequeñas 14-3-3s, homólogos humanos de Rad24 y Rad25 de la levadura de fisión (Lopez-Girona (1999) Nature 397:172-175). El papel regulador de esta fosforilación se indicó claramente cuando al sustituir la serina 216 por alanina en el Cdc25C se interrumpió la detención del ciclo celular en G2 en células humanas (Peng (1997) Science 277:1501-1505). Compuestos alternativos, útiles para la preparación de un fármaco capaz de interrumpir la detención del ciclo celular en G2 se revelan en WO-A-9428914 (Mitotix).

Resumen

Esta invención proporciona ácidos nucleicos y polipéptidos que pueden ser utilizados para la elaboración de fármacos para el tratamiento de alteraciones celulares proliferativas, tales como las asociadas con células de tumores tanto benignos como malignos. Mientras que la invención no se encuentra limitada a ningún mecanismo particular, los polipéptidos de la invención pueden funcionar mediante la inhibición de la detención en el punto de control G2 del ciclo celular. Así, la invención también proporciona composiciones y métodos para la sensibilización selectiva de una célula con la detención en el punto de control G1 del ciclo celular alterada, p.ej., una célula cancerígena, para un agente dañino del ADN.

La invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que consiste en YGGPGGGGN (ID. DE SEC. NO: 1895); RYSLPPELSNM (ID. DE SEC. NO:1); LARSASMPEAL (ID. DE SEC. NO: 1896); LYRSPSMPENL (ID. DE SEC. NO: 2); LYRSPAMPENL (ID. DE SEC. NO: 1897); WYRSPSFYENL (ID. DE SEC. NO: 904); WYRSPSYYENL (ID. DE SEC. NO: 908); o, WYRSPSYY (ID. DE SEC. NO: 1898).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en LYRSPSYPENL (ID. DE SEC. NO: 10), LYRSPSYFENL (ID. DE SEC. NO: 11), LYRSPSYYENL (ID. DE SEC. NO: 12), o LYRSPSYWENL (ID. DE SEC. NO: 13).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en donde la secuencia de aminoácidos consiste en LYRSPSNPENL (ID. DE SEC. NO: 22), LYRSPSNFENL (ID. DE SEC. NO: 23), LYRSPSNYENL (ID. DE SEC. NO: 24), o LYRSPSNWENL (ID. DE SEC. NO: 25).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en LYRSPSHPENL (ID. DE SEC. NO: 30), LYRSPSHFENL (ID. DE SEC. NO: 31), LYRSPSHYENL (ID. DE SEC. NO: 32), LYRSPSHWENL (ID. DE SEC. NO: 33), LYSSPSMPENL (ID. DE SEC. NO: 34), LYSSPSMFENL (ID. DE SEC. NO: 35), LYSSPSMYENL (ID. DE SEC. NO: 36), LYSSPSMWENL (ID. DE SEC. NO: 37), LYSSPSFPENL (ID. DE SEC. No: 38), LYSSPSFPENL (ID. DE SEC. NO: 38), LYSSPSFFENL (ID. DE SEC. NO: 39), LYSSPSFYENL (ID. DE SEC. NO: 40), LYSSPSFWENL (ID. DE SEC. NO: 41), LYSSPSY
PENL (ID. DE SEC. NO: 42), LYSSPSYFENL (ID. DE SEC. NO: 43), LYSSPSYYENL (ID. DE SEC. NO: 44), o LYSSPSYWENL (ID. DE SEC. NO: 45).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en LYSSPSQPENL (ID. DE SEC. NO: 58), LYSSPSQWENL (ID. DE SEC. NO: 61), LYSSPSHPENL (ID. DE SEC. NO: 62), LYSSPSHFENL (ID. DE SEC. NO: 63), LYSSPSHYENL (ID. DE SEC. NO: 64), LYSSPSHWENL (ID. DE SEC. NO: 65), LYTSPSMPENL (ID. DE SEC. NO: 66), LYTSPSMFENL (ID. DE SEC. NO: 67), LYTSPSMYENL (ID. DE SEC. NO: 68), LYTSPSMWENL (ID. DE SEC. NO: 69), LYTSPSF
PENL (ID. DE SEC. NO: 70), LYTSPSFFENL (ID. DE SEC. NO: 71), LYTSPSFYENL (ID. DE SEC. NO: 72), LYTSPSFWENL (ID. DE SEC. NO: 73), LYTSPSYPENL (ID. DE SEC. NO: 74), LYTSPSYFENL (ID. DE SEC. NO: 75), LYTSPSYYENL (ID. DE SEC. NO: 76), o LYTSPSYWENL (ID. DE SEC. NO: 77).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en LYTSPSNPENL (ID. DE SEC. NO: 86), LYTSPSNFENL (ID. DE SEC. NO: 87), LYTSPSNYENL (ID. DE SEC. NO: 88) o LYTSPSNWENL (ID. DE SEC. NO: 89).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en LYTSPSHPENL (ID. DE SEC. NO: 94), LYTSPSHFENL (ID. DE SEC. NO: 95), LYTSPSHYENL (ID. DE SEC. NO: 96) o LYTSPSHWENL (ID. DE SEC. NO: 97).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en LYHSPSYPENL (ID. DE SEC. NO: 106), LYHSPSYFENL (ID. DE SEC. NO: 107), LYHSPSYYENL (ID. DE SEC. NO: 108) o LYHSPSYWENL (ID. DE SEC. NO: 109).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en LFTSPSYPENL (ID. DE SEC. NO: 298), LFTSPSYFENL (ID. DE SEC. NO: 299), LFTSPSYYENL (ID. DE SEC. NO: 300) o LFTSPSYWENL (ID. DE SEC. NO: 301).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en FYSSPSHPENL (ID. DE SEC. NO: 510), FYSSPSHFENL (ID. DE SEC. NO: 511), FYSSPSHYENL (ID. DE SEC. NO: 512), FYSSPSHWENL (ID. DE SEC. NO: 513), FYTSPSMPENL (ID. DE SEC. NO: 514), FYTSPSMFENL (ID. DE SEC. NO: 515), FYTSPSMYENL (ID. DE SEC. NO: 516), FYTSPSM
WENL (ID. DE SEC. NO: 517), FYTSPSFPENL (ID. DE SEC. NO: 518), FYTSPSFFENL (ID. DE SEC. NO: 519), FYTSPSFYENL (ID. DE SEC. NO: 520), FYTSPSFWENL (ID. DE SEC. NO: 521), FYTSPSYPENL (ID. DE SEC. NO: 522), FYTSPSYFENL (ID. DE SEC. NO: 523), FYTSPSYYENL (ID. DE SEC. NO: 524) o FYTSPSYWENL (ID. DE SEC. NO: 525).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en WYRSPSMPENL (ID. DE SEC. NO: 898), WYRSPSMFENL (ID. DE SEC. NO: 899), WYRSPSMYENL (ID. DE SEC. NO: 900), WYRSPSMWENL (ID. DE SEC. NO: 901), WYRSPSFPENL (ID. DE SEC. NO: 902), WYRSPSFFENL (ID. DE SEC. NO: 903), WYRSPSFYENL (ID. DE SEC. NO: 904), WYRSPSF
WENL (ID. DE SEC. NO: 905), WYRSPSYPENL (ID. DE SEC. NO: 906), WYRSPSYFENL (ID. DE SEC. NO: 907), WYRSPSYYENL (ID. DE SEC. NO: 908) o WYRSPS YWENL (ID. DE SEC. NO: 909).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en WYTSPSMPENL (ID. DE SEC. NO: 962), WYTSPSMFENL (ID. DE SEC. NO: 963), WYTSPSMYENL (ID. DE SEC. NO: 964), WYTSPSMWENL (ID. DE SEC. NO: 965), WYTSPSFPENL (ID. DE SEC. NO: 966), WYTSPSFFENL (ID. DE SEC. NO: 967), WYTSPSFYENL (ID. DE SEC. NO: 968), WYTSPSF
WENL (ID. DE SEC. NO: 969), WYTSPSYPENL (ID. DE SEC. NO: 970), WYTSPSYFENL (ID. DE SEC. NO: 971), WYTSPSYYENL (ID. DE SEC. NO: 972) o WYTSPSYWENL (ID. DE SEC. NO: 973).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en WYTSPSHPENL (ID. DE SEC. NO: 990), WYTSPSHFENL (ID. DE SEC. NO: 991), WYTSPSHYENL (ID. DE SEC. NO: 992) o WYTSPSHWENL (ID. DE SEC. NO: 993).

En realizaciones alternativas, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante en el que la secuencia de aminoácidos consiste en LKRSPSMPENL (ID. DE SEC. NO: 1826), LYISPSMPENL (ID. DE SEC. NO: 1844) o LYRSPSMVENL (ID. DE SEC. NO: 1894). En todos los péptidos indicados arriba uno de los residuos nº 1, 9, 10, 11 pueden estar ausentes.

En una realización, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que al ser administrado o expresado en una célula interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular, en donde la célula es una célula de mamífero. La célula puede ser una célula humana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula bacteriana, una célula vegetal, y similares.

En una realización, la invención proporciona un polipéptido aislado o recombinante que además comprende un permeabilizador de membrana celular. El permeabilizador de membrana celular puede comprender un polipéptido como el dominio de transducción de la proteína TAT, p.ej., que comprenda una secuencia YGRKKRRQRRR (ID. DE SEC. NO: 1899). De forma alternativa, el permeabilizador de membrana puede comprender un lípido, tal como un liposoma.

La invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende un primer dominio conteniendo un polipéptido de la invención y un segundo dominio que comprende un permeabilizador de membrana celular, de tal forma que cuando el polipéptido es administrado o expresado en una célula provoca la interrupción de la detención en el punto de control G2 del ciclo celular. El polipéptido quimérico puede ser una proteína recombinante de fusión.

La invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un polipéptido o un polipéptido quimérico de la invención, de tal forma que cuando el polipéptido es administrado o expresado en una célula provoca la interrupción de la detención en el punto de control G2 del ciclo celular.

La invención proporciona un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido o un polipéptido quimérico de la invención, en dónde el polipéptido, cuando es administrado o expresado en la célula, interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular.

La invención proporciona una célula que contiene un ácido nucleico o un vector de expresión de la invención. La célula puede ser una bacteria, una levadura, una célula de insecto, una célula vegetal, o una célula de mamífero.

La invención proporciona una composición farmacéutica que contiene un polipéptido de la invención, un ácido nucleico de la invención, un vector de expresión de la invención, o una célula de la invención; y, un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica puede comprender un liposoma.

La invención proporciona un método in vitro para la inhibición de la actividad de una quinasa Chk1 o de una quinasa Chk2 comprendiendo el contacto de la quinasa con un polipéptido de la invención o una composición farmacéutica de la invención, en una cantidad suficiente como para inhibir la actividad de la quinasa Chk1 o de la quinasa Chk2.

La invención proporciona un método in vitro para la interrupción de la detención en el punto de control G2 del ciclo celular que comprende el contacto de la célula con un polipéptido de la invención o con una composición farmacéutica de la invención en una cantidad suficiente como para interrumpir la detención en el punto de control G2 del ciclo celular. En realizaciones alternativas la célula es una célula de mamífero, una célula humana, o una célula cancerígena.

La invención proporciona un método in vitro para la sensibilización de una célula a un agente dañino del DNA comprendiendo el contacto de la célula con un polipéptido de la invención o una composición farmacéutica de la invención en una cantidad suficiente para interrumpir la detención en el punto de control G2 del ciclo celular, de ese modo sensibilizando la célula al agente dañino del DNA. En realizaciones alternativas la célula es una célula de mamífero, una célula humana, o una célula cancerígena. La célula cancerígena puede tener alterada la detención en el punto de control G1 del ciclo celular.

La invención proporciona un método in vitro para la sensibilizar selectivamente una célula con la detención en el punto de control G1 del ciclo celular alterada hacia un agente dañino del DNA comprendiendo el contacto de la célula con un polipéptido de la invención o una composición farmacéutica de la invención, en una cantidad suficiente para interrumpir la detención en el punto de control G2 del ciclo celular, de esa manera sensibilizando la célula al agente dañino de DNA. En realizaciones alternativas la célula es una célula de mamífero, una célula humana, o una célula cancerígena.

La invención proporciona un método in vitro para la inducción de la apoptosis en una célula de un individuo comprendiendo la administración de un polipéptido de la invención o una composición farmacéutica de la invención en una cantidad suficiente para interrumpir la detención en el punto de control G2 del ciclo celular en la célula cancerígena, de este modo sensibilizando la célula cancerígena a un agente dañino del DNA y administrando un agente dañino del DNA. En realizaciones alternativas la célula es una célula de mamífero, una célula humana, o una célula cancerígena. La célula cancerígena puede tener alterada la detención en el punto de control G1 del ciclo celular. El agente dañino del DNA puede ser 5-fluorouracil (5-FU), rebecamicina, adriamicina, bleomicina, cisplatino, hipertermia, radiación UV o radiación gamma.

La invención proporciona un método para el cribado en busca de compuestos capaces de modular la actividad de una quinasa Chk1 o una quinasa Chk2 comprendiendo los siguientes pasos: (a) proporcionar un compuesto test; (b) proporcionar una Chk1 quinasa o una Chk2 quinasa; (c) proporcionar un polipéptido de la invención, donde el polipéptido se une a la quinasa Chk1 o la quinasa Chk2; y, (d) contactar el compuesto test con la quinasa y el polipéptido y medir la capacidad del compuesto test para impedir la unión del polipéptido a la quinasa.

La invención proporciona un método para el cribado en busca de compuestos capaces de modular la actividad de una quinasa Chk1 o una quinasa Chk2 que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar un compuesto test; (b) proporcionar una quinasa Chk1 o una quinasa Chk2; (c) proporcionar un polipéptido de la invención, donde el polipéptido es fosforilado por la quinasa Chk1 o una quinasa Chk2; y, (d) contactar el compuesto test con la quinasa y el polipéptido y medir la capacidad del compuesto test para impedir o eliminar la fosforilación del polipéptido por la quinasa. Además, el método puede comprender el suministro de de un Cdc25C humano de longitud completa. En una realización del método, el polipéptido del paso (c) comprende un residuo aminoacídico serina 216 del Cdc25C humano, ya que comprende desde alrededor del aminoácido 200 a alrededor del aminoácido 250 del Cdc25C humano. En una realización del método, el polipéptido del paso (c) además comprende una glutatión-S-transferasa.

En una realización del método de la invención, incluyendo los métodos de cribado, el polipéptido de la invención es inmovilizado.

La invención proporciona un método para el cribado en busca de compuestos capaces de inhibir de forma específica el punto de control G2 del ciclo celular que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar un compuesto test y un polipéptido de la invención; (b) proporcionar una célula con el punto de control G1 alterado; (c) contactar la célula del paso (b) con el compuesto test o el polipéptido del paso (a) además de un tratamiento dañino del DNA, tal como 5-fluorouracil (5-FU), rebecamicina, adriamicina, bleomicina, cisplatino, hipertermia, radiación UV o radiación gamma, o un activador del punto de control de la fase M del ciclo celular; y, (d) medir la cantidad de DNA en las células después del contacto del paso (c) para determinar si el compuesto test ha inhibido el punto de control G2 del ciclo celular, en donde el polipéptido del paso (a) actúa como un control positivo de la inhibición del punto de control G2. En realizaciones alternativas la célula es una célula de mamífero, una célula humana o una célula cancerígena. En una realización, la cantidad de DNA se mide utilizando yoduro de propidio por medio de, por ejemplo, un análisis FACS, o equivalente. En una realización, la cantidad de DNA se mide al cabo de las 10 a 72 horas posteriores al contacto del paso (c).

En una realización, el método comprende el contacto de la célula del paso (b) solamente con un activador del punto de control de la fase M del ciclo celular (como un sustituto de un agente dañino del ADN) y el compuesto test o el polipéptido del paso (a), en donde un compuesto test que no ha inhibido o eliminado la detención en el punto de control de la fase M del ciclo celular después de contactar la célula con un activador de la fase M es un inhibidor específico del punto de control G2 del ciclo celular (porque no ha afectado el punto de control de la fase M o no fue un fenómeno no específico). En una realización, el activador del punto de control de fase M es colchicina o nocoda-
zol.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen más abajo en las ilustraciones acompañantes y su descripción. Otras características, objetos, y ventajas de la invención pueden ser revelados en la descripción e ilustraciones, así como en las reivindicaciones.

Descripción de las ilustraciones

La Figura 1 muestra péptidos quiméricos utilizados y los resultados de los experimentos demostrando que los péptidos TAT-S216A y TAT-S216 inhiben la actividad in vitro de las quinasas hChk1 y hChk2/HuCds1, tal y como se describe más abajo en el Ejemplo 1. La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de los péptidos TAT-control quiméricos de fusión (ID. DE SEC. NO: 1934), TAT-S216A (ID. DE SEC. NO: 1933) y TAT-S216 (ID. DE SEC. NO: 1932). En la Figura 1B se presentan autoradiogramas SDS-PAGE que demuestran los resultados de la inhibición in vitro de la fosforilación de Cdc25C en los ensayos utilizando los péptidos TAT-S216A y TAT-S216 para la inhibición de la actividad de hChk1 purificada; los residuos aminoacídicos del 200 al 256 de Cdc25C (ID. DE SEC. NO: 1) se usaron como sustrato a una concentración de 1 \muM. En la Figura 1C se presentan autorradiogramas SDS-PAGE que demuestran los resultados de los ensayos in vitro de la inhibición de la fosforilación de Cdc25C utilizando el péptido TAT-S216A para la inhibición de las actividades de hChk1 y de hChk2/HuCds1 purificadas; los residuos aminoacídicos del 211 al 220 de Cdc25C (ID. DE SEC. NO: 1) se utilizaron como sustrato a una concentración de 10 \muM.

En la Figura 2 se presentan los resultados de los experimentos que demuestran que los péptidos TAT-S216A y TAT-S216 pueden eliminar la detención G2 inducida por daños en el DNA en células Jurkat. La Figura 2 muestra los resultados del análisis FACS de células Jurkat tratadas con bleomicina (10 \mug/ml) y los péptidos TAT-S216A y TAT-S216 (10 \muM cada uno). La Figura 2B muestra los resultados de la realización de SDS-PAGE de lisados celulares de un análisis de quinasa de histona H1; los lisados fueron preparados a partir de células tratadas con el reactivo indicado durante 6 horas. En la Figura 2C se muestran los resultados de un análisis FACS de células tratadas con colchicina (5 \mug/ml) y péptido (10 \muM cada uno); las células Jurkat fueron tratadas durante 20 horas.

La Figura 3 muestra los resultados de los experimentos demostrando que los péptidos TAT-S216A y TAT-S216 pueden sensibilizar de forma específica células cancerígenas a la bleomicina, pero no a la colchicina. La Figura 3A muestra los resultados del análisis de exclusión por tinción de azul de tripán de células Jurkat tratadas con bleomicina con o sin los péptidos TAT-S216A y TAT-S216. La Figura 3B muestra los resultados del análisis de exclusión (supervivencia) por tinción de azul de tripán de células Jurkat tratadas con colchicina con o sin los péptidos TAT-S216A y TAT-S216. La Figura 3C muestra los resultados del análisis de exclusión (supervivencia) por tinción de azul de tripán de blastos PHA tratados con bleomicina con o sin los péptidos TAT-S216A y TAT-S216. La Figura 3D muestra los resultados del análisis FACS de blastos PHA tratados con bleomicina con o sin los péptidos TAT-S216A y TAT-S216 (en el eje vertical se representa el contenido de DNA indicado por la tinción con yoduro de propidio).

La Figura 4 muestra los resultados de los experimentos que demuestran que los péptidos TAT-S216A y TAT-S216 pueden sensibilizar células cancerígenas a la bleomicina. La Figura 4A muestra los resultados del análisis X-TT de células PANC1 tratadas con bleomicina con o sin los péptidos TAT-S216A y TAT-S216. La Figura 4B muestra los resultados del análisis X-TT de células MIA PaCa2 tratadas con bleomicina con o sin los péptidos TAT-S216A y TAT-S216.

La Figura 5 muestra una estructura tridimensional esquemática del Chk2 humano interaccionando con los péptidos ejemplares eliminadores de G2 de la invención, tal y como se describe más abajo en el Ejemplo 2.

La Figura 6 muestra los resultados de un análisis FACS de la cantidad de DNA en células para determinar el número de células que se encuentran en una de las cuatro fases del ciclo celular después de la incubación de estas células con bleomicina y los péptidos ejemplares de la invención, tal y como se describe más adelante en el Ejemplo 3.

La Figura 7 muestra los resultados de un análisis FACS de la cantidad de DNA en células para determinar el número de células que se encuentran en una de las cuatro fases del ciclo celular después de la incubación de estas células con colchicina y los péptidos ejemplares de la invención, tal y como se describe más adelante en el Ejemplo 3.

En la Figura 8 se muestran las secuencias de los péptidos (ID. DE SEC. Nos: 1935-1948) utilizados en los experimentos descritos más adelante en el Ejemplo 4.

La Figura 9 muestra el resumen de los resultados de los experimentos descritos más adelante en el Ejemplo 4.

La Figura 10 muestra los resultados de los experimentos que demuestran que un péptido de la invención (como una proteína de fusión que contenga S216) administrado in vivo a un animal sensibiliza de forma efectiva células cancerígenas a un agente dañino del DNA.

La Figura 11 muestra los resultados de los experimentos que demuestran que un péptido de la invención (como una proteína de fusión que contenga R-II) administrado in vivo a un animal sensibiliza de forma efectiva células cancerígenas a un agente dañino del DNA.

Los símbolos de referencia de las diferentes ilustraciones indican determinados elementos.

Descripción detallada

Los genes y los polipéptidos de la invención proporcionan nuevos medios para el tratamiento de las trastornos proliferativos celulares, lo que incluye, p.ej., la detención del crecimiento o la muerte de células cancerígenas. Mientras la invención no se encuentra limitada por ningún mecanismo de acción en particular, la administración de los polipéptidos de la invención puede retrasar o eliminar la detención en el punto de control G2 del ciclo celular en las células. Los genes y polipéptidos de la invención pueden también ser utilizados para inhibir la actividad quinasa Chk1 y/o Chk2/Cds1. La inhibición de las quinasas Chk1 y/o Chk2/Cds1 puede ser el mecanismo mediante el cual el punto de control G2 es inhibido. La invención también proporciona métodos para sensibilizar de forma selectiva células cancerígenas con un punto de control G1 alterado hacia agentes y tratamientos dañinos de ADN. También se proporcionan métodos para el cribado en busca de compuestos capaces de interaccionar con, p.ej. inhibir, los enzimas que están implicados en la detención en el punto de control G2 del ciclo celular, tales como las quinasas Chk1 y/o Chk2/Cds1. De esta manera, la invención proporciona métodos para el cribado en busca de compuestos que inhiben o eliminan el punto de control G2 del ciclo celular.

La invención describe por primera vez los motivos aminoacídicos en el polipéptido Cdc25C humano (hCdc25C) (ID. DE SEC. NO:1) que son los motivos del sustrato por las actividades quinasas de la Chk1 humana (hChk1) (ID. DE SEC. NO:3) y la Chk2/Cds1 humana (Chk2/HuCdsl) (ID. DE SEC. NO:4). Los polipéptidos y los ácidos nucleicos inhibidores de quinasa de la invención son modelados en función de estos motivos peptídicos hCdc25C. El hCdc25C de tipo salvaje es fosforilado por hChk1 (ID. DE SEC. NO:3) y Chk2/HuCds1 (ID. DE SEC. NO:4).

La fosforilación de Cdc25C es necesaria para la detención celular en punto de control G2. De esta manera, los péptidos y polipéptidos de la invención, al inhibir la fosforilación de Cdc25C (por enzimas que probablemente incluyen Chk1 y Chk2/HuCds1), pueden inhibir o eliminar la capacidad del punto de control G2 de la célula. La falta de de un punto de control G2 efectivo después de un daño en el ADN resulta fatal para la célula (ver, p.ej., Maity (1994) Radiother. Oncol. 31:1-13). Si una célula progresa a través de la fase G2 sin que se produzca una reparación suficiente del daño en el DNA se convierte en apoptótica. Así, las composiciones de la invención pueden ser utilizadas para sensibilizar células, tales como células tumorales, a agentes dañinos del ADN. De hecho, como se discute más adelante, las composiciones de la invención pueden sensibilizar células cancerígenas para los efectos apoptóticos de agentes alteradores del DNA con un efecto citotóxico pequeño o nulo en las células normales.

El Ejemplo 1, más adelante, describe la síntesis y el uso de dos polipéptidos ejemplares de la invención. Dos péptidos correspondientes a los aminoácidos del 211 al 221 del Cdc25C humano (ID. DE SEC. NO:1) fusionados con una parte del HIV-1-TAT (ID. DE SEC. NO:5). Se ha demostrado que estos péptidos inhiben la actividad quinasa de hChk1 (ID. DE SEC. NO:3) y la actividad quinasa de Chk2/HuCds1 (ID. DE SEC. NO:4) in vitro y eliminar de forma específica el punto de control G2 in vivo. Estos péptidos sensibilizan líneas celulares cancerígenas defectivas para p53 a los efectos apoptóticos de agentes dañinos del DNA sin efectos citotóxicos obvios sobre las células normales. Estos resultados demuestran de forma clara que los polipéptidos que comprenden los motivos de la invención pueden ser utilizados para la inhibición o eliminación específica del punto de control G2 del ciclo celular. Estos resultados demuestran que las composiciones de la invención pueden ser utilizadas para el cribado de en busca de composiciones capaces de inhibir la actividad quinasa de Chk1 o Chk2. Estos resultados también demuestran que las composiciones de la invención pueden ser utilizadas para la terapia del cáncer. Mientras la invención no se encuentra limitada por ningún mecanismo de acción en particular, los péptidos y polipéptidos de la invención pueden ser utilizados para interceptar y inhibir las quinasas hChk1 (ID. DE SEC. NO:3) y Chk2/HuCds1 (ID. DE SEC. NO:4).

Definiciones

A menos que esté definido de otra forma, todos los términos científicos y técnicos utilizados de aquí en adelante tienen el sentido comúnmente entendido para aquellos que son expertos en la materia a la que pertenece la presente invención. Como son usados aquí, los siguientes términos tienen los significados atribuidos a los mismos a menos que se especifique de otra forma.

El término "permeabilizador de membrana celular" como se usa aquí indica cualquier composición que, cuando se asocia a un péptido o polipéptido de la invención o a un ácido nucleico de la invención, causa, o asiste a, la internalización de la composición dentro de la célula. La asociación puede ser covalente (p.ej., un reactivo enlazante, o como una proteína de fusión) o no covalente (p. ej., como con liposomas). Por ejemplo, en una realización, un dominio permeabilizador de membrana celular se encuentra ligado a un péptido o polipéptido de la invención como un dominio de proteína de fusión, p. ej. un dominio de transducción de proteína TAT (ver, p.ej., Vives (1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017). Otros dominios permeabilizadores de membrana celular incluyen, p.ej, los dominios PreS2 y S de los antígenos de superficie del virus de la hepatitis-B, ver, p.ej., Oess (2000) Gene Ther. 7:750-758.

El término "Cdc25C humano" o "hCdc25C" tal y como se usa aquí indica, dependiendo del contexto, el polipéptido Cdc25C humano (ID. DE SEC. NO:1) o el mensajero (cDNA) (ID. DE SEC. NO:2) o gen (ver, p.ej., Peng (1997) Science 277:1501-1505) del polipéptido Cdc25C humano (ID. DE SEC. NO: 1). El término también incluye todas las variaciones funcionales del hCdc25C, incluyendo, p.ej., variantes alélicas, mutaciones funcionales, variaciones con adiciones, deleciones, sustituciones que mantienen actividad funcional. Un polipéptido Cdc25C que tiene actividad funcional presenta la misma actividad que el Cdc25C de tipo salvaje, esto es, cuando es fosforilado de forma adecuada, puede actuar en concierto con otros polipéptidos controladores del ciclo celular para detener el crecimiento celular en la fase G2 bajo condiciones adecuadas, p.ej., bajo condiciones en las que se ha producido suficiente daño en el DNA como para inducir apoptosis si la célula pasa por el punto de control G2.

Los términos "tratamiento dañino del DNA" o "agente dañino del DNA" incluyen cualquier tratamiento o agente capaz de causar daños en el DNA de la célula, incluyendo un fármaco, una radiación, un shock ambiental, o similares, incluyendo, p.ej., hipertermia, radiación UV o gamma, además de los fármacos dañinos de DNA conocidos, p.ej., 5-fluorouracilo (5-FU), rebecamicina, adriamicina, bleomicina, cisplatino y similares.

El término "interrumpir el punto de control G2 del ciclo celular" o "inhibir el punto de control G2 del ciclo celular" significa la capacidad de un péptido o polipéptido de la invención para inhibir (incluyendo la eliminación) la actividad de una quinasa Chk1 y/o una quinasa Chk2, p.ej., una quinasa de mamífero, tal como una quinasa Chk1 humana (hChk1) (ID. DE SEC. NO: 3) (ver, p.ej., Yin (2000) Mol. Pharmacol. 57:453-459) o una quinasa Chk2 humana/Cds1 humana (Chk2/HuCds1) (ID. DE SEC. NO:4) (ver, p. ej., Hirao (2000) Science 287:1824-1827), o, para interrumpir (incluyendo la eliminación) la capacidad de una célula de detener el crecimiento en el punto de control G2 bajo condiciones adecuadas, p. ej., en condiciones que de otra manera podrían causar la detención G2 del ciclo celular, tales como la acumulación de daños en el DNA por, p. ej., algunos agentes antitumorales.

La capacidad de un péptido o un polipéptido de la invención para modular o inhibir la actividad de una quinasa Chk1 y/o una quinasa Chk2 puede ser analizada fácilmente in vitro o in vivo, como por ejemplo, en los ensayos, o variaciones de los mismos, descritos más adelante en el Ejemplo 1. Un péptido o un polipéptido es considerado un inhibidor efectivo si, p.ej., se une a la quinasa para inhibir o eliminar su actividad quinasa. De forma alternativa, un péptido o polipéptido se considera también un inhibidor efectivo de la actividad quinasa si actúa como un sustrato de fosforilación e impide la fosforilación del sustrato natural, p.ej., el Cdc25C tipo salvaje, interrumpe de este modo la capacidad de una célula de detener el crecimiento en el punto de control G2 bajo condiciones adecuadas.

La capacidad de los péptidos o polipéptidos de los ejemplos de la invención para interrumpir la capacidad de una célula para detener el crecimiento en el punto de control G2, es decir, actuar en concierto con otros polipéptidos de control del ciclo celular para detener el crecimiento celular en G2 bajo condiciones adecuadas, p. ej., bajo condiciones en las que se ha producido suficiente daño en el DNA como para inducir la apoptosis si la célula pasa a través de el punto de control G2 puede ser fácilmente analizada in vivo, p. ej., en cultivo celular, como se muestra más adelante en el Ejemplo 1.

El término "cassette de expresión" tal y como se utiliza aquí se refiere a una secuencia de nucleótidos la cual es capaz de afectar la expresión de un gen estructural (es decir, una secuencia que codifique una proteína) en un huésped compatible con tales secuencias. Los cassettes de expresión incluyen como mínimo un promotor unido de forma operativa con la secuencia que codifica el polipéptido; y, de forma opcional, con otras secuencias, p.ej., señales de terminación de la trascripción. Factores adicionales necesarios o que ayuden en la expresión pueden ser también utilizados, p.ej, potenciadores de la trascripción. "Unido de forma operativa" tal y como se usa aquí, hace referencia a la conexión de un promotor corriente arriba con una secuencia de DNA de tal forma que el promotor media la trascripción de la secuencia de DNA. Así, los cassettes de expresión también incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes, cualquier forma de vector de "DNA desnudo" recombinante, y similares. Un "vector" comprende un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir una célula de forma transitoria o permanente. Se reconocerá que un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico formando complejos con proteínas o lípidos. El vector comprende de forma opcional ácidos nucleicos virales o bacterianos y/o proteínas, y/o membranas (p. ej., una membrana celular, una envuelta lipídica viral, etc.). Los vectores incluyen, aunque no están limitados a replicones (p. ej., replicones de RNA, bacteriófagos) a los cuales se puede añadir fragmentos de DNA para que sean replicados. Los vectores incluyen de esta manera, aunque no están limitados a RNA, DNA o RNA autónomo autoreplicable circular o lineal (p. ej., plásmidos, virus, y similares, ver, p. ej., Patente estadounidense No. 5,217,879), e incluyen tanto los plásmidos de expresión como los de no expresión. Donde se describe un microorganismo recombinante o un cultivo celular como huésped de un "vector de expresión" esto incluye tanto DNA extracromosómico circular como lineal así como DNA que ha sido incorporado en el cromosoma(s) huésped. Donde el vector es mantenido por la célula huésped, el vector puede ser replicado de forma estable por las células durante la mitosis como una estructura autónoma, o ser incorporado al genoma del huésped.

El término "químicamente unido" se refiere a cualquier unión de tipo químico de dos porciones, p.ej., como en una de las realizaciones de la invención, un polipéptido que comprenda como mínimo dos motivos peptídicos de la invención. Tal unión química incluye la unión peptídica de una proteína de fusión ya sea recombinante o generada in vivo.

El término "proteína quimérica" o "proteína de fusión" se refiere a una composición que comprende al menos un dominio o motivo péptidico o polipeptídico que se encuentra asociado a un segundo dominio o motivo peptídico o polipeptídico. Por ejemplo, en una realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante que codifica una proteína de fusión que comprende como mínimo dos dominios, en donde el primer dominio comprende un motivo inhibidor de quinasa o un motivo inhibidor del punto de control G2 y el segundo dominio comprende un segundo motivo con la misma o similar actividad (por ejemplo, un motivo puede tener una alta afinidad de unión para la quinasa, mientras que el segundo dominio tiene una elevada actividad inhibidora de quinasa).

Dominios adicionales pueden comprender un polipéptido, péptido, polisacárido, o similar. La "fusión" puede ser una asociación generada por un enlace peptídico, un enlace químico, una interacción por carga (p.ej., atracciones electrostáticas, tales como puentes salinos, puentes de hidrógeno, etc.) o similares. Si los polipéptidos son recombinantes, la "proteína de fusión" puede ser traducida a partir de un mensajero común. De forma alternativa, las composiciones de los dominios pueden estar unidas por cualquier tipo de medio químico o electrostático. Las moléculas quiméricas de la invención pueden también incluir secuencias adicionales, p.ej., enlazantes, marcadores epítopos, secuencias diana de digestión enzimática, secuencias señal, señales de secreción, y similares. De forma alternativa, un péptido puede ser unido a un transportador simplemente para facilitar la manipulación o identificación/localización del péptido.

El término "actividad inhibidora del punto de control G2" tal y como se utiliza aquí indica cualquier grado de inhibición del punto de control G2.

El termino "aislado" tal y como aquí se utiliza, cuando se refiere a una molécula o composición, tal como, p.ej., un ácido nucleico o un polipéptido de la invención, significa que la molécula o la composición se ha separado de al menos otro compuesto, tal como una proteína, otros ácidos nucleicos (p.ej., RNA), u otros contaminantes con los cuales se encuentra asociado in vivo o en su estado natural. Así, un ácido nucleico o polipéptido se considera aislado cuando ha sido aislado de cualquier otro componente con el que se encontraba naturalmente asociado, p.ej., una membrana celular, como en un extracto celular. Una composición aislada puede, sin embargo, ser también sustancialmente pura. Una composición aislada puede encontrarse en un estado homogéneo y puede encontrarse en seco o en una solución acuosa. La pureza y homogeneidad puede ser determinada, por ejemplo, utilizando técnicas de química analítica como la electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Así, las composiciones aisladas de esta invención no contienen materiales normalmente asociados a su entorno in situ. Aunque una proteína haya sido aislada a partir de una banda homogénea o dominante, pueden existir contaminantes traza que se co-purifican con la proteína deseada.

Los términos "polipéptido", "proteína", y "péptido" incluyen composiciones de la invención que también incluyen "análogos", o "variantes conservativas" y "miméticos" o "péptidomiméticos" con estructuras y actividades que corresponden de forma sustancial al péptido del cual deriva la variante, incluyendo, p.ej., variaciones de los péptidos y polipéptidos de la invención que son capaces tanto de inhibir las quinasas Chk1 y/o Chk2 de mamífero como de inhibir un punto de control G2 de mamífero.

El término "composición farmacéutica" hace referencia a una composición adecuada para el uso farmacéutico en un sujeto, p.ej., como un agente anticancerígeno. Las composiciones farmacéuticas de esta invención son formulaciones que contienen una cantidad farmacológicamente efectiva de una composición que contenga, p.ej., un péptido, polipéptido, ácido nucleico, vector, o célula de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.

El término "promotor" comprende una serie de secuencias control de ácido nucleico que dirigen la trascripción del ácido nucleico. Tal y como se utiliza aquí, un promotor incluye secuencias necesarias de ácido nucleico cerca del lugar de inicio de la trascripción, tales como, en el promotor del tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor puede contener también de forma opcional elementos potenciadores o represores distales que pueden situarse a varios miles de pares de bases del lugar de inicio de la trascripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de condiciones ambientales y del desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que se encuentra bajo regulación ambiental o del desarrollo. Un promotor "específico de tejido" es activo en determinados tipos de tejido del organismo, pero no en otros tipos de tejido del mismo organismo. El término "unido de forma operacional" se refiere a una conexión funcional entre una secuencia de control de la expresión de ácidos nucleicos (como un promotor, o un conjunto de lugares de unión para factores de trascripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, donde la secuencia de control de la expresión dirige la trascripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

El término "recombinante" se refiere a un polinucleótido sintetizado o de otra forma manipulado in vitro (p.ej., "polinucleótido recombinante"), a métodos que utilizan polinucleótidos recombinantes para producir productos génicos en células u otros sistemas biológicos, o a un polipéptido ("proteína recombinante") codificado por un polinucleótido recombinante. Por ejemplo, péptidos recombinantes o polipéptidos o ácidos nucleicos pueden ser utilizados para practicar los métodos de la invención. "Medios recombinantes" también atañen a la ligación de ácidos nucleicos que presentan varias regiones o dominios codificantes o secuencias promotoras procedentes de diversas fuentes en un cassette de expresión o vector de expresión de, p.ej., expresión inducible o constitutiva de las secuencias que codifican el polipéptido en los vectores utilizados para practicar esta invención.

Ácidos Nucleicos y Vectores de Expresión

Esta invención proporciona nuevos ácidos nucleicos, incluyendo vectores de expresión, para el uso en el tratamiento del crecimiento celular descontrolado, tal como el cáncer, así como medios para hacer y expresar estos ácidos nucleicos. Como los genes y los vectores de la invención pueden hacerse y expresarse in vitro o in vivo, la invención proporciona una variedad de medios para hacer y expresar estos genes y vectores. Los expertos reconocerán que los niveles de expresión deseados de los polipéptidos de la invención pueden ser obtenidos por modulación de la expresión o actividad de los genes y ácidos nucleicos (p.ej., promotores) dentro de los vectores de la invención. Cualquiera de los métodos conocidos descritos para el incremento o disminución de la expresión o de la actividad, incluyendo la expresión específica en tejido, puede ser utilizada para esta invención. La invención puede ser practicada en conjunción con cualquier método o protocolo conocido en el campo, que esté bien descrito en la literatura científica y de patentes.

Técnicas generales

Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención y otros ácidos nucleicos utilizados para practicar la invención, ya sean RNA, cDNA, DNA genómico, vectores, virus o híbridos de los mismos, pueden ser aislados de una variedad de fuentes, por ingeniería genética, amplificados, y/o expresados de forma recombinante. Cualquier sistema de expresión recombinante puede ser utilizado, incluyendo, además de las células bacterianas, p.ej., sistemas de expresión celular de mamífero, levadura, insecto o vegetal.

De forma alternativa, estos ácidos nucleicos pueden ser sintetizados in vitro por medio de técnicas de síntesis química bien conocidas, como se describe p.ej., en Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; Patente Estadounidense No. 4,458,066. Fragmentos de DNA de doble cadena pueden también ser obtenidos, ya sea por la síntesis de la cadena complementaria y posterior anillamiento de las cadenas bajo condiciones adecuadas, o añadiendo la cadena complementaria utilizando DNA polimerasa con una secuencia cebadora adecuada.

Técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, tales como, p.ej., la generación de mutaciones en las secuencias, subclonaje, marcaje de sondas, secuenciación, hibridación y similares se encuentran bien descritas en la literatura científica y de patentes, ver p.ej., Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).

Ácidos nucleicos, vectores, cápsides, polipéptidos, y similares pueden ser analizados y cuantificados a través de un gran número de medios generales que son bien conocidos por aquellos que son expertos en el campo. Estos medios incluyen, p.ej., métodos analíticos bioquímicos tales como RMN, espectrofotometría, radiografía, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía en capa fina (CCF), y cromatografía por hiperdifusión, varios métodos inmunológicos, p.ej., reacciones de precipitación en fluido o en gel, inmunodifusión, inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), ensayo de inmunofluorescencia, análisis Southern, análisis Northern, análisis dot-blot, electroforesis en gel (p.ej., SDS-PAGE), métodos de marcaje o amplificación de señal en ácidos nucleicos, radiomarcaje, conteo por centelleo, cromatografía de afinidad. Los métodos de amplificación incluyen, p.ej., la reacción en cadena de la polimerasa, PCR (PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., la reacción en cadena de la ligasa (LCR)(ver, p.ej., Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificación de la trascripción (ver, p.ej., Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173); y, replicación de secuencia autosostenida (ver, p.ej., Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874); amplificación por la replicasa Q-Beta (ver, p.ej., Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491), ensayo de amplificación automatizada por la replicasa Q-Beta (ver, p.ej., Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271) y otras técnicas mediadas por RNA polimerasa (p. ej., NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); ver también Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; Patentes Estadounidenses Nos. 4,683,195 y 4,683,202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-
564.

Una vez amplificadas, las librerías pueden ser clonadas, si se desea, en variedad de vectores utilizando métodos rutinarios en biología molecular; métodos para la clonación de ácidos nucleicos amplificados in vitro se encuentran descritos, p.ej., en la Patente Estadounidense No. 5,426,039. Para facilitar la clonación de las secuencias amplificadas, se pueden introducir dianas de restricción a través del par de cebadores de la PCR.

La invención proporciona librerías de expresión de vectores codificantes para polipéptidos y péptidos de la invención. Estos ácidos nucleicos pueden ser introducidos en el genoma o en el citoplasma o en el núcleo de una célula y ser expresados por medio de una variedad de técnicas convencionales, bien descritas en la literatura científica y de patentes. Ver, p.ej., Roberts (1987) Nature 328:731; Schneider (1995) Protein Expr. Purif. 6435:10; Sambrook, Tijssen o Ausubel. Los vectores pueden ser aislados a partir de fuentes naturales, obtenidos de tales fuentes como librerías ATCC o librerías GenBank, o preparados por medio de métodos sintéticos o recombinantes. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la invención pueden ser expresados en cassettes de expresión, vectores o virus que son expresados de forma estable o transitoria en células (p.ej., sistemas de expresión episómica). Marcadores de selección pueden ser incorporados en los cassettes de expresión y vectores para conferir un fenotipo seleccionable a las células transformadas y secuencias. Por ejemplo, los marcadores de selección pueden codificar para un mantenimiento y replicación episomal de tal forma que no se requiera la integración en el genoma del huésped.

En una realización, los ácidos nucleicos de la invención se administran in vivo para la expresión in situ de los péptidos o polipéptidos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden ser administrados como "DNA desnudo" (ver, p.ej., Patente Estadounidense No. 5,580,859) o bajo la forma de vector de expresión, p.ej., un virus recombinante. Los ácidos nucleicos pueden ser administrados por cualquier vía, incluyendo peri- o intra-tumoralmente, tal y como se describe más adelante. Los vectores administrados in vivo pueden ser derivados de genomas virales, incluyendo virus de DNA o RNA recombinantemente modificados con o sin envuelta, preferiblemente seleccionados a partir de baculoviridae, parvoviridae, picornoviridae, herpesviridae, poxviridae, adenoviridae, o picornaviridae. Los vectores quiméricos pueden ser también utilizados explotando las características más ventajosas de cada uno de los vectores parentales (ver p.ej., Feng (1997) Nature Biotechnology 15:866-870). Tales genomas virales pueden ser modificados por medio de técnicas de DNA recombinante para incluir los ácidos nucleicos de la invención; y pueden además ser diseñados para ser deficientes en la replicación, condicionalmente replicables o competentes para la replicación. En realizaciones alternativas, los vectores derivan de genomas adenovíricos (p.ej., los vectores incompetentes para replicación derivados de del genoma del adenovirus humano, ver, p.ej., Patente Estadounidense Nos. 6,096,718; 6,110,458; 6,113,913; 5,631,236); genomas virales adeno-asociados y genomas retrovíricos. Los vectores retrovíricos pueden incluir aquellos que se basan en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y combinaciones de los mismos; ver, p.ej., U.S. Patent Nos. 6,117,681; 6,107,478; 5,658,775; 5,449,614; Buchscher (1992) J. Virol. 66:2731-2739; Johann (1992) J. Virol. 66:1635-1640). Los vectores basados en virus adeno-asociados (AAV) pueden ser utilizados para transducir células con ácidos nucleicos diana, p.ej., en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y procedimientos in vivo y ex vivo de terapia génica; ver, p. ej., Patente Estadounidense Nos. 6,110,456; 5,474,935; Okada (1996) Gene Ther. 30 3:957-964.

Los péptidos y polipéptidos de la invención son derivados de, o están basados en, la estructura de la quinasa Cdc25C. La secuencia del ácido nucleico cDNA para hCdc25C es

1

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La secuencia de aminoácidos del hCdc25C humano es

3

Ver también, p.ej., Números de acceso GenBank NP 001781 (proteína) y NM 001790 (ácido nucleico, cDNA) y Sadhu (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:5139-5143.

Péptidos y Polipéptidos

Los péptidos y polipéptidos de la invención pueden ser administrados para tratar trastornos del ciclo proliferativo, incluyendo, p.ej., para detener el crecimiento de, o matar, células cancerosas. Los péptidos y polipéptidos de esta invención pueden ser utilizados para inhibir (p.ej., retrasar) o eliminar la detención en el punto de control G2 del ciclo celular. Los péptidos y polipéptidos de la invención también pueden ser utilizados para inhibir la actividad quinasa Chk1 y/o Chk2/Cdsl.

Mientras los péptidos y los polipéptidos de la invención se pueden expresar de forma recombinante in vivo después de administrar ácidos nucleicos, como se describe anteriormente, también pueden ser administrados directamente, p. ej., como una composición farmacéutica.

Polipéptidos y péptidos de la invención pueden ser aislados a partir de fuentes naturales, ser sintéticos, o polipéptidos generados por recombinación. Péptidos y proteínas pueden ser expresados por recombinación in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos de la invención se pueden hacerse y aislarse utilizando cualquier método conocido en el campo. Polipéptidos y péptidos de la invención también pueden ser sintetizados, enteros o por partes, utilizando métodos químicos bien conocidos en el campo. Ver p.ej., Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por ejemplo, la síntesis de péptidos se puede llevar a cabo utilizando varias técnicas de fase-sólida (ver p.ej., Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13) y la síntesis automatizada se puede conseguir, p.ej., utilizando el Sintetizador de Péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Los péptidos y polipéptidos de la invención, como se definen anteriormente, incluyen todos las formas "miméticas" y "peptidomiméticas". Los términos "mimético" y "peptidomimético" se refieren a compuestos químicos sintéticos que tienen sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales que los polipéptidos de la invención. Los miméticos pueden estar enteramente compuestos de aminoácidos sintéticos, análogos no naturales, o, es una molécula quimérica con parte de aminoácidos peptídicos naturales y con parte de análogos de aminoácidos no naturales. Los miméticos también pueden incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservativas de aminoácidos naturales siempre que las sustituciones no alteren sustancialmente la estructura del mimético y/o actividad. Como con los polipéptidos de la invención que son variantes conservativas, la experimentación rutinaria determinará si un mimético está dentro del objetivo de la invención, es decir, que su estructura y/o función no se altera sustancialmente. En consecuencia, una composición mimética está dentro del objetivo de la invención si, cuando se administra o se expresa en una célula, ésta interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular. Una composición mimética también puede estar dentro del objetivo de la invención si puede inhibir la actividad quinasa Chk1 y/o Chk2/Cdsl, o, unirse al centro activo de cualquiera de estos enzimas.

Composiciones miméticas polipeptídicas pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales, que son habitualmente de tres grupos estructurales: a) grupos de unión de residuo distintos de la unión natural por enlace amida ("enlace peptídico"); b) residuos no-naturales en lugar de residuos aminoacídicos de aparición natural; o c) residuos que inducen mimetización de la estructura secundaria, es decir, para inducir o estabilizar una estructura secundaria, p.ej., un giro beta, un giro gamma, hoja beta, conformación hélix alfa, y similares. Por ejemplo, un polipéptido se puede caracterizar como un mimético cuando todos o algunos de sus residuos por medios químicos en lugar de enlaces peptídicos naturales. Residuos peptidomiméticos individuales se pueden unir por enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, tales como, p.ej., glutaraldehido, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Grupos de unión que pueden ser una alternativa a la unión tradicional por enlace amida ("enlace peptídico") incluyen, p.ej., cetometileno (p.ej., -C(=O)-CH_{2}- para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH_{2}-NH), etileno, olefino (CH=CH), éter (CH_{2}-O), tioéter (CH_{2}-S), tetrazol (CN_{4}-), tiazol, retroamida, tioamida, o éster (ver, p.ej., Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol.7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NY).

Un polipéptido también puede ser caracterizado como mimético por contener todos o algunos residuos no naturales en lugar de residuos aminoacídicos de aparición natural. Residuos no naturales están bien descritos en la literatura científica y de patentes; unas cuantas composiciones no naturales ejemplares útiles como miméticos de residuos aminoacídicos naturales y las líneas directivas se describen a continuación. Miméticos de aminoácidos aromáticos se pueden generar por sustitución con, p.ej., D- o L-nafilalanina; D-o L-fenilglicina; D- o L-2 tienilalanina; D- o L-1, -2, 3-, o 4-pireneilalanina; D- o L-3 tienilalanina; D- o L-(2-piridinil)-alanina; D- o L-(3-piridinil)-alanina; D- o L-(2-pirazinil)-alanina; D- o L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilalanina; D-p-fluoro-fenilalanina; D- o L-p-bifenilfenilalanina; K- o L-p-metoxi-bifenilfenilalanina; D- o L-2-indol(alquil)alaninas; y, D- o L-alquilaininas, donde alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, iso-butilo, sec-isotilo, iso-pentilo sustituido o no sustituido, o aminoácidos no acídicos. Anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluye, p.ej., anillos aromáticos tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, benzimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo, y piridilo.

Miméticos de aminoácidos acídicos se pueden generar por sustitución con, p.ej., aminoácidos no carboxilados manteniendo una carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfato. Grupos carboxilo laterales (p.ej., aspartilo o glutamilo) también pueden ser selectivamente modificados por reacción con carbodiimidas (R'-N-C-N-R') tal como, p. ej., 1-ciclohexil-3(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1-etil-3(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Aspartilo o glutamilo también pueden ser convertidos a residuos asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.

Miméticos de aminoácidos básicos se pueden generar por sustitución con, p.ej., (en adición a lisina y arginina) los aminoácidos ornitina, citrulina, o ácido (guanidino)acético, o ácido (guanidino)alquilacético, donde alquilo se define anteriormente. Derivados nitrilo (p.ej., conteniendo una porción CN en lugar de COOH) se pueden sustituir por asparagina o glutamina. Los residuos asparaginilo y glutaminilo se pueden desaminar a los correspondientes residuos aspartilo o glutamilo.

Miméticos del residuo arginina pueden ser generados reaccionando arginilo con, p.ej., uno o más reactivos convencionales, incluyendo, p.ej., fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, o ninhidrina, preferiblemente bajo condiciones alcalinas. Miméticos del residuo tirosina se pueden generar reaccionando tirosilo con, p.ej., compuestos diazonio aromáticos o tetranitrometano. N-acetilimidizol y tetranitrometano se pueden utilizar para formar especies tirosil O-acetil y derivados 3-nitro, respectivamente. Miméticos del residuo cisteina se pueden generar reaccionando residuos cisteínilo con, p.ej., alfa-haloacetatos tales como ácido 2-cloroacético o cloroacetamida y aminas correspondientes; para dar derivados carboximetilo o derivados carboxiamidometilo. Miméticos del residuo cisteina también pueden ser generados reaccionando residuos cisteinil con, p.ej., bromo-trifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil) propionico; fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil bisulfuro; metil 2-piridil bisulfuro; p-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4-nitrofenol; o, cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Miméticos de lisina se pueden generar (y se pueden alterar residuos amino-terminales) reaccionando lisinilo con, p.ej., succínico u otros ácidos carboxílicos anhídridos. Miméticos de lisina y de otros residuos que contienen alfa-amino pueden también ser generados por imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidrato, ácido trinitrobenzenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona, y reacciones con glioxilato catalizadas por transamidasa. Miméticos de metionina se pueden generar por reacción con, p.ej., sulfóxido de metionina. Miméticos de prolina incluyen, p.ej., ácido pipecólico, ácido carboxílico tiazolidina, 3- o 4- hidroxi prolina, dihidroprolina, 3- o 4-metilprolina, o 3,3,-dimetilprolina. Miméticos de residuo de histidina pueden ser generados reaccionando histidilo con, p.ej., dietilprocarbonato o bromuro de para-bromofenacilo. Otros miméticos incluyen, p.ej., aquellos generados por hidroxilación de prolina y lisina; fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo y treonilo; metilación de grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina; acetilación de la amina N-terminal; metilación de los residuos amida de la cadena principal o sustitución con aminoácidos N-metilo; o amidación de grupos carboxílicos C-terminal.

Un componente de un polipéptido de la invención también puede ser reemplazado por un aminoácido (o residuo peptidomimético) de quiralidad opuesta. Así, cualquier aminoácido de aparición natural de configuración L (al que también se puede referir como el R o S, según la estructura de la entidad química) se puede sustituir con el aminoácido de el mismo tipo de estructura química o un peptidomimético, pero de quiralidad opuesta, referido como el D-aminoácido, pero que puede adicionalmente ser referido como la forma R- o S-.

El profesional experto reconocerá que residuos sintéticos individuales y polipéptidos que incorporan estos miméticos pueden ser sintetizados usando una variedad de procedimientos y metodologías, los cuales están bien descritos en la literatura científica y de la patente, por ejemplo, Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY. Péptidos y miméticos peptídicos de la invención también se pueden sintetizar usando metodologías combinatorias. Varias técnicas para la generación de librerías de péptidos y peptidomiméticos son bien conocidas, e incluyen, por ejemplo, las técnicas multipin, bolsa de te, y split-couple-mix; ver, p.ej., al-Obeidi (1998) Mol. Bíotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27; Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234. Péptidos modificados de la invención además pueden ser producidos por métodos de modificación química, ver, p.ej., Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896.

Los péptidos y polipéptidos de la invención también se pueden sintetizar y expresar como proteínas de fusión con uno o más dominios adicionales conectados a éstos, por ejemplo, produciendo un péptido más inmunogénico, para aislar más fácilmente un péptido sintetizado recombinantemente, para identificar y aislar anticuerpos y anticuerpos que expresan las células B, y similares. La detección y purificación que facilita los dominios incluye, p.ej., péptidos que quelan metales tales como tractos de polihistidina, y módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulinas inmovilizadas, y el dominio utilizado el sistema de purificación extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). La inclusión de un conector de secuencias que se puede dividir tal como el Factor Xa o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego CA) entre un dominio de purificación y el péptido que contiene el motivo o el polipéptido para facilitar la purificación. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos que codifique el epítopo conectado a seis residuos de histidina seguidos por una tioredoxina y un sitio de escisión para la enteroquinasa (ver p.ej., Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-14). Los residuos de histidina facilitan la detección y la purificación mientras que el sitio de escisión de la enteroquinasa proporciona una manera para purificar el epítopo del resto de proteínas de fusión. La tecnología relativa a los vectores que codifican las proteínas de fusión y la aplicación de proteínas de fusión están bien descritas en la literatura científica y de la patente, ver p.ej., Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53.

La invención proporciona métodos para inhibir in vitro la actividad de una quinasa Chk1 o una quinasa Chk2. La invención también proporciona métodos para el cribado de composiciones que inhiben la actividad de, o unen a (p.ej., unir al sitio activo), quinasa Chk 1 y/o una quinasa Chk2. La secuencia de aminoácidos de la quinasa Chk1 humana es

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Ver también, Sanchez (1997) Science 277:1497-1501; Genbank Accession Nos. AF 016582; AAC 51736; NP 001265, NM 001274.

La secuencia de aminoácidos de la quinasa chk2 humana es

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Ver también Brown (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3745-3750; Chaturvedi (1999) Oncogene 18:4047-4054; Genbank Accession Nos. NP 009125; NM 007194.

Generación de anticuerpos

La invención proporciona anticuerpos que unen específicamente a los péptidos y polipéptidos de la invención. Estos anticuerpos se pueden usar para identificar la presencia de estos péptidos y polipéptidos. Los péptidos y polipéptidos de la invención se pueden usar como immunógenos para generar anticuerpos específicos para una fosfatasa Cdc25C correspondiente. Los anticuerpos anti-péptidos de la invención se pueden usar para generar anticuerpos anti-idiotipos de que se unen específicamente a los sitios activos de las quinasas Chk1 o Chk2.

Métodos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales son conocidos por expertos en el campo y están descritos en la literatura científica y de la patente, ver, p.ej., Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Hanlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spning Harbor Publications, New York. Los anticuerpos pueden ser generados in vitro, p.ej., usando sitios de unión de anticuerpos recombinantes expresando librerías expuestas de fagos, además de los métodos tradicionales in vivo usando animales. Ver, p.ej., Huse (1989) Science 246:1275; Ward (1989) Nature 341:544; Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45. Los anticuerpos humanos pueden ser generados en ratones ingeniados para producir solamente anticuerpos humanos, como se describe en, p.ej., Patente Estadounidense No. 5,877,397; 5,874,299; 5,789,650; y 5,93 9,598. Las células B de estos ratones pueden ser inmortalizados usando técnicas estándar (p.ej., fusionando con una línea celular inmortalizada tal como un mieloma o manipulando tales células B mediante otras técnicas para perpetuar una línea celular) para producir células que produzcan anticuerpo monoclonal humano. Ver, p.ej., Patente Estadounidense No 5,916,771; 5,985,615. Para hacer quiméricos, p.ej.,"humanizados", anticuerpos, ver p.ej., Patentes Estadounidenses Nos. 5,811,522; 5,789,554; 5,861,155. Alternativamente, los anticuerpos recombinantes también pueden ser expresados por vectores de expresión transitorios o estables en mamíferos, incluyendo humanos, células como en Norderhaug (1997) J. Immunol. Methods 204:77-87; Beden (1997) Nat. Biotechnol. 15:553-557; ver también patente Estadounidense No. 5,976,833

Cribado para los compuestos candidatos

La invención proporciona composiciones y métodos para el cribado de potenciales compuestos terapéuticos ("compuestos candidatos") para inhibir o eliminar la actividad de las quinasas Chk1 y/o Chk2/Cds1 y/o la detención en el punto de control G2 del ciclo celular. Por ejemplo, el cribado puede involucrar ensayos in vitro o in vivo en donde las quinasas Chk1 y Chk2/Cds1 fosforilan péptidos y polipéptidos que comprenden los motivos de la invención; ver Ejemplo 1, más adelante. Inhibidores de la fosforilación peptídica son compuestos candidatos. Alternativamente, los ensayos que incorporan los experimentos, o variaciones de los mismos, como se publica en el Ejemplo 1, más adelante, puede ser diseñado para ensayar para compuestos candidatos los cuales pueden inhibir o eliminar la actividad de las quinasas chk1 y/o Chk2/Cds1 y/o la detención en el punto de control G2 del ciclo celular.

En una realización, los péptidos y polipéptidos de la invención pueden ser unidos a un soporte sólido. Los soportes sólidos pueden incluir, p.ej.,membranas (p.ej., nitrocelulosa o nylon), una placa microtiter (p.ej.,PVC, polipropileno o polistireno), un tubo de ensayo (cristal o plástico), una varilla indicadora (p.ej., vidrio, PVC, polipropileno, polistireno, látex, y similares), un tubo microfuga, o un abalorio de vidrio, sílice, plástico, metálico o polímero u otro sustrato tal como papel. Un soporte sólido usa un metal (p.ej., cobalto o níquel)- que comprende una columna la cual se une con especificidad a un marcador de histidina diseñado sobre un péptido.

Adhesión de péptidos a un soporte sólido puede ser directa (es decir la proteína contacta el soporte sólido) o indirecta (un compuesto particular o compuestos son unidos al soporte y la proteína diana se une a este compuesto más bien que al soporte sólido). Los péptidos pueden ser inmovilizados tanto covalentemente (p.ej., utilizando grupos tiol reactivos individuales de residuos de cisteina,(ver, p.ej. Colliuod (1993) Bioconjugate Chem. 4:528-536) como no-covalentamente pero específicamente (p.ej., mediante anticuerpos inmovilizados (ver, p.ej., Schuhmann (1991) Adv. Mater. 3:388-391; Lu(1995)Anal. Chem. 67:83-87; el sistema biotina/estreptavidina (ver, p.ej., Iwane (1997) Biophys. Biochem. Res. Comm. 230:76-80); quelantes de metales, p.ej., Langmuir-Blodgett films (ver, p. ej., Ng (1995) Langmuir 11:4048-55); monocapas autoensambladas de quelantes de metales (ver, p.ej., Sigal (1996) Anal.Chem. 68:490-497) para la unión de fusiones de polihistidina.

La unión indirecta se puede conseguir usando una variedad de conectores que están disponibles comercialmente. Los reactivos finales pueden ser cualesquiera de una variedad de funcionalidades incluyendo, pero no limitadas a: amino terminales reactivos tales como ésteres activos de N-hidroxisuccinimida (NHS), imidoésteres, aldehídos, epóxidos, hálidos de sulfonilo, isocianato, isotiocianato, y hálidos de nitroarilo; y tioles terminales reactivos tales como piridil disulfuros, maleimidas, tioftalimidas, y halógenos activos. Los reactivos entrecruzadores heterobifuncionales tienen dos terminaciones reactivas diferentes, p.ej.,un reactivo amino terminal y un reactivo tiol terminal, mientras que reactivos homobifuncionales tienen dos terminaciones reactivas similares, p. ej., bismaleimidohexano (BMH) el cual permite el entrecruzamiento de los compuestos que contienen sulfhidrilo. El espaciador puede ser de longitud variada, y puede ser alifático o aromático. Ejemplos de reactivos de entrecruzamiento homobifuncionales disponibles comercialmente incluyen, pero no se limitan a, los imidoésteres tales como dihidrocloruro de adipimidato de dimetilo (DMA); dihidrocloruro de pimelimidato de dimetilo (DMP); y dehidrocloruro de suberimidato de dimetilo (DMS). Los reactivos heterobifuncionales incluyen agentes de acoplamiento ésteres activos NHS-halógeno activo disponibles comercialmente como bromoacetato de N-succinimidil y (4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB) y los derivados de sulfosuccinimidilo tales como sulfosuccinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB) (Pierce). Otro grupo de agentes de acoplamiento es el de los agentes heterobifuncionales y tiólicos divisibles tales como N-succinimidil-3-(2-piridiiditio)propionato (SPDP) (Pierce Chemicals, Rockford, IL).

Los anticuerpos se pueden usar para unir polipéptidos y péptidos de la invención en un soporte sólido. Esto se puede hacer directamente uniendo anticuerpos específicos de un péptido a la columna o se puede hacer creando quimeras de proteínas de fusión que comprenden péptidos que contienen el motivo unido a, p.ej., un epítopo conocido (p.ej., un marcador (p.ej., FLAG, myc) o una secuencia apropiada de un dominio constante inmunoglobulina (una "immunoadhesina", ver, p.ej., Capon(1989) Nature 377:525-531 (1989).

Hay una variedad de formatos de ensayo que se pueden usar para cribar los "compuestos candidatos" para inhibir o eliminar la actividad quinasa Chk1 y/o Chk2/Cds1 y/o la detención del punto de control G2 del ciclo celular. Por ejemplo, como se discutió anteriormente, compuestos que inhiben la fosforilación de los péptidos de la invención que contienen el motivo pueden ser compuestos candidatos. Alternativamente, compuestos que se unen específicamente a los motivos de la invención pueden ser compuestos candidatos. Para una descripción general de diferentes formatos para enlazar ensayos, ver, p.ej., BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 7ª Ed. (D. Stiles y A. Terr, ed.)(1991); ENZYME IMMUNOASSAY, E.T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida (1980); y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" en P. Tijssen, LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier Science Publishers, B.V. Amsterdam (1985).

Librerías químicas combinatorias

Librerías químicas combinatorias son una manera de asistir en la generación de nuevos compuestos químicos principales, es decir, compuestos que inhiben las quinasas Chk1 y/o quinasa Chk2/Cdsl y/o inhiben y eliminan la detención en el punto de control G2 del ciclo celular. Una librería química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados por tanto síntesis química como biológica combinando numerosos "bloques de construcción" químicos como reactivos. Por ejemplo, una librería química combinatoria lineal tal como una librería de polipéptidos se forma combinando un conjunto de bloques de construcción químicos llamados aminoácidos en todas las formas posibles para una longitud de compuesto dada.(es decir., el número de aminoácidos en un compuesto polipeptídico). Millones de compuestos químicos pueden ser sintetizados a través de tal mezcla combinatoria de bloques de construcción químicos. Por ejemplo, la sistemática, mezcla combinatoria de 100 bloques de construcción químicos intercambiables resulta en la síntesis teórica de 100 millones de compuestos tetraméricos o 10 billones de compuestos pentaméricos (ver, p.ej., Gallop et al. (1994) 37(9):1233-1250). La preparación y el cribado de librerías químicas combinatorias son bien conocidos por los expertos en el campo, ver, p.ej., Patente Estadounidense No. 6,004,617; 5,985,356. Tales librerías químicas combinatorias incluyen, pero se limitan a, librerías de péptidos (ver, p.ej., Patente estadounidense No. 5,010,175; Furka (1991) Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493, Houghton et al. (1991) Nature, 354:84-88). Otras químicas para la generación de librerías de diversidad química incluyen, pero no se limitan a: peptoides (ver, p.ej., WO 91/19735), péptidos codificados (ver, p.ej., WO 93/20242), bio-oligómeros aleatorios (ver, p.ej., WO 92/00091), benzodiacepinas (ver, p.ej., Patente Estadounidense No. 5,288,514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiacepinas y dipéptidos (ver, p.ej., Hobbs (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913), polipéptidos vinilogosos (ver, p.ej., Hagihara (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568), peptidomiméticos no peptídico con un andamio de Beta-D-Glucosa (ver, p.ej., Hirschmann (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218), síntesis orgánica análoga de librerías de compuestos pequeños (ver, p.ej., Chen (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116:2661), oligocarbamatos (ver, p.ej., Cho (1993) Science 261:1303), y/o peptidil fosfonatos (ver, p.ej., Campbell (1994) J. Org. Chem. 59: 658). Ver también Gordon (1994) J. Med. Chem. 37:1385; para librerías de ácidos nucleicos, ver, p.ej., Patente Estadounidense No. 5,539,083; para librerías de anticuerpos, ver, p.ej., Vaughn (1996) Nature Biotechnology 14:309-314; para librerías de carbohidratos, ver, p.ej., Liang et al. (1996) Science 274:1520-1522, Patente Estadounidense No. 5,593,853; para librerías de moléculas orgánicas pequeñas, ver, p.ej., para isoprenoides Patente Estadounidense 5,569,588; para tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente Estadounidense No. 5,549,974; para pirrolidinas, Patente Estadounidense Nos. 5,525,735 y 5,519,134; para compuestos morfolínicos, Patente estadounidense No. 5,506,33 7; para benzodiacepinas Patente Estadounidense No. 5,288,514.

Dispositivos para la preparación de librerías combinatorias están comercialmente disponibles (ver, p.ej., Patente Estadounidense No. 6,045,755; 5,792,43 1; 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). Un número de sistemas robóticos han estado también desarrollados para químicas de fase solución. Estos sistemas incluyen estaciones de trabajo automatizadas, p.ej., como el aparato de síntesis automatizada desarrollado por Takeda Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japón) y varios sistemas robóticos que utilizan armas robóticas (Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.) los cuales imitan las operaciones manuales sintéticas ejecutadas por un químico. Cualquier dispositivo de los anteriores son adecuados para usarlo con la presente invención. La natura e implantación de modificaciones de estos dispositivos (si hay) a fin de que puedan operar como se discutió aquí serán aparentes en personas expertas en el campo relevante. Además, numerosas librerías combinatorias están ellas mismas disponibles comercialmente (ver, p.ej., ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).

Formulación y Administración de composiciones farmacéuticas

En una realización, los péptidos y polipéptidos de la invención están combinados con un transportador farmacéuticamente aceptable (excipiente) para formar una composición farmacéutica. Transportadores farmacéuticamente aceptables pueden contener un compuesto fisiológicamente aceptable que actúa para, p.ej., estabilizar, o incrementar o disminuir los índices de absorción o aclaramiento de las composiciones farmacéuticas de la invención. Compuestos fisiológicamente aceptables pueden incluir, p.ej., carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa, o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular, composiciones que reducen el aclaramiento o hidrólisis de los péptidos y polipéptidos, o excipientes u otros estabilizadores y/o tampones. Detergentes pueden también ser utilizados para estabilizar o para incrementar o disminuir la absorción de composiciones farmacéuticas, incluyendo transportadores liposomales. Transportadores farmacéuticamente aceptables para péptidos y polipéptidos son conocidos por los profesionales expertos y están descritos en detalle en la literatura científica y de patente, ver p.ej., la última edición de Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania ("Remington's").

Otros compuestos fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes emulsificantes, agentes dispersantes o conservantes los cuales son particularmente útiles para la prevención del crecimiento o acción de microorganismos. Varios conservantes son bien conocidos e incluyen, p.ej., fenol y ácido ascórbico. Un experto en el campo apreciaría que la elección de un transportador farmacéuticamente aceptable que incluya un compuesto fisiológicamente aceptable depende, por ejemplo, de la vía de administración del péptido o polipéptido de la invención y de sus características físico-químicas particulares.

En una realización, una solución de péptido o polipéptido de la invención se disuelve en un transportador farmacéuticamente aceptable, p.ej., un transportador acuoso si la composición es soluble en agua. Ejemplos de soluciones acuosas que pueden ser usadas en formulaciones para la administración enteral, parenteral o transmucosal del fármaco incluyen, p.ej., agua, salina, fosfato tamponado salino, solución de Hank, solución de Ringer, dextrosa/salina, soluciones de glucosa y similares. Las formulaciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiere para aproximar a condiciones fisiológicas, tales como agentes tamponadores, agentes para ajustar la tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. Los aditivos pueden también incluir principios activos adicionales tales como agentes bactericidas, o estabilizadores. Por ejemplo, la solución puede contener acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano u oleato de trietanolamina. Estas composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas convencionales, bien conocidas, o pueden ser esterilizadas por filtración. Las soluciones resultantes acuosas pueden ser empaquetadas para usar como están, o liofilizadas, la preparación liofilizada siendo combinadas con una solución acuosa estéril previa a la administración. La concentración del péptido en estas formulaciones puede variar ampliamente, y será seleccionada ante todo basado en los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente.

Formulaciones sólidas pueden ser usadas para administración enteral (oral). Pueden ser formuladas como, p.ej., píldoras, comprimidos, polvos o cápsulas. Para composiciones sólidas, se pueden usar transportadores sólidos no tóxicos los cuales incluyen, p.ej., manitol de grado farmacéutico, lactosa, almidón, estereato magnésico, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato magnésico, y similares. Para administración oral, una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma por incorporación de cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como esos transportadores previamente citados, y generalmente de 10% a 95% del principio activo (p.ej., péptido). Una formulación no sólida también se puede usar para administración enteral. El transportador puede ser seleccionado de entre varios aceites incluyendo aquellos de origen en petróleo, animal, vegetal o sintético, p.ej., aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen p.ej., almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, cebada, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estereato magnésico, estereato sódico, monoestereato de glicerol, cloruro sódico, leche descremada desecada, glicerol, propilenglicol, agua, etanol.

Péptidos y polipéptidos de la invención, cuando se administran oralmente, pueden ser protegidos de la digestión. Esto puede ser cumplido tanto por complexión del péptido o polipéptido con una composición para subministrarle resistencias a la hidrólisis acídica o enzimática como por empaquetamiento del péptido o complejo en un transportador apropiadamente resistente tal como un liposoma. Formas de proteger compuestos de la digestión son bien conocidos en el campo, ver, p.ej., Fix (1996) Pharm Res. 13:1760-1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119-135; Patente Estadounidense 5,391,377, describiendo composiciones de lípido para la administración oral de agentes terapéuticos (la administración liposomal se discute en más detalle, abajo).

La administración sistémica puede ser también por vía transmucosal o transdermal. Para la administración transmucosal o transdermal, agentes penetrantes apropiados para poder atravesar la barrera pueden ser usados en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en el campo, e incluyen, p.ej., para la administración transmucosal, sales biliares y derivados del ácido fusídico. Además, se pueden usar detergentes para facilitar la permeación. La administración transmucosal puede ser a través de aerosoles nasales o usando supositorios. Ver, p.ej., Sayani (1996) "Systemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosae" Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13:85-184. Para la administración tópica, transdermal, los agentes están formulados en ungüentos, cremas, pomadas, polvos y geles. Los sistemas de administración transdermal también pueden incluir, p.ej., parches.

Los complejos peptídicos y polipeptídicos pueden también ser administrados en forma de administración sostenida o mecanismos de liberación sostenida, los cuales pueden entregar la formulación internamente. Por ejemplo, microesferas biodegradables o cápsulas u otras configuraciones poliméricas biodegradables capaces de sostener la liberación de un péptido pueden estar incluidas en las formulaciones de la invención (ver, p.ej., Putney (1998) Nat. Biotechnol. 16:153-157).

Para inhalación, el péptido o polipéptido puede ser administrado usando cualquier sistema conocido en el campo, incluyendo aerosoles de polvos secos, sistemas líquidos de administración, nebulizadores de aire a presión, sistemas propulsores, y similares. Ver, p.ej., Patton (1998) Biotechniques 16:141-143; producto y sistemas de administración por inhalación de macromoléculas polipeptídicas por, p. ej., Dura Pharmaceuticals (San Diego, CA), Aradigm (Hayward, CA), Aerogen (Santa Clara, CA), Inhale Therapeutic Systems (San Carlos, CA), y similares. Por ejemplo, la formulación farmacéutica puede ser administrada en forma de un aerosol o niebla. Para la administración en aerosol, la formulación puede ser subministrada finamente dividida junto con un surfactante y propulsor. En otra realización, el dispositivo para administrar la formulación a tejido respiratorio, es un inhalador en el que la formulación vaporiza. Otros sistemas de administración líquida incluyen, p.ej., nebulizadores de aire a presión.

En la preparación de formulaciones farmacéuticas de la presente invención, una variedad de modificaciones de la formulación puede ser usada y manipulada para alterar la farmacocinética y la biodistribución. Un número de métodos para alterar la farmacocinética y la biodistribución son conocidos por los expertos habituales del campo. Ejemplos de tales métodos incluyen protección de los complejos en vesículas compuestas de sustancias tales como proteínas, lípidos (por ejemplo, liposomas, ver adelante), carbohidratos, o polímeros sintéticos (discutido anteriormente). Para una discusión general de la farmacocinética, ver, p.ej., los capítulos 37-39 de Remington's.

Los complejos peptídicos y polipeptídicos usados en los métodos de la invención pueden ser administrados solos o como composiciones farmacéuticas mediante cualquier medio conocido en el campo, p.ej., sistémicamente, regionalmente, o localmente (p.ej., directamente dentro, o dirigido a, un tumor); por administración intraarterial, intratecal (IT), intravenosa(IV), parenteral, cavidad intra-pleural, tópica, oral, o local, como subcutánea, intra-traqueal (p.ej., por aerosol) o transmucosal (p.ej., bucal, vejigal, vaginal, uterina, rectal, mucosa nasal). Métodos actuales para preparar composiciones administrables serán conocidas o aparentes para aquellos expertos en el campo y están descritas en detalle en la literatura específica y de la patente, ver p.ej., la del Remington. Para un "efecto regional", p.ej., centrarse en un órgano específico, un modo de administración incluye inyecciones intra-arteriales o intratecales(IT), p.ej., centrarse en un órgano específico, p.ej., el cerebro y SNC (ver p.ej., Gurun(1997) Anesth Analg. 85:317-323). Por ejemplo, la inyección en la arteria intra-carótida será preferida si se desea administrar un complejo peptídico o polipeptídico de la invención directamente en el cerebro. La administración parenteral es una vía preferida de liberación si se necesita una dosificación sistémica alta. Métodos actuales para preparar composiciones administrables vía parenteral serán conocidas o aparentes para aquellos expertos en el campo y están descritas en detalle, en p.ej., el Remington,. Ver también, Bai (1997) J. Neuroimmunol. 80:65-75; Warren (1997) J. Neurol Sci. 152:31-38; Tonegawa (1997) J. Exp. Med. 186:507-515.

En una representación, las formulaciones farmacéuticas que comprenden péptidos o polipéptidos de la invención se incorporan en monocapas o bicapas lipídicas, p.ej., liposomas, ver, p.ej., Patente Estadounidense No. 6,110,490; 6,096,716; 5,283,185; 5,279,833. La invención también provee formulaciones en las que péptidos solubles en agua o complejos han estado anexados a la superficie de la monocapa o bicapa. Por ejemplo, péptidos pueden ser adjuntados a liposomas que contienen hidracida-PEG-(distearoilfosfatidil)etanolamina- (ver, p.ej, Zalipsky (1995) Bioconjug. Chem. 6:705-708). Liposomas o cualquier forma de membrana lipídica, tal como las membranas de lípidos planares o la membrana celular de una célula intacta, p.ej., una célula roja de la sangre, se puede usar. Formulaciones liposomales pueden ser para cualquier vía, incluyendo administración intravenosa, transdérmica (ver, p.ej., Vutla(1996) J. Pharm. Sci. 85:5-8), transmucosa, u oral. La invención también suministra preparaciones farmacéuticas en que los péptidos y complejos de la invención son incorporados en micelas y/o liposomas (ver, p.ej., Suntres (1994) J. Pharm. Pharmacol. 46:23-28; Woodle (1992) Pharm. Res. 9:260-265). Liposomas y formulaciones liposomales pueden ser preparadas de acuerdo con métodos estándar y se conocen también bien en el campo, ver, p.ej., el Remington; Akimaru (1995) Cytokines Mol. Ther. 1:197-210; Alving (1995) Immunol. Rev. 145:5-31; Szoka (1980) Ann. Rev.Biophys. Bioeng. 9:467, Patente Estadounidense. Nos. 4,235,871,4,501,728 y 4,837,028.

Regímenes de tratamiento: farmacocinética

Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en una variedad de formas de dosificación unitarias dependiendo del método de administración. Las dosis para composiciones farmacéuticas peptídicas y polipeptídicas son bien conocidas por expertos del campo. Tales dosis son generalmente recomendadas y son ajustadas dependiendo del contexto terapéutico particular, la tolerancia del paciente, etc. La cantidad de polipéptido adecuado para cumplir ésto se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". El programa de posología y las cantidades efectivas para este uso, es decir, el "régimen de dosis", dependerá de una variedad de factores, incluyendo el estadio de la enfermedad o condición, la severidad de la enfermedad o condición, el estado general de la salud del paciente, el estado físico del paciente, la edad, la formulación farmacéutica y la concentración del principio activo, y similares. Calculando el régimen de dosis para un paciente, el modo de administración también se toma en consideración. El régimen de dosis debe tomar también en consideración la farmacocinética, es decir, el índice de absorción de composición farmacéutica, biodisponibilidad, metabolismo, aclaramiento, y similares. Ver, p.ej., el último Remington; Egleton (1997) "Bioavailability and transport of peptides and peptide drugs into the brain" Peptides 18:1431-1439; Langer (1990) Science 249:1527-1533.

En aplicaciones terapéuticas, se administran composiciones a un paciente que sufre cáncer en una cantidad suficiente para como mínimo detener parcialmente de la enfermedad y/o sus complicaciones. Por ejemplo, en una representación, una dosis de una composición peptídica farmacéutica soluble para administración intravenosa (IV) sería sobre 0,01 mg/hr a 1,0 mg/hr administrado cada varias horas (habitualmente 1, 3, o 6 horas), que puede ser repetido durante semanas con ciclos intermitentes. Dosis considerablemente más altas (p.ej subiendo hasta alrededor de 10 mg/ml) pueden ser utilizadas, particularmente cuando el fármaco es administrado en un sitio aislado y no en el torrente sanguíneo, tal como en una cavidad corporal o en el lumen de un órgano, p. ej., el fluido cerebroespinal (FCE).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1 Administración de péptidos de la invención para sensibilizar selectivamente células cancerosas a agentes que dañan el DNA

La invención proporciona composiciones y métodos para sensibilizar células, particularmente células con la detención en el punto de control G1 del ciclo celular deteriorada, tales como células cancerosas, hacia agentes que dañan el DNA. El siguiente ejemplo describe estudios que demuestran que las composiciones y métodos de la invención son efectivos para matar selectivamente células cancerosas (versus células normales, que tienen un punto de control G1 no deteriorado). Específicamente, estos experimentos describen la síntesis y el uso de dos polipéptidos ejemplares de la invención. Dos péptidos correspondientes a los aminoácidos 211 a 221 de Cdc25C humano (ID. DE SEC. NO: 1) fusionados con una parte de HIV-1-TAT (ID. DE SEC. NO:5). Se demostró que estos péptidos inhibían la actividad quinasa hChk1 (ID. DE SEC. NO:3) y Chk2/HuCdsl (ID. DE SEC. NO:4) in vitro y específicamente eliminaban el punto de control G2 in vivo.

Productos químicos y reactivos. La bleomicina y la colchicina se obtuvieron de Wako Pure Chemical Co. (Osaka, Japón). La hidroxiurea se obtuvo de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Estos productos químicos se disolvieron en H_{2}O destilada a 10,5 y 50 mg/ml, respectivamente, y se almacenaron a 4ºC. Los anticuerpos contra 14-3-3\beta se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) y los anticuerpos secundarios conjugados IgG anti-conejo- peroxidasa de rábano picante se obtuvieron de Amersham Life Sciences (Arlington Heights, IL). Los anticuerpos en contra de HA y c-myc, y proteína G-Sepharosa se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology y Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden), respectivamente.

Cultivos celulares y plásmidos. Una línea celular de células T humanas derivadas de leucemia, Jurkat, se cultivó en RPMI 1640 (Sigma) suplementado con suero fetal de ternera 10% (IBL: Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japón) a 37ºC/5% CO_{2}. Líneas celulares derivadas de carcinoma epitelial pancreático humano, MIA PaCa2 y PANC1, se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle (Eagle's MEM) (IWAKI, Chiba, Japón) y el medio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM) con 1-glucosa 4 mM (Sigma) y piruvato sódico 1,0 mM (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY), respectivamente, y suplementado con suero fetal de ternera 10% a 37ºC/5% CO_{2}. Linfocitos de sangre periférica humanos normales se recogieron por gradiente de densidad Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech). Dos millones de células/ml se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con suero fetal de ternera 10% a 37ºC/5% CO_{2} en presencia de 5 \mug/ml PHA (Life Technologies, Inc.) durante una semana. Los lisados de Baculovirus que incluyen hChk1 marcada con HA (ID. DE SEC. NO:3) o Chk2/HuCds1 marcada con c-myc (ID. DE SEC. NO:4) y el plásmido para GST-Cdc25C (aminoácidos 200-256) se hicieron como se describe en Matsuoka (1998) Science 282:1893-1897, y fueron proporcionados por el Dr. Makoto Nakanishi (Departamento de Bioquímica, Universidad Nagoya City.

Péptidos. El péptido TAT-S216 se sintetizó de forma que contenía un dominio transduccional de la proteína TAT con un NH_{2}-terminal de 11 aminoácidos (YGRKKRRQRRR (ID. DE SEC. NO:1899); ver, p.ej., Nagahara (1998) Nature Med. 4:1449-1452) seguido de los correspondientes aminoácidos 211 a 221 derivados de la secuencia de aminoácidos de Cdc25C humana (ID. DE SEC. NO: 1904) (S216; LYRSPASMPENL). El residuo serina-216 se cambió a alanina en TAT-S216A (S216A; LYRSPSMPENL) (ID. DE SEC. NO: 2). La porción Cdc25C se suprimió parcialmente y se sustituyó con glicina en el control TAT (GGRSPAMPE) (ID. DE SEC. NO: 1905). Todos los péptidos fueron sintetizados por Sawady Technology Co. (Tokyo, Japón).

Purificación de proteínas recombinantes GST-Cdc25C. Células Escherichia coli DH5\alpha se transformaron en el plásmido GST-Cdc25C (200-256). Las células se incubaron con 0,1 mM isopropil \beta-D-tiogalactosidasa durante 2 horas, se arrancaron, y se lisaron con tampón que contenía Tris HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM, 0,5% NP-40, 5 \mug/ml aprotinina, 5 \mug/ml pepstatina A y 5 \mug/ml leupeptina. El lisado se sonicó, se centrifugó para clarificar y se incubó con cuentas de glutatión-Sepharose 4B^{TM} durante 1 hora a 4ºC y se lavó cinco veces.

Ensayo quinasa. hChk1 marcado con HA (ID. DE SEC. NO:3) y Chk2/HuCdsl marcado con c-myc (ID. DE SEC. NO:4) expresados en células de insectos utilizando baculovirus recombinante (ver, p.ej., Kaneko (1999) Oncogene 18:3673-3681) se purificaron por inmunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-HA o anti-c-myc y proteína G-Sepharose. La reacción inmuno complejo quinasa se hizo en PBS con DTT 1 mM, MgC1_{2} 1 mM y 100 \muCi de [\gamma-^{32}P] ATP (Amersham; 6000Ci/mmol) más sustratos purificados GST-Cdc25C 1 \muM o péptido Cdc25C 10 \muM (aminoácidos 211 a 221 de Cdc25C (ID. DE SEC. NO: 2); LYRSPSMPENL, Sawady Technology Co.) a 30ºC durante 15 min. en presencia de 10 \muM TAT-S216, TAT-S216A o TAT-Control. Después de la reacción, las muestras se separaron en SDS-PAGE 12% o 15% y se autoradiografiaron para detectar fosforilación de GST-Cdc25C o de péptido.

Análisis del ciclo celular. El estado del ciclo celular en las células tratadas con péptidos y/o bleomicina o colchicina se analizó por FACS, como describió Kawabe (1997) Nature 385:454-458. En breve, dos millones de células Jurkat se resuspendieron e incubaron en 300 \mul de solución de Krishan (0,1% citrato sódico, 50 \mug/ml PI, 20 \mug/ml RNasa A y 0,5% NP-40; ver supra) durante 1 hora a 4ºC y se analizaron por FACScan^{TM} (Beckton Dickinson, Mountain View, CA) con el programa CELLQuest^{TM} (Beckton Dickinson).

Ensayo quinasa Histona Hl. Diez millones de células Jurkat se trataron con hidroxiurea (100 \mug/ml), bleomicina (10 \mug/ml), o colchicina (5 \mug/ml) con o sin adición de TAT-S216A, TAT-S216 o TAT-Control (10 \muM) durante 6 horas. Las células se lavaron con PBS frío y se lisaron a 4ºC en 1 ml de tampón A (Tris 50 mM pH 8,2 mM DTT, EDTA 5 mM, NaCl 100 mM, NP40 0,5%, Na_{3}VO_{4} 20 mM, NaF 50 mM, ácido ocadaico 4 \muM, aprotinina 5 \mug/ml, pepstatin A 5 \mug/ml y leupeptina 5 \mug/ml.). Veinte microlitros de cuentas de agarosa pl3^{sucl} (Upstate Biotechnology., Saranac, NY) se añadieron a los lisados clarificados, se incubaron durante 4 horas a 4ºC, y se lavaron cinco veces con tampón A sin EDTA 5 mM, Na_{3}VO_{4} 20 mM, NaF 50 mM, ácido ocadaico 4 \muM. La actividad quinasa histona Hl en las cuentas se analizó utilizando el kit de ensayo quinasa Cdc2 (Upstate Biotechnology) con [\gamma -^{32}P] ATP seguido por electroforesis en SDS-PAGE 12%, y autoradiografia para detectar la Histona Hl fosforilada.

Ensayo de citotoxicidad celular. Células MIA PaCa2 y PANC1 (3 x 10^{3}/pozillo) se plaquearon en placas mirotituladas de 96-pozillos. Después de adherencia toda la noche, las células se trataron con bleomicina (10 \mug/ml) con o sin los péptidos-TAT indicados a varios tiempos hasta 96 horas. La citotoxicidad y la supervivencia celular se determinaron por el ensayo de 3'-[1-(fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazolio]-bis (4-metoxi-6-nitro) hidrato de ácido benceno sulfónico) (XTT) (Kit de Proliferación Celular II^{TM}: Boehringer Mannheim, Alemania), que se hizo de acuerdo con el protocolo de la compañía y Scudiero (1988) Cancer Res. 48.4827-4833.

Los péptidos TAT-S216 y TAT-S216A inhiben la actividad quinasa de hChk1 y Chk2/HuCds1

Para inhibir las actividades quinasa hChk1 (ID. DE SEC. NO:3) y Chk2/HuCdsl (ID. DE SEC. NO:4) y para eliminar la detención en G2 inducida por el daño en el DNA, se generaron péptidos sintéticos que comprenden los residuos aminoácido 211 a 221 de Cdc25C (ID. DE SEC. NO:1) y una variación del dominio de transducción de la proteína TAT (YGRKKRRQRRR (ID. DE SEC. NO: 1899) (TAT-S216).

Los resultados se muestran en la Figura 1: los péptidos TAT-S216A y TAT-S216 inhiben las actividades quinasa hChk1 y Chk2/HuCdsl in vitro. Figura 1A. Secuencias de los péptidos. Figura 1B, análisis de fosforilación in vitro utilizando GST-Cdc25C y hChk1 purificado. GST-Cdc25C (aminoácidos 200-256) que se produjo en E. coli (DH5\alpha) se utilizó como sustrato (1 \muM). Se hizo reacción inmuno complejo quinasa en presencia de TAT-S216A (10 \muM) o TAT-S216 (10 \muM). Figura 1C, análisis de fosforilación in vitro de hChk1 y Chk2/HuCds1 utilizando el péptido sintetizado Cdc25C correspondiente a los aminoácidos 211-221 de Cdc25C (LYRSPSMPENL (ID. DE SEC. NO: 2)) como sustrato (10 \muM).

Un péptido TAT-S216A (S216A; LYRSPSMPENL, (ID. DE SEC. NO: 2)), en el que el residuo serina 216 se sustituyó por alanina se ideó para estabilizar el estado transitorio de su interacción con hChk1 (ID. DE SEC. NO:3) y Chk2/HuCdsl (ID. DE SEC. NO:4) (Fig. 1A). Este péptido TAT se incluyó para transducir eficientemente estos péptidos en las células (ver, p.ej., Nagahara (1998) supra). Esta secuencia se conoce que facilita la captación de proteínas heterólogas a través de la membrana celular. Como un péptido control, parte de la porción Cdc25C de éste péptido se eliminó (TAT-Control).

Como se muestra en la Fig. 1B, hChk1 (ID. DE SEC. NO:3) fue capaz de fosforilar la proteína Cdc25C (residuos 200-256) (ID. DE SEC. NO:1) fusionada a GST. La serina-216 en Cdc25C (ID. DE SEC. NO:1) es el mayor sitio de fosforilación de esta proteína de fusión in vivo. (ver, p. ej., Furnari (1997) Science 277:1495-1497; Sanchez (1997) Science 277:1497-1501; Peng (1997) Science 277:1501-1505).

En la Fig. 1B, ambos TAT-S216 y TAT-S216A inhibieron la fosforilación de Cdc25C por hChk1 producida por baculovirus (ID. DE SEC. NO:3). TAT-S216 pero no TAT-S216A fue eficientemente fosforilado por hChk1, sugiriendo que la serina-216 en TAT-S2l6 fue fosforilada por hChk1 y TAT-S216 inhibiría competitivamente la fosforilación del sustrato en una proporción molar excesiva si estuviera presente en una cantidad suficientemente grande. El péptido TAT-Control no inhibió la actividad quinasa hChk1.

Como se muestra en la Fig. 1C, TAT-S216A inhibió significativamente la fosforilación del péptido Cdc25C (residuos 200-256) (ID. DE SEC. NO:1) mediada por hChk1 (ID. DE SEC. NO:3) y Chk2/HuCdsl (ID. DE SEC. NO:4) aún en una baja estequiometría (a un exceso molar de cuatro veces más de péptido TAT-S216A contra el sustrato péptido Cdc25C).

Eliminación del punto de control G2 inducido por DNA dañado por los péptidos TAT-S216 y TAT-S216A

El estado del ciclo celular de las células tratadas con TAT-S216A o TAT-S216 frente la detención G2 inducida por DNA dañado se analizó por análisis FACS. Las actividades quinasa de la Histona Hl de estas células fueron simultáneamente monitorizadas. La células Jurkat se detuvieron exclusivamente en G2 por tratamiento con bleomicina (10 \mug/ml), porque no tiene p53 funcional. Los resultados se muestran en la Figura 2: eliminación de la detención en G2 inducida por DNA dañado por los péptidos TAT-S2l6A y TAT-S216. Figura 2A, análisis FACS de células Jurkat tratadas con bleomicina y péptidos. Las células fueron tratados con bleomicina (10 \mug/ml) con o sin péptidos (10 \muM) durante 20hr. B, análisis de la quinasa de Histona H1. Los lisados celulares se prepararon a partir de células tratadas con el reactivo indicado durante 6 horas. Las concentraciones que se usaron fueron: hidroxiurea (HU), 100 \mug/ml; bleomicina (Bleo), 10 \mug/ml; colchicina, 5 \mug/ml; TAT-S216A y TAT-S216, 10 \muM.C, análisis FACS de colchicina y células tratadas con péptido. Las células Jurkat se trataron con colchicina (5 \mu g/ml) con o sin péptido (10 \muM) durante 20 hr.

Como se muestra en la fig. 2A, la detención en G2 se eliminó completamente con la adición de TAT-S216A o TAT-S216 en respuesta a la bleomicina. La detención en G2 fue eliminada a cualquiera hora punta entre las 12 y 48 hr con el tratamiento con TAT-S216A o TAT-S216. Las células Jurkat tratadas con bleomicina junto con TAT-Control se detuvieron en G2 de forma similar a las células tratadas sólo con bleomicina.

También observamos que TAT-S216A o TAT-S216 también eliminaban la detención G2 inducida por irradiación-gamma y cisplatino (irradiación-gamma, 5 Gy; cisplatino, 1\mug/ml durante 1 hr de tratamiento). Para analizar más el efecto de esos péptidos en la transición G2/M, la actividad quinasa de la Histona H1 fue monitorizada. Constante con los descubrimientos anteriores, aunque la actividad quinasa de la Histona H1 disminuyó por tratamiento con bleomicina o hidroxiurea, no se modificó o se incrementó ligeramente con el tratamiento con bleomicina en presencia de TAT-S216A o TAT-S216 (Fig. 2B). En presencia del péptido control-TAT, el tratamiento con bleomicina no afectó la actividad quinasa de H1.

Como se muestra en la Fig. 2C, la detención en la fase M de células Jurkat inducidas por colchicina no se afectó por la adición de TAT-S216 o TAT-S216A. Estos resultados demuestran que TAT-S216A y TAT-S216 específicamente eliminan el punto de control G2 del ciclo celular activado por DNA dañado inhibiendo la actividad quinasa de hChk1 (ID de SEC NO:3) y/o Chk2/HuCdsl (ID. DE SEC. NO:4).

Sensibilización de células Jurkat a la muerte celular inducida por la bleomicina por péptidos TAT-S216A y TAT-S2l6

El efecto de TAT-S216A y TAT-S216 se examinó en la muerte celular inducida por bleomicina. Los resultados se muestran en la Fig.3; análisis de exclusión por tinción de azul Tripán de células Jurkat tratadas con bleomicina (A) o colchicina (B) con o sin péptidos indicados. Barras, Ejes verticales SD, % viabilidad de las células; Bleo 5, bleomicina 5 \mug/ml; Bleo 10, bleomicina 10 \mug/ml; colchicina, 5 \mug/ml; TAT-S216 o TAT-S216A, 10 \muM de péptido indicado. Obsérvese que los péptidos TAT-S216A y TAT-S216 no incrementaron la citotoxicidad de bleomicina a las células normales. C, análisis de supervivencia de blastos PHA tratados con bleomicina y péptidos. Ejes verticales, % viabilidad de las células determinada por análisis de exclusión por tinción con azul Tripán, ejes horizontales, Tiempo en horas. Bleo 5, bleomicina 5 \mug/ml; Bleo 10, bleomicina 10 \mug/ml; TAT-S216 o TAT-S216A, 10 \muM de péptido indicado. D, análisis FACS de las células tratadas con bleomicina y péptidos. Blastos PHA se trataron con bleomicina con o sin péptidos durante 20 hr. Ejes vertical, número celular; eje horizontal, contenido de DNA indicado por una mancha de yoduro de propidio.

Como se muestra en la Fig. 3A, la adición de TAT-S216A y TAT-S216 sensibilizó eficientemente las células Jurkat a la muerte celular inducida por bleomicina. Mientras que el tratamiento con bleomicina a 5 o 10 \mug/ml mataron solamente 27-30% de células Jurkat, la adición de 10 \muM TAT-216A en TAT-S216 mató casi el 80% de las células Jurkat. En contraste, estos péptidos por si mismos no mostraron ninguna citotoxicidad significativa. En adición, un péptido control TAT-control no afectó la viabilidad de las células Jurkat tratadas con bleomicina. Además, como se esperaba del resultado en la Fig.2C, ni TAT-S216A ni TAT-S216 afectaron la citotoxicidad por la colchicina (Fig. 3B). Esta observación indica que la muerte celular inducida por estos péptidos en presencia de bleomicina no era atribuible a un efecto citotóxico inespecífico.

Péptidos TAT-S216 y TAT-S216A no afectaron la viabilidad de las células normales

A fin de confirmar la especificidad del efecto de estos péptidos en células cancerosas en las que el punto de control G1 está eliminado, se investigó el efecto de estos péptidos en células humanas normales. Linfocitos T humanos normales activados por mitógeno (blastos PHA) se prepararon por estimulación de las células mononucleares de la sangre periférica obtenida a partir de un donante sano con PHA durante 1 semana. Estas células fueron tratadas con bleomicina (5 y 10 \mug/ml) en presencia o ausencia de TAT-S216A o TAT-S216.

Como se muestra en la Fig. 3C, estos péptidos no aumentaron el efecto citotóxico de la bleomicina, aunque estas células se replicaban tan rápido como las células Jurkat. Como se muestra en la Fig. 3D, los blastos PHA tratados con bleomicina (5 \mug/ml) se detuvieron en la fase G1 y S pero no en G2, presumiblemente a causa de la actividad del tipo p53 salvaje. Cuando estas células fueron tratadas con TAT-S216 o TAT-S216A en adición a la bleomicina, no se observaron más alteraciones del patrón de ciclo celular.

Sensibilización de células de cáncer de páncreas a la muerte celular inducida por bleomicina por los péptidos TAT-S216A y TAT-S216

Se examinó el efecto de estos péptidos en las otras dos líneas de células de cáncer pancreático con p53 defectuoso, células MIA PaCa2 y PANC 1. La Figura 4 muestra los resultados de las análisis de supervivencia de las células PANC1 (A) y MIA PaCa2 (B) tratadas con bleomicina y péptidos. Las células PANCI y MIA PaCa2 fueron tratadas con bleomicina con o sin péptido indicado. La viabilidad celular se determinó por el ensayo del hidruro del ácido 3'-[1-(fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazolio]-bis(4-metoxi-6-nitro)benzeno sulfónico al tiempo indicado después de la adición de bleomicina y péptido. Bleo 60, bleomicina 60 \mug/ml; TAT-S216 o TAT-S216A, 10 \muM de péptido indicado. Barrotes, SD.

Aunque estas células de cáncer pancreático son conocidas por ser resistentes a varios reactivos anticancerosos, estas células podrían también ser sensibles a la muerte celular inducida por bleomicina por TAT-S216A y TAT-S216 (Fig.4). Similarmente, estos péptidos podrían sensibilizar estas células a la muerte celular inducida por otro agente que daña el DNA incluyendo el cisplatino y la irradiación-gamma.

En resumen, estos experimentos demostraron por primera vez que péptidos cortos inhiben las actividades quinasa de hChk1 y Chk2/HuCdsl pueden eliminar específicamente la detención en el punto de control G2 del crecimiento celular inducida por DNA dañado. Estos datos también demostraron que la eliminación específica del punto de control G2 sensibilizaba células cancerosas a la bleomicina, un agente dañino de DNA, sin efecto obvio en el ciclo celular normal y en su viabilidad. Estas observaciones indican que estas quinasas involucradas en el punto de control G2 del ciclo celular son dianas ideales para la eliminación específica del punto de control G2 y que los péptidos y polipéptidos de la invención y sus derivados pueden ser usados en una nueva terapia del cáncer.

Ejemplo 2 Optimización de secuencias para péptidos de la invención que eliminan G2

El siguiente ejemplo describe estudios que identificaron péptidos ejemplares de la invención que eliminan el punto de control G2. Esto se cumplió usando un análisis por ordenador de la estructura de la quinasa humana Chk2 (ID. DE SEC. NO:4) y los péptidos de la invención.

La estructura 3-dimensional de Chk2 humana se predijo comparando la estructura primaria y 3-D de otra quinasa serina-treonina, PKA (PDB protein data base, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB), The National Science Foundation, Arlington, VA) (1 CDK), usando un programa informático, MODELER^{TM} (IMMD, Tokyo, Japón). La alineación de los péptidos de la invención y hChk2 se predijeron comparando una alineación de hChk1 y varios péptidos Cdc25C como describió Chen (2000) "The 1.7 A crystal structure of human cell cycle checkpoint kinase Chk1: implications for Chk1 regulation," Cell 100:681-92. Comparando la estructura prevista de hChk2 con los péptidos de la invención, se predijo que hay cuatro cavidades en hChk2 que son importantes para la interacción con péptidos, como se muestra en la Figura 5, P1, P2, P3 y P4. La estructura de estas cavidades se usó para diseñar y confirmar las secuencias de péptidos ejemplares de la invención.

La capacidad de estos péptidos para eliminar la actividad quinasa Chk2, por esa razón imbuir la capacidad de eliminar el punto de control G2 del ciclo celular, se demostró por su capacidad de actuar como sustrato de fosforilación para la quinasa humana Chk2. Péptidos ejemplares se sintetizaron directamente (inmovilizados) en una membrana y se contactaron con una quinasa humana Chk2. Específicamente, oligo-péptidos con todas las secuencias previstas por el modelo 3-dimensional se sintetizaron directamente en una membrana usando un auto sintetizador de péptidos, Modelo ASP-22 2 (ABiMED, Alemania). La cantidad de péptido fue alrededor de 0,1 micro-mol/cm^{2}.

La membrana se incubó con Gly-Gly 2% en PBS durante 2 horas (hr) a temperatura ambiente (TA). Luego, se lavaron tres veces con Tween-P BS^{TM} 0,1%. La reacción de "quinación," o "fosforilación," tuvo lugar con una proteína recombinante de fusión Gst-Chk2 a una concentración alrededor de 5 \mug en 4 ml de tampón de la reacción, MgCl_{2} 1mM, Gly-Gly 2% y \gamma-^{33}P-ATP en PBS a TA durante 1 hr. Después de la reacción, la membrana se lavó 5 veces con RIPA (SDS 1%, NP-40 1%, NaCl 100 mM) y se analizó con el analizador de imagen Bass 2500^{TM} (Fuji, Japón). La señal se graduó a "-", un "+", un "++", o un "+++". La Tabla 1 muestra las secuencias de péptidos que daban señales más fuertes que "++". Los péptidos RYSLPPELSNM (ID. DE SEC. NO: 1) y LYRSPSAMPENL (ID. DE SEC. NO: 1906) dio señales "+" por este análisis.

Todos los siguientes péptidos fueron fosforilados por la quinasa humana Chk2; en posición "X" (correspondiente a la posición X_{8}), en donde X = P, F, Y, o W, la señal fue más fuerte (un "+++") cuando X = el aminoácido tirosina (Y):

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Los mejores sustratos de fosforilación eran los péptidos LYRSPSYYENL (ID. DE SEC. NO: 12) y WYTSPSYFENL (ID. DE SEC. NO: 971).

La siguiente Tabla 1 es una lista completa de péptidos ensayados y resultados de la fosforilación in vitro por ensayo de la quinasa humana Chk2. Los resultados se presentan a la derecha del péptido, debajo: un "+++" indica que el péptido se fosforila de forma relativamente alta, un "++" indica que el péptido fue relativamente menos fosforilado, un "+" indica que el péptido fue detectable y significativamente fosforilado sobre control negativo, y ninguna indicación indica que un péptido no fue significativamente fosforilado sobre el control negativo (nota: el número inmediatamente a la derecha del péptido es el PM del péptido).

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TABLA 1

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Ejemplo 3 Péptidos de la invención que eliminan G2

El siguiente ejemplo describe estudios que identificaron péptidos ejemplares de la invención que eliminan el punto de control G2. Los siguientes péptidos de la invención fueron sintetizados directamente en membranas y ensayados en fosforilación in vitro (ensayos de "quinación", como se describió anteriormente.

TABLA 2

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Estos péptidos se probaron en reacciones de quinación in vitro. Los oligopéptidos se usaron como sustratos de fosforilación; las quinasas añadidas están involucradas en el punto de control G2 del ciclo celular. De esta manera, una sustancia que inhibe la reacción de quinación puede ser un eliminador del punto de control G2 del ciclo celular. Para la detección del estado de fosforilación de los sustratos en este método de cribado, se pueden usar isótopo marcado con ATP y anticuerpos antifosfopéptidos.

hChk1; proteínas de fusión hChk1 (péptido-MBP, péptido-GST), HuCdsl/Chk2; proteínas de fusión HuCdsl/Chk2 (péptido-MBP, péptido-GST); o, el extracto celular de células con DNA dañado, se pueden utilizar como las quinasas en el ensayo de cribaje.

Los oligopéptidos ensayados como sustratos son Y X_{2} X_{3} P S X_{6} X_{7} X_{8} N (ID. DE SEC. NO: 1930) (X_{2} a través de X_{9}, respectivamente; la primera posición (X_{1})"Y" en este motivo de nueve residuos abreviado corresponde a la posición X_{2} en el motivo de once residuos, descrito anteriormente) y variaciones de esto en que los residuos aminoácidos en la posición 2 (X_{2}) y posición 3 (X_{3}) son Gly, Leu, Ser, o Arg; y los residuos aminoácido en la posición 6 a 8 son Gly, Leu, Ser, Met, Pro o Glu. Otras variaciones en la secuencia de los oligopéptidos ensayados tienen residuos aminoácidos en la posición 2 como Gly, Leu, Ser, o Arg; residuos aminoácido en la posición 3 como Gly, Leu o Ser; residuos aminoácido en la posición 6 como Gly, Met, Pro o Glu; residuos aminoácido en la posición 7 como Gly, Leu, o Pro; y, residuos aminoácido en la posición 8 como Gly, Met, Ser o Glu. En una otra variación el residuo en la posición 2 era Arg; posición 3 era Ser; posición 6 era Met; posición 7 era Pro; y, posición 8 era Glu.

Las células con el punto de control G1 del ciclo celular defectuoso (tal como una línea celular Jurkat derivada de leucemia humana) se trataron con un tratamiento que daña el DNA. Como tratamiento que daña el DNA, las células se trataron con bleomicina u otros fármacos anticancerosos. Estos fármacos se añadieron al medio de cultivo celular. Alternativamente, las células se irradiaron con irradiación gamma. Los péptidos se añadieron a las células y la cantidad de DNA se determinó entre 10 a 48 horas después del daño en el DNA. Las células arrancadas se resuspendieron con la solución que incluye ioduro de propidio, RNasa y NP-40 y se analizaron por citometría de flujo. Si el oligopéptido "sustancia candidata" induce a las células que no acumulen DNA en G2/M por este análisis, el resultado es positivo y la sustancia potencialmente elimina el punto de control G2/M.

Otros métodos de cribado pueden ser utilizados para identificar inhibidores selectivos del punto de control G2 del ciclo celular. Para ello, las células son tratadas simultáneamente con un oligopéptido "sustrato de fosforilación candidato" y un activador del punto de control fase M, tales como colchicina o nocodazol. El contenido de DNA de las células se analiza de entre 10 a 48 horas después del tratamiento descrito anteriormente. Los candidatos que no disturben la acumulación de las células en G2/M se seleccionaran como eliminadores del punto de control G2 en este método de cribaje.

En una realización, los que eliminan del punto de control G2 tenían en las posiciones 2 y 3 los residuos aminoácidos Gly, Leu, Ser o Arg, y en las posiciones 5 a 8 son los residuos aminoácidos Ser, Gly, Met, Pro o Glu.

En una realización de la invención las composiciones son potenciadoras o aumentadoras de un tratamiento anti-cáncer que daña el DNA. Tratando células cancerosas simultáneamente o secuencialmente con un tratamiento anti-cáncer y una composición de la invención inhibidora del punto de control G2, uno puede matar de forma efectiva las células cancerosas. Puesto que la mayoría de células cancerosas humanas no tienen un punto de control G1 intacto, la eliminación del punto de control G2 por una composición de la invención inhibidora del punto de control G2 mataría efectivamente células cancerosas tratadas con un método que daña el DNA. Las composiciones de la invención pueden ser utilizadas directamente como un fármaco (p.ej., una composición farmacéutica) o estos oligopéptidos podrían ser expresados de forma recombinante in vivo, p.ej., a partir de un vector vírico o de otro vector de expresión, p.ej., un plásmido, como una terapia génica in vivo.

Células Jurkat se cultivaron en suero fetal de ternera 10% con un medio (RPMI 1640) a 37ºC/5% CO_{2} con: bleomicina a 20 \mug/ml; bleomicina a 20 \mug/ml y el péptido "4aa" (la secuencia de aminoácidos es GGSPSM (ID. DE SEC. NO: 1931)); bleomicina a 20 \mug/ml y el péptido AAA (Tabla 1); bleomicina a 20 \mug/ml y el péptido YNP (Tabla 1). La cantidad de DNA se analizó a las 0, 6, 12, 24 horas después de la adición de diez microgramos de bleomicina con o sin los oligopéptidos "4aa," "YNP" y "AAA." La cantidad de DNA se analizó por citometría de flujo (FACS) después de la adición de una solución que contiene ioduro de propidio, RNasa y NP-40.

Los resultados se muestran en la Figura 6. Los paneles de la izquierda son resultados reales de un análisis por citometría de flujo (FACS). El panel de la derecha indica la población de células en cada una de las fases del ciclo celular (sub G1, G1, S, y G2/M). Los resultados indicaron que el péptido YNP eliminó el punto de control G2 porque las células no se acumulan a las fases G2/M.

En otro experimento, un activador del punto de regulación de la fase M, colchicina, se utilizó en lugar de bleomicina: colchicina a 2,5 \mug/ml; colchicina a 2,5 \mug/ml y el péptido "4aa"; colchicina a 2,5 \mug/ml y el péptido AAA (Tabla 1); colchicina a 2,5 \mug/ml y el péptido YNP (Tabla 1), y no tratamiento. Los resultados se muestran en la Figura 7. Ninguno de los oligopéptidos antes ensayados (Tabla 1), incluyendo, YPN, afectaron a la acumulación de las células tratadas con colchicina en la fase G2/M. Estos datos indicaron que YPN eliminó específicamente el ciclo celular en el punto de control G2.

Los péptidos que se ensayaron y los resultados de estos experimentos se resumen más en las Figuras 8 y 9.

Ejemplo 4 Péptidos de la invención sensibilizan células cancerosas en un modelo animal in vivo

El siguiente ejemplo describe estudios en un modelo animal aceptado por el campo que demuestran que péptidos ejemplares de la invención son agentes efectivos para sensibilizar selectivamente células cancerosas hacia agentes que dañan el DNA. En particular, estudios en ratones desnudos demostraron la eficacia in vivo de las composiciones y métodos de la invención.

Línea celular de cáncer de colon humano SW620 se inyectó de forma subcutánea en un ratón desnudo Balb/c de tres semanas (1 x 10^{8} células por ratón). Casi dos semanas después de la inyección, los tumores subcutáneos establecidos de 2 a 4 mm de diámetro se reseccionaron y se transplantaron en un ratón singeneico. Una semana después del transplante, se empezó la inyección de cis-platino (CDDP) y péptidos (TAT-control y TAT-S216, ver Tabla 1). Los péptidos estaban en la forma de proteínas de fusión recombinantes, con TAT siendo el dominio de transducción de la proteína teniendo la secuencia YGRKKRRQRRR. (ID. DE SEC. NO: 1899).

Cis-platino (CDDP) a 6 mg/kg se inyectó una vez a la semana en el peritoneo. Péptidos (a 100 nM) se inyectaron en el tumor dos veces por semana. El peso relativo de los tumores se avaluó en las semanas 3 y 5. Los resultados se muestran en la Figura 10, panel superior. Experimentos similares se llevaron a cabo con 5-FU en lugar de cis-platino. Los resultados se muestran en la Figura 8, panel inferior. Como se muestra en la Figura 10, la proteína de fusión conteniendo S216 sensibilizó efectivamente las células cancerosas hacia un agente que daña el DNA administrado al animal in vivo.

Experimentos similares se llevaron a cabo con cis-platino (CDDP) y otro péptido ejemplar de la invención, "RANDOM II" o "RII" (ver Tabla 1). Como con S216, el péptido RII estaba en forma de una proteína de fusión recombinante con TAT. Se determinó el volumen relativo del tumor subcutáneo trasplantado con o sin cis-platino ("CDDP"), CDDP más DMSO, CDDP más TAT-FLAG o CDDP más péptido TAT-Random II. Como se muestra en la Figura 11, la proteína de fusión que contenía R-II sensibilizó efectivamente las células cancerosas hacia el agente que daña el DNA administrado al animal in vivo.

Claims (39)

1. Un polipéptido aislado o recombinante, en donde la secuencia de aminoácidos es seleccionada del grupo consistente en

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en dónde el polipéptido cuando es administrado o expresado en una célula interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular.

2. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 1, en donde el aminoácido de la primera posición está ausente.

3. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 1, en donde el aminoácido de la novena posición está ausente.

4. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 1, en donde el aminoácido de la décima posición está ausente.

5. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 1, en donde el aminoácido de la undécima posición está ausente.

6. El polipéptido aislado o recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo además un permeabilizador de la membrana celular.

7. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 6, en donde el permeabilizador de la membrana celular contiene un polipéptido.

8. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 7, en donde el polipéptido contiene un dominio de transducción de la proteína TAT.

9. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 8, en donde el dominio de transducción de la proteína TAT es Y G R K K R R Q R R R.

10. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 6, en donde el permeabilizador de la membrana celular contiene un lípido.

11. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 10, en donde el permeabilizador de la membrana celular contiene un liposoma.

12. Un polipéptido quimérico que contiene un primer dominio que contiene un polipéptido tal como se apunta en las reivindicaciones 1 a 5 y un segundo dominio que contiene un permeabilizador de membrana celular, en donde el polipéptido cuando se administra o se expresa en la célula interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular.

13. El polipéptido quimérico de la reivindicación 12, en donde el polipéptido es una proteína de fusión recombinante.

14. Un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12, en donde el polipéptido cuando se administra o se expresa en la célula interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular.

15. Un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12, en donde el polipéptido cuando se administra o se expresa en la célula interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular.

16. Una célula que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12, en donde el polipéptido cuando se administra o se expresa en la célula interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular.

17. Las células de la reivindicación 16, en donde la célula es una bacteria, una levadura, un insecto, o una célula de mamífero.

18. Una composición farmacéutica que contiene un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12, en donde el polipéptido cuando se administra o se expresa en la célula interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular, un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12, en donde el polipéptido cuando se administra o se expresa en la célula interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular, un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12, en donde el polipéptido cuando se administra o se expresa en la célula interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular, o una célula que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12, en donde el polipéptido cuando se administra o se expresa en la célula interrumpe la detención en el punto de control G2 del ciclo celular; y, un excipiente farmacéuticamente aceptable.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18 conteniendo un liposoma.

20. Un método in vitro para inhibir la actividad de la quinasa Chk1 o la quinasa Chk2 que implica contactar la quinasa con un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12 o una composición farmacéutica como se apunta en la reivindicación 18, en una cantidad suficiente para inhibir la actividad de las quinasas Chk1 o Chk2.

21. Un método in vitro para interrumpir la detención en el punto de control G2 del ciclo celular que comprende contactar la célula con un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12 o una composición farmacéutica como se apunta en la reivindicación 18, en una cantidad suficiente para interrumpir la detención en el punto de control G2 del ciclo celular.

22. Un método in vitro para sensibilizar una célula hacia un agente que daña el DNA que comprende contactar la célula con un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12 o una composición farmacéutica como se apunta en la reivindicación 18, en una cantidad suficiente para interrumpir la detención en el punto de control G2 del ciclo celular, así sensibilizando la célula hacia el agente que daña el DNA.

23. El método de la reivindicación 22, en dónde la célula es una célula humana.

24. El método de la reivindicación 22, en dónde la célula es una célula cancerosa.

25. Un método in vitro para sensibilizar selectivamente una célula con la detención en el punto de control G1 del ciclo celular deteriorada hacia un agente que daña el DNA que implica contactar la célula con un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12 o una composición farmacéutica como se apunta en la reivindicación 18, en una cantidad suficiente para interrumpir la detención en el punto de control G2 del ciclo celular, así sensibilizando la célula hacia el agente que daña el DNA.

26. El método de la reivindicación 25, en dónde la célula es una célula cancerosa.

27. Uso de un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12, o un vector de expresión como se apunta en la reivindicación 15 o una célula como se apunta en la reivindicación 16 y un agente que daña el DNA para la preparación de una composición farmacéutica para inducir apoptosis en una célula cancerosa de un individuo, en donde la composición farmacéutica es administrada en la cantidad suficiente para interrumpir la detención en el punto de control G2 del ciclo celular, así sensibilizando la célula hacia el agente que daña el DNA.

28. El uso de la reivindicación 27, en donde el agente que daña el DNA es 5-fluorouracil (5-FU), rebecamicina, adriamicina, bleomicina, cis-platino, hipertermia, irradiación UV o irradiación gamma.

\newpage

29. Un método para el cribaje de compuestos capaces de modular la actividad de la quinasa Chk1 o la quinasa Chk2 comprendiendo los pasos siguientes:

(a)

aportar un compuesto de ensayo;

(b)

aportar una quinasa Chk1 o una quinasa Chk2;

(c)

aportar un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12, en dónde el polipéptido se une a la quinasa Chk1 o a la quinasa Chk2; y

(d)

contactar el compuesto de ensayo con la quinasa y el polipéptido y medir al capacidad del compuesto a ensayo para prevenir la unión del polipéptido a la quinasa.

30. Un método de cribaje de compuestos capaces de modular la actividad de la quinasa Chk1 o la quinasa Chk2 comprendiendo los siguientes pasos

(a)

aportar un compuesto de ensayo;

(b)

aportar una quinasa Chk1 o una quinasa Chk2;

(c)

aportar un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12, en dónde el polipéptido es fosforilado por la quinasa Chk1 o a la quinasa Chk2; y

(d)

contactar el compuesto de ensayo con la quinasa y el polipéptido y mesurar la habilidad del compuesto a ensayo para inhibir o eliminar la fosforilación del polipéptido por la quinasa.

31. El método de la reivindicación 30, en dónde el polipéptido del paso (c) contiene el residuo aminoácido serina 216 de Cdc25C humano.

32. El método de la reivindicación 29 o reivindicación 30, en dónde el polipéptido del paso (c) además contiene glutatión-S-transferasa.

33. El método de la reivindicación 29 o reivindicación 30, en dónde el polipéptido del paso (c) está inmovilizado.

34. Un método para el cribaje de compuestos capaces de inhibir o eliminar específicamente la detención en el punto de control G2 del ciclo celular comprendiendo los pasos siguientes

(a)

aportar un compuesto de ensayo y un polipéptido como se apunta en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o reivindicación 12;

(b)

aportar una célula con el punto de control G1 deteriorado;

(c)

contactar la célula del paso (b) con el compuesto de ensayo del polipéptido del paso (a) y un tratamiento que daña el DNA o un activador del punto de control de fase M; y

(d)

mesurar la cantidad de DNA en las células después del contacto del paso (c) para determinar si el compuesto a ensayo ha inhibido o eliminado la detención en el punto de control G2 del ciclo celular, en dónde el polipéptido del paso (a) actúa como un control positivo de inhibición del punto de control G2.

35. El método de la reivindicación 34, en dónde la cantidad de DNA es mesurada utilizando yoduro de propidio y análisis FACS.

36. El método de la reivindicación 34, en dónde la cantidad de DNA es medida después de alrededor de 10 a 72 horas tras el contacto del paso (c).

37. El método de la reivindicación 34, en dónde la célula se contacta con un activador del punto de control de fase M y un compuesto de ensayo o un polipéptido del paso (a), en donde un compuesto de ensayo que no ha inhibido o eliminado la detención en el punto de control de la fase M del ciclo celular después de contactar la célula con un activador de fase M es un inhibidor específico de la detención en el punto de control G2 del ciclo celular.

38. El método de la reivindicación 37, en donde el activador del punto de control de la fase M es colchicina o nocodazol.

39. El método de la reivindicación 34, en dónde el tratamiento que daña el DNA es con 5-fluorouracilo (5-FU), rebecamicina, adriamicina, bleomicina, cis-platino, hipertermia, irradiación UV o irradiación gamma.