PT843591E

PT843591E - Particulas polimericas magneticas a base de alcool polivinilico processo para a sua preparacao e uilizacao

Info

Publication number: PT843591E
Application number: PT96918662T
Authority: PT
Inventors: Detlef Muller-Schulte
Original assignee: Chemagen Biopolymer Technologi
Priority date: 1995-07-31
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2001-08-30
Also published as: CA2227608A1; JPH11510836A; EP0843591B1; US6514688B2; GR3035993T3; ATE199503T1; AU717433B2; DE19528029A1; KR19990035924A; US20010014468A1; RU2160154C2; KR100355006B1; EP0843591A1; CN1104276C; ES2157443T3; IL123061A0; US6204033B1; DK0843591T3; WO1997004862A1; IL123061A

Description

Descrição “Partículas poliméricas magnéticas à base de álcool polivinílico, processo para a sua preparação e utilização” São objecto da presente invenção processos para a preparação de partículas de polímero com a forma de pérola ou de esfera (gotas) à base de álcool polivinílico (PVAL), em que é encapsulado um colóide magnético que confere propriedades magnéticas às partículas de polímero e, por consequência, possibilita ligar biomoléculas ou células.

Partículas poliméricas magnéticas foram utilizadas nos últimos anos sobretudo na bioquímica e medicina, nomeadamente para a separação de células, proteínas e ácidos nucleicos. Por causa das propriedades magnéticas podem-se utilizar também como sistemas de transporte para determinados fármacos em determinadas áreas corporais. A utilização de partículas magnéticas oferece pela sua manipulação prática grandes vantagens em relação aos sistemas de separação usuais porque, na maior parte dos casos, as partículas magnéticas presentes sob a forma de finas suspensões ou emulsões se podem separar da mistura por meio de forças magnéticas. Esta técnica de separação toma supérflua a centrifugação usual. A fracção magnética pode além disso ser separada no intervalo de tempo de uns minutos, o que significa uma considerável economia de tempo em comparação com as técnicas cromatográficas usuais de separação em coluna. Nesta técnica têm de ser tomadas em consideração sobretudo a equilibração e a eluição que consomem tempo, processos esses que praticamente desaparecem na técnica das esferas magnéticas. Uma outra vantagem essencial que caracteriza a tecnologia das esferas magnéticas, consiste no tipo da emética da reacção. Nos meios de enchimento para a ?

cromatografia em coluna recorre-se em geral a granulometrias de 50 - 100 μηι. Porque com essas granulometrias, no entanto, as capacidades de separação muitas vezes não são suficientes, verifica-se a tendência crescente de utilizar granulometrias < 50 pm e até < 10 pm. Para poderem ser resistentes às elevadas pressões produzidas na passagem através da coluna, esses meios praticamente não possuem porosidades, pelo que na prática se tem de substituir as colunas de plástico ou de vidro transparentes por colunas de aço resistentes à pressão. Os sistemas de bombagem eficientes necessários são um outro inconveniente da técnica de cromatografia em coluna actual. Estes inconvenientes que se baseiam fundamentalmente na cinética do movimento insuficiente podem ser completamente evitados por utilização da tecnologia das esferas magnéticas.

Por utilização de partículas de PVAL finamente dispersas, que possuem uma granulometria de 1-10 pm, de preferência uma granulometria de 1-4 pm, as partículas mantém-se durante várias horas no estado suspenso, de modo que a cinética do movimento corresponde a uma solução quase-homogénea. Em consequência da suspensão estável pode na maior parte dos casos renunciar-se à agitação ou ao sacudimento.

Processos para a preparação de micropartículas de ferro-dextrano magnéticas são descritas na memóna descativa da patente norte-americana 4 452 773. Por mistura de uma solução de sais de Fe(II) e Fe(III) em presença de uma quantidade definida de dextrano e subsequente adição de um reagente alcalino obtêm-se partículas de óxido de Fe de tamanho coloidal com 30-40 nm em que é adsorvido pelo dextrano. Um processo semelhante é a base do pedido PCT WO 90/07380. Tratam-se soluções de sal de Fe(II) e Fe (III) sob adição de dextrano a 40°C e seguidamente titula-se com NaOH, com base em que se obtêm as suas partículas superparamagnéticas com um tamanho de 40-100 nm. O inconveniente dos dois processos relativamente à separação rápida e simples consiste no facto de que, por causa da finura das partículas, só é possível realizar uma separação por meio de um campo magnético de elevado gradiente (High Gradient Magnetic Field = Campo Magnético de Elevado Gradiente). Este campo magnético de elevado gradiente é produzido por meio de uma coluna de separação, que está cheia compactamente com lã de aço ou com substâncias de micropartículas semelhantes, e se encontra entre as extremidades polares de dois electroímanes ou magnetes permanentes. A separação das partículas realiza-se por passagem interior da suspensão ao longo da coluna de separação cheia. Não é possível efectuar a separação desses coloides por meio de imanes manuais correntes. As diferenças experimentais fundamentais em relação à técnica da cromatografia tradicional são por consequência pequenas. Um outro inconveniente do processo de preparação citado é o facto de, por meio do processo de preparação próprio, não se obterem tamanhos de partículas unitários mas estes só se obtêm por meio de uma separação magnética ffaccionada. O facto de as partículas não serem visíveis ao microscópio óptico dificulta ainda mais a detecção destas partículas magnéticas. No outro processo, que é a base da patente norte-americana 4 070 246, as partículas magnéticas são obtidas por reacção de ácido p--aminobenzóico e um aldeído sob adição de um pó ferromagnético. A preparação de partículas com a forma de pérolas definida como são necessárias para os ensaios de diagnóstico, não é possível com este processo. Acoplamentos químicos de molécula biológicas aos suportes não são igualmente possíveis. O mesmo é também válido para os processo descritos nas memórias descritivas das patentes norte-americanas 4 106 448, 4 136 683 e 4 735 796 para a preparação de partículas magnéticas encapsuladas em dextrano para o diagnóstico e para a terapia de tumores. Nos processos mencionados antes também não se descrevem acoplamentos covalentes de biomoléculas. Na memória descritiva da patente norte-americana 4 647 447, descreve-se a preparação de partículas ferromagnéticas para o diagnóstico por NMR. Neste caso, parte-se ou de soluções de sais de Fe(II)/Fe(III) ou directamente de ferrites sob a forma de micropartículas que, em presença de um agente complexante com a forma de albumina do soro, polissacáridos, dextrano ou dextrina para a obtenção de suspensões magnéticas. Outras partículas ferromagnéticas que são encapsuladas numa matriz de silano, são referidas na memória descritiva da patente norte-americana 4 628 037. Igualmente como agentes de contraste para o diagnóstico por NMR servem os óxidos de ferro superparamagnéticos que são referidos na patente norte-americana 4 827 945. Por precipitação de misturas de sais de Fe(II)/Fe(III) por meio de bases em presença de albumina do soro, polipéptidos ou polissacáridos podem-se preparar partículas magnéticas recobertas com estas substâncias. Por acoplamento de determinados anticorpos à matriz, as partículas magnéticas podem ser dirigidas para determinadas áreas do corpo (direcção para um alvo). A preparação de óxidos de ferro por precipitação de sais de ferro em presença de, por exemplo, dextranos ou poliglutaraldeídos é à base das patentes norte--americanas 2 870 740 e 4 267 234. E comum a todos os processos e produtos antes mencionados que as partículas ferromagnéticas ou superparamagnéticas só sejam preparadas por precipitação de uma solução de sal de Fe, que é pressuposto ter uma determinada proporção molar de sais de Fe(ll) e Fe(III), em presença de um agente complexante ou de um agente de revestimento. As partículas descritas possuem uma distribuição de granulometrias mais ou menos larga. Com o mencionado processo não é possível preparar partículas com a forma de pérola ou de esfera definida. Os meios descritos possuem uma estrutura geométrica mais ou menos amorfa. Por causa da sua finura, que está compreendida na gama dos nm, eles são apropriados portanto principalmente como agentes de contraste para o diagnóstico por NMR ou como agente de marcação de células (marcador de células). A separação das fracções magnéticas além disso, não é possível por meio de imanes manuais simples como são vantajosas para os ensaios de diagnóstico rápidos ou para as separações cromatográficas de afinidade. A preparação de micropartículas magnéticas de albumina ou proteína que são recobertas com determinados agentes de ligação e podem ser utilizados para as preparações de vírus e de células assim como em ensaios de diagnóstico é descrita nas patentes norte-americanas 4 345 588; 4 169 804; 4 115 534; 4 230 685; 4 247 406 e 4 357 259. Conhecem-se partículas magnéticas com uma estrutura com a forma de pérola definida por meio da patente norte-americana 4 861 705. São objecto da patente mencionada antes partículas compósitas de agarose-polialdeído que são obtidas por· suspensão da fase poliménca em uma fase oleosa. Por mistura de um fluido de ferro obtêm-se colóides de óxido de ferro aquosos superparamagnéticos muito finos de acordo com a definição para a fase polimérica com partículas poliméricas magnéticas com uma granulometria de 40-1000 pm.

Partículas com a forma esférica ideal são descritas na patente norte--americana 4 654 267. O processo diferencia-se fundamentalmente do mencionado antes pelo facto de se utilizar como matriz poliacrilatos ou poliestireno que primeiramente são polimerizados por radicais por meio de uma polimerização em 6

suspensão com a obtenção de partículas com a forma de pérola. Em seguida, as partículas são inchadas numa fase orgânica sob condições definidas. Segue-se uma incubação das partículas de polímero numa solução de sal de Fe(II)/Fe(III) que depois de se ter difundido nas partículas, é oxidado por meio de amoníaco com a obtenção de óxidos de ferro superparamagnéticos. O processo proporciona partículas com a forma de pérola com uma granulometria compreendida entre 0,5 e 20 μτη. O processo é tecnicamente muito dispendioso. Além da utilização de substâncias de alta toxicidade, o tempo necessário para a preparação da matriz de base monta a 10--30 horas. Ainda é preciso introduzir grupos nitro-, nitroso ou amino adicionais na matriz polimérica por meio de uma fase adicional de preparação para garantir uma absorção suficiente do sal dê Fe. O inconveniente decisivo das partículas aí descritas baseia-se no poliestireno utilizado como polímero de base. O poliestireno constitui um material extraordinariamente hidrófobo que, em contacto com as soluções de proteína ou com outras biomoléculas, tem fortemente tendência para adsorção não específica, um fenómeno que é inconveniente especialmente nos ensaios de imunidade e nas separações cromatográficas de afinidade. Os inconvenientes dos processos mencionados antes relativamente à despesa de preparação, às medidas de partículas, ao comportamento de separação magnética, às propriedades do material polimérico ou o tipo do acoplamento podem ser eliminadas por um processo de suspensão de água em óleo do novo tipo.

Como matriz de polímero utiliza-se álcool polivinílico (PVAL) que, como solução aquosa, é suspenso sob agitação numa fase orgânica não miscível com água e reticulado. Exemplos dessas fases orgânicas são geralmente conhecidos a partir do estado da técnica da polimenzação em suspensão. Preferivelmente, para o processo ^¢/7 7 de acordo com a presente invenção, utilizam-se óleos vegetais correntes no comércio. Para conseguir as propriedades magnéticas pretendidas das partículas de polímero, a fase polimérica antes da suspensão é misturada com um colóide magnético por exemplo com a forma de pós de óxido de ferro ou fluidos de ferro e, em seguida, suspensa na fase oleosa. A preparação de partículas de PVAL com a forma de pérolas por suspensão de uma solução aquosa de polímero é descrita na DE-OS 4127657. Por adição de pó de magnetite à solução do polímero podem preparar-se partículas magnéticas. O processo aí descrito utiliza soluções de polímeros e fases oleosas que não contêm adições com a forma de agentes emulsionantes nem de outras substâncias tensioactivas. Por consequência, os tamanhos das partículas estão geralmente compreendidos entre 50 e 500 ,um. No processo mencionado antes, eles são determinados em primeiro lugar pela viscosidade da fase orgânica e/ou da fase do polímero.

Em contrapartida, são objecto da presente invenção partículas magnéticas que possuem uma granulometria compreendida na gama de 1-10 um, de preferência entre 1-4 ,um e, além disso, possuem uma distribuição de granulometrias muito apertada. Essas partículas apenas podem ser utilizadas para a separação de células/marcaçao de células que se utilizam para a purificação de sistemas biológicos em suspensão assim como para ensaios de diagnóstico.

Verificou-se surpreendentemente que essas partículas de polímero se podem realizar por adição de determinadas misturas de agente emulsionante à fase oleosa. O termo “agente emulsionante” é em seguida, de acordo com a definição, considerada como conceito genérico para todas as substâncias com actividade tensioactiva tais como agentes tensioactivos, agentes detergentes ou agentes 8

estabilizadores da suspensão. Agentes emulsionantes que são apropriados como aditivos para a fase oleosa, são por exemplo : copolímeros em bloco de dióxido de propileno-óxido de etileno, ésteres de sorbitano de ácidos gordos, ésteres mistos complexos de ésteres de penteritrite de ácido gordo com ácido cítrico, derivados de polietilenoglicol-óleo de rícino, copolímeros em bloco de derivados de óleo de rícino, polietilenoglicóis, poliésteres modificados, ésteres de ácido gordo de polioxietileno-sorbitano, copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno-etilenodiamina, derivados de poliglicerilo, derivados de polioxietileno-álcoois, derivados de alquilfenil-polietilenoglicol, copolímeros em bloco de ácido poli--hidroxi gordo-polietileno glicol, derivados de éteres de polietileno glicol. Substâncias deste tipo são conhecidas no comércio, entre outras, sob as seguintes designações comerciais: Pluroni®, Synperoni®, Tetronic®, Triton®, Axlacel®, Span®, Tween®, Brij®, Renex®, Hypermer®, Lameform®, Dehymuls® ou Eumulgin®.

Em relação às partículas poliméricas com a forma de pérola uniformes com o tamanho das partículas exigido de 1-10 pm verificou-se surpreendentemente que para a fase oleosa apenas uma mistura de pelo menos duas, de preferência três ou quatro substâncias activas, satisfazem a especificação das partículas exigida. A condição para a realização dos tamanhos das partículas exigidos é uma correspondente diminuição da tensão superficial das fases. Isto é possibilitado surpreendentemente por mistura de um componente emulsionante lipófilo com pelo menos um agente emulsionante que possui propriedades semi-hidrófilas, isto é, emulsionantes que possuem esta última propriedades são por exemplo: derivados de copolímeros em bloco do óxido de etileno-óxido de propileno com uma proporção maior de óxido de etileno, éter polietilenoglicol-hexadecílico, ésteres de ácido gordo de polioxietileno-sorbitano de cadeia curta, polietilenoglicóis ou ésteres de ácido gordo de sorbitano de cadeia curta. A concentração dos agentes emulsionantes monta em geral a 2-6 % Vol, de preferência 3,5-5,0 % Vol. Relativamente à finura e à distribuição apertada de granulometrias das gotículas do polímero são vantajosas as misturas de agentes emulsionantes tais que contêm pelo menos dois componentes lipófilos e um agente emulsionante semi-hidrófilo. A concentração do agente emulsionante semi-hidrófílo está em geral compreendida entre 15 e 30 % Vol., em relação à quantidade total de emulsionante. Os processos de acordo com a invenção possibilitam, juntamente com a finura das partículas também a preparação de partículas com a forma de pérolas, que são a condição para a obtenção de uma suspensão homogénea. Desta forma, possibilita-se a pipetagem exacta como é necessária nas análises/diagnósticos bioquímicos medicinais.

Juntamente com os agentes emulsionantes para a fase oleosa, ela possui também substâncias tensioactivas especiais que são solúveis na fase aquosa polimérica para melhorar a qualidade da suspensão sobretudo de soluções poliméricas com baixas massas moleculares (20 000-80 000). Além disso, verificou-se surpreendentemente que os coloides magnéticos adicionados sob a forma sólida só se conseguem dispersar de maneira fina por adição de emulsionantes iónicos. São exemplos de emulsionantes que podem ser utilizados também sob a forma de misturas binárias os seguintes: albumina de soro, gelatina, derivados de ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos, polietilenoglicóis, poli-N-vinilpirrolidona ou acetato-butirato de celulose. As quantidades dos agentes emulsionantes adicionados 10 ο ·

montam em geral a 0,01 - 2 % em peso, relativamente à fase polimérica, em que a concentração dos emulsionantes iónicos em geral fica compreendida entre 0,01 e 0,05 % em peso. As influências de parâmetros como velocidade de agitação assim como concentração e viscosidade das duas fases sobre os tamanhos das partículas, como se mostra na DE-OS 4127657, desempenham apenas um papel de segunda ordem no processo de acordo com a presente invenção provocado por causa das adições de emulsionante. Para a realização dos tamanhos das partículas necessários de 1-10 pm, são suficientes velocidades de agitação de 1500-2000 rotações/minuto, em que se utiliza um agitador de hélice de duas pás. A influência determinante dos agentes emulsionantes do presente processo sobre o tamanho das partículas é evidenciada pelo facto de que pela diminuição da velocidade de agitação de 2000 para 1300 rotações/minuto o tamanho das partículas tenha subido de 1-5 pm para 2-8 pm. Aumentando a velocidade de agitação de 2000 para 5000 rotações/minuto praticamente não se verificam alterações do tamanho das partículas. Em contrapartida, os tamanhos das partículas preparadas de acordo com o método mencionado antes com alteração análoga das velocidades de rotação variam entre 10 e 80 pm. Também a influência das viscosidades tanto da fase de suspensão como também da fase polimérica sobre as dimensões das partículas se verifica ser mínima no processo de acordo com a invenção em comparação com a influência dos agentes emulsionantes. Assim, os tamanhos das partículas de PVAL com a alteração da viscosidade da fase polimérica de 10 para 1000 mPa.s no processo de acordo com a presente invenção variam apenas entre 2 e 8 pm, no processo mencionado antes sob as mesmas condições pelo contrário variam entre 50 e 140 pm.

Como partículas magnéticas que são encapsuladas na matriz polimérica durante o processo de reticulação em suspensão podem ser utilizados fundamentalmente nos colóides ferromagnéticos ou superparamagnéticos que possuem um correspondente tamanho das partículas e em geral originam uma saturação magnética de 50-400 Gauss. Uma outra especificação que as partículas magnéticas têm de satisfazer, é a dispersabilidade na fase polimérica aquosa. Ao contrário do processo descrito na patente norte-americana 4 654 267 para a produção de partículas magnéticas, em cuja base está um processo de inchamento dispendioso com sais de ferro e subsequente oxidação com obtenção de colóides de magnetite, no presente processo, os colóides magnéticos são directamente dispersos na fase polimérica. Na suspensão subsequente na fase orgânica, os colóides magnéticos são então encerrados simultaneamente nas gotículas de polímero. Esta maneira de proceder constitui uma nítida simplificação técnica do processo em comparação com o processo mencionado antes, estando também associado com uma considerável economia de tempo para o processo de preparação. Enquanto para a preparação dos agentes referidos antes à base de poliestireno são necessários tempos de preparação de 10 a 30 horas, no processo de acordo com a presente invenção são necessários somente 5-30 minutos para a obtenção das partículas magnéticas de base.

Como colóides magnéticos interessam magnetites com tamanhos de partículas de 10-200 nm, não se limitando o processo de acordo com a invenção a esta classe de compostos. Estes produtos são, por exemplo obtidos no comércio sob a designação comercial de Bayferrox ou Ferrofluidice. Porque a fabricação desses colóides é objecto do estado actual da técnica, as partículas magnéticas podem também preparar-se de acordo com processos conhecidos, como por exemplo descritos por Shinkai et al., Biocatalysis, Vol. 5, 1991, 61, Reimers e Khalafalla, patente brasileira 1 439 031 ou Kondo et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 41, 1994, 99. As concentrações dos colóides na fase polimérica ficam geralmente compreendidas entre 4 e 14 % em vol., respectivamente calculadas em relação à fase polimérica, nos colóides que por razões de preparação já estão presentes como colóides aquosos e 0,3-2% em peso no caso das substâncias sólidas. Para a preparação os colóides magnéticos são directamente misturados com a fase polimérica. Para garantir uma distribuição finamente dispersa uniforme das partículas, é necessária uma pré-mistura durante um curto intervalo de tempo da dispersão aquosa por meio de um dispositivo de dispersão de elevado número de rotações (Ultra. Turrax) com subsequente tratamento por ultra-sons. A fase polimérica necessária para a preparação das partículas magnéticas consiste em geral em solução de PVAL com 2,5-10 % em peso. Como se sabe por meio de DE-OS 4127657 a porosidade das partículas de polímero determina-se fmalmente por meio da densidade de aglomeração que por seu lado é fixada pela massa molecular média do polímero e pela concentração. Massas moleculares crescentes e/ou concentrações do polímero decrescentes significam menores massas volúmicas de compactação e, por consequência, porosidade diminuída. Porque a pratibalidade de um processo de ensaio especialmente no quadro dos processos de diagnóstico ou analíticos de rotina também depende das substâncias absorvidas por quantidade de suporte, a porosidade como parâmetro para esse efeito um papel essencial na preparação de partículas magnéticas. Nos agentes de acordo com a presente invenção utilizam-se portanto preferivelmente concentrações de polímero de 2,5-5 % em peso e massa moleculares > 50 000. As partículas de polímero preparadas desta maneira possuem uma elevada a · j -7:- f porosidade e uma correspondentemente elevada capacidade de ligação não só em relação aos ligandos acoplados à matriz mas também aos ligados ou biomoléculas ligados aos ligandos. Um outro factor que influencia a porosidade e portanto também a funcionalidade das partículas magnéticas, é a escolha do agente reticulante assim como a sua concentração. Relativamente às elevadas capacidades de carga as concentrações do agente reticulante são escolhidas de modo que se garanta uma correspondente porosidade em ligação com suficiente estabilidade de forma. Como agentes reticulantes interessam principalmente todos os compostos bifuncionais solúveis em água que reagem com os grupos hidroxilo do PVAL como por exemplo aldeídos, cloretos de ácido com divinilsulfona. De preferência, utiliza--se glutaraldeído sob catálise ácida como agente de reticulação, porque esta substância já ao fim de poucos minutos reage com o polímero com a formação de partículas reticuladas sólidas. Nas substâncias usuais são necessários uma a duas horas de tempo de reticulação. A utilização de glutaraldeído proporciona além disso surpreendentemente a possibilidade de, mediante adição simultânea de uma diamina solúvel em água, por exemplo, etilenodiamina ou hexametilenodiamina, prolongar correspondentemente a unidade do agente reticulador do comprimento da cadeia de diamina e dessa forma aumentar a porosidade da matriz de polímero. As concentrações de agente reticulante, em relação à fase polimérica aquosa, estão geralmente compreendidas entre 0,2 e 1 % em vol. e para o glutaraldeído entre 2 e 7% em vol. O glutaraldeído é geralmente utilizado sob a forma de uma solução aquosa a 6-25%. Nas diaminas utilizam-se em geral entre 10 e 50% em moles, em relação à quantidade de glutaraldeído. Para a preparação das partículas magnéticas, em geral, utiliza-se em primeiro lugar uma quantidade em volume de 20-25 vezes de uma fase orgânica, de preferência óleo vegetal à venda no comércio, no qual seguidamente se suspende a mistura polímero-partículas magnéticas-colóide sob agitação. A adição do ácido no caso da reticulação com glutaraldeido é determinada pela estabilidade do colóide magnético. Muitos colóides magnéticos têm tendência, após adição do ácido, a aglomerar. Isto pode evitar-se surpreendentemente adicionando o ácido só durante ou no fim do processo de suspensão. Como os colóides magnéticos neste momento já estão distribuídos de maneira finamente dispersa na matriz do polímero, pode evitar-se completamente uma aglomeração. Nos coloides magnéticos estáveis ácidos o ácido pode também ser adicionado directamente à fase de polímero antes do processo de suspensão. A adição do agente de reticulação realiza-se respectivamente durante o processo de suspensão.

Além dos parâmetros até agora descritos que determinam o tamanho e a geometria das partículas pode surpreendentemente verificar-se que a concentração do ácido tem uma influência decisiva sobre a suspendibilidade das partículas magnéticas. Boa suspendibilidade significa que as partículas estão completamente isoladas umas das outras e? nas soluções aquosas, não se formam de maneira nenhuma aglomerados. Esta propriedade, que é o pressuposto para um longo tempo de permanência no estado suspenso, é obtida por concentrações de ácido de 15-50% em vol., relativamente à fase de polímero. Utiliza-se de preferência HC1 1-3 N. Os tempos de permanência da suspensão no caso das partículas de PVAL- são correspondentemente muito altos, ficam compreendidos entre 12 e 48 horas em comparação com 4 horas nas gotas de poliestireno da memória descritiva da patente norte-americana 4 654 267. Às partículas magnéticas assim obtidas, cujas vantagens especiais se baseiam nas propriedades aperfeiçoáveis e adaptáveis pelos diversos parâmetros do processo, como porosidade, granulometria, comportamento magnético e funcionalidade química, abre-se um grande número de utilizações que na sua totalidade não podem ser conseguidas com os suportes magnéticos até agora descritos. Com base na elevada funcionalidade química do polímero de base PVAL podem-se utilizar nos agentes de acordo com a presente invenção todos os processos de activação e acoplamento conhecidos nos meios de cromatografia de afinidade usuais. Exemplos desses agentes de activação são: BrCN, tolueno-4-sulfonato de 2--fluor-l-metil-piridínio, Ι,Γ-carbonil-di-imidazol, epicloro-hidrina, hexametilenodi--isocianato ou tetrafluorborato de l-ciano-4-dimetilamino-piridinio. Os correspondentes métodos de acoplamento para bioligandos com biomoléculas são descritos no actual estado da técnica e entre outros em Methods in Enzymology, Vol. 135, K. Mosbach Hrsg., 1987. Os processos de acoplamento referidos na patente norte-americana número 4 654 267 restringem-se à activação e acoplamento de grupos carboxilo.

Os grupos hidroxilo existentes no polímero de base de acordo com a presente invenção descrito na presente memória oferecem além disso surpreendentemente a possibilidade de enxertar monómeros vinílicos sobre a matriz de polímero. Por meio deste processo de enxerto podem-se inserir cadeias da molécula funcionais adicionais (moléculas espaçadoras). O acoplamento das biomoléculas nessas moléculas espaçadoras proporcionam geralmente a obtenção da estrutura natural, por consequência, a actividade biológica das biomoléculas acopladas. Em consequência de a biomolécula não ficar nunca em contacto directo com a superfície da matriz, são ligadas no interior da biomolécula possíveis alterações de conformações. O enxerto com monómeros de vinilo prevê-se que se faça sob acção 16

catalítica de sais de cério (IV), por exemplo, nitrato de cério (IV) - amónio ou de sulfato de cério (IV) - amónio que funcionam como iniciadores redox da polimerização por radicais. Os sais de cério (IV) são utilizados preferivelmente como soluções 0,03-0,1 molar em ácido sulfurico ou ácido nítrico 0,5 - I N. Como monómeros de vinilo podem ser utilizadas as substâncias que dispõem de grupos funcionais ou reactivos, por exemplo sob a forma de grupos HO-, HOCC-, NH2-, NCO-, CHO- ou oxirano. Relativamente aos pormenores do processo de enxerto em si conhecido é conhecido o processo descrito nas memórias descritivas publicadas das patentes DE-OS 2157902 e DE-OS 3811042. As matrizes de polímeros de acordo com a presente invenção antes mencionadas na presente descrição são diferentes relativamente à sua estrutura física e química, propriedades e utilização fimdamentalmente das matrizes de enxerto citadas antes. Uma outra diferença em relação aos processos de enxerto previamente descritos consiste no facto de nos agentes de acordo com a presente invenção não se ter de trabalhar com a exclusão de oxigénio mas ser suficiente a presença de um dissolvente orgânico não miscível com água como por exemplo hexano, heptano, ciclo-hexano ou éter de petróleo, para realizar bons rendimentos de enxerto. Os tempos de enxerto podem-se além disso diminuir até 90% em relação aos processos antes referidos. As quantidades dos monómeros de vinilo utilizados afastam-se entre 10 e 50% em vol., relativamente às suspensão de partículas magnéticas.

Em virtude das inúmeras possibilidades de modificação e de activação das partículas magnéticas de PVAL pode acoplar-se num número praticamente ilimitado de biomoléculas à matriz. Obtêm-se tantas possibilidades de utilização diferentes que são suficientes para o diagnóstico médico até à analítica biológica molecular.

Uma utilização importante dentro dos conhecimentos da biologia é constituída pelas separações de acordo com o princípio da afinidade. A utilização da técnica de coluna normalmente utilizada para este fim no entanto fica ligada com grandes despesas experimentais de modo que sobretudo para pequenas separações da rotina são alternativas praticamente sem valor. Os meios de acordo com a invenção proporcionam essas alternativas porque necessita um segundo tempo e experimental que é uma fracção em relação às técnicas correntes. Como ligandos podem-se acoplar fimdamentalmente todos os ligandos utilizados na cromatografia de afinidade hoje em dia. São exemplos que também abrem perspectivas interessantes do ponto de vista prático os seguintes: proteína A, proteína G, heparina, anticorpos, albumina de soro, gelatina, lisina, concavalma A, oligossacáridos, oligonucleótidos ou enzimas. As separações especiais que se podem realizar com essas matrizes de afinidade são gerais no estado da técnica. Relativamente aos pormenores destes processos em si conhecidos referem-se as indicações referidas em J. of Chromatography, Vol. 510, 1990. Além da simplificação experimental, a vantagem especial da tecnologia de partículas magnéticas no entanto baseia-se num nítido encurtamento dos tempos de separação. Isto baseia-se no facto de a suspensão de partículas magnéticas representarem uma fase quase-homogénea que possibilita uma cinética de reacção análoga a uma solução homogénea. Desta maneira, podem-se realizar separações sem grandes dificuldades dentro de 2-5 minutos de acordo com o tamanho da amostra.

Um outro campo interessante que pode ser coberto com a tecnologia das partículas magnéticas é o domínio do diagnóstico, em especial, o domínio do ensaio de imunidade. O principio de base consiste em determinar quantitativamente substâncias específicas. A qualidade da substância detectada é indicada imediatamente ao isolamento específico da referida substância acoplada, quer seja por meio de um processo cromatográfico com por ligação a um sólido polimérico. Na prática, realiza-se esta ligação específica em geral sobre uma anticorpo imobilizado, que é realizado fotometricamente ou nefelometricamente. Os meios de PVAL novos desenvolvidos proporcionam então uma base excelente para serem utilizados para ensaios de imunidade. Para isso, são ligados quimicamente anticorpos de acordo com a maneira e o tipo conhecidos para os antigenes relevantes para a diagnose às partículas magnéticas. São exemplos desses anticorpos: anti-insulina, antitiroxina, anticorpos contra a hormona de estimulação da tiróide (TSH), anticorpos contra a globulina que liga a tiróide, anticortisona, antiferritina, antigonadotropina coriónica, antigene anticarcinogénio-embrional (CEA), antiprogesterona, antitestosterona, antiestradiol, antiprolactina, anti-hormona de crescimento humana, antidigoxina, antimicroglobulina-p2, antimacroglobulina-a2, antivitamina BI2, antifactor VIII ou anti-AFP. Os tempos de incubação das partículas magnéticas acopladas com anticorpos com as misturas de substâncias estão em geral compreendidos entre 2-5 minutos. Depois da separação magnética, detectam-se quantitativamente os complexos anticorpo-antigene fotometricamente com o auxilio dos métodos de análise conhecidos. Por utilização da tecnologia das partículas magnéticas consegue-se encurtar os tempos de incubação de um factor 1 ΟΙ 00 em relação à técnica usual de placas de microtitulação ou de separação em coluna como se descreve na DE-OS 4126436. Além dos anticorpos, podem-se também acoplar outras substâncias às partículas magnéticas e utilizar para a detecção de determinadas substâncias. Uma dessas substâncias é o ácido 3- 19

-aminofenilborónico, que se utiliza para a detecção do açúcar no sangue acoplado com a matriz de PVAL. Para a imobilização do ligando de uma primeira fase activa--se o suporte de PVAL com dioxianatos. Em seguida, realiza-se a reacção com o ligando. Para a reacção utilizam-se em geral 15-30 mg de ácido 3--aminofenilborónico por 100 mg de fase magnética. À análise do teor de açúcar no sangue realiza-se por meio da hemoglobina glicada existente no sangue que se liga especificamente aos ligandos de ácido borónico. Por subsequente eluição da fracção delicada ligada a partir da matriz analisa-se esta quantitativamente por meio de métodos fotométricos. A vantagem especial em relação ao processo de ensaio anterior é menor despesa de mão de obra técnica. O método pode portanto ser especialmente utilizado para as análises do tipo de rotina.

As análises moleculares biológicas em relação com novas considerações terapêuticas e de diagnóstico constituem um outro campo de utilização para as partículas magnéticas de PVAL.

Em muitos processos analíticas pertencentes ao campo da biologia molecular utiliza-se a elevada actividade entre estreptavinida/avidina e biotina. Por acoplamento de estreptavidina ou de avidina à fase sólida polimérica podem-se isolar biomoléculas biotiniladas de todos os tipos como por exemplo fragmentos de DNA, oligonucleótidos, proteínas, anticorpos ou antigenes. A utilização da matriz de PVAL proporciona nesta caso por causa da técnica de acoplamento simples em ligação com a elevada capacidade de suspensão a possibilidade de realizar essas separações de maneira simples. Domínios de utilização práticos, em que a técnica das esferas magnéticas pode ser utilizada preferivelmente, são por exemplo: sequenciamento de DNA-fases sólidas, síntese de DNA ou reacção de cadeias de polimerase (PCR). As partículas magnéticas de PVAL proporcionam ainda a realização do acoplamento de anticorpos, que são dirigidos a determinados marcadores de células, por exemplo anti-CD4, anti-CD15, anti-CD35, anti-CD8, separações e marcação de células (etiquetagem) de células. Relativamente aos pormenores, eles são descritos na literatura conhecida: Haukanes und Kram, Biotechnology, Vol. 11, 1993, 60. A invenção é descrita mais pormenorizadamente nos seguintes exemplos.

Exemplo 1

Prepara-se um colóide de magnetite analogamente às prescrições de Kondo et al., Appl. Microbiol Biotechnologie, Vol. 41, 1994, 99-105. Dispersam-se 10 ml do colóide numa mistura que consiste em 80 ml de solução a 10% de PVAL (massa molecular média 48 000), 5 ml de solução a 2,5% de polivinilpirrolidona, 20 ml de HC1 2 N e 0,4 ml de dodecilsulfato de Na a 3,5%. Depois de tratar durante 1 minuto em banho de ultra-sons (100 W) suspende-se a mistura a 20°C em 2 litros de um óleo vegetal tal que contém 2% de Pluronic 6100, 0,8% de Pluronic 6200, 0,4% de Dehymuls FCE e de 0,6% de Dehymuls HRE 7. A velocidade de agitação monta a 2000 rotações/minuto. Depois de 10 segundos, adicionam-se 6,4 ml de solução de glutaraldeído a 12%. Agita-se ainda durante 20 segundos. Em seguida, centrifuga-se a suspensão a 5000 x g durante 30 segundos e decanta-se a fase oleosa. Lava-se a suspensão assim obtida uma vez com cerca de 300 ml de n-hexano e com 300 ml de metiletilcetona. A suspensão magnética obtida é dispersa em cerca de 400 ml de água/metanol 1:1 (v/v) e centriíuga-se de novo. Em seguida efectuam-se 10 lavagens da fracção magnética por dispersão em cerca de 400 ml de água com 21 -ο respectivamente operações de centrifugação intermédias. Obtém-se partículas magnéticas com uma distribuição de tamanhos de 2-4 pm e um teor de ferro de 7 %: (Todas as indicações de % neste exemplo e nos exemplos seguintes são % em volume sempre que se trate de uma substância líquida e em % em peso sempre que se trate de uma substância sólida).

Exemplo 2

Dispersam-se 5 ml de colóide magnético de acordo com o Exemplo 1 em 40 ml de fase de PVAL de acordo com o Exemplo 1 e, em seguida, dissolvem-se em 880 ml de óleo de origem vegetal à venda no comércio, em que se dissolvem 1,5 % de Pluronic 8100, 0,4 % de Pluronic 6200 e 0,4 % de Dehymuls FCE, suspende-se sobre agitação (velocidade de agitação 2000 rotações/mmuto). Imediatamente adicionam-se 4% de solução de glutaraldeído a 25%, agita-se a suspensão durante mais 10 segundos. Depois de 10 minutos, centrifuga-se a suspensão e lava-se de acordo com o Exemplo 1 com metanol/água, n-hexano e metiletilcetona. Produzem--se partículas magnéticas com um tamanho de 1-3 pm. A proporção de óxido de ferro monta a 7,3 %.

Exemplo 3

Dispersam-se 4 ml de Ferrofluidics EMG 807 em 100 ml de solução de PVAL a 5% (massa molecular média 224 000). Trata-se a dispersão durante 5 minutos em banho de ultra-sons e em seguida suspende-se em 2300 ml de óleo de origem vegetal, que contém 2 % de Ariacel 83, 0,8 % de Tween 85 e 0,4 % de Dehymuls FCE, sob agitação (velocidade de agitação 1800 rotações/minuto). Depois de 5 segundos, adicionam-se 25 ml de HC1 2.5 N e, depois de mais 5 segundos, 7 ml de solução de glutaraldeído a 12%. Agita-se ainda durante mais 10 segundos.

Centrifiiga-se a suspensão depois de 10 minutos, como se descreveu no Exemplo 1 e lava-se. Obtêm-se partículas magnéticas com uma granulometria de 2-5 pm e um teor de óxido de ferro de 24,6%.

Exemplo 4

Misturam-se 180 mg de pigmento de óxido de ferro PR 5044 N em 20 ml de solução de PVAL a 7% (massa molecular média 88 000), que contem 0,01% de ácido poliestirenossulfónico e 0,05% de polietilenoglicol 1000 e dispersa-se com o dispositivo de dispersão (Ultra-Turrax) a 20 000 rotações/minuto. Segue-se um tratamento durante 2 minutos duas vezes em banho de ultra-sons. A mistura é em seguida dispersada sob agitação (velocidade de agitação 2000) em 460 ml de óleo de origem vegetal, que contém 1,9% de Arlacel 83, 0,4% de Tween 20, 0,3% de Dehymuls FCE e 1% de Dehymuls HRE 7. Depois de 10 segundos, adiciona-se 0,8 ml de solução de glutaraldeído a 25% e, depois de mais 5 segundos, 8 ml de HC1 1 N. Agita-se a suspensão durante ainda mais 10 segundos. Depois de 10 minutos, realiza-se o isolamento e o processamento da fracção de acordo com o Exemplo 1. Precipitam partículas magnéticas com uma distribuição de granulometria de 2-4 pm e um teor de óxido de ferro de 12,3%.

Exemplo 5

Dispersam-se 50 mg de Bayferrox 318 M em 10 ml de uma mistura que consiste em 5% de PVAL (massa molecular média 224 000), 0,01 % de dodecilsulfato de Na e 0,1 % de polietilenoglicol 1000 por meio de um UltraTurrax (20 000 rotações/minuto). Em seguida, suspende-se sob agitação a fase polimérica em 250 ml de óleo de origem vegetal, que contém 2,2 % de Span 80, 0,4 % de Dehymuls FCE e 0,4 % de Pluronic 6200, sob agitação (velocidade de agitação 1800). Depois de 5 segundos, adicionam-se 10 ml de HC1 1 N e, depois de mais 10 segundos, 0,6 ml de solução de glutaraldeído a 25 %. Agita-se durante 10 segundos e centrifuga-se a suspensão depois de 5 minutos. Lava-se a fracção assim obtida de acordo com o Exemplo 1. Formam-se partículas magnéticas com uma distribuição de granulometria de 3-6 pm, cujo teor de ferro monta a 10,2 %.

Exemplo 6

Numa mistura que consiste em 50 ml de solução de PVAL a 4 % (massa molecular média 103 000), na qual são dissolvidos 0,1 % de albumina de soro de vitelo e 0,5 % de politetilnoglicol 1000, dispersam-se 6,4 ml de coloide magnético de acordo com o Exemplo 1. Trata-se a dispersão durante 5 mmutos em banho de ultra-sons e, em seguida, suspende-se em 1100 ml de óleo de origem vegetal que contém 1,8 % de Span 85, 0,8 % de Synperonic PI 61, 0,8 % de Tetronic 901 e 0,4 % de Dehymuls FCE (velocidade de agitação 2000). Depois de 10 segundos, adicionam-se 4 ml de solução a 12 % de glutaraldeído e depois de mais 5 segundos 12,5 ml de HC1 2,5 N. A suspensão é ainda agitada durante mais 10 segundos. Depois de 15 minutos realiza-se a centrifugação e o processamento posterior de acordo com o Exemplo 1. Obtêm-se partículas magnéticas com uma distribuição de granulometria de 1 -3 pm e um teor de óxido de ferro 8,3 %.

Exemplo 7

Misturam-se 100 ml de solução de PVAL a 3,5 % (massa molecular média 224 000), que contém 20 % de HC1 3 N, com 13 ml de Ferrofluidics EMG 507 e trata-se em banho de ultra-sons durante 0,5 minutos. Suspende-se imediatamente a fase de magnetite-polímero em 2,3 litros de óleo de origem vegetal, que contém 1,8 % de Pluronic 6100, 0,2 % de Pluronic 6200, 0,2 % de Hypermer A60 e 1,8 % de 24 ? y > . s y “

Dehymuls HRE 7 (velocidade de agitação 2000). Depois de 10 segundos, adicionam-se 8 ml de solução de glutaraldeído a 12 % e agita-se durante mais 15 segundos. Depois de 10 minutos, centrifuga-se a suspensão e lava-se de acordo com o Exemplo 1. As partículas obtidas têm uma distribuição da granulometria de 1-2 pm e possuem um teor de óxido de ferro de 14,2 %.

Exemplo 8

Misturam-se 100 ml de solução de PVAL a 7,5 % (massa molecular média 88 000), em que se dissolvem 0,05 % de gelatina, com 12,5 ml de Ferrofluidics EMG 707 e trata-se em banho de ultra-sons durante 3 minutos. Em seguida suspende-se a mistura em 2,5 litros de óleo de origem vegetal, que contém 1 % de Arlacel 83, de Pluronic 6100 e 0,2 % de Brij 52 e 0,4 % de Tween 60 sob agitação (velocidade de agitação 2000). Depois de 10 segundos, adicionam-se 4 ml de solução de glutaraldeído a 12 % e, depois de mais de 5 segundos, 26,5 ml de HC1 1 N. Agita-se a suspensão durante ainda mais 15 segundos. Depois de 15 minutos, centrifuga-se a suspensão e lava-se de acordo com o Exemplo 1. Precipitam partículas magnéticas com uma distribuição da granulometria de 2-4 μτη e um teor de óxido de ferro de 26,0 %.

Exemplo 9

Agitam-se a pH 9,5 10 ml de solução de PVAL a 7,5 % (massa molecular média 103 000) com NaOH 0,5 N e adicionam-se com pipeta 75 μΐ de divinilsulfona. Na fase aquosa dispersam-se imediatamente 1,2 ml de colóide magnético de acordo com o Exemplo 1. Depois de tratamento durante 3 minutos em banho de ultra-sons suspende-se a mistura em 220 ml de óleo vegetal em que estão dissolvidos 2 % de Span 60, 0,4 % de Tween 80 e 0.4 % de Dehymuls FCE. sob 25

agitação (velocidade de agitação 2000). Agita-se durante mais 30 segundos. Em seguida, deixa-se repousar a suspensão durante 60 minutos à temperatura ambiente e em seguida processa-se de acordo com o Exemplo 1. Obtêm-se partículas com uma distribuição da granulometria de 4-8 μπι. O teor de óxido de ferro monta a 7,7 %.

Exemplo 10

Misturam-se 100 ml de solução de PVAL a 3,5 % (massa molecular média 224 000), em que são dissolvidos 40 % de HC1 1 N e 0,015 % de dodecilsulfato de Na, com 5 ml de Ferrofluidics EMG 507 e trata-se em banho de ultra-sons durante 1 minutos. Suspende-se a fase polimérica em 2,3 litros de óleo de origem vegetal, em que são dissolvidos 1 % de Arlacel 83, 1 % de Pluronic 6100, 0,8 % de Tween 80 e 2 % de Dehymuls HRE (velocidade de agitação 2000) durante 10 segundos. Depois 10 segundos, adicionam-se 6 ml de solução de glutaraldeído a 25 %; agita-se durante mais 10 segundos. Depois de 10 minutos, centrifuga-se a suspensão e lava-se de acordo com o Exemplo 1. Formam-se partículas magnéticas com uma distribuição de granulometrias de 2-4 μπι que possuem um teor de óxido de ferro de 24 %.

Exemplo 11

Dispersam-se 14,5 ml de colóide de magnetite de acordo com o Exemplo 1 em 100 ml de fase polimérica que contém 4 % de PVAL (massa molecular média 224 000) e 0,1 % de albumina de soro de vitela e trata-se durante 1 minuto em banho de ultra-sons. Em seguida, suspende-se a dispersão primeiramente durante 15 segundos em 2,5 litros de óleo vegetal em que estão dissolvidos 3,8 % de Pluronic 3100, 0,8 % de Pluronic 6200 e 1,5 % de Tetronic 304, sob agitação (velocidade de agitação 2000). Adicionam-se 7,5 ml de solução de glutaraldeído e, depois de outros 10 segundos, 25 ml de HC1 3 N; continua-se a agitar durante mais 10 26 és {/ segundos. Depois de 10 minutos processa-se a suspensão de acordo com o Exemplo 1. Obtêm-se partículas magnéticas com uma distribuição de granulometria de 1-2 pm e um teor de óxido de ferro de 9,6 %.

Exemplo 12

Em 1200 ml de óleo vegetal, que contém 2,2 % de Arlacel 80, 0,8 % de Span 85 e 0,8 % de Triton CF 10, suspendem-se 50 ml de fase polimérica que consiste em 5 % de PVAL (massa molecular média 224 000), 0,5 % de polietilenoglicol 3350 e 12 % de Ferrofluidics EMG 707 sob agitação (velocidade de agitação 1800) durante 10 segundos. Segue-se em intervalos de 5 segundos a adição de 4 ml de solução Suspende-se imediatamente a fase de magnetite-polímero em 2,3 litros de óleo de glutaraldeído a 25 % e 25 ml de HC1 1 N. Prossegue-se a agitação durante mais 15 segundos. Depois de 10 minutos, centnfuga-se a suspensão e lava-se de acordo com o Exemplo 1. Obtêm-se partículas magnéticas que possuem uma distribuição de granulometrias de 1-2 pm e possuem um teor de óxido de ferro de 18,3 %.

Exemplo 13

Em 100 ml de solução de PVAL a 5 % (massa molecular média 203 000), em que se dissolvem 0,05 % de ácido poliestirenossulfónico e 0,1 % de polivinilpirrolidona, dispersam-se 12 ml de colóide de magnetite de acordo com o Exemplo 1 e tratam-se num banho de ultra-sons durante 2 minutos. Segue-se a suspensão em 2,2 litros de óleo de origem vegetal, cuja composição é análoga ao Exemplo 12. Depois de 10 segundos, com intervalos de 10 segundos, adicionam-se 8 ml de solução de ácido glutárico a 12 % e 10 ml de HC1 2,5 N. Depois de correspondente processamento analogamente ao Exemplo 1 obtêm-se partículas magnéticas com o tamanho de 2-4 |im e com um teor de óxido de ferro igual a 7,5 %.

Exemplo 14

Dispersam-se 6,5 ml de Ferrofluidics EMG 807 em 100 ml de fase polimérica que consiste em 10 % de PVAL (massa molecular média 88 000), 0,05 % de acetato-butirato de celulose e 0,1 % de polivmilpirrolidona e submete-se à acção de um banho de ultra-sons durante 3 minutos. Em seguida, suspende-se a dispersão em 2300 ml de óleo de origem vegetal, que contém 1,8 % de Synperonic L61, 0,2 % de Tetronic 1101 e 1 % de Dehymuls FCE, sob agitação (velocidade de agitação 2000 rotações/minuto). Depois de 10 segundos, com intervalo de 10 segundos, adicionam-se 8 ml de solução de glutaraldeído a 12 % que contém 20 % em moles de etilenodiamina e 23 ml de HC1 2,5 N. Agita-se durante mais 10 segundos e processa-se a suspensão depois de 10 minutos de maneira análoga ao Exemplo 1. Obtêm-se partículas magnéticas com uma distribuição de granulometria de 1 -3 um e um teor de óxido de ferro de 10,4 %.

Exemplo 15

Suspendem-se em 100 ml de água 300 mg das partículas poliméricas preparadas de acordo com o Exemplo 1, mistura-se com 10 ml de NaOH 3,5 M e 15 ml de epicloro-hidrina e faz-se reagir durante 2 horas a 55°C sob intensa agitação. Em seguida, separam-se as partículas magnéticas por meio de um íman de neodimio-ferro-boro. Suspende-se o produto em cerca de 10 ml de água e separa-se mais uma vez magneticamente. Este processo de lavagem/separação repete-se 10 vezes, seguidos por uma lavagem com acetona. Fazem-se reagir 30 mg das partículas magnéticas assim activadas imediatamente com 2 ml de tampão de borato 28

0,1 Μ, ρΗ 11,4, que contém 10 % de hexametilenodiamina, a 50°C durante 2 horas. Depois lava-se 10 vezes com água. O produto obtido é em seguida dissolvido com 2 ml de tampão de fosfato de K 0,1 M, de pH 7,0, em que se dissolve 12,5 % de aldeído glutárico, faz-se reagir durante 2 horas a 30°C. Em seguida depois de um intervalo de tempo de 30 minutos lava-se 10 vezes com água e, em seguida, duas vezes com tampão de fosfato de K 0,1 M de pH 7,5. Por adição de 1 ml de tampão de fosfato de K 0,1 M, de pH 7,5, em que se dissolvem 0,3 mg de estreptavidina, ligam-se depois de incubação durante 12 horas a 4°C 0,11 mg de estreptavidina à matriz. À matriz deixam-se ligar fragmentos de DNA biotinilados de acordo com métodos conhecidos, que são utilizados para o sequenciamenteo de DNA.

Exemplo 16

Fazem-se reagir durante 24 horas a 4°C 30 mg das partículas magnéticas activadas com epicloro-hidrina/hexametilenodiamina/aldeído glutárico obtidas de acordo com o Exemplo 15 com 2 ml de tampão de fosfato de K 0,1 M, pH 7,5, em que se dissolve 0,3 mg de anticorpos anti-insulína. Lígam-se 0,28 mg de anticorpos.

Exemplo 17

Tratam-se 60 mg de partículas magnéticas de acordo com o Exemplo 3 por sucessiva adição de misturas de acetona/água 1:3,1:1,3:1 (v/v) e no fim desidratam--se com acetona absoluta. Em seguida dispersa-se a suspensão em 2 ml de sulfóxido de dimetilo absoluto que contém 0,1% de octoato de estanho e activa-se por adição de 0,5 ml de hexametilenodi-isocianato durante 30 minutos a 45°C. Em seguida, lava-se 5 vezes alternadamente com alguns ml de sulfóxido de dimetilo e de acetona. Fazem-se reagir 30 mg da fracção activada com l ml de sulfóxido de dimetilo absoluto em que são dissolvidos 20 % de polietilenoglicol 400 e 0,05 % de DABCO, 29 - f7

'S

durante 4 horas a 30°C. Lava-se uma vez com sulfóxido de dimetilo e 5 vezes com água e desidrata-se a fracção com as misturas mencionadas antes de acetona/água. Faz-se reagir imediatamente a fracção acoplada a polietileno com 1 ml de sulfóxido de dimetilo em que se dissolve 6 mmoles de 4-dimetilamino-piridina e 5 mmoles de toluenossulfonato de 2-fluormetil-pirimidínio, durante 45 minutos à temperatura ambiente. Segue-se a lavagem 5 vezes alternada com sulfóxido de dimetilo e acetona. O produto activo é em seguida acoplado a 4°C por incubação com uma solução de anticorpos antitiroxina (0,25 mg de anticorpos/ml de tampão de fosfato de K 0,05 M, pH 7,5). Faz-se acoplar 0,23 pg de anticorpos. Depois da lavagem por várias vezes com o tampão de acoplamento, desactivam-se os restantes grupos activos por incubação durante 4 horas com 2 mmoles de mercaptoetanol que contém tampão de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5. Em seguida, lavam-se as partículas magnéticas com tampão PBS, pH 7,2. As partículas magnéticas acopladas são utilizadas para a determinação da tiroxina de acordo com os processos conhecidos.

Exemplo 18

Misturam-se 30 mg da fracção activada por meio de hexametilenodi--ísocianato de acordo com o Exemplo 17 com 2 ml de solução 0,3 de KOH/MeOH 1:1 (v/v). Depois da reacção durante 5 horas à temperatura ambiente lava-se várias vezes com água. A fracção que contém os grupos amino é em seguida activada com glutaraldeído de acordo com o Exemplo 15. Segue-se a lavagem várias vezes com água durante um intervalo de tempo de 30 minutos. Por incubação durante 20 horas a 4°C com 1 ml de tampão de fosfato de K 0,1 M, pH 7,5, em que se dissolvem 0,35 mg de IgG anti-rato, liga-se 0,28 mg de IgG. O produto acoplado é utilizado para a separação de células de acordo com os processos conhecidos. 30

Exemplo 19

Misturam-se 30 mg de partículas magnéticas de acordo com o Exemplo 10 a 0°C com 4 ml de água, em que se dissolvem 100 mg de BrCN. Por adição de NaOH 2 N, regula-se o pH para 11,5. Termina-se a reacção depois de 5 minutos por separação magnética da fracção magnética. Segue-se a lavagem 4 vezes com água gelada. Em seguida, lava-se uma vez com HC1 0,01 N e tampão de bicarbonato 0,1 M, pH 8:2. Incuba-se 1 ml de tampão de bicarbonato 0,1 M, pH 8,2, em que se dissolve 0,2 mg de anticorpos anti-CD4 com as esferas magnéticas activadas durante 12 horas a 4°C. Lava-se. várias vezes com tampão PBS, pH 7,2, que contém NaCl 0,5 M e 0,1 % de Triton XI00. Obtém-se um suporte a que estão ligados 0,18 mg de anticorpos. Os suportes assim obtidos são utilizados para isolar células T--auxiliadoras.

Exemplo 20

Activam-se 30 mg de partículas magnéticas de acordo com o Exemplo 5 com BrCN procedendo de maneira análoga ao Exemplo 19. Realiza-se o acoplamento de heparina (massa molecular 6000) por incubação durante 12 horas de 1 ml de tampão de bicarbonato, pH 8,2, que contém 0,5 mg de heparina dissolvida. Em seguida, incuba-se durante 2 horas à temperatura ambiente com solução de etanolamina 0,1 M, pH 8,0, e em seguida lava-se 4 vezes com tampão de acetato 0,1 M. Utiliza-se a fracção assim obtida de acordo com o processo conhecido para a separação de antitrombina III.

Exemplo 21

Desidratam-se 30 mg de partículas magnéticas de acordo com o Exemplo 4 por adição sucessiva de misturas de acetona/água, como se descreveu antes. Incuba- -se cada vez lml de sulfóxido de dimetilo em que se dissolvem 6 mmoles de 4--dimetilamino-piridina e 5 mmoles de toluenossulfonato de 2-fluor-metil-piridinio, com as esferas magnéticas durante 45 minutos à temperatura ambiente. Em seguida lava-se 5 vezes alternadamente com acetona e sulfóxido de dimetilo assim como uma vez com tampão de fosfato de K 0,05 M, pH 7,5. Em seguida adiciona-se 1 ml de tampão de fosfato de K 0,05 M, pH 7,5, que contém 0,3 mg de Proteína A. O acoplamento realiza-se durante o intervalo de tempo de 12 h à temperatura ambiente. Seguem-se várias lavagens com tampão de PBS, em que se dissolvem 0,5 % de NaCl e 0,1 % de Triton XI00. Ligam-se 0,27 mg de proteína. A fracção das partículas magnéticas é utilizada para a separação de subclasses de IgG de maneira análoga aos processos conhecidos.

Exemplo 22

Lavam-se uma vez 30 mg de partículas magnéticas de acordo com o Exemplo 12 com 2 ml de tampão de carbonato 0,5 M, pH 11. A activação subsequente realiza-se com 100 μΐ de divinilsulfona sob adição de 1 ml de tampão de lavagem durante o intervalo de tempo de 70 minutos à temperatura ambiente. Segue-se a lavagem várias vezes com água durante um intervalo de tempo de 30 minutos. Incuba-se 1 ml de carbonato de pH 10, que contém 10% de lactose durante 20 h à temperatura ambiente com a fracção das esferas magnéticas. Ligam-se 0,68 mg de lactose. O suporte é utilizado para a purificação de lectinas de extractos de mistel de acordo com o processo conhecido.

Exemplo 23

Fazem-se reagir 30 mg de partículas magnéticas de acordo com o Exemplo 7, que foram activadas com epicloro-hidrina de maneira análoga ao Exemplo 15 32

durante 16 horas à temperatura ambiente com di-hidrazida do ácido adípico 0,3 M em tampão de carbonato 0,2 M, pH 9, para se obter o derivado de hidrazida. Lava-se várias vezes com tampão de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5. Os restantes grupos oxirano são desactivados por incubação durante 4 horas com solução de tampão de lavagem que contém solução 0,3 M de mercaptoetanol. Lava-se seguidamente com 3 ml de tampão de acetato de Na 0,1 M, pH 5,5. Incuba-se 1 ml de tampão de lavagem em que são dissolvidos 0,3 mg de anti-HGH e 10 mmoles de m-periodato de Na, sob exclusão de luz durante 40 minutos a 4°C. Segue-se uma lavagem repetida 5 vezes com tampão de acetato e lavagem 2 vezes com tampão de PBS. Ligam-se 0,21 mg de anticorpos. O suporte acoplado é utilizado para a determinação de HGH.

Exemplo 24

Suspendem-se-se 30 mg de partículas magnéticas de acordo com o Exemplo 9 em água e separam-se por íman manual. A fracção separada é incubada durante 15 minutos à temperatura ambiente em 0,5 ml de ácido nítrico 0,1 M, que contém nitrato de cério (IV)-amónio 0,1 M. Em seguida, as partículas magnéticas são separadas magneticamente e lavadas uma vez com água. A fracção é imediatamente feita reagir por adição de 0,5 ml de ácido acrílico e 0,5 ml de n-hexano durante 15 minutos a 50°C. Lava-se 10 vezes com água durante um intervalo de tempo de 30 minutos. O rendimento de enxertamento monta a 85%. A fracção enxertada é activada durante 30 minutos à temperatura ambiente com 1 ml de tampão MOPS (ácido 3-morfolino-propanossulfónico) 0,1 M, pH 7,5, que contém p--toluenossulfonato de N’-ciclo-hexilo-N’-(2-morfolinoetil)-carbodiimida-metilo. Lava-se seguidamente 5 vezes com água gelada e adiciona-se 0,3 mg de anticorpos anti-LDL dissolvidos em 1 ml de tampão MOPS, pH 7,5. Duração da reacção 24 h a 1.

y: 33 /?

D 4°C. Em seguida, desactiva-se o suporte por incubação durante 4 horas com 5 ml de etanolamina 5 mM/tampão de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5. Ligam-se 0,25 mg de anticorpos. A matriz acoplada é utilizada para a eliminação de LDL (lipoprotreína de pequena densidade) a partir de líquidos biológicos.

Exemplo 25

Enxertam-se com ácido acrílico 30 mg de partículas magnéticas de acordo com o Exemplo 3 de maneira análoga ao Exemplo 24. Substituem-se 100 pg de Oligo (dT)20 na extremidade 5’ por etilenodiamina correspondentemente às prescrições mencionadas em DNA, Vol. 4, 1988, 327. O oligonucleótido modificado com NH2 é dissolvido em lml de tampão de imidazol 0,1 M, pH 7,0 e incubado com a fracção de partículas magnéticas durante 20 horas à temperatura ambiente. Em seguida, lava-se várias com tampão de imidazol que contém 0,1 % de Triton XI00. Ligam-se 38 pg de oligonucleótido. As partículas magnéticas obtidas são utilizadas para o isolamento de mRNA de acordo com os processos conhecidos.

Exemplo 26

Desidratam-se 100 mg de partículas magnéticas de acordo com o Exemplo 9 primeiramente com auxílio das misturas de acetona/água de acordo com a prescrição referida antes. Segue-se a activação por meio de hexametilenodi-isocianato de acordo com o Exemplo 17. Incubam-se 2 ml de sulfóxido de dimetilo em que se dissolve 0,1% de octoato de estanho e 30 mg de áxido m-amino-fenil-borónico, com as partículas activadas durante 6 h a 30°C. Em seguida lava-se com água. As partículas magnéticas acopladas com ácidos borónico são utilizadas para a determinação da hemoglubina delicada no sangue de acordo com os processos conhecidos. s 34

Exemplo 27

Misturam-se 30 mg de partículas magnéticas que correspondem ao Exemplo 14, com 2 ml de água, em que se dissolveram 50 mg de Azul de Cibracon F3G-A e aquece-se a 60°C durante 30 minutos. Em seguida adiciona-se 1 ml de solução de NaCl a 25% e aquece-se a 75°C durante uma outra hora. Depois da adição de 1 ml de solução de carbonato de Na a 10% aquece-se a 70°C durante 2 horas. Segue-se a lavagem múltipla com água. A matriz obtida é utilizada para a separação de álcool--desidrogenase de acordo com os processos conhecidos.

Lisboa, 16 de Maio de 2001 -7 O Agente Oficld do Propriedade Industrial

JOSÉ DE SAMPAIO Λ.Ο.Ρ. 1. Ru:·, do Soliir-.’, 195,

Claims

0 *Ν 1 1

Reivindicações 1. Processo para a preparação de partículas de PVAL com a forma de pérolas ou de esferas, caracterizado pelo facto de se suspender sob agitação uma solução de PVAL, na qual se dispersa um colóide magnético, à temperatura ambiente numa fase orgânica não miscível com a fase polimérica, que contém pelo menos dois agentes emulsionantes, e durante o processo de suspensão se reticular por adição de um agente que reage com grupos hidroxilo solúveis em água.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fase orgânica se dissolver 2-6% em volume de mistura emulsionante que consiste em pelo menos dois componentes diferentes, dos quais pelo menos um componente é parcialmente solúvel em água.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de na fase polimérica serem dissolvidos 0,01-2% em peso de um ou mais agentes emulsionantes.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de os agentes emulsionantes serem proteínas, derivados de celulose, derivados de ácido sulfónico, polivinilpirrolidona ou polietilenoglicóis ou suas misturas.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a solução de polímero conter 2,5-12,5% em peso de PVAL.
6. Processo de acordo com as reivindicações 1-5, caracterizado pelo facto de à fase polimérica se misturar um colóide magnético com a forma de substâncias ferromagnéticas ou superparamagnéticas. 2 2

✓Λ'
7. Processo de acordo com as reivindicações 1-6, caracterizado pelo facto de se adicionar 2-7% em volume de solução de agente de reticulação, calculado em relação à fase polimérica
8. Processo de acordo com as reivindicações 1-7, caracterizado pelo facto de o agente reticulante ser inserido sob adição de diaminas solúveis em água.
9. Processo de acordo com as reivindicações 1-7, caracterizado pelo facto de a reticulação se realizar com dialdeídos sob adição de 20-50% em volume de ácido, calculado em relação à fase polimérica.
10. Partículas de PVAL sob a forma de pérolas ou de esferas magnéticas com tamanhos das partículas de 1-10 jim que se podem obter de acordo com o processo das reivindicações 1-9.
11. Partículas poliméricas com a forma de pérolas ou de esferas, de acordo com a reivindicação 10, cuja superfície possui cadeias poliméricas quimicamente melhoradas, caracterizadas pelo facto de conterem grupos carboxilo, hidroxilo, amino, aldeído ou oxirano que constituem as cadeias poliméricas.
12. Partículas magnéticas de acordo com as reivindicações 10 e 11, caracterizadas pelo facto de as superfícies das partículas poliméricas possuírem grupos reactivos de acoplamento das moléculas biológicas.
13. Partículas de PVAL com a forma de pérolas de acordo com a reivindicação 12, caracterizadas pelo facto de se fazerem reagir grupos de acoplamento com anticorpos, péptidos, proteínas, enzimas, estreptavidinas, avidina, oligonucleótidos ou fragmentos de DNA. ..-7 3
14. Utilização das partículas de PVAL de acordo com as reivindicações 10-13 para o fraccionamento de células, ácidos nucleicos, proteínas, vírus ou bactérias.
15. Utilização das partículas de PVAL de acordo com as reivindicações 10-13 para os ensaios de imunidade, para o sequenciamento de DNA ou para a síntese de DNA. Lisboa, 16 de Maio de 2001