CN112748096B - 一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法及应用，属于磺胺二甲氧嘧啶的检测技术领域。本发明解决现有磺胺二甲氧嘧啶的检测过程复杂，成本高以及干扰大的问题。本发明利用制备的巯基丙酸修饰的Mn:ZnS室温磷光量子点(MPA‑Mn:ZnS)为磷光探针，MoS2纳米片为磷光猝灭单元，磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体为分子识别单元，通过检测加入磺胺二甲氧嘧啶后体系被MoS2纳米片猝灭的室温磷光恢复程度实现对磺胺二甲氧嘧啶的分析检测。该磷光检测体系对磺胺二甲氧嘧啶的响应范围为2‑400ng/mL，检出限为0.91ng/mL。可用于河水、牛奶及鸡肉中磺胺二甲氧嘧啶的检测。室温磷光的产生也不需要加入除氧剂和诱导剂，并能够避免实际样品本底荧光和散射光的干扰。
Description
技术领域
本发明属于磺胺二甲氧嘧啶的检测技术领域，具体涉及一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法及应用。
背景技术
磺胺二甲氧嘧啶(SDM)是一种常用的磺胺类兽药抗生素，具有广谱抗菌效果，而且对球虫和弓形体具有较强药理作用。广泛应用于兽、禽、鱼类疾病的预防与治疗，但是其进入动物体内不能被完全吸收代谢，残留于动物体内或以母体化合物及其代谢产物的形式经由动物粪尿排泄出体外。随着病菌的耐药性越来越强抗生素用量不断增加，对生态平衡造成负面影响，而且可能使人体产生过敏反应或造血系统障碍等。还有研究表明，即使在低浓度下，SDM对其靶生物如肾脏和肝脏也有毒性。因此磺胺二甲氧嘧啶在肉、蛋、奶类等动物性食品组织中的残留问题受到了人们的密切关注。开发准确、简便、高灵敏的磺胺二甲氧嘧啶检测方法具有现实意义。
为了控制这种增长趋势，许多国家和地区都规定了动物源性食品中SDM的最大残留限量。例如，中国和欧盟都规定了食用动物食品中SDM的最大残留限量(MRL)值为100μg/kg。早期检测磺胺二甲氧嘧啶的方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)，酶联免疫法(ELISA)，表面等离子共振法(SPR)等，随着实验手段的不断丰富，逐渐出现了光电化学法、电化学和荧光法等，这些方法对SDM的检测虽然可以得到较好的结果，但仍然存在很多问题。如：高效液相色谱法所需费用较高，检测程序较复杂，而且不适用小型实验室操作；酶联免疫法耗时较长，操作繁琐，检测灵敏度不高；表面等离子共振法是一种光学分析技术，它具有灵敏度高等优势，但也具难以区分非特异性吸附，对温度等干扰因素较为敏感；电化学法虽操作简便，但需对电极进行修饰导致电化学方法的重现性较差。荧光光谱法具有准确、简便、快速、灵敏等优点，但很难避免复杂样品尤其是生物体液本底荧光和散射光的干扰。与荧光相比，磷光具有发射寿命长、选择性好等优点。Mn:ZnS量子点可以在590nm左右处发射毫秒级的磷光，同时具有较长斯托克斯位移，降低了样品自体荧光和散射光的干扰，提高分析检测的选择性。此外，Mn:ZnS量子点不需要加入除氧剂和诱导剂，大大简化了磷光分析的操作。
发明内容
针对现有磺胺二甲氧嘧啶的检测过程复杂，耗时长，成本高以及干扰大的问题，本发明提供了一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法及应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法，包括如下步骤：
步骤1，制备Mn:ZnS量子点：将巯基丙酸、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为3-5:0.8-1.2:0.03-0.05的比例混合，用2M NaOH调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌；在隔绝空气的条件下快速加入90％Zn(Ac)2的Na2S，室温下继续反应；再将溶液加热并在空气中陈化，得到MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品，以与MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，弃上清，重复至清洗干净，烘干，得到MPA-Mn:ZnS量子点固体粉末；
步骤2，制备MoS2纳米片：取摩尔比为0.5-1:1-3的H4MoNa2O6和CH3CSNH2，完全溶解于蒸馏水中，加入聚苯内衬不锈钢高压反应釜中，密闭后进行反应，冷却至室温，过滤得到沉淀物，然后清洗烘干，过夜保存备用；
步骤3，配制Mn:ZnS量子点母液：称取所需Mn:ZnS量子点，用二次去离子水定容；
步骤4，磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体(NH2-APT)溶液的配制：先将磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体(NH2-APT)(序列为：5’-GAGGGCAACGAGTGTTTATAGA-3’)进行离心处理，将经离心的磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体(NH2-APT)溶解于磷酸缓冲液中配成磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液，进行水浴加热然后冷却至室温，储存于-20℃环境中备用；
步骤5，NH2-APT修饰的量子点(APT-QDs)的制备：将500μL，5.2mM的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液(EDC)和500μL，8.4mM的N-羟基琥珀酰亚胺溶液(NHS)混合在一起，超声处理，然后加入20mM，pH＝8的PBS溶解2mg/mL Mn-ZnS量子点溶液1000μL，孵育20min，最后将100μM，100μL的NH2-APT引入活化的QDs混合溶液中，在37℃下连续孵育1h；所得APT-QDs经透析袋除杂后，于4℃保存；
步骤6，检测磺胺二甲氧嘧啶的标准曲线；
步骤7，待测样品磺胺二甲氧嘧啶及其加标回收率的检测。
进一步，所述步骤1中磁力搅拌时间为20-40min；室温下继续反应时间为40-50min；所述将溶液加热的温度为40-70℃；所述在空气中陈化的陈化时间为1-3h；所述烘干温度为40-60℃。
进一步，所述步骤2中蒸馏水的用量为25mL，所述步骤2中烘干的温度为40-60℃，所述步骤2中保存条件为在4℃下保存；所述步骤2中反应温度为200-220℃，反应时间为20-24h。
进一步，所述步骤3中Mn:ZnS量子点为100mg，二次去离子水定容为50mL。
进一步，所述步骤4中离心处理的时间为5-10min；所述步骤4中水浴加热的温度为70-90℃，加热时间为5-10min。
进一步，所述步骤4张磷酸缓冲液的浓度为20mM；所述磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液的浓度为100μM。
进一步，所述步骤5超声处理的时间为30s。
进一步，所述步骤6检测磺胺二甲氧嘧啶的标准曲线的具体方法是：用20mM的磷酸缓冲液将APT-QDs母液稀释5倍，加入MoS2纳米片(2mg/mL)20μL，加入一系列不同浓度的SDM(1、2、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、800、1000ng/mL)溶液，最终体积为2.0mL，然后将工作溶液在室温下孵育10-20min；转入10mm厚的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长307nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线583nm处的磷光强度对磺胺二甲氧嘧啶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程。
进一步，所述步骤7待测样品磺胺二甲氧嘧啶及其加标回收率的检测的具体方法：待测样品中磺胺二甲氧嘧啶的检测，用20mM的磷酸缓冲液将待测样品稀释至40-100倍；将200μL APT-QDs母液用稀释后的待测样品稀释5倍，加入MoS2纳米片使其最终浓度为20μg/mL，待测液最终体积为2.0mL；室温下孵育10-20min后，将待测液转移至石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为307nm，发射波长为583nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm；
待测样品磺胺二甲氧嘧啶加标回收率的检测，用20mM的磷酸缓冲液将待测样品稀释至40-100倍；在200μL APT-QDs母液中加入500μL不同浓度的磺胺二甲氧嘧啶标准溶液样品，加入MoS2纳米片使其最终浓度为20μg/mL，用稀释后的待测样品定容至2mL，室温孵育10-20min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为307nm，发射波长为583nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的磷光强度测量值和标准曲线方程，计算出磺胺二甲氧嘧啶浓度值，得出磺胺二甲氧嘧啶在待测样品中的加标回收率。
一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法的应用，应用于河水、牛奶及鸡肉的磺胺二甲氧嘧啶的检测。
本发明的原理如下：磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体通过共价键作用结合在Mn:ZnS量子点表面。MoS2纳米片对单链DNA具有选择性高亲和性，可以将磺胺二甲氧嘧啶核酸适配修饰的Mn:ZnS量子点吸附在其表面，并将其磷光猝灭，加入磺胺二甲氧嘧啶后，由于磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体与磺胺二甲氧嘧啶之间强烈的亲和作用使得量子点与MoS2纳米片脱离，从而使得量子点的磷光得以恢复。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明的检测方法简单、高效、经济、环保。除了具备以往Mn:ZnS量子点磷光检测的优势，如：避免生物样品自体荧光和散射光的干扰，免除繁琐的样品预处理过程，不需要加入除氧剂和诱导剂等，本发明的检测方法还具备如下优势：
1.本发明中Mn:ZnS量子点以小分子MPA修饰，得到大小均一的量子点颗粒，磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体通过与MPA的-COOH共价结合在量子点表面，结合更加牢固。加入MoS2纳米片后通过与单链DNA适配体的高亲和性使量子点被猝灭，加入磺胺二甲氧嘧啶后，由于磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体与磺胺二甲氧嘧啶之间强烈的亲和作用使得量子点从MoS2纳米片表面脱落，从而使得量子点的磷光得以恢复。
2.本发明中Mn:ZnS量子点制备步骤简单，合成条件温和，不需要有机溶剂，得到的磷光量子点材料具有很好生物溶性和分散性，且室温磷光性能优良。
4.本发明提出的磷光增强型分析体系同时协同MoS2纳米片的优异猝灭能力使得本方法的灵敏度较高，分析检测磺胺二甲氧嘧啶的检出限为0.91ng/mL，高于其它分析体系，该磷光检测体系对磺胺二甲氧嘧啶的响应范围为2-400ng/mL。
5.本发明方法可应用于河水、牛奶、鸡肉等实际样品中磺胺二甲氧嘧啶的检测，其应用范围更广。
6.本发明中作为识别单元的磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体无需进行荧光标记，检测更加经济、简便。
附图说明
图1为MPA修饰的锰掺杂硫化锌室温磷光量子点透射电镜图；
图2为MoS2纳米片透射电镜图；
图3为室温磷光量子点检测磺胺二甲氧嘧啶的光谱图；
图4为室温磷光量子点检测磺胺二甲氧嘧啶的标准曲线。
具体实施方式
实施例1，室温磷光检测河水中的磺胺二甲氧嘧啶
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将巯基丙酸(MPA)、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为4:1:0.05的比例混合，用NaOH(2M)调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入90％Zn(Ac)2的Na2S，室温下继续反应40min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化2h，得到MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品，以与MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，重复三次将其清洗干净，烘箱内50℃烘干，即可得到MPA-Mn:ZnS量子点固体粉末；
第二步，制备MoS2纳米片：
取3mM(0.0181g)钼酸钠二水合物(H4MoNa2O6)和9mM(0.0169g)硫代乙酰胺(CH3CSNH2)，并完全溶解于25mL蒸馏水中。加入50mL聚苯内衬不锈钢高压反应釜密封，210℃下反应22h。冷却至室温，过滤得到的沉淀物，随后用水和乙醇洗涤几次。最后，将湿粉末在50℃的烘箱中干燥过夜，并在4℃下保存以备下次使用。
第三步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量100mg Mn:ZnS量子点，二次去离子水定容在50mL的容量瓶中；
第四步，磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液的配制：
先将磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体(NH2-APT)(序列为：5’-GAGGGCAACGAGTGTTTATAGA-3’)离心5-10min，将经离心的适配体溶解于20mM的磷酸缓冲液中配成浓度为100μM的磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液，在90℃下水浴10min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用；
第五步，NH2-APT修饰的量子点(APT-QDs)的制备：
将EDC(500μL，5.2mM)和NHS(500μL，8.4mM)混合在一起，超声处理30s，然后加入1000μL含有2mg/mL Mn-ZnS量子点的PBS(20mM，pH＝8)，孵育20min，最后将NH2-APT(100μM，100μL)引入活化的QDs混合溶液中，在37℃下连续孵育1h。所得APT-QDs经透析袋除杂后，于4℃保存。
第六步，实际样品的处理：
首先将取得的河水过滤，取上清液10mL，加入20mM的磷酸缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第七步，检测标准曲线：
用20mM的磷酸缓冲液将APT-QDs母液稀释5倍，加入MoS2纳米片(2mg/mL)20μL，加入一系列不同浓度的SDM(1、2、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、800、1000ng/mL)溶液，二次水稀释至2.0mL，然后将工作溶液在室温下孵育15min。转入10mm厚的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长307nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线583nm处的磷光强度对磺胺二甲氧嘧啶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线。
第八步，河水中磺胺二甲氧嘧啶的测定：
将200μL APT-QDs母液用处理过的河水稀释5倍，加入MoS2纳米片使其最终浓度为20μg/mL，加入处理过的河水样品至2.0mL。室温下孵育15min后，将待测液转移至石英比色皿中进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为307nm，发射波长为583nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm。每个浓度水平上重复3次。如果样品中含有磺胺二甲氧嘧啶则测得的磷光强度会高于空白样品，据此判断样品中是否含有磺胺二甲氧嘧啶。
实施例2，室温磷光检测河样中的磺胺二甲氧嘧啶
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将巯基丙酸(MPA)、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为3.5:1:0.03的比例混合，用NaOH(2M)调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌40min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入90％Zn(Ac)2的Na2S，室温下继续反应40min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化3h，得到MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品，以与MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，重复三次将其清洗干净，烘箱内60℃烘干，即可得到MPA-Mn:ZnS量子点固体粉末；
第二步，制备MoS2纳米片：
取3mM(0.0181g)钼酸钠二水合物(H4MoNa2O6)和9mM(0.0169g)硫代乙酰胺(CH3CSNH2)，并完全溶解于25mL蒸馏水中。加入50mL聚苯内衬不锈钢高压反应釜密封，220℃下反应20h。冷却至室温，过滤得到的沉淀物，随后用水和乙醇洗涤几次。最后，将湿粉末在50℃的烘箱中干燥过夜，并在4℃下保存以备下次使用。
第三步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量100mg Mn:ZnS量子点，二次去离子水定容在50mL的容量瓶中；
第四步，磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液的配制：
将磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体(NH2-APT)(序列为：5’-GAGGGCAACGAGTGTTTATAGA-3’)离心5-10min，将经离心的适配体溶解于20mM的磷酸缓冲液中配成浓度为100μM的磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液，在90℃下水浴10min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用；
第五步，NH2-APT修饰的量子点(APT-QDs)的制备：将EDC(500μL，5.2mM)和NHS(500μL，8.4mM)混合在一起，超声处理30s，然后加入1000μL含有2mg/mL Mn-ZnS量子点的PBS(20mM，pH＝8)，孵育20min，最后将NH2-APT(100μM，100μL)引入活化的QDs混合溶液中，在37℃下连续孵育1h。所得APT-QDs经透析袋除杂后，于4℃保存。
第六步，实际样品的处理：
首先将取得的河水过滤，取上清液10mL，加入20mM的磷酸缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第七步，检测标准曲线：
河样中磺胺二甲氧嘧啶的检测，用20mM的磷酸缓冲液将APT-QDs母液稀释10倍，加入MoS2纳米片(2mg/mL)20μL，加入一系列不同浓度的SDM(1、2、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、800、1000ng/mL)溶液，最终体积为2.0mL，然后将工作溶液在室温下孵育20min。转入10mm厚的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长307nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线583nm处的磷光强度对磺胺二甲氧嘧啶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程为:y＝0.37c+164.29(R2＝0.997)，以S/N＝3为标准计算得检出限为0.91ng/mL。
第八步，河水样品中磺胺二甲氧嘧啶的加标回收率：
将200μL APT-QDs母液用处理过的河水稀释5倍，加入MoS2纳米片使其最终浓度为20μg/mL，加入不同浓度磺胺二甲氧嘧啶使其最终浓度为0,20,100,300ng/mL,加入处理过的河水样品至2.0mL。室温下孵育20min后，将待测液转移至石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为307nm，发射波长为583nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm。每个浓度水平上重复3次。根据检测的磷光强度测量值，代入标准曲线方程，计算出磺胺二甲氧嘧啶浓度值，并计算磺胺二甲氧嘧啶在河水样中的加标回收率，见表1，磺胺二甲氧嘧啶在河水中的加标回收率为91.31-96.16％。
表1，磺胺二甲氧嘧啶在河水中的加标回收率
实施例3，室温磷光检测牛奶中的磺胺二甲氧嘧啶
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将巯基丙酸(MPA)、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为4:1:0.04的比例混合，用NaOH(2M)调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入90％Zn(Ac)2的Na2S，室温下继续反应40min；再将溶液加热至60℃，空气中陈化3h，得到MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品，以与MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，重复三次将其清洗干净，烘箱内60℃烘干，即可得到MPA-Mn:ZnS量子点固体粉末；
第二步，制备MoS2纳米片：
取3mM(0.0181g)钼酸钠二水合物(H4MoNa2O6)和6mM(0.0112g)硫代乙酰胺(CH3CSNH2)，并完全溶解于25mL蒸馏水中。加入50mL聚苯内衬不锈钢高压反应釜密封，220℃下反应24h。冷却至室温，过滤得到的沉淀物，随后用水和乙醇洗涤几次。最后，将湿粉末在50℃的烘箱中干燥过夜，并在4℃下保存以备下次使用。
第三步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量100mg Mn:ZnS量子点，二次去离子水定容在50mL的容量瓶中；
第四步，磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液的配制：
先将磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体(NH2-APT)(序列为：5’-GAGGGCAACGAGTGTTTATAGA-3’)离心5-10min，将经离心的适配体溶解于20mM的磷酸缓冲液中配成浓度为100μM的磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液，在90℃下水浴10min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用；
第五步，NH2-APT修饰的量子点(APT-QDs)的制备：
将EDC(500μL，5.2mM)和NHS(500μL，8.4mM)混合在一起，超声处理30s，然后加入1000μL含有2mg/mL Mn-ZnS量子点的PBS(20mM，pH＝8)，孵育20min，最后将NH2-APT(100μM，100μL)引入活化的QDs混合溶液中，在37℃下连续孵育1h。所得APT-QDs经透析袋除杂后，于4℃保存。
第六步，实际样品的处理：
取2mL牛奶稀释5倍然后加入2.0mL10％三氯乙酸和2.0mL氯仿沉淀蛋白质和溶解脂肪。5min后超声处理15min，然后在20℃，12000rpm下离心15min。收集上清液，用超纯水稀释10倍备用。
第七步，检测标准曲线：
牛奶中磺胺二甲氧嘧啶的检测，用20mM的磷酸缓冲液将APT-QDs母液稀释5倍，加入MoS2纳米片(2mg/mL)20μL，加入一系列不同浓度的SDM(1、2、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、800、1000ng/mL)溶液，最终体积为2.0mL，然后将工作溶液在室温下孵育15min。转入10mm厚的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长307nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线583nm处的磷光强度对磺胺二甲氧嘧啶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线。
第八步，牛奶中磺胺二甲氧嘧啶的测定：
将200μL APT-QDs母液用处理过的牛奶稀释5倍，加入MoS2纳米片使其最终浓度为20μg/mL，加入处理过的牛奶样品至2.0mL。室温下孵育15min后，将待测液转移至石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为307nm，发射波长为583nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm。每个浓度水平上重复3次。如果样品中含有磺胺二甲氧嘧啶则测得的磷光强度会高于空白样品，据此判断样品中是否含有磺胺二甲氧嘧啶。
实施例4，室温磷光检测牛奶样中的磺胺二甲氧嘧啶
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将巯基丙酸(MPA)、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为4:1.2:0.05的比例混合，用NaOH(2M)调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入90％Zn(Ac)2的Na2S，室温下继续反应50min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化2.5h，得到MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品，以与MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，重复三次将其清洗干净，烘箱内50℃烘干，即可得到MPA-Mn:ZnS量子点固体粉末；
第二步，制备MoS2纳米片：
取3mM(0.0181g)钼酸钠二水合物(H4MoNa2O6)和6mM(0.0112g)硫代乙酰胺(CH3CSNH2)，并完全溶解于25mL蒸馏水中。加入50mL聚苯内衬不锈钢高压反应釜密封，200℃下反应24h。冷却至室温，过滤得到的沉淀物，随后用水和乙醇洗涤几次。最后，将湿粉末在60℃的烘箱中干燥过夜，并在4℃下保存以备下次使用。
第三步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量100mg Mn:ZnS量子点，二次去离子水定容在50mL的容量瓶中；
第四步，磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液的配制：
先将磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体(NH2-APT)(序列为：5’-GAGGGCAACGAGTGTTTATAGA-3’)离心5-10min，将经离心的适配体溶解于20mM的磷酸缓冲液中配成浓度为100μM的磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液，在90℃下水浴10min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用；
第五步，NH2-APT修饰的量子点(APT-QDs)的制备：将EDC(500μL，5.2mM)和NHS(500μL，8.4mM)混合在一起，超声处理30s，然后加入1000μL含有2mg/mL Mn-ZnS量子点的PBS(20mM，pH＝8)，孵育20min，最后将NH2-APT(100μM，100μL)引入活化的QDs混合溶液中，在37℃下连续孵育1h。所得APT-QDs经透析袋除杂后，于4℃保存。
第六步，检测标准曲线：
牛奶样中磺胺二甲氧嘧啶的检测，用20mM的磷酸缓冲液将APT-QDs母液稀释10倍，加入MoS2纳米片(2mg/mL)20μL，加入一系列不同浓度的SDM(1、2、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、800、1000ng/mL)溶液，最终体积为2.0mL，然后将工作溶液在室温下孵育15min。转入10mm厚的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长307nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线583nm处的磷光强度对磺胺二甲氧嘧啶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程为:y＝0.37c+164.29(R2＝0.997)，以S/N＝3为标准计算得检出限为0.91ng/mL。
第七步，实际样品的处理：
取2mL牛奶稀释5倍然后加入2.0mL10％三氯乙酸和2.0mL氯仿沉淀蛋白质和溶解脂肪。5min后超声处理15min，然后在20℃，12000rpm下离心15min。收集上清液，用超纯水稀释10倍备用。
第八步，牛奶样中磺胺二甲氧嘧啶的加标回收率：
将200μL APT-QDs母液用处理过的牛奶稀释5倍，加入MoS2纳米片使其最终浓度为20μg/mL，加入不同浓度磺胺二甲氧嘧啶使其最终浓度为0,20,100,300ng/mL,加入处理过的牛奶样品至2.0mL。室温下孵育15min后，将待测液转移至石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为307nm，发射波长为583nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm。每个浓度水平上重复3次。根据检测的磷光强度测量值，代入标准曲线方程，计算出磺胺二甲氧嘧啶浓度值，并计算磺胺二甲氧嘧啶在牛奶样中的加标回收率，见表2，磺胺二甲氧嘧啶在牛奶样中的加标回收率为82.07-94.39％。
表2，磺胺二甲氧嘧啶在牛奶样中的加标回收率
实施例5，室温磷光检测鸡肉样中的磺胺二甲氧嘧啶
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将巯基丙酸(MPA)、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为4:1:0.05的比例混合，用NaOH(2M)调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌20min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入90％Zn(Ac)2的Na2S，室温下继续反应40min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化3h，得到MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品，以与MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，重复三次将其清洗干净，烘箱内50℃烘干，即可得到MPA-Mn:ZnS量子点固体粉末；
第二步，制备MoS2纳米片：
取3mM(0.0181g)钼酸钠二水合物(H4MoNa2O6)和9mM(0.0169g)硫代乙酰胺(CH3CSNH2)，并完全溶解于25mL蒸馏水中。加入50mL聚苯内衬不锈钢高压反应釜密封，220℃下反应24h。冷却至室温，过滤得到的沉淀物，随后用水和乙醇洗涤几次。最后，将湿粉末在50℃的烘箱中干燥过夜，并在4℃下保存以备下次使用。
第三步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量100mg Mn:ZnS量子点，二次去离子水定容在50mL的容量瓶中；
第四步，磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液的配制：
先将磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体(NH2-APT)(序列为：5’-GAGGGCAACGAGTGTTTATAGA-3’)离心5-10min，将经离心的适配体溶解于20mM的磷酸缓冲液中配成浓度为100μM的磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液，在90℃下水浴10min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用；
第五步，NH2-APT修饰的量子点(APT-QDs)的制备：将EDC(500μL，5.2mM)和NHS(500μL，8.4mM)混合在一起，超声处理30s，然后加入1000μL含有2mg/mL Mn-ZnS量子点的PBS(20mM，pH＝8)，孵育20min，最后将NH2-APT(100μM，100μL)引入活化的QDs混合溶液中，在37℃下连续孵育1h。所得APT-QDs经透析袋除杂后，于4℃保存。
第六步，检测标准曲线：
鸡肉样中磺胺二甲氧嘧啶的检测，用20mM的磷酸缓冲液将APT-QDs母液稀释10倍，加入MoS2纳米片(2mg/mL)20μL，加入一系列不同浓度的SDM(1、2、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、800、1000ng/mL)溶液，最终体积为2.0mL，然后将工作溶液在室温下孵育15min。转入10mm厚的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长307nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线583nm处的磷光强度对磺胺二甲氧嘧啶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程为:y＝0.37c+164.29(R2＝0.997)，以S/N＝3为标准计算得检出限为0.91ng/mL。
第七步，实际样品的处理：
将鸡肉(4.0g)放入100mL聚四氟乙烯试管中然后用20mL盐酸(pH＝5)80℃萃取5min。冷却后，以20℃，12000rpm离心10min，最后取上清液稀释10倍备用。
第八步，鸡肉样中磺胺二甲氧嘧啶的加标回收率：
将200μL APT-QDs母液用处理过的鸡肉提取液稀释5倍，加入MoS2纳米片使其最终浓度为20μg/mL，加入不同浓度磺胺二甲氧嘧啶使其最终浓度为0,20,100,300ng/mL,加入处理过的鸡肉样品至2.0mL。室温下孵育15min后，将待测液转移至石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为307nm，发射波长为583nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm。每个浓度水平上重复3次。根据检测的磷光强度测量值，代入标准曲线方程，计算出磺胺二甲氧嘧啶浓度值，并计算磺胺二甲氧嘧啶在鸡肉样中的加标回收率，见表3，磺胺二甲氧嘧啶在鸡肉样中的加标回收率为90.41-95.83％。
表3，磺胺二甲氧嘧啶在鸡肉样中的加标回收率
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
Claims (9)
1.一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1，制备Mn:ZnS量子点：将巯基丙酸MPA、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为3-5:0.8-1.2:0.03-0.05的比例混合，用2M NaOH调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌；在隔绝空气的条件下快速加入Na2S溶液，Na2S的用量是Zn(Ac)2的90％，室温下继续反应；再将溶液加热并在空气中陈化，得到MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品，以与MPA包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，弃上清，重复至清洗干净，烘干，得到MPA-Mn:ZnS量子点固体粉末；
步骤2，制备MoS2纳米片：取摩尔比为0.5-1:1-3的H4MoNa2O6和CH3CSNH2，完全溶解于蒸馏水中，加入聚苯内衬不锈钢高压反应釜中，密闭后进行反应，冷却至室温，过滤得到沉淀物，然后清洗烘干，过夜保存备用；
步骤3，配制Mn:ZnS量子点母液：称取所需Mn:ZnS量子点，用二次去离子水定容；
步骤4，磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体NH2-APT溶液的配制：先将磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体NH2-APT进行离心处理，NH2-APT的序列为：5’-GAGGGCAACGAGTGTTTATAGA-3’，将经离心的磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体NH2-APT溶解于磷酸缓冲液中配成磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液，进行水浴加热然后冷却至室温，储存于-20℃环境中备用；
步骤5，NH2-APT修饰的量子点APT-QDs的制备：将500μL，5.2mM的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液EDC和500μL，8.4mM的N-羟基琥珀酰亚胺溶液NHS混合在一起，超声处理，然后加入20mM，pH＝8的磷酸缓冲液溶解的2mg/mL Mn-ZnS量子点溶液1000μL，孵育20min，最后将100μM，100μL NH2-APT引入活化的QDs混合溶液中，在37℃下连续孵育1h；所得APT-QDs经透析袋除杂后，于4℃保存；
步骤6，检测磺胺二甲氧嘧啶的标准曲线的具体方法是：用20mM的磷酸缓冲液将APT-QDs母液稀释5倍，加入2mg/mL MoS2纳米片20μL，分别加入不同浓度的磺胺二甲氧嘧啶溶液，浓度分别为1、2、20、50、100、150、200、250、300、400、500、600、800、1000ng/mL，最终体积为2.0mL，然后将工作溶液在室温下孵育10-20min；转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长307nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线583nm处的磷光强度对磺胺二甲氧嘧啶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；
步骤7，待测样品磺胺二甲氧嘧啶及其加标回收率的检测：待测样品中磺胺二甲氧嘧啶的检测，用20mM的磷酸缓冲液将待测样品稀释至40-100倍；将200μL APT-QDs母液用稀释后的待测样品稀释5倍，加入MoS2纳米片使其最终浓度为20μg/mL，待测液最终体积为2.0mL；室温下孵育10-20min后，将待测液转移至石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为307nm，发射波长为583nm，激发狭缝为10nm，发射狭缝为10nm。
2.根据权利要求1所述的一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法，其特征在于：所述步骤1中磁力搅拌时间为20-40min；室温下继续反应时间为40-50min；所述将溶液加热的温度为40-70℃；所述在空气中陈化的陈化时间为1-3h；所述烘干温度为40-60℃。
3.根据权利要求2所述的一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法，其特征在于：所述步骤2中蒸馏水的用量为25mL，所述步骤2中烘干的温度为40-60℃，所述步骤2中保存条件为在4℃下保存；所述步骤2中反应温度为200-220℃，反应时间为20-24h。
4.根据权利要求 3所述的一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法，其特征在于：所述步骤3中Mn:ZnS量子点为100mg，二次去离子水定容为50mL。
5.根据权利要求 4所述的一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法，其特征在于：所述步骤4中离心处理的时间为5-10min；所述步骤4中水浴加热的温度为70-90℃，加热时间为5-10min。
6.根据权利要求 5所述的一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法，其特征在于：所述步骤4中磷酸缓冲液的浓度为20mM；所述磺胺二甲氧嘧啶核酸适配体溶液的浓度为100μM。
7.根据权利要求 6所述的一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法，其特征在于：所述步骤5超声处理的时间为30s。
8.根据权利要求 7所述的一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法，其特征在于：所述步骤7待测样品磺胺二甲氧嘧啶的检测的具体方法：待测样品磺胺二甲氧嘧啶加标回收率的检测，用20mM的磷酸缓冲液将待测样品稀释至40-100倍；在200μL APT-QDs母液中加入500μL不同浓度的磺胺二甲氧嘧啶标准溶液样品，加入MoS2纳米片使其最终浓度为20μg/mL，用稀释后的待测样品定容至2mL，室温孵育10-20min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为307nm，发射波长为583nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的磷光强度测量值和标准曲线方程，计算出磺胺二甲氧嘧啶浓度值，得出磺胺二甲氧嘧啶在待测样品中的加标回收率。
9.一种使用权利要求1所述磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法的应用，其特征在于：应用于河水、牛奶及鸡肉的磺胺二甲氧嘧啶的检测。
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