ES2311703T3 - Peptidos y peptidomimeticos que tienen actividad anti-proliferativa y/o que aumentan agentes o tratamientos que dañan los acidos nucleicos. - Google Patents

Peptidos y peptidomimeticos que tienen actividad anti-proliferativa y/o que aumentan agentes o tratamientos que dañan los acidos nucleicos. Download PDF

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Abstract

Una secuencia contigua de péptido o peptidomimético que comprende la siguiente estructura: P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:2); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:4); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:7); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:8); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:10); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:12); donde P1 es Cha; donde P2 es (Phe-2,3,4,5,6-F), Bpa o Phe 4NO 2; donde P3 es cualquier aminoácido; donde P4 es Trp; donde P5 es cualquier aminoácido; donde P6 es Bpa o Phe 4NO 2; y donde al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11 y P12 son aminoácidos básicos siendo el resto cualquier aminoácido o estando ausente.

Description

Péptidos y peptidomiméticos que tienen actividad anti-proliferativa y/o que aumentan agentes o tratamientos que dañan los ácidos nucleicos.
Campo técnico
Esta invención se refiere a compuestos, incluyendo péptidos y peptidomiméticos, que tienen actividad contra la proliferación celular individualmente y en combinación con tratamientos que dañan de forma directa o indirecta los ácidos nucleicos (por ejemplo, el ADN). Por lo tanto, los compuestos de la invención son útiles para inhibir la proliferación celular y, como tales, para tratar trastornos de la proliferación celular incluyendo cánceres. En particular, los compuestos de la invención son útiles en el tratamiento de tumores sólidos o líquidos metastásicos y no metastásicos.
Antecedentes
El ciclo celular comprende la fase S (replicación del ADN), la fase M (mitosis) y dos fases de reposo (fases G1 y G2) entre las fases S y M. Los puntos de control en el ciclo celular aseguran una progresión sin errores, tal como la verificación del estado de integridad del ADN, la replicación del ADN, el tamaño de las células y el entorno circundante (Maller, J.L. Curr. Opin. Cell Biol., 3:26 (1991)). Es especialmente importante en el caso de los organismos multicelulares mantener la integridad del genoma y hay múltiples puntos de control que controlan el estado del genoma. Entre ellos se encuentran los puntos de control de G1 y G2 que están antes de la replicación del ADN y de la mitosis, respectivamente. Esto es crucial para corregir las lesiones del ADN antes de entrar en la fase S, porque una vez que se ha replicado el ADN dañado a menudo produce mutaciones (Hartwell, L. Cell, 71: 543 (1992)). La progresión a través de los puntos de control G1 y G2 sin reparar las lesiones de ADN de consideración induce apoptosis y/o catástrofe.
La mayoría de las células cancerosas llevan anomalías en proteínas relacionadas con el punto de control de G1 tales como p53, Rb, MDM-2, p16^{INK4} y p19^{ARF} (Levine, A.J. Cell, 88:323 (1997)). Como alternativa, ciertas mutaciones pueden producir sobreexpresión y/o una sobreactivación de productos oncogénicos, por ejemplo, Ras, MDM-2 y ciclina D, que reducen la rigurosidad del punto de control de G1. Además de estas mutaciones, puede producirse una señalización excesiva con factores de crecimiento por la sobreexpresión de factores de crecimiento y se puede reducir la rigurosidad del punto de control de G1. Junto con la pérdida y la obtención de mutaciones de función, la activación continua de receptores de factores de crecimiento o moléculas de transducción de señales corriente abajo puede ocasionar una transformación celular por medio de la anulación del punto de control de G1. La anulación del punto de control de G1 aumenta el porcentaje de mutaciones y el número de mutaciones observadas en las células cancerosas. Como resultado, la mayoría de las células cancerosas dependen del punto de control de G2 para la supervivencia contra las lesiones excesivas del ADN (O'Connor y Fan, Prog. Cell Cycle Res., 2:165 (1996)).
Se cree que el mecanismo que promueve la detención del ciclo celular en G2 después de que se hayan producido lesiones en el ADN está conservado entre especies desde las levaduras hasta los seres humanos. En presencia de un ADN dañado, la Cdc2/Ciclina B quinasa permanece inactiva debido a que se reduce la fosforilación inhibidora de los restos de treonina-14 y tirosina-15 en la Cdc2 quinasa o el nivel de proteína de la Ciclina B. Al inicio de la mitosis, la fosfatasa dual Cdc25 retira estos fosfatos inhibidores y, por lo tanto, activa la Cdc2/Ciclina B quinasa. La activación de Cdc2/Ciclina B es equivalente al inicio de la fase M.
En la división de levaduras, se requiere la proteína quinasa Chk1 para la detención del ciclo celular en respuesta a lesiones en el ADN. La quinasa Chk1 actúa corriente abajo de varios productos del gen rad y se modifica por fosforilación tras una lesión en el ADN. Se sabe que las quinasas Rad53 de levaduras en fase de gemación y la proteína Cds1 de levaduras en fase de división llevan señales procedentes del ADN no replicado. Parece ser que hay alguna redundancia entre Chk1 y Cds1 porque la eliminación de Chk1 y Cds1 culminaba en la interrupción de la detención en G2 inducida por el ADN dañado. De manera interesante, tanto Chk1 como Cds1 fosforilan Cdc25 y promueven la unión de Rad24 a Cdc25, que hace que Cdc25 permanezca en el citosol e impide la activación de la Cdc2/Ciclina B. Por lo tanto, Cdc25 parece ser una diana común para estas quinasas, lo que supone que esta molécula es un factor indispensable en el punto de control de G2.
Suganuma et al. (Suganuma et al., Cancer Research 59, 5887 - 5891, 1999) demostraron la importancia de Cdc25 por medio de la fusión de Cdc25C humana con una parte de TAT de VIH1 anulando de ésta manera el punto de control de G2. La solicitud de patente internacional WO 01/21771 describe de forma similar medios para interrumpir el ciclo celular en G2 por medio de la inhibición de las quinasas Chk1 y/o Chk2 demostrando de esta manera la importancia de las quinasas Cdc25 y Chk1 en el punto de control de G2.
En los seres humanos, tanto hChk1, un homólogo humano de la proteína Chk1 de la levadura en fase de división, como Chk2/HuCds1, un homólogo humano de la proteína Rad53 de levadura en fase de gemación y de la proteína Cds1 de levadura en fase de división, fosforilan Cdc25C en la serina-216, un sitio regulador crítico, en respuesta a lesiones en el ADN. Esta fosforilación crea un sitio de unión para proteínas ácidas pequeñas 14-3-3s, homólogos humanos de las proteínas Rad24 y Rad25 de levaduras en fase de división. El papel regulador de esta fosforilación se indicó claramente por el hecho de que la sustitución de la serina-216 por alanina en Cdc25C interrumpía la detención del ciclo celular en G2 en células humanas. Sin embargo, no se entiende completamente el mecanismo del punto de control de G2.
Sumario
De acuerdo con la invención, se proporcionan péptidos y peptidomiméticos como se especifica en las reivindicaciones que tienen una o más actividades para inhibir la proliferación celular, estimular la apoptosis o catástrofe, o tratar una proliferación o supervivencia celular indeseable, tal como la que caracteriza a un trastorno de la proliferación celular. En una realización, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:1) o P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:2). P1 es Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3); un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar (por ejemplo, Tyr o Phe), o cualquier aminoácido con uno o dos grupos aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P2 es Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe_{4}NO_{2}, un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar (por ejemplo, Tyr o Phe), o cualquier aminoácido con uno o dos grupos aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P3, P4 y P5 son cualquier aminoácido (por ejemplo, P4 es Trp), o donde uno o más de P3, P4 y P5 es una cadena carbonada sencilla (por ejemplo, ácido 11 -aminoundecanoico, ácido 10-aminodecanoico, ácido 9-aminononanoico, ácido 8-aminocaprílico, ácido 7-aminoheptanoico, ácido 6-aminocaproico, o una estructura similar con uno o más enlaces de carbono insaturados) de tal forma que la distancia entre P2 y P6 sea aproximadamente igual a la distancia que existe cuando cada uno de P3, P4 y P5 es un aminoácido; y P6 es Bpa, Phe_{4}NO_{2}, cualquier otro aminoácido y Tyr (por ejemplo, Ser-Tyr), cualquier aminoácido y Phe (por ejemplo, Ser-Phe), cualquier aminoácido, o está ausente.
En otra realización, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:3); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:4); PI, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:5); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:6); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:7); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:8); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:9); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:10); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:11); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:12); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:13); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:14); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEQ ID NO:15); o P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11; P12 (SEQ ID NO:16). P1 es Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe_{4}NO_{2}, un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar (por ejemplo, d- o l-Tyr, d- o l-Phe), o cualquier aminoácido con uno o dos grupo aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P2 es Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), o un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar (por ejemplo, Tyr o Phe), o cualquier aminoácido con uno o dos grupos aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P3, P4, P5 es cualquier aminoácido (por ejemplo, P4 es Trp), o uno o más de P3, P4, P5 es una cadena carbonada sencilla (por ejemplo, ácido 11-aminoundecanoico, ácido 10-aminodecanoico, ácido 9-aminononanoico, ácido 8-aminocaprílico, ácido 7-aminoheptanoico, ácido 6-aminocaproico, o una estructura similar con uno o más enlaces carbonados insaturados) de tal forma que la distancia entre P2 y P6 sea aproximadamente igual que la distancia que existe cuando cada uno de P3, P4, P5 es un aminoácido; P6 es Bpa, Phe_{4}NO_{2}, cualquier aminoácido y Tyr (por ejemplo, Ser-Tyr), cualquier aminoácido y Phe (por ejemplo, Ser-Phe); y al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11 y P12 son aminoácidos básicos siendo el resto cualquier aminoácido o estando
ausente.
En otra realización, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:17); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1(SEQ ID NO:18); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:19); o P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:20). P1 es Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe_{4}NO_{2}, un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar, o cualquier aminoácido con uno o dos grupo aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P2 es Cha; Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3) o un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar (por ejemplo, Tyr o Phe), o cualquier aminoácido con uno o dos grupos aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P3, P4 y P5 es cualquier aminoácido (por ejemplo, P4 es Trp), o uno o más de P3, P4 y P5 es una cadena carbonada sencilla (por ejemplo, ácido 8-aminocaprílico) de tal forma que la distancia entre P2 y P6 sea aproximadamente igual que la distancia que existe cuando cada uno de P3, P4 y P5 es un aminoácido; P6 es Bpa, Phe_{4}NO_{2}, cualquier aminoácido y Tyr (por ejemplo, Ser-Tyr), cualquier aminoácido y Phe (por ejemplo, Ser-Phe); cualquier aminoácido o está ausente; y al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11 y P12 son aminoácidos básicos siendo el resto cualquier aminoácido o estando
ausente.
En una realización adicional, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:21) o P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:22). P1 es Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe_{4}NO_{2}, Tyr o Phe; P2 es Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe_{4}NO_{2}, Tyr o Phe; P3 Es Ser, Arg, Cys, Pro o Asn; P4 es Trp; P5 es Ser, Arg o Asn; o P3, P4 y P5 es un solo ácido aminoundecanoico o un solo ácido 8-aminocaprílico; y P6 es Bpa, Phe_{4}NO_{2}, (Ser-Tyr) o (Ser-Phe).
En otra realización, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:23); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:24); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:25); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEC ID: Nº: 26); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:27); P7,P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:28); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:29); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:30); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:31); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:32); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEQ ID NO:33); o P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:34). P1 es Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe_{4}NO_{2}, Tyr o Phe; P2 es Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe_{4}NO_{2}, Tyr o Phe; P3 es Ser, Arg, Cys, Pro o Asn; P4 es Trp; P5 es Ser, Arg o Asn; o P3, P4 y P5 es un solo ácido aminoundecanoico o un solo ácido 8-aminocaprílico; P6 es Bpa, Phe_{4}NO_{2}, (d-Ser-d-Tyr), o (d-Ser-d-Phe); y al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11 y P12 son Arg o Lys siendo el resto cualquier aminoácido o estando ausente.
En otra realización, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:35); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:36); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:37); o P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:38). P1 es Cha o Nal(2); P2 es (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3); P3 es Ser, P4 es Trp; P5 es Ser o Asn; P6 es Bpa, Phe_{4}NO_{2}, (Ser-Tyr) o (Ser-Phe); y al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11 y P12 son Arg siendo el resto cualquier aminoácido o estando ausente.
En otra realización adicional, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:39) o P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:40). P1 es Cha o Nal(2); P2 es (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) o (Phe-4CF3); P3 es Ser, P4 es Trp; P5 es Ser y P6 es Bpa, o (Ser-Tyr).
En otra realización, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:41); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:42); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:43); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:44); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:45); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:46); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:47); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:48); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:49); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:50); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:51); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:52); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEQ ID NO:53); o P1, P2, P7, P4, P9, P6_{,} P10, P11, P12 (SEQ ID NO:54). P1 es Cha o Nal(2); P2 es (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) o (Phe-4CF3); P3 es cualquier aminoácido (por ejemplo, Ser o Pro); P4 es d- o l-Trp; P5 es cualquier aminoácido (por ejemplo Ser o Pro); P6 es Bpa o (Ser-Tyr); P7 es Arg; P8 es Arg; P9 es Arg; P10 es Gln o Arg; P11 es Arg; y P12 es d- o l-Arg.
En otra realización, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:55); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:56); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:57); o P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:58). P1 es Cha o Nal(2); P2 es (Phe-2,3,4,5,6-F); P3 es Ser; P4 es Trp; P5 es Ser; P6 es Bpa o (Ser-Tyr); P7 es Arg; P8 es Arg; P9 es Arg; P10 es Gln o Arg; P11 es Arg; y P12 es
Arg.
En aspectos particulares, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético incluye la siguiente estructura: (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:99); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:100); (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)
(SEQ ID NO:59); (d-Arg)(d-Arg)(d-GIn)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:60); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:67); (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)
(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:68); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)
(SEQ ID NO:71); (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:72); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:73).
En aspectos adicionales, las secuencias de péptidos y peptidomiméticos incluyen uno o más restos de tipo-l o de tipo-d; un resto d sustituido con un resto l; o un resto l sustituido con un resto d.
Las secuencias de péptidos y peptidomiméticos incluyen una o más de las siguientes actividades: inhiben la proliferación de una célula; anulan el punto de control de G2 del ciclo celular de una célula; estimulan la apoptosis de una célula y estimulan la catástrofe de una célula.
Las secuencias de péptidos y peptidomiméticos incluyen una secuencia que tiene una longitud de aproximadamente 6 a aproximadamente 12, de 10 a aproximadamente 20, de 18 a aproximadamente 25, de 25 a aproximadamente 100, de 25 a aproximadamente 200 o de 50 a aproximadamente 300 restos de longitud.
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También se proporcionan composiciones que incluyen secuencias de péptidos y peptidomiméticos de la invención. En una realización, una composición incluye una secuencia de péptido o peptidomimético y un agente que daña a los ácidos nucleicos. En otra realización, una composición incluye una secuencia de péptido o peptidomimético y un agente antiproliferativo. En una realización adicional, una composición incluye un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y una secuencia de péptido o peptidomimético y opcionalmente un agente que daña a los ácidos nucleicos o un agente antiproliferativo.
Además, se proporcionan kits que incluyen secuencias de péptidos y peptidomiméticos de la invención opcionalmente en combinación con un tratamiento que daña a los ácidos nucleicos (por ejemplo, un agente que daña a los ácidos nucleicos), o un agente antiproliferativo. En una realización, un kit incluye una secuencia de péptido o peptidomimético e instrucciones para uso en la puesta en práctica del método de la invención. En un aspecto particular, las instrucciones son para inhibir la proliferación celular.
La invención también proporciona métodos in vitro para usar las secuencias de péptidos y peptidomiméticos de la invención, donde las células no son células embrionarias humanas. En una realización, el método in vitro incluye poner en contacto una célula con una cantidad de un péptido o peptidomimético suficiente para inhibir la proliferación de la célula. En otra realización, el método in vitro incluye poner en contacto una célula con un agente que daña a los ácidos nucleicos o exponer una célula a un tratamiento que daña a los ácidos nucleicos.
La invención proporciona métodos in vitro para aumentar la sensibilidad de una célula a un agente o tratamiento que daña a los ácidos nucleicos. En una realización, el método in vitro incluye poner en contacto la célula con una cantidad de un péptido o peptidomimético suficiente para aumentar la sensibilidad de la célula a un agente o tratamiento que daña a los ácidos nucleicos.
La invención también proporciona métodos in vitro para aumentar las lesiones en el ácido nucleico de una célula. En una realización, el método in vitro incluye poner en contacto una célula con una cantidad de un péptido o peptidomimético suficiente para aumentar las lesiones en el ácido nucleico de la célula.
En diversos aspectos de los métodos in vitro de la invención, la célula es una célula cultivada. En otros aspectos, el método in vitro incluye además poner en contacto la célula con un agente que daña a los ácidos nucleicos o exponer la célula a un tratamiento que daña a los ácidos nucleicos.
La invención proporciona además el uso de una cantidad de un péptido o peptidomimético de la invención para tratar un trastorno de la proliferación celular. En una realización, el uso incluye una cantidad de péptido o peptidomimético eficaz para tratar el trastorno de la proliferación celular. En aspectos particulares, el trastorno de la proliferación celular comprende un tumor sólido o líquido benigno o maligno (por ejemplo, sarcoma o carcinoma metastásico o no metastásico, o cáncer hematopoyético tal como mieloma, linfoma o leucemia). En otros aspectos particulares, al menos una parte de las células que constituyen el trastorno de la proliferación celular se localizan en la sangre, mama, pulmón, tiroides, cabeza o cuello, cerebro, linfa, tracto gastrointestinal, nasofaringe, tracto genitourinario, vejiga, riñón, páncreas, hígado, hueso, músculo o piel.
Los usos de la invención incluyen la administración por cualquier vía. En realizaciones particulares, un péptido o peptidomimético se administra de forma local, regional o sistémica.
Los usos de la invención incluyen tratamientos que tienen como resultado una mejora del estado del sujeto. En realizaciones particulares, la mejora incluye uno o más de los siguientes: reducción de la proliferación celular, reducción del número de células, inhibición del aumento de la proliferación celular, inhibición del aumento en el número de células, aumento de la apoptosis o reducción de la supervivencia, de al menos una parte de las células que constituyen el trastorno de la proliferación celular.
Los usos de la invención incluyen además un agente que daña a los ácidos nucleicos, un tratamiento que daña a los ácidos nucleicos, un agente antiproliferativo o un tratamiento antiproliferativo para el sujeto. En aspectos particulares, el agente o tratamiento comprende un fármaco (por ejemplo, un fármaco quimioterapéutico tal como 5-fluorouracilo (5-FU), rebecamicina, adriamicina (ADR), bleomicina (Bleo), pepleomicina, un derivado de cisplatino tal como cisplatino (CDDP) u oxaliplatino, o camptotecina (CPT), radiación (por ejemplo, radiación UV, radiación IR o radiación alfa, beta o gamma), un radioisótopo (por ejemplo, I^{131}, I^{125}, ^{90}Y, ^{177}Lu, ^{2I3}Bi o ^{211}At), o un choque ambiental (por ejemplo, hipertermia).
Descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una curva de dosis-respuesta de cada compuesto cuando se usa contra células Jurkat tratadas con bleomicina. El eje X indica la dosis y el eje Y indica el % de células en fase G2/M después del tratamiento.
La Figura 2 muestra una curva de dosis-respuesta de cada compuesto cuando se usa contra células Jurkat tratadas con colchicina. El eje X indica la dosis y el eje Y indica el % de células en fase G2/M después del tratamiento.
Figuras 3A y 3B. Línea celular derivada de cáncer pancreático humano MIAPaCa2 tratada con (A) bleomicina (Bleo) o (B) adriamicina (ADR) con diversas dosis de compuestos. Se tiñó el ADN de las células recogidas y se analizaron con citometría de flujo. El % de población de células sub-G1 se indica como células muertas.
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Las Figuras 4A a 4C son un diagrama esquemático de la relación entre estructura y actividad del anulador del punto de control de G2 (l-Gly)(l-Arg)(l-Lys)(I-Lys)(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(l-Tyr) (SEQ ID NO:78): (A) la actividad de anulación del punto de control de G2 de sustituciones de aminoácidos para l-Cha en células Jurkat tratadas con bleomicina se indica en orden, [l-Cha=l-Nal(2)] > [l-Ala(3-Bzt)=l-Nal(l)=l-Trp=l-Dph] > [l-Ala(tBu)=Cys(tBu)=Leu]; (B) actividad de anulación del punto de control de la fase M y/o la toxicidad no específica de sustituciones de aminoácidos para l-Cha en células Jurkat tratadas con colchicina, en orden, [Ala(3-Bzt)=l-Nal(l)=l-Dph] > [l-Cha=l-Nal(2)]; (C) la actividad de anulación del punto de control de G2 de sustituciones de aminoácidos para l-Phe-2,3,4,5,6-F se indica en orden, l-(Phe-2,3,4,5,6-F)=l-(Phe-3,4,5-F)=l-(Phe-4CF3)] > [l-(Phe-3Br,4Cl,5Br)=l-(Phe-4Cl)=l-Tyr].
La Figura 5 muestra la actividad de anulación de G2 de diversas secuencias ricas en arginina. Los péptidos indicados se añadieron a células Jurkat con o sin bleomicina. El % de células en fase G2/M se indica en el eje Y. El eje X como se presenta a continuación: 1, Bleomicina sola; 2, 0,2 \mug/ml; 3, 0,39 \mug/ml; 4, 0,78 \mug/ml; 5, 1,56 \mug/ml; 6, 3,125 \mug/ml; 7, 6,25 \mug/ml; 8, 12,5 \mug/ml; 9, 25 \mug/ml y 10, 50 \mug/ml. Las secuencias peptídicas son las siguientes: rrrqrrkkr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Lys)(d-Lys)(d-Arg) (SEQ ID NO:79); CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:80); no TAT, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:81); rqrr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:82); rrqrr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)
(d-Arg) (SEQ ID NO:83); rrrq, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)
(SEQ ID NO:84); y rrrqr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg) (SEQ ID NO:85).
La Figura 6 muestra la actividad de anulación de G2 de diversos péptidos sin (d-Bpa). Los péptidos indicados se añadieron a células Jurkat con o sin bleomicina. En el eje Y se indica el % de células en fase G2/M. El eje X es como se indica a continuación; 1, Bleomicina sola; 2, 0,2 \mug/ml; 3, 0,39 \mug/ml; 4, 0,78 \mug/ml; 5, 1,56 \mug/ml; 6, 3,125 \mug/ml; 7, 6,25 \mug/ml; 8, 12, 5 \mug/ml; 9, 25 \mug/ml; y 10, 50 \mug/ml. Las secuencias peptídicas son las siguientes: CBP0, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:86); CBP451, (d-Tyr)(d-Ser)(d-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:87); CBP452, (d-Tyr)(d-Ser)(l-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:88); y CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:80).
La Figura 7 muestra la actividad de anulación de G2 de diversas secuencias peptídicas ricas en arginina y ricas en lisina. Se añadieron los péptidos indicados a células Jurkat como se ha indicado anteriormente y se calculó el % de células en fase G2/M (eje Y). Las secuencias peptídicas son las siguientes: CBP603, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe_{4}NO_{2})(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:89); CBP607, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:90); CBP608, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:91); y CBP609, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys) (SEQ ID NO:92).
La Figura 8 demuestra que la localización de la parte rica en arginina de la secuencia puede variar. Se añadieron los péptidos indicados a células Jurkat como se ha indicado anteriormente y se calculó el % de células G2/M (eje Y). Las secuencias peptídicas son las siguientes: CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:80); CBP510, (d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(SEQ ID NO:93); CBP511, (d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:94) y CBP512, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa) (SEQ ID NO:95).
La Figura 9 muestra la estructura de varias secuencias peptídicas sustituidas estudiadas. La actividad de anulación de G2 aumentó con las sustituciones sombreadas claras (*), la actividad de anulación del punto de control de la fase M y/o la toxicidad no específica aumentaron con las sustituciones sombreadas más oscuras (**) y se mantuvieron aproximadamente sin cambios para el resto de las sustituciones.
La Figura 10 muestra la inhibición del crecimiento tumoral (carcinoma pancreático humano) en ratones SCID después del tratamiento con CBP501 y cisplatino. El día 0 indica el inicio del tratamiento. En el eje Y se indican los tamaños medios de los tumores con la desviación típica para cada grupo de tratamiento y en el eje X se indica el número de días después del inicio del tratamiento.
La Figura 11 muestra la actividad de anulación de G2 de péptidos que tienen una región de secuencia de inhibición de quinasa y una región de secuencia basada en una secuencia de transducción de TAT de VIH, como se ha indicado anteriormente. En el eje Y se indica el % de células en fase G2/M. El eje X es como se indica a continuación: 1, bleomicina sola; 2, 0,2 \mug/ml; 3, 0,39 \mug/ml; 4, 0,78 \mug/ml; 5, 1,56 \mug/ml; 6, 3,125 \mug/ml; 7, 6,25 \mug/ml; 8, 12,5 \mug/ml;9, 25 \mug/ml; y 10, 50 \mug/ml. Las secuencias peptídicas son las siguientes: CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:80); CBP700, (d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:96); CBP701, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:97); CBP702, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:98); CBP703, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:99).
La Figura 12 muestra una comparación entre la actividad de anulación de G2 y la actividad de anulación de M y/o la toxicidad no específica de péptidos G2 con bleomicina para el análisis de anulación de G2 y colchicina para la actividad de anulación de M y/o la toxicidad no específica. Los péptidos indicados se añadieron a células Jurkat con bleomicina o colchicina. En el eje Y se indica el % de células en fase G2/M. El eje X es como se indica a continuación: 1, bleomicina o colchicina solas, 2, 0,2 \mug/ml; 3, 0,39 \mug/ml; 4, 0,78 \mug/ml; 5, 1,56 \mug/ml; 6, 3,125 \mug/ml; 7, 6,25 \mug/ml; 8, 12,5 \mug/ml; 9, 25 \mug/ml y 10, 50 \mug/ml. Las secuencias peptídicas son como se indica a continuación: CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:
80).
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Descripción detallada
La invención proporciona compuestos, incluyendo péptidos y peptidomiméticos, que inhiben la proliferación celular. Por lo tanto, los compuestos de la invención son útiles para tratar trastornos de la proliferación celular o afecciones fisiológicas caracterizadas por una proliferación celular indeseable o inoportuna, tales como células tumorales benignas y malignas. La capacidad de los péptidos y peptidomiméticos de la invención para inhibir la proliferación celular parece deberse al menos en parte a la anulación del punto de control de G2 del ciclo celular. Como puede inducirse la entrada de las células en el punto de control de G2 del ciclo celular en respuesta a una lesión en el ácido nucleico para permitir que la célula repare la lesión antes de que tenga lugar la replicación del ADN y la división celular, por medio de la inhibición del punto de control de G2, los péptidos y peptidomiméticos de la invención sensibilizan a las células frente a los protocolos de tratamiento y agentes que dañan a los ácidos nucleicos. Las células que acumulen suficientes lesiones en el ácido nucleico no podrán completar la reparación del ácido nucleico dañado porque se altera el punto de control de G2. Estas células presentarán una menor proliferación (por ejemplo, debido a la mutación de un gen crítico para la supervivencia que no se ha reparado) y finalmente experimentarán
apoptosis.
Las células que tienen una fase G1 normal son menos susceptibles a acumular ácidos nucleicos dañados ya que también puede tener lugar una reparación del ácido nucleico durante la fase G1. De esta manera, las células normales son menos susceptibles a los efectos de los compuestos de la invención. Sin embargo, las células que tienen un punto de control de G1 del ciclo celular alterado o dañado tienen más probabilidad de acumular ácidos nucleicos dañados, porque el punto de control de G1 alterado o dañado hace que sea menos probable que las células puedan reparar completamente el ácido nucleico dañado. De esta manera, el tratamiento de células alteradas o dañadas en G1 con un péptido o peptidomimético de la invención que altera el punto de control de G2 hace que las células tengan incluso menos probabilidad de reparar completamente el ácido nucleido dañado. Por lo tanto, las células alteradas o dañadas en G1 son particularmente sensibles a éstos péptidos y peptidomiméticos de la invención. De esta manera, los compuestos de la invención, incluyendo péptidos y peptidomiméticos, pueden usarse en general para inhibir o prevenir la proliferación celular y en particular para inhibir la proliferación de células que tienen un punto de control de G1 alterado o dañado.
Las células que tienen un punto de control del ciclo celular de G1 alterado o dañado incluyen, pero sin limitación, células que proliferan rápidamente. Los trastornos de la proliferación celular y las afecciones fisiológicas caracterizadas por células que crecen rápidamente, células que crecen de forma indeseable o células que sobreviven en lugar de experimentar apoptosis frecuentemente tienen un punto de control de G1 del ciclo celular alterado o dañado. De esta manera, como parece ser que la capacidad de los péptidos y peptidomiméticos de la invención para inhibir la proliferación o estimular apoptosis se debe, al menos en parte, a la alteración del punto de control de G2 del ciclo celular, las células que proliferan de forma rápida o indeseable debido a una alteración o lesión del punto de control de G1 son dianas particularmente atractivas.
Los compuestos de la invención, incluyendo los péptidos y peptidomiméticos, también pueden reprimir la proliferación celular por sí mismos sin tratamientos adicionales que dañen a los ácidos nucleicos o que tengan actividad antiproliferativa, ya que la alteración del punto de control de G2 probablemente conducirá a la acumulación de lesiones en el ácido nucleico según se dividen las células. Por consiguiente, pueden tratarse células con una proliferación o supervivencia anómala o indeseable con un compuesto de la invención solo o en combinación con un tratamiento que daña a los ácidos nucleicos (por ejemplo, un agente químico o un protocolo de tratamiento), para inhibir o prevenir la proliferación de las células o para estimular la apoptosis/catástrofe de las células.
A diferencia de lo que ocurre con los agentes contra la proliferación celular convencionales, que se dirigen rápidamente a las células en proliferación independientemente de que las células sean normales o anormales (por ejemplo, células cancerosas), los compuestos de la invención preferiblemente se dirigen a células que tienen el punto de control de G1 del ciclo celular alterado o dañado. Por ejemplo, CBP501, a diferencia del cisplatino, no afecta el crecimiento de las células HUVEC (véase, por ejemplo, la Tabla 3). CBP501 tampoco afecta a la detención del ciclo celular en fase M y/o a la toxicidad no especifica inducida por la colchicina (véase, por ejemplo, la Figura 12). Por consiguiente, es poco probable que los compuestos de la invención produzcan los efectos secundarios indeseables excesivos asociados con los agentes de tratamiento convencionales contra la proliferación celular tales como supresión de médula ósea, náuseas, pérdida de apetito, diarrea y pérdida de pelo. Además, como la inmensa mayoría de las células cancerosas tienen un punto de control de G1 del ciclo celular alterado o dañado, las células cancerosas presentarán una mayor sensibilidad a los compuestos de la invención que anulan el punto de control de G2 del ciclo celular. El hecho de que estas células normales sean menos susceptibles también significa que los compuestos de la invención, incluyendo péptidos y peptidomiméticos, pueden usarse en mayores
cantidades.
De acuerdo con la invención, se proporcionan compuestos que incluyen péptidos y peptidomiméticos como se especifica en las reivindicaciones, que tienen actividad contra la proliferación celular y/o que anulan el punto de control de G2 del ciclo celular. Los péptidos o peptidomiméticos incluyen secuencias que inhiben la proliferación de una célula o que estimulan la apoptosis de una célula. Los péptidos o peptidomiméticos también incluyen secuencias que anulan el punto de control de G2 del ciclo celular, En una realización, una secuencia de péptido o peptidomimético contigua también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:1) o P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:2); donde P1 es d- o I-Cha, d- o l-Nal(2), d- o l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- o l-(Phe-3,4,5F), d- o l-(Phe-4CF3), un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar (por ejemplo, d- o l-Tyr, d- o l-Phe), o cualquier aminoácido con uno o dos grupos aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P2 es d- o l-Cha, d- o l-Nal(2), d- o l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- o l-(Phe-3,4,5F), d- o l-(Phe-4CF3), d- o l-Bpa, d-o l-Phe_{4}NO_{2}, un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar (por ejemplo, d- o l-Tyr, d- o l-Phe), o cualquier aminoácido con uno o dos grupos aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P3, P4, P5 son cualquier aminoácido o uno o más de P3, P4, P5 es una cadena carbonada sencilla tal que la distancia entre P2 y P6 sea aproximadamente igual a la distancia que existe cuando cada uno de P3, P4, P5 es un aminoácido (d- o l-Trp es un ejemplo de P4); P6 es d- o l-Bpa, d- o l-Phe_{4}NO_{2}, cualquier aminoácido y d- o l-Tyr (por ejemplo, d-Ser-d-Tyr), cualquier aminoácido y d- o l-Phe (por ejemplo, d-Ser-d-Phe), cualquier aminoácido, o está ausente. En diversos aspectos, el aminoácido que tiene una cadena carbonada sencilla es el ácido d- o l-11-aminoundecanoico, el ácido d o l-10-aminodecanoico, el ácido d- o l-9-aminononanoico, el ácido d o I-8-aminocaprílico, ácido d- o l-7-aminoheptanoico, el ácido d- o l-6-aminocaproico o una estructura similar con uno o más enlaces carbonados
insaturados.
En otra realización, la secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:3); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:4); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:5); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:6); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:7); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:8); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:9); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:10); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:11); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:12); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:13); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:14); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEQ ID NO:15); o P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:16); donde P1 es d o l-Cha, d o l-Nal(2), d o l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d o l-(Phe-3,4,5F), d o l-(Phe-4CF3), d-o l-Bpa, d o l-Phe_{4}NO_{2}, un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar (por ejemplo, d o l-Tyr o l-Phe), o cualquier aminoácido con uno o dos grupos aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P2 es d o l-Cha, d o l-Nal(2), d o l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d o l-(Phe-3,4,5F), d o l-(Phe-4CF3), o un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar (por ejemplo, d o l-Tyr, d o l-Phe), o cualquier aminoácido con uno o dos grupos aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P3, P4 y P5 son cualquier aminoácido o uno o más de P3, P4 y P5 es una cadena carbonada sencilla tal que la distancia entre P2 y P6 sea aproximadamente igual que la distancia que existe cuando cada uno de P3, P4, P5 es un aminoácido (d o l-Trp es un ejemplo de P4); P6 es d o l-Bpa, d o l-Phe_{4}NO_{2}, cualquier aminoácido y d o l-Tyr (por ejemplo, d-Ser-d-Tyr), cualquier aminoácido y d o l-Phe (por ejemplo, d-Ser-d-Phe), y al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11 y P12 son aminoácidos básicos siendo el resto cualquier aminoácido o estando ausente. En diversos aspectos, el aminoácido que tiene una cadena carbonada sencilla es el ácido d o l-11-aminoundecanoico, ácido d o l-10-aminodecanoico, ácido d- o l-9-aminononanoico, ácido d o I-8-aminocaprílico, ácido d o l-7-aminoheptanoico, ácido d o l-6-aminocaproico o una estructura similar con uno o más enlaces carbonados
insaturados.
En una realización adicional, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:17); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:18); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:19); o P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:20); donde P1 es d o l-Cha, d o l-Nal(2), d o I-(Phe-2,3,4,5,6-F), d o l-(Phe-3,4,5F), d o l-(Phe-4CF3), d o l-Bpa, d o l-Phe_{4}NO_{2}, un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar (por ejemplo d o l-Tyr, d o l-Phe), o cualquier aminoácido con uno o dos grupos aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P2 es d o l-Cha, d-o l-Nal(2), d o l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d o l- (Phe-3,4,5F), d o l- (Phe-4CF3), un aminoácido que ocupa un espacio de cadena lateral similar (por ejemplo, d o l-Tyr, d o l-Phe), o cualquier aminoácido con uno o dos grupos aromáticos, piperidina, pirazina, pirimidina, piperazina, morfolina o pirimidina, o un grupo indol, pentaleno, indeno, naftaleno, benzofurano, benzotiofeno, quinolina, indolina, cromano, quinoxalina o quinazolina en la cadena lateral; P3, P4 y P5 son cualquier aminoácido o uno o más de P3, P4 y P5 es una cadena carbonada sencilla de manera que la distancia entre P2 y P6 sea aproximadamente igual que la distancia que existe cuando cada uno de P3, P4 y P5 es un aminoácido (d o l-Trp es un ejemplo de P4); P6 es d o l-Bpa, d o l-Phe_{4}NO_{2}, cualquier aminoácido y d o l-Tyr (por ejemplo, d-Ser-d-Tyr), cualquier aminoácido y d o l-Phe (por ejemplo, d-Ser-d-Phe), cualquier aminoácido, o está ausente; y al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11 y P12 son aminoácidos básicos siendo el resto cualquier aminoácido o estando ausente. En diversos aspectos, el aminoácido que tiene una cadena carbonada sencilla es el ácido d o l-aminoundecanoico o el ácido d- o l-8-aminocaprílico.
En otra realización adicional, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:21) o P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:22); donde P1 es d- o l-Cha, d- o l-Nal(2), d- o l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- o l- (Phe-3,4,5F), d- o l-(Phe-4CF3), d- o l-Bpa, d- o l-Phe_{4}NO_{2}, d-o l-Tyr, o d- o l-Phe; P2 es d- o l-Cha, d o l-Nal(2), d o l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d o l-(Phe-3,4,5F), d o l-(Phe-4CF3), d o l-Bpa, d o l-Phe_{4}NO_{2}, d o l-Tyr, o d- o l-Phe; P3 es d- o l-serina, d- o l-arginina, d- o l-cisteína, d- o l-prolina, o d- o l-asparagina; P4 es d- o l-triptófano; y P5 es d- o l-serina, d- o l-arginina, o d- o l-asparagina; o P3, P4 y P5 es un ácido d- o l-aminoundecanoico sencillo o un ácido d- o l-8-aminocaprílico sencillo; P6 es d- o l-Bpa, d- o l-Phe_{4}NO_{2}, (d-Ser-d-Tyr) o (d-Ser-d-Phe).
En otra realización adicional, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:23); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:24); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:25); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:26); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:27); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:28); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:29); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:30); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:31); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:32); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEQ ID NO:33); o P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:34); donde P1 es d o I-Cha, Nal(2), d o l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d o l- (Phe-3,4,5F), d o l-(Phe-4CF3), d- o l-Bpa, d- o l-Phe_{4}NO_{2}, d- o l-Tyr, o d- o l-Phe; P2 es d- o l-Cha, d- o l-Nal(2), d- o l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- o l-(Phe-3,4,5F), d- o l-(Phe-4CF3), d- o l-Bpa, d- o l-Phe_{4}NO_{2}, d- o l-Tyr, o d- o l-Phe; P3 es d- o l-serina, d- o I-arginina, d- o l-cisteína, d- o l-prolina, o d- o l-asparagina; P4 es d- o l-triptófano; P5 es d- o l-serina, d- o l-arginina, o d- o l-asparagina; o P3, P4 y P5 es un ácido d- o l-aminoundecanoico sencillo o un ácido d- o l-8-aminocaprílico sencillo; P6 es d- o l-Bpa, d- o l-Phe_{4}NO_{2}, (d-Ser-d-Tyr), o (d-Ser-d-Phe); y al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11 y P12 son d- o l-Arg o d- o l-Lys siendo el resto cualquier aminoácido o estando ausente.
En otra realización adicional, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:35); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:36); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:37); o P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:38); donde P1 es d o l-Cha, o d- o l-Nal(2); P2 es d- o l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- o l-(Phe-3,4,5F), d- o l-(Phe-4CF3); y al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11 y P12 son d- o l-Arg siendo el resto cualquier aminoácido o estando ausente; P3 es d- o l-serina; P4 es d o l -triptófano; P5 es d- o l-serina o d- o l-asparagina; P6 es d- o l-Bpa, d- o l-Phe_{4}NO_{2}, (d- o l-Ser, d- o l-Tyr), o (d- o l-Ser, d- o l-Phe).
En otra realización adicional, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético también descrita en la memoria descriptiva incluye la siguiente estructura: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:39) o P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:40); donde P1 es d- o l-Cha, o d- o l-Nal(2); P2 es (d- o l-Phe-2,3,4,5,6-F), (d- o l-Phe-3,4,5F) o (d- o l-Phe-4CF3); P3 es d- o l-Ser; P4 es d- o l-Trp; P5 es d- o l-Ser; P6 es d- o l-Bpa, o (d- o l-Ser-, d- o l-Tyr).
En otra realización adicional, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético incluye la siguiente estructura: P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:42); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:45); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:46); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:48); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:50); donde P4 es Trp; P7 es Arg; P8 es Arg; P9 es Arg; P10 es Gln o Arg; P11 es Arg; P12 es d- o l-Arg; y P6 es Bpa.
En otra realización adicional, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético incluye la siguiente estructura: P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:56); donde P3 es Ser; P4 es Trp; P5 es Ser; P7 es Arg; P8 es Arg; P9 es Arg; P10 es Gln o Arg; P11 es Arg; P12 es Arg; y P6 es Bpa.
En otra realización adicional, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético incluye la siguiente estructura: (d-Bpa)(d-Ser)( d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4.5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:80); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:100); (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)
(SEQ ID NO:59); (d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:60); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:67); (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:68); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:71); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:73).
En realizaciones preferidas, una secuencia contigua de péptido o peptidomimético incluye la siguiente estructura: (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:77).
Los péptidos y peptidomiméticos de la invención opcionalmente contienen una secuencia de poli-lys y/o arg para ayudar a atravesar la membrana celular. Como otras secuencias de aminoácidos (por ejemplo tat de VIH, ligandos para receptores de la superficie celular/proteínas, etc.) pueden atravesar la membrana y otras moléculas pueden usarse para facilitar la entrada en las células de péptidos y peptidomiméticos que anulan la fase G2 (por ejemplo, liposomas, micelas y otras moléculas lipídicas, vectores virales y otros vectores, electroporación, etc.), la inclusión de secuencias de poli-lys y/o poli-arg es opcional. De esta manera, en otras realizaciones, los péptidos y peptidomiméticos no tienen una secuencia de poli-lys y/o arg que ayude a la entrada en la célula. Por ejemplo, en una realización preferida, una secuencia mínima sin una secuencia de poli-lys/arg que ayude a atravesar la membrana celular incluye: P6, P5, P4, P3, P2, P1, por ejemplo, d-Bpa, d-Ser, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha (SEQ ID NO:
101).
También se describe en la presente memoria una secuencia mínima sin una secuencia de poli-lys/arg que ayude a atravesar la membrana celular que incluye, por ejemplo, d-Bpa, d-Cys, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha, d-Cys (SEQ ID NO:103); y d-Tyr, d-Cys, d-Pro, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha, d-Cys (SEQ ID NO:104); estando opcionalmente ciclados los restos de Cys.
Como se ha descrito, los compuestos de la invención tienen actividad contra la proliferación celular o actividad de anulación de G2 sola. La actividad contra la proliferación celular puede aumentarse combinando dichos compuestos de la invención con tratamientos que producen de forma directa o indirecta lesiones en el ácido nucleico. La actividad contra la proliferación celular también puede aumentarse combinando dichos compuestos de la invención con tratamientos que inhiben la proliferación celular tanto si estos tratamientos dañan los ácidos nucleicos como si no. Por lo tanto, la invención también proporciona composiciones que incluyen un compuesto de la invención (por ejemplo, una secuencia de péptido o peptidomimético) y un agente que daña los ácidos nucleicos, y composiciones que incluyen un compuesto de la invención (por ejemplo, una secuencia de péptido o peptidomimético) y un agente
antiproliferativo.
Como se usa en la presente memoria, las expresiones "anula el punto de control de G2 del ciclo celular", "altera el punto de control de G2 del ciclo celular", "daña al punto de control de G2 del ciclo celular" y variaciones gramaticales de las mismas, se refieren a la inhibición de la capacidad de una célula para detener el ciclo celular en el punto de control de G2. Una célula en la que se ha anulado el punto de control de G2 del ciclo celular presenta una reducción en el periodo de tiempo durante el cual la célula está en el punto de control de G2, que puede variar desde la ausencia del punto de control de G2 a un punto de control de G2 que tiene una reducción en la duración de minutos, horas, días, semanas o más en condiciones apropiadas. De esta manera, una célula que ha entrado en contacto con un compuesto de la invención tiene un tiempo de punto de control de G2 de menor longitud que el que tendría la célula normalmente en ausencia del compuesto. Por ejemplo, una reducción en la longitud del periodo del punto de control de G2 significaría que una célula que está en G2 durante un cierto periodo de tiempo, por ejemplo 4 horas, cuando entra en contacto con un compuesto de la invención, está en G2 durante menos de 4 horas, por ejemplo, 3,5, 3, 2,5, 2, 1 o menos
horas.
Como se usa en la presente memoria, el término "apoptosis" se refiere a la muerte celular programada, y a cambios asociados en la fisiología celular, por ejemplo, fragmentación de ácidos nucleicos, activación de caspasa, et., como se entiende en la técnica. El término "catástrofe" significa la muerte celular que resulta de un error en el proceso mitótico. En la catástrofe hay menos rasgos presentes que son característicos de la apoptosis, por ejemplo, activación de caspasa, condensación de cromosomas, etc.
Como se usan en la presente memoria, los términos "péptido," "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a dos o más aminoácidos unidos de forma covalente por un enlace amida o un equivalente no amida. Los péptidos de la invención pueden tener cualquier longitud. Por ejemplo, los péptidos pueden tener una longitud de aproximadamente 5 a 100 o más restos, tal como de 5 a 12, de 12 a 15, de 15 a 18, de 18 a 25, de 25 a 50, de 50 a 75, de 75 a 100, o más restos. Los péptidos de la invención incluyen isómeros l y d, y combinaciones de isómeros l y d. Los péptidos pueden incluir modificaciones asociadas típicamente con el procesamiento postraduccional de proteínas, por ejemplo ciclación (por ejemplo, enlaces disulfuro o amida), fosforilación, glicosilación, carboxilación, ubiquitinación, miristilación o lipidación.
Los péptidos descritos en la presente memoria también incluyen compuestos que tienen análogos estructurales y funcionales, por ejemplo, peptidomiméticos que tienen aminoácidos sintéticos o no naturales o análogos de aminoácidos, siempre que el mimético tenga una o más funciones o actividades. Por lo tanto, los compuestos de la invención incluyen formas "miméticas" y "peptidomiméticas".
Como se usa en la presente memoria, los términos "mimético" y "peptidomimético" se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los péptidos de la invención. El mimético puede estar compuesto exclusivamente por análogos de aminoácido sintéticos no naturales, o pueden ser una molécula quimérica que incluye uno o más aminoácidos de péptidos naturales y uno o más análogos de aminoácidos no naturales. El mimético también puede incorporar cualquier número de sustituciones de aminoácidos naturales conservativas siempre que dichas sustituciones no destruyan la actividad del mimético. Como ocurre con los polipéptidos de la invención que son variantes conservativas, pueden usarse ensayos rutinarios para determinar si un mimético tiene la actividad requerida, por ejemplo, una actividad de anulación del punto de control de G2 del ciclo celular detectable. Por lo tanto, cuando se administra un mimético que altera de forma detectable el punto de control de G2 del ciclo celular a un sujeto o entra en contacto con una célula, tiene una actividad de anulación del punto de control de G2.
Las composiciones de petidomiméticos pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales que típicamente proceden de tres grupos estructurales: a) grupos de enlaces de restos distintos de los enlaces amida naturales ("enlaces peptídicos"); b) restos no naturales en lugar de restos aminoacídicos naturales; o c) restos que inducen un mimetismo estructural secundario, es decir, inducen o estabilizan una estructura secundaria, por ejemplo un giro, un giro gamma, una lámina beta, una conformación en alfa hélice y similares. Por ejemplo, un polipéptido puede caracterizarse como un mimético cuando uno o más de los restos se unen por medios químicos distintos de un enlace amida. Los restos individuales del peptidomimético pueden unirse por enlaces amida, enlaces químicos no naturales y no amida distintos de enlaces químicos o medios de acoplamiento que incluyen, por ejemplo, glutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de unión alternativos al enlace amida incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(=O)-CH_{2}- para -C(=O)-NH), aminometileno (CH_{2}-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH_{2}-O), tioéter (CH_{2}-S), tetrazol (CN_{4}-), tiazol, retroamida, tioamida, o éster (véase, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins. Vol. 7, pp 267-357, "Peptide and Backbone Modifications" Marcel Decker, NY).
Como se ha descrito, un péptido puede caracterizarse como un mimético por contener uno o más restos no naturales en lugar de un resto aminoacídico natural. Los restos no naturales se conocen en la técnica. Son ejemplos no limitantes particulares de restos no naturales útiles como miméticos de restos aminoacídicos naturales, miméticos de aminoácidos aromáticos que incluyen, por ejemplo, D- o L-naftilalanina; D- o L-fenilglicina; D- o L-2-tienilalanina; D- o L-1, 2-, 3-, o 4-pirenilalanina; D- o L-3-tienilalanina; D- o L-(2-piridinil)alanina; D- o L-(3-piridinil)alanina; D- o L-(2-pirazinil)-alanina; D- o L-(4-isopropil)fenilglicina; D-(trifluorometil)fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilalanina; D-p-fluorofenilalanina; D- o L-p-bifenilfenilalanina; K- o L-p-metoxi-bifenilfenilalanina; D- o L-2-indol(alquil)alaninas; y D- o L-alquilalaninas, donde el alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, iso-butilo, sec-butilo o iso-pentilo, sustituidos o no sustituidos, o un aminoácido no ácido. Los anillos aromáticos de un aminoácido no natural que pueden usarse en lugar de anillos aromáticos naturales incluyen, por ejemplo, anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo y
piridilo.
Los miméticos de aminoácidos ácidos pueden generarse por sustitución con aminoácidos sin carboxilato siempre que mantengan una carga negativa; (fosfono)alanina; y treonina sulfatada. Los grupos laterales carboxilo (por ejemplo, aspartilo o glutamilo) también pueden modificarse selectivamente por reacción con carbodiimidas (R'-N-C-N-R') incluyendo, por ejemplo, 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Los grupos aspartilo o glutamilo también pueden convertirse en grupos asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.
Los miméticos de aminoácidos básicos pueden generarse por sustitución, por ejemplo, además de lisina y arginina, con los aminoácidos ornitina, citrulina o ácido (guanidino)acético, o ácido (guanidino)alquilacético, donde el alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, iso-butilo, sec-isotilo o iso-pentilo, sustituidos o no sustituidos, o un aminoácido no ácido. La asparagina o glutamina pueden sustituirse por derivados de nitrilo (por ejemplo, que contienen el resto CN en lugar de COOH). Los restos de asparaginilo y glutaminilo pueden desaminarse para dar los correspondientes restos de aspartilo o glutamilo.
Los miméticos de arginina pueden generarse por medio de la reacción de arginilo con uno o más reactivos que incluyen, por ejemplo, fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona o ninhidrina, opcionalmente en condiciones alcalinas. Los miméticos de restos de tirosina pueden generarse por medio de la reacción de tirosilo con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Pueden usarse N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar especies de O-acetiltirosilo y 3-nitro-derivados, respectivamente.
Los miméticos de lisina pueden generarse (y los restos amino terminales pueden alterarse) por medio de la reacción de lisinilo con anhídrido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. También puede generarse lisina y otros miméticos de restos que contienen alfa-amino por reacción con imidoésteres, tales como metil picolinimidato, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona y reacciones con glioxilato catalizadas por transamidasa.
Los miméticos de metionina pueden generarse por reacción con sulfóxido de metionina. Los miméticos de prolina incluyen, por ejemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico, 3- o 4-hidroxiprolina, deshidroprolina, 3- o 4-metilprolina, y 3,3-dimetilprolina. Los miméticos de histidina pueden generarse por reacción de histidilo con dietilprocarbonato o bromuro de para-bromofenacilo. Otros miméticos incluyen, por ejemplo, los generados por hidroxilación de prolina y lisina; fosforilación de los grupos hidroxilo de restos de serilo o treonilo; metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina; acetilación de la amina N-terminal; metilación de restos de amida de la cadena principal o sustitución con N-metilaminoácidos; o amidación de grupos carboxilo C-terminales.
Uno o más restos también pueden reemplazarse por un aminoácido (o resto de peptidomimético) de la quiralidad opuesta. De esta manera, cualquier aminoácido natural en la configuración L (que también puede denominarse R o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) puede reemplazarse por el mismo aminoácido o un mimético pero de la quiralidad opuesta, que se denomina D-aminoácido, pero que puede denominarse adicionalmente forma R
o S.
Los péptidos y peptidomiméticos de la invención también incluyen formas modificadas de las secuencias indicadas en la presente memoria, siempre que la forma modificada conserve al menos una parte de la función del péptido o peptidomimético de referencia o no modificado. Por ejemplo, un péptido o peptidomimético modificado conservará al menos una parte de la actividad de anulación de G2 o inhibidora de la proliferación celular, pero puede tener una mayor o menor actividad de anulación de G2 o inhibidora de la proliferación celular con respecto a un péptido o peptidomimético de referencia.
Los péptidos y peptidomiméticos modificados pueden tener uno o más restos aminoacídicos sustituidos con otro resto, añadido a la secuencia o delecionado de la secuencia. En una realización, el péptido o peptidomimético modificado tiene una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos (por ejemplo, 1-3, 3-5, 5-10 o más). En un aspecto, la sustitución es con un aminoácido o mimético cuya cadena lateral ocupa un espacio similar al del aminoácido o mimético de referencia (el aminoácido o mimético que se está sustituyendo). En otro aspecto, la sustitución es con un aminoácido no humano que es estructuralmente similar al resto humano. En un aspecto particular, la sustitución es una sustitución de aminoácido conservativa.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "espacio similar" significa un resto químico que ocupa un espacio tridimensional similar en tamaño a un resto de referencia. Típicamente, un resto que ocupa un espacio similar será similar en tamaño al resto de referencia. Un aminoácido o mimético que "ocupa un espacio de cadena lateral similar" tiene una cadena lateral que ocupa un espacio tridimensional similar en tamaño al aminoácido o mimético de referencia. Los ejemplos específicos para d-(Phe-2,3,4,5,6-F), 1-(Phe-2,3,4,5,6-F), d-(Phe-3,4,5F), 1-(Phe-3,4,5F), d-(Phe-4CF3) o 1-(Phe-4CF3) son (l- o d-Phe-2R1,3R2,4R3, 5R4,6R5) donde R1, R2, R3, R4 y R5 pueden ser cloruro, bromuro, fluoruro, yoduro, hidrógeno, óxido de hidrógeno o está ausente. En el caso de moléculas pequeñas, por ejemplo, el fluoruro que tiene un tamaño de aproximadamente 1 Ángstrom, el espacio similar puede ser la ausencia de un resto.
La expresión "sustitución conservativa" significa el reemplazo de un aminoácido por un resto biológico, química o estructuralmente similar. Biológicamente similar significa que la sustitución es compatible con la actividad biológica, por ejemplo, la actividad contra la proliferación celular o de anulación de G2. Estructuralmente similar significa que los aminoácidos tienen cadenas laterales con una longitud similar, tales como alanina, glicina y serina, o tienen un tamaño similar. La similitud química significa que los restos tienen la misma carga o son los dos hidrófilos o hidrófobos. Los ejemplos particulares incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un resto polar por otro, tal como la sustitución de lisina por arginina, la sustitución de ácido aspártico por glutámico o la sustitución de asparagina por glutamina, treonina por serina y
similares.
Por lo tanto, los péptidos y peptidomiméticos de la invención incluyen péptidos y peptidomiméticos que tienen una secuencia que no es idéntica a las secuencias de péptidos y peptidomiméticos indicadas en la Tabla 1. En la presente memoria, se describe un péptido o peptidomimético que tiene una secuencia con una identidad de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o mayor con una secuencia indicada en la Tabla 1. Además, la identidad puede ser en un área definida de la secuencia, por ejemplo, los 3-5 restos amino o carboxi terminales.
Los compuestos de la invención, incluyendo los péptidos y peptidomiméticos, pueden producirse y aislarse usando cualquier método conocido en la técnica. Los péptidos pueden sintetizarse, en su totalidad o en parte, usando métodos químicos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; y Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA). La síntesis de péptidos puede realizarse usando diversas técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol, 289:3-13) y la síntesis automática puede conseguirse, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Pueden sintetizarse polipéptidos y restos sintéticos individuales que incorporan miméticos usando diversos procedimientos y metodologías conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY). Los péptidos y peptidomiméticos también pueden sintetizarse usando metodologías combinatorias. La técnicas para generar bibliotecas de péptidos y peptidomiméticos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, técnicas de múltiples contactos, bolsas de té y técnicas de división-asociación-mezcla (split-couple-mix) (véase, por ejemplo, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol, 1:114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27; y Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234). También pueden producirse péptidos modificados por métodos de modificación química (véase, por ejemplo, Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; y Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896).
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Los péptidos también pueden sintetizarse y expresarse como proteínas de fusión con uno o más dominios adicionales unidos para producir un péptido más inmunogénico, para aislar más fácilmente un péptido sintetizado de forma recombinante o para identificar y aislar anticuerpos o células B que expresan anticuerpos. Los dominios que facilitan la detección y purificación incluyen, por ejemplo, péptidos quelantes de metales tales como tramos de polihistidina y módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados; dominios de proteína A que permiten la purificación en una inmunoglobulina inmovilizada; y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). Puede usarse la introducción de una secuencia enlazadora escindible tal como el Factor Xa o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego CA) entre un dominio de purificación y el péptido para facilitar la purificación del péptido. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido unida a seis restos de histidina seguido de una tiorredoxina y un sitio de escisión de enteroquinasa (véase, por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-14). Los restos de histidina facilitan la detección y purificación de la proteína de fusión mientras que el sitio de escisión de enteroquinasa proporciona un medio para purificar el péptido del resto de la proteína de fusión. En la técnica se conoce la tecnología referente a vectores que codifican proteínas de fusión y la aplicación de proteínas de fusión (véase, por ejemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol.,
12:441-53).
En la presente memoria también se describen ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención. En particular, un ácido nucleico codifica secuencias de péptidos de la invención que tienen una longitud de aproximadamente 8 a 12, 12 a 15, 15 a 18, 15 a 20, 18 a 25, 20 a 25, 25 a 35, 25 a 50 o 50 a 100 aminoácidos o mayor.
Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a todas las formas de ácido nucleico, incluyendo ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Los ácidos nucleicos pueden ser dobles, monocatenarios o triples, lineales o circulares. Los ácidos nucleicos incluyen ADN genómico, ADNc y antisentido. El ácido nucleico ARN puede ser ARNm resultante de un proceso de corte y empalme o sin procesar, ARNr, ARNt o antisentido (por ejemplo, ARNi). Los ácido nucleicos de la invención incluyen ácidos nucleicos naturales, sintéticos, así como análogos de nucleótidos y derivados. Estos polinucleótidos alterados o modificados incluyen análogos que proporcionan, por ejemplo, resistencia a nucleasas. Las longitudes de los ácidos nucleicos también pueden ser menores que las de las secuencias peptídicas ejemplificadas. Por ejemplo, una subsecuencia de cualquiera de las secuencias peptídicas puede codificar un péptido con actividad antiproliferativa o de anulación de G2.
El ácido nucleico puede producirse usando cualquiera de una diversidad de métodos de síntesis química y de clonación convencionales bien conocidos y puede alterarse de forma intencionada por mutagénesis dirigida u otras técnicas recombinantes conocidas por los especialistas en la técnica. La pureza de los polinucleótidos puede determinarse por medio de secuenciación, electroforesis en gel y similares.
Los ácidos nucleicos pueden insertarse en una construcción de ácido nucleico en la que la expresión del ácido nucleico está influenciada o regulada por un "elemento de control de la expresión", denominándose la combinación "casete de expresión". La expresión "elemento de control de la expresión" significa uno o más elementos de secuencia que regulan o influyen en la expresión de una secuencia de ácido nucleico con la que están unidos de forma funcional. Un elemento de control de la expresión unido de forma funcional a una secuencia de ácido nucleico controla la transcripción y, cuando sea apropiado, la traducción de la secuencia de ácido nucleico.
La expresión "unido de forma funcional" se refiere a una yuxtaposición funcional donde los componentes descritos de ésta manera están en una relación que permite que funcionen de la manera deseada. Los elementos de control de la expresión típicamente están yuxtapuestos en el extremo 5' o 3' del gen, pero también pueden ser intrónicos. Los promotores generalmente están en posición 5' de la secuencia codificante. Un "promotor" significa un elemento de secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción.
Los elementos de control de la expresión incluyen promotores, potenciadores, terminadores de la transcripción, silenciadores génicos, un codón de inicio (por ejemplo, ATG) delante de un gen que codifica una proteína. Los elementos de control de la expresión activan la transcripción constitutiva, la transcripción inducible (es decir, requieren una señal externa para la activación), o anulan la represión de la transcripción (es decir, una señal inhibe la transcripción, por lo que la retirada de la señal activa la transcripción). Los casetes de expresión también pueden incluir elementos de control suficientes para hacer que la expresión génica sea controlable para tipos celulares o tejidos específicos (es decir, elementos de control con especificidad de tejido).
Los ácidos nucleicos de la invención pueden insertarse en un plásmido para la propagación en una célula hospedadora y para la manipulación genética posterior. Un plásmido es un ácido nucleico que puede propagarse de forma estable en una célula hospedadora; los plásmidos opcionalmente contienen elementos de control de la expresión para dirigir la expresión del ácido nucleico que codifica el péptido en la célula hospedadora. El término "vector" se usa en la presente memoria como sinónimo de un plásmido y también puede incluir un elemento de control de la expresión en una célula hospedadora. Los plásmidos y los vectores generalmente contienen al menos un origen de replicación para la propagación en una célula y un promotor. Por lo tanto, los plásmidos y vectores son útiles, por ejemplo, para la manipulación genética de péptidos que codifican ácidos nucleicos, para producir péptidos y para expresar los péptidos en las células hospedadoras u organismos enteros.
Por lo tanto, pueden expresarse péptidos en sistemas bacterianos usando promotores constitutivos tales como T7, o promotores inducible tales como pL del bacteriófago \lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrdo ptrp-lac); en sistemas de levaduras usando promotores constitutivos tales como ADH o LEU2 o un promotor inducible tal como GAL (véase, por ejemplo, Ausubel et al., En: Current Protocols in Molecular Biology. Vol. 2, Ch. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. Methods in Enzymology. 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman; Bitter
Methods in Enzymology. 152: 673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; y, Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I y II; R. Rothstein En: DNA Cloning. A Practical Approach. Vol.11, Ch. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C.,1986); en sistemas de células de insectos usando promotores constitutivos o inducibles tales como ecdisona; y en sistemas de células de mamíferos usando promotores constitutivos tales como SV40, RSV, o promotores inducibles derivados del genoma de de células de mamífero tales como el promotor de la metalotioneína IIA, el promotor de choque térmico o derivados de virus de mamífero tales como el promotor tardío de adenovirus o la repetición terminal larga del virus del tumor mamario de ratón inducible. Los sistemas de expresión de péptidos además incluyen vectores diseñados para el uso in vivo incluyendo vectores adenovirales (Patentes de Estados Unidos N^{os} 5.700.470 y 5.731.172), vectores adenoasociados (Patente de Estados Unidos Nº 5.604.090), vectores de virus del herpes simple (Patente de Estados Unidos Nº 5.501.979) y vectores retrovirales (Patentes de Estados Unidos N^{os} 5.624.820, 5.693.508 y 5.674.703 y publicaciones WIPO WO92/05266 y WO92/14829). También se ha empleado el virus del papiloma bovino (BPV) en terapia génica (Patente de Estados Unidos Nº 5.719.054). Estos vectores de terapia génica también incluyen vectores basados en CMV (Patente de Estados Unidos Nº 5.561.063).
Por lo tanto, también se describen ácidos nucleicos que codifican péptidos de la invención insertados en células hospedadoras. La célula hospedadora es una célula procariota, una célula eucariota tal como de una célula de levadura o una célula de mamífero (por ejemplo, de ser humano, primate, etc.).
Como se usa en la presente memoria, una "célula hospedadora" es una célula en la que se introduce un ácido nucleico que puede propagarse, transcribirse o codificar el péptido expresado. La expresión también incluye cualquier descendencia de la célula hospedadora objeto.
Las células hospedadoras incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias o levaduras; células vegetales, células de insectos y de mamífero. Por ejemplo, bacterias transformadas con vectores de expresión de ácido nucleico de bacteriófago recombinante, ácido nucleido de plásmido o ácido nucleico de cósmido; levaduras transformadas con vectores de expresión de levadura recombinante; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaco del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti); sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo,baculovirus); o sistemas de células animales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, vaccinia virus), o sistemas de células animales transformadas modificadas por ingeniería genética para proporcionar una expresión estable.
El vector de expresión también puede contener un ácido nucleico que codifica un marcador de selección que confiere resistencia a un marcador identificable o de presión de selección (por ejemplo, \beta-galactosidasa), permitiendo de ésta manera que las células que tienen el vector a identificar se desarrollen y se expandan. Como alternativa, el marcador de selección puede estar en un segundo vector que se introduce por cotransfección en una célula hospedadora, conteniendo el primer vector un polinucleótido de la invención. Pueden usarse varios sistemas de selección incluyendo, pero sin limitación, el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), el gen de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), y los genes de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al, Cell 22:817 (1980)) que pueden emplearse en células tk-, hgprt- o aprt- respectivamente. Puede usarse resistencia antimetabolito como base de la selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); el gen gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); el gen neomycin, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1(1981)); y el gen hygromycin, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Otros genes de selección incluyen trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); y ODC (ornitina descarboxilasa), que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue (1987) En: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor
Laboratory).
Como se usan en la presente memoria, las expresiones "tratamiento para dañar a los ácidos nucleicos" y "agente que daña a los ácidos nucleicos" se refieren a cualquier régimen de tratamiento que dañe directa o indirectamente los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ADNc, ADN genómico, ARNm, ARNt o ARNr). Los ejemplos específicos de estos agentes incluyen agentes alquilantes, nitrosoureas, antimetabolitos, alcaloides vegetales, extractos vegetales y radioisótopos. Los ejemplos específicos de agentes incluyen también fármacos que dañan a los ácidos nucleicos, por ejemplo, 5-fluorouracilo (5-FU), capecitabina, S-1 (Tegafur, 5-cloro-2,4-dihidroxipiridina y ácido oxónico), 5-etiniluracilo, arabinosil citosina (ara-C), 5-azacitidina (5-AC), 2',2'-difluoro-2'-desoxicitidina (dFdC), antimetabolitos de purina (mercaptopurina, azatiopurina, tioguanina), hidrocloruro de gemcitabina (Gemzar), pentostatina, alopurinol, 2-fluoro-arabinosil-adenina (2F-ara-A), hidroxiurea, mostaza de azufre (biscloroetilsulfuro), mecloretamina, melfalán, clorambucilo, ciclofosfamida, ifosfamida, tiotepa, AZQ, mitomicina C, dianhidrogalactitol, dibromoducitol, alquil sulfonato (busulfán), nitrosoureas (BCNU, CCNU, 4-metil CCNU o ACNU), procarbazina, decarbazina, rebecamicina, antraciclinas tales como doxorubicina (adriamicina; ADR), daunorubicina (Cerubicine), idarubicina (Idamicina) y epirubicina (Ellence), análogos de antraciclina tales como mitoxantrona, actinomicina D, inhibidores de la topoisomerasa no intercalantes tales como epipodofilotoxinas (etopósido = VP16, tenipósido = VM-26), podofilotoxina, bleomicina (Bleo), pepleomicina, compuestos que forman aductos con ácidos nucleicos incluyendo derivados de platino (por ejemplo, cisplatino (CDDP), análogo trans del cisplatino, carboplatino, iproplatino, tetraplatino y oxaliplatino), camptotecina, topotecan, irinotecan (CPT-11) y SN-38. Los ejemplos específicos de tratamientos que dañan a los ácidos nucleicos incluyen radiación (por ejemplo, radiación ultravioleta (UV), infrarroja (IR), o alfa, beta o gamma) y choque ambiental (por ejemplo, hipertermia).
Como se usan en la presente memoria, las expresiones "tratamiento antiproliferativo" y "agente antiproliferativo" se refieren a cualquier régimen de tratamiento que inhiba directa o indirectamente la proliferación de una célula, virus, bacteria u otro organismo unicelular o multicelular independientemente de si el tratamiento o el agente dañan o no el ácido nucleico. Son ejemplos particulares de agentes antiproliferativos fármacos antitumorales y antivirales que inhiben la proliferación celular o la proliferación o replicación de virus. Los ejemplos específicos incluyen, entre otros, ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina A, prednisolona, melfalán, clorambucilo, mecloretamina, busulfán, metotrexato, 6-mercaptopurina, tioguanina, citosina, arabinósido, taxol, vinblastina, vincristina, doxorubicina, actinomicina D, mitramicina, carmustina, lomustina, semustina, estreptozotocina, hidroxiurea, cisplatino, mitotano, procarbazina, dacarbazina y dibromomanitol. Son agentes antiproliferativos que producen errores en la replicación de los ácidos nucleicos o inhiben la replicación de los ácidos nucleicos análogos de nucleósidos y de nucleótidos (por ejemplo, AZT o 5-AZC).
Los péptidos y peptidomiméticos de la invención también pueden aumentar la actividad contra la proliferación celular de agentes estabilizadores o desestabilizadores de microtúbulos tales como alcaloides de la vinca (vinblastina = VLB, vincristina=VCR, vinorelbina=VRLB, vinflunina=VFL), y taxanos (paclitaxel y docetaxel=taxotere). De ésta manera, estos agentes pueden incluirse adicionalmente en las composiciones de la invención y usarse en los métodos de la invención.
Las células que pueden tratarse con los compuestos de la invención incluyen cualquier célula cuya proliferación se desea inhibir o prevenir in vitro, ex vivo o in vivo. Las células diana particulares presentan un periodo de tiempo del punto de control de G1 del ciclo celular más corto de lo normal o tienen un punto de control de G1 del ciclo celular alterado de tal forma que las células salen del punto de control de G1 antes de que haya transcurrido un periodo de tiempo suficiente para completar la reparación del ácido nucleico. Por lo tanto, las células candidatas incluyen células que proliferan rápidamente tanto si las células son normales como si son anómalas. Son ejemplos específicos células benignas o tumorales metastásicas o no metastásicas. Otras células candidatas pueden identificarse midiendo su velocidad de proliferación o el periodo de tiempo durante el cual las células permanecen en la fase G1. Las células candidatas también pueden identificarse poniendo en contacto una célula de ensayo con un compuesto de la invención solo o en combinación con un tratamiento que daña a los ácidos nucleicos y determinando si la célula que ha entrado en contacto presenta una menor proliferación o una mayor muerte celular o apoptosis/
catástrofe.
Por lo tanto, los compuestos de la invención son útiles para inhibir la proliferación celular in vitro, ex vivo e in vivo. Como tales, los sujetos que tienen un trastorno o riesgo de tener un trastorno o afección fisiológica caracterizada por una proliferación o supervivencia celular anómala, indeseable o inoportuna, o una diferenciación celular anómala o deficiente, pueden tratarse con un compuesto de la invención solo o en combinación con un tratamiento que produce directa o indirectamente lesiones en el ácido nucleico o con un tratamiento antiproliferativo.
De esta manera, de acuerdo con la invención se proporcionan métodos in vitro para inhibir la proliferación celular, métodos in vitro para aumentar la sensibilidad de una célula a un agente o tratamiento que daña a los ácidos nucleicos y métodos in vitro para aumentar las lesiones de los ácidos nucleicos en una célula in vitro, ex vivo e in vivo. En una realización, el método in vitro incluye poner en contacto una célula (por ejemplo, una célula cultivada o una célula presente en un sujeto) con una cantidad de un péptido o peptidomimético de la invención suficiente para inhibir la proliferación de la célula. En otra realización, el método in vitro incluye poner en contacto la célula con una cantidad de un péptido o peptidomimético de la invención suficiente para aumentar la sensibilidad de la célula a un agente o tratamiento que daña a los ácidos nucleicos. En otra realización, el método in vitro incluye poner en contacto la célula con una cantidad de un péptido o peptidomimético de la invención suficiente para aumentar la lesión del ácido nucleico de la célula. En diversos aspectos, el método in vitro además incluye poner en contacto la célula con un agente que daña a los ácidos nucleicos o exponer la célula a un tratamiento que daña a los ácidos
nucleicos.
También se proporcionan usos de una cantidad de péptido o peptidomimético para tratar un trastorno de la proliferación celular o un trastorno de la diferenciación celular en un sujeto, incluyendo afecciones caracterizadas por una proliferación o supervivencia celular indeseable o inoportuna, afecciones caracterizadas por una apoptosis deficiente o aberrante, afecciones caracterizadas por una supervivencia celular aberrante o deficiente, así como afecciones caracterizadas por una diferenciación celular aberrante o deficiente. En una realización, el uso incluye una cantidad de un péptido o peptidomimético de la invención eficaz para tratar el trastorno de la proliferación celular. En un aspecto, la cantidad es suficiente para mejorar la afección de los sujetos. En aspectos particulares, la mejora incluye, al menos en una parte de las células diana (por ejemplo, células que proliferan de forma anómala), una reducción de la proliferación celular, reducción del número de células, inhibición de los aumentos en el número de células, aumento de la apoptosis o disminución de la supervivencia. En otro aspecto, al sujeto se le administra un compuesto de la invención antes, contemporáneamente con o después de haber administrado un tratamiento que inhibe la proliferación celular. En otros aspectos particulares, al menos una parte de las células del trastorno de la proliferación celular están localizadas en la sangre, mama, pulmón, tiroides, cabeza o cuello, cerebro, linfa, tracto gastrointestinal, tracto genitourinario, riñón, páncreas, hígado, hueso, músculo o piel.
En otra realización, el uso incluye una cantidad de compuesto para tratar un tumor sólido. En otra realización, el uso incluye una cantidad de un compuesto para tratar un tumor líquido. En diversos aspectos, al sujeto que tiene el tumor se le administra un compuesto de la invención antes, contemporáneamente con o después de otra terapia antitumoral.
Como se usan en la presente memoria, las expresiones "trastorno proliferativo" y "afección proliferativa" se refieren a cualquier afección fisiológica patológica o no-patológica caracterizada por una proliferación aberrante o indeseable (por ejemplo, de una célula, virus, bacteria, hongo, etc.). Las expresiones "trastorno de la proliferación celular" y "afección de la proliferación celular" se refieren a cualquier situación fisiológica patológica o no-patológica caracterizada por una proliferación celular aberrante o indeseable, además de incluir situaciones caracterizadas por una proliferación o supervivencia celular indeseable o inoportuna (por ejemplo, debido a una apoptosis deficiente), afecciones caracterizadas por una apoptosis deficiente o aberrante, así como afecciones caracterizadas por una supervivencia celular aberrante, indeseable o inoportuna. La expresión, "trastorno de diferenciación" se refiere a cualquier situación fisiológica patológica o no patológica caracterizada por una diferenciación aberrante o
deficiente.
Los trastornos de la proliferación o diferenciación susceptibles de tratamiento incluyen enfermedades y situaciones fisiológicas no patológicas, tanto benignas como neoplásicas, caracterizadas por cantidades de células, crecimiento celular o supervivencia celular anómalos o indeseables. Por lo tanto, estos trastornos o situaciones pueden constituir una patología e incluyen todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados de forma maligna, o pueden ser no patológicos, es decir, una desviación de lo normal pero que no está asociada típicamente con una enfermedad. Un ejemplo específico de una situación no patológica que puede tratarse de acuerdo con la invención es el crecimiento de nuevo tejido en la reparación de heridas que se produce en la cicatrización.
Las células que constituyen el trastorno proliferativo o de la diferenciación pueden estar agregadas en una masa celular o pueden estar dispersas. La expresión "tumor sólido" se refiere a neoplasias o metástasis que típicamente se agregan entre sí y forman una masa. Los ejemplos particulares incluyen tumores viscerales tales como cánceres gástricos o de colon, hepatomas, carcinomas venosos, tumores/cánceres pulmonares y cerebrales. Un "tumor líquido" se refiere a neoplasias del sistema hematopoyético, tales como linfomas, mielomas y leucemias, o neoplasias que son de naturaleza difusa, ya que típicamente no forman una masa sólida. Los ejemplos particulares de leucemias incluyen mieloma linfoblástico, mieloblástico y múltiple, agudos y crónicos.
Estos trastornos incluyen neoplasmas o cánceres que pueden afectar prácticamente a cualquier tipo de célula o de tejido, por ejemplo, carcinoma, sarcoma, melanoma, trastornos metastásicos o trastornos neoplásicos hematopoyéticos. Un tumor metastásico puede producirse a partir de una multitud de tipos de tumores primarios, incluyendo pero sin limitación mama, pulmón, tiroides, cabeza y cuello, cerebro, linfoide, gastrointestinal (boca, esófago, estómago, intestino delgado, colon y recto), tracto genitourinario (útero, ovario, cuello del útero, vejiga, testículo, pene, próstata), riñón, páncreas, hígado, hueso, músculo, piel, etc.
Los carcinomas se refieren a malignidades del tejido epitelial o endocrino e incluyen carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas prostáticos, carcinomas del sistema endocrino y melanomas. Los carcinomas ilustrativos incluyen los que se forman en el cuello del útero, pulmón, próstata, mama, cabeza y cuello, colon, hígado y ovario. El término también incluye carcinosarcomas, por ejemplo, que incluyen tumores malignos compuestos por tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. El adenocarcinoma incluye un carcinoma de un tejido glandular, o en el que el tumor forma una estructura de forma glandular.
Los sarcomas se refieren a tumores malignos que se originan en células mesenquimáticas. Los sarcomas ilustrativos incluyen, por ejemplo, linfosarcoma, liposarcoma, osteosarcoma y fibrosarcoma.
Como se usa en la presente memoria, el término "trastorno proliferativo hematopoyético" se refiere a una enfermedad en las que están implicadas células hiperplásicas/neoplásicas de origen hematopoyético, por ejemplo, procedentes del linaje mieloide, linfoide o eritroide, o células precursoras de las mismas. Típicamente, las enfermedades se producen a partir de leucemias agudas poco diferenciadas, por ejemplo, leucemia eritroblástica y leucemia megacarioblástica aguda. Otros trastornos mieloides ilustrativos incluyen, pero sin limitación, leucemia promieloide aguda (APML), leucemia mielógena aguda (AML) y leucemia mielógena crónica (CML); las malignidades linfoides incluyen, pero sin limitación, leucemia linfoblástica aguda (ALL), que incluye ALL de linaje B y ALL de linaje T, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia prolinfocítica (PLL), leucemia de células pilosas (HLL) y macroglobulinemia de Waldenstrom (WM). Otros linfomas malignos incluyen, pero sin limitación, linfoma no Hodgkin y variantes del mismo, linfomas de células T periféricas, linfoma/leucemia de células T adultas (ATL), linfoma de células T cutáneas (CTCL), leucemia linfocítica granular grande (LGF), enfermedad de Hodgkin y enfermedad de
Reed-Stemberg.
Los tratamientos para usar en combinación con los compuestos de la invención incluyen cualquier tratamiento antiproliferativo, que dañe a los ácidos nucleicos o antitumoral como se ha descrito en la presente memoria o conocido en la técnica. Por ejemplo, un tratamiento contra la proliferación celular o antitumoral puede comprender radiación o resección quirúrgica opcionalmente en combinación con un tratamiento con fármacos. El tratamiento puede comprender la administración de una sustancia química tal como un radioisótopo, un fármaco tal como un agente quimioterapéutico, o terapia genética tal como un anti-oncogén (por ejemplo,Rb, DCC, p53, etc.), un oncogén dominante negativo o una molécula antisentido para un oncogén. Los compuestos pueden administrarse antes, contemporáneamente con o después de otros protocolos de tratamiento. Por ejemplo, a un sujeto candidato que se va a someter a una terapia contra la proliferación celular (por ejemplo, radioterapia, quimioterapia, terapia génica, resección quirúrgica, etc.) se le puede administrar un compuesto de la invención antes de iniciar la terapia contra la proliferación celular. De esta manera, se proporcionan métodos de tratamiento profiláctico.
El término "sujeto" se refiere a animales, típicamente mamíferos, tales como primates (seres humanos, monos, gibones, chimpancés, orangutanes, macacos), animales domésticos (perros y gatos), animales de granja (caballos, vacas, cabras, ovejas, cerdos) y animales experimentales (ratón, rata, conejo, cobaya). Los sujetos incluyen modelos de enfermedad animal (por ejemplo, ratones que llevan tumores).
Los sujetos apropiados para el tratamiento incluyen los que actualmente están en tratamiento o son candidatos para el tratamiento de un trastorno proliferativo o de diferenciación (por ejemplo, terapia antitumoral). Otros sujetos candidatos adicionales incluyen, por ejemplo, sujetos con riesgo de desarrollar un trastorno de la proliferación celular. Por lo tanto, los usos de la invención son aplicables para tratar a un sujeto con riesgo de desarrollar un trastorno de la proliferación celular pero que no ha presentado aún los síntomas del trastorno. Los sujetos con riesgo pueden identificarse como sujetos que tienen una predisposición genética o una historia familiar de desarrollo de trastorno de la proliferación celular. Por ejemplo, son sujetos candidatos sujetos que tienen un oncogén activado o que tienen una mutación o deleción de un gen supresor de tumores. Por lo tanto, los sujetos con riesgo pueden identificarse usando una selección genética rutinaria con respecto a la presencia de la lesión genética o examinando la historia familiar de los sujetos para establecer si tienen riesgo de padecer el trastorno. Un ejemplo particular de un sujeto con riesgo sería uno con una historia familiar u otra característica genética que indica predisposición a padecer un cáncer en el que las células neoplásicas resistentes al fármaco expresan CD40. Un ejemplo específico particular de una enfermedad genética es el retinoblastoma, causado por un defecto en el gen supresor de tumores
Rb.
Las cantidades a administrar son típicamente una "cantidad eficaz" o una "cantidad suficiente" que es una cantidad suficiente para producir el efecto deseado. Por lo tanto, las cantidades eficaces incluyen una o mas de las cantidades siguientes: las que reducen la proliferación celular, reducen el número de células, inhiben el aumento de proliferación, inhiben el aumento del número de células, aumentan la apoptosis o reducen la supervivencia de al menos una parte de las células que constituyen las células proliferativas (por ejemplo, al menos algunas de las células diana). De esta manera, por ejemplo, cuando se desea inhibir la proliferación celular, una cantidad eficaz será una cantidad que reduce de forma detectable la proliferación celular o el número de células en proliferación, o aumenta la apoptosis celular o reduce la supervivencia celular. Por lo tanto, la cantidad puede ser suficiente para reducir el número de células diana, estabilizar el número de células diana o inhibir aumentos en el número de células diana. Por ejemplo, cuando el trastorno comprende un tumor sólido, es un criterio de valoración clínico satisfactorio la reducción del tamaño del tumor, la estabilización del tamaño del tumor o la prevención del crecimiento adicional del tumor, o de al menos una parte del tumor (por ejemplo, inhibir el crecimiento de 5-10% de las células o 10-20% o mas de las células que constituyen la masa tumoral). Cuando el trastorno comprende un tumor líquido, es un criterio de valoración clínico satisfactorio la reducción del número de células tumorales, la estabilización del número de células tumorales o la inhibición de un aumento adicional en el número de células tumorales, de al menos una subpoblación de células tumorales (por ejemplo, la inhibición del crecimiento de 5-10% de las células o 10-20% o mas de las
células).
Además, las cantidades consideradas eficaces pueden prevenir o inhibir la progresión de la afección o trastorno. Por ejemplo, ciertos tumores se vuelven cada vez mas agresivos según progresan, incluyendo la progresión a formas metastásicas. De esta manera, las cantidades consideradas eficaces también producirían una reducción o prevención de que los tumores se vuelvan cada vez más agresivos o formen metástasis. Por consiguiente, es un criterio de valoración clínico satisfactorio adicional la inhibición o prevención de un empeoramiento del trastorno o afección, es decir, la estabilización de la afección.
Por medio del examen de una muestra biológica que contiene un tumor líquido (por ejemplo, sangre o una muestra de tejido) se puede establecer si se ha reducido el número o masa de células tumorales, o si se ha producido inhibición de la proliferación de células tumorales. En el caso de un tumor sólido, por medio de métodos de formación de imágenes invasivos o no invasivos se puede determinar una reducción del tamaño del tumor, o la inhibición del aumento del tamaño del tumor. Pueden usarse cantidades decrecientes de receptor de un tumor positivo para receptores para evaluar la reducción o inhibición de la proliferación de las células tumorales. Pueden usarse cantidades de hormona de un tumor productor de hormonas, por ejemplo, cáncer de mama, testicular o de ovario, para evaluar una reducción o inhibición de la proliferación del tumor.
Las cantidades eficaces también pueden reducir de forma objetiva o subjetiva o disminuir la gravedad o frecuencia de los síntomas asociados con el trastorno o afección. Por ejemplo, es un criterio de valoración clínico satisfactorio una cantidad de un compuesto de la invención que reduce el dolor, náuseas u otras molestias, o aumenta el apetito o el bienestar subjetivo.
Las cantidades eficaces también incluyen una reducción de la cantidad (por ejemplo, dosificación) o frecuencia de tratamiento con otro protocolo, que se considera un criterio de valoración clínico satisfactorio. Por ejemplo, un paciente con cáncer tratado con un compuesto de la invención puede necesitar un menor tratamiento que daña a los ácidos nucleicos para inhibir la proliferación de células cancerosas. En este ejemplo, una cantidad eficaz incluiría una cantidad que reduce la frecuencia de dosificación o la cantidad de un agente que daña a los ácidos nucleicos que se administra al sujeto en comparación con la frecuencia o cantidad de dosificación administrada sin el tratamiento con un compuesto de la invención.
Los usos de la invención que conducen a una mejoría del estado del sujeto o a un efecto terapéutico beneficioso pueden tener una duración relativamente corta, por ejemplo, la mejoría puede durar varias horas, días o semanas, o extenderse durante un periodo mayor de tiempo, por ejemplo, meses o años. Una cantidad eficaz no necesita ser una cantidad que anule de forma completa todos y cada uno de los síntomas de la afección o trastorno. De esta manera, se consigue un criterio de valoración clínico satisfactorio para una cantidad eficaz cuando hay una mejoría subjetiva u objetiva en el estado del sujeto, determinada usando cualquiera de los criterios anteriores u otros criterios conocidos en la técnica apropiados para determinar en estado del trastorno o afección, durante un periodo de tiempo corto o largo. Una cantidad eficaz para proporcionar uno o mas efectos beneficiosos, como se describe en este documento o se conoce en la técnica, se conoce como una cantidad que proporciona una "mejoría" del estado del sujeto o un "efecto terapéutico beneficioso" para el sujeto.
La cantidad eficaz de un compuesto de la invención puede determinarse basándose en estudios animales u opcionalmente en ensayos clínicos en seres humanos. El especialista en la técnica apreciará los diversos factores que pueden influir en la dosificación y el programa de tiempos necesario para tratar a un sujeto particular incluyendo, por ejemplo, la salud general, edad o sexo del sujeto, la gravedad o estadío del trastorno o afección, tratamientos previos, susceptibilidad a efectos secundarios indeseables, resultados clínicos deseados y la presencia de otros trastornos o afecciones. Estos factores pueden influir en la dosificación y el programa de tiempos necesario para proporcionar una cantidad suficiente para producir el efecto terapéutico beneficioso. El régimen de dosificación también tiene en cuenta la farmacocinética, es decir, la velocidad de absorción de la composición farmacéutica, la biodisponibilidad, el metabolismo y el aclaramiento (véase, por ejemplo, Egleton (1997) "Bioavailability and transport of peptides and peptide drugs into the brain" Peptides 18:1431-1439; y Langer (1990) Science 249:1527-1533). Además, las dosis o protocolos de tratamiento pueden adaptarse específicamente al sujeto o modificarse basándose en datos
farmacogenómicos.
Por lo tanto, los compuestos de la invención pueden administrarse solos o como una composición farmacéutica, sistémicamente, regionalmente (por ejemplo, dirigidos a un órgano o tejido, por ejemplo mediante inyección en la vena porta para tratar un trastorno de la proliferación celular del hígado) o localmente (por ejemplo, directamente en una masa tumoral), de acuerdo con cualquier protocolo o ruta que consiga el efecto deseado. Los compuestos y composiciones farmacéuticas pueden administrase como una sola dosis o múltiples dosis cada día (por ejemplo, a una baja dosis) o de manera intermitente (por ejemplo, un día sí y otro no, una vez por semana, etc., a una dosis superior). Los compuestos y composiciones farmacéuticas pueden administrase por inhalación (por ejemplo, por vía intratraqueal), o por vía oral, intravenosa, intraarterial, intravascular, intratecal, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavital, transdérmica (por ejemplo, tópica), transmucosa (por ejemplo bucal, en la vejiga, vaginal, uterina, rectal o nasal), por múltiples administraciones, liberación sostenida (por ejemplo, perfusión gradual a lo largo del tiempo) o en una sola embolada. Los dispositivos implantables, incluyendo dispositivos microfabricados, para administrar fármacos son bien conocidos y también son aplicables para administrar los compuestos de la invención a un
sujeto.
La administración intravenosa (IV) de los compuestos sería de aproximadamente 0,01 mg/h a aproximadamente 1,0 mg/h durante varias horas (típicamente 1, 3 ó 6 horas), que puede repetirse durante una o mas semanas con ciclos intermitentes. Pueden usarse dosificaciones considerablemente mayores (por ejemplo, que varían hasta aproximadamente 10 mg/ml), particularmente cuando el fármaco se administra en un sitio apartado y no en la corriente sanguínea, tal como en una cavidad corporal o en la luz de un órgano, por ejemplo, en el líquido cefalorraquídeo (CSF).
Por lo tanto, la invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Estas composiciones farmacéuticas son útiles para la administración a un sujeto in vivo o ex vivo y, por ejemplo, para tratar a un sujeto con los compuestos de la invención.
Como se usan en la presente memoria, las expresiones "farmacéuticamente aceptable" y "fisiológicamente aceptable" incluyen disolventes (acuosos o no-acuosos), emulsiones, medios de dispersión, recubrimientos, agentes para promover o retrasar la absorción e isotónicos, compatibles con la administración farmacéutica. Una "composición farmacéutica" o "formulación farmacéutica", por lo tanto, se refiere a una composición adecuada para el uso farmacéutico en un sujeto. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas incluyen una cantidad de un compuesto de la invención, por ejemplo, una cantidad eficaz de un péptido o peptidomimético, un ácido nucleico que lo codifica, vector o célula de la invención, y un vehículo farmacéutico fisiológicamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera que sean compatibles con una vía de administración particular, sistémica o local. De esta manera, las composiciones farmacéuticas incluyen vehículos, diluyentes o excipientes adecuados para la administración por diversas vías.
Las formulaciones para administración entérica (oral) pueden estar contenidas en un comprimido (recubierto o sin recubrir), cápsula (dura o blanda), microesfera, emulsión, polvo, gránulo, cristal, suspensión, jarabe o elixir. Pueden usarse vehículos sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, para preparar formulaciones sólidas. En las formulaciones también pueden incorporarse compuestos activos suplementarios (por ejemplo, conservantes, agentes antibacterianos, antivirales y antifúngicos). Una formulación líquida también puede usarse para la administración entérica. El vehículo puede seleccionarse entre diversos aceites que incluyen aceite de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral o aceite de sésamo. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen, por ejemplo, almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, carbonato cálcico, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato sódico, monoestearato de glicerol, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua y
etanol.
Las composiciones farmacéuticas para administración entérica, parenteral o transmucosa incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, solución de Hank, solución de Ringer, dextrosa/solución salina y soluciones de glucosa. Las formulaciones pueden contener sustancias auxiliares para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes tamponantes, agentes para ajustar la tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. Los aditivos también pueden incluir otros ingredientes activos adicionales tales como agentes bactericidas o estabilizantes. Por ejemplo, la solución puede contener acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, monolaurato de sorbitán u oleato de trietanolamina. Se describen otras formulaciones parenterales y métodos en Bai (1997) J. Neuroimmunol. 80:65-75; Warren (1997) J. Neurol. Sci. 152:31-38; y Tonegawa (1997) J. Exp. Med. 186:507-515. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o de plástico.
Las composiciones farmacéuticas para administración intradérmica o subcutánea pueden incluir un diluyente estéril tal como agua, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico, glutatión o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para ajustar la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa.
Las composiciones farmacéuticas para inyección incluyen dispersiones o soluciones acuosas (cuando son solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, por medio del mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión y por medio del uso de tensioactivos. Otros agentes antibacterianos y antifúngicos incluyen, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y timerosal. En la composición pueden incluirse agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro sódico. Las soluciones resultantes pueden envasarse para el uso tal cual o liofilizadas, y la preparación liofilizada puede combinarse posteriormente con una solución estéril antes de la administración.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener un compuesto que estabiliza, aumenta o retrasa la absorción o el aclaramiento. Estos compuestos incluyen, por ejemplo, carbohidratos tales como glucosa, sacarosa o dextranos; proteínas de bajo peso molecular; composiciones que reducen el aclaramiento o la hidrólisis de péptidos; o excipientes u otros estabilizantes y/o tampones. Los agentes que retrasan la absorción incluyen, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. También pueden usarse detergentes para estabilizar o aumentar o reducir la absorción de la composición farmacéutica, incluyendo vehículos liposomales. Para proteger el compuesto de la digestión, puede complejarse con una composición para hacerlo resistente a la hidrólisis ácida y enzimática, o el compuesto puede complejarse en un vehículo resistente de manera apropiada tal como un liposoma. En la técnica se conocen medios para proteger los compuestos de la digestión (véase, por ejemplo, Fix (1996) Pharm Res. 13:1760-1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119-135; y la Patente de Estados Unidos 5.391.377, que describe composiciones lipídicas para la administración oral de agentes terapéuticos).
Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera a atravesar. Estos penetrantes se conocen generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede realizarse a través de pulverizaciones nasales o supositorios (véase, por ejemplo, Sayani (1996) "Systemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosae" Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13:85-184). Para la administración transdérmica, el compuesto activo puede formularse en pomadas, ungüentos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica. También pueden conseguirse sistemas de administración transdérmica usando
parches.
Para la administración por inhalación, la formulación farmacéutica puede administrarse en forma de aerosol o neblina. Para la administración del aerosol, la formulación puede administrarse en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y un propulsor. En otra realización, el dispositivo para administrar la formulación en el tejido respiratorio es una formulación que se vaporiza. Otros sistemas de administración conocidos en la técnica incluyen aerosoles de polvo seco, sistemas de administración de líquido, inhaladores, nebulizadores de chorro de aire y sistemas propulsores (véase, por ejemplo, Patton (1998) Biotechniques 16:141-143; Dura Pharmaceuticals, San Diego, CA; Aradigm, Hayward, CA; Aerogen, Santa Clara, CA; e Inhale Therapeutic Systems, San Carlos,
CA).
Pueden usarse polímeros biocompatibles y biodegradables tales como acetato de etileno y vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Para los especialistas en la técnica se conocen métodos para la preparación de estas formulaciones. Los materiales también pueden obtenerse en el mercado en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células o tejidos usando anticuerpos o proteínas de la cubierta viral) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como los descritos en las Patentes de Estados Unidos N^{os} 4.235.871; 4.501.728; 4.522.811; 4.837.028; 6.110.490; 6.096.716; 5.283.185; 5.279.833; Akimaru (1995) Cytokines Mol. Ther. 1:197-210; Alving (1995) Immunol. Rev. 145:5-31; y Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467). En la técnica se conocen microesferas o cápsulas biodegradables u otras configuraciones poliméricas biodegradables capaces de mantener la administración de moléculas pequeñas, incluyendo péptidos (véase, por ejemplo, Putney (1998) Nat. Biotechnol. 16:153-157). Los compuestos de la invención pueden incorporarse dentro de micelas (véase, por ejemplo, Suntres (1994) J. Pharm. Pharmacol. 46:23-28; Woodle (1992) Pharm. Res. 9:260-265). Pueden unirse péptidos a la superficie de la monocapa o bicapa lipídica. Por ejemplo, pueden unirse péptidos a liposomas que contienen hidrazida-PEG-(diestearoilfosfatidil)etanolamina (véase, por ejemplo, Zalipsky (1995) Bioconjug. Chem. 6:705-708). Como alternativa, puede usarse cualquier forma de membrana lipídica, tal como una membrana lipídica plana o la membrana celular de una célula intacta, por ejemplo, un glóbulo rojo. Pueden administrarse formulaciones liposomales y formulaciones que contienen lípidos por cualquier medio incluyendo, por ejemplo, la administración intravenosa, transdérmica (véase, por ejemplo, Vutla (1996) J. Pharm. Sci. 85:5-8), transmucosa u oral.
Una formulación farmacéuticamente aceptable puede incorporar de aproximadamente 1% a 99,9% de ingrediente activo (por ejemplo, un péptido o peptidomimético). Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas o pueden filtrase de forma estéril.
En la técnica se conocen otras formulaciones farmacéuticas y sistemas de administración y son aplicables a los métodos y composiciones de la invención (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993); y Poznansky et al., Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), pp. 253-315).
Las formulaciones farmacéuticas pueden envasarse en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La "forma de dosificación unitaria", como se usa en este documento, se refiere a dosificaciones unitarias físicamente discretas para la administración al sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto que produce un efecto deseado en combinación con un vehículo o excipiente farmacéutico.
La invención proporciona kits adicionales que incluyen compuestos de la invención y formulaciones farmacéuticas de los mismos, opcionalmente envasados en un material de envasado adecuado. Un kit típicamente incluye una etiqueta o un prospecto que incluye una descripción de los componentes o instrucciones para uso, in vitro, in vivo o ex vivo, de los componentes incluidos en su interior. Un kit puede contener una colección de estos componentes, por ejemplo dos o más compuestos de la invención o un compuesto de la invención en combinación con un agente que daña a los ácidos nucleicos o un agente antiproliferativo.
La expresión "material de envasado" se refiere a una estructura física que alberga a los componentes del kit. El material de envasado puede mantener los componentes de forma estéril y puede estar hecho de un material usado comúnmente para estos fines (por ejemplo, papel, fibra ondulada, vidrio, plástico, papel metálico, ampollas, etc.). La etiqueta o prospecto puede incluir instrucciones escritas apropiadas. Por lo tanto, los kits de la invención además pueden incluir etiquetas o instrucciones para usar los componentes del kit en cualquier método de la invención. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para poner en práctica cualquiera de los métodos de la invención descritos en la presente memoria, incluyendo los métodos de tratamiento, detección, control o diagnóstico. De esta manera, por ejemplo, un kilt puede incluir un compuesto de la invención en un paquete o dispensador junto con las instrucciones para administrar el compuesto en un método de tratamiento de la invención. Las instrucciones pueden incluir además indicaciones de un criterio de valoración clínico satisfactorio o cualquier síntoma adverso que pueda producirse, o la información adicional requerida por las agencias reguladoras tales como la Administración de Alimentos y Fármacos para uso en un ser humano.
Las instrucciones pueden estar "impresas" por ejemplo, en papel o cartón dentro o fijado al kit, o en una etiqueta fijada al kit o al material de envasado, o unida a un vial o un tubo que contiene un componente del kit. Las instrucciones además pueden incluirse en un medio legible por ordenador, tal como un disco (disco flexible o disco duro), CD óptico tal como CD- o DVD-ROM/RAM, cinta magnética, medio de almacenamiento eléctrico tal como RAM y ROM, dispositivos de tipo IC e híbridos de éstos tales como medios de almacenamiento magnético/
óptico.
Los kits de la invención pueden incluir adicionalmente un agente tamponante, un conservante o un agente de estabilización en una formulación farmacéutica. Cada componente del kit puede encerrarse dentro de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden estar dentro de un único envase. Los kits de la invención pueden diseñarse para almacenamiento en frío.
A continuación se indican abreviaturas usadas en la presente memoria:
Cha: ciclohexilalanina.
Phe-2,3,4,5,6-F: los fluoruros están en la posición 2, 3, 4, 5 y 6 en el resto de fenilo de la fenilalanina.
F: Fluoruro.
Bpa: Benzoilfenilalanina.
Nal(2): 2-Naftilalanilo.
Ala(3-Bzt): (3-Benzotienil)alanina.
Nal(1): 1-Naftilalanina.
Dph: Difenilalanina.
Ala(tBu): t-Butilalanilo.
Cys(tBu): t-Butilcisteína.
Phe-3,4,5-F: los fluoruros están en la posición 3, 4 y 5 en el fenilo de la fenilalanina.
Phe-4CF3: CF3 está en la posición 4 en el resto fenilo de la fenilalanina.
Phe-3Br,4Cl,5Br: el bromuro está en la posición 3, el cloruro en la posición 4, y el bromuro está en la posición 5 en el fenilo de la fenilalanina.
Phe-4Cl: el cloruro está en la posición 4 en el fenilo de la fenilalanina
P1, P2, P3, P4, P5, P6, etc., y (P1, P2, P3, P4, P5, P6, etc.); y P7, P8, P9, P10, P11, P12, etc., y (P7, P8,
P9, P10, P11, P12, etc.): secuencia contigua de P1, P2, P3, P4, P5, P6, etc.; y P7, P8, P9, P10, P11, P12,
respectivamente.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un especialista habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria, aquí se describen métodos y materiales
adecuados.
Como se usa en la presente memoria, las formas singulares "una", "la" y "es" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a un "compuesto" incluye una pluralidad de compuestos y la referencia a un "resto" o un "aminoácido" incluye la referencia a uno o más restos y aminoácidos.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Este Ejemplo describe materiales y varios métodos. Este Ejemplo también describe las secuencias de los péptidos/peptidomiméticos analizados.
Agentes químicos y reactivos. La bleomicina se adquirió en Wako Pure Chemical Co. (Osaka, Japón) y se disolvió en H_{2}O destilada a 10 mg/ml. El yoduro de propidio (PI) y la adriamicina se adquirieron en Sigma (St. Louis,
MO).
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Cultivo celular. Una línea celular derivada de leucemia de células T humanas, Jurkat, se cultivó en RPMI 1640 (Sigma) suplementado con suero bovino fetal al 10% (IBL: Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japón) a 37ºC/5% de CO_{2}. La línea celular derivada de cáncer pancreático humano, MIAPaCa2 se cultivó en DMEM con suero bovino fetal al 10% a 37ºC/5% de CO_{2}.
Análisis del ciclo celular. El estado del ciclo celular de las células tratadas con bleomicina o adriamicina se analizó por citometría de flujo como describe Kawabe (1997) Nature 385:454-458. En resumen, se resuspendieron dos millones de células y se incubaron en 200 \mul de solución de Krishan (citrato sódico al 0,1%, 50 \mug/ml de PI, 20 \mug/ml de RNasa A y NP-40 al 5%) durante 1 hora a 4ºC y se analizaron por citometría de flujo, FACScan^{TM} (Beckton Dickinson, Mountain View, CA) con el programa CELLQuest^{TM} (Beckton Dickinson).
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TABLA 1 Secuencias y nombres de códigos correspondientes de péptidos/peptidomiméticos ejemplares 
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1
2
3 
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Ejemplo 2
Este Ejemplo describe datos que indican la actividad de anulación de G2 de diversos péptidos y los efectos de diversas permutaciones de secuencia sobre la actividad incluyendo el efecto de reducir la longitud de la secuencia.
El análisis de citometría de flujo de la anulación del punto de control de G2 se realizó usando la línea de células Jurkat de origen de leucemia humana. En resumen, las células cultivadas se trataron con diversas dosis de péptido/peptidomimético y 40 \mug/ml de bleomicina durante 24 horas. El ADN de las células se tiñó con yoduro de propidio y se analizó por citometría de flujo. Estos resultados se resumen en la Tabla 2.
En las Figuras 1, 5, 6, 7, 8,11 y 12 se muestra una curva de dosis-respuesta de cada péptido/peptidomimético cuando se usó contra células Jurkat tratadas con bleomicina; el eje Y indica el porcentaje de células Jurkat en fase G2/M 24 horas después del tratamiento.
El análisis de citometría de flujo de la anulación del punto de control de la fase M por los compuestos se realizó usando la línea de células Jurkat de leucemia de células T humanas tratada con colchicina (5 \mug/ml o 0,5 \mug/ml) y diversas dosis de péptidos/peptidomiméticos durante 24 horas (Figura 12). El ADN de las células se tiñó y se analizó por citometría de flujo como se ha descrito anteriormente. Estos resultados también se resumen en la Tabla 2.
Las Figuras 2 y 14 muestran curvas de dosis-respuesta de cada péptido/peptidomimético cuando se usó contra células Jurkat tratadas con colchicina; el eje Y indica el porcentaje de células Jurkat en fase G2/M 24 horas después del tratamiento.
TABLA 2 Dosis de compuestos que inducen la anulación del punto de control de G2 o efectos secundarios
4
La "aparición de efectos secundarios cuando se usó solo" indica la dosis de péptido/peptidomimético que produjo una alteración del ciclo de las células Jurkat, es decir, la aparición de cantidades significativas de células SubG1 (células muertas) o células en las que el contenido de ADN varía mas de lo habitual. Por ejemplo, las células en G1 normalmente presentan un pico agudo en el análisis FACS, pero después del tratamiento el pico se hace mas ancho y menor cuando el ciclo celular se altera, lo cual indica una progresión inapropiada del ciclo celular o el inicio de muerte celular. La "dosis de anulación de G2" indica la dosis de péptido/peptidomimético con 40 \mug/ml de bleomicina que produjo una actividad de anulación del punto de control de G2 detectable después del tratamiento durante 24 horas. La "aparición de efectos secundarios cuando se usó con colchicina" indica la dosis de péptido/peptidomimético con 5 \mug/ml de colchicina que produjo una alteración del ciclo de las células Jurkat después del tratamiento durante 24 horas. La actividad de anulación del punto de control de G2 de CBP501 cuando se combinó con cisplatino se estudió en diversas líneas celulares. En resumen, se añadieron simultáneamente cisplatino (3 \mug/ml) y CBP501 (0,4, 2 y 10 \muM) al cultivo celular que se incubó durante 3 horas a 37 grados con 5% de CO_{2}. El medio se aspiró, se añadió más medio sin estos compuestos y las células se incubaron durante 45 horas. Las células, incluyendo las células flotantes, se recogieron usando solución de tripsina-EDTA, se incubaron con solución de Krishan y se analizaron con respecto al contenido de ADN por citometría de flujo como se ha descrito previamente. Estos resultados se resumen en la Tabla 3. El sombreado claro, con la excepción de HUVEC, indica líneas celulares que tienen una pérdida significativa de población de G2 y un aumento de la población subG1, indicando la anulación del punto de control de G2 y la sensibilización al cisplatino por CBP501. La observación de que las células HUVEC, que son células que tienen un punto de control de G1 normal, no se sensibilizaron al menos hasta CBP501 50 \muM, indica que CBP501 es específico para el punto de control de G2 en lugar de no específico.
TABLA 3 Dosis de anulación del punto de control de G2 de CBP501 contra diversas líneas celulares
5
Se estudió la actividad de anulación del punto de control de G2 de diversos compuestos a diferentes dosis sobre la línea celular derivada de cáncer pancreático humano MIAPaCa2 tratada con bleomicina (Bleo) o adriamicina (ADR). En resumen, las células se incubaron con los compuestos y bleomicina (10 \mug/ml) o adriamicina (1 \mug/ml) durante 3 horas. El medio se cambió y se incubó durante 21 horas más. Se tiñó el ADN de las células recogidas con yoduro de propidio y se analizó por citometría de flujo como se ha descrito previamente. El % de población de células sub-G1 se indica como células muertas en la Figura 3. Los resultados indican que CBP501 sensibilizó a las células MIAPaCa2 a bleomicina y adriamicina de una manera dependiente de la dosis.
Las Figuras 4A y 4C son un resumen de la actividad de anulación del punto de control de G2 conseguida con pares de péptidos en los que un resto aminoacídico es diferente del otro. La actividad de anulación del punto de control de G2 de estos péptidos se analizó usando células Jurkat tratadas con bleomicina como se ha descrito anteriormente. La Figura 4B es un resumen del análisis de la actividad de anulación del punto de control de M y/o de la toxicidad no específica realizado con pares de péptidos en los que un resto aminoacídico es diferente del otro. La actividad de anulación del punto de control de M y/o la toxicidad no específica de estos péptidos se analizaron usando células Jurkat tratadas con colchicina como se ha descrito anteriormente.
Se estudió la actividad de anulación del punto de control de G2 de diversas secuencias ricas en arginina a diferentes dosis en células tratadas con bleomicina. En resumen, se añadieron péptidos al medio de cultivo de células Jurkat con bleomicina (40 \mug/ml) a 0,2 \mug/ml, 0,39 \mug/ml, 0,78 \mug/ml, 1,56 \mug/ml, 3,125 \mug/ml, 6,25 \mug/ml, 12,5 \mug/ml, 25 \mug/ml y 50 \mug/ml. Posteriormente, las células se recogieron después de 24 horas, se tiñeron con solución de Krishan y se analizaron por citometría de flujo como se ha descrito previamente. En la Figura 5 se representó el % de células en fase G2/M (eje Y) frente a las dosis de péptidos (eje X). Los datos indican que la secuencia rica en restos básicos "(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:137)" es la mejor secuencia en comparación con secuencias que tienen un número mayor o menor de restos.
Se estudió la actividad de anulación del punto de control de G2 de péptidos sin (D-Bpa) a diferentes dosis sobre células tratadas con bleomicina. En resumen, se añadieron péptidos al medio de cultivo de células Jurkat con bleomicina (40 \mug/ml) a 0,2 \mug/ml, 0,39 \mug/ml, 0,78 \mug/ml, 1,56 \mug/ml, 3,125 \mug/ml, 6,25 \mug/ml, 12,5 \mug/ml, 25 \mug/ml y 50 \mug/ml. Posteriormente, las células se recogieron y se analizaron con citometría de flujo como se ha descrito previamente. En la Figura 6 se representó el porcentaje de células en fase G2/M (eje Y) frente a las dosis de péptidos (eje X). Este resultado indica que la secuencia (Tyr)(Ser)(Pro)(Trp)(Ser)(Phe-2,3,4,5,6F)(Cha) (SEQ ID NO:138) tiene una actividad de anulación del punto de control de G2 comparable con la de la secuencia (Bpa)(Ser)(Trp)(Ser)(Phe-2,3,4,5,6F)(Cha) (SEQ ID NO:139).
Se estudió la actividad de anulación del punto de control de G2 de secuencias ricas en arginina y lisina a diferentes dosis sobre células tratadas con bleomicina. En resumen, se añadieron péptidos al medio de cultivo de células Jurkat con bleomicina (40 \mug/ml) a la dosis indicada (eje X). Las células posteriormente se recogieron y se analizaron por citometría de flujo como se ha descrito previamente. En la figura 7 se representó el porcentaje de células G2/M (eje Y) frente a las dosis de péptidos. Los resultados indican que las secuencias de Arg parecen proporcionar mejor actividad que las secuencias de Lys para la secuencia rica en aminoácidos básicos y que Gln no es esencial para la función de la secuencia.
Se estudió la actividad de anulación del punto de control de G2 de secuencias en las que se varía la localización de la región rica en arginina. En resumen, se añadieron péptidos al medio de cultivo de células Jurkat con bleomicina (40 \mug/ml) a la dosis indicada (eje X) durante 24 horas. Las células posteriormente se recogieron y se analizaron por citometría de flujo como se ha descrito previamente. En la Figura 8 se representó el porcentaje de células en fase G2/M (eje Y) frente a las dosis de péptidos.
Los datos indican que la actividad de anulación de G2 de los péptidos no se altera significativamente cambiando la localización de la región rica en arginina. Además, CBP501 era soluble en agua, mientras que CBP511 no. Esta diferencia puede ser ventajosa para sistemas de administración de fármaco particulares ya que algunos sistemas prefieren compuestos insolubles en agua.
La Figura 9 ilustra un resumen del análisis realizado con diversos pares de péptidos en los que sólo un resto aminoacídico era diferente entre los pares. La actividad de anulación del punto de control de G2 de éstos péptidos se analizó usando células Jurkat tratadas con bleomicina como se ha descrito.
El tamaño, carga e hidrofobia de cada aminoácido determina la eficacia con la que la secuencia se ajusta a una molécula diana. La cadena lateral del péptido o peptidomimético se movería libremente, de forma que incluso con una o dos cadenas laterales desfavorables el péptido o peptidomimético se podría ajustar a una cavidad o ranura de la molécula diana. El resumen indica que hay tamaños preferibles para cada cadena lateral, lo que sugiere el tamaño de la región de unión (cavidad o ranura) de la proteína diana para cada cadena lateral. Por ejemplo, las cadenas laterales con una estructura de anillo tales como benceno, indol y ciclohexano determinan la resistencia de la anulación de G2 o la anulación de M y/o la toxicidad no específica; véanse las Figuras 9 y 4, donde estructuras de anillo mayores de 5 miembros afectan a la actividad de anulación de G2 (un tamaño moderado en P1 y P2 aumenta la actividad de anulación de G2, mientras que una estructura demasiado grande (P1, P5 y P6) aumenta la anulación de M y/o la toxicidad no específica).
Las cadenas laterales sin una estructura de anillo parecen neutras. De esta forma, para conseguir una mejor actividad se desea una estructura de anillo de tamaño apropiado en P1, P2, P4 y P6, y ninguna estructura de anillo en P3 y P5 o una estructura de anillo con menos de 6 miembros. Un anillo apropiado para P1, P2 y P6 es un anillo de 1 a 6 miembros obtenido por fusión de dos anillos con 5 ó 6 miembros. En el caso de P4, un anillo de tamaño apropiado es una fusión de dos anillos, teniendo cada uno de ellos 5 ó 6 miembros. De esta manera, en el caso de P1, Cha o Nal(2) parecen ser los mejores; en el caso de P2, parecen ser mejores Phe-2,3,4,5,6F, Phe-3,4,5F o Phe-CF3. Estos tamaños de cadenas laterales indican que hay dos cavidades o una sola cavidad de mayor tamaño en la molécula diana donde interacciona esta región. En el caso de P3 y P5 es aceptable una cadena lateral pequeña tal como Ser o Pro y también es aceptable una cadena lateral de mayor tamaño tal como Arg, indicando que no hay ninguna cavidad en esta región de la molécula diana, de forma que las cadenas laterales pueden ponerse de forma opuesta a la diana. Sin embargo, es posible que una estructura de anillo permita que el péptido o peptidomimético interaccione con otra molécula (es decir, otra distinta a la molécula diana) lo cual, a su vez, puede aumentar los efectos secundarios. En el caso de P6, Bpa o Ser-Tyr parecen mejores que Tyr sola o una cadena de menor tamaño, lo que indica una ranura mas profunda que se sitúa horizontalmente en la diana. También puede haber una cavidad menos profunda y más ancha para P4 en la diana basándose en los tamaños de los restos para P4.
Los siguientes péptidos se analizaron usando Jurkat y bleomicina como se ha descrito. Las secuencias de los péptidos son las siguientes: CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:80); CBP700, (d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:96); CBP701, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3_{,}4,5,6-F)(d-Cha)
(SEQ ID NO:97); CBP702, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:98); y CBP703, (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:99). Los resultados indican que CBP700, 701, 702, 703, aunque son mas cortos que los otros péptidos ejemplificados, mantienen la actividad de anulación del punto de control de G2 de forma comparable a otros péptidos que tienen una actividad de anulación del punto de control de G2 significativa (Figura 11).
Se realizó una comparación entre la actividad de anulación del punto de control de G2 y la toxicidad no específica (anulación del punto de control de M) por CB501. En resumen, se trataron células Jurkat con 40 \mug/ml de bleomicina o 0,5 \mug/ml de colchicina para la actividad de anulación del punto de control de G2 y la toxicidad no específica, respectivamente. La cantidad de ADN en cada una de las células tratadas se analizó por citometría de flujo, como se ha descrito previamente. Los datos indican que el punto de control de G2 se anuló de una forma dependiente de la dosis para CBP501 mientras que la toxicidad no específica estaba ausente en una cantidad de hasta 50 \muM de péptido, como se determina por el porcentaje sin cambios de células detenidas en fase M (Figura 12).
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Ejemplo 3
Este Ejemplo describe la actividad de inhibición de quinasa de péptidos/peptidomiméticos y el análisis de estabilidad en suero de diversos péptidos.
Como dos quinasas, Chk1 y Chk2, son importantes para el mecanismo del punto de control de G2, se realizó un análisis de inhibición de quinasa para las dos enzimas. El análisis de inhibición de quinasa in vitro se realizó usando "Ensayos de Proteína Quinasa No Radiactiva PepTag®^{)}", de Promega, de acuerdo con el protocolo de la compañía, con la excepción de que se usó la quinasa CHK2 purificada en lugar de PKC. Se adquirió PKC purificada en Upstate Biotechnology, Inc. Estos resultados se muestran en la Tabla 4A.
TABLA 4A Análisis de inhibición de quinasa de los compuestos
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Se realizó un análisis de inhibición de quinasa in vitro por CycLex, Co. Ltd., Nagano, Japón. En resumen, como quinasas se usaron Chk1 de longitud completa humana recombinante derivada de baculovirus con una señal de histidina o Chk2 de longitud completa humana recombinante derivada de E. coli fusionada con GST. Como sustrato se usó GST-Cdc25C (aminoácidos 167-267) recombinante derivada de E. coli. Las condiciones de reacción fueron Hepes-KOH 20 mM (pH 7,5), DTT 1 mM, BSA a 80 \mug/ml, MgCl_{2} 10 mM y ATP 50 mM a 30 grados durante 60 minutos. La fosforilación de la serina 216 en GST-Cdc25C se detectó por el anticuerpo anti-Cdc25C-S216 fosforilado con un inmunoensayo ligado a enzimas. Estos resultados se muestran en la Tabla 4B.
TABLA 4B Análisis de inhibición de quinasa de péptidos
7
Los datos indican que se produce tanto inhibición de la quinasa Chk1 como inhibición de la quinasa Chk2 a una dosis mayor que la dosis de anulación de G2 (los valores de CI_{50} para la anulación de G2 por CBP500, 501, 505, 506, 603 son menores de 1 \muM). Estos resultados sugieren que estos péptidos tienen un mecanismo de acción además de la inhibición de las moléculas de Chk1l/2. Como alternativa, los péptidos posiblemente se acumulan dentro de las células de tal forma que su concentración sea mayor dentro de las células que en el medio circundante.
Se realizó un análisis en suero para determinar la estabilidad de los péptidos en suero de ratón y humano. En resumen, se incubaron péptidos (10 mM o 2,5 mM) con suero humano recién preparado a 37 grados durante 1 hora. Se incubó CBP501 (10 mM) con suero de ratón recién preparado durante 1 hora a 37 grados. Se trataron células Jurkat con el suero con o sin péptidos y bleomicina (40 \mug/ml) y se incubaron durante 24 horas. La población de las células en fase G2 se determinó por citometría de flujo como se ha descrito previamente. La actividad de anulación del punto de control de G2 residual de los péptidos tratados con suero se determinó comparando el porcentaje de células G2 del suero tratado y la curva patrón producida con péptidos tratados con medio, bleomicina y células Jurkat (Tabla 5A). La cantidad de residual de CBP501 se determinó con HPLC después de la desproteinización por tratamiento con etanol (Tabla 5B). Los datos indican que los péptidos con aminoácidos de tipo d tales como CBP501 y CBP603 son mas estables en suero que los péptidos con aminoácidos de tipo l tales como CBP413.
TABLA 5A Análisis de tratamiento con suero humano
8 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5B Análisis de tratamiento con suero de ratón
9
Ejemplo 4
Este Ejemplo describe la actividad contra la proliferación celular de CBP501 en células cultivadas. Este Ejemplo también describe datos que demuestran la actividad in vivo de los péptidos/peptidomiméticos.
Para demostrar la actividad contra la proliferación celular de los compuestos, se trataron células de carcinoma pancreático humano MIAPaCa2 cultivadas con CBP501 (10 \mumM), cisplatino (1, 3 ó 9 \mug/ml) y oxaliplatino (1, 3 ó 9 \mug/ml) solos y en combinación. En resumen, las células se cultivaron a 300 células/pocillo en placas de 6 pocillos, se incubaron durante una noche y se trataron con los compuestos durante tres horas. El medio se cambió y se cultivó durante 10 días más. Posteriormente, las células se fijaron con metanol al 70%, se tiñeron con violeta de cristal al 0,1% y se visualizaron. Los resultados del análisis de formación de colonias indicaron que el CBP501 aumentaba la actividad citotóxica del cisplatino y el oxaliplatino contra células MIAPaCa2.
Se realizaron estudios similares usando células endoteliales de vena umbilical humana normales (HUVEC). Como las células normales no forman colonias, se cultivaron a 3000 células/pocillo en lugar de 300 células/pocillo. Los resultados indican que el péptido por sí mismo no alteraba el crecimiento de las células normales ni aumentaba la actividad citotóxica del cisplatino y oxaliplatino hacia las células. Por lo tanto, los péptidos no parecen presentar una actividad de anulación de G2 significativa contra células normales sometidas a un tratamiento que daña a los ácidos nucleicos, a diferencia de las células hiperproliferativas tales como células cancerosas, que se sensibilizan frente al tratamiento que daña a los ácidos nucleicos. Los resultados indican la especificidad del péptido en la sensibilización de las células en proliferación pero no en las células normales frente al tratamiento que daña a los ácidos nucleicos.
TABLA 6 Análisis de inhibición del crecimiento de MIAPaCa2 usando azul alamar
10
El análisis con azul alamar se realizó para analizar la actividad inhibidora del crecimiento de CBP501 con y sin cisplatino. En resumen, se expusieron células MIAPaCa2 a una concentración de 1, 3, 10, 30 y 100 \muM de cisplatino o a una concentración 0,22, 0,67, 2, 6 y 18 \muM de CBP501 con o sin cisplatino 10 \muM durante tres horas en placas de 96 pocillos a 2500 células/pocillo por duplicado. El medio se cambió y se incubó durante 24, 48 ó 72 horas más. Después de la incubación, se añadieron 20 \mul de reactivo azul alamar al 90% a cada pocillo durante otras 6 horas para detectar la viabilidad celular por intensidad de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia se midió usando un lector de placas Spectrafluor Plus con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Se calculó el valor de CI_{50} (Tabla 6).
Este estudio indica que CBP501 solo inhibe el crecimiento celular mejor que el cisplatino en una dosis molar. CBP501 reprimió el crecimiento celular a una dosis mucho menor cuando se combinó con una concentración 10 \muM de cisplatino, que es aproximadamente la dosis de cisplatino usada para el tratamiento de cánceres. Además, la actividad se supresión del crecimiento de CBP501 fue mayor que la del cisplatino; la CI_{50} a las 72 horas fue mucho mejor cuando se usó CBP501 en comparación con el cisplatino.
La vida media in vivo de CBP501 se determinó cuantificando CBP501 en suero de ratón 1, 3 y 6 horas después de la inyección intraperitoneal de CBP501 (40 mg/kg). La cantidad residual de CBP501 intacto se determinó con HPLC después de desproteinizar el suero de ratón extraído de ratones inyectados con tratamiento con etanol (Tabla 7).
TABLA 7 Vida media in vivo de CBP501
11
Para determinar la tolerancia a péptidos, se inyectaron por vía intravenosa grupos de diez ratones una vez con CBP501 (5, 8 ó 10 mg/kg) o se inyectaron por vía intraperitoneal una vez con CBP501 (50, 80 ó 100 mg/kg). Los ratones inyectados se observaron durante una semana para determinar su supervivencia (Tabla 8).
TABLA 8 Dosis máxima tolerada en ratones por medio de una sola inyección
12
Para estudiar la eficacia in vivo de los compuestos, se implantaron células de carcinoma pancreático humano MIAPaCa2 por vía subcutánea en ratones SCID. El tratamiento se inició cuando el tamaño del tumor primario alcanzó 0,1 cm^{3} (Día 0) o mas, por ejemplo, 7 u 8 mm de diámetro. Se administraron por vía intraperitoneal CDDP (3 mg/kg) y CBP 501 (10 ó 40 mg/kg) solos o en combinación. Los tamaños de los tumores se midieron usando calibres tres veces por semana y los volúmenes se calcularon usando la fórmula: peso (mg) = [anchura (mm) 2 x longitud (mm)]/2. Se representan los tamaños medios de los tumores para cada grupo de tratamiento (n=4) contra los días después del inicio del tratamiento (Figura 10).
Los resultados indican que tratamientos con CBP501 solo reprimen el crecimiento de las células de cáncer pancreático humano in vivo. Los resultados indican además que CBP501 aumentó la actividad anti-tumoral del cisplatino.

Claims (48)

1. Una secuencia contigua de péptido o peptidomimético que comprende la siguiente estructura:
P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:2); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:4); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:7); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:8); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:10); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:12);
donde P1 es Cha;
donde P2 es (Phe-2,3,4,5,6-F), Bpa o Phe_{4}NO_{2};
donde P3 es cualquier aminoácido;
donde P4 es Trp;
donde P5 es cualquier aminoácido;
donde P6 es Bpa o Phe_{4}NO_{2}; y
donde al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11 y P12 son aminoácidos básicos siendo el resto cualquier aminoácido o estando ausente.
2. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, que comprende la siguiente estructura:
P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:18);
donde P2 es (Phe-2,3,4,5,6-F).
3. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, donde P2 es (Phe-2,3,4,5,6-F) o Phe_{4}NO_{2}.
4. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, donde P2 es (Phe-2,3.4,5,6-F).
5. La secuencia de péptido o peptidomimético de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde P3 o P5 es Ser.
6. La secuencia de péptido o peptidomimético de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde P6 es Bpa.
7. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, donde P2 es Phe_{4}NO_{2}.
8. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1 que comprende la siguiente estructura:
P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:22);
donde P3 es Ser, Arg, Cys, Pro o Asn; y
donde P5 es Ser, Arg o Asn.
9. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, que comprende la siguiente estructura:
P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:25); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:26); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:28); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:30);
donde P3 es Ser, Arg, Cys, Pro o Asn;
donde P5 es Ser, Arg o Asn; y
donde al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11, P12 son Arg o Lys, siendo el resto cualquier aminoácido o estando ausente.
10. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, que comprende la siguiente estructura:
P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:36);
donde P3 es Ser;
donde P5 es Ser o Asn;
donde al menos tres de P7, P8, P9, P10, P11, P12 son Arg, siendo el resto cualquier aminoácido o estando ausente.
11. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, que comprende la siguiente estructura:
P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:40);
donde P3 es Ser; y
donde P5 es Ser.
12. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, que comprende la siguiente estructura:
P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:42); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:45); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:46); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:48); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:50);
donde P4 es d- o l-Trp;
donde P6 es Bpa;
donde P7 es Arg;
donde P8 es Arg;
donde P9 es Arg;
donde P10 es Gln o Arg;
donde P11 es Arg; y
donde P12 es d- o l-Arg.
13. La secuencia de péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 12, donde P3 o P5 es Ser o Pro.
14. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, que comprende la siguiente estructura:
P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:56);
donde P3 es Ser;
donde P5 es Ser;
donde P6 es Bpa;
donde P7 es Arg;
donde P8 es Arg;
donde P9 es Arg;
donde P10 es Gln o Arg;
donde P11 es Arg; y
donde P12 es Arg.
15. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, que comprende la siguiente estructura:
(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEC ID: Nº: 80);(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4, 5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:100); (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg) (d-GIn)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:59); (d-Arg)(d-Arg)(d-GIn)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6F)(d-Cha) (SEQ ID NO:60); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:67); (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:68); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:71); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:73).
16. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, que comprende la siguiente estructura:
(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-GIn)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:77).
17. La secuencia de péptido o peptidomimético de la reivindicación 1, que comprende la siguiente estructura:
(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:101).
18. La secuencia de péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde
(a)
uno o mas restos son de tipo l; o
(b)
uno o más restos son de tipo d.
19. La secuencia de péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, donde un resto d se sustituye por un resto l.
20. La secuencia de péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde
(a)
la secuencia inhibe la proliferación de una célula;
(b)
la secuencia anula el punto de control de G2 del ciclo celular de una célula.
21. La secuencia de péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde la secuencia tiene una longitud de 6 a 12, de 10 a 20, de 18 a 25, de 25 a 100, de 25 a 200 o de 50 a 300 restos.
22. Una composición que comprende la secuencia de péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un agente que daña a los ácidos nucleicos o un agente antiproliferativo.
23. Una composición farmacéutica que comprende la secuencia de péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
24. Una composición farmacéutica que comprende la secuencia de péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un agente que daña a los ácidos nucleicos o un agente antiproliferativo.
25. Un kit que comprende la secuencia de péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 e instrucciones de uso.
26. El kit de la reivindicación 25, donde las instrucciones de uso incluyen las instrucciones para inhibir la proliferación celular en combinación con un tratamiento que daña a los ácidos nucleicos.
27. El kit de la reivindicación 25 ó 26, que comprende además un agente que daña a los ácidos nucleicos o un agente antiproliferativo.
28. Un método in vitro para inhibir la proliferación de una célula, que comprende poner en contacto una célula con una cantidad de un péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1a 17 suficiente para inhibir la proliferación de la célula, donde dicha célula no es una célula embrionaria humana.
29. Un método in vitro para aumentar la sensibilidad de una célula a un agente o tratamiento que daña a los ácidos nucleicos, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad de un péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 suficiente para aumentar la sensibilidad de la célula al agente o tratamiento que daña a los ácidos nucleicos, donde dicha célula no es una célula embrionaria humana.
30. Un método in vitro para aumentar las lesiones en los ácidos nucleicos de una célula, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad de un péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 suficiente para aumentar las lesiones en los ácidos nucleicos de la célula, donde dicha célula no es una célula embrionaria humana.
31. El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, que comprende además poner en contacto la célula con un agente que daña a los ácidos nucleicos o exponer la célula a un tratamiento que daña a los ácidos nucleicos.
32. El método in vitro de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, donde la célula es una célula cultivada.
33. El uso de una cantidad de péptido o peptidomimético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 eficaz para tratar un trastorno de la proliferación celular, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno de la proliferación celular.
34. El uso de la reivindicación 33, en el que el trastorno de la proliferación celular se localiza en la sangre, mama, pulmón, tiroides, cabeza o cuello, cerebro, linfa, tracto gastrointestinal, nasofaringe, tracto genitourinario, vejiga, riñón, páncreas, hígado, hueso, músculo o piel.
35. El uso de la reivindicación 33 ó 34, donde la composición farmacéutica se va a administrar local, regional o sistémicamente.
36. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, donde el trastorno de la proliferación celular comprende un tumor sólido o líquido benigno o maligno.
37. El uso de la reivindicación 36, donde el tumor es metastásico o no metastásico.
38. El uso de la reivindicación 36, donde el tumor sólido comprende un sarcoma o carcinoma.
39. El uso de la reivindicación 36, donde el tumor liquido comprende un cáncer hematopoyético.
40. El uso de la reivindicación 39, donde el cáncer hematopoyético comprende un mieloma, linfoma o leucemia.
41. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, donde el tratamiento produce una mejoría del estado del sujeto.
42. El uso de la reivindicación 41, donde la mejoría comprende una reducción de la proliferación celular, reducción del número de células, inhibición del aumento de la proliferación celular, inhibición del aumento del número de células, aumento de apoptosis o disminución de la supervivencia, de al menos una parte de las células que constituyen el trastorno de la proliferación celular.
43. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, donde la composición farmacéutica comprende además un agente que daña a los ácidos nucleicos, un tratamiento que daña a los ácidos nucleicos o un agente antiproliferativo.
44. El uso de la reivindicación 43, donde el agente comprende un fármaco o un radioisótopo, o el tratamiento que daña a los ácidos nucleicos comprende radiación o choque ambiental.
45. El uso de la reivindicación 44, donde el fármaco comprende un fármaco quimioterapéutico.
46. El uso de la reivindicación 45, donde el fármaco comprende 5-fluorouracilo (5-FU), rebecamicina, adriamicina (ADR), bleomicina (Bleo), pepleomicina, un derivado de cisplatino o camptotecina (CPT).
47. El uso de la reivindicación 46, donde el derivado de cisplatino comprende cisplatino (CDDP) u oxaliplatino.
48. El uso de la reivindicación 44, donde
(a)
el radioisótopo comprende I^{131},l^{125}, ^{90}Y, ^{177}Lu, ^{213}Bi o ^{211}At;
(b)
la radiación comprende, radiación UV, radiación IR o radiación alfa, beta o gamma; o
(c)
el choque ambiental comprende hipertermia.
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