KR100355006B1 - 폴리비닐알콜을 토대로 한 자기중합체 입자, 그것의 제조방법 및 용도 - Google Patents

폴리비닐알콜을 토대로 한 자기중합체 입자, 그것의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PVAL의 구형 입자의 제조 방법에 관한 것으로서, 자기 콜로이드(magnetic colloid)가 분산되어 있는 수성 PVAL 용액은, 중합체 상과 혼합될 수 없는 두 개 이상의 에멀션화제(emulsifier); 및, 상기 PVAL 방울(droplet)을 교차-결합(cross-link)시키기 위해 현탁 과정중에 첨가되는 히드록실 그룹(hydroxyl group)과 반응하는 수용성 제제를 함유하는 유기상(organic phase)에서 교반함으로써, 실온에서 현탁되는 것을 특징으로 하는 PVAL의 구형 입자의 제조 방법을 제공한다.

Description

폴리비닐 알코올을 토대로 한 자기 중합체 입자, 그것의 제조 방법 및 용도{MAGNETIC POLYMER PARTICLES ON THE BASIS OF POLYVINYL ALCOHOL, PROCESS FOR THE PRODUCTION AND USE}
최근에 이르러, 자기 중합체 비드는 세포, 단백질 및 핵산을 분리하기 위해 생화학 및 의학 분야에서 주로 사용되어 왔다. 자기 중합체 비드의 자기 성질을 고려해볼 때, 자기 중합체 비드는 또한 신체의 특정 부분에 특정 약물을 운반하기 위한 시스템으로서 사용될 수도 있다. 자기 비드를 사용함으로써 종래의 분리 시스템을 능가하는 대단히 큰 실제적인 이익을 얻을 수 있는데, 왜냐하면, 보통 미세한 현탁액(suspension) 또는 에멀션(emulsion)의 형태를 취하고 있는 자기 입자들이 자기력에 의하여 혼합물로부터 분리될 수 있기 때문이다. 이러한 분리 기법은 정규의 원심분리를 필요로 하지 않는다. 자기 분획(magnetic fraction)은 또한 일 분내에 분리될 수 있으며, 따라서 정규의 크로마토그래피를 이용한 칼럼 분리 기법과비교하여 아주 많은 시간을 절약하게 된다. 상기 언급된 칼럼 분리 기법의 필수 부분은 시간이 많이 소모되는 평형 및 용출 과정이며, 이 과정들은 자기 비드 기법을 이용했을 때에는 실제로 생략될 수 있다. 자기 비드 기법의 보다 중요한 장점은 반응 속도론(reacion kinetics)의 방식이다. 보통 칼럼 크로마토그래피에서는 50 내지 100㎛의 입자 크기를 가지고 있는 충전 물질(packing material)이 사용된다. 그러나, 이러한 입자 크기에 대해서 분리능이 흔히 부적당하기 때문에, 50㎛ 미만, 심지어는 10㎛ 미만의 입자 크기를 사용하는 경향이 증가되고 있다. 칼럼을 통과하는 동안 생성되는 고압을 견디기 위해서 이러한 매질은 실제로 더 이상 다공성이 아니다. 이것이 바로 실제로 투명한 플라스틱 또는 유리 칼럼으로부터 내압성 (pressure-resistant) 강 (steel) 칼럼으로 바뀌었어야만 하는 이유이다. 현재 사용되고 있는 칼럼 크로마토그래피 기법의 또 다른 단점은 강력한 펌프 시스템이 필요하다는 것이다. 궁극적으로는 부적당한 반응 속도론에 기인한 이들 단점은 자기 비드 기법을 사용함으로써 완전하게 피할 수 있다.
입자 크기가 1 내지 10㎛, 바람직하게는 1 내지 4㎛인 미세하게 분산된 PVAL 입자들을 사용함으로써, 입자들은 여러 시간동안 현탁 상태로 유지되며, 그래서 반응 속도론은 유사-균질(quasi-homogeneous)용액의 반응 속도론에 상응한다. 이러한 안정한 현탁의 결과로, 대부분의 경우에 교반(stirring) 또는 쉐이킹(shaking)이 또한 필요없을 수 있다.
철-덱스트란(iron-dextrane) 미소입자들을 제조하는 방법은 미국 특허 제 4,452,773 호에 설명되어 있다. 내부에 덱스트란이 흡수되어 있는 30 내지 40nm의큰 콜로이드 산화 철 입자들은 Fe(II)와 Fe(III) 함염(saline) 용액을 규정된 양의 덱스트란의 존재하에 혼합하고 계속해서 알칼리를 첨가함으로써 얻어진다. 이것과 유사한 방법이 PCT 출원 WO 90/07380 호의 기초를 형성한다. 덱스트란이 Fe(II)와 Fe(III) 함염 용액에 첨가되고 40??에서 처리된 후, NaOH로 적정되어 크기가 40 내지 100nm인 과상자성(superparamagnetic) 입자들이 제조된다. 상기 두 가지 방법의 단점은 입자의 정밀함 때문에 높은 그레디언트(gradient)의 자기장에 의해서만 분리가 가능하다는 것이다. 이러한 높은 그레디언트의 자기장은 극 모양의 두 개의 강한 전자석 또는 손 자석 사이에 놓여 있는 스틸 울(steel wool) 또는 유사한 미소입자 물질로 조밀하게 충전되어 있는 분리 칼럼에 의해 생성된다. 입자들은 충전된 분리 칼럼을 통하여 현탁액을 통과시킴으로써 분리된다. 이러한 콜리이드의 분리는 보통의 손 자석으로는 이루어지지 않는다. 그러므로, 원칙적으로는 통상적인 크로마토그래피 기법들 사이에 실험적인 차이는 거의 없다. 상기 언급된 제조 방법의 또 다른 단점은 실제의 제조 방법에 의해서는 균질한 입자 크기가 얻어질 수 없다는 것이다. 이것은 오직 분획화된 자기 분리에 의해서만 가능하다. 게다가, 이들 자기 입자들의 검출은 또한 입자들이 광-광학 현미경하에서 더 이상 보이지 않는다는 사실에 의하여 복잡해진다. 미국 특허 제 4,070,246호의 기초를 형성하는 추가의 방법에서, 자기 입자들은 p-아미노벤조산(p-aminobenzoic acid)과 알데히드(aldehyde)를 강자성(ferromagnetic) 분말의 첨가를 통해 전환시킴으로써 얻어진다. 진단 시험을 위해 통상적으로 요구되는 규정된 비드의 제조는 이 방법으로는 가능하지 않다. 또한 생체분자를 이 담체(carrier)에 화학적으로 결합시키는것도 가능하지 않다. 동일한 원리가 미국 특허 제 4,106,448호, 4,136,683호 및 4,735,796호에서 설명된 방법에도 적용되는데, 이들 특허에서는 자기 입자들이 진단 및 종양 치료를 위하여 덱스트란 내에 캡슐화(capsulation)된다. 상기 언급된 방법에서 생체분자들의 공유 결합은 또한 설명되어 있지 않다. 미국 특허 제 4,647,447호에는 NMR 진단을 위한 강자성 입자들의 제조가 설명되어 있다. 이 방법은 Fe(I)/Fe(III) 함염 용액을 이용하거나 또는 혈청 알부민, 다당류, 덱스트란 또는 덱스트린(dextrin) 형태의 착화제(complexing agents)의 존재하에 자기 현탁액으로 전환된 아철산염(ferrites) 미소입자를 직접 이용하여 시작된다. 실란 매트릭스(silane matrix)로 캡슐화되어 있는 다른 강자성 입자들은 미국 특허 제 4,628,037호에서 다루어진다. 미국 특허 제 4,827,945호에 설명된 과상자성 산화 철은 또한 NMR 진단에서 대조 매질로서 사용된다. 코팅된 자기 입자들은 혈청 알부민, 폴리펩티드 또는 다당류의 존재하에 염기에 의한 Fe(II)/Fe(III) 함염 용액의 침전을 통하여 이들 물질을 사용하여 제조될 수 있다. 자기 입자들은 매트릭스에 특정 항체를 결합시킴으로써 신체의 특정 영역으로 표적화될 수 있다. 덱스트란 또는 폴리글루타르알데히드(polyglutaraldehyde)의 존재하에 철 염의 침전을 통한 철 산화물의 제조는, 예를 들면 미국 특허 제 2,870,740호 및 4,267,234호의 기초를 형성한다. 상기 언급된 방법들 및 그것의 생성물들은 공통된 한 가지를 가지고 있다. 즉, 강자성 또는 과상자성 입자들은 함염 용액의 침전을 통해서만 제조되며, 이것은 착화제 또는 코팅제의 존재하에 Fe(II) 및 Fe(III) 염의 특정 몰비를 나타낸다. 설명된 입자들은 다소 넓은 범위의 입자 크기를 나타낸다. 규정된 방울 또는구형의 입자들은 상기 언급된 방법으로 제조될 수 없다. 설명된 물질들은 비결정질과 같은 기하 구조를 나타낸다. 보통 nm 범위인 이들의 정밀도 때문에, 이것들은 주로 NMR 진단용 대조 매질 또는 세포 표시자(cell marker)로서 적당하다. 더욱이, 자기 분획들의 분리는 빠른 진단 시험 또는 친화성 크로마토그래피 분리에 대해 유리한 것처럼 통상적으로는 간단한 손 자석으로 가능하지 않다. 진단 시험뿐만 아니라 바이러스 및 세포 분리에 대해 사용될 수 있는 특정 결합제로 코팅된 자기 알부민 또는 단백질 미소입자들의 제조는 미국 특허 제 4,345,588호, 4,169,804호, 4,115,534호, 4,230,685호, 4,247,406호 및 4,357,259호에 기재되어 있다. 규정된 비드-형 구조를 갖는 자기 입자들은 미국 특허 제 4,861,705호로부터 공지된다. 상기 언급된 특허의 주제는 오일 상에 중합체 상의 현탁을 통해 생성된 아가로스 폴리알데히드(agarose polyaldehyde) 복합(composite) 입자이다. 입자의 크기가 40 내지 1000㎛ 인 자기 중합체 입자들은 매우 미세한 과상자성 수성 산화 철 콜로이드를 규정함으로써 유동성 철(ferrofluid)을 중합체 상에 혼합시킴으로써 얻어진다.
완전하게 비드-형인 입자들은 미국 특허 제 4,654,267 호에 설명되어 있다. 이 방법은 현탁 중합법에 의하여 비드-형 입자들로 초기에 라디칼성으로(radically) 중합된 폴리아크릴레이트(polyacrylate) 또는 폴리스티렌(polystyrene)이 매트릭스로 사용된다는 점에서 상기 언급된 방법들과 다르다. 그런 다음 입자들은 규정된 조건하에서 유기 상에서 팽창된다. 다음 단계로 일단 입자들이 확산되면 암모니아를 사용하여 과상자성 산화 철로 산화된Fe(II)/Fe(III) 함염 용액중에서 중합체 입자들이 인큐베이션된다. 이 방법으로 입자의 크기가 0.5 내지 20㎛ 사이에 있는 구형 입자들이 제조된다. 이 방법 자체는 기술적으로 매우 복잡하다. 매우 독성인 물질의 사용과는 별도로, 염기성 매트릭스를 제조하기 위해서는 10 내지 30 시간이 필요하다. 더욱이, 추가의 니트로(nitro), 니트로소(nitroso) 또는 아미노(amino) 그룹이 필요한데, 이것들은 Fe 염의 적당한 흡수를 보증하기 위하여 추가의 제조 단계에서 중합체 매트릭스로 주입된다. 여기에서 설명된 입자의 큰 단점은 염기성 중합체, 즉 폴리스티렌이다. 폴리스티렌은 단백질 용액 또는 다른 생체분자들과 접촉했을 때 비특이적으로 흡수하는 경향이 강한 매우 소수성인(hydrophobic) 물질이다. 이런 현상은 면역검정(immunoassays) 및 친화성 크로마토그래피 분리에서 특히 불리하다. 제조 비용 및 노력, 입자들의 기하 구조, 자기 분리 방식, 중합체 매트릭스의 성질 또는 커플링 과정의 유형의 견지에서 볼 때 상기 언급된 방법들의 결점은 신규한 유-중-수 현탁액 과정에 의하여 회피될 수 있다. 이 방법에서 사용되는 중합체 매트릭스는 폴리비닐 알코올 (PVAL)로서, 이것은 물과 혼합될 수 없는 유기상에서 교반됨으로써 수용액으로 현탁되고 교차 결합(crosslink)된다. 이러한 유기상의 실례는 일반적으로 현탁 중합법의 최신식 기술로부터 알 수 있다. 통상적인 식물성 기름이 본 발명에 따른 방법에 대해 바람직하게 사용된다. 중합체 입자의 원하는 자기 성질을 달성하기 위해서는, 중합체 상은 자기 콜로이드, 예컨대 산화 철 분말 또는 유동성 철과 혼합된 후, 오일상에 현탁된다. 중합체 수용액의 현탁을 통한 비드-형 PVAL 입자의 제조는 독일 특허 출원 41 27 657호에 설명되어 있다. 자기 입자들은자기 분말을 중합체 용액에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 상기 언급된 방법은 에멀션화제(emulsifier) 또는 다른 계면활성제 형태의 첨가제를 함유하지 않은 오일상과 중합체 용액을 사용한다. 이러한 이유로, 입자 크기는 아주 쉽게 50 내지 500㎛ 사이에 있을 수 있다. 입자의 크기는 상기 언급된 방법에서 유기 및/또는 중합체 상의 점도에 의해 주로 결정된다.
본 발명은 중합체 비드(bead)에 자기 성질(magnetic property)을 부여하고 중합체 비드들이 생체 분자 또는 세포에 결합하는 것을 가능하게 하는 자기 콜로이드가 그 안에 캡슐화되어 있는, 폴리비닐 알코올 (PVAL)을 토대로 한 구형 형상의 중합체 입자들 (비드)의 제조를 위해 적용된 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 입자의 크기가 1 내지 10㎛, 바람직하게는 1 내지 4㎛의 범위내에 있으며, 또한 매우 좁은 입자 크기 분포를 보이는 자기 입자를 제조하는 것이다. 이러한 입자들만이 세포 분리/분류, 현탁 상태의 생체 물질 정화 및 진단 검정에 사용될 수 있다.
흥미롭게도, 이러한 중합체 입자들은 특정 에멀션화제 혼합물을 오일상에 첨가함으로써 얻어질 수 있다는 것이 밝혀졌다. 에멀션화제라는 용어는 하기에서 텐사이드(tensides), 세제 또는 현탁 안정화제와 같은 모든 계면활성제에 대한 일반적인 용어로 정의된다. 오일상에 대한 첨가제로 적당한 에멀션화제의 실례로는 산화 프로필렌-산화 에틸렌 블록 공중합체, 소르비탄(sorbitan) 지방산 에스테르, 펜타에리트리톨(pentaerythritol) 지방산 에스테르와 시트르산(citric acid)의 복합(complex) 혼합된 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 캐스터 오일 유도체(polyethylene glycol castor oil derivatives), 캐스터유 유도체들의 블록 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 변형된 폴리에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 에틸렌디아민 블록 공중합체, 폴리글리세롤 유도체, 폴리옥시에틸렌 알코올 유도체, 알킬페닐폴리에틸렌 글리콜 유도체, 폴리히드록시 지방산 폴리에틸렌 글리콜 블록 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜 에테르 유도체가 있다. 상기와 같은 종류의 물질들은 다음과 같은 상표명으로 시판되고 있다: 플루로닉(등록상표)(Pluronic), 신페로닉(등록상표)(Synperonic), 테트로닉(등록상표)(Tetronic), 트리톤(등록상표)(Triton), 아르라셀(등록상표)(아르레이셀), 스팬(등록상표)(Span), 트윈(등록상표)(Tween), 브리즈(등록상표)(Brij), 레녹스(등록상표)(Renox), 하이퍼머(등록상표)(Hypermer), 레임폼(등록상표)(Lameform), 디히물스(등록상표)(디히물스) 또는 에우물긴(등록상표)(Eumulgin). 요구되는 입자 크기가 1 내지 10㎛인 균질한 비드-형 중합체 입자에 관해서는, 두 가지 이상, 바람직하게는 세 가지 내지 네 가지의 계면활성제 혼합물만이 오일상에 필요한 입자 내역이 될 수 있는 것으로 나타났다. 필요한 입자 크기를 실현시키기 위한 한 가지 조건은 상들의 계면 장력(interfacial tension)의 상응하는 감소이다. 이것은 친지방성 에멀션화제 성분을 물과 오일 두 가지 모두에 가용성인 반-친수성을 갖는 하나 이상의 에멀션화제와 혼합함으로써 가능하다. 후자의 필요조건을 만족시키는 에멀션화제의 실례로는 주된 부분이 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide)인 에틸렌 옥사이드 프로필렌 옥사이드 블록 공중합체 유도체, 폴리에틸렌 글리콜 헥사데실(hexadecyl) 에테르, 보다 짧은 사슬의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 보다 짧은 사슬의 소르비탄 지방산 에스테르가 있다.
오일상 내의 에멀션화제 농도는 통상 2 내지 6 부피%, 바람직하게는 3.5 내지 5.0 부피% 이다. 중합체 방울의 정밀도 및 좁은 입자 크기 분포에 관해서는, 두 가지 이상의 친지방성 성분과 하나의 반-친수성 에멀션화제를 함유하고 있는 에멀션화제 혼합물이 가장 적당하다. 반-친수성 에멀션화제의 농도는 통상적으로 에멀션화제 총량에 대하여 15 내지 30 부피% 사이에 있다. 본 발명에 따른 방법은 입자들의 정밀도뿐만 아니라 비드-형 입자들의 제조도 가능하게 하며, 이러한 것은 균질한 현탁액의 필수조건이다. 이것은 생화학적 및 의학적 분석/진단시에 요구되는 정확한 피펫 작업(pipetting)을 가능하게 한다. 오일 상에 대한 에멀션화제와는 별도로, 수성 중합체 상에 가용성인 특별한 계면활성제가 또한 현탁액의 질을, 특히 저분자량(20,000 - 80,000)의 중합체 용액에 대해 향상시키는 것을 도와준다. 나아가, 고체 형태로 첨가된 자기 콜로이드가 이온성 에멀션화제를 첨가한 후에 미세하게 분산되기만 하는 것을 알 수 있다. 이성분 혼합물로서도 사용될 수 있는 이러한 이온성 에멀션화제들의 실례로는 혈청 알부민, 젤라틴(gelatin), 지방족 및 방향족 술폰산 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-노르말-비닐피롤리돈(poly-n-vinylpyrrolidone) 또는 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트(cellulose acetate butyrate)가 있다. 사용되는 에멀션화제의 양은 통상 중합체 상에 대하여 0.01 내지 2 중량%이며, 그로써 이온성 에멀션화제의 농도는 0.01 내지 0.05 중량% 일 수 있다. 독일 특허 출원 41 27 657호에서 알 수 있는 바와 같이, 두 개 상의 농도 및 점도뿐만 아니라 교반 속도와 같은 입자 크기에 미치는 영향은 첨가되는 에멀션화제를 고려할 때 본 발명에 따른 방법에서 단지 부속적인 역할만을 한다. 1 내지 10㎛의 필요한 입자 크기를 얻기 위해서는 1500 내지 2000rpm의 교반 속도가 적당하며, 그로써 정규의 두-날 프로펠러 혼합기가 사용된다. 본 발명에서 입자 크기에 대한 에멀션화제의 결정적인 영향은, 만약 교반 속도가 2000rpm 에서 1300rpm 으로 감소되면, 입자 크기는 1 내지 5㎛에서 2 내지 8㎛로 증가한다는 사실로부터 명백해진다. 만약 교반 속도가 2000rpm으로부터 5000rpm으로 증가한다면, 입자 크기에 실제적인 변화는 없다. 다른 한편으로, 상기 언급된 방법들에 의하여 제조된 입자들의 크기는 교반 속도를 유사하게 변화시켰을 때 10㎛ 내지 80㎛ 사이로 다양하다. 상기 언급된 특허에서 관찰된 입자 크기에 미치는 현탁액 상과 중합체 상 두 가지 모두의 점도 영향은 또한 본 발명의 에멀션화제의 영향력에 비교하여 최소이다. 그러므로, PVAL 입자들의 크기는 본 발명에 따른 방법에서 중합체 상의 점도를 10mPa에서 1000mPa로 변화시켰을 때 단지 2 내지 8㎛ 사이에서 변동하며, 동일한 조건하에서 상기 언급된 방법들에서는 50 내지 140㎛ 사이에서 변동한다.
원칙적으로, 상응하는 입자 크기를 갖고, 일반적으로 50 내지 400 가우스(Gauss)의 자기 포화도(magnetic saturation)를 갖는 철-(ferro-) 또는 과상자성 콜로이드는 현탁 교차 결합 과정중에 중합체 매트릭스 안에 캡슐화하기 위한 자기 입자로 사용될 수 있다. 자기 입자로서 만족시켜야 할 다른 선행조건은 수성 중합체 상에서의 분산이다. 철 염(iron salt)을 이용한 복잡한 팽창 과정과 이어지는 자기 콜로이드로의 산화과정을 토대로 한 미국 특허 제 4,654,267 호에 설명되어 있는 바와 같은 자기 입자를 제조하기 위한 방법과는 달리, 자기 콜로이드는 직접 본 발명의 중합체 상에 분산될 수 있다. 그런 다음 이어지는 유기 상에서의 현탁 과정 동안에 자기 콜로이드는 동시에 중합체 비드로 캡슐화된다. 이것은 상기언급된 방법들에 비해 상당히 단순화된 과정이며, 또한 제조 방법면에서도 많은 시간이 절약됨을 의미한다. 폴리스티렌을 토대로 한 상기 언급된 제제들을 제조하기 위해 필요한 제조 시간은 10 내지 30시간인 반면, 본 발명에 따른 방법은 염기성 자기 입자들을 제조하기 위해 단지 5 내지 30분만이 소요된다. 입자 크기가 10 내지 200nm인 자철광(magnetite)이 바람직하게는 자기 콜로이드로 사용되며, 그로써 본 발명에 따른 방법은 이런 유형의 물질로 한정되지 않는다. 이러한 물질은, 예를 들면 베이페록스(Bayferrox) 또는 이엠지(EMG)[페로플루이딕스(Ferrofluidics)]라는 상표명으로 시판된다. 이러한 콜로이드의 제조가 최신식 기술이기 때문에, 자기 입자들은 또한 공지된 방법, 예를 들면 신까이 등에 의한 1991년도 생체 촉매반응 제 5 권 61 페이지, 라이머스와 칼라팔라에 의한 영국 특허 제 1,439,031호 또는 콘도 등에 의한 1994년도 응용 미생물학 생체기술 제 41 권 99 페이지에 설명된 것과 같이 제조될 수 있다. 각각의 경우에 중합체 상에 대한 중합체 상에서 콜로이드 농도는 이것들의 제조 방법을 고려할 때 이미 수성인 콜로이드의 경우에는 4 내지 14 부피% 이고, 고체 물질인 경우에는 0.3 내지 2 중량% 이다. 자기 콜로이드는 제조되는 동안 직접 중합체 상에 혼합된다. 미세하게 분산되는 것을 보증하기 위하여, 입자들의 고른 분포, 고속 분산기 [울트라-튜랙스(Ultra-Turrax)]를 이용한 수성 분산액의 단기간 혼합 및 뒤이은 초음파 처리가 유익하다.
자기 입자들을 제조하기 위하여 필요한 중합체 상은 보통 2.5 내지 10 중량% 의 PVAL 로 구성된다. 독일 특허 출원 41 27 657 호로부터 알 수 있는 바와 같이, 중합체 입자들의 다공성은 궁극적으로는 중합체 코일 밀도에 의해 결정되며, 상기중합체 코일 밀도는 또 중합체의 평균 분자량 및 농도에 의해 결정된다. 더 큰 분자량 및/또는 더 낮은 중합체 농도는 더 낮은 코일 밀도와, 그로써 다공성이 증가하는 것을 의미한다. 특히 관례적인 진단 또는 분석 과정 중에 시험 공정의 실행성은 담체의 양 당 흡수된 물질의 양에 좌우되기 때문에, 다공성은 자기 입자가 제조되는 동안 공동-결정 인자로서 중요한 역할을 한다. 이것이 본 발명에 따르는 물질에 2.5 내지 5 중량%의 농도와 50,000 이상의 분자량을 가지는 중합체가 사용되는 것이 바람직한 이유이다. 이런 방식으로 제조된 중합체 입자들은 매트릭스와 결찰물(ligates)에 결합된 리간드 및 리간드에 의해 결합된 생체 분자 두 가지 모두에 의해 높은 다공성과 상응하는 높은 결합 능력을 갖는다. 다공성과 그로 인해 자기 입자들의 기능성에 영향을 미치는 추가의 인자는 교차결합제 및 이것의 농도 선택이다. 높은 부하 용량의 견지에서 볼 때, 교차결합제의 농도는 적절한 차원 안정성(dimensional stability)과 함께 상응하는 다공성을 보증하기 위하여 선택된다. PVAL의 히드록실 그룹(hydroxyl group)과 반응할 수 있는 모든 수용성 이작용기성 화합물들은 원칙적으로, 예컨대 알데히드, 산 염화물(acid chloride) 또는 디비닐 술폰(divinyl sulfone)은 교차결합제로 사용될 수 있다. 산 촉매하의 글루타르알데히드는 이 물질이 수분내에 중합체와 반응하여 단단하게 교차결합된 입자들을 생성하기 때문에 바람직하게는 교차결합제로 사용된다. 다른 물질의 경우에는 1 내지 2 시간 사이의 반응 시간이 필요하다. 글루타르알데히드의 사용은 또한 예컨대 에틸렌디아민(ethylenediamine) 또는 헥사메틸렌디아민(hexamethylenediamine)과 같은 수용성 디아민의 동시 첨가를 통해 디아민 사슬 길이만큼 교차결합제를 연장시키는 기회를 제공함으로써, 중합체 매트릭스의 다공성을 증가시킨다. 수성 중합체 상에 대한 교차결합제의 농도는 통상적으로 0.2 내지 1 부피% 이며, 글루타르알데히드에 대해서는 2 내지 7 부피% 이다. 글루타르알데히드는 때로 6 내지 25%의 수용액 형태로 사용되기도 한다. 글루타르알데히드의 양에 대하여 10 내지 50 몰% 사이가 보통 사용된다.
자기 입자들을 제조하기 위하여, 보통 20 내지 25 부피 배의 바람직하게는 통상적인 식물성 기름인 유기 상이 첨가되며, 그런 다음 중합체 자기 콜로이드 혼합물이 교반에 의해 현탁된다. 여기에서 글루타르알데히드 교차결합의 경우에 산의 첨가는 자기 콜로이드의 안정성에 의해 결정된다. 일부 자기 콜로이드는 산이 첨가되었을 때 응집하는 경향이 있다. 이것은 현탁 과정의 도중에 또는 끝부분에 산을 첨가함으로써 회피될 수 있다. 이 시점에서는 자기 콜로이드가 이미 중합체 매트릭스안에 미세하게 분산되어 있기 때문에, 응집을 완전하게 피할 수 있다. 산에 대해 내성인 자기 콜로이드의 경우에는, 산은 또한 현탁 과정전에 중합체 상에 직접 첨가될 수도 있다. 두가지 경우에 교차결합제는 모두 현탁과정 중에 첨가된다. 입자 크기 및 기하 구조를 결정하는 상술된 변수들과는 별도로, 산 농도가 또한 자기 입자들의 현탁성에 결정적인 영향을 미친다. 양호한 현탁성이란 입자들이 서로서로 완전히 분리되고 수용액에서조차도 응집체를 형성하지 않는 것을 의미한다. 수용액에서 입자들의 긴 분산 반감기에 대한 선행조건인 상기 특성은 중합체 상에 대하여 15 내지 50 부피%의 산 농도를 사용하여 이루어진다. 1 내지 3N HCl이 바람직하게 사용된다. 현탁액에서의 분산 시간은 미국 특허 제 4,654,267호에 기재되어 있는폴리스티렌 비드에 대한 2 시간에 비해, 12 내지 48시간으로 PVAL 입자에 대하여 매우 길다.
상기와 같은 방식으로 얻어진 자기 입자들의 특별한 장점이 다양한 방법의 변수들에 의하여 적응될 수 있는 다공성, 입자 크기, 자기 방식 및 화학적인 작용기성(functionality)과 같은 특성들을 토대로 하는, 상기와 같은 방식으로 얻어진 자기 입자들은 많은 응용 분야에 사용될 수 있으며, 이들중 많은 수는 상술된 다른 자기 담체를 이용해서는 실현될 수 없다.
염기성 중합체 PVAL 의 높은 화학적 작용기성을 고려할 때, 통상적인 친화성 크로마토그래피 매질로부터 공지되어 있는 모든 활성화 및 결합 방법들은 본 발명에 따른 방법과 함께 사용될 수 있다. 아러한 활성제의 예에는 BrCN, 2-플루오로-1-메틸피리디늄-p-톨루엔술포네이트(2-fluoro-1-methylpyridinium-p-toluenesulfonate), 1,1'-카르보닐디이미다졸(1,1'-carbonyldiimidazole), 에피클로로히드린(epichlorohydrin), 헥사메틸렌디이소시아네이트(hexamethylenediisocynate) 또는 1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄-테트라플루오로보레이트(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium-tetrafluoroborate)가 있다. 생체 리간드 및 생체 분자들에 대한 상응하는 결합 방법들은 최신식 기술이며, 다른 문헌들 중에서도 1987년 케이.모스배치(K. Mosbach)가 편집한 효소론 방법 제 135권에 설명되어 있다. 미국 특허 제 4,654,267호에서 언급된 결합 방법들은 다른 한편으로 카르복실 그룹의 활성화 및 결합에 국한된다.
본원에서 설명된 본 발명에 따른 염기성 중합체의 기존의 히드록실기는 또한비닐 단위체(monomer)를 중합체 매트릭스로 그라프팅(grafting)하는 기회를 제공한다. 추가의 작용기성 분자 사슬[스페이서 분자(spacer molecules)]은 이 그라프팅 과정에 의해 도입될 수 있다. 이러한 스페이서 분자들에 대한 생체 분자들의 결합은 일반적으로 천연 구조의 유지 및 그 결과 결합된 생체 분자들의 생물학적 활성을 필요로 한다. 생체 분자는 더 이상 매트릭스 표면과 직접적으로 접촉하지 않기 때문에, 생체 분자 내에서 가능한 형태의 변형이 방지된다. 비닐 단위체를 이용한 그라프팅은 라디칼성 중합반응에 대한 산화환원 개시자(initiator)로서 작용하는 세륨(cerium)(IV) 염, 예컨대 세륨(IV) 암모늄 나이트레이트(nitrate) 또는 세륨(IV) 암모늄 설페이트(sulfate)의 촉매 효과하에서 일어난다. 세륨(IV) 염은 바람직하게는 0.5 내지 1N 황산 또는 질산중의 0.03 내지 0.1몰 용액으로서 사용된다. 예를 들어 HO-, HOOC-, NH2-, NCO-, CHO- 또는 옥시란(oxirane) 그룹 형태의 작용기성 그룹 또는 반응성 그룹을 갖는 물질들이 비닐 단위체로 사용된다. 이러한 기본적으로 공지되어 있는 그라프팅 방법의 상세한 설명에 대해서는 독일 특허 출원 21 57 902호와 38 11 042호에 설명되어 있다. 그러나, 본원에서 제공되는 본 발명에 따른 중합체 매트릭스들은 이것들의 물리적 및 화학적 구조, 성질 및 적용성의 견지에서 근본적으로 상기 언급된 그라프트 매트릭스와 상이하다. 상기 언급된 그라프팅 방법에 대해 추가로 다른 점은 본 발명에 따른 물질이 산소가 아닌 대기중에서는 사용될 필요가 없으며, 오히려 물과 혼합될 수 없는 유기 용매, 예를 들면 헥산(hexane), 헵탄(heptane), 시클로헥산(cyclohexane) 또는 석유계에테르(petroleum ether)등이 높은 그라프트 수율을 이루는데 적당하다는 것이다. 그라프팅 시간은 또한 상기 언급된 방법들에 비해 최대 90%까지 감소될 수 있다. 사용되는 비닐 단위체의 양은 자기 입자 현탁액에 대하여 10 내지 50 부피% 사이로 다양하다.
PVAL 자기 입자들에 대한 다양한 활성화 및 변형 가능성을 고려할 때, 실제로 제한되지 않은 수의 생체 분자들이 매트릭스에 결합될 수 있다. 이것은 의학적 진단으로부터 분자 생물학 분석에 이르기까지 광범위한 적용범위를 가능하게 한다. 생물 과학에서 중요한 응용은 친화 원리에 따른 분리이다. 일반적으로 사용되는 칼럼 기법은 복잡한 실험 장치를 포함하며, 그러므로 실용적인 대체물이 특히 보다 규모가 작고 관례적인 분리에 대해서 바람직하다. 본 발명에 따른 물질은 상기 물질들이 정규 기법에 필요한 적은 시간 및 실험 장치만을 필요로 하기 때문에 이러한 대용방안이 될 수 있다. 친화성 크로마토그래피에서 오늘날 사용되는 모든 리간드는 원칙적으로는 리간드로 결합될 수 있다. 실제적인 측면에서 흥미로운 전망을 또한 열어주는 실례로는 단백질 A, 단백질 G, 헤파린(heparin), 항체, 혈청 알부민, 젤라틴, 리신(lysine), 콘카발린(concavalin) A, 올리고당, 올리고뉴클레오티드 또는 효소가 있다. 이러한 친화성 매트릭스를 이용하여 수행될 수 있는 특별한 분리는 최신식 기술이다. 공지된 방법들의 상세한 설명에 대해서 1990년도 저널 오브 크로마토그래피 제 510 권을 참조한다. 실험적인 단순화와는 별도로, 자기 입자 기법의 특별한 장점은 분리 시간의 상당한 감소이다. 이것은 자기 입자 현탁액이 균질 용액과 유사한 반응 속도론을 허용하는 유사-균질 상이라는 사실에 기인한다.이것은 분리가 배치 규모(batch scale)에 따라 커다란 노력이 없어도 2 내지 5분 이내에 수행될 수 있음을 의미한다. 자기 입자 기법에 대한 추가의 흥미로운 적용 분야는 진단, 특히 면역검정 분야이다. 기본적인 원리는 특정 물질의 정량 검출이다. 그러므로 검출의 질은 크로마토그래피에 의하거나 또는 중합체 고체에 대한 결합에 의한 상응하는 물질의 특정 분리와 직접 연관된다. 상기 특정 결합은 일반적으로 고정된 항체에 의해 수행될 수 있으며, 상기 고정된 항체는 다음 단계에서 광도법(photometrically) 또는 니펠로법으로(nephelometrically) 분석된다. 신규하게 개발된 PVAL 매질은 면역검정에 대한 우수한 기초를 제공한다. 진단학적으로 관련된 항원들에 대한 항체는 그 결과로서 자기 입자들에 화학적으로 결합된다. 이러한 항체들의 실례로는 항-인슐린(anti-insulin), 항-티록신(anti-thyroxine), 갑상선 자극 호르몬(TSH)에 대한 항체, 갑상선-결합 글로불린(thyroid-binding globulin)에 대한 항체, 항-코르티손(anti-cortisone), 항-페리틴(anti-ferritine), 항-융모막 고나도트로핀(anti-chorionic gonadotropine), 항-발암물질-배-항원(anti-carcinogen-embronic-antigen) (CEA), 항-프로게스테론(anti-progesterone), 항-테스토스테론(anti-testosterone), 항-에스트라디올(anti-estradiol), 항-프로락틴(anti-prolactine), 항-사람-성장-르몬, 항-디곡신(anti-digoxine), 항-β2-마이크로글로불린(anti-β2-microglobulin), 항-α2-마크로글로불린(anti-α2-macroglobulin), 항-비타민 B12, 항-인자 VIII 또는 항-AFP가 있다. 혼합물질을 갖는 항체-결합된 자기 입자에 대한 인큐베이션 시간은 보통 2 내지 5분이다. 자기 분리 후에 분리된 항체-항원 복합체(complex)들은 공지된 분석 방법을 사용하여 광도법으로 정량 검출된다. 자기 입자 기법의 사용은 인큐베이션 시간이 독일 특허 출원 41 26 436호에서 설명되어 있는 바와 같은 종래의 미소-적정농도 플레이트(micro-titre plate) 또는 칼럼 분리 방법들에 비해 1- 내지 100의 인자만큼 감소될 수 있음을 의미한다. 항체와는 별도로 다른 물질들이 자기 입자에 결합되고 특정 물질을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 물질은 3-아미노페닐 보론산(3-aminophenylboronic acid)으로, 이것은 혈당 함량을 검출하기 위해 PVAL 매트릭스에 결합된다. 리간드를 고정시키기 위해서, PVAL 담체는 제 1 단계에서 디이소시아네이트(diisocyanate)로 활성화된다. 그런 다음 리간드를 이용하여 전환된다. 전환을 위해 보통 100mg의 자기 상에 대해 15 내지 30mg의 3-아미노페닐 보론산이 사용된다. 혈당 함량은 보론산 리간드에 특정하게 결합하는, 혈액내의 당화된(glycated) 헤모글로빈에 의하여 분석된다. 결합 당화된 분획을 매트릭스로부터 연이어 용출할 때 광도법 측정에 의하여 정량적으로 분석될 수 있다. 선행 시험 방법과 비교할 때 특별한 장점은 감소된 시간과 노력이다. 그러므로 이 방법은 관례적인 분석에 대해 이상적이다.
최근 들어 새로운 치료 및 진단 과정 중에 매우 빈번해지고 있는 분자-생물학 분석은 PVAL 자기 입자에 대한 추가의 적용 분야이다.
스트렙타비딘(streptavidin)/아비딘(avidin)과 비오틴(biotin) 사이의 높은 친화성은 분자 생물학의 많은 분석 과정에서 사용된다. 예를 들어 DNA 단편, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 항체 또는 항원들 어떤 종류의 비오티닐화된 생체 분자들은 스트렙타비딘 또는 아비딘을 중합체 고체 상에 결합시킴으로써 분리될 수 있다.PVAL 매트릭스의 사용으로 높은 현탁성과 관련된 단순한 결합 기법을 고려할 때 이러한 분리가 간단하게 수행되는 것이 가능해진다. 자기 비드 기법이 바람직하게 사용될 수 있는 실제 적용 분야의 실례로는 고체-상 DNA-서열화, DNA 합성 또는 중합 효소 사슬 반응 (PCR)이 있다. PVAL 자기 입자들을 사용하면, 예를 들어 항-CD4, 항-CD15, 항-CD35, 항-CD8과 같은 특정 세포 표시자에 대해 표적화된 항체와의 결합을 통한 세포 분리 및 표지(labelling)가 가능해진다. 우리는 보다 상세한 설명을 위해 적절한 문헌인 호우케인스와 크램의 1993년도 바이오테크놀러지 제 11권 60 페이지를 참조한다.
본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1
자기 콜로이드는 콘도 등의 1994년도 응용 미생물학 바이오테크놀러지 제 41권 99-105 페이지에 기재되어 있는 것과 유사하게 제조된다. 10ml의 콜로이드는 80ml의 10% PVAL 용액(평균 분자량 48,000), 5ml 의 2.5% 폴리비닐피롤리돈 용액, 20ml의 2N HCl 및 0.4ml의 3.5% 소듐-도데실술페이트(sodium-dodecylsulfate)의 혼합물중에 분산된다. 이것을 초음파 배쓰(bath)(100 W)에서 1 분동안 처리한 후, 혼합물을 2%의 플루로닉(Pluronic) 6100, 0.8%의 플루로닉 6200, 0.4%의 디히물스(디히물스) FCE 및 0.6%의 디히물스(디히물스) HRE7을 함유하는 보통 식물성 기름 2리터에 20℃에서의 교반에 의하여 현탁시킨다. 교반속도는 2000rpm 이다.
10초가 지난 후, 6.4ml의 12% 글루타르알데히드 용액이 첨가된다. 추가로 20초동안 교반을 계속한다. 그런 다음 현탁액을 5000 ×g 에서 30초동안 원심분리하여 생성된 오일상을 따라버린다. 남아 있는 현탁액을 대략 300ml의 노르말-헥산으로 1회 세척하고 대략 300ml의 메틸 에틸 케톤으로 1회 세척한다. 얻어진 자기 현탁액을 대략 400ml 의 1:1 (v/v)의 물/메탄올에 분산시킨 후 원심분리한다. 그런 다음 자기 분획을 대략 400ml의 물중에 분산시킴으로써 10회 세척하되, 각 세척 단계 사이에 원심분리를 행한다.
이렇게 하여 크기분포가 2 내지 4㎛ 이고 철 함량이 7%인 자기 입자가 얻어진다.(여기에서는 모두 % 수치이고, 다음에 유동성 물질에 대해서는 부피% 이며, 고체 물질에 대해서는 중량% 이다).
실시예 2
실시예 1 에 따라 얻어진 자기 콜로이드 5ml를 실시예 1 에 따라 40ml의 PVAL 상에 분산시킨 후, 1.5%의 플루로닉 8100, 0.4%의 플루로닉 6200 및 0.4%의 디히물스 FCE 가 용해되어 있는 880ml의 보통 식물성 기름에서 혼합함으로써(교반 속도는 2000rpm) 현탁시킨다.
그런 다음 25% 글루타르알데히드 용액 4%를 첨가한다. 현탁액을 추가로 10초 동안 교반한다. 10분 후에, 현탁액을 원심분리하고 실시예 1에 따라 메탄올/물, 노르말-헥산 및 메틸 에틸 케톤을 사용하여 세척한다.
1 내지 3㎛의 크기를 갖는 자기 입자들이 얻어진다. 산화 철 함량은 7.3% 이다.
실시예 3
4ml의 페로플루이딕스(Ferrofluidics) EMG 807을 100ml의 5% PVAL 용액(평균 분자량 224,000)에 분산시킨다. 이 분산액을 5분 동안 초음파 배쓰에서 처리한 후, 2%의 아르레이셀(아르레이셀) 83, 0.8%의 트윈(Tween) 85 및 0.4%의 디히물스 FCE를 함유하고 있는 2300ml의 식물성 기름 중에서 교반함으로써(교반 속도 1800rpm) 현탁시킨다.
5초 후에 25ml의 2.5N HCl을 첨가하고 다시 5초 후에 7ml의 12% 글루타르알데히드 용액을 첨가한다. 추가로 10초 동안 교반을 계속한다. 현탁액을 원심분리하고 실시예 1 에서 설명한 바와 같이 10분 후에 세척한다.
2 내지 5㎛의 크기를 갖고 산화 철 함량이 24.6%인 자기 입자가 얻어진다.
실시예 4
180 mg 의 베이페록스(Bayferrox) PR 5044 N 산화 철 안료를 0.01%의 폴리스티렌 술폰산 및 0.05%의 폴리에틸렌 글리콜 1000 을 함유하고 있는 20ml의 7%의 PVAL 용액(평균 분자량 88,000)에 첨가하고, 1분 동안 20,000rpm에서 분산장치[울트라-튜랙스(Ultra-Turrax)]를 이용하여 분산시킨다. 그런 다음 초음파 배쓰에서 각각 2분 동안 2회 처리한다. 연이어 상기 혼합물을 1.9%의 아르레이셀 83, 0.4% 의 트윈 20, 0.3%의 디히물스 FCE 및 1%의 디히물스 HRE 7을 함유하고 있는 460ml 의 식물성 기름 중에서 교반함으로써(교반 속도는 2000rpm) 분산시킨다.
10초가 지난 후, 0.8ml의 25%의 글루타르알데히드 용액을 첨가하고, 5초 후에 8ml의 1N HCl을 첨가한다. 이 현탁액을 계속해서 추가로 10초 동안 교반한다. 10분 후에, 분획이 분리되고 실시예 1에 따라 세척한다.
2 내지 4㎛의 크기를 겆고 철 함량이 12.3%인 자기 입자들이 형성된다.
실시예 5
50mg의 베이페록스 318M을 5%의 PVAL(평균 분자량 224,000), 0.01%의 소듐 도데실 설페이트 및 0.1%의 폴리에틸렌 글리콜 1000을 함유하고 있는 10ml의 혼합물에 울트라-튜랙스 (20,000rpm)를 사용하여 분산시킨다. 계속해서, 중합체 상을 2.2%의 스팬(Span) 80, 0.4%의 디히물스 FCE 및 0.4%의 플루로닉 6200을 함유하고 있는 250ml의 식물성 기름에 교반하에 (1800rpm) 분산시킨다.
5초가 지난후, 10ml의 1N HCl을 첨가하고 다시 10초 후에 0.6ml의 25%의 글루타르알데히드 용액을 첨가한다. 추가로 10초 동안 교반한다. 5분 후에, 현탁액을 원심분리한다. 수집된 분획을 실시예 1에 따라 세척한다.
이렇게 하여 3 내지 6㎛의 크기를 갖고 산화 철 함량이 10.2%인 자기 입자들이 형성된다.
실시예 6
실시예 1에서 설명된 바와 같은 자기 콜로이드 6.4ml을 50ml의 4% PVAL(평균 분자량 103,000), 0.1%의 우혈청 알부민(bovine serum albumin) 및 0.5%의 폴리에틸렌 글리콜 1000을 함유하고 있는 혼합물에 분산시킨다. 상기 분산액을 5분 동안 초음파 배쓰에서 처리하고, 계속해서 1.8%의 스팬 85, 0.8%의 신페로닉(Synperonic) PL 61, 0.8%의 테트로닉(Tetronic) 901 및 0.4%의 디히물스 FCE를 함유하고 있는 1100ml의 식물성 기름에 현탁시킨다(교반 속도 2000rpm).
120초가 지난후, 4ml의 12%의 글루타르알데히드 용액을 첨가하고, 5초 후에12.5ml의 2.5N HCl을 첨가한다. 다시 10초 동안 교반을 계속하고, 원심분리한 후, 실시예 1에 따라 세척한다.
이렇게 하여 비드의 크기가 1 내지 3㎛ 이고, 산화 철 함량이 8.3%인 자기 입자들이 얻어진다.
실시예 7
13ml의 페로플루이딕스 EMG 507을 20%의 3N HCl을 함유하고 있는 100ml의 3.5% PVAL 용액(평균 분자량 224,000)과 혼합하고, 상기 혼합물을 0.5분 동안 초음파 배쓰에서 처리한다. 자철광-중합체-상을 1.8%의 플루로닉 6100, 0.2%의 플루로닉 6200, 0.2%의 하이퍼머(Hypermer) A60 및 1.8%의 디히물스 HRE 7을 함유하고 있는 2.3리터의 식물성 기름에서 교반함으로써 (교반 속도 2000rpm) 현탁시킨다.
10초 후에 8ml의 12%의 글루타르알데히드 용액을 첨가하고, 추가로 15초 동안 교반을 계속한다. 10분 후 현탁액을 원심분리하고 실시예 1에서 설명한 바와 같이 세척한다.
수집된 비드는 1 내지 2㎛의 크기를 갖고 산화 철 함량은 14.2%로 나타난다. 실시예 8
0.05%의 젤라틴이 용해되어 있는 100ml의 7.5%의 PVAL 용액(평균 분자량 88,000)을 12.5ml의 페로플루이딕스 EMG 707과 혼합하고 3분 동안 초음파 배쓰에서 초음파 처리한다. 연이어 상기 혼합물을 1%의 아르레이셀 83, 0.4%의 플루로닉 6100, 0.2%의 브리즈(Brij) 52 및 0.4%의 트윈 60을 함유하고 있는 2.5리터의 식물성 기름에서 교반하에(교반 속도 2000rpm) 현탁시킨다.
10초 후에 4ml의 12% 글루타르알데히드 용액을 첨가하고 다시 5초 후에 26.5 ml의 1N HCl을 첨가한다.
다시 15초 동안 교반을 계속하고 15분 후에 실시예 1에 따라 현탁액을 원심분리한다.
2 내지 4㎛의 크기를 갖고 산화 철 함량이 26%인 자기 입자들이 얻어진다.
실시예 9
10ml의 7.5% PVAL 용액(평균 분자량 103,000)을 0.5N NaOH를 사용하여 pH 9.5로 조정하고, 75㎕의 디비닐 술폰(divinyl sulfone)을 첨가한다. 계속해서 실시예 1에 따른 자기 콜로이드 1.2ml를 수용액 상에 분산시킨다. 3분 후에 이것을 초음파 배쓰에서 처리한 후, 상기 혼합물을 2%의 스팬 60, 0.4$ 트윈 80 및 0.4%의 디히물스 FCE가 용해되어 있는 220ml의 식물성 기름에서 교반하에(교반 속도 2000rpm) 현탁시킨다. 추가로 30초 동안 교반을 계속하고, 그런 다음 현탁액을 60분 동안 실온에서 방치한다. 현탁액을 실시예 1에서 설명한 바와 같이 세척한다.
4 내지 8㎛의 크기를 갖고 산화 철 함량이 7.7%인 비드가 얻어진다.
실시예 10
5ml의 페로플루이딕스 EMG 707을 40%의 1N HCl 및 0.015%의 소듐 도데실 설페이트가 용해되어 있는 100ml의 3.5% PVAL 용액(평균 분자량 224,000)에 넣고, 상기 혼합물을 1분 동안 초음파 배쓰에서 초음파 처리한다. 계속해서 중합체 상을 1% 의 아르레이셀 83, 1%의 플루로닉 6100, 0.8%의 트윈 80 및 2%의 디히물스 HRE 7 을 함유하고 있는 2.3 리터의 식물성 기름에 교반하에 (교반 속도 2000) 10초 동안현탁시킨다. 10초가 지난 후, 6ml의 25% 글루타르알데히드 용액을 첨가하고, 다시 10초 동안 교반을 계속한다.
10분 후, 현탁액을 원심분리하고 실시예 1에 따라 세척한다. 2 내지 4㎛의 크기를 갖고 산화 철 함량이 24%인 자기 입자들이 얻어진다.
실시예 11
실시예 1에 따른 자기 콜로이드 14.5ml를 4% PVAL (평균 분자량 224,000) 및 0.1%의 우혈청 알부민을 함유하고 있는 100ml의 중합체 상에 분산시킨다. 상기 혼합물을 1분 동안 초음파 배쓰에서 처리한다. 계속해서 분산액을 3.8%의 플루로닉 3100, 0.8%의 플루로닉 6200 및 1.5%의 테트로닉 304가 용해되어 있는 2.5 리터의 식물성 기름에 15초 동안 교반하에 (교반 속도 2000) 현탁시킨다. 그런 다음 7.5ml 의 12% 글루타르알데히드 용액을 첨가하고 다시 10초 후에 25ml의 3N HCl을 첨가한 다음, 다시 10초 동안 교반을 계속한다. 10분 후에 현탁액을 세척하고 실시예 1에 따라 추가로 제조한다.
크기가 1 내지 2㎛ 이고, 산화 철 함량이 9.5%인 자기 입자들이 얻어진다.
실시예 12
5%의 PVAL (평균 분자량 224,000), 0.5%의 폴리에틸렌 글리콜 3350 및 12% 의 페로플루이딕스 EMG 707을 함유하고 있는 50ml의 중합체 상을 2.2%의 아르레이셀 80, 0.8%의 스팬 85 및 0.8%의 트리톤 CF10 이 용해되어 있는 1200ml의 식물성 기름에 10초 동안 교반하에 (교반 속도 1800) 현탁시킨다.
5초 간격으로 4ml의 25% 글루타르알데히드 용액과 25ml의 1N HCl을 첨가한다. 추가로 15초 동안 교반을 계속한다.
10분 후에 실시예 1에 따라 원심분리 및 세척한다.
크기가 1 내지 2㎛ 이고 산화 철 함량이 18.3%인 자기 비드가 얻어진다.
실시예 13
0.05%의 폴리스티렌 술폰산과 0.1%의 폴리비닐피롤리돈이 용해되어 있는 100 ml의 5% PVAL 용액(평균 분자량 203,000)을 실시예 1에 따라 12ml의 자기 콜로이드로 분산시키고, 2분 동안 초음파 배쓰에서 초음파 처리한다. 이것을 실시예 12에서와 유사한 조성을 가지고 있는 2.2 리터의 식물성 기름에 현탁시킨다.
10초 동안 교반한 후, 각각 10초 간격으로 8ml의 12% 글루타르알데히드 용액과 20ml의 2.5N HCl을 첨가한다.
실시예 1에 설명되어 있는 바와 같이 세척하고 제조한 후에, 산화 철 함량이 7.5%인 2 내지 4㎛ 크기의 자기 입자들이 얻어진다.
실시예 14
6.5ml의 페로플루이딕스 EMG 807을 10%의 PVAL (평균 분자량 88,000), 0.05% 의 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트(cellulose acetate butylate) 및 0.1%의 폴리비닐피롤리돈을 함유하고 있는 100ml의 중합체에 분산시킨다. 그런 다음 초음파 배쓰에서 3분 동안 초음파 처리한다. 다음에, 상기 분산액을 1.8%의 신페로닉(Synperonic) L61, 0.2%의 테트로닉 1101 및 1%의 디히물스 FCE를 함유하고 있는 2300ml의 식물성 기름에 교반하에 (교반 속도 2000rpm) 현탁시킨다.
10초 후, 20 몰%의 에틸렌디아민을 함유하고 있는 8ml의 12% 글루타르알데히드 용액과 23ml의 2.5N HCl 을 각 10초 간격으로 첨가한다. 교반을 10초 동안 추가로 계속한다.
10분 후, 현탁액을 실시예 1에 따라 분리 및 세척한다. 1 내지 3㎛의 비드 크기 분포를 갖고 산화 철 함량이 10.4%인 자기 입자들이 얻어진다.
실시예 15
실시예 1에 따라 합성된 300mg의 중합체 입자를 10ml의 물에 현탁시키고 15ml의 에피클로로히드린(epichlorohydrin)과 10ml의 3.5M NaOH를 첨가한다. 현탁액을 55℃에서 격렬하게 2시간 동안 교반한다. 그런 다음, 자기 입자들을 네오디뮴-철-붕소 자석(neodymium-iron-boron magnet)을 사용하여 수집한다. 생성물을 10ml 의 물에 현탁시키고 다시 자석에 의하여 분리한다. 상기 세척 분리 과정을 10회 반복하고 아세톤으로 1회 세척한다.
30mg의 활성화된 자기 입자들을 pH 11.4인 0.1M의 붕산염 완충액에 용해된 2 ml의 10% 헥사메틸렌디아민과 50℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 물로 10회 세척한다. 그런 다음 얻어진 생성물을 12.5%의 글루타르알데히드가 용해되어 있는 2ml의 pH 7.0인 0.1M의 포타슘 포스페이트(potassium phosphate)완충액으로 충전(charge)시킨다. 반응은 30℃에서 2시간 동안 진행된다. 그런 다음 반응액을 30분에 걸쳐 물을 사용하여 10회 세척하고 pH 7.5인 0.1M의 포타슘 포스페이트 완충액을 사용하여 2회 세척한다. 1ml의 pH 7.5인 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액에 용해되어 있는 0.3mg의 스트렙타비딘을 12시간에 걸쳐 4℃에서 인큐베이션함으로써, 0.11mg의 스트렙타비딘을 매트릭스에 결합시킨다. 비오티닐화된(biotinylated) DNA 단편들은DNA 서열화에 대한 공지의 방법에 따라 상기 매트릭스에 결합될 수 있다.
실시예 16
실시예 15에서 설명된 바와 같이 합성되고 에피클로로히드린/헥사메틸렌디아민/글루타르알데히드로 활성화되어 있는 30mg의 자기 입자를, pH 7.5인 2ml의 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액에 용해되어 있는 0.3mg의 항-인슐린-항체와 4℃에서 24시간 동안 반응시킨다. 그 결과 0.28mg의 항체가 결합된다.
실시예 17
실시예 3에 따른 60mg의 자기 입자를 아세톤-물 혼합물(1:3, 1:1, 3:1)을 계속해서 첨가하고 마지막으로 무수 아세톤을 첨가함으로써 탈수시킨다. 상기 현탁액을 0.1%의 주석 옥토에이트(tin octoate)를 함유하고 있는 2ml의 건조 디메틸 설폭사이드중에 분산시킨 다음, 45℃에서 30분 동안 0.5ml의 헥사메틸렌디이소시아네이트를 첨가함으로써 활성화시킨다. 계속해서 샘플을 몇 ml의 디메틸 설폭사이드와 아세톤을 교대로 사용하여 5회 세척한다.
30mg의 활성화된 분획을 20%의 폴리에틸렌 글리콜 400 과 0.05%의 DABCO를 함유하고 있는 1ml의 무수 디메틸 설폭사이드와 30℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 샘플을 계속해서 디메틸 설폭사이드로 1회 세척하고, 물로 5회 세척한 후, 상술한 바와 같이 아세톤-물 혼합물을 사용하여 탈수시킨다.
계속해서 폴리에틸렌 글리콜 결합 분획을 45분 동안 실온에서, 각각 1ml의 디메틸 설폭사이드에 용해되어 있는 6mM의 4-디메틸아미노피리딘 및 2-플루오로-1-메틸피리디늄-p-톨루엔설포네이트와 반응시킨다. 상기 생성물을 디메틸 설폭사이드와 아세톤을 교대로 사용하여 5회 세척한다.
항-티록신-항체 용액(pH 7.5의 0.05M 포타슘 포스페이트 완충액 ml 당 0.25mg의 항체)을 활성화된 생성물과 4℃에서 인큐베이션함으로써 0.23mg의 항체가 계속해서 결합된다. 결합 완충액(coupling buffer)을 사용한 여러 세척 단계 후에,잔류하는 활성 그룹을 20mM의 머캅토 에탄올(mercapto ethanol)을 함유하고 있는 pH 8.5의 2ml 0.1M 트리스(tris)-HCl 완충 용액과 4시간 동안 인큐베이션함으로써 비활성화시킨다. 그런 다음 자기 입자들을 pH 7.2의 PBS 완충액으로 세척한다.
결합된 자기 입자들은 공지된 방법에 따라 티록신 측정에 사용될 수 있다.
실시예 18
실시예 17에 따라 헥사메틸렌디이소시아네이트로 활성화된 30mg의 분획을 2ml의 1:1 비율인 0.3M KOH/메탄올 용액으로 5시간 동안 인큐베이션한다. 실온에서 5시간 동안 반응시킨 후, 생성물을 물로 5회 세척한다. 계속해서 아미노기를 함유하고 있는 분획을 실시예 15에 따라 글루타르알데히드를 이용하여 활성화시킨 후, 30분에 걸쳐 여러 번 세척한다.
pH 7.5인 1ml의 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액에 용해되어 있는 0.35mg의 항-마우스(anti-mouse) IgG를 20시간 동안 4℃에서 인큐베이션한 결과 0.28mg의 결합된 IgG가 얻어진다.
결합된 생성물은 공지된 방법들에 따라 세포 분리를 위해 사용될 수 있다.
실시예 19
실시예 10에 따른 30mg의 자기 입자들을 100mg의 BrCN이 용해되어 있는 4ml의 물로 0℃에서 인큐베이션한다. 여기에 2N의 NaOH를 첨가함으로써 pH를 11.5로 조절한다. 자기 분획의 자기 분리에 의해 반응을 중지시킨다. 생성물을 얼음물로 4회 세척한다. 0.01N의 HCl 과 pH 8.2의 0.1M 바이카르보네이트(bicarbonate) 완충액으로의 1회 세척 단계가 뒤따른다.
0.2mg의 항-CD4 항체가 용해되어 있는 pH 8.2인 1ml의 0.1M 바이카르보네이트 완충액을 활성화된 자기 비드와 12시간 동안 4℃에서 인큐베이션한다. 그런 다음 0.5M NaCl 과 0.1%의 트리톤 X100을 함유하고 있는 pH 7.2의 PBS 완충액으로 여러 번 세척한다. 0.18mg의 항체가 결합되어 있는 담체가 얻어진다.
얻어진 담체는 T-헬퍼(helper) 세포의 분리를 위해 사용될 수 있다.
실시예 20
실시예 5에 따른 자기 입자 30mg을 실시예 19에 설명된 것과 동일한 방식으로 BrCN을 사용하여 활성화시킨다. 헤파린(heparin)(분자량 6000)의 결합은 pH 8.2 의 1ml 바이카르보네이트 완충액에 용해되어 있는 0.5mg의 헤파린을 12시간에 걸쳐 인큐베이션함으로써 일어난다.
계속해서 생성물을 2시간 동안 실온에서 0.1M의 pH 8.0인 에탄올아민 용액으로 인큐베이션한 후, pH 4인 0.1M의 아세테이트 완충액으로 4회 세척한다. 얻어진 분획은 공지된 방법을 따라 항트롬빈(antithrombin) III을 분리하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 21
실시예 4에 따른 자기 입자 30mg을 상술된 바와 같이 아세톤-물 혼합물을 계속해서 첨가함으로써 탈수시킨다. 자기 비드를 각각 6mM의 4-디메틸아미노피리딘 및 5mM의 2-플루오로-1-메틸피리디늄-p-톨루엔설포네이트를 함유하고 있는 1ml의 디메틸 설폭사이드와 45분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 이것을 아세톤과 디메틸 설폭사이드를 교대로 사용하여 5회 세척한 후, 0.05M의 pH 7.5인 포타슘 포스페이트 완충액으로 1회 세척한다.
0.3mg의 단백질 A를 함유하고 있는 pH 7.5인 1ml의 0.05M 인산 칼룸 완충액을 계속해서 첨가한다. 결합은 12시간에 걸쳐 실온에서 일어나며, 계속해서 0.5% 의 NaCl 과 0.1%의 트리톤 X100을 함유하고 있는 PBS 완충액으로 여러 번 세척한다. 0.27mg의 단백질이 결합된다.
자기 분획은 공지된 방법과 유사한 IgG-하위부류를 분리하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 22
실시예 12에 따른 30mg의 자기 입자 분획을 pH 11인 2ml의 0.5M 카르보네이트 완충액으로 1회 세척한다. 계속해서 100㎕의 디비닐 술폰을 사용하여 활성화한 후, 70분에 걸쳐 실온에서 1ml의 세척 완충액을 실온에서 첨가한다. 상기 생성물을 30분에 걸쳐 물로 여러 번 세척한다.
자기 분획을 10%의 락토오스(lactose)가 용해되어 있는 pH 10인 1ml의 카르보네이트 완충액으로 20시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 0.68mg의 락토오스가 결합된다. 담체는 공지된 방법론을 따라 미스레토(misletoe) 추출물로부터 렉틴(lectine)을 정제하기 위하여 사용될 수 있다.
실시예 23
실시예 15에서 설명된 바와 같이, 에피클로로히드린으로 활성화되어 있는 실시예 7에 따른 30mg의 자기 입자를 pH 9인 0.2M 카르보네이트 완충액중의 0.3M의 아디프산 디히드라자이드(adipic acid dihydrazide)와 함께 16시간에 걸쳐 실온에서 반응시킴으로써 히드라자이드 유도체가 형성된다. pH 8.5인 0.1M의 트리스-HCl 완충액을 사용하여 여러번 세척한 후, 남아 있는 옥시란 그룹을 0.3M의 머캅토에탄올을 함유하고 있는 세척 완충액과 함께 4시간 동안 인큐베이션함으로써 ??칭(quenching)된다. 그런 다음 pH 5.5인 3ml의 0.1M 소듐 아세테이트 완충액으로 최종 세척한다.
0.3mg의 항-HGH(인간 성장 호르몬) 항체와 10mM의 소듐 m-페리오데이트(periodate)가 용해되어 있는 1ml의 아세테이트 세척 완충액을 40분 동안 4??에서 어두운 곳에서 인큐베이션한다. 계속해서 이것을 소듐 아세테이트 완충액으로 5회 세척한 후, PBS 완충액으로 2회 세척한다. 0.21mg의 항체가 결합된다.
결합된 담체는 HGH 의 검출을 위해 사용될 수 있다.
실시예 24
실시예 9에 따른 30mg의 자기 입자를 물에 현탁시키고 손 자석을 사용하여 분리시킨다. 분리된 분획을 0.1M의 암모늄 세륨(IV) 나이트레이트를 함유하고 있는 0.5ml의 0.1M 질산과 함께 15분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 계속해서 자기 입자들을 자기 수단에 의해 분리하고 물로 1회 세척한다. 분획을 0.5ml의 아크릴산과0.5ml의 헥산을 15분 동안 50℃에서 인큐베이션함으로써 반응시킨다. 그런 다음 30분에 걸쳐 10회 세척한다. 그라프트(graft) 수율은 85 % 이다.
그라프트된 분획을 5%의 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드 메토-p-톨루엔설포네이트[1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide metho-p-toluenesulfonate]가 용해되어 있는 pH 7.5인 1ml의 0.1M 3-(N-모르폴리노)프로판 술폰산 (MOPS)을 사용하여 실온에서 30분 동안 활성화시킨다. 활성화 단계 후에 얼음물을 사용하여 5회 세척한다. 여기에 pH 7.5인 1ml의 MOPS 완충액에 용해되어 있는 0.3mg의 항-LDL (저밀도 지방단백질) 항체를 첨가한다. 반응은 24시간 동안 4℃에서 계속된다. 그런 다음 담체를 pH 8.5인 5ml의 5mM 에탄올아민/0.1M 트리스-HCl 완충액으로 4시간 동안 인큐베이션함으로써 비활성화시킨다. 0.25mg의 항체가 결합된다.
결합된 매트릭스는 생물학적 유체로부터 LDL을 제거하기 위하여 사용될 수 있다.
실시예 25
실시예 3에 따른 30mg의 자기 입자를 실시예 24에서 설명된 것과 동일한 방식으로 그라프트시킨다. 1985년도 DNA 제 4권 327 페이지에 설명된 방법에 따라 에틸렌디아민으로 100㎍의 올리고(oligo)(dT)20 을 5'-단부에서 치환시킨다.
자기 입자 분획을 pH 7.0인 1ml의 0.1M 이미다졸 완충액에 용해되어 있는 NH2-치환된 올리고뉴클레오티드와 함께 20시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 그런다음 0.1%의 트리톤 X100을 함유하고 있는 이미다졸 완충액으로 여러 번 세척한다. 38㎍의 올리고뉴클레오티드가 결합된다.
얻어진 자기 입자들은 정립된 방법을 따라 mRNA의 분리를 위해 사용될 수 있다.
실시예 26
실시예 9에 따른 100mg의 자기 입자를 상술한 바와 같이 아세톤-물 혼합물을 사용하여 계속해서 탈수시킨다. 그런 다음 실시예 17에 따라 헥사메틸렌디이소시아네이트를 사용하여 활성화한다.
활성화된 입자들을 0.1%의 주석 옥토에이트와 30mg의 m-아미노페닐 보론산을 함유하고 있는 2ml의 디메틸 설폭사이드와 함께 30??에서 6시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 이것을 물로 여러 번 세척한다.
보론산 결합 자기 담체는 정립된 방법을 따라 혈액중의 당화된 헤모글로빈의 검출을 위해 사용될 수 있다.
실시예 27
50mg의 시바크론 블루(Cibacron Blue) F3G-A 가 용해되어 있는 2ml의 물에 실시예 14에 따른 30mg의 자기 입자를 넣는다.
이 혼합물을 30분 동안 60℃에서 반응시킨다. 그런 다음 1ml의 25%의 NaCl 용액을 첨가하고 추가로 1시간 동안 75℃에서 가열을 계속한다. 10%의 소듐카르보네이트 용액을 첨가한 후, 추가로 2시간 동안 70℃에서 가열을 계속하고, 이어 여러 시간동안 물로 세척한다.
얻어진 매트릭스는 공지된 방법에 따라 알코올 디히드로게나제(alcohol dehydrogenase)를 분리하기 위하여 사용될 수 있다.
본 출원은 본 발명의 원리를 기술했지만, 본 발명의 범위 내에서 다른 관점, 이점 및 변형은 당업자에게 명백할 것이라고 이해할 수 있을 것이다.

Claims (16)

  1. PVAL의 구형 입자의 제조 방법에 있어서,
    자기 콜로이드(magnetic colloid)가 분산되어 있는 수성 PVAL 용액은, 중합체 상과 혼합될 수 없는 두 개 이상의 에멀션화제(emulsifier) 및,
    상기 PVAL 방울(droplet)을 교차-결합(cross-link)시키기 위해 현탁 과정중에 첨가되는 히드록실 그룹(hydroxyl group)과 반응하는 수용성 제제를 함유하는 유기상(organic phase)에서 교반함으로써, 실온에서 현탁되는 것을 특징으로 하는 PVAL의 구형 입자의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 성분은 부분적으로 수용성인, 두 개 이상의 상이한 성분들로 구성된 2 - 6 부피%의 에멀션화제 혼합물은 상기 유기상에 용해되는 것을 특징으로 하는 PVAL의 구형 입자의 제조 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 0.01 - 2 중량%의 하나 이상의 에멀션화제는 중합체 상에 용해되는 것을 특징으로 하는 PVAL의 구형 입자의 제조 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 에멀션화제가 단백질, 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives), 술폰산 유도체(sulfonic acid derivatives), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethyleneglycol) 또는 이것들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 PVAL의 구형 입자의 제조 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 중합체 용액은 2.5 - 12. 5 중량%의 PVAL을 함유하는 것을 특징으로 하는 PVAL의 구형 입자의 제조 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 강자성(ferromagnetic) 또는 과상자성(superparamagnetic) 물질 형태의 자기 콜로이드는 상기 중합체 상과 혼합되는 것을 특징으로 하는 PVAL의 구형 입자의 제조 방법.
  7. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 상에 대하여 2 - 7 부피%의 교차-결합 용액이 첨가되는 것을 특징으로 하는 PVAL의 구형 입자의 제조 방법.
  8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 교차결합제(cross-linking agent)가 수용성 디아민(diamine)의 첨가와 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 PVAL의 구형 입자의 제조 방법.
  9. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 교차결합은 중합체 상에 대하여 20 - 50 부피%의 산을 첨가함으로써 디알데히드(dialdehyde)를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 PVAL의 구형 입자의 제조 방법.
  10. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어지는, 입자의 크기가 1 - 10㎛인 구형의 자기 PVAL 입자.
  11. 제 10항에 있어서, 구형의 중합체 입자의 표면은 화학적으로 결합된 중합체 사슬을 나타내며, 상기 중합체 사슬을 구성하는 비닐 단위체(monomer)는 카르복실(carboxyl), 히드록실(hydroxyl), 아미노(amino), 알데히드(aldehyde) 또는 옥시란(oxirane) 그룹을 함유하는 것을 특징으로 구형의 자기 PVAL 입자.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 중합체 입자의 표면은 생체 분자와 결합하는 반응성 그룹을 나타내는 것을 특징으로 하는 구형의 자기 PVAL 입자.
  13. 제 12항에 있어서, 결합 그룹은 항체, 펩티드(peptide), 단백질, 효소, 스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘(avidine), 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 단편(fragment)과 반응하는 것을 특징으로 하는 구형의 자기 PVAL 입자.
  14. 세포, 핵산, 단백질, 바이러스 또는 박테리아를 분획화(fractionation)하기 위한 제 10항에 따른 구형의 자기 PVAL 입자.
  15. 면역검정(immunoassays), DNA 서열화(DNA sequencing) 또는 DNA 합성을 위한 제 10항에 따른 구형의 자기 PVAL 입자.
  16. 제 11항에 있어서, 상기 중합체 입자의 표면은 생체 분자와 결합하는 반응성 그룹을 나타내는 것을 특징으로 하는 구형의 자기 PVAL 입자.
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