CN110982873A - 一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用 - Google Patents
一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110982873A CN110982873A CN201911178138.XA CN201911178138A CN110982873A CN 110982873 A CN110982873 A CN 110982873A CN 201911178138 A CN201911178138 A CN 201911178138A CN 110982873 A CN110982873 A CN 110982873A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alkaline phosphatase
- solution
- phosphorescence
- quantum dot
- zns quantum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 title claims abstract description 90
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 title claims abstract description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000013 phosphorescence detection Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 72
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 37
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 33
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 claims description 33
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 claims description 33
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 claims description 33
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 21
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 17
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 17
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 claims description 15
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 14
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 13
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 claims description 11
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 claims description 11
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 claims description 11
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 claims description 11
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 10
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical group O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 7
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 7
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 5
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 claims description 4
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 claims description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 4
- 229910052979 sodium sulfide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 2
- GRVFOGOEDUUMBP-UHFFFAOYSA-N sodium sulfide (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[S-2] GRVFOGOEDUUMBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 4
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229940048084 pyrophosphate Drugs 0.000 description 4
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 3
- VDQVEACBQKUUSU-UHFFFAOYSA-M disodium;sulfanide Chemical compound [Na+].[Na+].[SH-] VDQVEACBQKUUSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010019754 Hepatitis cholestatic Diseases 0.000 description 1
- 206010031149 Osteitis Diseases 0.000 description 1
- 229940123973 Oxygen scavenger Drugs 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000018339 bone inflammation disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 231100000838 cholestatic hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 208000005368 osteomalacia Diseases 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001296 phosphorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用，属于碱性磷酸酶的检测技术领域，可解决现有碱性磷酸酶的检测过程复杂，成本高以及干扰大的问题。室温下，本发明利用制备的β‑环糊精修饰的Mn:ZnS室温磷光量子点为磷光探针，焦磷酸根为分子识别单元，通过检测加入碱性磷酸酶后体系的室温磷光变化实现对焦磷酸酶的分析检测。该磷光检测体系对焦磷酸酶的响应范围为0.22‑10.4 U/L，检出限为0.045 U/L。可用于血清中碱性磷酸酶的检测，且在测定时无需复杂的样品预处理过程。室温磷光的产生也不需要加入除氧剂和诱导剂，并能够避免实际样品本底荧光和散射光的干扰。
Description
技术领域
本发明属于碱性磷酸酶的检测技术领域，具体涉及一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用。
背景技术
碱性磷酸酶一般存在于除高等植物外几乎所有的生物体内，可直接参加磷代谢，在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化过程中发挥着重要的作用。同时，碱性磷酸酶的检测是临床常规检测项目之一，主要用于诊断肝脏和骨骼系统疾病。由于它在许多疾病的诊断中都可以作为重要的生物指标，如原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎、纤维性骨炎、骨软化病等疾病的检查。如果血清中ALP值不正常，会导致某些疾病的发生，例如，骨疾病、肝癌、乳腺癌、前列腺癌症和糖尿病。因此，开发一种快速、简便、灵敏的碱性磷酸酶检测方法具有重要的现实意义。
近年来，已有多种方法用于碱性磷酸酶活性检测，包括比色法、荧光法、表面增强拉曼光谱法、电化学、化学发光方法等。在这些方法中，荧光法引起了人们相当大的关注，主要是由于方法的灵敏度高，操作方便，成本效率低，并且很容易达到一种高通量的筛选模式，遗憾的是其难以避免复杂样品尤其是生物体液本底荧光和散射光的干扰。与荧光相比，磷光具有发射寿命长、选择性好等优点，尤其对于复杂样品的测试中，其较长的激发光谱和发射光谱之间的间隙进一步降低了样品自体荧光和散射光的干扰，提高分析检测的选择性。尤其对于Mn:ZnS量子点的磷光测试中，不需要加入除氧剂和诱导剂，大大简化了磷光分析的操作。
发明内容
本发明针对现有碱性磷酸酶的检测过程复杂，成本高以及干扰大的问题，提供一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用。Mn:ZnS量子点磷光性能优异，生物相容性好，方便检测。体系的磷光强度与碱性磷酸酶浓度呈良好的线性关系，相关系数0.993。检测过程简单方便、灵敏度高、检测限低，可实现实际临床样品中碱性磷酸酶的快速灵敏检测，本发明的方法对碱性磷酸酶的检测限可达0.045 U/L。
本发明采用如下技术方案：
一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法，包括如下步骤：
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将β-环糊精、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为3.5:1:0.03-0.05的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至10.5，通氮气保护，室温下磁力搅拌40min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与Zn(Ac)2等摩尔的Na2S，室温下继续反应20-30min；再将溶液加热至50-70℃，空气中陈化1-2h，得到β-环糊精包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品，以与β-环糊精包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24 h，即可得到Mn:ZnS量子点固体粉末；
第二步：配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50 mg Mn:ZnS量子点，二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第三步，焦磷酸钠溶液的配制：
称量0.2330g焦磷酸钠，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，配成浓度为5.0mM的焦磷酸钠溶液，使用时用100 mmol/L的pH 值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液稀释至稀释10倍；
第四步，配制不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准溶液：分别配制浓度为22、42、63、84、104、133、186、245、355、450、550U/L的碱性磷酸酶标准溶液；
第五步，检测标准曲线：分别取1mL的Mn:ZnS量子点母液、50 μL的焦磷酸钠溶液和500μL的不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准溶液，用Tris-HCl缓冲溶液定容至5mL，30-40℃下孵育30-50min，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长312nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线590nm处的磷光强度P对碱性磷酸酶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；
第六步，待测样品碱性磷酸酶及其加标回收率的检测：
待测样品碱性磷酸酶的检测，用100mmol/L的Tris-HCl缓冲液将待测样品稀释至40-100倍，在比色管中，按照Mn:ZnS量子点母液和焦磷酸钠溶液的体积比为1mL:50μL的比例，分别加入Mn:ZnS量子点母液和焦磷酸钠溶液，按照Mn:ZnS量子点母液的体积和整个待测体系的体积比为1:5的比例，用稀释后的待测样品定容，35℃下孵育35min，倒入石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm；
待测样品碱性磷酸酶加标回收率的检测，用100mmol/L的Tris-HCl缓冲液将待测样品稀释至40-100倍，在比色管中，按照Mn:ZnS量子点母液和焦磷酸钠溶液的体积比为1mL:50μL的比例，分别加入Mn:ZnS量子点母液和焦磷酸钠溶液，再分别加入500μL不同浓度的碱性磷酸酶标准溶液样品，按照Mn:ZnS量子点母液的体积和整个待测体系的体积比为1:5的比例，用稀释后的待测样品定容，35℃下孵育35min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的磷光强度测量值和标准曲线方程，计算出碱性磷酸酶浓度值，得出碱性磷酸酶在待测样品中的加标回收率。
一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法应用于血清中的碱性磷酸酶的检测。
本发明的原理如下：
该检测体系在没有碱性磷酸酶的情况下具有强烈的室温磷光发射，随着碱性磷酸酶的加入，磷光逐渐猝灭。Mn:ZnS量子点体系中加入焦磷酸钠后，焦磷酸盐和Mn:ZnS量子点表面Zn2+离子的强螯合作用以及焦磷酸盐和β-环糊精之间的氢键缩短了量子点之间的距离，导致电荷从一个量子点表面陷阱转移到另一个量子点表面陷阱掺杂带的概率增加，从而使得量子点的磷光增强。碱性磷酸酶的加入使焦磷酸盐水解成正磷酸盐，螯合作用及氢键作用消失，量子点之间的距离恢复正常，使得体系的磷光逐渐猝灭。
本发明的有益效果如下：
本发明的检测方法简单、高效、经济、环保。除了具备以往Mn:ZnS量子点磷光检测的优势，如：避免生物样品自体荧光和散射光的干扰，免除繁琐的样品预处理过程，不需要加入除氧剂和诱导剂等，本发明的检测方法还具备如下优势：
1. 本发明中Mn:ZnS量子点以β-环糊精为修饰剂，焦磷酸钠通过与环糊精的超分子相互作用及其与Zn2+离子的强螯合作用，使得量子点之间的距离缩短，其磷光发射增强，加入碱性磷酸酶后，由于碱性磷酸酶催化水解焦磷酸盐形成正磷酸盐，量子点之间的距离恢复，从而使得量子点的磷光发生猝灭。
2. 本发明中Mn:ZnS量子点制备步骤简单，合成条件温和，不需要有机溶剂，得到的磷光量子点材料具有很好生物溶性和分散性，且室温磷光性能优良。
3. 碱性磷酸酶对焦磷酸钠的水解作用、焦磷酸钠与Zn2+离子的强螯合作用及其与环糊精的超分子相互作用使得本方法具有较好的选择性。
4. 本发明提出的磷光增强型分析体系同时协同环糊精的预富集作用使得本方法的灵敏度较高，分析检测碱性磷酸酶的检出限为0.045 U/L，高于其它Mn:ZnS量子点磷光分析体系2-3个数量级，该磷光检测体系对碱性磷酸酶的响应范围为0.2-10.4 U/L。
5. 本发明方法可应用于血清实际样品中碱性磷酸酶的检测，其应用范围更广。
附图说明
图1为不同浓度碱性磷酸酶存在时体系的磷光光谱图；
图2为室温磷光法检测碱性磷酸酶的标准曲线；
图3为量子点/焦磷酸检测体系磷光信号对碱性磷酸酶浓度（0-55.0 U/L）的散点图。
具体实施方式
实施例1，室温磷光检测人血清中的碱性磷酸酶
第一步，制备Mn掺杂ZnS量子点
将β-环糊精、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为3.5:1:0.05的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至10.5，通氮气保护，室温下磁力搅拌40min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与Zn(Ac)2的Na2S，室温下继续反应30min；再将溶液加热至70℃，空气中陈化1.5h，得到β-CD包覆的Mn:ZnS量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24h，即可得到所需的量子点固体粉末。
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50mgMn:ZnS量子点，用二次去离子水定容在100mL的容量瓶中。
第三步，焦磷酸钠溶液的配制：
称量0.2230g焦磷酸钠，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，配成浓度为5.0mM的焦磷酸钠溶液，使用时用100 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.5）稀释至稀释10倍；
第四步，配制不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品：
分别配制浓度为22、42、63、84、104、133、186、245、355、450、550U/L的碱性磷酸酶标准溶液。
第五步，移取1mL的Mn:ZnS量子点溶液、50μL的焦磷酸钠溶液及500μL的不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品溶液，用Tris-HCl缓冲溶液定容至5 mL，35℃下孵育35min，转入10 mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长312 nm，激发狭缝为5 nm，发射狭缝为10 nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度。将每条曲线590 nm处的磷光强度对碱性磷酸酶浓度作图，获得工作曲线。当碱性磷酸酶浓度在0.2-10.4 U/L范围内时，体系的磷光强度P与其浓度c呈现较好的线性关系（R2=0.993），回归方程为P=0.026c+0.064，以S/N=3为标准计算得检出限为0.045 U/L。
第六步，实际样品的处理：
血液样品由某医院提供，3000rpm，离心5min，取上清液。取血清10mL，加入100mmol/L的Tris-HCl缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第七步，血清样品中碱性磷酸酶的检测：
在比色管中，依次加入2mL的Mn:ZnS量子点母液，100μL的焦磷酸钠溶液，最后加入稀释后的血清样定容在10 mL的容量瓶中。35℃下孵育35min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm，因为含有碱性磷酸酶样本的磷光强度会高于无碱性磷酸酶样本的磷光强度，据此判断样品中是否含有碱性磷酸酶。
实施例2，室温磷光检测血清中的碱性磷酸酶
第一步，制备Mn掺杂ZnS量子点：
将β-环糊精、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为3.5:1:0.03的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至10.5，通氮气保护，室温下磁力搅拌40min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与Zn(Ac)2等摩尔的Na2S，室温下继续反应20min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化1.5h，得到β-CD包覆的Mn:ZnS量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24h，即可得到所需的量子点固体粉末。
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50mgMn:ZnS量子点，用二次去离子水定容在100mL的容量瓶中。
第三步，焦磷酸钠溶液的配制：
称量0.2230g焦磷酸钠，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，配成浓度为5.0mM的焦磷酸钠溶液，使用时用100 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.5）稀释至稀释10倍；
第四步，配制不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品：
分别配制浓度为22、42、63、84、104、133、186、245、355、450、550U/L的碱性磷酸酶标准溶液。
第五步，移取1mL的Mn:ZnS量子点溶液、50μL的焦磷酸钠溶液及500μL的不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品溶液，用Tris-HCl缓冲溶液定容至5mL，40℃下孵育30min，转入10mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长312nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；通过加入一定量的不同浓度梯度的碱性磷酸酶溶液以考察Mn:ZnS量子点/碱性磷酸酶核酸适配体体系对它的响应情况。碱性磷酸酶浓度增加时，体系的磷光强度随之而增强。将每条曲线590nm处的磷光强度P对碱性磷酸酶浓度c作图，获得工作曲线。
第六步，实际样品的处理：
血液样品由某医院提供，3000rpm，离心5min，取上清液。取血清10mL，加入100mmol/L的Tris-HCl缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第八步，检测碱性磷酸酶在血清中的加标回收率
在比色管中，依次加入2mL的Mn掺杂ZnS量子点母液，100μL的碱性磷酸酶适配体溶液，分别加入500μL的不同浓度的碱性磷酸酶标准样品，最后加入稀释后的血清样定容在10 mL的容量瓶中，定容后碱性磷酸的浓度分别为0.8、3.3、5.0、7.5U/L，同时做空白样，35℃下孵育35min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm。以上实验，每个浓度水平上重复3次。根据检测的磷光强度测量值，代入标准曲线方程，计算出碱性磷酸酶浓度值。
实施例3，室温磷光检测血清中的碱性磷酸酶
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将β-环糊精、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为3.5:1:0.04的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至10.5，通氮气保护，室温下磁力搅拌40min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与Zn(Ac)2等摩尔的Na2S，室温下继续反应20 min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化2h，得到β-CD包覆的Mn:ZnS量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24 h，即可得到所需的量子点固体粉末。
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50 mg Mn:ZnS量子点，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中。
第三步，焦磷酸钠溶液的配制：
称量0.2230g焦磷酸钠，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，配成浓度为5.0mM的焦磷酸钠溶液，使用时用100 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.5）稀释至稀释10倍；
第四步，配制不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品：
分别配制浓度为22、42、63、84、104、133、186、245、355、450、550U/L的碱性磷酸酶标准溶液。
第五步，移取1mL的Mn:ZnS量子点溶液、50μL的适配体溶液及500μL的不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品溶液，用Tris-HCl缓冲溶液定容至5 mL，30℃下孵育50min转入10mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长312 nm，激发狭缝为5 nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度，通过加入一定量的不同浓度梯度的碱性磷酸酶溶液以考察Mn:ZnS量子点/焦磷酸钠体系对它的响应情况。将每条曲线590 nm处的磷光强度P对碱性磷酸酶浓度c作图，获得工作曲线。当碱性磷酸酶浓度在0.2-10.4U/L范围内时，体系的磷光强度P与其浓度c呈现较好的线性关系。
第六步，实际样品的处理：
血液样品由某医院提供，3000rpm，离心5min，取上清液。取血清10mL，加入100mmol/L的Tris-HCl缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第八步，检测碱性磷酸酶在血清中的加标回收率
在比色管中，依次加入2mL的Mn掺杂ZnS量子点母液，100μL的碱性磷酸酶适配体溶液，分别加入500μL的不同浓度的碱性磷酸酶标准样品，最后加入稀释后的血清样定容在10 mL的容量瓶中，定容后碱性磷酸的浓度分别为0.8、3.3、5.0、7.5U/L，同时做空白样，35℃下孵育35min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm。以上实验，每个浓度水平上重复3次。根据检测的磷光强度测量值，代入标准曲线方程，计算出碱性磷酸酶浓度值。计算碱性磷酸酶在血清中的加标回收率，见表1，碱性磷酸酶在人血清中的加标回收率为93.75-103.03%。
表1人血清中碱性磷酸酶加标回收实验
Claims (2)
1.一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将β-环糊精、Zn(Ac)2和Mn(Ac)2按摩尔比为3.5:1:0.03-0.05的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至10.5，通氮气保护，室温下磁力搅拌40min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与Zn(Ac)2等摩尔的Na2S，室温下继续反应20-30min；再将溶液加热至50-70℃，空气中陈化1-2h，得到β-环糊精包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品，以与β-环糊精包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24 h，即可得到Mn:ZnS量子点固体粉末；
第二步：配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50 mg Mn:ZnS量子点，二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第三步，焦磷酸钠溶液的配制：
称量0.2330g焦磷酸钠，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，配成浓度为5.0mM的焦磷酸钠溶液，使用时用100 mmol/L的pH 值为8.5的Tris-HCl缓冲溶液稀释至稀释10倍；
第四步，配制不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准溶液：分别配制浓度为22、42、63、84、104、133、186、245、355、450、550U/L的碱性磷酸酶标准溶液；
第五步，检测标准曲线：分别取1mL的Mn:ZnS量子点母液、50μL的焦磷酸钠溶液和500μL的不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准溶液，用Tris-HCl缓冲溶液定容至5mL，30-40℃下孵育30-50min，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长312nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线590nm处的磷光强度P对碱性磷酸酶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；
第六步，待测样品碱性磷酸酶及其加标回收率的检测：
待测样品碱性磷酸酶的检测，用100mmol/L的Tris-HCl缓冲液将待测样品稀释至40-100倍，在比色管中，按照Mn:ZnS量子点母液和焦磷酸钠溶液的体积比为1mL:50μL的比例，分别加入Mn:ZnS量子点母液和焦磷酸钠溶液，按照Mn:ZnS量子点母液的体积和整个待测体系的体积比为1:5的比例，用稀释后的待测样品定容，35℃下孵育35min，倒入石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm；
待测样品碱性磷酸酶加标回收率的检测，用100mmol/L的Tris-HCl缓冲液将待测样品稀释至40-100倍，在比色管中，按照Mn:ZnS量子点母液和焦磷酸钠溶液的体积比为1mL:50μL的比例，分别加入Mn:ZnS量子点母液和焦磷酸钠溶液，再分别加入500μL不同浓度的碱性磷酸酶标准溶液样品，按照Mn:ZnS量子点母液的体积和整个待测体系的体积比为1:5的比例，用稀释后的待测样品定容，35℃下孵育35min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的磷光强度测量值和标准曲线方程，计算出碱性磷酸酶浓度值，得出碱性磷酸酶在待测样品中的加标回收率。
2.一种如权利要求1所述的碱性磷酸酶的室温磷光检测方法应用于血清中的碱性磷酸酶的检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911178138.XA CN110982873A (zh) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911178138.XA CN110982873A (zh) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110982873A true CN110982873A (zh) | 2020-04-10 |
Family
ID=70087369
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911178138.XA Pending CN110982873A (zh) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110982873A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112067601A (zh) * | 2020-08-05 | 2020-12-11 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种碱性磷酸酶促化学发光底物增强剂及其应用 |
| CN112748096A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-05-04 | 山西大学 | 一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107976427A (zh) * | 2017-11-08 | 2018-05-01 | 安徽师范大学 | 一种荧光生物传感器、制备方法及其对铜离子、焦磷酸根和碱性磷酸酶的检测应用 |
| CN109609125A (zh) * | 2019-02-20 | 2019-04-12 | 潍坊科技学院 | CDs/SiO2/AuNCs比率荧光探针、制备方法及应用 |
-
2019
- 2019-11-27 CN CN201911178138.XA patent/CN110982873A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107976427A (zh) * | 2017-11-08 | 2018-05-01 | 安徽师范大学 | 一种荧光生物传感器、制备方法及其对铜离子、焦磷酸根和碱性磷酸酶的检测应用 |
| CN109609125A (zh) * | 2019-02-20 | 2019-04-12 | 潍坊科技学院 | CDs/SiO2/AuNCs比率荧光探针、制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| GUOJIEQIN等: "Highly sensitive detection for alkaline phosphatase using doped ZnS quantum dots with room temperature phosphorescence and its logic gate function", 《COLLOIDS AND SURFACES B: BIOINTERFACES》 * |
| XIANGHENGNIU等: "A review on emerging principles and strategies for colorimetric and fluorescent detection of alkaline phosphatase activity", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 * |
| 吴鹏等: "基于Mn掺杂ZnS量子点的室温磷光传感应用的研究进展", 《分析化学评述与进展》 * |
| 李晓双等: "碱性磷酸酶检测方法研究进展", 《吉林化工学院学报》 * |
| 郝红叶: "基于环糊精功能化Mn掺杂ZnS量子点的光学传感体系研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)工程科技Ⅰ辑(月刊)》 * |
| 陈秋菊等: "锌基量子点的合成、表面修饰及其生物化学传感应用", 《功能材料》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112067601A (zh) * | 2020-08-05 | 2020-12-11 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种碱性磷酸酶促化学发光底物增强剂及其应用 |
| CN112067601B (zh) * | 2020-08-05 | 2022-04-22 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种碱性磷酸酶促化学发光底物增强剂及其应用 |
| CN112748096A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-05-04 | 山西大学 | 一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法及应用 |
| CN112748096B (zh) * | 2020-12-29 | 2022-03-18 | 山西大学 | 一种磺胺二甲氧嘧啶的室温磷光检测方法及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104749151B (zh) | 一种基于谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒在检测巯基化合物方面的应用 | |
| CN108517208B (zh) | 稀土比率荧光探针的制备方法及其Cu2+检测应用 | |
| CN112608734B (zh) | 一种检测碱性磷酸酶的复合荧光探针及其制备方法与应用 | |
| CN106905310B (zh) | 一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN110229165B (zh) | 上转换荧光探针罗丹明衍生物及其应用 | |
| CN111286324A (zh) | 一种用于检测水环境中次氯酸根的荧光探针及其制备方法与应用 | |
| CN110982873A (zh) | 一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用 | |
| CN104892541A (zh) | 一种用于γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针及其制备方法与应用 | |
| CN110684014B (zh) | 可用于卵巢癌的一种具有聚集诱导发射效应的水溶性荧光探针和纳米粒及其制备方法和应用 | |
| CN112730355A (zh) | 一种级联催化的纳米多酶及其制备方法和应用 | |
| CN110172070B (zh) | 一种检测粘度与过氧化氢的荧光探针及其合成方法与应用 | |
| CN113214184B (zh) | 一种用于检测甲醛的荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN110642857B (zh) | 一种用于检测粘度和pH的双功能荧光探针及其制备与应用 | |
| CN105548130B (zh) | 一种用于钴离子检测的荧光传感器及其应用方法 | |
| CN114684807B (zh) | 一种室温驱动的长波长发射荧光碳点及其制备方法和应用 | |
| CN111040465A (zh) | 一种双模态检测二氧化硫的近红外荧光探针及其制备方法和用途 | |
| CN108250188B (zh) | 一种检测铜离子的长波长荧光探针及其合成方法与应用 | |
| CN109053711A (zh) | 一种用于汞离子检测的探针化合物及其制备方法和应用 | |
| CN113340862A (zh) | 荧光分子传感器及制法、水中痕量铀酰离子的检测方法 | |
| CN113979984A (zh) | 一种水溶性黄酮类铝离子荧光探针的制备方法及其应用 | |
| CN112794819A (zh) | 一种基于分子异构化机理的可用于铁离子特异性检测的新型荧光探针的制备方法及应用 | |
| CN112409330B (zh) | 一种新型检测Hg2+的荧光分子探针的制备方法及其在环境和生物体内的应用 | |
| CN112480152B (zh) | 一种稀土荧光探针及其制备方法与应用 | |
| CN115650934B (zh) | 一种用于检测焦磷酸根和碱性磷酸酯酶的荧光分子探针及其应用 | |
| CN111875574B (zh) | 一种萘并吡喃醛衍生物及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200410 |