具体实施方式
发明人经过深入研究,首次通过筛选影响Axin与LRP5/6相互作用而得到了一系列化合物。这些化合物能够进而影响经典Wnt信号途径。由于经典Wnt信号途径与多种疾病,例如癌症、老年痴呆症、风湿性关节炎、骨质疏松症以及调控造血干细胞的发育有关,因此发现的化合物能够为治疗这些疾病提供了新的思路和途径。
具体地说,本发明提供了一种筛选影响经典Wnt信号途径的化合物的方法,所述的化合物能够通过影响Axin与LRP5/6相互作用,进而影响经典Wnt信号途径。所述方法包括:
1)将备选药物作用于Axin和LRP5/6的复合物,并检测被处理后的Axin和LRP5/6的复合物的变化情况,选择能影响Axin和LRP5/6的复合物的药物作为初筛药物;
2)用能够产生变化的特定浓度的化合物测定经典Wnt信号途径报告基因活性,包括:
a)用含报告基因TOPFlash的质粒和含内标GFP的质粒转染细胞;
b)特定时间后,加入含有1)中筛选到的特定浓度的化合物的对照培养基或含有1)中筛选到的特定浓度的化合物的Wnt3a条件培养基作用于细胞特定时间;
c)收集细胞,测定细胞裂解液中的GFP蛋白的荧光和荧光素酶的活性;
d)用GFP的荧光量使荧光素酶的活性标准化,筛选出能影响经典Wnt信号途径报告基因活性的药物。
3)从初筛药物中选出满足以下任一条件的药物作为筛选的阳性药物。
a.该药物在步骤1)中能够增强Axin与LRP5/6复合物的形成,并且该药物在步骤2)中能够提高Wnt报告基因的表达;
b.该药物在步骤1中能够抑制Axin与LRP5/6复合物形成的,并且该药物在步骤2)中能够抑制Wnt报告基因的表达。
本发明通过该方法首次发现了一些能够提高Axin与LRP5/6相互作用的化合物,并且这些化合物能够以一种依赖于Wnt受体的形式激活经典Wnt信号途径,能够增强斑马鱼造血干细胞的发育。这为进一步研究Wnt信号途径提供了有利的工具,并为寻找调节该信号途径进而治疗经典Wnt信号途径相关疾病的化合物提供了方向。
下面结合本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容,但不以此来限定本发明。应理解,这些实施例仅为了说明本发明而非限制本发明的范围。实施例所采用的具体实验方法和实验条件是本领域常规方法和条件,或制造厂商所推荐的方法和条件。除非另有定义,文中所用的专业与科学用语与本领域技术人员所知的相同。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等
MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates;the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODSIN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1
1.实验材料
1)质粒
Axin-HA和GSK3β-Myc通过PCR得到并分别克隆到哺乳动物表达载体pCMV-HA和pCMV-Myc中。(参考Chen,T.,et al.,Identification of zinc-finger BEDdomain-containing3(Zbed3)as a novel Axin-interacting protein that activates Wnt/beta-catenin signaling.The Journal of biological chemistry,2009.284(11):p.6683-9操作)
LRP6和MESD质粒(表达载体为pCS2+)由Xi He教授(Children’s HospitalBoston,USA)馈赠,此二质粒可参考文献Li,Y.,et al.,Modulation of LRP6-mediated Wnt signalingby molecular chaperone Mesd.FEBS letters,2006.580(22):p.5423-8制备。
TOPFlash质粒从Millipore的公司购买。
GFP质粒从Millipore的公司购买。
2)抗体
HA(1666606,Roche)的抗体购自Roche公司;LRP6(#3395,Cell signaling)的抗体购自Cell signaling公司。
3)试剂
蛋白酶抑制剂(完全蛋白酶抑制剂混合片剂)和NP-40购自Roche公司;
Lipofectamine和PLUS转染试剂购自Invitrogen公司;
Wnt3a条件培养基从Wnt3a细胞株(CRL-2647,购自美国ATCC细胞库)制备:采用加了10%小牛血清的DMEM细胞培养基培养Wnt3a细胞4天,然后离心收集上清培养基。
对照培养基从L细胞株(CRL-2648,购自美国ATCC细胞库)制备:采用加了
10%小牛血清的DMEM细胞培养基培养L细胞4天,然后离心收集上清培养基。
4)备选化合物的制备:
HLY78:
结构式:
制备路线:
1)以Lycorine为原料制备HLY72(5-methyl-4-vinyl-5,6-dihydro-[1,3]dioxolo[4,5-j]phenanthridine)
石蒜碱(Lycorine)(28.7mg,0.1mmol)溶解解至N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(5mL)中,加入碘甲烷(MeI)(17.0mg,0.12mmol),在50℃下搅拌反应12h,减压蒸馏出溶剂后直接用于下一步反应;在氮气保护条件下,溶解于叔丁醇(t-BuOH)(5mL)中,加入叔丁醇钾(t-BuOK)(30mg)后回流反应4小时,反应结束后加入氯化铵溶液,然后加入乙醚萃取2次(2×10ml),接着用氯化铵液洗涤2次(2×10ml),用饱和食盐水洗涤2次(2×10ml),有机层用饱和食盐水洗后用无水硫酸镁干燥,减压移除易挥发的溶剂后用硅胶色谱柱纯化(乙酸乙酯/石油醚200:1,Rf=0.23),得到HLY72,21.2mg,得率80%。
NMR、MS分析确认产物:
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.58(d,J=7.7Hz,1H),7.47(d,J=7.7Hz,1H),7.26(dt,J=10.7,7.1Hz,2H),7.16(t,J=7.7Hz,1H),6.72(s,1H),5.99(s,2H),5.75(d,J=17.8Hz,1H),5.32(d,J=11.1Hz,1H),4.03(s,2H),2.51(s,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:147.4(C),145.1(C),133.4(CH),133.2(C),129.2(C),126.4(C),125.8(C),124.9(CH),124.3(CH),122.7(CH),114.3(CH2),107.1(CH),103.6(CH),100.9(CH2),54.8(CH2),41.5(CH),EIMS m/z:266[M+H]+.
2)从HLY72出发进一步制备HLY78(4-ethyl-5-methyl-5,6-dihydro-[1,3]dioxolo[4,5-j]phenanthridine)
在氮气保护条件下,HLY72(26.5mg,0.1mmol)溶解在四氢呋喃(THF)/H2O(5mL,4:1)中,然后加入对甲苯磺酰肼(TsNHNH2)(37.2mg,0.2mmol)回流反应4小时,冷却至室温然后加入醋酸钠(NaOAc)(73.8mg,0.3mmol)反应结束后加入氯化铵溶液,然后加入乙醚萃取2次(2×10ml),接着用氯化铵液洗涤2次(2×10ml),用饱含食盐水洗涤2次(2×10ml),有机层用饱和食盐水洗后用无水硫酸镁干燥,减压移除易挥发的溶剂后用硅胶色谱柱纯化(乙酸乙酯/石油醚200:1,Rf=0.21),得到化合物HLY78,黄色固体26.8mg,得率95%。
产物m.p.(熔点)179-180°C;
NMR、MS分析确认产物:
1H NMR(400MHz,MeOD)δ:7.51(t,J=8.4Hz,1H),7.28(d,J=6.4Hz,2H),7.20(t,J=7.9Hz,2H),6.75(s,1H),6.01(s,1H),4.01(s,2H),2.83(q,J=7.5Hz,2H),2.50(s,3H),1.32(dd,J=15.7,8.2Hz,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:147.3(C),147.1(C),145.4(C),139.4(C),129.3(C),127.7(CH),126.6(C),126.3(C),124.6(CH),121.0(CH),107.2(CH),103.7(CH),100.9(CH2),55.2(CH2),41.02(CH),23.1(CH2),14.8(CH3),HREIMS m/z217.1261[M]+(calcd for C17H17NO2,267.1259).HLY179:
结构式:
制备路线如图4:
1)从HLY78出发制备HLY119(4-ethyl-5-methyl-5,6-dihydrophenanthridine-8,9-diol)
-78℃条件下,在化合物HLY78(26.7mg,0.1mmol)溶解到二氯甲烷(CH2Cl2)(2mL)中,加入三溴化硼(BBr3)(49.4mg,0.2mmol)反应2小时,反应结束后加入碳酸氢钠溶液,然后加入乙醚萃取2次(2×10ml),接着用碳酸氢钠溶液洗涤2次(2×10ml),用饱和食盐水洗涤2次(2×10ml),有机层用饱和食盐水洗后用无水硫酸镁干燥,减压移除易挥发的溶剂后用硅胶色谱柱纯化(乙酸乙酯/石油醚1:1,Rf=0.22),得到化合物HLY119,黄色固体17.9mg,得率70%。
NMR、MS分析确认产物:
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.46(d,J=7.1Hz,1H),7.27(d,J=2.7Hz,1H),7.17-7.11(m,2H),6.75(s,1H),3.96(s,2H),2.79(q,J=7.5Hz,2H),2.47(s,3H),1.28(dd,J=14.7,7.1Hz,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:143.8(C),143.0(C),139.4(C),129.0(C),127.6(CH),125.7(C),125.5(C),124.7(CH),120.9(CH),113.8(CH),113.4(C),110.4(CH),54.6(CH2),41.2(CH3),23.1(CH2),14.8(CH3);EIMSm/z:256[M+H]+.
2)从HLY119出发制备HLY165a(4-ethyl-5-methyl-8,9-bis(prop-2-ynyloxy)-5,6-dihydrophenanthridine)
在氮气保护条件下,化合物HLY119(25.5mg,0.1mmol)溶解在THF(5mL)中,然后加入氢化钠(NaH)(180mg,0.3mmol,40%)和丙炔溴(14mg,0.3mmol,80%),室温下反应8小时,反应结束后加入氯化铵溶液,然后加入乙醚萃取2次(2×10ml),接着用氯化铵溶液洗涤2次(2×10ml),用饱和食盐水洗涤2次(2×10ml),有机层用饱和食盐水洗后用无水硫酸镁干燥,减压移除易挥发的溶剂后用硅胶色谱柱纯化(乙酸乙酯/石油醚200:1,Rf=0.21),得到化合物HLY165a,黄色固体26.4mg,得率80%。
NMR、MS分析确认产物:
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.54(d,J=6.9Hz,1H),7.46(s,1H),7.23–7.12(m,2H),6.91(s,1H),4.83(s,2H),4.80(s,2H),4.02(s,2H),3.09–2.99(m,2H),2.86–2.74(m,2H),2.47(s,3H),1.29–1.17(m,3H);;13CNMR(100MHz,CDCl3)δ:147.4(C),146.8(C),145.6(C),139.5(C),128.9(C),127.9(CH),126.8(C),126.3(C),124.6(CH),121.0(CH),113.1(CH),110.5(CH),78.6(C),78.4(C),75.9(CH),75.8(CH),57.2(CH2),56.9(CH2),54.8(CH2),41.31(CH3),23.1(CH2),14.8(CH3);ESIMS m/z:330[M-H]-.
3)(R,S,S)-N,N'-(2,2'-(4,4'-(4-ethyl-5-methyl-5,6-dihydrophenanthridine-8,9-diyl)bis(oxy)bis(methylene)bis(1H-1,2,3-triazole-4,1-diyl))bis(ethane-2,1-diyl))bis(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamide)(HLY179)的制备
HLYC165a(33.1mg,0.1mmol)和化合物HLYC177(68.6,0.22mmol)溶解至叔丁醇(tBuOH)(5mL)中,抗坏血酸钠(sodium ascorbate)(19.8mg,0.1mmol)和硫酸铜(1.8mg,0.01)加入水(2mL),然后把水溶液加入叔丁醇溶液中,50℃下搅拌反应12小时,减压蒸馏移除溶剂后用硅胶色谱柱纯化(氯仿/甲醇25:1,Rf=0.23),得到化合物HLY179,黄色固体57.3mg,得率60%。产物熔点(m.p.)196-197°C;
NMR、MS分析确认产物:
1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.96(s,1H),7.95(s,1H),7.58–7.51(m,1H),7.46(s,1H),7.19–7.11(m,2H),6.97(s,1H),5.24(s,2H),5.21(s,2H),4.55–4.48(m,6H),4.46–4.39(m,2H),4.31–4.22(m,2H),4.02–3.94(m,2H),3.71–3.62(m,4H),3.35–3.26(m,4H),2.80–2.72(m,2H),2.43(s,3H),2.20–2.04(m,4H),1.75–1.46(m,8H),1.39–1.32(m,4H),1.28(t,J=7.1Hz,3H);13C NMR(101MHz,CDCl3)δ176.42,170.23,165.98,163.95,153.09,152.51,152.04,149.87,149.69,147.94,147.35,147.29,144.84,143.41,143.20,142.15,138.90,128.20,127.50,126.39,126.01,125.20,124.26,123.96,120.57,119.87,110.56,108.66,92.87,89.43,62.94,62.41,61.37,59.65,55.06,54.05,41.63,40.49,39.58,38.68,34.89,27.76,27.51,24.85,22.55,14.04,10.24;HREIMS m/z955.4321[M]+(calcd forC46H61N13O6S2,955.4307).
HLYC177
结构式:
制备路线:
1)2-Azidoethylamine(HLYC175)的制备
2-溴乙胺氢溴酸盐(2-Bromoethylamine hydrobromide)(500mg,2.44mmol)和叠氮钠(sodium azide)(475.9mg,7.32mmol)溶解到水(2mL)中,75°C下搅拌反应21小时然后冷却至0°C,加入氢氧化钾(KOH)(800mg)和Et2O(2mL),水层用乙醚萃取2次(2×10ml),有机层用饱和食盐水洗后用无水硫酸镁干燥,减压移除易挥发的溶剂后用硅胶色谱柱纯化(氯仿/甲醇20:1,Rf=0.21),得到化合物HLY175,黄色液体171mg,1.99mmol,得率82%。
NMR、MS分析确认产物:
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.27(s,2H,NH2),2.80–2.84(m,2H,CH2N3),3.30(t,J=5.7Hz,2H,CH2NH2);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:41.2(CH2NH2),54.6(CH2N3)。
2)2,5-dioxopyrrolidin-1-yl5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoate(HLYC176)的制备
Biotin(24.4mg,0.1mmol)溶解至N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(10mL)中,加入吡啶(Py)(2mL)和N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)(41.2mg,0.2mmol),反应半小时后加入N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide)(13.8mg,0.12mmol),反应24小时后停止反应,过滤后滤液减压蒸馏移除DMF,接着用热异丙醇溶剂溶解,然后过滤,滤液在4℃冰箱中沉淀2天,最后过滤得到白色固体沉淀10.2mg,得率30%。
NMR、MS分析确认产物:
1H NMR(400MHz,[D6]DMSO)δ:6.42(s,1H,3-NH),6.36(s,1H,1-NH),4.27–4.32(m,1H,6a-H),4.11–4.16(m,1H,3a-H),3.06–3.12(m,1H,SCH),2.78–2.85(m,5H,CH2CH2(succinyl),SCH2),2.66(t,J=7.3Hz,2H,2'-H),2.57(d,J=11.4Hz,1H,SCH2),1.58–1.68(m,3H,3'-H,5'H),1.35–1.54(m,3H,4'-H,5'-H);13C NMR(100MHz,[D6]DMSO)δ:170.3(N(CO)2),168.9(CO2),162.7((HN)2CO),61.0(C-3a),59.2(C-6a),55.2(SCH),39.9(SCH2),30.0(C-2'),27.8(C-4'),27.6(C-5'),25.4(CH2CH2(succinyl)),24.3(C-3');EIMS m/z:342[M+H]+。
3)N-(2-azidoethyl)-5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamide(HLYC177)的制备:
HLYC176(34.1mg,0.1mmol)溶解至DMF(2mL)中,加入三乙胺(Et3N)(12.0mg,1.2mmol),然后加入化合物HLYC175(17.2mg,0.2mmol)在室温下反应24小时,减压蒸馏移除N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后用硅胶色谱柱纯化(氯仿/甲醇20:1,Rf=0.23),得到化合物HLYC177,黄色固体21.8mg,得率70%。
NMR、MS分析确认产物:
1H NMR(400MHz,[D6]DMSO)δ:8.03(t,J=5.3Hz,1H,CONH),6.42(s,1H,3-NH),6.35(s,1H,1-NH),4.26–4.32(m,1H,6a-H),4.08–4.14(m,1H,3a-H),3.31(d,J=7.6Hz,2H,CH2N3),3.19–3.24(m,2H,CH2CH2N3),3.05–3.11(m,1H,SCH),2.80(dd,J=12.4,5.1Hz,1H,SCH2),2.56(d,J=12.9Hz,1H,SCH2),2.06(t,J=7.3Hz,2H,2'-H),1.55–1.65(m,1H,5'-H),1.39–1.55(m,3H,3'-H,5'-H),1.20–1.38(m,2H,4'-H);13C NMR(100MHz,[D6]DMSO)δ:172.4(CONH),162.7((HN)2CO),61.0(C-3a),59.2(C-6a),55.4(SCH),50.0(CH2N3),39.9(SCH2),38.1(CH2CH2N3),35.1(C-2'),28.2(C-4'),28.0(C-5'),25.2(C-3');HRESI+MS:m/z313.14419[M+H]+(calcd for C12H20N6O2S+H,313.14412).
HSS49a:
结构式:
制备方法:红花石蒜(9kg)利用甲醇回流提取浸膏后,利用100目硅胶(4kg),以氯仿-甲醇(20:1)分离,再利用MCI、凝胶色谱分离,提取组分利用HPLC(甲醇-水,10:1,保留时间:17分钟),分离得到HSS49a(500mg)。
NMR、MS分析确认产物:
1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:7.30(m,1H,),7.02(s,1H,H-7),7.01(m,1H,),6.85(m,1H),6.76(m,1H),6.69(s,1H,H-10),6.01(s,2H,,-OCH2O-),4.28-4.19(m,2H,H-6);13C NMR(CDCl3,400MHz)δ:147.6,(C)147.5(C),146.6(C),133.9(C),131.1(C),129.9(CH),129.0(CH),118.1(CH),111.0(CH),110.9(C),110.2(CH),109.9(CH),101.3(CH2,-OCH2O-),63.8(CH2),30.8(CH3);ESI+MS m/z258[M+1]+.
2.实验方法
1)细胞培养
HEK293T,细胞在含10%胎牛血清的DMEM(Invitrogen)培养液中培养,37℃,CO2浓度5%。稳定分泌小鼠Wnt3a的L细胞株(CRL-2647购自美国ATCC细胞库)及对照株(CRL-2648购自美国ATCC细胞库),该细胞在生长至大约70%密度时对其进行换液(含10%胎牛血清的DMEM),连续培养四天后,收集培养液并离心,经液氮速冻后-80℃长期保存。
2)细胞转染HEK293T细胞在转染前24小时分盘,培养一天后进行转染。转染所用质粒转染试剂以24孔盘每孔的用量来计算:质粒总量为250ng/孔,如转染质粒量不足用lacZ质粒补足;质粒首先加入无血清的培养基(25μL/孔)中混匀,然后按照1μL/孔加入PLUS试剂(Invitrogen)混合,静置15分钟;按照1μL/孔的量将Lipofectamine(Invitrogen)脂质体加入无血清DMEM培养基(25μL/孔)中混匀,再与上述质粒和PLUS的混合溶液混合,静置15分钟;将细胞换入无血清DMEM培养基(200μL/孔),朝细胞中滴加入最终的质粒、PLUS和Lipofectamine的包装混合物,孵育3小时进行转染,过后用含10%胎牛血清的培养基中止转染反应。
3)对Axin和LRP5/6的复合物的影响检测
参考2)在HEK293T细胞中转入Axin-HA,LRP6,GSK3β-Myc,和MESD的质粒,在细胞培养液中加入10μM的待筛化合物。作用24小时后,收集细胞做免疫共沉淀实验,利用HA标签的Axin共沉淀LRP6蛋白。Western blot检测Axin-HA结合的LRP6的量。分析筛选化合物和溶剂对照DMSO(二甲基亚砜)对于Axin-HA和LRP6结合的影响。如果Axin-HA结合的LRP6的量增加即表明小分子能够增强它们的结合,反之,如果Axin-HA结合的LRP6的量减少即表明小分子能够抑制它们的结合。
4)报告基因测活
将用于测定报告基因活性的HEK293T细胞在转染前24小时分入24孔盘中,并以2)的方法进行转染。转染的各质粒量为,2.5ng/孔TOPFlash和2.5ng/孔作为内标的GFP质粒。余下用lacZ补齐250ng/孔。在转染后18小时加入加有小于等于20uM的小分子药物的Wnt3a条件培养基刺激6-8小时,用Boehringer MannheimLuci-ferase Assay Kit裂解细胞(200μL/孔),用荧光计FL600(BIO-TEK Inc.Winooski,VT)测细胞裂解液中GFP蛋白的强度,作为细胞表达量的内标,然后用每孔20μL荧光素酶的底物,用Micro Lumate Plus(Perkin Elmer Inc.Wellesley,MA)luminometer测定荧光素酶活性,活性越高表示Wnt报告基因表达量越高。最后用GFP的荧光量为内标修正荧光素酶的活性数据。同时以含有初筛药物的对照培养基进行平行试验作为对照,以及只加溶剂对照DMSO的Wnt3a条件培养基平行试验作为对照
5)免疫共沉淀
将转染的HEK293T细胞(6孔盘)弃去培养基,并置于冰上。加入500μL/孔细胞裂解液(1mM焦磷酸,2mM Na3VO4,10mM NaF,50mM Tris-HCl pH7.4,150mM NaCl,1mM EDTA,5%甘油,1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂)裂解细胞。冰上裂解10分钟后,将细胞收到1.5mL的Eppendorf管中,4℃,13,000rpm离心10分钟。将裂解液上清转移到另一干净EP管中。取30μL与2×SDS样品缓冲液混合,100℃煮样10分钟。其余裂解液上清中加入BSA至0.2%,并加入HA标签的抗体,4℃旋转混合2小时后,补加Protein A/G树脂25μL/管,4℃继续混合1小时后用裂解缓冲液洗涤树脂3次,最后加SDS样品缓冲液,100℃煮沸。免疫共沉淀后的样品和之前的上清样品分别进行SDS-PAGE电泳后做免疫印迹检测。
6)Western blot
配制合适浓度的SDS-PAGE胶,加入蛋白样品并进行电泳分离。经电转将蛋白质转到硝酸纤维膜上,硝酸纤维膜用封闭液(0.5%脱脂牛奶)封闭1小时,用TTBS洗涤3次,每次5分钟,再加HA或LRP6的抗体室温孵育1小时。一抗处理过后用TTBS洗涤3次,每次5分钟,最后加入针对一抗物种的HRP二抗,室温孵育1小时,洗涤三次后,HRP偶联二抗免疫印迹的硝酸纤维素膜加入反应底物后用FujiFilm Las4000曝光扫描。
7)斑马鱼的品系和培养条件
Tüebingen strain的斑马鱼培养在28.5℃的水中。
8)斑马鱼的原位杂交实验
原位杂交是一种可以对组织内特定核酸进行定量定位的方法。在斑马鱼胚胎中通常所用的都是RNA探针,用来检测特定mRNA的表达。最常用的外缘标记物是地高辛(Digoxigenin,Roche),具体的原位杂交技术已经很成熟(Thisse,C.and B.Thisse,High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.Nat Protoc,2008.3(1):p.59-69.)。本实验中所用的探针是runx1和c-myb,它们都是标记斑马鱼造血干细胞的基因(North,T.E.,et al.,Prostaglandin E2regulates vertebrate haematopoietic stem cellhomeostasis.Nature,2007.447(7147):p.1007-11.;Burns,C.E.,et al.,A genetic screen in zebrafishdefines a hierarchical network of pathways required for hematopoietic stem cell emergence.Blood,2009.113(23):p.5776-82.)。质粒PBSK-runx1和PBSK-cmyb分别被HindⅢ和BamhⅠ线性化,纯化模板后用T7体外转录酶(Ambion)合成相应的探针。原位杂交之后,所有的照片都是在室温下通过Olympus的DP71相机在Olympus的显微系统下拍摄(SZX16,10×或40×;Olympus)。
1.实验结果
1)HLY78和HLY179能够增强Axin与LRP6的相互作用
发明人通过免疫共沉淀筛选系统发现HLY78和HLY179能够增强Axin与LRP6的相互作用(图2);而其他的如HLYC177和HSS49a对于Axin与LRP6的相互作用没有影响(图2)。
2)HLY78和HLY179能够以依赖于Wnt3a受体的形式激活经典Wnt信号途径的报告基因系统
为了验证筛选到的化合物是否能够影响经典Wnt信号途径,发明人利用经典Wnt信号途径的报告基因系统继续筛选化合物。发现HLY78和HLY179能够协同Wnt3a激活经典Wnt信号途径的报告基因系统(图3);而HLYC177和HSS49a不影响经典Wnt信号途径的报告基因系统(图3)。
3)HLY78能够提高斑马鱼中造血干细胞的形成
为了验证我们筛选到的化合物的确能够在生物体内起作用,我们选取了斑马鱼的造血干细胞系统。已有文献报道提高经典Wnt信号能够促进造血干细胞的形成(Goessling,W.,et al.,Genetic interaction of PGE2and Wnt signaling regulates developmentalspecification of stem cells and regeneration.Cell,2009.136(6):p.1136-47)。
在斑马鱼三体节时加入80μM的HLY78和溶剂对照DMSO。24小时后收集斑马鱼胚胎做原位染色实验,检测造血干细胞的标记物runx1/cmyb的mRNA水平表达。
在我们的研究中,我们的确看到了HLY78能够显著性提高造血干细胞的标记物runx1/cmyb,也就是HLY78能够显著性提高造血干细胞的数量(图4)。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案,并不能理解为对本发明的限制。此外,本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化,在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述,但应当理解,本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上,各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。