CN108218898A - 一种新型靶向溶酶体的次氯酸比率荧光探针的制备及应用 - Google Patents

一种新型靶向溶酶体的次氯酸比率荧光探针的制备及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108218898A
CN108218898A CN201710442230.7A CN201710442230A CN108218898A CN 108218898 A CN108218898 A CN 108218898A CN 201710442230 A CN201710442230 A CN 201710442230A CN 108218898 A CN108218898 A CN 108218898A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
hypochlorous acid
fluorescence
lysosome
hypochlorous
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710442230.7A
Other languages
English (en)
Inventor
申世立
曹晓群
葛燕青
董建
吉瑞雪
刘爱坤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Taishan Medical University
Original Assignee
Taishan Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Taishan Medical University filed Critical Taishan Medical University
Priority to CN201710442230.7A priority Critical patent/CN108218898A/zh
Publication of CN108218898A publication Critical patent/CN108218898A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新型溶酶体靶向的比率型次氯酸荧光探针的制备及应用。探针是以硫代双酰肼结构作为次氯酸的响应基团，咪唑并[1,5‑a]吡啶荧光团作为能量供体，罗丹明荧光团作为能量受体，基于荧光共振能量转移机理的比率型荧光探针。该探针可高选择性、高灵敏地与次氯酸作用。当有次氯酸存在时，探针的硫代酰肼结构被氧化，罗丹明的螺环结构变成开环结构，探针同时发射咪唑并[1,5‑a]吡啶（465 nm）和罗丹明（585 nm）的荧光，二者的比值（I585/I465）与次氯酸浓度在一定范围内（0‑5 μM）呈良好的线性关系。探针可用于检测溶酶体内次氯酸的变化，具有广阔的应用前景。

Description

一种新型靶向溶酶体的次氯酸比率荧光探针的制备及应用
技术领域
本发明涉及一种基于FRET机理的靶向溶酶体次氯酸比率荧光探针的制备及应用，该探针可以用于检测细胞内次氯酸浓度的变化。
背景技术
生物体内的活性氧如过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（•OH）、单线态氧（1O2）、次氯酸（HOCl），在许多生理活动中起着重要的作用。其中，HOCl是过氧化氢与氯离子在髓过氧化物酶（MPO）的催化下产生的，可以对细菌的入侵起到防御作用，是生物体自身的天然杀菌剂。然而，生物体内HOCl不受控制的产生可能与一些疾病密切相关。因此，生物体内HOCl的检测是一项意义重大的课题。
为探究HOCl在细胞活动中的生理功能，发展生物体内即时性检测HOCl的技术尤为重要。在众多分析方法中，荧光探针因灵敏度高、选择性好、对生物体损伤小及膜透性好等优势而备受科学家们的青睐。
大多数探针是基于单荧光团发射，其检测结果易受探针浓度和溶剂极性的影响；而比率荧光探针拥有双荧光发射，具备自身修正功能，能够较好地消除外界环境的干扰。构建比率荧光探针的常用策略是荧光共振能量转移（FRET）原理，此类型的荧光探针能减少测量误差，提高结果的准确性。
文献报道的具有靶向功能的次氯酸探针多为靶向线粒体 [Hou, J. T. et al,Chem. Commun. 2015, 51, 6781-6784; Hou, J. T. et al, Chem. Commun. 2014, 50,8640-8643; Xiao, H. D. et al, J. Mater. Chem. B 2015, 3, 1633-1638; Li, D. X.et al, Sens. Actuators B 2016, 222, 483-491]，而溶酶体靶向的次氯酸荧光探针报道很少[Yuan, L. et al, J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 5930-5938; Ren, M. G. etal, J. Mater. Chem. B 2016, 4, 4739-4745; Zhu, B. C. et al, Anal. Chem. 2016,88, 12532-12538]。
基于此，发明人设计以罗丹明结构为能量受体，咪唑并[1,5-a]吡啶为能量供体，硫代酰肼结构为次氯酸响应基团，构建了基于FRET机理的比率型次氯酸荧光探针。探针具有靶向溶酶体的功能，并被应用于细胞内次氯酸浓度的测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向溶酶体的比率型次氯酸荧光探针的制备及应用。
本发明公开一种靶向溶酶体的比率型次氯酸荧光探针，具有如下结构（RIM）：
本发明的另一目的在于提供所述比率型次氯酸荧光探针在检测细胞内次氯酸浓度变化的荧光成像方面的应用。
本发明所述检测细胞内次氯酸的荧光探针的制备方法为（图1）。
本发明所述次氯酸荧光探针可以高选择性和高灵敏度地与次氯酸作用。
上述的次氯酸比率探针在检测含次氯酸样品中的应用，其中所述含次氯酸样品为次氯酸水溶液和生物细胞。
当有次氯酸存在时，探针分子中的硫代酰肼结构被氧化，罗丹明的螺环结构变成开环结构，探针同时发射咪唑并[1,5-a]吡啶（465 nm）和罗丹明结构（585 nm）的荧光。随着次氯酸浓度的增加，585 nm处的荧光逐渐增强，而465 nm处的荧光强度也增强，二者的比值（I585/I465）与次氯酸浓度在一定范围内（0-5 μM）呈良好的线性关系，见图2。
配制上述次氯酸探针的乙醇与PBS（0.01 M）缓冲溶液（V/V = 3:7，pH 6.00）的溶液。分别加入一定量活性氧/活性氮物种，然后对上述样品进行荧光测试分析，结果表明探针对次氯酸有良好的选择性，见图3。
用上述探针孵育小鼠巨噬细胞（RAW264.7细胞），然后用LPS处理细胞后进行成像，探针的绿红荧光强度之比明显降低，因此上述探针可以用于内源性次氯酸的检测，见图4。
用LPS处理RAW264.7细胞后，再分别用上述探针和商品化的溶酶体染料LysoTracker Deep Red继续孵育，然后进行成像分析，由图5的重叠情况可知，探针能够靶向溶酶体。
综上所述，本发明所述的一种溶酶体靶向的比率型次氯酸荧光探针，合成方法简单，不仅可以高灵敏地检测溶液中的次氯酸，而且可以用于细胞溶酶体内次氯酸的检测，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明探针的合成路线。
图2是本发明探针在不同次氯酸浓度时的荧光变化。图2（a）是荧光发射图谱；图2（b）是荧光强度比值I585/I465在不同当量次氯酸时的变化情况。
图3是本发明探针对HOCl及生物体内其他常见物种的选择性。
图4是本发明探针对RAW264.7细胞内源性HOCl的荧光成像。图4（a）为LPS处理前后探针在细胞内的荧光发射情况；图4（b）是通过Image J得到的绿光与红光比值的量化结果。
图5是本发明探针在RAW264.7细胞内的共定位分析。图5（a）为探针绿色通道（410-520 nm）收集到的荧光图像；图5（b）为Lyso Tracker Deep Red的荧光图像；图（c）为（a）、（b）的叠加图；图（d）为亮场图像；共定位系数为0.92。
具体实施方法
实施例1：探针的合成路线如下：
将化合物1（1 mmol）、劳森试剂（1 mmol）和40 mL甲苯置于100 mL圆底烧瓶中加热回流4小时，然后减压蒸馏除去溶剂，得深红色固体化合物2（未分离提纯，直接用于下一步反应）。
将化合物3（1 mmol）和5 mL SOCl2置于25 mL圆底烧瓶中，常温搅拌4小时，然后减压蒸馏除去溶剂，得黄色固体化合物4。将10 mL干燥二氯甲烷和0.5 mL三乙胺加入反应瓶中得黄色溶液，然后将该溶液加入到上述固体化合物2中，室温搅拌5小时后，柱层析（二氯甲烷：甲醇 = 50：1）纯化，得到黄色固体即是本发明所述次氯酸荧光探针。
以1H NMR、13C NMR及HRMS对其进行表征，数据如下：
1H NMR (400 MHz, d 6-DMSO), δ (ppm): 0.89 (t, 3H, J = 7.4 Hz, CH2CH2CH2 CH 3 ), 1.06 (t, 6H, J = 6.8 Hz, NCH2 CH 3 ), 1.30 (m, 2H, CH2), 1.67 (m, 2H,CH2), 2.92 (t, 2H, J = 7.4 Hz, CH2), 3.25 (br, 4H, N(CH 2 CH2)2), 3.31 (m, 4H,NCH 2 CH3 ), 3.64 (br, 4H, CON(CH 2 CH2)2), 5.36 (s, 2H, NNH2), 6.18 (d, 1H, J =8.4 Hz, ArH), 6.23 (d, 1H, J = 8.4 Hz, ArH), 6.36 (d, 2H, J = 9.2 Hz, ArH),6.65 (d, 1H, J = 9.2 Hz, ArH), 6.73 (d, 2H, J = 6.0 Hz, ArH), 7.03 (d, 1H, J= 6.8 Hz, ArH), 7.50 (m, 3H, ArH), 7.88 (d, 1H, J = 7.2 Hz, ArH), 8.26 (d,1H, J = 7.2 Hz, ArH).
13C NMR (100 MHz, d 6-DMSO), δ (ppm): 181.3, 167.1, 152.7, 152.5, 151.7,149.1, 148.7, 138.4, 135.8, 132.1, 128.8, 127.7, 125.9, 123.8, 123.2, 122.9,122.3, 118.2, 115.6, 111.9, 111.7, 108.6, 102.9, 101.9, 97.3, 72.4, 63.0,43.7, 41.5, 28.6, 25.2, 21.7, 13.7, 12.4.
HRMS m/z: calcd for C40H43ClN7O2S [M+H]+: 720.2887; found: 720.2896.
实施例2：本发明所述探针与不同浓度次氯酸作用的荧光分析。
配制11份10 mL的2 μM探针的PBS缓冲溶液（含30%乙醇，pH 6.00）。分别向上述缓冲溶液中加入0 μM、0.5 μM、1.0 μM、1.5 μM、2.0 μM、2.5 μM、3.0 μM、3.5 μM、4.0 μM、4.5μM、5.0 μM的次氯酸溶液，然后进行荧光分析，λex = 370 nm。结果见图2。
实施例3：本发明所述探针的选择性。
配制16份10 mL的2 μM探针的PBS缓冲溶液（含30%乙醇，pH 6.00）。分别加入一定量的细胞内活性物质，然后对上述样品进行荧光测试分析，结果见图3。1：空白, 2：H2O2, 3：t-BuOOH, 4：t-BuO•, 5：1O2, 6：-O2, 7：ON, 8：NO2 -, 9：ONOO-, 10：•OH, 11：AcO-, 12：Br-,13：Cl-, 14：I-, 15：CO3 2-, 16：SO4 2-, 17：HOCl。活性氧/活性氮的浓度均为40 µM，阴离子浓度均为50 µM。
实施例4：
先用1 μg/mL LPS刺激细胞6小时，随后加入1 μg/mL PMA继续培养30分钟，随后在无血清培养基中加入1 μM本发明所述探针，培养30分钟；细胞分别用PBS洗3遍，使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，收集410-520 nm和560-700 nm的荧光，并统计两个光的比值。在无血清培养基中加入1 μM探针，培养30分钟；细胞分别用PBS洗3遍，再进行荧光成像，收集410-520 nm；560-700 nm的荧光，并统计两个光的比值，结果见图4。
实施例5：
先用1 μg/mL LPS刺激细胞6小时，随后加入1 μg/mL PMA继续培养30分钟，随后在无血清培养基中加入本发明所述探针1 μM，培养30分钟；再加入溶酶体标记物Lyso TrackerDeep Red 继续孵育30分钟。细胞分别用PBS洗3遍，使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，分别收集410-520 nm波段的荧光成像照片，同时收集Lyso Tracker Deep Red的荧光照片。然后进行叠加分析,计算共定位系数，见图5。

Claims (4)

1.本发明的目的在于提供一种靶向溶酶体的比率型次氯酸荧光探针（RIM）的制备及应用。
2.其化学结构式如下所示，
如权利要求1所述探针在检测含次氯酸样品中的应用。
3.如权利要求1所述含次氯酸样品是含有次氯酸的溶液、生物细胞。
4.如权利要求1所述探针在检测溶酶体内次氯酸的应用。
CN201710442230.7A 2017-06-13 2017-06-13 一种新型靶向溶酶体的次氯酸比率荧光探针的制备及应用 Pending CN108218898A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710442230.7A CN108218898A (zh) 2017-06-13 2017-06-13 一种新型靶向溶酶体的次氯酸比率荧光探针的制备及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710442230.7A CN108218898A (zh) 2017-06-13 2017-06-13 一种新型靶向溶酶体的次氯酸比率荧光探针的制备及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108218898A true CN108218898A (zh) 2018-06-29

Family

ID=62656664

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710442230.7A Pending CN108218898A (zh) 2017-06-13 2017-06-13 一种新型靶向溶酶体的次氯酸比率荧光探针的制备及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108218898A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109232615A (zh) * 2018-11-02 2019-01-18 泰山医学院 一种跨键能量转移型次氯酸荧光探针及其在溶酶体次氯酸检测中应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105017271A (zh) * 2015-07-21 2015-11-04 山东大学 一种次氯酸荧光比率探针及其应用
CN105086998A (zh) * 2015-09-08 2015-11-25 济南大学 一种溶酶体靶向次氯酸分子荧光探针及其制备方法和应用
CN105567216A (zh) * 2015-10-27 2016-05-11 西北大学 一类溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用
CN105884740A (zh) * 2016-05-16 2016-08-24 山东师范大学 一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法和应用
CN106518860A (zh) * 2016-11-07 2017-03-22 山东大学 一种基于荧光共振能量转移机理的靶向线粒体的次氯酸比例荧光探针及其应用
CN106632363A (zh) * 2016-11-07 2017-05-10 山东大学 一种线粒体靶向比率型次氯酸荧光探针及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105017271A (zh) * 2015-07-21 2015-11-04 山东大学 一种次氯酸荧光比率探针及其应用
CN105086998A (zh) * 2015-09-08 2015-11-25 济南大学 一种溶酶体靶向次氯酸分子荧光探针及其制备方法和应用
CN105567216A (zh) * 2015-10-27 2016-05-11 西北大学 一类溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用
CN105884740A (zh) * 2016-05-16 2016-08-24 山东师范大学 一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法和应用
CN106518860A (zh) * 2016-11-07 2017-03-22 山东大学 一种基于荧光共振能量转移机理的靶向线粒体的次氯酸比例荧光探针及其应用
CN106632363A (zh) * 2016-11-07 2017-05-10 山东大学 一种线粒体靶向比率型次氯酸荧光探针及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU Y. ET AL: ""A ratiometric fluorescent probe based on boron dipyrromethene and rhodamine Forster resonance energy transfer platform for hypochlorous acid and its application in living cells"", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 *
李美含等: ""溶酶体荧光探针研究新进展"", 《有机化学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109232615A (zh) * 2018-11-02 2019-01-18 泰山医学院 一种跨键能量转移型次氯酸荧光探针及其在溶酶体次氯酸检测中应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105524612B (zh) 一种异佛尔酮类荧光探针及其制备与应用
CN106632363B (zh) 一种线粒体靶向比率型次氯酸荧光探针及其应用
CN108129459B (zh) 一种用于检测二氧化硫的新型荧光探针及其应用
CN108398409B (zh) 一种荧光比率检测次氯酸根的方法
CN107298654A (zh) 一种检测内质网中硫化氢的荧光探针
CN105295899B (zh) 一种检测硫化氢的比率荧光探针及其应用
CN106967102B (zh) 一种基于罗丹明衍生物的过氧化氢增强型荧光探针
CN104974743A (zh) 一种荧光探针及其在检测细胞溶酶体内次氯酸中的应用
CN109336815B (zh) 一种检测细胞内质网内次氯酸的双光子荧光探针
CN108276990A (zh) 一种区分GSH、Cys、NAC荧光探针及其制备方法和应用
CN110256513A (zh) 一种FRET-ICT型β-半乳糖苷酶荧光探针及其制备方法与应用
CN108440476A (zh) 一种用于同时检测水合肼和亚硫酸（氢）盐的荧光探针及其制备方法和用途
CN110357865A (zh) 一种用于检测hNQO1酶的近红外荧光探针及其合成方法和应用
Song et al. A turn-on fluorescent probe for Au 3+ based on rodamine derivative and its bioimaging application
CN1715919A (zh) 细胞锌离子检测用的氟硼染料荧光探针
CN109651249A (zh) 一种检测细胞内质网半胱氨酸的荧光探针及其合成和应用
CN108752373B (zh) 一种基于苯硼酯识别过氧化氢的荧光探针
CN106608862A (zh) 一种长波长检测肼的荧光探针及其合成方法与应用
CN108774240A (zh) 一种能应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针
Zhang et al. A lysosome-targeted fluorescent probe based on a BODIPY structure for Cys/Hcy detection
CN110964044B (zh) 一种基于双香豆素衍生物的过氧化亚硝酸盐荧光探针、制备方法与应用
CN110642857B (zh) 一种用于检测粘度和pH的双功能荧光探针及其制备与应用
CN109021000A (zh) 一种检测过氧化氢的荧光探针、合成方法和应用
CN108218898A (zh) 一种新型靶向溶酶体的次氯酸比率荧光探针的制备及应用
CN109912581B (zh) 基于香豆素与苯乙烯吡啶鎓的次氯酸荧光探针及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 250012 No. 18877 Jingshi Road, Jinan City, Shandong Province

Applicant after: Shandong First Medical University (Shandong Academy of Medical Sciences)

Address before: 271016 College of chemistry and pharmaceutical engineering, Taishan Medical University, 619 the Great Wall Road, Tai'an, Shandong

Applicant before: Taishan Hospital

CB02 Change of applicant information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180629

RJ01 Rejection of invention patent application after publication