JP3164585B2 - ポリビニルアルコールを主成分とする磁性ポリマー粒子及びその製造方法及び使用方法 - Google Patents

ポリビニルアルコールを主成分とする磁性ポリマー粒子及びその製造方法及び使用方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ポリビニルアルコール（PVAL）を主成分と
する球形ポリマー粒子（ビーズ）であって、ポリマービ
ーズを磁性化し、生体分子または細胞と結合することを
可能とする磁性コロイドがカプセル化されている球形ポ
リマー磁性ビーズの製造方法に関する。
近年、磁性ポリマービーズは主として生化学や医学の
分野において、細胞やタンパク質、核酸を分離するため
に使用されている。その磁性から、体内の特定部位への
特定薬物の投与システムとしても使用できる。通常細か
い懸濁液もしくは乳化剤の形態で存在する磁性粒子が、
磁力によって混合物から分離するため、磁性ビーズの使
用には従来の分離システムに比べて大きな実用的利点が
ある。この分離技術には標準的な遠心分離が不要であ
る。磁性断片は１分以内の分離も可能であるため、標準
的なカラムクロマトグラフィーの技術に比べ、大幅に時
間が短縮できる。時間のかかる均衡化や溶出が上記技術
の重大な問題点であり、それらは磁性ビーズの技術を用
いれば実用的になくすことができる。磁性ビーズの技術
の更に重要な利点は反応運動の方法である。通常カラム
クロマトグラフィーは、粒径50〜100μｍの充填物質を
使用する。しかし、そのような粒径では分離能が不十分
なことが多いため、粒径50μｍ未満、さらには10μｍ未
満を使用する傾向が高まってきている。カラムを通過中
に発生する高い圧力に耐えるためには、そのようなカラ
ムは、もはやほどんど多孔性ではない。このような理由
から、実際には、透明プラスチックまたはガラスカラム
から耐圧スチールカラムに切り替えざるを得なくなっ
た。強力な注入システムが必要とされていることは今日
のカラムクロマトグラフィー技術の更なる欠点である。
結局は不適切な反応運動に起因するこうした欠点は、磁
性ビーズの技術を使用することで完全に克服することが
できる。
粒径１〜10μｍ、好ましくは１〜４μｍの細かく分散
されたPVAL粒子を使用することによって、粒子は何時間
も懸濁状態を保ち、反応運動は準均一溶液のそれに相当
する。この安定した懸濁状態の結果として、多くの場合
において、攪拌もしくは振とうを行うこともできる。
米国特許第4,452,773号明細書は、デキストリン−鉄
微粒子の製造方法を開示している。鉄（II）塩溶液及び
鉄（III）塩溶液を、所定量のデキストリンの存在下で
混合し、その後、アルカリを添加することによって、デ
キストリンを吸収した30〜40nmの大きなコロイド酸化鉄
粒子を得る。PCT出願WO90/07380号明細書にも同様の方
法が開示されている。デキストリンを鉄（II）塩溶液及
び鉄（III）塩溶液に添加し、40℃で処理し、その後水
酸化ナトリウムで滴定して、粒径40〜100nmの超常磁性
粒子を製造する。両方法の欠点は、粒子の細かさゆえに
分離がグラジエントの高い磁界によってのみ可能である
ことである。このグラジエントの高い磁界は、スチール
ウールが濃密に詰められた分離カラムまたは２つの強力
な電磁石またはハンド磁石のポールシューの間に存在す
る同様の微粒子物質によって発生する。懸濁液を充填剤
が詰められた分離カラムを通過させることによってその
微粒子を分離する。そのようなコロイドの分離は普通の
ハンド磁石ではできない。従って、原理としては、標準
的なクロマトグラフィー技術間に実験的な違いはほとん
ど存在しない。前記製造方法のさらなる欠点は、実際の
製造方法によって均一な粒子が得られないことである。
これは細分化された磁性分離によってのみ可能なのであ
る。更に、これらの磁性粒子は光学顕微鏡ではもはや見
えないことからその検出が面倒である。米国特許第4,07
6,246号明細書の主題となっている更に別の方法とし
て、強磁性パウダーを添加してｐ−アミノ安息香酸やア
ルデヒドを転移させることによって磁性粒子を得る方法
が記載されている。診断検査に一般的に必要とされる所
定のビーズはこの方法では製造できない。生体分子を担
体に化学的に結合させることも不可能である。米国特許
第4,106,448号明細書、第4,136,683号明細書、第4,735,
796号明細書にも同様の方法が記載されており、そこで
は診断法や腫瘍治療のために磁性粒子がデキストラン内
にカプセル化されている。生体分子の共有結合について
は記載されていない。米国特許第4,647,447号明細書に
は、NMR（核磁気共鳴）診断のための強磁性粒子の製造
を記載がある。この方法は鉄（Ｉ）塩／鉄（II）塩溶液
で始められるか、もしくは血清アルブミン、多糖類、デ
キストランまたはデキストリンの形態の錯化剤の存在下
で磁性懸濁液に移される微粒子フェライトで直接始めら
れる。米国特許第4,628,037号明細書では、その他の塩
性マトリックス中でカプセル化された強磁性粒子を取り
扱っている。米国特許第4,827,945号明細書に記載の超
常磁性酸化鉄はNMR診断法の造影剤としても使用でき
る。塗布された磁性粒子はこれらの物資を用いて、鉄
（II）塩／鉄（III）塩溶液の析出によって調製され、
血清アルブミン、ポリペプチドまたは多糖類が存在する
基剤によって製造することができる。磁性粒子は、特定
の抗体をマトリックスに結合させることによって生体の
特定部位を標的とすることもできる。デキストランもし
くはポリグルタルアルデヒド類の存在下で鉄塩を沈殿さ
せて酸化鉄を製造する方法が、例えば、米国特許第2,87
0,740号明細書や第4,267,234号明細書に記載されてい
る。前記すべての方法や製造物には１つの共通点があ
る。即ち、錯化剤または被覆剤の存在下で鉄（II）塩と
鉄（III）塩のモル比が一定の塩水の析出によっての
み、強磁性粒子また超常磁性粒子が製造される点であ
る。そこに記載されている粒子の粒径は様々である。所
定の微量液体または球形粒子は前記方法では製造するこ
とができない。記載されている物質はアモルファス様の
幾何学構造を示す。通常nmレベルというその微細さゆえ
に、それらはNMR診断法の造影剤または細胞マーカーに
本来好適である。また、磁性断片の分離は簡単なハンド
磁石を使ったのでは通常不可能であり、それには迅速な
診断検査やアフィニティクロマトグラフィー分離が有利
である。米国特許第4,345,588号明細書、第4,169,804号
明細書、第4,115,534号明細書、第4,230,685号明細書、
第4,247,406号明細書及び第4,357,259号明細書には、診
断検査同様、ウイルス分離や細胞分離に使用できる特定
の結合剤が被覆された磁性アルブミン微粒子またはタン
パク質微粒子が記載されている。所定のビーズ形構造を
もつ磁性粒子が米国特許第4,861,705から公知である。
前記特許の主題は、オイル相中のポリマー相の懸濁液か
ら製造されるアガロースポリアルデヒド複合粒子であ
る。定義上、非常に細かい超常磁性水溶性酸化鉄コロイ
ドである強磁性流体をポリマー相に混和することによっ
て、粒径40〜1000μｍの磁性ポリマー粒子が得られる。
米国特許第4,654,267号明細書は完全なビーズ形の粒
子を記載している。その方法は、最初ラジカル重合を
し、懸濁重合によってビーズ形の粒子にされたポリアク
リレートまたはポリスチレンをマトリックスとして使用
する点で、前記方法とは根本的に異なる。その粒子は所
定の条件のもとで有機相において膨張する。次いでポリ
マー粒子を、粒子が分散しているアンモニアを用いて、
超常磁性酸化鉄が酸化された鉄（II）／鉄（III）塩溶
液中でインキュベートする。この方法によって、粒径0.
5〜20μｍの球形粒子を製造する。方法自体が技術的に
非常に複雑である。毒性の高い物質を使用する場合意外
は、基本マトリックスを調製するのに10〜30時間必要で
ある。また、ニトロ基、ニトロソ基またはアミノ基を更
に添加する必要があり、鉄塩の適切な吸収を確実にする
ための、追加調製の段階でポリマーマトリックスに導入
される。ここに記載された粒子の大きな欠点は基本ポリ
マーであるポリスチレンにある。ポリスチレンは疎水性
が強く、タンパク質溶液や他の生体分子と接触したとき
特定の吸収をしない傾向が強い。この現象は免疫定量法
やアフィニティクロマトグラフィーの分離にとって、特
に不都合である。製造にかかるコストや労力、粒子の形
状寸法、磁性分離挙動、ポリマーマトリックスの特性や
結合方法の種類に関する前記方法の欠点は新規な油中水
型懸濁方法によって避けることができる。使用されるポ
リマーマトリックスはポリマビニルアルコール（PVAL）
であり、それは水と混合されない有機相中で攪拌して水
溶液として懸濁し、架橋する。そのような有機相の例
は、懸濁重合における最新技術から一般によく知られて
いる。本発明の方法においては、標準的な植物性油が好
ましく使用される。ポリマー粒子の好ましい磁性を達成
するためには、ポリマー相を磁性コロイド、例えば酸化
鉄パウダーまたは強磁性流体と混合され、油相中で懸濁
する。水溶性ポリマー溶液の懸濁によるビーズ形PVAL粒
子の製造が、ドイツ公開公報第41 27 657号明細書に記
載されている。磁性粒子は、磁性パウダーをポリマー溶
液に添加することによって製造できる。前記方法はポリ
マー溶液と乳化剤やその他の表面活性剤の形の添加剤を
含まない油相とを使用する。このため、粒径50〜500μ
ｍにすることは容易である。粒径は主に前記方法の有機
相かつ／またはポリマー相の粘度によって決まる。
本発明の目的は、粒径が１〜10μｍ、好ましくは１〜
４μｍで、しかも粒径のばらつきが小さい磁性粒子を製
造することである。そのような粒子のみが細胞の分離・
分類、懸濁状態の生体物質の浄化や診断検査に使用する
ことができる。
面白いことに、そのようなポリマー粒子は特定の乳化
剤混合物をオイル相に添加することによって得られる。
乳化剤という言葉は以下のように、界面活性剤、洗剤、
安定剤といった全ての表面活性剤の一般用語として定義
される。オイル相への添加剤として好適な乳化剤の例と
しては、酸化プロピレン−酸化エチレンブロックコポリ
マー、ソルビタン脂肪酸エステル、ペンタエリスリトー
ル脂肪酸エステルとクエン酸の混合エステルの複合体、
ポリエチレングリコールひまし油誘導体類、ひまし油誘
導体のブロックコポリマー類、ポリエチレングリコー
ル、変性ポリエステル、ポリオキシエチレンソルビタン
脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロ
ピレンエチレンジアミンブロックコポリマー類、ポリグ
リセロール誘導体類、ポリオキシエチレンアルコール誘
導体類、アルキルフェニルポリエチレングリコール誘導
体類、ポリヒドロキシ脂肪酸ポリエチレングリコールブ
ロックコポリマー類、ポリエチレングリコールエーテル
誘導体類がある。この種の物質は、プルーロニック（Pl
uronic）、シンペロニック（Synperonic）、テトロニッ
ク（Tetronic）、トリトン（Triton）、アーラセル（Ar
lacel）、スパン（Span）、ツィーン（Tween）、ブリジ
（Brij）、レネックス（Renex）、ハイパーマー（Hyper
mer）、レームフォーム（Lameform）、デヒマルス（Deh
ymuls）またはユーマルジン（Eumulgin）といった商標
名で市販され公知である。必要粒径１〜10μｍの均一な
ビーズ形ポリマー粒子に関しては、少なくとも２種の、
好ましくは３〜４種の表面活性剤の混合物だけが油相に
おける必要な粒子の特定条件へ導くことがわかってい
る。必要な粒径を実現するための１つの条件は相の界面
張力をそれに対応させて減少することである。これは半
親水性特性、即ち、油にも水にも溶解する特性をもつ少
なくとも１つの乳化剤と、親油性乳化剤成分を混合する
ことによって可能である。後者の要件を満たす乳化剤の
例としては、酸化エチレンを主成分とする酸化エチレン
酸化プロピレンブロックコポリマー誘導体類、ポリエチ
レングリコールヘキサデシルエーテル、短鎖ポリオキシ
エチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリ
コールまたは短鎖ソルビタン脂肪酸エステルがあげられ
る。
油相中の乳化剤の濃度は通常２〜6vol.％、好ましく
は3.5〜5.0vol.％である。ポリマー液滴の細かさや粒径
のばらつきの小ささにおいては、少なくとも２つの親油
性成分と１つの半親水性乳化剤を含む乳化剤混合物が最
適である。半親水性乳化剤の濃度は、乳化剤の総量に対
して通常15〜30vol.％である。本発明の方法は、粒径の
細かさのみならず、均一な懸濁の前提条件であるビーズ
形の粒子の製造をも可能とする。これは、生化学や医学
の検査・診断に要求される正確なピペット移送を可能に
する。油相中の乳化剤の他に、水溶性ポリマー相に可溶
の特別な表面活性剤もまた、懸濁液、特に低分子量（2
0,000〜80,000）のポリマー溶液の質を高めるのに役立
つ。更に、固形で添加される磁性コロイドだけがイオン
形の乳化剤の添加後、細かく分散する。二元混合物とし
て使用することのできるそのような乳化剤の例として
は、血清アルブミン、ゼラチン、脂肪族及び芳香族のス
ルホン酸誘導体類、ポリエチレングリコール、ポリ−ｎ
−ビニルピロリドンまたはセルロースアセテートブチレ
ートがあげられる。使用される乳化剤の量はポリマー相
に対して通常0.01〜2wt.％、イオン形乳化剤の濃度は0.
01〜0.05wt.％とすることができる。ドイツ公開公報第4
1 27 657号明細書に示されている、例えば、攪拌速度
や、２相の濃度や粘度などが粒径に及ぼす影響は、本発
明の方法においては乳化剤添加剤のために、付随滴なも
のでしかない。必要な粒径である、１〜10μｍとするた
めには、攪拌速度は1500〜2000rpmが適当であり、それ
には標準的な二枚羽根プロペラミキサーが使用できる。
本発明において、乳化剤が粒径に影響を及ぼしていると
いうことは、攪拌速度が2000rpmから1300rpmに減少すれ
ば、粒径が１〜５μｍから２〜８μｍに増加するという
事実から明らかである。攪拌速度が2000rpmから5000rpm
に増加した場合、ほとんど粒径に変化はない。一方、前
記方法によって製造される粒子の大きさは10〜80μｍの
間で、攪拌速度の変化と類似の変化をする。前記特許で
見られた懸濁相とポリマー相の粘度が粒径に及ぼす影響
は、本発明の乳化剤の影響に比べると極小さい。従っ
て、本発明の方法においてポリマー相の粘度が10〜1000
mPaで変化しているとき、PVAL粒子の大きさは２〜８μ
ｍの間で変化するにすぎない。同じ条件にしたとき、前
記方法では50〜140μｍの間で変化する。
理論上、当該粒径をもち、通常50〜400ガウスの磁性
飽和度をもつ強磁性コロイドまたは超常磁性コロイド
は、懸濁、架橋工程においてポリマーマトリックス中で
カプセル化される磁性粒子として使用できる。
磁性粒子が満たすべき更なる要件は水溶性ポリマー相
中での分散性である。鉄塩を使用する複雑な膨張プロセ
スや続く磁性コロイドへの酸化を基礎とする米国特許第
4.654.267号明細書に記載に磁性粒子を製造するための
方法とは違い、本発明の方法では、ポリマー相に直接磁
性コロイドを分散させることができる。有機相中の下記
の懸濁過程において、磁性コロイドは同時にポリマービ
ーズにカプセル化される。これは前記方法と比べて著し
く処理が簡素化されており、また、製造方法において大
幅な時間短縮を約束するものである。ポリスチレンを基
剤とする前記物質を製造するには10〜30時間の調製時間
が必要であったのに対し、基本的な磁性粒子を製造する
のに本発明の方法によれば５〜30分だけですむ。粒径10
〜200nmのマグネタイトが磁性コロイドとして好ましく
使用されるが、本発明の方法はこの種の物質だけに限定
されるわけではない。そのような物質としては、例え
ば、ベイフェロックス（Bayferrox）またはイーエムジ
ーフェロフルーディックス（Ferrofluidics（EMG））の
商標名で市販されている物質が例としてあげられる。そ
のようなコロイドの製造は最新技術を使用するので、磁
性粒子はまた、例えば、シンカイ他「バイオカタリシ
ス」５巻、1991年、61頁、ライマー＆クハーラファーラ
編集（Shinkai et al.,Biocatalysis,Vol.5,1991,61,Re
imers ＆ Khalafalla）、英国特許第1.439.031号明細書
またはコンドウ他「応用微生物生物工学」41巻、1994
年、99頁（Kondo et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,
Vol.41,1994,99.）等に記載されている公知の方法によ
っても製造することができる。ポリマー相のコロイドの
濃度はポリマー相に対して、それぞれ製造方法上の理由
から既に水溶性のコロイドの場合は４〜14vol.％、固形
物質の場合は0.3〜2wt.％である。磁性コロイドは製造
中、ポリマー相に直接混合される。細かい分散を確実に
するために、粒子の均等な分散、高速分散器（ウルトラ
−ツラックス（Ultra−Turrax））を用いて短時間の水
系分散を行い、続いて超音波処理を行うことが好都合で
ある。
磁性粒子を製造するために必要なポリマー相は通常2.
5〜10wt.％のPVAL溶液からなる。ドイツ公開公報第41 2
7 657号から明らかなように、ポリマー粒子の多孔性は
究極的にはポリマーのコイル密度によって決まる。つま
りは、ポリマー類の平均分子量及び濃度によって決ま
る。高分子量かつ／または低ポリマー濃度であれば、コ
イル密度は低く、従って多孔性は高まる。試験方法、特
に日常的な診断や検査の方法における実用性が、担体の
量当たりに吸収される物質の量によって決まるので、多
孔性は磁性粒子製造における共通の測定パラメータとし
て重要な役割を担う。このような理由から、2.5〜5wt.
％のポリマーの濃度、50000を超える分子量が本発明の
物質には好ましく使用される。マトリックスに結合する
リガンド及び結紮物、及びリガンドによって結合された
生体分子からみて、この方法で製造されたポリマー粒子
は多孔性が高く、従って結合力が強い。多孔性に影響を
及ぼし、従って磁性粒子の機能性にも影響を及ぼす更に
別の要因は架橋剤とその濃度の選定である。負荷容量の
大きさに鑑み、適切な二次元的安定性と関連する多孔性
を確保するために架橋剤の濃度を選定する。理論上、PV
ALのヒドロキシル基と反応可能な全ての、二官能基をも
つ水溶性化合物が、例えば、アルデヒド類、酸クロリド
類またはジビニルスルフォンといった架橋剤として使用
できる。酸触媒のもとでグルタールアルデヒドが、架橋
剤として好ましく使用される。なぜなら、この物質は数
分でポリマー類と反応し、強く架橋した粒子を製造する
からである。他の物質においては１〜２時間の反応時間
が必要である。グルタールアルデヒドの使用はまた、水
溶性ジアミン、例えば、エチレンジアミンまたはヘキサ
メチレンジアミンを同時に添加することによって架橋剤
をジアミン鎖の長手方向に引き伸ばし、こうして、ポリ
マーマトリックスの多孔性を増加させる。水溶性ポリマ
ー相に対する架橋剤の濃度は通常0.2〜1vol.％、グルタ
ールアルデヒドでは２〜7vol.％である。グルタールア
ルデヒドは６〜25％水溶液の状態で使用されることが多
く、グルタールアルデヒドの量に対して通常10〜50mol
％が使用される。
磁性粒子を製造するために、通常20〜25倍の容量の有
機相、好ましくは標準的な植物性油を添加し、その後、
ポリマー磁性コロイド混合物を攪拌によって懸濁する。
グルタールアルデヒド架橋の場合、酸の添加は磁性コロ
イドの安定性によって決まる。磁性コロイドには、酸が
添加されるときに固化するものがある。これは、懸濁工
程中または懸濁工程終了後に、酸を添加することによっ
て完全に防げる。この時点で、磁性コロイドがポリマー
マトリックス中に既に細かく分散しているので、固化を
完全に避けることができるのである。耐酸性磁性コロイ
ドの場合は、酸は懸濁工程前にポリマー相に直接添加す
ることもできる。架橋剤はどちらの場合も、懸濁工程中
に添加される。粒径及び幾何学的形状を決定する上記パ
ラメータの他に、酸の濃度もまた磁性粒子の懸濁性に決
定的な影響を与える。懸濁性が高いとは、粒子同士が完
全に分離していて、水溶液中に塊のようなものが形成さ
れていないことを意味する。水溶液中の粒子の分散の半
減期が長いことの前提条件であるこの特性は、酸の濃度
をポリマー相に対して15〜50vol.％とすることによって
達成できる。１〜3N塩酸が好ましく使用される。従っ
て、米国特許第4.654.267号明細書のポリスチレンビー
ズの場合、分散時間は２時間であるのに対し、PVAL粒子
の懸濁状態における分散時間は12〜48時間と非常に長
い。
このようにして得られた磁性粒子は、様々な工程のパ
ラメータとなる多孔性、粒径、磁性挙動及び化学的官能
性等の特性を基礎とするという特別な利点を有してお
り、多くの用途に使用することができる。その用途の多
くは、上記の他の磁性担体ではできない。
主成分であるポリマーPVALの化学的官能性が高いこと
から、一般的なアフィニティクロマトグラフィー法から
公知の全ての活性化方法及び結合方法を、本発明の方法
とあわせて使用することができる。そのような活性化物
質の例としては、BrCN、２−フルオロ−１−メチルピリ
ジニウム−ｐ−トルエンスルフォネート、1,1′−カル
ボニルジイミダゾール、エピクロロヒドリン、ヘキサメ
チレンジイソシアネートまたは１−シアノ−４−ジメチ
ルアミノピリジニウム−テトラフルオロボレートがあげ
られる。関連する生体リガンド及び生体分子結合方法は
最新の技術であり、「メソード イン エンザイモロジ
ー」135巻、1987年、K.モスバック編（Methods in Enzy
mology、Vol.135,1987,K.Mosbach.）に記載されてい
る。一方、前記米国特許第4.654.267号明細書に記載の
結合方法は、カルボキシル基の活性化及び結合に限定し
ている。
ここに記載されている本発明の主成分となるポリマー
類の既存ヒドロキシル基もまたポリマーマトリックス上
にビニルモノマーをグラフトする可能性がある。このグ
ラフト工程で追加的官能分子鎖（スペーサー分子）を導
入することができる。生体分子をそのようなスペーサー
分子に結合することは、通常、原形の維持、従って結合
した生体分子の生物学的活性の維持を必要とする。今や
生体分子はマトリックスの表面と直接接触しないので、
生体分子内で起こりうる形状変性は避けられる。ビニル
モノマーのグラフトは、例えば、ラジカル重合のレドッ
クス開始剤の役割を果たす硝酸アンモニウムセリウム
（IV）または硫酸アンモニウムセリウム（IV）といった
セリウム（IV）塩触媒の影響下で行われる。セリウム
（IV）塩は、0.5〜1Nの硫酸もしくは硝酸の0.03〜0.1分
子溶液として好ましく使用できる。例えば、HO−、HOOC
−、NH2、NCO−、CHO−またはオキシラン基の状態で官
能基、反応基をもつ物質がビニルモノマーとして使用さ
れる。そのような基本的に知られているグラフト工程の
詳細についてはドイツ公開公報第21 57 902号明細書及
び第38 11 042号明細書に開示されている方法が参考に
なる。しかし、ここに示されている本発明のポリマーマ
トリックスは、物理的・化学的構造、特性、及び実用可
能性の見地から、前記グラフトマトリックスとは根本的
に異なる。前記グラフト工程との更なる違いは、本発明
の物質を無酸素雰囲気、また、水と混合しない有機溶
液、例えば、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンまた
は石油エーテルの存在下で使用する必要がなく、高グラ
フト量の達成に適切であるということである。グラフト
時間もまた、前記方法と比較して最大90％まで短縮でき
る。使用されるビニルモノマーの量は、磁性粒子懸濁液
に対して10〜50vol.％の間で変化する。
PVAL磁性粒子の活性化及び変性可能性が多岐にわたる
ために、実際的には数知れない生体分子がマトリックス
と結合できる。これは、医学的診断から分子生物学分析
に至る幅広い分野において実用可能である。バイオサイ
エンスにおける重要な用途はアフィニティ原理に基づく
分離である。ここで一般的に使用されるカラム技術は複
雑な実験準備が含まれるため、特に、より小規模の日常
的な分離には、実用的な別の形態が望ましい。本発明の
物質こそ、そのような別の形態である。なぜなら、これ
らは通常の技術に必要な時間と実験装置のほんの一部だ
けを必要としているからである。今日アフィニティクロ
マトグラフィーで使用される全てのリガンドは原則とし
てリガンドとして結合している。実用的な局面から、将
来的に有望な例をここにあげると、タンパク質Ａ、タン
パク質Ｇ、ヘパリン、抗体、血清アルブミン、ゼラチ
ン、リジン、コンカナバリンＡ、オリゴサッカライド
類、オリゴヌクレオチド類または酵素類があげられる。
そのようなアフィニティマトリックスを用いて行うこと
のできる特別な分離には最先端の技術を用いる。公知の
方法の詳細については「ジャーナル クロマトグラフィ
ー」510号、1990年（J.of Chromatography,Vol.510,199
0）を参照した。実験の簡素化に加えて磁性粒子技術の
特別な利点は分離に要する時間がかなり短縮できること
である。これは磁性粒子懸濁液が、均一溶液の反応運動
に類似した反応運動が可能な準均一相であるという事実
による。つまり、バッチスケールによるが、２〜５分
で、さして労力も使わずに分離を行うことができる。更
に、磁性粒子技術の実用化が楽しみな分野は診断学、特
に、免疫定量法の分野である。基本原理は、特定物質の
量的検出である。検出の質は関連物質の特殊な分離に直
結し、クロマトグラフィーやポリマー固体への結合によ
る。この特殊な結合は一般的に非流動化した抗体を使っ
て、測光器分析もしくは比濁分析によって行われる。新
しく開発されたPVALの方法は免疫定量法に優れた基礎を
与える。診断に使われる抗原に対する抗体は、この方法
によって磁性粒子に化学的に結合する。そのような抗体
の例としては、抗インシュリン、抗チロキシン、甲状腺
刺激ホルモン（TSH）の抗体、甲状腺ホルモン結合グロ
ブリンの抗体、抗コーチゾン剤、抗フェリチン、抗絨毛
性性腺刺激ホルモン、抗がん胎児性抗原（CEA）、抗プ
ロゲステロン、抗テストステロン、抗エストラジオー
ル、抗プロラクチン、抗ヒト成長ホルモン、抗ジゴキシ
ン、抗β−２−ミクログロブリン、抗α−２−マクログ
ロブリン、抗ビタミンB12、抗VIII因子または抗αフェ
トプロテインがあげられる。抗体結合磁性粒子混合物の
インキュベーション時間は一般的に２〜５分である。下
記の磁性分離、抗体−抗原錯体については測光器による
量的検出を公知の分析工程を用いて行う。磁性粒子技術
を使用することで、インキュベーション時間は、例え
ば、ドイツ公開公報第41 26 436号明細書に記載されて
いる従来のミクロ摘定プレートまたはカラム分離方法と
比較すると係数にして10〜100短縮できる。抗体以外の
他の物質も磁性粒子に結合することができ、特定物質を
検出するのに使用できる。そのような物質にはPVALマト
リックスと結合して血糖値を検出するアミノフェニルホ
ウ酸がある。リガンドを固定化するために、PVAL担体は
最初の段階においてジイソシアネート類によって活性化
し、その後、リガンドによって転移する。磁性相100mg
に対して15〜30mgの３−アミノフェニルホウ酸を通常使
用する。血糖値は、特にホウ酸リガンドに結合する血中
の糖化ヘモグロビンについて分析される。続いて、結合
した糖化した断片はマトリックスから溶出した時点で、
測光器による測定によって量的分析をすることができ
る。従来の試験方法と比較したときの特別の利点は時間
と労力の縮減である。従って、この方法は日常の分析に
も理想的である。
近年新しい治療・診断方法において普及してきた分子
生物学的分析はPVAL磁性粒子の実用化の新しい分野であ
る。
ストレプトアビジン・アビジンとビオチンの間の密接
な関係は分子生物学の多くの分析方法に使用される。ビ
オチン化された生体分子、例えば、DNA断片類、オリゴ
ヌクレオチド類、タンパク質類、抗体類または抗原類を
ストレプトアビジンまたはアビジンをポリマー固相に結
合させることによって使用できる。高懸濁性につながる
簡単な結合技術であるので、PVALマトリックスを使用す
ることによって、そのような分離を簡単に行うことがで
きるようになる。磁性ビーズ技術が好ましく使用される
可能性のある実用的用途の例としては、固相DNA塩基配
列決定、DNA合成もしくはポリメラーゼ鎖反応（PCR）が
あげられる。PVAL磁性粒子はまた、例えば、抗CD4、抗
体CD15、抗CD35、抗CD8等の特定の細胞マーカーの標的
抗体との結合によって、細胞の分離、分類をすることも
できる。詳細については関連文献、ホーキンス、クラム
共著「バイオテクノロジー」11巻,1993年,60頁（Haukan
es and Kram,Biotechnology,Vol.11,1993,60）を参照し
た。
以下本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。
実施例１ コンドウ他「応用微生物学、バイオテクノロジー」41
巻、1994年、99〜105頁（Kondo et al.,Appl.Microbio
l.Biotechnol.,Vol.41,1994,99−105）の明細書と同様
に磁性コロイドを製造する。コロイド10mlを10％PVAL溶
液80ml（平均分子量48,000）、2.5％ポリビニルピロリ
ドン溶液5ml、2N塩酸20ml及び3.5％ドデシル硫酸ナトリ
ウム0.4mlを含む混合物中に分散させる。続いて超音波
浴（100W）で１分間処理し、その混合物を２％のプルー
ロニック6100、0.8％のプルーロニック6200、0.4％のデ
ヒマルスFCE及び0.6％のデヒマルスHRE7を含む標準的な
植物性油２リットル中で、20℃で攪拌することによって
懸濁する。攪拌速度は2000rpmとする。
10秒後、12％のグルタールアルデヒド溶液6.4mlを添
加する。更に20秒間、攪拌を続ける。その後懸濁液を、
5000G（Ｇは重力）の速度で30秒間遠心分離し、油相を
別の容器に移す。残りの懸濁液と約300mlのｎ−ヘキサ
ンで１回、約300mlのメチルエチルケトンで１回ゆす
ぐ。得られた磁性懸濁液を水／メタノール（容量比＝1:
1）約400ml中に分散させ、遠心分離する。その後、その
磁性断片を約400mlの水に分散させることによって10回
洗浄する。洗浄１回毎に遠心分離を行う。
粒径２〜４μｍの範囲、鉄含有量７％の磁性粒子が得
られる。
（以上及び以下において、％は全て、流体物質に関し
てはvol.％、固体物質に関してはwt.％を表す。） 実施例２ 実施例１の磁性コロイド5mlを実施例１のPVAL相40ml
に分散させ、1.5％のプルーロニック8100、0.4％のプル
ーロニック6200及び0.4％のデヒマルスFCEが分散してい
る800mlの標準的な植物性油に混合することによって懸
濁する（攪拌速度:2000rpm）。
その後、25％グルタールアルデヒド溶液４％を添加す
る。この懸濁液を更に10秒間攪拌する。10秒後、実施例
１と同様にして、メタノール／水、ｎ−ヘキサンそして
メチルエチルケトンを使って、この懸濁液を遠心分離
し、洗浄する。
粒径１〜３μｍの磁性粒子が得られる。酸化鉄含有量
は7.3％である。
実施例３ フェロフルーディックスEMG807を4ml、５％PVAL溶液1
00ml（平均分子量:224.000）中に分散させる。その分散
は５分間超音波浴にて超音波処理を施し、２％のアーラ
セル83、0.8％のツィーン85、0.4％のデヒマルスFCEを
含む植物性油2300ml中で攪拌することによって懸濁する
（攪拌速度:1800rpm）。
５秒後、2.5N塩酸25mlを添加し、更に５秒後12％のグ
ルタールアルデヒド溶液7mlを添加する。更に10秒間、
攪拌を続ける。実施例１と同様にして、10分後その懸濁
液を遠心分離し、洗浄する。
粒径２〜５μｍ、酸化鉄含有量24.6％の磁性粒子が得
られる。
実施例４ ベイフェロックスPR5044N酸化鉄塗料180mgを0.01％の
ポリスチレンスルホン酸と0.05％のポリエチレングリコ
ール1000を含む７％PVAL溶液20ml（平均分子量:88.00
0）に添加し、速度20.000rpmで１分間、分散器（ウルト
ラ−ツラックス（Ultra−Turrax）を用いて分散させ
る。この後、超音波浴にて２分ずつ２回の処理を行う。
続いてその混合物を、1.9％のアーラセル83、0.4％のツ
ィーン20、0.3％のデヒマルスFCEを及び１％のデヒマル
スHRE7を含む標準的な植物性油460ml中で攪拌しながら
分散させる（攪拌速度:2000rpm）。
10秒後、25％のグルタールアルデヒド溶液0.8mlを添
加し、５秒後1Nの塩酸8mlを添加する。更に10秒間、攪
拌を続ける。10分後、断片を実施例１と同様にして分離
し、洗浄する。
粒径２〜４μｍ、鉄含有量12.3％の磁性粒子が得られ
る。
実施例５ ベイフェロックス318M 50mgを、５％のPVAL溶液（平
均分子量:224,000）、0.01％のドデシル硫酸ナトリウム
と0.1％のポリエチレングルコール1000を含む混合物10m
l中にウルトラ−ツラックスを用いて分散する（20.000r
pm）。続いて、そのポリマー相を、2.2％のスパン80、
0.4％のデヒマルスFCE及び0.4％のプルーロニック6200
を含む標準的な植物性油250ml中に攪拌しながら分散さ
せる（攪拌速度:1800rpm）。
５秒後、1N塩酸10mlを、更に10秒後、25％のグルター
ルアルデヒド溶液0.6mlを添加する。更に10秒間、攪拌
を続ける。５分後、懸濁液を遠心分離する。回収した断
片を実施例１と同様の方法で洗浄する。
粒径３〜６μｍ、酸化鉄含有量10.2％の磁性粒子が得
られる。
実施例６ 実施例１の磁性コロイド6.4mlを、４％のPVAL50ml
（平均分子量:103.000）、0.1％のウシ血清アルブミン
及び0.5％のポリエチレングリコール1000を含む混合物
中に分散させる。超音波浴での５分間の分散に続いて、
1.8％のスパン85、0.8％のシンペロニックPL61、0.8％
のテトロニック901及び0.4％のデヒマルスFCEを含む植
物性油1100ml中で懸濁する（攪拌速度:2000rpm）。
120秒後、12％グルタールアルデヒド溶液4mlを添加
し、更に５秒後、2.5N塩酸12.5mlを添加する。更にもう
10秒間攪拌を続けた後、実施例１と同様にして、遠心分
離、洗浄を行う。
ビーズ粒径１〜３μｍ、酸化鉄含有量8.3％の磁性粒
子が得られる。
実施例７ フェロフルーディックスEMG507を13ml及び20％の3N塩
酸を含む3.5％PVAL溶液（平均分子量:224.000）100mlと
混合する。その混合物を超音波浴で0.5分間処理する。
マグネタイト−ポリマー相を、1.8％のプルーロニック6
100、0.2％のプルーロニック6200、0.2％のハイパーマ
ーA60及び1.8％のデヒマルスHRE7を含む植物性油2.3リ
ットル中で攪拌しながら懸濁する（攪拌速度:2000rp
m）。
10秒後、12％のグルタールアルデヒド溶液8mlを添加
し、15秒間、攪拌を続ける。10分後、その懸濁液を実施
例１と同様にして遠心分離し、洗浄する。
回収したビーズの粒径は１〜２μｍ、酸化鉄含有量は
14.2％である。
実施例８ 0.05％のゼラチンが溶解している7.5％PVAL溶液100ml
（平均分子量:88.000）をフェロフルーディックスEMG70
7を12.5mlと混合し、超音波浴にて３分間超音波処理す
る。続いて、１％のアーラセル83、0.4％のプルーロニ
ック6100、0.2％のブリジ52及び0.4％のツィーン60を含
む植物性油2.5リットル中で攪拌しながら懸濁する（攪
拌速度:2000rpm）。
10秒後、12％のグルタールアルデヒド溶液4mlを添加
し、更に５秒後、1N塩酸26.5mlを添加する。更に15秒
間、攪拌を続ける。15分後、その懸濁液を実施例１と同
様の方法で遠心分離する。
粒径２〜４μｍ、酸化鉄含有量26％の磁性粒子が得ら
れる。
実施例９ 7.5％PVAL溶液10ml（平均分子量103.000）を0.5N水酸
化ナトリウムを使ってpHを9.5に調整し、75μｌのジビ
ニルスルホンを添加する。続いて、実施例１の磁性コロ
イド1.2mlを水溶相中に分散させる。３分間の超音波浴
における処理の後、２％のスパン60、0.4％のツィーン8
0、0.4％のデヒマルスFCEが溶解している植物性油220ml
中で攪拌しながら分散させる（攪拌速度:2000rpm）。更
に30秒間、攪拌を続け、その後、その懸濁液を60分間常
温で放置する。実施例１と同様にして、その懸濁液を洗
浄する。
粒径４〜８μｍ、酸化鉄含有量7.7％のビーズが得ら
れる。
実施例10 フェロフルーディックスEMG707を5ml、40％の1N塩酸
と0.015％のドデシル硫酸ナトリウムが溶解している3.5
％PVAL溶液（平均分子量:224.000）100ml中に充填さ
せ、その混合物を３分間超音波浴において超音波処理す
る。続いて、ポリマー相を１％のアーラセル83、１％の
プルーロニック6100,0.8％のツィーン80及び２％のデヒ
マルスHRE7を含む植物性油2.3リットル中で10秒間攪拌
することによって懸濁する（攪拌速度:2000rpm）。10秒
後、25％のグルタールアルデヒド溶液6mlを添加し、更
に10秒間、攪拌を続ける。10分後その懸濁液を実施例１
と同様にして遠心分離し、洗浄する。粒径２〜４μｍ、
酸化鉄含有量24％の磁性粒子が得られる。
実施例11 実施例１の磁性コロイド14.5mlを４％PVAL（平均分子
量:224.000）及び0.1％のウシ血清アルブミンを含むポ
リマー相100ml中に分散させる。その混合物を超音波浴
中で１分間処理する。その後、その分散液を3.8％のプ
ルーロニック3100、0.8％のプルーロニック6200及び1.5
％のテトロニック304が溶解している植物性油2.5リット
ル中に15秒間攪拌することによって懸濁させる（攪拌速
度:2000rpm）。その後、12％グルタールアルデヒド溶液
7.5mlを添加し、更に10秒後、3N塩酸25mlを添加し、更
に10秒間攪拌を続ける。10分後、その懸濁液を洗浄し、
実施１と同様に更に調製する。
粒径１〜２μｍ、酸化鉄含有量9.5％の磁性粒子が得
られる。
実施例12 ５％のPVAL（平均分子量:224.000）、0.5％のポリエ
チレングリコール3350及び12％のフェロフルーディック
スEMG707を含むポリマー相50mlを、10秒間2.2％のアー
ラセル80、0.8％のスパン85及び0.8％のトリトンCF10が
溶解している植物性油1200ml中で攪拌することによって
懸濁する（攪拌速度:1800rpm）。
５秒間隔で、25％グルタールアルデヒド溶液4mlと1N
塩酸25mlを添加する。更に15秒間、攪拌を続ける。
10分後、実施例１と同様にして遠心分離と洗浄を行
う。
粒径１〜２μｍ、酸化鉄含有量18.3％の磁性ビーズが
得られる。
実施例13 0.05％のポリスチレンスルホン酸と0.1％のポリビニ
ルピロリドンが溶解している５％PVAL溶液100ml（平均
分子量:203.000）に実施例１の磁性コロイド12mlを分散
させ、２分間超音波浴にて超音波処理する。続いて実施
例12と同じ組成の植物性油2.2リットル中に懸濁させ
る。
10秒間の攪拌後、12％グルタールアルデヒド溶液8ml
を添加し、その10秒後に2.5N塩酸20mlをそれぞれ添加す
る。
実施例１の洗浄と調製を行うと、粒径２〜４μｍ、酸
化鉄含有量7.5％の磁性粒子が得られる。
実施例14 フェロフルーディックスEMG807を6.5ml、0.05％のセ
ルロースアセテートブチレートと0.1％のポリビニルピ
ロリドンを含む10％PVAL溶液（平均分子量:88.000）100
ml中に分散させる。その後、３分間超音波浴にて処理を
行う。その後、その分散液を１％のシンペロニックL6
1、0.2％のテトロニック1101及び1.8％のデヒマルスFCE
を含む植物性油2300ml中で攪拌しながら懸濁する（攪拌
速度:2000rpm）。
10秒後、20mol％のエチレンジアミンと2.5N塩酸23ml
を含む12％グルタールアルデヒド溶液8mlを、それぞれ1
0秒間隔で添加する。更に10秒間、攪拌を続ける。
10分後、実施例１と同様にして、その懸濁液を分離、
洗浄する。ビーズ粒径１〜３μｍ、酸化鉄含有量10.4％
の磁性粒子が得られる。
実施例15 実施例１と同様にして合成されたポリマー粒子300mg
を、水10ml中に懸濁させ、3.5Mの水酸化ナトリウム10ml
及びエピクロロヒドリン15mlを添加する。その懸濁液を
55℃で２時間、強く攪拌する。その後、ネオジム−鉄−
ホウ素磁石を使って磁性粒子を回収する。その生成物を
水10ml中に懸濁し、再度磁石によって分離する。この洗
浄分離処理を10回繰り返した後、アセトンを用いて１回
洗浄する。
活性化した磁性粒子30mgを0.1Mホウ酸緩衝液（pH11.
4）に溶解している10％ヘキサメチレンジアミン2mlと50
℃で２時間反応させ、水による洗浄工程を続ける。得ら
れた生成物に、12.5％グルタールアルデヒドが溶解して
いる0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）を充填させ
る。その反応は30℃で２時間行う、その反応の後、30分
以上かけて水による洗浄処理を10回、0.1Mリン酸カリウ
ム緩衝液（pH7.5）による洗浄処理を２回行う。0.1Mリ
ン酸カリウム緩衝液（pH7.5）に溶解しているストレプ
トアビジン0.3mgを４℃で12時間以上インキュベートす
ることによって、0.11mgのストレプトアビジンをマトリ
ックスに結合させる。ビオチニル化したDNA断片は、公
知のDAN塩基配列決定法によってこのマトリックスに結
合させることができる。
実施例16 エピクロロヒドリン、ヘキサメチレンジアミン、グル
タールアルデヒド活性化磁性粒子の合成物30mgを実施例
15の方法によって、0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.
5）2ml中に溶解している抗インシュリン抗体0.3mgと４
℃で24時間反応させる。0.28mgの抗体が結合する。
実施例17 実施例３の磁性粒子60mgに、アセトンと水混合物（1:
3,1:1,3:1）そして最後に無水アセトンを連続添加して
脱水する。その懸濁液を0.1％のオクチル酸スズを含む
乾燥ジメチルスルフォキシド2ml中に分散させ、ヘキサ
メチレンジイソシアネート0.5mlを45℃で30分以上かけ
て添加することによって活性化する。その後、その試料
を数mlのジメチルスルフォキシドとアセトンで交互に５
回洗浄する。
その活性化した断片30mgを20％のポリエチレングリコ
ール400及び0.05％のDABCOを含む無水ジメチルスルフォ
キシド1mlと30℃で４時間かけて反応させる。その後、
その試料をジメチルスルフォキシドで１回、水で５回洗
浄し、上記のアセトンと水の混合物で脱水処理した。
続いて、断片と結合したポリエチレングリコールを6m
Mの４−ジメチルアミノピリジンと２−フルオロ−１−
メチルピリジニウム−ｐ−トルエンスルフォネートがそ
れぞれ溶解しているジメチルスルフォキシド1mlと室温
で45分間、反応させる。その生成物をジメチルスルフォ
キシドとアセトンで交互に５回洗浄した。
抗チロキシン抗体溶液（0.25mg抗体/ml、0.05Mのリン
酸カリウム緩衝液（pH7.5））で活性化された生成物を
４℃で12時間インキュベートすることによって、抗体0.
23mgを結合させる。結合緩衝液を用いた数回の洗浄工程
の後、残りの活性基をメルカプトエタノール20mMを含む
0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）2mlによって４時間イ
ンキュベートすることによって不活性化する。その後、
その磁性粒子をPBS緩衝液（pH7.2）で洗浄する。
結合した磁性粒子は公知の方法によって、チロキシン
測定に使用することができる。
実施例18 実施例17のヘキサメチレンジイソシアネートによって
活性化した断片30mgを0.3Mの水酸化カリウム／メタノー
ル溶液（水酸化カリウム：メタノール＝1:1）2mlによっ
て５時間インキュベートする。室温で５時間反応させた
後、その生成物を水で５回洗浄する。
続いて、断片を含むアミノ基を実施例15のグルタール
アルデヒドによって活性化し、その後、30分かけて洗浄
処理を数回行う。
0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）1ml中に溶解して
いる抗マウス免疫グロブリンG0.25gを４℃で24時間かけ
てインキュベートする。その結果、0.28mgの免疫グロブ
リンＧが結合する。
結合した生成物は公知の方法を用いて細胞分離に使用
できる。
実施例19 実施例10の磁性粒子30mgを100mgのBrCNが溶解してい
る水4mlによって０℃でインキュベートする。2Nの水酸
化ナトリウムを添加することによって、pHを11.5に調整
する。磁性断片の磁性分離によってその反応を止める。
その生成物を氷水を使って４回洗浄し、その後、0.01N
塩酸と0.1Mバイオカーボネート緩衝液（pH8.2）を用い
て洗浄を１回行う。
0.2mgの抗CD4抗体が溶解している0.1Mバイオカーボネ
ート緩衝液（pH8.2）1mlを４℃で12時間インキュベート
する。その後、0.5M塩化ナトリウムと0.1％のトリトンX
100を含むPBS緩衝液（pH7.2）を用いて数回ゆすぐ。0.1
8mgの抗体が結合した担体が得られる。
得られた担体はＴ−ヘルパー細胞の分離に使用でき
る。
実施例20 実施例５の磁性粒子30mgを実施例19と同様の方法でBr
CNを用いて活性化する。バイオカーボネート緩衝液（pH
8.2）0.1ml中に溶解しているヘパリン0.5mgを12時間か
けてインキュベートすることによってヘパリン（分子量
6000）の結合を行う。
続いてその生成物を0.1Mのエタノールアミン溶液（pH
8.0）によって室温で２時間インキュベートし、0.1Mの
アセテート緩衝液（pH4）を用いて４回洗浄する。
得られた断片は、公知の方法によって、抗トロンビン
IIIの分離に使用できる。
実施例21 実施例４の磁性粒子30mgを、上記のアセトンと水の混
合物を連続添加することによって脱水する。その磁性ビ
ーズを6mMの４−ジメチルアミノピリジンと5mMの２−フ
ルオロ−１−メチルピリジニウム−Ｐ−トルエンスフォ
ネートをそれぞれ含むジメチルスルフォキシド1mlによ
って室温で45分間インキュベートする。アセトンとジメ
チルスルフォキシドで交互に５回洗浄を行い、さらに0.
3mgのタンパク質Ａを含む0.05Mのリン酸カリウム緩衝液
（pH7.5）1mlで１回洗浄する。
室温で12時間かけて結合させた後、0.5％の塩化ナト
リウムと0.1％のトリトンX100を含有しているPBS緩衝液
を用いて数回ゆすぐ。0.27mgのタンパク質が結合した。
その磁性断片は公知の諸方法によって、免疫グロブリ
ンＧサブクラスの分離に使用できる。
実施例22 実施例12の磁性粒子断片30mgを、0.5Mカーボネート緩
衝液（pH11）2mlを用いて１回洗浄する。続いて、ジビ
ニルスルフォン100μｌを用いて活性化し、更に1mlの洗
浄緩衝液を室温で70分かけて添加する。その生成物を30
分かけて数回洗浄する。
その磁性断片を10％のラクトースが溶解しているカー
ボネート緩衝液1ml（pH10）によって室温で20時間イン
キュベートする。0.68mgのラクトースが結合する。
この担体は、公知の方法によって、ミスルトー（mist
letoe,やどり木）抽出物からのレクチンの浄化に使用す
ることができる。
実施例23 エピクロロヒドリンを用いて活性化した実施例７の磁
性粒子30mgを、上記実施例15に記載のように、0.2Mのカ
ーボネート緩衝液（pH9）中の0.3Mアジピン酸ジヒドラ
ジドと室温で16時間反応させ、ジヒドラジド誘導体を生
成する。0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）を用いて数
回洗浄した後、オキシラン残基を、0.3Mメルカプトエタ
ノールを含む洗浄緩衝液によって４時間インキュベート
する。最後に0.1Mナトリウムアセテート緩衝液（pH5.
5）3mlを用いて洗浄する。続いて、抗HGH（ヒト成長ホ
ルモン）抗体0.3mgとｍ−過ヨウ素塩酸ナトリウム10mM
が溶解しているアセテート洗浄緩衝液1mlを４℃で40分
かけて暗室でインキュベートする。続いて、酢酸ナトリ
ウム緩衝液で５回ゆすぎ、PBS緩衝液で２回洗浄する。
0.21mgの抗体が結合する。
この結合された担体はHGHの検出に使用できる。
実施例24 実施例９の磁性粒子30mgを水中に懸濁させ、ハンド磁
石を使って分離する。分離された断片は、0.1Mのアンモ
ニウム硝酸セリウム（IV）を含む0.1Mの硝酸を用いて、
室温で15分間インキュベートする。続いて、磁性手段に
よって磁性粒子を分離し、水で１回洗浄する。断片を、
アクリル酸0.5ml及びヘキサン0.5mlを50℃で15分間イン
キュベートすることによって、反応させる。30分間、洗
浄処理を10回行う。グラフト量は85％である。
グラフト断片を、５％の１−シクロヘキシル−３−
（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−ト
ルエンスルフォネート1mlが溶解している0.1Mの３−
（Ｎ−モルホリノ）プロパン酢酸（MOPS）（pH7.5）を
用いて室温で活性化する。活性化に引き続いて氷水で５
回洗浄する。1mlのMOPS緩衝液（pH7.5）に溶解している
抗LDL（低密度リポタンパク質）抗体0.3mgを添加する。
その反応を４℃で24時間を続ける。その後、その担体を
5mMエタノールアミン/0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.5）5
mlによって４時間インキュベートすることによって不活
性化する。0.25gの抗体が結合する。
結合したマトリックスは生体液からのLDL除去に使用
できる。
実施例25 実施例３の磁性粒子30mgをアクリル酸によって、実施
例24と同様にしたグラフトする。５′末端において、10
0μｇのオリゴ（dT）20を、「DNA」４巻、327頁,1985年
（DNA、Vol.4,327,1985）に記載の方法によってエチレ
ンジアミンと置換した。
磁性粒子断片を、0.1Mイミダゾール緩衝液（pH7.0）1
mlに溶解しているNH2−置換オリゴヌクレオチドによっ
て室温で20分間インキュベートする。その後、0.1％の
トリトンX100を含むイミダゾール緩衝液を用いて数回の
洗浄処理を行う。38μグラムのオリゴヌクレオチドが結
合する。
得られた磁性粒子は確立した方法によってmRNAの分離
に使用できる。
実施例26 実施例９の磁性粒子100mgを上記のアセトンと水の混
合物の援助を受けて、連続的に脱水する。この後、実施
例17のヘキサメチレンジイソシアネートを用いて活性化
する。
活性化した粒子を0.1％のオクチル酸スズとｍ−アミ
ノフェニルホウ酸30mgを含有したジメチルスルフォキシ
ド2mlによって30℃で６時間インキュベートする。この
後、水で数回洗浄する。
磁性担体に結合したホウ酸は、確立した方法によって
糖化ヘモグロビンの検出に利用できる。
実施例27 50mgのシバクロンブルーF3G−Ａが溶解している水2ml
を実施例14の磁性粒子30mg中に混合する。
その混合物を60℃で30分間反応させる。その後、25％
の塩化ナトリウム溶液1mlを添加し、更に１時間加熱を
続け75℃にする。10％の炭酸ナトリウムを添加後、更に
２時間加熱を続け70℃にし、水で７時間洗浄する。
得られたマトリックスは、公知の方法によってアルコ
ールデヒドロゲナーゼの分離に使用できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４１Ａ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４１ 33/545 Ｚ 33/545 33/553 33/553 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (56)参考文献 特開 平４−23988（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−176212（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−63761（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−10912（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−93727（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−26879（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−26878（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08F 8/00 - 8/50 G01N 33/543 - 33/553

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ポリビニルアルコール（PVAL）の球形粒子
    の製造方法であって、磁性コロイドが分散している水溶
    性PVAL溶液が、ポリマー相と混ざらず、かつ少なくとも
    １つの乳化剤が親油性であり、少なくとももう一つの乳
    化剤が半親油性である、少なくとも２種の乳化剤を含む
    有機相中で、室温で攪拌することによって懸濁するこ
    と、及びヒドロキシル基と反応する水溶性物質を懸濁工
    程中に添加し、PVAL液滴を架橋結合することを特徴とす
    るPVALの球形粒子の製造方法。
  2. 【請求項２】少なくとも１成分が部分的に水溶性である
    少なくとも２種の異なる成分からなる乳化剤混合物２〜
    6vol.％が前記有機相中に溶解していることを特徴とす
    る請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】１種以上の乳化剤0.01〜２重量％が前記ポ
    リマー相中に溶解していることを特徴とする請求項１に
    記載の方法。
  4. 【請求項４】前記乳化剤がタンパク質類、セルロース誘
    導体類、スルホン酸誘導体類、ポリビニルピロリドン類
    またはポリエチレングリコール類またはこれらの混合物
    である請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】ポリマー溶液が2.5〜12.5重量％のPVALを
    含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】強磁性物質または超常磁性物質の形態の磁
    性コロイドをポリマー相に混和することを特徴とする請
    求項１から５に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記ポリマー相に対して２〜7vol.％の架
    橋溶液を添加することを特徴とする請求項１〜６に記載
    の方法。
  8. 【請求項８】水溶性ジアミン類を添加して前記架橋剤を
    使用することを特徴とする請求項１〜７に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記架橋が、前記ポリマー相に対して２〜
    50vol.％の酸を添加することによってジアルデヒド類を
    用いて行われることを特徴とする請求項１から７に記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】請求項１〜９に記載の方法によって得ら
    れる、粒径１〜10μｍの球形磁性PVAL粒子。
  11. 【請求項１１】化学的に結合したポリマー鎖を表面にも
    つ球形ポリマー粒子であって、ポリマー鎖を構成するビ
    ニルモノマー類がカルボキシル基、ヒドロキシル基、ア
    ミノ基、アルデヒド基またはオキシラン基を含むことを
    特徴とする請求項10に記載の球形ポリマー粒子。
  12. 【請求項１２】生体分子と結合する活性基を表面に持つ
    ポリマー粒子であることを特徴とする請求項10及び11に
    記載の磁性粒子。
  13. 【請求項１３】前記結合基が抗体類、ペプチド類、タン
    パク質類、酵素類、ストレプトアビジン、アビジン、オ
    リゴヌクレオチド類またはDNA断片と反応することを特
    徴とする請求項12に記載の球形PVAL粒子。
  14. 【請求項１４】細胞類、核酸類、タンパク質類、ウイル
    ス類または細菌類を断片化するための請求項10〜13に記
    載のPVAL粒子。
  15. 【請求項１５】免疫定量法、DNA塩基配列決定法またはD
    NA合成のための請求項10〜13に記載のPVAL粒子。
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