JP2001086991A - オリゴペプチド - Google Patents
オリゴペプチドInfo
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- JP2001086991A JP2001086991A JP26939899A JP26939899A JP2001086991A JP 2001086991 A JP2001086991 A JP 2001086991A JP 26939899 A JP26939899 A JP 26939899A JP 26939899 A JP26939899 A JP 26939899A JP 2001086991 A JP2001086991 A JP 2001086991A
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- JP
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- tat
- cells
- peptide
- oligopeptide
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡ傷害処理による癌細胞のＧ２期停止を
特異的に阻害することのできるオリゴペプチドを提供す
る。 【解決手段】 配列番号３または４のアミノ酸配列から
なるオリゴペプチド。
特異的に阻害することのできるオリゴペプチドを提供す
る。 【解決手段】 配列番号３または４のアミノ酸配列から
なるオリゴペプチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、新規なオ
リゴペプチドに関するものである。さらに詳しくは、こ
の出願の発明は、癌細胞におけるＤＮＡ障害に対するチ
ェックポイント機構を特異的に破壊することにより、例
えば癌細胞の抗癌剤に対する感受性を顕著に増強させる
ことのできるオリゴペプチドと、このオリゴペプチドの
利用に関するものである。
リゴペプチドに関するものである。さらに詳しくは、こ
の出願の発明は、癌細胞におけるＤＮＡ障害に対するチ
ェックポイント機構を特異的に破壊することにより、例
えば癌細胞の抗癌剤に対する感受性を顕著に増強させる
ことのできるオリゴペプチドと、このオリゴペプチドの
利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】抗癌剤の多く（例えば、ブレオマイシン
等）は、癌細胞に対するＤＮＡ損傷を作用機序としてい
る。
等）は、癌細胞に対するＤＮＡ損傷を作用機序としてい
る。
【０００３】正常細胞では、ＤＮＡ障害が起こった場合
には、細胞周期Ｇ１期チェックポイントおよびＧ２期チ
ェックポイントにおいて細胞周期を停止し、障害を受け
たＤＮＡを修復するが、正常細胞における修復機能はＧ
１期チェックポイントによる停止期に働くことが主であ
り、Ｇ２期チェックポイントの役割は少ないと考えられ
ている。
には、細胞周期Ｇ１期チェックポイントおよびＧ２期チ
ェックポイントにおいて細胞周期を停止し、障害を受け
たＤＮＡを修復するが、正常細胞における修復機能はＧ
１期チェックポイントによる停止期に働くことが主であ
り、Ｇ２期チェックポイントの役割は少ないと考えられ
ている。
【０００４】一方、分子腫瘍学における最近の進歩によ
って、Ｇ1細胞周期チェックポイントが大半のヒト癌細
胞で損なわれていることが明らかにされている。癌細胞
の大部分は、Ｇ１期チェックポイントに関係するｐ53、
Ｒb、ｐ16INK4やｐ19ARFのような癌抑制遺伝子に突然変
異を有するか、またはＭＤＭ-２やサイクリンＤのよう
な癌遺伝子が過剰発現している（参考文献１、２）。こ
れらに加えて、増殖因子の過剰発現やこれら遺伝子、そ
れらのレセプターまたは下流シグナル伝達分子の機能獲
得突然変異によって引き起こされる過剰な増殖シグナル
が、Ｇ1期チェックポイントを機能不全にすることによ
って細胞の形質転換を生じさせていると考えられる。例
外的に、癌細胞のなかにはＧ1期チェックポイントでは
なくてＧ2期チェックポイントが破壊されているものも
ある（参考文献３）。このことは、正常な細胞周期にお
いては、Ｇ2期チェックポイントと比較してＧ1期チェッ
クポイントが相対的に重要であることを示している。突
然変異の過剰集積はおそらく細胞に致命的であるが、上
記のチェックポイントの破壊による突然変異率の上昇に
より最終的に発癌に至る突然変異を細胞に集積させる
（参考文献４、５）。
って、Ｇ1細胞周期チェックポイントが大半のヒト癌細
胞で損なわれていることが明らかにされている。癌細胞
の大部分は、Ｇ１期チェックポイントに関係するｐ53、
Ｒb、ｐ16INK4やｐ19ARFのような癌抑制遺伝子に突然変
異を有するか、またはＭＤＭ-２やサイクリンＤのよう
な癌遺伝子が過剰発現している（参考文献１、２）。こ
れらに加えて、増殖因子の過剰発現やこれら遺伝子、そ
れらのレセプターまたは下流シグナル伝達分子の機能獲
得突然変異によって引き起こされる過剰な増殖シグナル
が、Ｇ1期チェックポイントを機能不全にすることによ
って細胞の形質転換を生じさせていると考えられる。例
外的に、癌細胞のなかにはＧ1期チェックポイントでは
なくてＧ2期チェックポイントが破壊されているものも
ある（参考文献３）。このことは、正常な細胞周期にお
いては、Ｇ2期チェックポイントと比較してＧ1期チェッ
クポイントが相対的に重要であることを示している。突
然変異の過剰集積はおそらく細胞に致命的であるが、上
記のチェックポイントの破壊による突然変異率の上昇に
より最終的に発癌に至る突然変異を細胞に集積させる
（参考文献４、５）。
【０００５】興味深いことに、Ｇ1期チェックポイント
が損なわれている癌細胞においてもＧ2期チェックポイ
ントは保持されている。正常細胞はＧ1とＧ2の２つの独
立したＤＮＡ損傷チェックポイントを有しているので、
何らかの処理によってＧ2期チェックポイントが選択的
に破壊された場合、Ｇ1期チェックポイントが既に破壊
されている癌細胞は、無傷のＧ1期チェックポイントを
有する正常細胞よりもＤＮＡ損傷処理に対して一層敏感
になるものと期待される。例えば、カフェイン等による
非特異的なＧ2期チェックポイント破壊はｐ53欠失癌細
胞をＤＮＡ損傷に対して感受性にするのに有効であるこ
とが報告されている（参考文献６−７）。
が損なわれている癌細胞においてもＧ2期チェックポイ
ントは保持されている。正常細胞はＧ1とＧ2の２つの独
立したＤＮＡ損傷チェックポイントを有しているので、
何らかの処理によってＧ2期チェックポイントが選択的
に破壊された場合、Ｇ1期チェックポイントが既に破壊
されている癌細胞は、無傷のＧ1期チェックポイントを
有する正常細胞よりもＤＮＡ損傷処理に対して一層敏感
になるものと期待される。例えば、カフェイン等による
非特異的なＧ2期チェックポイント破壊はｐ53欠失癌細
胞をＤＮＡ損傷に対して感受性にするのに有効であるこ
とが報告されている（参考文献６−７）。
【０００６】Ｇ2期チェックポイントに関する現在の仮
説によれば、ＤＮＡ損傷はrad3+/ＡＴＭの活性化によっ
てプロテインキナーゼＣhk1およびＨuＣds1/Ｃhk2を活
性化する（参考文献11−14）。次いで、Ｃhk1およびＨu
Ｃds1/Ｃhk2はヒトではＣdc25Ｃの216番セリンをリン酸
化し、そして14-3-3との結合を促進する（参考文献15−
17）。分裂酵母では、14-3-3とＣdc25Ｃとの結合によっ
てＣdc25Ｃは細胞質中に隔離され（参考文献18）、その
結果Ｃdc25ＣによるＣdc2/サイクリンＢの活性化が阻害
されるので、最終的にＧ2停止が誘導され、ＤＮＡの修
復が行われる（参考文献19−21）。
説によれば、ＤＮＡ損傷はrad3+/ＡＴＭの活性化によっ
てプロテインキナーゼＣhk1およびＨuＣds1/Ｃhk2を活
性化する（参考文献11−14）。次いで、Ｃhk1およびＨu
Ｃds1/Ｃhk2はヒトではＣdc25Ｃの216番セリンをリン酸
化し、そして14-3-3との結合を促進する（参考文献15−
17）。分裂酵母では、14-3-3とＣdc25Ｃとの結合によっ
てＣdc25Ｃは細胞質中に隔離され（参考文献18）、その
結果Ｃdc25ＣによるＣdc2/サイクリンＢの活性化が阻害
されるので、最終的にＧ2停止が誘導され、ＤＮＡの修
復が行われる（参考文献19−21）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、Ｇ1期
チェックポイントが損なわれている癌細胞においては、
さらにＧ２期チェックポイントが選択的に破壊されれ
ば、抗癌剤等のＤＮＡ障害処理に対して感受性となり、
効果的な癌治療が可能となるものと期待される。また、
そのような治療においては、Ｇ１およびＧ２の２つのチ
ェックポイント機構を持たない癌細胞を対象とすること
になるため、比較的少ない量の抗癌剤によっても癌細胞
を死滅させることが可能であり、正常細胞への副作用を
大幅に低減することが可能となる。
チェックポイントが損なわれている癌細胞においては、
さらにＧ２期チェックポイントが選択的に破壊されれ
ば、抗癌剤等のＤＮＡ障害処理に対して感受性となり、
効果的な癌治療が可能となるものと期待される。また、
そのような治療においては、Ｇ１およびＧ２の２つのチ
ェックポイント機構を持たない癌細胞を対象とすること
になるため、比較的少ない量の抗癌剤によっても癌細胞
を死滅させることが可能であり、正常細胞への副作用を
大幅に低減することが可能となる。
【０００８】この出願は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであって、細胞周期のＧ２チェックポイン
トを選択的に破壊することのできる新規なオリゴペプチ
ドを提供することを課題としている。
なされたものであって、細胞周期のＧ２チェックポイン
トを選択的に破壊することのできる新規なオリゴペプチ
ドを提供することを課題としている。
【０００９】また、この出願は、このオリゴペプチドの
発現ベクターを提供することを課題としている。
発現ベクターを提供することを課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するものとして、以下の(1)〜(6)の発明を提供す
る。 (1) 配列番号１のアミノ酸配列を有するオリゴペプチ
ド。 (2) 配列番号２のアミノ酸配列を有するオリゴペプチ
ド。 (3) 配列番号３のアミノ酸配列からなる前記(1)のオリ
ゴペプチド。 (4) 配列番号４のアミノ酸配列からなる前記(2)のオリ
ゴペプチド。 (5) 配列番号１のアミノ酸配列をコードするオリゴヌク
レオチドを保有する発現ベクター。 (6) 配列番号２のアミノ酸配列をコードするオリゴヌク
レオチドを保有する発現ベクター。
を解決するものとして、以下の(1)〜(6)の発明を提供す
る。 (1) 配列番号１のアミノ酸配列を有するオリゴペプチ
ド。 (2) 配列番号２のアミノ酸配列を有するオリゴペプチ
ド。 (3) 配列番号３のアミノ酸配列からなる前記(1)のオリ
ゴペプチド。 (4) 配列番号４のアミノ酸配列からなる前記(2)のオリ
ゴペプチド。 (5) 配列番号１のアミノ酸配列をコードするオリゴヌク
レオチドを保有する発現ベクター。 (6) 配列番号２のアミノ酸配列をコードするオリゴヌク
レオチドを保有する発現ベクター。
【００１１】以下、これらの発明の実施の形態について
詳しく説明する。
詳しく説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】この出願の発明(1)は、公知のヒ
トＣdc25Ｃ（GenPept. Accession No. NP 001781）の21
1〜221番アミノ酸配列に相当するペプチド（配列番号
１）を含むオリゴペプチドである。また、発明(2)は、
ヒトＣdc25Ｃの211〜221番アミノ酸配列のうち、216番
セリン残基（Ｓer）をアラニン残基（Ａla）に置換した
アミノ酸配列（配列番号２）を有するオリゴペプチドで
ある。すなわち、この出願の発明者らは、配列番号１ま
たは２のアミノ酸配列を有するペプチドが、プロテイン
キナーゼＣhk1およびＨuＣds1/Ｃhk2の活性を抑制する
ことにより、Ｇ２期チェックポイントを選択的に破壊す
ることを見出して、この発明を完成させた。
トＣdc25Ｃ（GenPept. Accession No. NP 001781）の21
1〜221番アミノ酸配列に相当するペプチド（配列番号
１）を含むオリゴペプチドである。また、発明(2)は、
ヒトＣdc25Ｃの211〜221番アミノ酸配列のうち、216番
セリン残基（Ｓer）をアラニン残基（Ａla）に置換した
アミノ酸配列（配列番号２）を有するオリゴペプチドで
ある。すなわち、この出願の発明者らは、配列番号１ま
たは２のアミノ酸配列を有するペプチドが、プロテイン
キナーゼＣhk1およびＨuＣds1/Ｃhk2の活性を抑制する
ことにより、Ｇ２期チェックポイントを選択的に破壊す
ることを見出して、この発明を完成させた。
【００１３】この発明(1)および(2)のオリゴペプチドに
は、各々、配列番号１および２のペプチドに、例えば細
胞膜通過機能を有するペプチド等を結合させることが好
ましい。このような細胞膜通過ペプチドとしては、公知
のＨＩＶ-1・ＴＡＴの部分配列や、ショウジョウバエの
ホメオボックスタンパク質アンテナペディアの部分配列
（例えば、配列番号６）を使用することができる。
は、各々、配列番号１および２のペプチドに、例えば細
胞膜通過機能を有するペプチド等を結合させることが好
ましい。このような細胞膜通過ペプチドとしては、公知
のＨＩＶ-1・ＴＡＴの部分配列や、ショウジョウバエの
ホメオボックスタンパク質アンテナペディアの部分配列
（例えば、配列番号６）を使用することができる。
【００１４】また、発明(3)および(4)は、各々、配列番
号３および配列番号４のアミノ酸配列からなるオリゴペ
プチドである。これらのオリゴペプチドにおいて、Ｃ末
端側の11アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配
列番号２の配列であり、Ｎ末端側の11アミノ酸配列は、
公知のＨＩＶ-1・ＴＡＴ（GenPept. Accession NO. CAA
45921：参考文献22、23）の47〜57番アミノ酸配列に相
当する。このＨＩＶ-1・ＴＡＴ部分配列は、その細胞膜
通過機能により、Ｃ末端側のペプチドを細胞内に形質導
入するために付加されている。
号３および配列番号４のアミノ酸配列からなるオリゴペ
プチドである。これらのオリゴペプチドにおいて、Ｃ末
端側の11アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配
列番号２の配列であり、Ｎ末端側の11アミノ酸配列は、
公知のＨＩＶ-1・ＴＡＴ（GenPept. Accession NO. CAA
45921：参考文献22、23）の47〜57番アミノ酸配列に相
当する。このＨＩＶ-1・ＴＡＴ部分配列は、その細胞膜
通過機能により、Ｃ末端側のペプチドを細胞内に形質導
入するために付加されている。
【００１５】これらの各オリゴペプチドは、配列番号１
〜４の情報に基づき、公知の固相ペプチド合成法等によ
り調製することができる。発明(1)ないし(4)のオリゴヌ
クレオチドは、これらを癌組織に投与し、癌細胞のＧ２
期チェックポイントを破壊すると同時に、抗癌剤を投与
することによって癌細胞を死滅させる癌治療方法に用い
ることができる。特に、発明(3)および(4)のオリゴペプ
チドは、そのＮ末端側のＨＩＶ-1・ＴＡＴ部分配列によ
って癌細胞内に容易に取り込まれ、Ｃ末端側のペプチド
がＧ２期停止に関与するプロテインキナーゼＣhk1およ
びＨuＣds1/Ｃhk2の活性を抑制する。既にＧ１期チェッ
クポイント機能を喪失している癌細胞は、Ｇ２期に停止
してＤＮＡ修復を行うことができないため、抗癌剤をよ
り有効に作用させることができる。この治療方法におい
て、オリゴペプチドは、例えば適当な溶媒等に適量を溶
液化し、癌組織に直接投与することができる。あるい
は、癌細胞を認識する抗体等と結合することによって、
全身投与することもできる。抗癌剤としては、ＤＮＡ障
害を作用機序とする公知の薬剤（例えば、ブレオマイシ
ン等）を用いることができる。
〜４の情報に基づき、公知の固相ペプチド合成法等によ
り調製することができる。発明(1)ないし(4)のオリゴヌ
クレオチドは、これらを癌組織に投与し、癌細胞のＧ２
期チェックポイントを破壊すると同時に、抗癌剤を投与
することによって癌細胞を死滅させる癌治療方法に用い
ることができる。特に、発明(3)および(4)のオリゴペプ
チドは、そのＮ末端側のＨＩＶ-1・ＴＡＴ部分配列によ
って癌細胞内に容易に取り込まれ、Ｃ末端側のペプチド
がＧ２期停止に関与するプロテインキナーゼＣhk1およ
びＨuＣds1/Ｃhk2の活性を抑制する。既にＧ１期チェッ
クポイント機能を喪失している癌細胞は、Ｇ２期に停止
してＤＮＡ修復を行うことができないため、抗癌剤をよ
り有効に作用させることができる。この治療方法におい
て、オリゴペプチドは、例えば適当な溶媒等に適量を溶
液化し、癌組織に直接投与することができる。あるい
は、癌細胞を認識する抗体等と結合することによって、
全身投与することもできる。抗癌剤としては、ＤＮＡ障
害を作用機序とする公知の薬剤（例えば、ブレオマイシ
ン等）を用いることができる。
【００１６】この出願の発明(5)および(6)は、各々、配
列番号１および２のアミノ酸配列をコードするポリヌク
レオチド（33bp）を保有する発現ベクターである。配列
番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
は、ヒトＣdc25ＣのｃＤＮＡ配列（GenBank Accession
No. NM 001790）に基づいて調製したオリゴヌクレオチ
ドプローブによりヒトＣＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングすることによって、あるいは、オリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いたＰＣＲ法によってＣdc25Ｃ・ｃＤ
ＮＡを取得し、このｃＤＮＡを適当なヌクレアーゼ等で
処理することにより作製することができる。あるいは、
ヒトＣdc25ＣのｃＤＮＡを保有する公知のクローンpＡ
Ｓ2Ｃdc25Ｃからインサート部分を切り出し、ヌクレア
ーゼ処置等によって該当するＤＮＡ断片を作製すること
もできる。また、配列番号１のアミノ酸配列をコードす
るポリヌクレオチドは、Ｃdc25ＣのｃＤＮＡを鋳型とす
る公知の変異導入ＰＣＲ法等により、所定のＳerコドン
がＡlaコドンに置換したポリヌクレオチドを作製するこ
とができる。なお、ベクターとしては、動物細胞にトラ
ンスフェクションすることのできるウイルスベクター
（例えばアデノウイルスベクター等）を使用する。
列番号１および２のアミノ酸配列をコードするポリヌク
レオチド（33bp）を保有する発現ベクターである。配列
番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
は、ヒトＣdc25ＣのｃＤＮＡ配列（GenBank Accession
No. NM 001790）に基づいて調製したオリゴヌクレオチ
ドプローブによりヒトＣＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングすることによって、あるいは、オリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いたＰＣＲ法によってＣdc25Ｃ・ｃＤ
ＮＡを取得し、このｃＤＮＡを適当なヌクレアーゼ等で
処理することにより作製することができる。あるいは、
ヒトＣdc25ＣのｃＤＮＡを保有する公知のクローンpＡ
Ｓ2Ｃdc25Ｃからインサート部分を切り出し、ヌクレア
ーゼ処置等によって該当するＤＮＡ断片を作製すること
もできる。また、配列番号１のアミノ酸配列をコードす
るポリヌクレオチドは、Ｃdc25ＣのｃＤＮＡを鋳型とす
る公知の変異導入ＰＣＲ法等により、所定のＳerコドン
がＡlaコドンに置換したポリヌクレオチドを作製するこ
とができる。なお、ベクターとしては、動物細胞にトラ
ンスフェクションすることのできるウイルスベクター
（例えばアデノウイルスベクター等）を使用する。
【００１７】このらの発現ベクターは、例えばベクター
を癌細胞にトランスフェクションし、細胞内において配
列番号１または２のアミノ酸配列を有するペプチドを発
現させ、これによって癌細胞のＧ２期チェックポイント
を破壊した後、抗癌剤を投与することによって癌細胞を
死滅させる癌治療方法に用いることができる。
を癌細胞にトランスフェクションし、細胞内において配
列番号１または２のアミノ酸配列を有するペプチドを発
現させ、これによって癌細胞のＧ２期チェックポイント
を破壊した後、抗癌剤を投与することによって癌細胞を
死滅させる癌治療方法に用いることができる。
【００１８】以下、実施例を示してこの出願の前記発明
についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願
の発明は以下の例によって限定されるものではない。
についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願
の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】配列番号３のアミノ酸配列からなるオリゴペ
プチド（ＴＡＴ−Ｓ216）および配列番号４のアミノ酸
配列からなるオリゴペプチド（ＴＡＴ−Ｓ216Ａ）を公
知の固相ペプチド合成法により作製した。
プチド（ＴＡＴ−Ｓ216）および配列番号４のアミノ酸
配列からなるオリゴペプチド（ＴＡＴ−Ｓ216Ａ）を公
知の固相ペプチド合成法により作製した。
【００２０】また、コントロールとして配列番号５にア
ミノ酸配列を示したオリゴペプチド（ＴＡＴ−Contro
l）を作製した。このコントロールは、Ｎ末端側の11ア
ミノ酸配列がＨＩＶ-1・ＴＡＴ部分配列であり、Ｃ末端
側の11アミノ酸配列は配列番号１に示したＣdc25Ｃ部分
配列のアミノ酸残基をランダムに配置している。
ミノ酸配列を示したオリゴペプチド（ＴＡＴ−Contro
l）を作製した。このコントロールは、Ｎ末端側の11ア
ミノ酸配列がＨＩＶ-1・ＴＡＴ部分配列であり、Ｃ末端
側の11アミノ酸配列は配列番号１に示したＣdc25Ｃ部分
配列のアミノ酸残基をランダムに配置している。
【００２１】これらのオリゴペプチドを用い、細胞の細
胞周期状態および細胞の抗癌剤感受性に対するオリゴペ
プチドの作用を試験した。なお、試験２〜５に共通する
材料と方法は以下のとおりとした。 (a) 細胞 Ｊurkat、ＭＩＡＰaＣa2およびＰＡＮＣ1はＲＰＭＩ164
0（Sigma）、イーグル最少必須培地（Iwaki）並びにダ
ルベッコ修正イーグル培地＋４ mＭｌ-グルコース（Sig
ma）および1.0 mＭピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL）
中でそれぞれに10％のウシ胎児血清を加えて37℃／５％
ＣＯ2で培養した。正常な末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は
フィコール・パク（Pharmacia）傾斜法を使用して調製し
た。ＰＢＬは５μg/mlＰＨＡ（Nacalai tesque）で５日
間刺激し、１回洗浄し、そして５μg/mlＰＨＡおよびブ
レオマイシン＋ペプチドで更に刺激した。 (b) ヒストンＨ１キナーゼアッセイ １×107個の細胞を冷ＰＢＳ中で洗浄し、そして１ mlの
緩衝液Ａ中４℃で溶解した。ｐ13suc1アガロースビーズ
（20μg/ml: Upstate biotechnology）を上記清明溶解
物に加え、４℃で４時間インキュベートし、そしてビー
ズを緩衝液Ｂで５回洗浄した。ｐ13suc1アガロースはＣ
dc2キナーゼアッセイキット（Upstate biotechnology）
および［γ-32Ｐ］ＡＴＰを使用してヒストンＨ１キナ
ーゼ活性について分析し、続いて12％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
電気泳動にかけ、そしてオートラジオグラフィーにかけ
て、リン酸化したヒストンＨ１を検出した。 試験１ ＴＡＴ−Ｓ216およびＴＡＴ−Ｓ216ＡのＣhk1およびＣh
k2活性阻害作用をin vitro系で試験した。
胞周期状態および細胞の抗癌剤感受性に対するオリゴペ
プチドの作用を試験した。なお、試験２〜５に共通する
材料と方法は以下のとおりとした。 (a) 細胞 Ｊurkat、ＭＩＡＰaＣa2およびＰＡＮＣ1はＲＰＭＩ164
0（Sigma）、イーグル最少必須培地（Iwaki）並びにダ
ルベッコ修正イーグル培地＋４ mＭｌ-グルコース（Sig
ma）および1.0 mＭピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL）
中でそれぞれに10％のウシ胎児血清を加えて37℃／５％
ＣＯ2で培養した。正常な末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は
フィコール・パク（Pharmacia）傾斜法を使用して調製し
た。ＰＢＬは５μg/mlＰＨＡ（Nacalai tesque）で５日
間刺激し、１回洗浄し、そして５μg/mlＰＨＡおよびブ
レオマイシン＋ペプチドで更に刺激した。 (b) ヒストンＨ１キナーゼアッセイ １×107個の細胞を冷ＰＢＳ中で洗浄し、そして１ mlの
緩衝液Ａ中４℃で溶解した。ｐ13suc1アガロースビーズ
（20μg/ml: Upstate biotechnology）を上記清明溶解
物に加え、４℃で４時間インキュベートし、そしてビー
ズを緩衝液Ｂで５回洗浄した。ｐ13suc1アガロースはＣ
dc2キナーゼアッセイキット（Upstate biotechnology）
および［γ-32Ｐ］ＡＴＰを使用してヒストンＨ１キナ
ーゼ活性について分析し、続いて12％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
電気泳動にかけ、そしてオートラジオグラフィーにかけ
て、リン酸化したヒストンＨ１を検出した。 試験１ ＴＡＴ−Ｓ216およびＴＡＴ−Ｓ216ＡのＣhk1およびＣh
k2活性阻害作用をin vitro系で試験した。
【００２２】ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープをつ
け、バキュロウイルスを用いて昆虫の細胞で発現させた
ヒトＣhk1およびc-mycエピトープをつけたＣhk2を、そ
れぞれＨＡおよびc-mycに対する抗体を用いて免疫沈降
し、大腸菌を用いて作成したＧＳＴ−Ｃdc25Ｃ（アミノ
酸位置200-256）または合成ペプチド（Ｃdc25Ｃのアミ
ノ酸位置201-211）を基質としたリン酸化反応を行い、
この反応にＴＡＴ−Ｓ216およびＴＡＴ−Ｓ216Ａをそれ
ぞれ加えることにより、その阻害作用を確認した。反応
は30℃15分で行い、阻害作用は15％ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびオートラで測定した。
け、バキュロウイルスを用いて昆虫の細胞で発現させた
ヒトＣhk1およびc-mycエピトープをつけたＣhk2を、そ
れぞれＨＡおよびc-mycに対する抗体を用いて免疫沈降
し、大腸菌を用いて作成したＧＳＴ−Ｃdc25Ｃ（アミノ
酸位置200-256）または合成ペプチド（Ｃdc25Ｃのアミ
ノ酸位置201-211）を基質としたリン酸化反応を行い、
この反応にＴＡＴ−Ｓ216およびＴＡＴ−Ｓ216Ａをそれ
ぞれ加えることにより、その阻害作用を確認した。反応
は30℃15分で行い、阻害作用は15％ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびオートラで測定した。
【００２３】結果は図１および図２に示したとおりであ
り、Ｃhk1およびＣhk2のリン酸化反応はＴＡＴ−Ｓ216
およびＴＡＴ−Ｓ216Ａにより顕著に抑制された。この
結果から、この発明のオリゴペプチドはプロテインキナ
ーゼＣhk1およびＨuＣds1/Ｃhk2の活性を抑制すること
が確認された。 試験２ ＴＡＴ−Ｓ216およびＴＡＴ−Controlで処理した細胞の
細胞周期状態を、ＤＮＡ損傷誘導Ｇ2停止中にフローサ
イトメトリーおよびヒストンＨ1キナーゼアッセイで分
析した。
り、Ｃhk1およびＣhk2のリン酸化反応はＴＡＴ−Ｓ216
およびＴＡＴ−Ｓ216Ａにより顕著に抑制された。この
結果から、この発明のオリゴペプチドはプロテインキナ
ーゼＣhk1およびＨuＣds1/Ｃhk2の活性を抑制すること
が確認された。 試験２ ＴＡＴ−Ｓ216およびＴＡＴ−Controlで処理した細胞の
細胞周期状態を、ＤＮＡ損傷誘導Ｇ2停止中にフローサ
イトメトリーおよびヒストンＨ1キナーゼアッセイで分
析した。
【００２４】ＴＡＴ−Controlペプチドとブレオマイシ
ン（Ｂleo）とで処理したＪurkat細胞はＧ2で停止した
（図３左下）。対照的に、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドで処
理した細胞はＧ２停止を示さなかった（図３左上）。な
お、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチド単独では正常な細胞周期に
対して明白な効果を示さなかった（データは示さず）。
これらの結果と一致して、Ｃdc2のヒストンＨ1キナーゼ
活性はブレオマイシンとＴＡＴ−Contolによる処理で消
失したが（データは示さず）、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチド
の添加では正常に比べて増加した（図４）。他方、コル
ヒチン（紡錘体形成の阻害試薬）で処理して活性化した
Ｍ期チェックポイントはＴＡＴ−Ｓ216ペプチドでは影
響されなかった（図５）。
ン（Ｂleo）とで処理したＪurkat細胞はＧ2で停止した
（図３左下）。対照的に、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドで処
理した細胞はＧ２停止を示さなかった（図３左上）。な
お、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチド単独では正常な細胞周期に
対して明白な効果を示さなかった（データは示さず）。
これらの結果と一致して、Ｃdc2のヒストンＨ1キナーゼ
活性はブレオマイシンとＴＡＴ−Contolによる処理で消
失したが（データは示さず）、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチド
の添加では正常に比べて増加した（図４）。他方、コル
ヒチン（紡錘体形成の阻害試薬）で処理して活性化した
Ｍ期チェックポイントはＴＡＴ−Ｓ216ペプチドでは影
響されなかった（図５）。
【００２５】以上の結果から、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチド
は、ＤＮＡ損傷によるＧ2期チェックポイントを特異的
に破壊することが確認された。 試験３ ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドによるＤＮＡ損傷誘導Ｇ2停止の
終了が癌細胞を抗癌剤に対して高感受性にするかどうか
を試験するために、癌細胞Ｊurkatを用いて試験した。
また正常細胞への影響を調べるため、フィトヘマグルチ
ニン（ＰＨＡ）で刺激した正常ヒトＴ細胞（ＰＨＡ芽細
胞）をブレオマイシンとペプチドで処理した。
は、ＤＮＡ損傷によるＧ2期チェックポイントを特異的
に破壊することが確認された。 試験３ ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドによるＤＮＡ損傷誘導Ｇ2停止の
終了が癌細胞を抗癌剤に対して高感受性にするかどうか
を試験するために、癌細胞Ｊurkatを用いて試験した。
また正常細胞への影響を調べるため、フィトヘマグルチ
ニン（ＰＨＡ）で刺激した正常ヒトＴ細胞（ＰＨＡ芽細
胞）をブレオマイシンとペプチドで処理した。
【００２６】その結果、図６に示したように、ＴＡＴ−
Ｓ216ペプチド単独ではこれらの細胞に対して明白な効
果を示さなかったが、このペプチドの添加によってＪur
katはブレオマイシンに対して感受性となった。コント
ロールのＴＡＴ−ControlペプチドはＪurkatに対するブ
レオマイシンの細胞傷害活性に影響を与えなかった（デ
ータは示さず）。また、図５の細胞周期パターンからも
予想されるように、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドはコルヒチ
ンによる細胞傷害には影響を与えなかった（図７）。
Ｓ216ペプチド単独ではこれらの細胞に対して明白な効
果を示さなかったが、このペプチドの添加によってＪur
katはブレオマイシンに対して感受性となった。コント
ロールのＴＡＴ−ControlペプチドはＪurkatに対するブ
レオマイシンの細胞傷害活性に影響を与えなかった（デ
ータは示さず）。また、図５の細胞周期パターンからも
予想されるように、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドはコルヒチ
ンによる細胞傷害には影響を与えなかった（図７）。
【００２７】以上の結果から、この発明のオリゴペプチ
ドとブレオマイシンによって引き起こされる細胞死はＧ
2停止欠損の結果であって、非特異的な細胞死経路に与
える効果によるものではないことが示された。
ドとブレオマイシンによって引き起こされる細胞死はＧ
2停止欠損の結果であって、非特異的な細胞死経路に与
える効果によるものではないことが示された。
【００２８】さらに、ＰＨＡ刺激活性化Ｔ細胞はＪurka
tと同じ速さで分裂するが、ブレオマイシン処理に応答
したＰＨＡ刺激活性化Ｔ細胞の感受性（図８）および細
胞周期パターン（図９）はＴＡＴ−Ｓ216ペプチドでは
影響されなかった。これらの結果は、細胞のブレオマイ
シン感受性に対するＴＡＴ−Ｓ216ペプチドの効果は、
生存に対するＧ2期チェックポイント活性への細胞の依
存度に相関していることが示唆された。
tと同じ速さで分裂するが、ブレオマイシン処理に応答
したＰＨＡ刺激活性化Ｔ細胞の感受性（図８）および細
胞周期パターン（図９）はＴＡＴ−Ｓ216ペプチドでは
影響されなかった。これらの結果は、細胞のブレオマイ
シン感受性に対するＴＡＴ−Ｓ216ペプチドの効果は、
生存に対するＧ2期チェックポイント活性への細胞の依
存度に相関していることが示唆された。
【００２９】さらに、ＭＩＡＰaＣa2細胞とＰＡＮＣ1細
胞を使用して同様な実験を行った。これらの細胞はブレ
オマイシン処理によってＧ2期に停止された（データは
示さず）。図10および図11に示したように、これらの細
胞もＴＡＴ−Ｓ216ペプチドによってブレオマイシンに
感受性になったが、コントロールのペプチドでは感受性
にならなかった。 試験４ ＴＡＴ−Ｓ216、ＴＡＴ−Ｓ216ＡおよびＴＡＴ−Contro
lで処理したＪurkat細胞の細胞周期状態を、ブレオマイ
シン処理の24時間後にフローサイトメトリーで分析し
た。
胞を使用して同様な実験を行った。これらの細胞はブレ
オマイシン処理によってＧ2期に停止された（データは
示さず）。図10および図11に示したように、これらの細
胞もＴＡＴ−Ｓ216ペプチドによってブレオマイシンに
感受性になったが、コントロールのペプチドでは感受性
にならなかった。 試験４ ＴＡＴ−Ｓ216、ＴＡＴ−Ｓ216ＡおよびＴＡＴ−Contro
lで処理したＪurkat細胞の細胞周期状態を、ブレオマイ
シン処理の24時間後にフローサイトメトリーで分析し
た。
【００３０】結果は図３に示したとおりである。ＴＡＴ
−Controlペプチドとブレオマイシンとで処理したＪurk
at細胞（図３左下）はＧ2期で停止したままであるのに
対し、ＴＡＴ−Ｓ216（図３左下）およびＴＡＴ−Ｓ216
Ａ（図３右上）を処理した場合には、ブレオマイシン処
理によるＧ２期停止がこれらのペプチド処理により欠損
した。
−Controlペプチドとブレオマイシンとで処理したＪurk
at細胞（図３左下）はＧ2期で停止したままであるのに
対し、ＴＡＴ−Ｓ216（図３左下）およびＴＡＴ−Ｓ216
Ａ（図３右上）を処理した場合には、ブレオマイシン処
理によるＧ２期停止がこれらのペプチド処理により欠損
した。
【００３１】一方、図５に示したＴＡＴ−Ｓ216ペプチ
ドの結果と同様に、コルヒチンで処理して活性化したＭ
期チェックポイントはＴＡＴ−Ｓ216Ａペプチドでも影
響されなかった（図５）。
ドの結果と同様に、コルヒチンで処理して活性化したＭ
期チェックポイントはＴＡＴ−Ｓ216Ａペプチドでも影
響されなかった（図５）。
【００３２】以上の結果から、ＴＡＴ−Ｓ216Ａペプチ
も、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドと同様に、ＤＮＡ損傷によ
るＧ2期チェックポイントを特異的に破壊することが確
認された。 試験５ 試験３と同様にして、ＴＡＴ−Ｓ216Ａペプチドによる
ＤＮＡ損傷誘導Ｇ2停止の欠損が癌細胞を抗癌剤に対し
て高感受性にするかどうかを試験した。
も、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドと同様に、ＤＮＡ損傷によ
るＧ2期チェックポイントを特異的に破壊することが確
認された。 試験５ 試験３と同様にして、ＴＡＴ−Ｓ216Ａペプチドによる
ＤＮＡ損傷誘導Ｇ2停止の欠損が癌細胞を抗癌剤に対し
て高感受性にするかどうかを試験した。
【００３３】結果は図６に示したとおりである。ＴＡＴ
−Ｓ216ＡペプチドはＴＡＴ−Ｓ216ペプチドと同様に、
Ｊurkat細胞をブレオマイシンに対して高感受性とし
た。
−Ｓ216ＡペプチドはＴＡＴ−Ｓ216ペプチドと同様に、
Ｊurkat細胞をブレオマイシンに対して高感受性とし
た。
【００３４】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、ＤＮＡ傷害処理による癌細胞のＧ２期停
止を特異的に阻害することのできるオリゴペプチドが提
供される。このオリゴペプチド処理によって癌細胞は抗
癌剤等に対して感受性となるため、抗癌剤を用いた癌治
療をより効果的に行うことが可能となる。
発明によって、ＤＮＡ傷害処理による癌細胞のＧ２期停
止を特異的に阻害することのできるオリゴペプチドが提
供される。このオリゴペプチド処理によって癌細胞は抗
癌剤等に対して感受性となるため、抗癌剤を用いた癌治
療をより効果的に行うことが可能となる。
【００３５】
【配列表】 <110> 科学技術振興事業団（Japan Science and Technology Corporation） <120> オリゴペプチド <130> NP99226-YS <160> 6 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapience <223> A part of Cdc25C <400> 1 Leu Tyr Arg Ser Pro Ser Met Pro Glu Asn Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Artificial Sequence: Synthesized peptide <400> 2 Leu Tyr Arg Ser Pro Ala Met Pro Glu Asn Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Artificial Sequence: Synthesized peptide <400> 3 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Tyr Arg Ser Pro 1 5 10 15 Ser Met Pro Glu Asn Leu 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Artificial Sequence: Synthesized peptide <400> 4 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Tyr Arg Ser Pro 1 5 10 15 Ala Met Pro Glu Asn Leu 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Artificial Sequence: Synthesized peptide <400> 5 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Tyr Leu Ser Arg Ser 1 5 10 15 Asn Pro Met Pro Glu Leu 20 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila <223> A part of Antennapedia gene product <400> 6 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Phe Lys 1 5 10 15
【００３６】
【参考文献】１． Levine, A.J. p53, the cellula
r gatekeeper for growth and division.Cell 88, 323-
331（1997)． ２． Larsen, C.J. Contribution of the dual cod
ing capacity of the p16INK4a/MTS1/CDKN2 locus to h
uman malignancies. Prog. Cell. Cycle. Res 3, 109-1
24（1997)． ３． Kawabe, T., Muslin, A.J. & Korsmeyer, S.
J. Hox11 interacts withprotein phosphatases PP2A a
nd PP1 and disrupts a G2/M cell-cycle checkpoint.
Nature 385, 454-458（1997)． ４． Hartwell, L.H. & Kastan, M.B. Cell cycle
control and cancer. Science 266, 1821-1828（199
4)． ５． Paulovich, A.G., Toczyski, D.P. & Hartwel
l, L.H. When checkpoints fail. Cell 88, 315-321（1
997)． ６． Rowley, R. Reduction of radiation-induced
G2 arrest by caffeine. Rad. Res 129, 224-227（199
2)． ７． Yao, S.L. et al. Selective radiosensitiza
tion of p53-deficientcells by caffeine-mediated ac
tivation of p34cdc2 kinase. Nature Med2, 1140-1143
（1996)． ８． DeFrank, J.S., Tang, W. & Powell, S.N. p5
3-null cells are moresensitive to ultraviolet ligh
t only in the presence of caffeine. Cancer Res 56,
5365-5368（1996)． ９． Wang, S.W., Norbury, C., Harris, A.L., To
da, T. Caffeine can override the S-M checkpoint in
fission yeast. J. Cell Sci. 112, 927-937（1999)． 10． Wang, Q., Fan, S, Eastman, A., Worland,
R.J., Sausville, E.A. &OiConnor, R.M. UCN-01: a po
tent abrogator of G2 checkpoint functionin cancer
cells with disrupted ｐ53. J. Natl. Cancer. Inst 8
8, 956-965（1996)． 11． Walworth, N., Davey, S., Beach, D. Fissio
n yeast chkl protein kinase links the Rad checkpoi
nt pathway to cdc2. Nature 363, 368-371（1993)． 12． Walworth, N.C., Bernards, R. rad-dependen
t-response of the chkl-encoded protein kinase at t
he DNA damage checkpoint. Science 271,353-356（199
6)． 13． Matsuoka, S., Huang, M., Ellcdgc, S.J. Li
nkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2
protein kinase. Science 282, 1893-1897（1998)． 14． Zeng, Y. et al. Replication checkpoint re
quires phosphorylationof the phosphatase Cdc25 by
Cds1 or Chk1. Nature 395, 507-510（1998)． 15． Furnari, B.,Rhind, N., Russell, P. Cdc25C
mitotic inducer tergeted by chk1 DNA damage check
point kinase. Science 277, 1495-1497（1997)． 16． Sanchez, Y. et al. Conservation of the ch
k1 checkpoint pathwayin mammals: linkage of DNA da
mage to cdk regulation through cdc25. Science 277,
1497-1501（1997)． 17． Peng, C.Y. et al. Mitotic and G2 checkpoi
nt control: regulationof 14-3-3 protein binding by
phosphorylation of cdc25C on serine-216. Science
277, 1501-1505（1997)． 18． Lopez-Girona, A., Furnari, B., Mondesert,
O., Russel, P. Nuclear localization of Cdc25 is r
egulated by DNA damage and a 14-3-3 protein. Natur
e 397, 172-175（1999)． 19． Nurse, P. Checkpoint pathways come of ag
e. Cell 91, 865-867（1997)． 20． Weinert, T.A. DNA damage checkpoint meets
the cell cycle engine. Science 277, 1450-1451（19
97)． 21． Russell, P. Checkpoints on the road to mi
tosis. TIBS 23, 399-402（1998)． 22． Nagahara, H. et al. Transduction on full-
length TAT fusion proteins into mammalian cells: T
AT-p27Kip1 induces cell migration.NatureMed 4, 144
9-1452（1998)． 23． Vocero-Akbain, A.M., Heyden, N.V., Lissy,
N.A., Ratner, L., Dowdy, S.F. Killing HIV-infecte
d cells by transduction with an HIV protease-activ
ated caspase-3 protein. Nature Med 5, 29-33（199
9)．
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331（1997)． ２． Larsen, C.J. Contribution of the dual cod
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uman malignancies. Prog. Cell. Cycle. Res 3, 109-1
24（1997)． ３． Kawabe, T., Muslin, A.J. & Korsmeyer, S.
J. Hox11 interacts withprotein phosphatases PP2A a
nd PP1 and disrupts a G2/M cell-cycle checkpoint.
Nature 385, 454-458（1997)． ４． Hartwell, L.H. & Kastan, M.B. Cell cycle
control and cancer. Science 266, 1821-1828（199
4)． ５． Paulovich, A.G., Toczyski, D.P. & Hartwel
l, L.H. When checkpoints fail. Cell 88, 315-321（1
997)． ６． Rowley, R. Reduction of radiation-induced
G2 arrest by caffeine. Rad. Res 129, 224-227（199
2)． ７． Yao, S.L. et al. Selective radiosensitiza
tion of p53-deficientcells by caffeine-mediated ac
tivation of p34cdc2 kinase. Nature Med2, 1140-1143
（1996)． ８． DeFrank, J.S., Tang, W. & Powell, S.N. p5
3-null cells are moresensitive to ultraviolet ligh
t only in the presence of caffeine. Cancer Res 56,
5365-5368（1996)． ９． Wang, S.W., Norbury, C., Harris, A.L., To
da, T. Caffeine can override the S-M checkpoint in
fission yeast. J. Cell Sci. 112, 927-937（1999)． 10． Wang, Q., Fan, S, Eastman, A., Worland,
R.J., Sausville, E.A. &OiConnor, R.M. UCN-01: a po
tent abrogator of G2 checkpoint functionin cancer
cells with disrupted ｐ53. J. Natl. Cancer. Inst 8
8, 956-965（1996)． 11． Walworth, N., Davey, S., Beach, D. Fissio
n yeast chkl protein kinase links the Rad checkpoi
nt pathway to cdc2. Nature 363, 368-371（1993)． 12． Walworth, N.C., Bernards, R. rad-dependen
t-response of the chkl-encoded protein kinase at t
he DNA damage checkpoint. Science 271,353-356（199
6)． 13． Matsuoka, S., Huang, M., Ellcdgc, S.J. Li
nkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2
protein kinase. Science 282, 1893-1897（1998)． 14． Zeng, Y. et al. Replication checkpoint re
quires phosphorylationof the phosphatase Cdc25 by
Cds1 or Chk1. Nature 395, 507-510（1998)． 15． Furnari, B.,Rhind, N., Russell, P. Cdc25C
mitotic inducer tergeted by chk1 DNA damage check
point kinase. Science 277, 1495-1497（1997)． 16． Sanchez, Y. et al. Conservation of the ch
k1 checkpoint pathwayin mammals: linkage of DNA da
mage to cdk regulation through cdc25. Science 277,
1497-1501（1997)． 17． Peng, C.Y. et al. Mitotic and G2 checkpoi
nt control: regulationof 14-3-3 protein binding by
phosphorylation of cdc25C on serine-216. Science
277, 1501-1505（1997)． 18． Lopez-Girona, A., Furnari, B., Mondesert,
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egulated by DNA damage and a 14-3-3 protein. Natur
e 397, 172-175（1999)． 19． Nurse, P. Checkpoint pathways come of ag
e. Cell 91, 865-867（1997)． 20． Weinert, T.A. DNA damage checkpoint meets
the cell cycle engine. Science 277, 1450-1451（19
97)． 21． Russell, P. Checkpoints on the road to mi
tosis. TIBS 23, 399-402（1998)． 22． Nagahara, H. et al. Transduction on full-
length TAT fusion proteins into mammalian cells: T
AT-p27Kip1 induces cell migration.NatureMed 4, 144
9-1452（1998)． 23． Vocero-Akbain, A.M., Heyden, N.V., Lissy,
N.A., Ratner, L., Dowdy, S.F. Killing HIV-infecte
d cells by transduction with an HIV protease-activ
ated caspase-3 protein. Nature Med 5, 29-33（199
9)．
【図１】ＴＡＴ−Ｓ216およびＴＡＴ−Ｓ216ＡのＣhk1
活性阻害のin vitro実験結果を示すブロッティング図で
ある。Ｃhk1の基質なるＧＳＴ−Ｃdc25Ｃ（１μM）にＴ
ＡＴ−Ｓ216およびＴＡＴ−Ｓ216Ａ（10μM）を加えてi
n vitroリン酸化反応を行った。
活性阻害のin vitro実験結果を示すブロッティング図で
ある。Ｃhk1の基質なるＧＳＴ−Ｃdc25Ｃ（１μM）にＴ
ＡＴ−Ｓ216およびＴＡＴ−Ｓ216Ａ（10μM）を加えてi
n vitroリン酸化反応を行った。
【図２】ＴＡＴ−Ｓ216ＡのＣhk1およびＣhk2/ＨcＣds1
活性阻害の実験結果を示すブロッティング図である。基
質となるＣdc25Ｃペプチド（10μM）の４倍量のＴＡＴ
−Ｓ216Ａ（40μM）にてＣhk1およびＣhk2/ＨcＣds1の
活性が阻害された。
活性阻害の実験結果を示すブロッティング図である。基
質となるＣdc25Ｃペプチド（10μM）の４倍量のＴＡＴ
−Ｓ216Ａ（40μM）にてＣhk1およびＣhk2/ＨcＣds1の
活性が阻害された。
【図３】ブレオマイシン（５μg/ml）で処理した後、Ｔ
ＡＴ−Ｓ216およびＴＡＴ−Ｓ216Ａを形質導入し、ヨウ
化プロピジウム（ＰＩ）で染色したＪurkatのフローサ
イトメトリー分析の結果である。縦軸は細胞数、横軸は
ＰＩ染色によるＤＮＡ含有量を示す。
ＡＴ−Ｓ216およびＴＡＴ−Ｓ216Ａを形質導入し、ヨウ
化プロピジウム（ＰＩ）で染色したＪurkatのフローサ
イトメトリー分析の結果である。縦軸は細胞数、横軸は
ＰＩ染色によるＤＮＡ含有量を示す。
【図４】Ｊurkat細胞におけるヒストンＨ1キナーゼ分析
の結果である。レーン１は無処理、レーン２は2.5μg/m
lコルヒチン処置６時間後、レーン３は20μg/mlブレオ
マイシン＋20μg/mlＴＡＴ−Controlペプチド処理の６
時間後、レーン４は20μg/mlブレオマイシン＋20μg/ml
ＴＡＴ−Ｓ216ペプチド処置の６時間後に測定した。
の結果である。レーン１は無処理、レーン２は2.5μg/m
lコルヒチン処置６時間後、レーン３は20μg/mlブレオ
マイシン＋20μg/mlＴＡＴ−Controlペプチド処理の６
時間後、レーン４は20μg/mlブレオマイシン＋20μg/ml
ＴＡＴ−Ｓ216ペプチド処置の６時間後に測定した。
【図５】2.5μg/mlコルヒチンで処理した後、ＴＡＴ−
Ｃdc25Ｃペプチドを形質導入し、ヨウ化プロピジウム
（ＰＩ）で染色したＪurkatのフローサイトメトリー分
析の結果である。縦軸は細胞数、横軸はＰＩ染色による
ＤＮＡ含有量を示す。
Ｃdc25Ｃペプチドを形質導入し、ヨウ化プロピジウム
（ＰＩ）で染色したＪurkatのフローサイトメトリー分
析の結果である。縦軸は細胞数、横軸はＰＩ染色による
ＤＮＡ含有量を示す。
【図６】トリパンブルー色素排除法によるブレオマイシ
ン処理Ｊurkatの細胞生存分析の結果を示すグラフであ
る。。縦軸は細胞の生存％、横軸は時間を示す。なお、
ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドは20μg/mlを処理した。
ン処理Ｊurkatの細胞生存分析の結果を示すグラフであ
る。。縦軸は細胞の生存％、横軸は時間を示す。なお、
ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドは20μg/mlを処理した。
【図７】トリパンブルー色素排除法によるコルヒチン処
理Ｊurkatの細胞生存分析の結果を示すグラフである。
縦軸は細胞の生存％、横軸は時間を示す。なお、コルヒ
チンは2.5μg/ml、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドは20μg/mlを
処理した。
理Ｊurkatの細胞生存分析の結果を示すグラフである。
縦軸は細胞の生存％、横軸は時間を示す。なお、コルヒ
チンは2.5μg/ml、ＴＡＴ−Ｓ216ペプチドは20μg/mlを
処理した。
【図８】トリパンブルー色素排除法によるブレオマイシ
ン処理ＰＨＡ活性化Ｔ細胞の細胞生存分析の結果を示す
グラフである。縦軸は細胞の生存％、横軸は時間を示
す。なお、ブレオマイシンは５μg/ml、ＴＡＴ−Ｓ216
ペプチドは20μg/mlを処理した。
ン処理ＰＨＡ活性化Ｔ細胞の細胞生存分析の結果を示す
グラフである。縦軸は細胞の生存％、横軸は時間を示
す。なお、ブレオマイシンは５μg/ml、ＴＡＴ−Ｓ216
ペプチドは20μg/mlを処理した。
【図９】ブレオマイシン（５μg/ml）で処理した後、Ｔ
ＡＴ−Ｃdc25Ｃペプチドを形質導入し、ヨウ化プロピジ
ウム（ＰＩ）で染色したＰＨＡ活性化Ｔ細胞のフローサ
イトメトリー分析の結果である。縦軸は細胞数、横軸は
ＰＩ染色によるＤＮＡ含有量を示す。
ＡＴ−Ｃdc25Ｃペプチドを形質導入し、ヨウ化プロピジ
ウム（ＰＩ）で染色したＰＨＡ活性化Ｔ細胞のフローサ
イトメトリー分析の結果である。縦軸は細胞数、横軸は
ＰＩ染色によるＤＮＡ含有量を示す。
【図10】ＭＩＡＰaＣa2細胞をブレオマイシン（90μg/m
l）＋ＴＡＴ−Ｓ216またはＴＡＴ−Ｃontrolペプチドで
処理した場合の細胞の生存を測定した結果を示すグラフ
である。なお、細胞生存は、ブレオマイシンとペプチド
を添加した後、所定の時間にＸＴＴアッセイ（Ｃell Ｐ
roliferationＫit II：Ｒoche）で測定した。
l）＋ＴＡＴ−Ｓ216またはＴＡＴ−Ｃontrolペプチドで
処理した場合の細胞の生存を測定した結果を示すグラフ
である。なお、細胞生存は、ブレオマイシンとペプチド
を添加した後、所定の時間にＸＴＴアッセイ（Ｃell Ｐ
roliferationＫit II：Ｒoche）で測定した。
【図11】ＰＡＮＣ1細胞の生存結果を図10と同様に示し
たグラフである。
たグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 船曳 孝彦 愛知県豊明市二村台７−35−５ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 HA01 4C084 AA02 AA07 AA13 BA22 CA59 NA14 ZB262 4C087 AA02 BB70 CA12 CA16 NA14 ZB26 4H045 AA10 BA16 BA17 CA40 EA28 FA34
Claims (6)
- 【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配列を有するオリ
ゴペプチド。 - 【請求項２】 配列番号２のアミノ酸配列を有するオリ
ゴペプチド。 - 【請求項３】 配列番号３のアミノ酸配列からなる請求
項１のオリゴペプチド。 - 【請求項４】 配列番号４のアミノ酸配列からなる請求
項２のオリゴペプチド。 - 【請求項５】 配列番号１のアミノ酸配列をコードする
オリゴヌクレオチドを保有する発現ベクター。 - 【請求項６】 配列番号２のアミノ酸配列をコードする
オリゴヌクレオチドを保有する発現ベクター。
Priority Applications (13)
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|---|---|---|---|
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| JP2001525330A JP4610828B2 (ja) | 1999-09-22 | 2000-09-21 | Ｇ２期細胞周期停止の阻害、およびｄｎａ損傷剤に対する細胞感作のための組成物および方法 |
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| EP00964563A EP1218494B1 (en) | 1999-09-22 | 2000-09-21 | Compositions and methods for inhibiting g2 cell cycle arrest and sensitizing cells to dna damaging agents |
| ES00964563T ES2239037T3 (es) | 1999-09-22 | 2000-09-21 | Metodos y composiciones para inhibir la deteccion del ciclo celular en g2 y sensibilizar celulas a agentes dañinos del dna. |
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| CA002385257A CA2385257A1 (en) | 1999-09-22 | 2000-09-21 | Compositions and methods for inhibiting g2 cell cycle arrest and sensitizing cells to dna damaging agents |
| US10/967,008 US7851592B2 (en) | 1999-09-22 | 2004-10-15 | Compositions and methods for inhibiting G2 cell cycle arrest and sensitizing cells to DNA damaging agents |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112368578A (zh) * | 2018-06-08 | 2021-02-12 | 诺瓦格雷公司 | 博莱霉素用于模拟电离辐射对t细胞的效应 |
-
1999
- 1999-09-22 JP JP26939899A patent/JP2001086991A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112368578A (zh) * | 2018-06-08 | 2021-02-12 | 诺瓦格雷公司 | 博莱霉素用于模拟电离辐射对t细胞的效应 |
| JP2021527229A (ja) * | 2018-06-08 | 2021-10-11 | ノバグレイＮｏｖａｇｒａｙ | Ｔ細胞に対する電離放射線の影響を模倣するためのブレオマイシン |
| JP7480130B2 (ja) | 2018-06-08 | 2024-05-09 | ノバグレイ | Ｔ細胞に対する電離放射線の影響を模倣するためのブレオマイシン |
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