CN118146223A - 一种SNAP-tag探针及制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可用于405nm激发的SNAP‑tag探针的制备方法及应用，其结构如下，在萘酰亚胺4位引入氮杂环丁酮设计，N‑端引入SNAP‑tag可特异性识别的苄基鸟嘌呤。该探针能够在405nm的激发光下对活细胞内融合有SNAP‑tag的目标蛋白进行特异性标记，实现活细胞内对目标蛋白的荧光成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种可用405nm激光激发的SNAP-tag探针的制备方法及应用。
背景技术
相比于荧光蛋白，有机小分子荧光染料具有结构小、颜色丰富、易改造等优势。因此，其被广泛用于蛋白荧光成像领域，如蛋白的动态追踪、蛋白相互作用等。然而，特异性差一度成为限制有机小分子荧光染料在蛋白研究方面进一步应用的难题。为了解决这一问题，科研工作者提出了蛋白标签技术，其中蛋白标签可以特异性识别底物衍生物。SNAP-tag作为目前在蛋白质特异性标记技术中应用最为广泛的蛋白标签，能够特异性识别苄基鸟嘌呤衍生物，能够与有机小分子染料形成稳定的共价键。因此，近几年基于SNAP-tag的有机小分子荧光探针也层出不穷，并在蛋白标记领域得到了广泛的应用。
目前，商业SNAP-tag探针的激发波长通常集中在500nm以上，包括SNAP-Cell 505-Star(激发光504nm)、SNAP-Cell TMR-Star(激发光554nm)、SNAP-Cell 647-SiR(激发光645nm)、SNAP-Surface 488(激发光506nm)、SNAP-Surface Alexa Fluor 546(激发光558nm)、SNAP-Surface 549(激发光560nm)、SNAP-Surface Alexa Fluor 647(激发光652nm)等，以上染料很难匹配常用的405nm激光器，这使得在荧光成像时，蛋白的多色标记受限。因此，亟需开发激发波长在400nm左右的SNAP-tag荧光探针，以帮助研究蛋白的动态行为以及相互作用等问题。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种可用于405nm激光激发的SNAP-tag探针，可实现活细胞内的荧光成像，从而应用于多色成像。
本发明的另一目的是提供一种可用于405nm激光激发的SNAP-tag探针的制备方法，该合成方法具有合成步骤简单、操作方便、易于提纯等优点。
本发明提供一种可用于405nm激光激发的SNAP-tag探针，以1,8-萘酰亚胺为母体，4位引入氮杂环丁酮，实现了在405nm下SNAP-tag蛋白的超分辨荧光成像，可以在多色成像上有所应用。
一种可用于405nm激发的SNAP-tag探针，该荧光探针具有如下结构：
此荧光探针合成路线，如下：
具体合成步骤如下：
(1)中间体AO-4的合成：
在N2保护下，将0.5-2.0g 4-溴-1,8-萘酐、0.19-2.57g 2-氮杂环丁酮、0.88-11.76g碳酸铯和0.085-0.86g甲烷磺酸[9,9-二甲基-4,5-双(二苯基膦)呫吨][2'-氨基-1,1'-联苯]钯(II)二氯甲烷加合物(XantPhos Pd G3)溶于干燥的15-100mL 1,4-二氧六环中。将反应液缓慢升温至70-130℃，搅拌1-5h。停止加热，待反应液冷却至室温后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离，以体积比二氯甲烷：石油醚＝1:1先为洗脱剂，后替换为二氯甲烷：甲醇＝400:1为洗脱剂洗脱，减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色固体AO-4。
(2)SNAP-tag探针的合成
将0.01-0.5g中间体AO-4和0.01-2.53g 6-((4-(氨基甲基)苄基)氧基)-7H-嘌呤-2-胺溶解于2-20mL无水乙醇和0.2-2mL二氯甲烷的混合溶剂中，将反应液缓慢升温至30-90℃，搅拌9-15h。停止加热，待反应液冷却至室温后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离，以体积比二氯甲烷：甲醇＝30:1为洗脱剂，减压蒸馏除去溶剂，得到靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针。步骤(1)中，0.5-2.0g 4-溴-1,8-萘酐，0.19-2.57g 2-氮杂环丁酮，0.88-11.76g碳酸铯，0.085-0.86g甲烷磺酸[9,9-二甲基-4,5-双(二苯基膦)呫吨][2'-氨基-1,1'-联苯]钯(II)二氯甲烷加合物(XantPhos Pd G3)，15-100mL干燥的1,4-二氧六环。
步骤(2)中，0.01-0.5g中间体AO-4，0.01-2.53g 6-((4-(氨基甲基)苄基)氧基)-7H-嘌呤-2-胺，2-20mL无水乙醇和0.2-2mL二氯甲烷的混合溶剂。上述一种可用于405nm激发的SNAP-tag探针对SNAP-tag蛋白具有高度选择性，能够在活细胞等复杂环境中对SNAP-tag进行特异性识别。
本发明在萘酰亚胺4位引入氮杂环丁酮设计，N-端引入SNAP-tag可特异性识别的苄基鸟嘌呤。该探针能够在405nm的激发光下对活细胞内融合有SNAP-tag的目标蛋白进行特异性标记，实现活细胞内对目标蛋白的荧光成像。
本发明具有以下特征：
该SNAP-tag探针拥有合成原料廉价易得、合成方法简单通用、合成步骤简单等优点。
该SNAP-tag探针可实现405nm激发下的荧光发射。
该SNAP-tag探针能够对活细胞内SNAP-tag蛋白进行特异性识别，实现荧光成像。
附图说明
图1实施例1制备的AO-4的核磁谱图氢谱。
图2实施例1制备的AO-4的核磁谱图碳谱。
图3实施例1制备的AO-4的高分辨质谱。
图4实施例1制备的SNAP-tag探针的核磁谱图氢谱。
图5实施例1制备的SNAP-tag探针的核磁谱图碳谱。
图6实施例1制备的SNAP-tag探针的高分辨质谱。
图7实施例1制备的SNAP-tag探针在转染的pSNAPf-H2B的HeLa细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。
图8实施例1制备的SNAP-tag探针在转染的pSNAPf-H2B的HeLa细胞中的原位荧光光谱，荧光探针的浓度为1μM。
具体实施方式
实施例1.SNAP-tag探针的合成方法。
中间体AO-4的合成：
在N2保护下，将4-溴-1,8-萘酐(0.50g，1.81mmol)、2-氮杂环丁酮(190mg，2.72mmol)、碳酸铯(880mg，2.72mmol)和甲烷磺酸[9,9-二甲基-4,5-双(二苯基膦)呫吨][2'-氨基-1,1'-联苯]钯(II)二氯甲烷加合物(XantPhos Pd G3)(85mg，0.09mmol)溶于干燥的15mL 1,4-二氧六环中。将反应液缓慢升温至70℃，搅拌1h。停止加热，待反应液冷却至室温后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离，以体积比二氯甲烷：石油醚＝1:1先为洗脱剂，后替换为体积比二氯甲烷：甲醇＝400:1为洗脱剂洗脱，减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色固体AO-4 300mg，产率62％。
1H NMR(700MHz,DMSO-d6)δ8.93(dd,J＝8.6,0.8Hz,1H),8.54(dd,J＝7.2,0.8Hz,1H),8.49(d,J＝8.1Hz,1H),7.88(dt,J＝7.2,3.8Hz,1H),4.14(t,J＝4.9Hz,2H),3.30(t,J＝4.9Hz,2H).13C NMR(176MHz,DMSO-d6)δ166.80,161.43,160.64,142.33,134.03,133.47,132.96,131.67,126.97,123.27,119.49,116.78,114.62,41.95,36.75.高分辨质谱理论值C15H9NO4[M+H]+268.0610,实际值268.0588.
经检测，其结构如上式AO-4所示。
SNAP-tag探针的合成：
将中间体AO-4(10mg，0.04mmol)和6-((4-(氨基甲基)苄基)氧基)-7H-嘌呤-2-胺(10.8mg，0.04mmol)溶解于2mL无水乙醇和0.2mL二氯甲烷的混合溶剂中，将反应液缓慢升温至30℃，搅拌9h。停止加热，待反应液冷却至室温后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离，以体积比二氯甲烷：甲醇＝30:1为洗脱剂，减压蒸馏除去溶剂，得到靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针10.8mg，产率52％。
1H NMR(700MHz,DMSO-d6)δ8.87(dd,J＝8.6,0.9Hz,1H),8.55(dd,J＝7.3,0.9Hz,1H),8.50(d,J＝8.1Hz,1H),7.86(dt,J＝8.5,3.8Hz,2H),7.44(d,J＝8.2Hz,2H),7.39(d,J＝8.2Hz,2H),6.25(s,2H),5.43(s,2H),5.25(s,2H),4.12(t,J＝4.8Hz,2H),3.28(t,J＝4.8Hz,2H).13C NMR(176MHz,DMSO-d6)δ166.69,164.00,163.36,160.04,141.60,137.70,136.05,134.04,133.48,132.98,132.46,132.08,132.04,130.11,129.29,129.08,128.88,128.11,126.98,126.78,123.47,122.46,118.19,116.89,66.95,43.17,41.82,36.62.高分辨质谱理论值C28H21N7O4[M+H]+520.1733,实际值520.1705.
经检测，其结构如上式SNAP-tag所示。
实施例2.SNAP-tag探针的合成方法。
中间体AO-4的合成：
在N2保护下，将4-溴-1,8-萘酐(1.25g，4.51mmol)、2-氮杂环丁酮(1.04g，14.66mmol)、碳酸铯(4.78g，14.66mmol)和甲烷磺酸[9,9-二甲基-4,5-双(二苯基膦)呫吨][2'-氨基-1,1'-联苯]钯(II)二氯甲烷加合物(XantPhos Pd G3)(1.18g，1.24mmol)溶于干燥的60mL 1,4-二氧六环中。将反应液缓慢升温至100℃，搅拌3h。停止加热，待反应液冷却至室温后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离，以体积比二氯甲烷：石油醚＝1:1先为洗脱剂，后替换为体积比二氯甲烷：甲醇＝400:1为洗脱剂洗脱，减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色固体AO-4 843mg，产率70％。
经检测，其结构如上式AO-4所示。
SNAP-tag探针的合成：
将中间体AO-4(255mg，0.95mmol)和6-((4-(氨基甲基)苄基)氧基)-7H-嘌呤-2-胺(774mg，2.86mmol)溶解于11mL无水乙醇和1.1mL二氯甲烷的混合溶剂中，将反应液缓慢升温至60℃，搅拌12h。停止加热，待反应液冷却至室温后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离，以体积比二氯甲烷：甲醇＝30:1为洗脱剂，减压蒸馏除去溶剂，得到靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针222mg，产率45％。
经检测，其结构如上式SNAP-tag所示。
实施例3.SNAP-tag探针的合成方法。
中间体AO-4的合成：
在N2保护下，将4-溴-1,8-萘酐(2.0g，7.22mmol)、2-氮杂环丁酮(2.57g，36.1mmol)、碳酸铯(11.76g，36.1mmol)和甲烷磺酸[9,9-二甲基-4,5-双(二苯基膦)呫吨][2'-氨基-1,1'-联苯]钯(II)二氯甲烷加合物(XantPhos Pd G3)(3.42g，3.61mmol)溶于干燥的100mL 1,4-二氧六环中。将反应液缓慢升温至130℃，搅拌5h。停止加热，待反应液冷却至室温后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离，以体积比二氯甲烷：石油醚＝1:1先为洗脱剂，后替换为体积比二氯甲烷：甲醇＝400:1为洗脱剂洗脱，减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色固体AO-4 1.06g，产率55％。
经检测，其结构如上式AO-4所示。
SNAP-tag探针的合成：
将中间体AO-4(500mg，1.87mmol)和6-((4-(氨基甲基)苄基)氧基)-7H-嘌呤-2-胺(2.53g，9.35mmol)溶解于20mL无水乙醇和2mL二氯甲烷的混合溶剂中，将反应液缓慢升温至90℃，搅拌15h。停止加热，待反应液冷却至室温后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离，以体积比二氯甲烷：甲醇＝30:1为洗脱剂，减压蒸馏除去溶剂，得到靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针466mg，产率48％。
经检测，其结构如上式SNAP-tag所示。
实施例4：探针SNAP-tag在转染细胞中的荧光共聚焦成像及原位荧光光谱。将该探针溶解于DMSO溶液中，配制成浓度为2mM的母液。取0.5μL母液溶于1mL Hela细胞DMEM培养液中，而后置于37℃下孵育30分钟后进行荧光共聚焦成像，成像图如图7所示，图7中通过pSNAPf-H2B诱导Hela细胞表达融合有SNAP-tag的H2B(质粒购自NEB)。在405nm的激发光下的细胞内原位荧光光谱如图8所示。
Claims (4)
1.一种SNAP-tag探针，其结构如下：
2.一种权利要求1所述的SNAP-tag探针的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体AO-4的合成：
将0.5-2.0g 4-溴-1,8-萘酐、0.19-2.57g 2-氮杂环丁酮、0.88-11.76g碳酸铯和0.085-0.86g甲烷磺酸[9,9-二甲基-4,5-双(二苯基膦)呫吨][2'-氨基-1,1'-联苯]钯(II)二氯甲烷加合物(XantPhos Pd G3)溶于15-100mL 1,4-二氧六环中；将反应液升温至70-130℃，搅拌1-5h；纯化，得到固体中间体AO-4；
(2)SNAP-tag探针的合成
将0.01-0.5g中间体AO-4和0.01-2.53g 6-((4-(氨基甲基)苄基)氧基)-7H-嘌呤-2-胺溶解于2-20mL乙醇和0.2-2mL二氯甲烷的混合溶剂中，将反应液升温至30-90℃，搅拌9-15h，纯化，得到靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针。
3.一种权利要求1所述的SNAP-tag探针在SNAP-tag蛋白的识别和/或检测过程中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：SNAP-tag探针采用405nm光激发，实现在405nm下SNAP-tag蛋白的荧光成像。
Priority Applications (1)
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