ITRM20090232A1 - Peptide capace di disassemblare i complessi proteici fra la proteina p53 mutata his 273 e la proteina oncosoppressiva p73 in cellule tumorali e suoi usi in campo medico. - Google Patents
Peptide capace di disassemblare i complessi proteici fra la proteina p53 mutata his 273 e la proteina oncosoppressiva p73 in cellule tumorali e suoi usi in campo medico. Download PDFInfo
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Description
Peptide capace di disassemblare i complessi proteici fra la proteina p53 mutata HIS 273 e la proteina oncosoppressiva p73 in cellule tumorali e suoi usi in campo medico.
La presente invenzione concerne un peptide capace di disassemblare i complessi proteici fra la proteina p53 mutata His-273 e la proteina oncosoppressiva p73 in cellule tumorali e suoi usi in campo medico. Più in particolare, la presente invenzione concerne un peptide SIMP (Short-interfering mutant p53 peptides) in grado di rompere i complessi proteici formatisi all'interno delle cellule tumorali tra le proteine m-p53 e p73 in modo selettivo in tumori in cui m-p53 presenta una mutazione His273.
Nel corso degli ultimi anni l'interesse dei ricercatori si à ̈ spostato dall'utilizzo dei convenzionali trattamenti con farmaci citotossici a quello delle terapie con un singolo farmaco intelligente o in combinazione con le terapie standard. Poiché il successo terapeutico à ̈ tanto più garantito quanto più si riescono a tipizzare delle sottopopolazioni di pazienti con uno specifico profilo genomico o metabolomico, l'interesse dei ricercatori si à ̈ focalizzato sullo studio della comprensione del meccanismo d'azione dei geni associati al cancro. Tra questi, un ruolo di rilievo viene esercitato dal prodotto genico dell'oncosoppressore p53.
È noto che i membri della famiglia p53, che includono le proteine p53, p63, p73 e le loro rispettive isoforme, sono coinvolti in processi chiave per la sopravvivenza cellulare quali l'inibizione della crescita cellulare, l'apoptosi, la senescenza ed il differenziamento. È nota (Strano e coll, Journal Biological Chemistry 275:29503-508 2000 ; Strano e coll, Journal Biological Chemistry 277: 18817-26.2002) l'esistenza in linee tumorali di complessi proteici tra le proteine mutata p53/p73. La formazione di tali complessi inibisce l'attività trascrizionale e apoptotica di p73 in risposta a farmaci antitumorali (Strano S. Blandino G. Celi Cycle 2:348-9 2003) indebolendo e rendendo inefficace l'attività antitumorale di p73. Quindi, il complesso m-p53/p73 esercita la sua funzione oncogenica impedendo il corretto posizionamento di p73 sulle regioni di regolazione dei geni bersaglio pro-apoptotici , aumentandone così la quota di p73 intrappolata nel legame con la m-p53.
L'analisi dei complessi proteici ha evidenziato che le superfici di contatto coinvolte nel legame tra la m-p53 e p73 sono rappresentati in entrambi i casi dal dominio di legame al DNA (DBD). Il DBD rappresenta la sede della maggior parte delle mutazioni presenti nei tumori umani. Inoltre, il core (dominio di legame al DNA) della m-p53 si comporterebbe da piattaforma proteica capace di assemblare dei complessi multiproteici che includono fattori di trascrizione, acetilasi, deacetilasi, proteine di ancoraggio che cooperano con la m-p53 ad attivare o reprimere i suoi geni bersaglio.
Le proteine m-p53 sono abbondantemente presenti nelle cellule tumorali. Conseguentemente, anche soltanto la parziale riattivazione di una piccola quota di proteine a m-p53 potrebbe essere sufficiente a ripristinare le sue funzioni oncosoppressive .
Allo scopo di identificare delle nuove molecole bersaglio, con potenziale farmacologico, gli autori della presente invenzione hanno precedentemente disegnato delle piccole molecole peptidiche chiamate, con una nomenclatura convenzionale, SIMP (Shortinterfering mutant p53 peptides) la cui sequenza amminoacidica ricapitola la maggior parte della sequenza del dominio di legame al DNA di p73 (Brevetto Europeo EP1812467) .
La proteina p73 consiste di 636 aminoacidi suddivisi in 4 porzioni: l'N- terminale che rappresenta il dominio di attivazione trascrizionale (1- 54); la porzione centrale che rappresenta il dominio di legame specifico al DNA (131-310) ; il dominio di oligomerizzazione (345- 390); una porzione C- terminale (390- 636). Allo scopo di coprire l'intera regione centrale, che rappresenta il dominio di legame specifico al DNA, sono stati disegnati 14 peptidi di cui 12 sono descritti nel brevetto EP1812467, SIMP5M Ã ̈ descritto nel lavoro di DiAgostino e coll, Celi Cycle 2008) La tabella 1 mostra le sequenze dei peptidi SIMP disegnati sul dominio di legame al DNA del gene p73 umano .
Tabella 1
131 141 151 161 171
I I I I I
FQQSSTAKSA TWTYSPLLKK LYCQIAKTCP IQIKVSTPPP PGTAIRAMPV
YKKAEHVTDV VKRCPNHELG RDFNEGQSAP ASHLIRVEGN NLSQYVDDPV
TGRQSWVPY EPPQVGTEFT TILYNFMCNS SCVGGMNRRP ILIIITLEMR
DGQVLGRRSF EGRICACPGR DRKADEDHYR
S1MP1 FQQSSTAKSATW (131-142 aa) (SEQ ID NO 1) SIMPB DDPVTGRQSWV (227-23B aa) (SEQ ID NO B)
SIMP2 PILKKLYCQI (146-155 aa) (SEQ ID NO 2) S1MP9 GQVGTEFTTIL (244-263 aa) (SEQ ID NO 9)
SIMP3 CPIQIKVSTPPP (159-170 aa) (SEQ ID NO 3) SIMP10 MNCNSSCVGGMNRR (257-269 aa) (SEQ IO NO 10)
SIMP11 IIITLEMRDGQ (273-283 aa) (SEQ ID NO 11) SINIP4 IRAMPVYKKAEH (174-1 B6 aa) (SEQ ID NO 4)
SIMP12 RRSFEGRICAC (287-297 aa) (SEQ ID NO 12) SIMP5 WKRCPNHE (190-198 aa) (SEQ ID NO 5)
SIMP13 DRKADEDHYR (301-310 aa) (SEQ ID NO 13) SIMP6 GQRDFNEGQSAPA (200-211 aa) (SEQ ID NO 6)
S1MP5M WKRCPNHELGRD (SEQ ID NO 14)
SIMP7 IRVEGNNLS (215-223 aa) (SEQ ID NO 7)
La lunghezza dei peptidi à ̈ stata stabilita in funzione della loro applicazione farmacologica. Infatti, i peptidi SIMP, avendo una lunghezza tra gli 8 e i 10 aminoacidi sono in grado di permeare la membrana citoplasmatica e quella nucleare. I peptidi sopra menzionati sono in grado di rompere i complessi, che si formano nel nucleo delle cellule tumorali, m-p53/p73 , in particolare in presenza di una mutazione His- 175 or His - 27 3 (p-53-His 175,p-53-His 273) .
Allo scopo di individuare le regioni minime coinvolte o ingaggiate nell'interazione tra le proteine p73 e m-p53, i peptidi sopra menzionati sono stati suddivisi in tre sottogruppi e, procedendo per sottrazione, sono stati individuati due peptidi, SIMP5 e SIMP6, maggiormente in grado di ripristinare le funzioni oncosoppressive di p73 . Al termine degli esperimenti, i peptidi ricadenti nel dominio centrale della sequenza di p73 apparivano in grado di rompere il complesso m-p53/p73. Le molecole SIMP5 e SIMP6 svolgono delle funzioni mirate selettivamente all'eliminazione di cellule tumorali portatrici di specifiche mutazioni del gene p53 e non sembrano avere alcun effetto su sistemi cellulari privi del gene p53 o portatori del gene p53 selvatico. Infatti, tali molecole rendono le linee cellulari tumorali SKBR3 , portatrici della mutazione His-175, più sensibili al trattamento chemioterapico (Di Agostino e coll,Celi Cycle 7:21,3440-3447. 2008) Analoghi esperimenti condotti su delle linee di carcinoma della mammella che presentano altri tipi di mutazione non inducono cambi nella risposta apoptotica (es : SW480 e MDA-MB-468). Il ripristino della chemiosensibilità à ̈ direttamente correlato al tipo di mutazione per p53.
Tali peculiarità e specificità rendono le molecole SIMP idonee per una terapia mirata e personalizzata e di interesse farmacologico. Tuttavia, i peptidi sopra menzionati sono finora noti come in grado di rompere i complessi m-p53/p73 in cellule tumorali portatrici di mutazioni His 175 del gene p53 e non di mutazioni differenti, pertanto sono ritenuti non adatti per ripristinare la funzione oncosoppressiva di m-p53 in molti tumori dello stesso istotipo o di istotipo diverso ma portatori di altre categorie di mutazioni.
Alla luce di quanto esposto sopra risulta pertanto evidente l'esigenza di poter disporre di nuove molecole in grado di rompere i complessi m-p53/p73 nelle cellule tumorali che superino gli svantaggi dei peptidi noti.
Gli autori della presente invenzione hanno ora sorprendentemente trovato che il peptide SIMP1: FQQSSTAKSATW (SEQ ID N0:1) à ̈ in grado di rompere i complessi m-p53/p73 in cellule tumorali portatrici della mutazione His-273, che à ̈ in assoluto la mutazione più diffusa nei tumori umani di vario istotipo. In modo particolare, gli autori della presente invenzione hanno ora trovato che una versione mutata del peptide SIMP1, in cui il residuo K138 à ̈ stato sostituito con un residuo in Arginina, mostra le stesse funzioni del peptide SIMP1 potenziandone le sue attività .
Il peptide SIMP1: FQQSSTAKSATW (SEQ ID N0:1) (MW: 1341, PI: 8.75; 131-142 aa della sequenza umana del gene p73a) à ̈ posizionato sulla regione centrale del dominio di legame specifico al DNA compresa tra gli aa 131 -310. Integrando le informazioni provenienti dai dati funzionali degli autori con i dati strutturali e cristallografici già presenti in letteratura, i peptidi interferenti sono stati posizionati sulla superficie di legame al DNA di p53 (Kitayner e coll, Mol.Celi.22;741-53. 2006). È stato costruito un modello di p73 basato sulla struttura di un monomero di p53. Per il modello iniziale à ̈ stato utilizzato il modulo di omologia InsightII (Accelrys, San Diego , CA) e per l'energia di minimizzazione il modulo Discover3, utilizzando il campo di forze CVFF. Il modello del dimero p73/p53 à ̈ stato ottenuto giustapponendo p73 su di un monomero nel dimero simmetrico di p53 (Di Agostino e coll,Celi Cycle 7 :21,3440-3447 . 2008 ;Kitayner e coll, Mol.Celi.22;741-53 . 2006).
È stato osservato che SIMP1 rompe l'interazione mutp53/p73 interferendo vicino alla superficie di legame al DNA di p53 già indebolita dalla presenza della mutazione His-273, mentre SIMP5 mappa sull'interface impedendo la formazione del dimero mutp53 His-175/p73. L'interazione di SIMP1 con il DNA deve essere condotta elettrostaticamente.
Nel caso in cui SIMP1 venga mutato in Alanina nel sito K138, i complessi non sembrano essere alterati nella loro conformazione, cosa diversa se il residuo K138 Ã ̈ mutato in R. In tal caso, aumentano gli effetti interferenti sulla struttura.
Il peptide SIMP1KO: FQQSSTAASATW (SEQ ID NO:15) (MW: 1284, PI: 5.52} à ̈ una versione mutata del peptide SIMP1 il cui residuo K138 à ̈ stato sostituito con un residuo in Alanina e non mostra alcuna attività su entrambe le categorie di mutanti.
Il peptide SIMP1M :FQQSSTARSATW (SEQ ID NO:16) (MW: 1369, PI: 9.75) à ̈ una versione mutata del peptide SIMP1 il cui residuo K138 à ̈ stato sostituito con un residuo in Arginina. Come detto sopra, tale versione modificata del peptide SIMP1 esercita le sue stesse funzioni potenziandole e non mostra alcuna attività su linee tumorali che presentano altre categorie di mutazioni.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un peptide comprendente la o consistente nella sequenza FQQSSTARSATW (SEQ ID NO:16) per l'uso in campo medico. L'invenzione concerne inoltre la sequenza nucleotidica codificante per il peptide sopra menzionato e un vettore di espressione comprendente la sequenza nucleotidica stessa.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente o consistente nel peptide o nel vettore definiti sopra come principio attivo in associazione con uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili. La composizione farmaceutica può comprendere ulteriormente uno o più principi attivi antitumorali quali ad esempio quelli scelti nel gruppo che consiste in agenti chemioterapici quali cisplatino, adriamicina, 5 fluorouracile, ed agenti antiproliferativi quali la vitamina D .
L'invenzione concerne inoltre l'uso del peptide o del vettore o della composizione come definiti sopra per la preparazione di un medicamento per il trattamento dei tumori. In particolare, possono essere trattati i tumori che presentano a livello cellulare il complesso proteico m-p53 His-273/p73. Lo screening delle mutazioni per p53 à ̈ un procedimento noto all'esperto del ramo. Il 90 % delle mutazioni rilevate in diverse neoplasie sono localizzate negli esoni 5,6,7,8 all'interno di quattro regioni molto conservate del gene. Il DNA viene estratto dai campioni cellulari o tessutali congelati, controllato e amplificato tramite PCR. I prodotti ottenuti, vengono sequenziali mediante un sequenzìatore automatico (sequenziatore ABI3730) (Andersen e coll, Diagn. Mol. Pathol.4.203211. 1995) . Alla fine si otterrà un tracciato elettrof oretico dove una mutazione puntiforme può essere facilmente riconosciuta in quanto determina un pattern di migrazione diverso rispetto al controllo normale .
I tumori da trattare possono essere ad esempio quelli scelti nel gruppo che consiste in tumori della mammella, polmone e colon retto.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una combinazione tra il peptide o il vettore come definiti sopra e uno o più principi attivi antitumorali per l'uso simultaneo, separato o sequenziale nella terapia dei tumori.
Infine, anche il peptide avente sequenza FQQSSTAKSATW (SEQ ID N0:1) può essere impiegato per la preparazione di un medicamento per il trattamento dei tumori che presentano a livello cellulare il complesso proteico m-p53 His-273/p73.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati in cui:
Figura 1 mostra che il peptide SIMP1 rompe il complesso proteico mutata p53/p73 ed aumenta la risposta apoptotica nelle cellule che esprimono il mutante p53 His273. (A) Le cellule MDA-MB-468 (5xl0<5>) sono state trasfettate con una miscela contenente lipofectamina, il vettore di espressione Pgal ,che normalizza l'efficienza di trasfezione, e con il peptide SIMP1 (20Î1⁄4Îœ). I U sati cellulari totali (lmg), sono stati immunoprecipitati con degli anticorpi diretti contro p73 e contro le immunoglobuline (IgG). Gli immunoprecipitati e un aliquota (50 Î1⁄4g) del U sato totale dopo corsa elettroforetica su di un gel di acrilamide al 12%, sono stati trasferiti su una membrana dì nitrocellulosa e marcati con gli anticorpi indicati nella figura. (B) Le cellule MDA-MB-468, venivano trasfettate con i peptidi SIMP1 e SIMP5,6. Successivamente, le cellule venivano lavate e stimolate con 3Î1⁄4Îœ di Adriamicina. I lisati totali ottenuti(30 Î1⁄4g)erano testati per l'espressione delle proteine apoptotiche PARP e BAX. Il U sato veniva normalizzato saggiando l'espressione della γ-tubulina. (C-D) I saggi di transattivazione erano condotti tramite trasfezione transiente delle cellule H1299 con una mix di lipofectamina contenente i plasmidi indicati SIMP1 (20Î1⁄4Îœ ciascuno),SIMP5,6 insieme con il vettore reporter pLUC-BAX. Ad ogni reazione veniva aggiunta un uguale ammontare del vettore di espressione della βgalattosidasi, aggiunto per normalizzare l'efficienza di trasfezione.
(E) SIMP1 aumenta la sensibilità alla Adriamicina in cellule portatrici di una mutazione His-273 p53. Le cellule MDA-MB-468 erano trasfettate con una mix contenente la lipofectamina e il plasmide pLUC-BAX, il vettore di espressione della β-Galattosidasi e i peptidi SIMP1 e SIMP di controllo. Le cellule, 24 ore dopo la trasfezione, venivano trattate con 3Î1⁄4Îœ di Adriamicina.
Figura 2 mostra che i peptidi SIMP1 e SIMP1M alterano il complesso proteico mutata p53/p73 ripristinando le funzioni oncosopressive di p73
(A) I dettagli relativi alla mappatura di SIMP1 sul modello del dimero p73/wtp53 legato al DNA sono stati descritti nel testo.
(B-C) I saggi di transattivazione erano condotti tramite trasfezione transiente delle cellule H1299 con una mix di lipofectamina contenente i plasmidi indicati ed i peptidi SIMP1 (20Î1⁄4Îœ ciascuno), SIMP1K0, SIMP1M, SIMP5,6 insieme con il vettore reporter pLUC-BAX. Ad ogni reazione veniva aggiunto un uguale ammontare del vettore di espressione della β-galattosidasi, aggiunto per normalizzare l'efficienza di trasfezione.
(D-E) SIMP1 e SIMP1M ma non SIMP1K0 aumentano la chemosensibilità all'Adriamicina in cellule portatrici di una mutazione Hi-s273 p53. Le cellule MDA-MB-468 erano trasfettate con una mix contenente la lipofectamina e il plasmide pLUC-BAX, pLUC-p21, il vettore di espressione della β-Galattosidasi, i peptidi SIMP1 e i suoi mutanti derivati SIMP1M e SIMP1K0. Le cellule, 24 ore dopo la trasfezione, venivano trattate con 3Î1⁄4Îœ di Adriamicina e poi processate.
Figura 3 mostra che SIMP1 si lega direttamente in saggi in "vitro" alla proteina mutp53 His-273.(A) Estratti totali derivati da cellule tumorali SKBR3, (His-175)HT29,(His-273) e H1299 (privi di p53) erano incubati (1 mg) su di una membrana di nitrocellulosa marcata con i peptidi SIMP1 e SIMP1K0 e sottoposti ad analisi di Dot Blotting. In (B) le membrane erano incubate con 20 di proteina purificata GST-p53 selvatica WT o GST-p53 His-175,GST-p53-His-175, 74-298 o GST da sola. In entrambi gli esperimenti i dot erano rilevati marcando le membrane con anticorpo anti-p53 (DOl)
Figura 4 mostra l'attività antitumorale di SIMP1 "in vitro"
(A) Al fine di verificare la specificità del peptide SIMP1,indipendentemente dal contesto cellulare, abbiamo testato i peptidi SIMP1 in alcune linee di carcinoma del colon HT29 (His-273) trattate con Adriamicina. Le cellule erano trasfettate con una miscela contenente la lipofectamina e il plasmide pLUC-BAX, il vettore di espressione della β-Galattosidasi, i peptidi SIMP1 e SIMP5M di controllo. Le cellule, 24 ore dopo la trasfezione, venivano trattate con 3Î1⁄4Îœ di Adriamicina. (B-C) Saggi di vitalità e di inibizione proliferativa erano condotti dopo trasfezione con i peptidi SIMP1 e SIMP5M nelle linee HT29 (cancro del colon) e nelle MDA-MB-468 (cancro della mammella) Figura 5 mostra che SIMP1 rallenta la crescita tumorale "in vivo "
Al fine di saggiare in vivo l'attività antitumorale di SIMP1 abbiamo iniettato in nu/nu topi SCIO sottocute (5.0x105 cellule/ topo) le cellule HT29 trasfettate con SIMP1 ,SIMP1K0 e SIMP5M. La crescita tumorale à ̈ stata monitorata per 5 settimane.
Figura 6 mostra che i peptidi SIMP e i loro derivati spiazzano i complessi proteici che coinvolgono la proteina mutata p53 e p73. In particolare, i peptidi SIMP5,6 e SIMP5M sono specifici per i tumori che presentano una mutazione His-175; i peptidi SIMP1 e SIMP1M mostrano specificità per le mutazioni His-273.
ESEMPIO 1: Sintesi dei peptidi SIMP1 e SIMP1M e studio della loro attività farmacologica
MATERIALI E METODI
Colture cellulari e trattamenti
Le linee cellulari umane tumorali H1299, SKBR3, HT29, MDA-MB-468 (ATCC, USA) sono state coltivate a 37 °C in atmosfera C02umidificata al 5% in terreno DMEM modificato Eagle (DMEM, Hyclone, Logan,LT) addizionato con 2 mM di L-glutamina, 100 IU/ mi, penicillinastreptomicina (Gibco, Gaithersburg, MD) e 10 % di siero bovino fetale (FCS, Hyclone) come riportato precedentemente (Strano e coll, 2000; DiAgostino e coll, 2006). Le linee cellulari sono state trattate per 24 ore con diverse concentrazioni di Adriamicina (ADR; 3,5Î1⁄4Îœ Sigma).
La vitalità cellulare veniva testata tramite saggi di Trypan Blue exclusion.
Screening delle mutazioni per p53
Il DNA viene estratto dai campioni cellulari o tessutali congelati, controllato e amplificato tramite PCR. I prodotti ottenuti vengono sequenziati mediante un sequenziatore automatico (sequenziatore ABI3730) (Andersen e coll,Diagn. Mol. Pathol.4. 203-211. 1995). Alla fine si otterrà un tracciato elettroforetico dove una mutazione puntiforme può essere facilmente riconosciuta in quanto determina un pattern di migrazione diverso rispetto al controllo normale.
Plasmidi e Trasfezione
Sono stati utilizzati i seguenti plasmidi per gli esperimenti di trasfezione: pcDNA3 , pcDNA3-p53His-175, pcDNA3 -p53His-273 , pcDNA3-p73 and pLuc-Baxpromoter , pLuc-p21promoter (provenienti dai laboratori del Prof.Kaelin B., Harvard Medicai School e del prof Oren M. Weizmann Institute, Rehovot) . La linea cellulare H1299 Ã ̈ stata trasfettata transientemente utilizzando la metodica del Calcio Fosfato in presenza della BES (Sigma).I precipitati sono lasciati nel mezzo di coltura per 12 ore dopo il cambio di terreno in RPMI-160 addizionato con il 10 % di FCS. Infine, le cellule venivano lisate a 36 o a 48 ore. (Strano e coll, Journal Biological Chemistry 275:29503-508 2000).
Saggi di transattivazione
Le linee cellulari SKBR3, HT-29, MDA-MB-468 sono state trasfettate con Lipof ectamina 2000 seguendo le istruzioni del produttore (inVitrogen) .
Le cellule (1.5x10<s>) venivano trasfettate transientemente con i peptidi SIMP, i plasmidi di espressione e i costrutti reporter come controlli interni per l'efficienza di trasfezione. Dopo la trasfezione, SKBR3 , HT-29 e MDA-MB-468 venivano incubate con 3 Î1⁄4Îœ di ADR per 24 ore. Le cellule venivano lavate con PBS freddo e risospese in un buffer di lisi (Promega) e incubate per 10 min a temperatura ambiente. Il materiale insolubile era centrifugato e l'attività luciferasica era determinata utilizzando un kit commerciale con l'aiuto di un luminometro (Turner). Peptidi
I peptidi sono stati disegnati analizzando la sequenza del dominio di legame al DNA della p73 umana (131-310 aa) . I peptidi dopo la purificazione e caratterizzazione tramite l'analisi della Spettrometria di Massa, sono stati trasfettati con Lipofectamina 2000 seguendo le istruzioni del produttore utilizzando una concentrazione tra 10 a 40 Î1⁄4Îœ per campione.
Sintesi dei Peptidi
La sintesi in fase solida dei peptidi à ̈ stata effettuata su di un sintetizzatore automatico di peptidi il Pioneer TMP Peptide Synthesis System utilizzando la tecnica Fmoc per l'assemblaggio della catena. Con tale metodo, il gruppo amminico Na à ̈ protetto provvisoriamente dal gruppo 9-fluorenilmetossicarbonil (Fmoc). La prima fase dell'assemblaggio della catena à ̈ la deprotezione o rimozione del gruppo protettore Fmoc mediante piperidina. Il gruppo Fmoc à ̈ una base instabile che può essere rapidamente rimossa da una ammina secondaria, cosi come dal 20% di piperidina in N,N-dimetilformammide . La catena peptidica à ̈ assemblata facendo reagire il gruppo N-terminale non bloccato di un aminoacido legato al supporto solido con il gruppo C-Carbossilico . I peptidi sono stati ottenuti per sintesi chimica dall'estremità C-terminale verso l'estremità N- terminale con il gruppo alphacarbossilico dell'amminoacido legato ad un supporto solido, costituito da una resina polistirenica con 1'1% di divinilbenzene o da una resina di polietilene o su di un supporto di polistirene. Prima dell'accoppiamento, il gruppo carbossilico dell<1>amminoacido à ̈ stato attivato mediante i metodi HOBt/DCC o HATU/DIEA e PyBop/DIEA.
La deprotezione e il distacco sono passaggi cruciali della sintesi dei peptidi. Esistono vari attivatori chimici e la scelta dipende da diversi fattori: in questo caso à ̈ stato utilizzato l'iidrossibenzotriazolo (HOBt). Il processo non bloccato del gruppo N-terminale, l'attivazione del gruppo carbossilico e la formazione del legame con gli aminoacidi successivi sono state ripetute fino a che il peptide di interesse à ̈ stato completato. Alla fine della sintesi il peptide à ̈ stato staccato dal supporto e deprotetto con una mistura di TFA/anisolo/mercaptoetanolo . I peptidi ottenuti sono stati isolati dalla soluzione di TFA mediante precipitazione con etere a freddo o estrazione con cloroformio. Successivamente, i peptidi purificati mediante HPLC sono stati passati su di una colonna sephasil C8, utilizzando un gradiente lineare di acquaacetonitrile a pH3. Un'aliquota del campione ottenuto à ̈ stata idrolizzata a 108 °C per almeno 24 ore con 6 N HC1 e analizzata per testare la corretta composizione di aminoacidi in HPLC con un contatore a fluorescenza.
Preparazione degli estratti cellulari e analisi di western blot
Gli estratti cellulari sono processati in un buffer di lisi contenente Tris HCL 50 mM pH8, 100 mM NaCl, 10% glicerolo, 1% Triton X-100, lraM EDTA, lOOmM NaF, MgCl2, lmM PMSF, inibitori delle proteasi e fosfatasi. Gli estratti sono poi sonicati e centrifugati a 14.000 rpm per 10 min per rimuovere i residui .
50 Î1⁄4g di proteine solubilizzate erano risolte per elettroforesi su 10 o 15% di SDS-gel di poliacrilamide. Analisi di Western blot erano condotte utilizzando anticorpi primari anti-p53 (D01 Calbiochem), rabbit anti-PARP, rabbit policlonale anti-Bax, anti-p21 e anticorpo monoclonale anti-tubulina (Calbiochem). Gli anticorpi secondari utilizzati per le analisi di espressione erano il goat anti-mouse e il goat antirabbit coniugato alla perossidasi di cavallo (Amersham). Le bande immunomarcate venivano rilevate attraverso i metodi della Chemioluminescenza (Pierce).
Saggi di Immunoprecipitazione
Gli estratti purificati sono stati incubati con la Prot.A/G Sefarosio (Pierce) in un buffer di lisi contenente 0.05% BSA e 1 Î1⁄49 dì anticorpo di coniglio ap73 (Santa Cruz) o con il siero pre-inmmune dopo un incubazione di 2 ore a 4°C. Successivamente, gli immunocomplessi venivano risospesi in un buffer di lisi ed eluiti in 50 Î1⁄4Î di SDS sample buffer per un analisi di Western Blot.
Saggi di Dot Immunobinding
Le membrane di nitrocellulosa venivano tagliate, lavate in acqua e blottate su dei filtri di carta. I peptidi alle concentrazioni di 250Î1⁄4Îœ venivano decorati sulla membrana. La membrana marcata veniva lavata per 10 min. con un buffer di TBST (lOmM di Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween-20) e poi bloccata per 45 min con TBST/latte al 5%. Le membrane venivano poi incubate per 6 ore a 4°C in agitatore con 1 mg di estratto totale di proteine o con 20 Î1⁄4g di proteine GST di fusione purificate. Le membrane venivano poi lavate con un buffer TBST e decorate con un anticorpo anti-p53 (DOl) come anticorpo primario. Come anticorpo secondario veniva utilizzato un anticorpo di capra coniugato con la perossidasi di cavallo. Le bande venivano testate con la metodica della Chemoluminescenza (Pierce).
Saggi di tumorigenicità in vivo
Saggi di xenotrapianto sono stati condotti trapiantando i topi nudi mediante delle iniezioni sottocutanee, con 5xl0<5>cellule/topo della linea umana di tumore colon-rettale trasfettata con i peptidi SIMP1, SIMP1KO e SIMP5M (nu/nu CD1 topi Charles River). La crescita tumorale à ̈ stata monitorata per 5 settimane in contemporaneo con il monitoraggio del peso corporeo degli animali al fine di valutare la tossicità cronica Tutte le procedure concernenti gli animali e la loro cura sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali vigenti.
RISULTATI
I peptidi SIMP1 e SIMP1M rompono selettivamente il complesso m-p53 /p73
Al fine di valutare l'attività del peptide SIMP1 e dei suoi derivati SIMP1KO e SIMP1M abbiamo analizzato la loro capacità a disassemblare il complesso oncogenico m-p53His-273/p73. Saggi di coprecipitazione mostravano che 1' ammontare di m-p53 legata a p73 era fortemente ridotta (Fig.lA) in linee di carcinoma della mammella MDA-MB-468 che presentavano una mutazione His-273.
Al fine di dimostrare l'avvenuta alterazione del complesso proteico m-p53/p73, lisati cellulari di linee di carcinoma del colon HT29 (m-p53 His273), del polmone H1299 (p53 nuli), della mammella SKBR3 (m-53 Hisl75) sono stati incubati con una membrana di nitrocellulosa marcata con i peptidi SIMP1, SIMP1K0, SIMP1M., SIMP5M (Fig. 3°. Le membrane decorate con i peptidi SIMP erano anche incubate con le proteine di fusione GST-p53 Hisl75, GST p53His74-298, GST WTp53, GST controllo. La rilevazione contro la proteina p53 mostrava che SIMP5M reagiva specificamente contro la mp53 Hisl75, nessuna reazione si osservava con i peptidi SIMP1, SIMP1K0 (Fig3B).
SIMP1 ripristina l'attività trascrizionale del gene p73, aumentando l'apoptosi indotta dall'adriamicina in cellule esprimenti m-p53 His-273 A tal fine, abbiamo analizzato la capacità di bloccare l'inibizione esercitata dalla m-p53 His273 sull'attività trascrizionale. Saggi di transattivazione mostravano che la trasfezione di SIMP1 bloccava l'inibizione della m-p53 His273 sull'attività trascrizionale di p73 . La trasfezione di SIMP1 aumentava la risposta trascrizionale di p73 in risposta all'adriamicina .
I peptidi sono stati trasfettati nelle cellule utilizzando il metodo della lipofectamina 2000 (Invitrogen) utilizzando una concentrazione tra i 10-40 Î1⁄4Îœ per campione {Fig.l, Fig. 2).
I peptdi SIMP1 e SIMP1M aumentano la risposta apoptotica ad agenti chemioterapici in linee tumorali esprimenti m-His 273
A tal fine sono stati condotti saggi di vitalità cellulare e saggi apoptotici (Fig.lB, Fig.4 B-C) in linee di carcinoma della mammella MDA-MB468.
I peptidi SIMP1 e SIMP1M riducono la proliferazione cellulare in vitro e la crescita tumorale in vivo
Abbiamo osservato in linee di carcinoma della mammella MDA-MB468 e in linee di carcinoma del colon HT29 una riduzione della proliferazione cellulare.
Esperimenti condotti in topi nudi trapiantati con linee tumorali trattate (tradotte) con i peptidi. SIMP1, SIMP1M mostravano una significativa riduzione della crescita (calibro tumorale). Al contrario, gli esperimenti condotti nei topi nudi inoculati con cellule trasfettate con il peptide SIMP1KO o con il SIMP5M mostravano una crescita tumorale simile al controllo non trattato (Fig. 4). Inoltre, la traduzione di SIMP1 nelle linee cellulari di un tumore umano HT29 le rendeva più sensibili al trattamento con Adriamicina .
Gli esperimenti sono stati condotti trapiantando i topi nudi (nu/nu CD1 mice Charles River), mediante iniezione sottocutanea , con 5x IO<5>cellule/topo. La crescita tumorale à ̈ stata monitorata per 5 settimane in contemporaneo con il monitoraggio del peso corporeo degli animali al fine di valutare eventuali effetti tossici che non si sono presentati (Fig.5) .
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1) Peptide comprendente la o consistente nella sequenza FQQSSTARSATW (SEQ ID NO:16) per l'uso in campo medico.
- 2) Sequenza nucleotidica codificante per il peptide della rivendicazione 1.
- 3) Vettore di espressione comprendente la sequenza nucleotidica della rivendicazione 2.
- 4) Composizione farmaceutica comprendente o consistente nel peptide definito nella rivendicazione 1 o nel vettore definito nella rivendicazione 3 come principio attivo in associazione con uno o più eccipienti e/o coadiuvanti farmaceuticamente accettabili .
- 5) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 4, che comprende ulteriormente uno o più principi attivi antitumorali.
- 6) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 5 in cui i principi attivi antitumorali sono scelti nel gruppo che consiste in cisplatino, adriamicina, 5 fluorouracile o antiproliferativi quali la vitamina D.
- 7) Uso del peptide definito nella rivendicazione 1 o del vettore definito nella rivendicazione 3 o della composizione come definita in ognuna delle rivendicazioni 4-6 per la preparazione di un medicamento per il trattamento dei tumori.
- 8) Uso secondo al rivendicazione 7, in cui i tumori presentano a livello cellulare il complesso proteico m-p53 His273/p73.
- 9) Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 7-8, in cui i tumori sono scelti nel gruppo che consiste in tumori della mammella, polmone e del colon retto.
- 10) Combinazione tra il peptide come definito nella rivendicazione 1 o il vettore come definito nella rivendicazione 3 e uno o più principi attivi antitumorali per l'uso simultaneo, separato o sequenziale nella terapia dei tumori.
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