WO2001010554A2 - Labor-roboter und verfahren und reagenzienkit zur isolierung von nukleinsäuren - Google Patents

Labor-roboter und verfahren und reagenzienkit zur isolierung von nukleinsäuren Download PDF

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WO2001010554A2
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nucleic acids
laboratory
robot
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Clemens Bergmann
Gerhard Bienhaus
Mario Berger
Jörg BÖTTGE
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Bilatec Ag
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
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    • G—PHYSICS
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Definitions

  • the invention relates to a laboratory robot with at least one robot arm which can be moved in a predetermined working area and on which a gripping device for gripping at least one functional unit to be moved by the robot arm is arranged.
  • the invention further relates to a method for isolating nucleic acids from a biological sample containing compartments containing nucleic acids as well as a method for amplifying and / or determining nucleic acids by means of PCR, and finally to a reagent kit for isolating nucleic acids from a biological sample containing compartments containing nucleic acids.
  • PCR polymerase chain reaction
  • sample preparation which contains the nucleic acids from a wide variety of materials such as saliva, blood, liquor; Organisms such as bacteria, yeasts, fungi but also plant material, meat and other nucleic acid-containing samples are released and prepared so that the PCR process can be carried out without interference.
  • sample preparation is currently the bottleneck for widespread use because, above all, there are no automated processes.
  • US Pat. No. 5,705,628 describes magnetic particles which carry carboxyl groups on the surface as adsorbers for nucleic acids.
  • the use of such particles is described in a multi-step process, in which a lysis buffer for digestion of the sample is first used in a staggered sequence, then the magnetic particle suspension and then a special buffer that adjusts the polarity and hydrophobicity of the resulting solution. that nucleic acids bind reversibly to the magnetic particles is added.
  • It is a highly viscous buffer that contains polyethylene glycol (20%) together with 2.5 M sodium chloride (hereinafter referred to as PEG buffer).
  • the nucleic acid After washing the magnetic particles one or more times and resuspending the magnetic particles in an elution buffer, the nucleic acid is desorbed and can be removed after the magnetic particles have been separated off.
  • the robot arm must be able to be coupled with a whole range of different functional units in order to be able to treat the samples in the desired manner.
  • a microtitration plate-like composite vessel cf. US Pat. No. 4,515,795
  • the laboratory robots described above are designed in such a way that they exert forces in the vertical direction (Z direction) of 15 N to 40 N, preferably 20 N to 30 N , can exercise.
  • a laboratory robot is known from EP-A-0 557 828 and parallel US-A-5,472,669, in the working area of which a plurality of functional units are kept at a predetermined parking position.
  • a gripping device is attached to the robot arm of this laboratory robot, with the aid of which the functional units can be taken from their parking positions as required and, after the functional step to be carried out with them, can be parked again at the parking position.
  • the gripper device known from these documents it can happen that when the functional unit is picked up from the parking position, during the execution of the functional step or when the functional unit is parked again at the parking position, its orientation relative to Robot arm changes. This can lead to malfunctions or even complete inability to operate the laboratory robot.
  • Another object is to provide a way to make sample preparation more effective while avoiding the disadvantages of the prior art.
  • a laboratory robot of the type mentioned in the introduction in which an orientation device is also provided on the robot arm, which is equipped with a function if desired, the counter-orientation device provided cooperates in order to impart a predetermined fixed relative orientation to the functional unit and the robot arm, and / or in which at least two functional units are provided, at least one of the functional units having such a counter-orientation device interacting with the orientation device of the robot arm. If there is still the possibility of rotation of the functional unit in the known laboratory robot after gripping the functional unit by the gripping device of the robot arm, such rotation is prevented in the laboratory robot according to the invention by the interaction of the orienting and counter-orienting device.
  • the orientation device and the counter-orientation device interact with one another by means of forces that can be switched on and off.
  • the gripping device or the robot arm and the functional unit could be coupled to one another electromagnetically after the functional unit has been gripped.
  • the desired interaction of the orienting and counter-orienting device can, however, be accomplished in a structurally and control-technically simple manner by simple mechanical intervention of the orienting and counter-orienting device.
  • one of the devices can comprise an orientation mandrel
  • the respective other device namely the counter-orientation device or the orientation device
  • the gripping device is also to be used for concealing vessels containing the samples, it is advantageous if the orientation mandrel is arranged on the functional unit and the receptacle on the robot arm or the gripping device.
  • the construction space taken up jointly by the gripping device and the orientation device only exceeds the construction space taken up by the gripping device alone slightly, so that the possibilities of movement of the robot arm, which is preferably essentially freely movable in space in a predetermined working area of the laboratory robot, are practically not restricted by the orientation device.
  • the engagement of the orienting mandrel and the receptacle can be produced when the gripping device approaches the functional unit, it being possible to facilitate engagement by providing at least one bevel on the orienting mandrel and / or the receptacle.
  • the gripping device can be designed in the manner of a capping gripping device.
  • the gripping device can be elongated and, if desired, essentially cylindrical symmetrical and comprise at least one gripping tool and an actuating device for actuating the gripping tool, the gripping tool being arranged essentially within a projection of the actuating device in the direction of the longitudinal axis of the gripping device.
  • Such a capping gripping device are known, for example, from the publications EP-A-0 734 768 already mentioned above (or DE-U-295 05 652, DE-U-295 05 707 and DE-U-295 1 5 990), EP- A-0 676 643 (or DE-A-44 1 2 286) and DE-A-1 98 01 1 78 are known.
  • an engagement point for the gripping device can be provided on the functional unit, for example an engagement pin or an attack recess.
  • the gripping device can be actuated electrically, for example electromagnetically, and / or hydraulically and / or pneumatically.
  • the actuating device in the manner of a ballpoint pen or of a mechanical pencil, ie by a first start against a resistance, the gripping device can be changed from a release state to a grip state and by a renewed start against a resistance again in the release state.
  • the resistance required for "switching" the gripping device is opposed by the functional unit placed on a base plate of the working area of the laboratory robot in a parking position even to the movement of the robot arm or the gripping device, if this or this when the functional unit is picked up in a simple manner Downward movement hits the functional unit or the functional unit hits the base plate when it is parked in its assigned parking position.
  • the laboratory robot according to the invention can comprise a whole series of different functional units.
  • At least one of these functional units can comprise, for example, a fork frame for transporting containers containing the samples, preferably a fork frame for transporting at least one microtitration plate or a microtitration plate-like composite container or composite container.
  • a fork frame for transporting containers containing the samples
  • the microtitration plate can be picked up from a first position of the work area and transported to any second position, for example a treatment position, and stored there. After this function has been carried out, the fork frame can be put down again in the parking position assigned to it.
  • the microtitration plate can be held at a predetermined distance above the base plate of the work area of the laboratory robot.
  • the gripping device can then be used to discover at least one predetermined container of the microtitration plate before the robot arm is moved to another parking position and fetches another functional unit from there.
  • the further functional unit can comprise, for example, at least the pipette tip receiving part of a pipetting device.
  • various media for example nutrient solutions or liquid reagents or reagents bound to the surface of particles, for example magnetic particles, can be introduced into the sample container.
  • the magnet device can preferably be designed as a functional unit that can be picked up by the robot arm or its gripping device according to the invention and can comprise at least one permanent magnet. If one drives along the reaction vessel with this magnet device, the magnetic particles in the immediate vicinity of the magnet device are deposited on the wall of the reaction vessel and follow their movement. It is thus possible to collect them in a tapered lower end of the reaction vessel. In this way, in particular for vessels with a volume of between approximately 20 ml and approximately 200 ml, preferably between approximately 20 ml and approximately 70 ml, a practical, simple and fully automatic tool for carrying out a magnetic separation can be provided.
  • a barcode reader can be coupled to the robot arm as a further functional unit.
  • Such a barcode reader can take on a wide variety of tasks, for example the detection of sample tubes, modules or rack systems identified by barcodes, which are located in the work area of the laboratory robot.
  • the one from the barcode reader recorded data can be supplied to a control unit, which takes this into account when controlling / regulating the movement of the robot arm and / or the actuation of the gripping device or / and the operation of the magnet device or / and the operation of the pipetting unit.
  • a reagent kit for the isolation of nucleic acids from a biological sample containing nucleic acid-containing compartments which is characterized in that it a) negatively charged particles made of a polymer material, b) a reagent I consisting of a mixture of a charged one or uncharged detergent and an aliphatic alcohol, or / and a reagent II consisting of an aqueous solution of at least one chaotropic salt and optionally an aliphatic
  • Alcohol, and c) contains a proteinase solution.
  • biological, nucleic acid-containing compartments denotes all structures in samples to be examined, from which nucleic acids have to be released by lysis.
  • cells including bacterial or yeast cells, and viruses are included in this definition.
  • the reagent kit according to the invention contains, as reagents I or / and II, compositions with surprisingly simple recipes which are necessary for an effective lysis of the samples, i.e. of the biological, nucleic acid-containing compartments can be used. Furthermore, the reagents I and II contained in the reagent kit according to the invention enable the released nucleic acids to bind to the polymer particles immediately after lysis, without the buffer having to be changed or other substances having to be added. By using neutral cationic or anionic detergents in high concentrations together with aliphatic alcohols, a particularly efficient and complete lysis can be achieved, which is particularly true for samples which contain yeast cells.
  • reagent II When using reagent II containing an aqueous solution of at least one chaotropic salt, particularly effective lysis of samples containing whole blood can be effected.
  • Reagents I and II are also suitable for all other applications, although the better suitability of one or the other reagent can easily be determined in advance by a person skilled in the art for the respective application.
  • the reagent kit according to the invention enables the lysis of cells or viruses and binding of the nucleic acids to particles as well as the separation of the particles from the sample solution in a quasi one-step process in which the sample substance is added to a mixture of particles, reagent I or II and proteinase solution. and after appropriate incubation the sample solution can be separated again, leaving behind the nucleic acids separated from the cells in a form bound to the polymer particles.
  • the reagent kit additionally contains wash buffer and / or elution buffer for separating the nucleic acids from the polymer particles.
  • the reagent set according to the invention thus contains, in a particularly preferred embodiment, all reagents for carrying out nucleic acid isolation from samples. It is possible to initially keep the reagents in the reagent set individually, i.e. in separate bottles, and to prepare a stable working solution only immediately before use. This has the advantage that, depending on the sample, very different lysis principles can be used. It was surprisingly found that a buffer with sodium dodecyl sulfate together with ethanol is particularly advantageous for the isolation of nucleic acid from yeast, while a buffer with guanidinium thiocyanate and possibly ethanol is more suitable for the digestion and isolation of nucleic acids from whole blood.
  • the reagent kit according to the invention therefore contains the reagents A) particles, B) Reagent I with detergent / alcohol mixture, C) Reagent II with high-molar salts of chaotropic compounds and, if appropriate, preferably an aliphatic alcohol, and D) a proteinase solution ,
  • the reagent kit according to the invention can also hold one or more working solutions containing mixtures of A, B and D and of A, C and D ready for use.
  • a reagent kit according to the invention which contains both reagent I and reagent II, is suitable for isolating nucleic acids from a large number of samples, the final preparation of the working solution being carried out by the user in each case based on the application.
  • a reagent kit is also included of the present invention, which contains only one of the two reagents and is therefore particularly suitable for, for example, the isolation of nucleic acids from yeast-containing samples or whole blood.
  • the use of one of the reagents in other samples is not intended to be limited by these preferred uses.
  • further components of the reagent kit according to the invention can be washing solutions for the particles, which are filled in a separate bottle.
  • an elution buffer is required, which should be characterized in particular by its low ionic strength.
  • This component can also be part of the reagent set according to the invention. Both suitable washing solutions and elution buffers are known in principle to the person skilled in the art.
  • a working solution containing components A, B, D or A, C, D is added to a sample and incubated. In individual cases, the incubation can take place at a higher temperature.
  • the working solution simultaneously causes the digestion of the sample, the release of the nucleic acids and the binding to the particles that are part of the working solution.
  • the particles are separated, the clear supernatant is suctioned off and discarded.
  • the particles are then washed in a suitable washing solution, with alcoholic solutions again proving to be particularly advantageous for reasons of simple miscibility.
  • water / ethanol or generally water / aliphatic alcohol mixtures in a ratio of 70 to 30 parts of water with 30 to 70 parts of alcohol give satisfactory results in the context of the invention.
  • the washing process is repeated one or more times and the washed and deposited particles are taken up with a buffer of low ionic strength so that the nucleic acids desorb and go into solution. Then a further processing z. B. for a PCR amplification.
  • the reagent kit contains, as negatively charged particles, those made of polystyrene or polyvinyl alcohol, the particles made of polyvinyl alcohol being a particularly preferred embodiment.
  • particles which cannot be magnetically influenced it is preferred to provide particles which can be magnetically influenced and which can be particularly easily concentrated at a point in the reaction vessel using a magnet when isolating the nucleic acids and of which the remaining sample solution is particularly simple can be separated.
  • the particles in the reagent kit preferably have an average diameter of 0.1 to 100 ⁇ m and in particular 1 to 10 ⁇ m. Particles of this diameter allow good and effective binding of nucleic acids.
  • the negative charge of the particles is based on the presence of carboxyl groups on the surface of the particles.
  • Particles to be used with particular preference in the context of the present invention are e.g. described in EP 0 843 591.
  • Reagent I of the reagent kit according to the invention preferably contains sodium dodecyl sulfate or cetylammonium bromide (CTAB) as detergent, preferably in an amount of 1 to 10% based on the reagent volume.
  • Reagent I preferably contains ethanol as the aliphatic alcohol, a concentration of at least 40% by volume leading to good results and is therefore preferred.
  • Reagent II preferably contains aqueous solutions of guanidinium hydrochloride or thiocyanate, concentrations of these salts of 2 to 8 M being preferred.
  • Reagent II can also contain an aliphatic alcohol as described for Reagent I, which can be advantageous by reducing the viscosity of the sample.
  • the reagents I and II may contain other customary and suitable buffers and / or auxiliary substances.
  • TRIS / HCI may be mentioned as an example of buffer substances; auxiliary substances can e.g. Complexing agents like EDTA.
  • the pH of the reagents is preferably adjusted to approximately the physiological pH.
  • the proteinase contained in the reagent kit according to the invention serves to avoid disturbances due to the presence of proteins after digestion of the biological, nucleic acid-containing compartments.
  • Proteinase K is preferably used for this purpose in the reagent kit according to the invention, the amount of proteinase used in nucleic acid isolation being dependent on the amount of cells present and thus on the amount of proteins. Suitable concentrations of proteinase can easily be determined by the person skilled in the art.
  • the reagent kit according to the invention enables simple and rapid isolation of nucleic acids from samples, in particular for the subsequent implementation of a PCR reaction, and is intended and suitable in particular for use with a laboratory robot according to the invention. Since only sample to z. B. a prepared working solution containing all the other necessary components must be added, after separation of the particles using a magnet, for example, the remaining sample solution can easily be removed and after washing, if necessary, can be eluted to obtain the nucleic acids, a corresponding process can be easily automated. Only about 4 pipetting steps are necessary before the final sample collection.
  • the present invention therefore furthermore relates to a method for isolating nucleic acids from a biological sample containing nucleic acid-containing compartments, which is characterized in that the sample is simultaneously treated with negatively charged particles made of a polymer material and a reagent consisting of a mixture of a charged one or uncharged detergent and an aliphatic alcohol, or consisting of an aqueous solution of at least one chaotropic salt and optionally also an aliphatic alcohol, which separates the particles from the supernatant solution in a suitable manner, optionally washes and either directly or for the nucleic acids bound to the particles other processes, e.g. PCR, used, or detaches the nucleic acids bound to the particles by means of an elution buffer from the particles.
  • a reagent consisting of a mixture of a charged one or uncharged detergent and an aliphatic alcohol, or consisting of an aqueous solution of at least one chaotropic salt and optionally also an aliphatic
  • This method is particularly suitable and advantageous for implementation with the laboratory robot according to the invention.
  • the method according to the invention is carried out using the components already described above for the reagent kit according to the invention, which is why reference is made to the above explanations for a more detailed description of the components. It is preferred to add a proteinase, preferably proteinase K, to avoid interference from proteins.
  • a proteinase preferably proteinase K
  • the particles and reagents used correspond to those described above, as do suitable washing and elution buffers, which are likewise used in the process according to the invention be used. At least 60% ethanol is particularly preferably used for washing.
  • reagent containing detergent and alcohol corresponding to reagent I for the isolation of nucleic acids from samples containing yeasts, whereas a reagent containing chaotropic salts corresponding to reagent II is used in particular to isolate nucleic acids from whole blood.
  • the method according to the invention can in principle be used to isolate DNA or RNA, although isolation of DNA is preferred.
  • the present invention further provides a method for the amplification and / or determination of nucleic acids by means of a polymerase chain reaction, in which the nucleic acid to be amplified is obtained from a sample containing biological, nucleic acid-containing compartments with the aid of the inventive method described above or with the aid of the reagent kit according to the invention described above is isolated.
  • a particular advantage of the invention is to be seen in the fact that the nucleic acids can still be used for a PCR reaction both on the polymer particles and after separation from the polymer particles in the elution buffer.
  • the PCR reaction and / or the identification of the nucleic acids z. B. by sequencing can be carried out according to methods known per se.
  • FIG. 1 shows a perspective view of a first embodiment of a laboratory robot according to the invention
  • FIG. 2 is a view for explaining the structure of a robot arm of a second embodiment of a laboratory robot according to the invention
  • FIG. 3 shows a side view of a gripping device
  • 5a shows a functional unit designed as a fork frame
  • FIG. 5b is a view for explaining the function of the fork frame according to FIG. 5a;
  • FIG. 6 shows a rough schematic view of a functional unit designed as a pipette tip holder
  • 7a is a rough schematic view for explaining the function of a functional unit designed as a magnetic device
  • a laboratory robot according to the invention is generally designated 10. It comprises a base plate 1 2 with a working surface 1 4 and a housing 1 6, in which two robot arms 1 8 and 20 are slidably mounted. Furthermore, a control unit 22 for controlling or regulating the movement of the robot arms 1 8, 20 is accommodated in the housing 1 6.
  • the two robot arms 1 8, 20 each have a main arm 1 8 a and 20 a, which extends substantially orthogonally to a substantially vertical front surface 1 6 a of the housing 1 6 and one end of which in the housing 1 6 horizontally along a path 24 can be moved back and forth (movement in the Y direction).
  • the laboratory robot 10 is therefore a typical representative of the Cartesian XYZ laboratory robot type.
  • a gripping device 26 At the lower end of the secondary arm 1 8b or 20b, a gripping device 26 according to the invention is attached, the operation of which can also be controlled or regulated by the control unit 22 and the structure of which will be explained in more detail below with reference to FIG. 3.
  • a number of functional units which are parked in parking areas 28 of the work surface 14 and whose structure and function will be explained in more detail with reference to FIGS. 4 to 8 can be picked up and used for the treatment of samples.
  • the microtitration plates 30 receiving the samples can be provided, for example, in storage areas 34, 36 of the work surface 1 4 and can be transported into a processing area 38 by means of the robot arm 1 8 or 20.
  • the microtitration plates 30 can then be brought back to one of the storage areas 34, 36. 2 only shows the robot arm 11 8 of another type of laboratory robot for the sake of completeness.
  • the robot arm 1 1 8 has a slide 1 1 8c, which is mounted linearly movable along a rail 1 24.
  • the main arm 1 1 8a and the secondary arm 1 1 8b of the robot arm 1 1 8 are borrowed in a similar manner to a human upper or lower arm on the shoulder or elbow joint on the slide 1 1 8c or on another.
  • a gripping device 1 26 is arranged at the free end of the forearm 1 1 8b.
  • the gripping device 26 or 1 can be designed as described in EP-A-0 734 768 (or DE-U-295 05 652, DE-U-295 05 707 or DE-U-295 1 5 990) or from DE-A-1 98 01 1 78. That it is elongated along an axis A which runs essentially vertically in use and, according to FIG. 3, comprises a gripper 40 and a housing 42. An actuating device 44 is accommodated in the housing 42, which actuates the opening and closing of the gripper by movement of an actuator 46 controls in the direction of the axis A.
  • the actuating device 44 can be designed as an active actuating device which brings about the movement of the actuator 46 by means of a power device, for example an electromagnet.
  • a power device for example an electromagnet.
  • EP-A-0 734 768 it is also possible to design the actuating device 44 according to EP-A-0 734 768 as a passive actuating device which derives the movement of the actuator 46 in the manner of a ballpoint pen or mechanical pencil from a movement of the gripping device.
  • the gripping pliers are arranged essentially within a projection P of the housing 42 in the direction of the axis A enables the gripping device 26 or 1 26 to be slender in the horizontal direction, which means that they move in the area of the working surface 1 4 of the laboratory robot 1 0 relieved.
  • All of the functional units to be explained below have an attack unit 50 (see FIG. 4) which is exclusively intended to interact with the gripping device 26, 1 26.
  • the attack unit 50 has a pin sleeve 52, as is known, for example, from EP-A-0 734 769 from the lids, which close the vessels receiving the samples.
  • the gripping tongs 40 of the gripping device 26, 1 26 engage the pin 52a of this pin sleeve 52 in order to pick up the functional unit and to move it to a specific position of the working area 14 of the laboratory robot.
  • the engagement unit 50 is further provided with a positioning rod 54 which is inserted into a receiving opening 48 on the housing when the gripping device 26, 1 26 approaches the functional unit 42 of the gripping device 26, 1 26 is formed or arranged.
  • This engagement of the positioning rod 54 and the receiving opening 48 ensures that the functional unit always has the desired relative orientation with respect to the gripping device 26, 1 26 or with respect to the movement in the working area 1 4 of the laboratory robot 10 or when carrying out its intended function of the entire laboratory robot 10.
  • inclined surfaces 54a and 48a are formed both on the positioning rod 54 and on the receiving opening 48.
  • the pin sleeve 52 is designed in exactly the same way as the lids which close the vessels receiving the samples has the advantage that the gripping device 26, 1 26 can be used both for transporting the functional units and for concealing the sample vessels.
  • the material of the two journal sleeves is different. While the lids are usually made of deformable plastic, for example polypropylene or the like, the The pin sleeve 52 of the engagement unit 50 is preferably made of metal in order to be able to meet the higher mechanical stress.
  • the receiving opening 48 need not necessarily be an opening that is enclosed on all sides. Rather, it is sufficient if, in cooperation with the positioning rod 54, it prevents the functional unit from rotating about the axis A of the gripping device 26, 1 26. For this purpose, stop surfaces that are essentially orthogonal to the circumferential direction about the axis A are required.
  • FIG. 5a shows a fork frame 60 as a first example of a functional unit which can be used in the laboratory robot 10 according to the invention and which, in the manner of the fork of a forklift, for transporting microtitration plates 30 from the storage areas 34, 36 of the work surface 14 of the laboratory Robot to the treatment area 38 and vice versa.
  • the fork frame 60 is essentially U-shaped, the engagement unit 50 being attached or formed on the base leg 60c of the U-shape, while the other two legs 60a and 60b form the prongs of the receiving fork.
  • the microtitration plates 30 are preferably placed on bearing blocks 62.
  • the distance between the work surface 1 4 and the microtitration plate 30 thereby makes it easier for the fork frame 60 to reach under the microtitration plate 30.
  • the bearing blocks 62 can be used for tempering, ie cooling or heating, the microtitration plates 30. With the help of So-called "hotels" in which a plurality of microtitration plates 30 can be arranged one above the other can finally be realized in the storage areas 34 and 36.
  • the microtitration plate 30 rests on an upper surface 60d of the legs 60a, 60b and 60c of the fork frame 60.
  • the outside of these legs are provided with a web 60e which extends in the illustrated embodiment over the entire length of the legs 60a and 60b and in the end regions of the base leg 60c.
  • the fork frame 60 is one of the most important modules for laboratory robots, since the safe movement of microtitration plates, which are used as reaction vessels, as sample vessels and other tasks, is an important task in the automation of laboratory processes.
  • a pipette tip holder 70 is shown in a rough schematic in FIG.
  • a docking unit 72 for detachably receiving pipette tips 74 is arranged below the pin sleeve 52.
  • a hose 76 coming from a pipetting unit opens into the lower surface 72a of the docking unit 72.
  • the pipette tip holder 70 which is gripped by the gripping device 26, 1 26, together with the robot arm 1 8 or 1 1 8, forms a conventional pipetting robot , Therefore, the exact structure and the exact function of the docking unit 72 need not be explained in more detail here.
  • magnétique particles coated with certain reagents are often used as the solid phase.
  • the magnetic particles generally have a diameter of between approximately 0.5 ⁇ m and approximately 50 ⁇ m and are in the sample volume, which can have a content of the order of 1 ml to 500 ml, preferably 30 ml to 100 ml , usually in suspension.
  • Magnetic separation is now about separating these magnetic particles on the walls of the sample vessel in order to then be able to remove the supernatants remaining in the sample volume, for example by means of the pipetting functional unit 70 described above.
  • the reaction vessel must be brought up to a magnet, usually a permanent magnet, for example made of neodyn. Magnet systems of this type, which are also suitable for use in composite vessels, can be obtained, for example, from the applicant. Reference is also made to WO-A-92/04961.
  • the microtitration plates 30 can be placed on such a magnetic separator without any problems. After the supernatants have been pipetted off, the microtitration plates 30 can then be transported back to a storage area 34, 36 for washing the magnetic particles.
  • FIG. 7a Another variant of the magnetic separation is shown in Fig. 7a, which serves to explain the structure and function of a magnetic separation function unit 80.
  • the magnetic separation functional unit 80 has a permanent magnet 82, which can be made of neodyn, for example.
  • This permanent magnet 82 can be approximated to the upper region 84a of a reaction vessel 84 with the aid of the robot arm 18 under the control of the control unit 22. It remains there for a certain time, which depends strongly on the diameter of the reaction vessel and is usually of the order of 10 seconds to 5 minutes.
  • the permanent magnet 82 can be moved in a plurality of steps along a travel path 86, and it keeps pausing again and again in order to reliably ensure that all magnetic particles that have been collected so far have slipped onto the wall of the reaction vessel. In this way, all magnetic particles are located in the tip 84b of the reaction vessel 84 at the end of the travel path 86.
  • the magnetic separation functional unit 1 80 can also have a plurality of permanent magnets 1 82, which are arranged in a holder 1 88 around an opening 1 88 a for the reaction vessel. With this magnetic separator 1 80, too, the magnetic particles can be collected at the bottom of the reaction vessel.
  • a barcode reading unit 90 is shown in FIG. 8, which comprises a barcode reader 92 attached to the attack unit 50.
  • the data lines connecting the barcode reader 92 to the control unit 22 are not shown in FIG. 8 for the sake of clarity.
  • Barcode readers play a major role in the automation of laboratory processes, since the identification of samples using barcodes is becoming more and more common to enable clear identification. In complex robot environments, it is therefore necessary to transmit the information provided by a barcode reader 92 to the control unit, which can be formed, for example, by a computer, for example a PC, and there to control the movements of the robot arm 18 or 20 as well as the other processes. This is the only way to ensure that the right sample is always subjected to the right treatment.
  • Carboxyl groups as adsorbers and magnetic separation.
  • the particles are then separated off with a magnet, the supernatant is removed and the particles are distilled with 150 ⁇ l 80% ethanol [5054.1, Roth, Düsseldorf]. Washed water. This process is repeated once; then the particles are resuspended in 150 ⁇ l BILATEST elution buffer consisting of 10 mM Tris / HCl pH 7.0 [see above] and 1 mM EDTA [see above], incubated at 65 ° C. for 5 minutes and separated with a magnet as before. The purified nucleic acid is removed in the supernatant. The analysis in a standard agarose flat bed gel (0.8% agarose [A9311, Sigma, Kunststoff]) gives an image as in FIG. 9.
  • a working solution is first prepared from 250 ⁇ g particles of polyvinyl alcohol (manufactured according to EP 0 843 591) in 5 ⁇ l bidist. Water, 5 ul proteinase K solution [1 373 1 96, Röche, Mannheim] and 1 30 ul BILATEST lysis buffer I (SDS) consisting of 5% sodium dodecyl sulfate [L4390, Sigma, Kunststoff], 100 mM Tris / HCI [T2584, Sigma, Kunststoff], 10 mM EDTA [E51 34, Sigma, Kunststoff], 50% ethanol [5054.1, Roth, Düsseldorf].
  • SDS BILATEST lysis buffer I
  • Example 2 was repeated, but instead of centrifuging, the particles were magnetized with a permanent magnet [Fa. Rheinmagnet, Neun Meinn] separated.
  • Example 3 was repeated, the elution being carried out not at 65 ° C. but at room temperature.
  • M marker M-Hindlll 23.1 1 9.41 6.6 i 4.41 2.3 1 2.010.56 KB 5.
  • Elution at RT results in less elution of smaller nucleic acid molecules, e.g. RNA (the bottom two bands in lanes 3 and 4). This selectivity can be used to separate different nucleic acid molecules.
  • Example 3 was repeated, lysis buffers being compared with SDS or with CTAB (cetyltrimethylammonium bromide, 91 61 .1, from Roth, Düsseldorf), in each case with 50% ethanol or without ethanol.
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide, 91 61 .1, from Roth, Düsseldorf
  • the eluate was analyzed with a standard agarose flat bed gel (0.8% agarose [see]) and shown in FIG. Fig. 14
  • CTAB can be used instead of SDS, but without ethanol, genomic DNA does not bind in both cases.
  • cell disruption can also be achieved without ethanol, the low yield in the samples without ethanol is therefore due to the low binding of the DNA in the absence of ethanol.
  • a working solution is first prepared from 250 ⁇ g particles of polyvinyl alcohol (produced according to EP 0 843 591) in 5 ⁇ l bidist.
  • yeast cells can be selectively lysed with the SDS lysis buffer from Examples 1 and 2, while whole blood can be selectively lysed with the guanidine buffer from Example 4.
  • Example 7 was repeated with whole human blood.
  • Example 4 The experiment from Example 4 was repeated with 1 0 8 cells of the human pathogenic yeast Candida albicans. This yeast is characterized by a particularly strong and difficult to lyse cell wall. As a result, the eluate was analyzed with a standard agarose flat bed gel (0.8% agarose [see above]) and shown in FIG. Fig. 18 lane content
  • Example 4 The experiment from Example 4 was repeated with the gram-positive bacterium Lactococcus lactis. Gram-positive bacteria also have a particularly strong and difficult to lyse cell wall. Lysis times from 1 minute to 15 minutes were used.
  • Example 4 The experiment from Example 4 was repeated with agarose particles coated with glutamic acid (G2759, Sigma, Kunststoff). The result was similar to the result of Example 4 shown in FIG. 1 2, but the yield was significantly lower.
  • KV80 5'-GCG GAT CCT TAA GTC CAA TCG TCA AAA TT-3 'KV102: 5'-GCG AAT TCG TAT CTT CTT TGC CCA AGG AA-3'
  • PCR approaches contain the following components:
  • the program includes the following steps:
  • the PCR batches are carried out as described under a). After the PCR, the samples with 1 5-20% gel loading buffer with EDTA [Fa. Sigma, Kunststoff]. The amplificates were analyzed on a standard agarose gel (1.6%) (shown in FIG. 21).
  • a working solution is first prepared from 250 ⁇ g particles of polyvinyl alcohol, prepared according to EP 0 843 591 in 5 ⁇ l bidist.
  • Water 5 ul proteinase K ([1 3731 96, Röche, Mannheim], 20mg ml "1 in 1 0mM Tris-HCl pH7 [see]) and 1 30 ul BILATEST lysis buffer II (Gu-SCN) consisting of 3 M guanidinium thiocynate [G9277, Sigma, Kunststoff], 3% sodium lauroyl sulfate [L91 50, Sigma, Kunststoff], 100 mM Tris / HCl pH 7.0 [see], 1 mM EDTA [E51 34, Sigma, Kunststoff], 50% ethanol [9065, Roth, Düsseldorf].
  • 1 0 l or 25 ⁇ l human whole blood (EDTA, citrate or heparin whole blood) are mixed with 1 40 ⁇ l of the previously described working solution and incubated for 5 min at room temperature.
  • sample volumes of 50 ⁇ l and 100 ⁇ l the erythrocyte lysis described above is carried out first, after the second centrifugation the pellet is resuspended in 140 ⁇ l of the previously described working solution and incubated for 5 min at room temperature.
  • the particles are then drawn to the wall with a permanent magnet and the supernatant removed.
  • the particles are mixed with 1 50 ⁇ l
  • the magnetic particles are resuspended in 1 50 ⁇ l BILATEST elution buffer (10 mM Tris / HCl pH 7.0 [see above], 1 mM EDTA [see above]) or water, incubated at 65 ° C. for 5 minutes and separated as before , The purified nucleic acid is removed in the supernatant.
  • the whole blood samples (EDTA, citrate or heparin whole blood) are mixed in a ratio of 1: 1, 4 with erythrocyte lysis buffer (1 0mM Tris-HCl pH7.5 [T2584, Sigma, Kunststoff], 300mM sucrose) before DNA isolation [9097, from Roth, Düsseldorf], 5 mM MgCl 2 [M2670, from Sigma, Kunststoff], 1% Triton X-1 00 [3051, from Roth, Düsseldorf]) mixed and centrifuged at 1,400 g for 30 s.
  • the pellet is resuspended once in the same buffer and then centrifuged off again.
  • the steps of erythrocyte lysis are currently still carried out manually.
  • a working solution is first prepared from 250 ⁇ g particles of polyvinyl alcohol, prepared according to EP 0 843 591 in 5 ⁇ l bidist.
  • the mixing of the working solution is carried out by the AUTOSPRINT pipetting robot, which takes the reagents from the storage bottles in the reagent block (position 4) and mixes them in a special vessel in the same block
  • the particles are then drawn to the wall with a permanent magnet.
  • the plate is transferred from the AUTOSPRINT to the magnetic separator (position 6), using the special system-specific plate gripper. After the magnetic particles have been separated off (1 min), the supernatant is suctioned off. The plate is transferred back to position 5, then 1 50 ⁇ l washing buffer (1 0mM Tris-HCl pH7.5 [see], 1 mM EDTA [see], 80% ethanol [see]) are added to the particles, the DNA magnetic particle complex is not destroyed .. This process is repeated at least once; the complex is then air-dried for 5 minutes (on the magnetic separator, position 6) to remove ethanol residues.
  • the worktop is transferred to position 5.
  • the particles are mixed with 100 .mu.l elution buffer (10 mM Tris / HCl pH 7.0 [see above], 1 mM EDTA [see above]) or water and incubated for 3 minutes at room temperature.
  • the particles are then resuspended by multiple uptake and delivery and used directly as a PCR template.
  • the thermal treatment for elution and the separation of the magnetic particles are omitted in this test, which leads to a substantial saving in time.
  • the magnetic particles do not influence the PCR reaction up to a final concentration in the PCR mixture of 1 ⁇ g ⁇ l '1 .
  • An HLA-DRB-PCR was carried out with DNA isolated from 50 ⁇ l EDTA whole blood (Biotest test kit). During DNA isolation, erythrocyte lysis was carried out first, the amount of magnetic particles was reduced to 1 00 ⁇ g. 3 ⁇ l of solution with resuspended magnetic particles were used in each 10 ⁇ l PCR reaction (total volume of the resuspended magnetic particles 100 ⁇ l). The approach is such that the DNA is mixed with a finished master mix and water and the resulting mix is distributed on the PCR plate with the dried primers. This step is currently carried out manually, but should also be automated.
  • Reagent block holds one bottle of solutions 1, 2, 3 or 4 [depending on the sample] and 6 as well as two bottles of solution 5.
  • the bottle for mixing the ready-to-use lysis solution by the robot is also in the reagent block).
  • the sample volume can be up to 25 ⁇ l EDTA whole blood (with upstream erythrocyte lysis, the initial volume can be up to 100 ⁇ l EDTA whole blood; the pellet after erythrocyte lysis is either resuspended manually with water or PBS [volume 25 ⁇ l] or before the samples are distributed by the AUTOSPRINT- Robot resuspended in 50 - 100 ⁇ l elution buffer [solution 6]).
  • the magnetic particles are first resuspended by recording and dispensing the full change tip volume five times, then the required amount ([N + 2] x 5 ⁇ l) removed and transferred to the vessel for the lysis solution (position 4).
  • the solution (position 4) is first mixed by taking up and dispensing the full change tip volume five times, then the required amount ([N + 2] x 5 ⁇ l) is removed and transferred to the vessel for the lysis solution (position 4).
  • the lysis solution is mixed with a fresh interchangeable tip by taking it five times and dispensing the full interchangeable tip volume, then 140 ⁇ l each are added to the samples.
  • the change tip does not come into contact with the sample and therefore does not have to be changed.
  • the robot uses a fresh interchangeable tip for each sample to avoid cross-contamination.
  • the tip change can be omitted. Aspiration is carried out by sucking up 1 60 ⁇ l, 5s waiting time and then sucking up the remaining volume from the tip of the THERMOSPRINT vessels. 23. 5 min incubation at room temperature to dry the samples (removal of the residual ethanol from the wash buffer).
  • the magnetic particle suspension from step 26 can be used directly as a PCR template (see HLA-PCR; manual distribution or automated preparation of the PRC reactions by the AUTOSPRINT robot). 16) Isolation of nucleic acids from meat / sausage using
  • BILATEST lysis buffer X (Gu-SCN) consisting of 3 MG uanide in iumthiocyn at [G 9277, Fa. Sig ma, Kunststoff], 3% sodium lauroyisulfate [Fa.
  • the samples are centrifuged off and the supernatant is treated with 1 50 ⁇ l of ethanol [9065, Roth. Düsseldorf] and 250 ⁇ g particles of polyvinyl alcohol, produced according to EP 0 843 591, in 5 ⁇ l bidist. Mixed water.
  • the samples are incubated for 5 minutes at room temperature.
  • the particles are then pulled onto the floor with a permanent magnet and the supernatant removed.
  • the particles are washed with 1 50 ⁇ l washing buffer (1 0mM Tris-HCl pH7.5 [see above], 1 mM EDTA [see above], 80% ethanol [see above]), the DNA-magnetic particle complex not being resuspended. This process becomes repeated at least once; the complex is then air dried for 5 minutes to remove residual ethanol.
  • the magnetic particles are resuspended in 100 ⁇ l water. 2 ⁇ l of these samples are used directly or after elution of the DNA and separation of the particles in a PCR reaction with MT2 and MT1 1 primers (total volume of the PCR mixture 50 ⁇ l).
  • the plant material (wheat leaf pieces) is mechanically crushed in 100 - 300 ⁇ l extraction buffer and the resulting extract is clarified by centrifugation. 75 ⁇ l of the clear supernatant are mixed with a mixture of 10 ⁇ g magnetic particles made of polyvinyl alcohol, produced according to EP 0 843 591, in 75 ⁇ l ethanol (9065, Roth, Düsseldorf) and mixed. The mixture is incubated for 5 min at room temperature for DNA binding.
  • the particles are then pulled onto the floor with a permanent magnet and the supernatant removed.
  • the particles are washed with 1 50 ⁇ l washing buffer (10mM Tris-HCl pH7.5 [see above], 1 mM EDTA [see above], 80% ethanol [see above]), the DNA-magnetic particle complex not being resuspended. This process is carried out at least repeated twice; the complex is then air-dried for 5 minutes to remove ethanol residues.
  • the magnetic particles are then resuspended in 10 ⁇ l BILATEST elution buffer (10 mM Tris / HCl pH 7.0 [see above], 1 mM EDTA [see above]) or water and used directly in the PCR. Analysis of the isolated DNA in a standard agarose flat-bed gel (0.8% agarose [from Sigma, Kunststoff] gives an image like FIG. 27. Trace content

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Abstract

Bei einem Labor-Roboter mit wenigstens einem in einem vorbestimmten Arbeitsbereich bewegbaren Roboterarm, an welchem eine Greifvorrichtung (26) zum Ergreifen mindestens einer durch den Roboterarm zu bewegenden Funktionseinheit angeordnet ist, ist erfindungsgemäss an dem Roboterarm bzw. der Greifvorrichtung (26) ferner eine Orientiervorrichtung (48) vorgesehen, um der Funktionseinheit und der Greifvorrichtung (26) eine vorbestimmte feste Relativorientierung zu verleihen. Zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enhtaltenden Probe, unter Verwendung eines erfindungsgemässen Labor-Roboters, versetzt man die Probe mit negativ geladenen Partikeln aus einem Polymermaterial und einem Reagenz, oder bestehend aus einer wässrigen Lösung mindestens eines chaotropen Salzes und gegebenenfalls einem aliphatischen Alkohol, trennt die Partikel in geeigneter Weise von der überstehenden Lösung ab, wäscht ggf. und löst die an die Partikel gebundenen Nukleinsäuren mittels eines Elutionspuffers von den Partikeln.

Description

Labor-Roboter und Verfahren und Reagenzienkit zur Isolierung von Nukleinsäuren Beschreibung
Die Erfindung betrifft einen Labor-Roboter mit wenigstens einem in einem vorbestimmten Arbeitsbereich bewegbaren Roboterarm, an welchem eine Greifvorrichtung zum Ergreifen mindestens einer durch den Roboterarm zu bewegenden Funktionseinheit angeordnet ist. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe sowie ein Verfahren zur Amplifikation oder/und Bestimmung von Nukleinsäuren mittels PCR, und schließlich einen Reagenzienkit für die Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe.
Bei der in US-PS 4,683 1 95 beschriebenen Polymerasekettenreaktion (PCR) handelt es sich um ein einfaches Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren. Durch diese Vervielfältigung ist der Nachweis winzigster Mengen an Nukleinsäuren möglich geworden. Das Verfahren hat eine Nachweisempfinglichkeit, die bisher in der wissenschaftlichen Analytik beispiellos ist: Wo früher ein Nachweis erst ab ca. 1 06 Molekülen möglich war, können jetzt schon etwa 10 bis 1 00 Moleküle nachgewiesen werden. Eine aktuelle und spektakuläre Anwendung dieser Nachweisempfindlichkeit ist z. B. die Identifizierung von Tätern bei der Verbrechensaufklärung. Die PCR-Technologie ist ein zentraler Bestandteil der in der Öffentlichkeit diskutierten Erstellung einer "Gen-Kartei". Auch für den Nachweis von gentechnisch-veränderten Lebensmitteln oder die Untersuchung von Blutkonserven auf Viren wie HIV oder HCV ist die PCR uneriässlich.
In kürzester Zeit hat sich die PCR-Technologie im wissenschaftlichen Alltag etabliert und stellt damit einen Wachstumsmarkt dar. Voraussetzung für das PCR-Verfahren ist eine sogenannte "Probenvorbereitung", welche die Nukleinsäuren aus den verschiedensten Materialien wie Speichel, Blut, Liquor; Organismen wie z.B. Bakterien, Hefen, Pilzen aber auch Pflanzenmaterial, Fleisch und weiteren nukleinsäureenthaltenden Proben freisetzt und so vorbereitet, dass das PCR-Verfahren ohne Störungen durchgeführt werden kann. Diese Probenvorbereitung ist derzeit das Nadelöhr für die breite Anwendung, weil vor allem automatisierbare Verfahren fehlen.
Für die Automatisierung sind Partikel als Festphase von großer Bedeutung, die entweder verbunden mit Filtration oder Zentrifugation in der Probenvorbereitung eingesetzt werden, oder aber in Form von sogenannten Magnetpartikeln mit Hilfe von magnetischen Feldern abgetrennt werden können. Als zusammenfassende Literaturstelle wird US 4, 554,088 genannt.
In der Literatur sind verschiedene Verfahren für die Probenvorbereitung zur PCR beschrieben, so z.B. unter Verwendung von anorganischen Silikaoberflächen als Adsorber für Nukleinsäuren, die in Gegenwart von chaotropen Salzen nach EP 0 389 063 an das Silika binden und mit diesem Prinzip isoliert werden können.
Die US-PS 5,705,628 beschreibt als Adsorber für Nukleinsäuren Magnetpartikel, die Carboxylgruppen an der Oberfläche tragen. Die Verwendung solcher Partikel ist in einem Mehrschrittprozeß beschrieben, bei dem zunächst in einer zeitlich gestaffelten Abfolge zu einer Probe ein Lysepuffer zu m Aufschluß der Probe , anschl ießend die Magnetpartikelsuspension und danach ein spezieller Puffer, der die Polarität und Hydrophobizität der resultierenden Lösung so einstellt, daß Nukleinsäuren an die Magnetpartikel reversibel binden, zugegeben wird. Es handelt sich dabei um einen hochviskosen Puffer, der Polyethylenglykol (20 %) zusammen mit 2,5 M Kochsalz enthält (im Folgenden PEG-Puffer genannt) . Nach ein- oder mehrmaligem Waschen der Magnetpartikel und Resuspension der Magnetpartikel in einem Elutionspuffer wird die Nukleinsäure desorbiert und kann nach Abtrennen der Magnetpartikel entnommen werden. Für eine Automatisierung ergeben sich aber aus diesem Prozeß drei Probleme: a) Die in einer zeitlich gestaffelten Abfolge notwendigen Pipettierschritte sind für eine Automatisierung, z. B. mit einem Pipettierroboter, äußerst zeitaufwendig, so daß dieses Verfahren nicht für einen höheren Probendurchsatz geeignet ist. b) Der Einsatz eines hochviskosen Puffers erfordert bei der Automatisierung einen erheblichen Aufwand, eine entsprechend notwendige
Durchmischung zu erreichen. Da vor allem bei Automatisierungen 96-Well- Mikrotiterplatten als Reaktionsgefäße eingesetzt werden, muß durch eine entsprechende Schüttel- oder Rüttel-Apparatur oder andere mechanische Durchmischung dafür gesorgt werden, daß in allen Gefäßen eine gleichmäßige Mischung erfolgt. c) Eine weitere Problematik ergibt sich aus der Tatsache, daß die Proben vielfältiger Natur sind. Die bekannten Methoden der Probenvorbereitung ließen für viele Proben im Hinblick auf ihre Effektivität zu wünschen übrig.
Bei der Automatisierung von Abläufen im Labor, beispielsweise im Bereich der medizinischen Technik bzw. der Analytik oder im Bereich der Molekularbiologie und Humandiagnostik, insbesondere bei der Nukleinsäureanalytik, sind seit einigen Jahren verschiedene Arten von Labor-Robotern in Gebrauch. Es handelt sich dabei vorwiegend um Systeme, bei denen ein Betätigungsende des Roboterarms längs dreier zueinander im Wesentlichen orthogonal verlaufender Raumachsen linear verschiebbar angeordnet ist (kartesische XYZ-Systeme). Solche Systeme werden beispielsweise von der Firma Tecan, Firma Beckmann, von Firma Canberra Packard sowie von Firma Rosys in verschiedenen Ausführungen mit unterschiedlicher Anzahl von Roboterarmen angeboten. Daneben sind jedoch auch Systeme im Verkauf, bei denen eine Roboterarm-Halterung längs einer Schiene linear verschiebbar, ein Oberarmteil des Roboterarms an dieser Roboterarm- Halterung verschwenkbar und ein Unterarmteil des Roboterarms an dem Oberarmteil verschwenkbar angeordnet ist. Solche Systeme werden beispielsweise von Firma CRS in Kanada sowie von Firma Zymark in den U.S.A. angeboten und sind im Laborbereich etabliert.
Bei allen diesen Systemen muss der Roboterarm mit einer ganzen Reihe verschiedener Funktionseinheiten gekoppelt werden können, um die Proben in der gewünschten Weise behandeln zu können. Beispielsweise kann es erforderlich sein, ein eine Mehrzahl von Proben aufnehmendes mikro- titrationsplatten-artiges Verbundgefäß (vgl. US-A-4, 1 54,795) aus einem Aufbewahrungsbereich zu einer Behandlungsposition zu transportieren, dann von wenigstens einem der Behältnisse des Verbundgefäßes den Deckel abzunehmen, ferner der in dem Behältnis enthaltenen Probe durch Pipettieren Reagenzien hinzuzufügen und anschließend nach erneutem Aufsetzen des Deckels das Verbundgefäß wieder in dem Aufbewahrungsbereich abzustellen. Um die Funktionseinheiten und gegebenfalls auch die Mikrotitrations- platten Weise tragen zu können, sind die vorstehend beschriebenen Labor- Roboter derart ausgebildet, dass sie in vertikaler Richtung (Z-Richtung) Kräfte von 1 5 N bis 40 N, bevorzugt 20 N bis 30 N, ausüben können.
Hierzu ist aus der EP-A-0 557 828 bzw. der parallelen US-A-5,472,669 ein Labor-Roboter bekannt, in dessen Arbeitsbereich eine Mehrzahl von Funktionseinheiten an vorbestimmten Parkposition bereitgehalten ist. An dem Roboterarm dieses Labor-Roboters ist eine Greifvorrichtung angebracht, mit deren Hilfe die Funktionseinheiten nach Bedarf aus ihren Parkpositionen geholt und nach Erledigung des mit ihnen auszuführenden Funktionsschritts wieder an der Parkposition abgestellt werden können. Beim Einsatz der aus diesen Druckschriften bekannten Greifervorrichtung kann es jedoch geschehen, dass sich beim Aufnehmen der Funktionseinheit von der Parkposition, während der Durchführung des Funktionsschritts oder beim Wiederabstellen der Funktionseinheit an der Parkposition deren Orientierung relativ zum Roboterarm ändert. Dies kann zu Betriebsstörungen bis hin zur vollständigen Betriebsunfähigkeit des Labor-Roboters führen.
Aus der EP-A-0 734 768 bzw. der DE-U-295 05 652, der DE-U-295 05 707 und der DE-U-295 1 5 990, aus der EP-A-0 676 643 bzw. der DE-A-44 1 2 286 und aus der DE-A-1 98 01 1 78 sind Greifvorrichtungen zum Abnehmen bzw. Aufsetzen von Deckeln von bzw. auf die Proben enthaltende Gefäße bekannt. Da die verwendeten Deckel als rotationssymmetrische Körper ausgebildet sind, stellt sich bei diesen Greif- Vorrichtungen das vorstehend diskutierte Orientierungsproblem nicht.
Zum weiteren Stand der Technik sei ergänzend noch auf die DE-U-297 20 432 verwiesen.
Demgegenüber ist es Aufgabe der Erfindung, einen Labor-Roboter der gattungsgemäßen Art bereitzustellen, bei welchem die Gefahr einer unbeabsichtigten Störung der gewünschten Relativorientierung von Funktionseinheit und Greifvorrichtung zumindest verringert, wenn nicht gar vollständig beseitigt ist.
Eine weitere Aufgabe ist es, eine Möglichkeit bereitzustellen, die Probenvorbereitung effektiver zu gestalten und dabei die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden. Insbesondere ist es Aufgabe der vo rliegenden Erfindung , Möglichkeiten bereitzustellen , d ie Probenvorbereitung und gegebenenfalls auch die spätere PCR-Reaktion mit Hilfe des Einsatzes von Pipettierrobotern durchzuführen und hierfür eine Vereinfachung und Automatisierung der bisherigen Verfahren zu ermöglichen.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß durch einen Labor-Roboter der eingangs genannten Art gelöst, bei welchem an dem Roboterarm ferner eine Orientiervorrichtung vorgesehen ist, welche mit einer an der Funktions- einheit gewünschtenfalls vorgesehenen Gegenorientiervorrichtung zusammenwirkt, um der Funktionseinheit und dem Roboterarm eine vorbestimmte feste Relativorientierung zu verleihen, oder/und bei welchem wenigstens zwei Funktionseinheiten vorgesehen sind, wobei wenigstens eine der Funktionseinheiten eine derartige, mit der Orientiervorrichtung des Roboterarms zusammenwirkende Gegenorientiervorrichtung aufweist. Besteht bei dem bekannten Labor-Roboter nach dem Ergreifen der Funktionseinheit durch die Greifvorrichtung des Roboterarms noch die Möglichkeit einer Rotation der Funktionseinheit, so wird eine derartige Rotation bei dem erfindungsgemäßen Labor-Roboter durch das Zusammenwirken von Orientier- und Gegenorientiervorrichtung unterbunden.
Grundsätzlich ist es zwar möglich, die Orientiervorrichtung und die Gegenorientiervorrichtung durch ein- bzw. ausschaltbare Kräfte miteinander zusammenwirken zu lassen. Beispielsweise könnten die Greifvorrichtung bzw. der Roboterarm und die Funktionseinheit nach Ergreifen der Funktionseinheit elektromagnetisch miteinander gekoppelt werden. Das gewünschte Zusammenwirken von Orientier- und Gegenorientiervorrichtung kann jedoch in konstruktiv und steuerungstechnisch einfacher Weise durch einfachen mechanischen Eingriff von Orientier- und Gegenorientiervorrichtung bewerkstelligt werden.
Hierzu kann eine der Vorrichtungen, nämlich die Orientiervorrichtung oder die Gegenorientiervorrichtung, einen Orientierungsdorn umfassen, während die jeweils andere Vorrichtung, nämlich die Gegenorientiervorrichtung oder die Orientiervorrichtung, eine Aufnahme für den Orientierungsdorn umfasst. Soll die Greifvorrichtung auch zum Verdeckein von die Proben enthaltenden Gefäßen eingesetzt werden, so ist es vorteilhaft, wenn der Orientierdorn an der Funktionseinheit und die Aufnahme am Roboterarm bzw. der Greifvor- richtung angeordnet ist. In diesem Fall übersteigt der von der Greifvorrichtung und der Orientiervorrichtung gemeinsam eingenommene Bauraum den von der Greifvorrichtung alleine eingenommenen Bauraum nur geringfügig, so dass die Bewegungsmöglichkeiten des Roboterarms, der vorzugsweise in einem vorbestimmten Arbeitsbereich des Labor-Roboters im Wesentlichen frei im Raum bewegbar ist, durch die Orientiervorrichtung praktisch nicht eingeschränkt werden.
Der Eingriff von Orientierdorn und Aufnahme kann bei der Annäherung der Greifvorrichtung an die Funktionseinheit hergestellt werden, wobei zur Erleichterung des In-Eingriff-Bringens vorgesehen sein kann, dass an dem Orientierdorn oder/und der Aufnahme wenigstens eine Einweisungsschräge vorgesehen ist.
Wie bereits erwähnt kann die Greifvorrichtung nach Art einer Verdecke- lungs-Greifvorrichtung ausgebildet sein. Beispielsweise kann die Greifvorrichtung länglich und gewünschtenfalls im Wesentlichen zylinder- symmetrisch ausgebildet sein und wenigstens ein Greifwerkzeug sowie eine Betätigungsvorrichtung zur Betätigung des Greifwerkzeugs umfassen, wobei das Greifwerkzeug im Wesentlichen innerhalb einer Projektion der Betätigungsvorrichtung in Richtung der Längsachse der Greifervorrichtung angeordnet ist. Derartige Verdeckelungs-Greifvorrichtung sind beispielsweise aus den vorstehend bereits angesprochenen Druckschriften EP-A-0 734 768 (bzw. DE-U-295 05 652, DE-U-295 05 707 und DE-U-295 1 5 990), EP-A-0 676 643 (bzw. DE-A-44 1 2 286) und DE-A-1 98 01 1 78 bekannt. Um mit diesen Greifvorrichtungen zusammenwirken zu können, kann an der Funktionseinheit eine in Abhängigkeit des jeweiligen Typs von Greif- Vorrichtung ausgebildete Angriffsstelle für die Greifvorrichtung vorgesehen sein, beispielsweise ein Angriffszapfen oder eine Angriffsvertiefung.
Grundsätzlich kann die Betätigung der Greifvorrichtung elektrisch, beispielsweise elektromagnetisch, oder/und hydraulisch oder/und pneumatisch erfolgen. Alternativ ist es jedoch auch möglich, die Betätigung der Greifvorrichtung von einer Bewegung des Roboterarms abzuleiten. Beispielsweise kann die Betätigungsvorrichtung nach Art eines Kugelschreibers bzw. eines Druckbleistifts ausgebildet sein, d.h. durch ein erstes Anfahren gegen einen Widerstand kann die Greifvorrichtung aus einem Freigabezustand in einen Greifzustand und durch ein nochmaliges Anfahren gegen einen Widerstand wieder in den Freigabezustand übergeführt werden. Bevorzugt wird der zum " Umschalten" der Greifvorrichtung benötigte Widerstand von der auf einer Grundplatte des Arbeitsbereichs des Labor-Roboters in einer Parkposition abgestellten Funktionseinheit selbst der Bewegung des Roboterarms bzw. der Greifvorrichtung entgegengesetzt, wenn dieser bzw. diese beim Aufnehmen der Funktionseinheit in einer einfachen Abwärts- bewegung auf die Funktionseinheit trifft oder die Funktionseinheit beim Abstellen in der ihr zugeordneten Parkposition auf der Grundplatte auftrifft.
Der erfindungsgemäße Labor-Roboter kann eine ganze Reihe verschiedene Funktionseinheiten umfassen.
Wenigstens eine dieser Funktionseinheiten kann beispielsweise einen Gabelrahmen zum Transport von die Proben beinhaltenden Gefäßen umfassen, bevorzugt also einen Gabelrahmen zum Transport wenigstens einer Mikro- titrationsplatte bzw. eines mikrotitrationsplatten-artigen Verbundgefäßes oder Gefäßeverbundes. Mit diesem Gabelrahmen, der im kleinen Maßstab letztendlich wie eine Art Gabelstapler funktioniert, kann die Mikrotitra- tionsplatte von einer ersten Position des Arbeitsbereichs aufgenommen werden und zu einer beliebigen zweiten Position, beispielsweise einer Behandlungsposition, transportiert und dort abgelegt werden. Nachdem diese Funktion ausgeführt worden ist, kann der Gabelrahmen wieder an der ihm zugeordneten Parkposition abgelegt werden. Zur Erleichterung des Aufnehmens und Absetzens der Mikrotitrationsplatte mittels des Gabelrahmens wird vorgeschlagen, wenigstens eine Lagervorrichtung vorzusehen, mittels derer die Mikrotitrationsplatte in einem vorbestimmten Abstand über der Grundplatte des Arbeitsbereichs des Labor-Robotersgehalten werden kann. Anschließend kann die Greifvorrichtung zum Entdeckein wenigstens eines vorbestimmten Behältnisses der Mikrotitrationsplatte genutzt werden, bevor der Roboterarm zu einer anderen Parkposition bewegt wird und von dort eine weitere Funktionseinheit holt.
Die weitere Funktionseinheit kann beispielsweise zumindest den Pipettenspitzen-Aufnahmeteil einer Pipettiervorrichtung umfassen. Mit Hilfe der Pipettiervorrichtung können in das Probenbehältnis verschiedene Medien, beispielsweise Nährlösungen oder flüssige oder auf der Oberfläche von Partikeln, etwa Magnetpartikeln, gebundene Reagenzien eingebracht werden.
Im Falle der Einbringung von Magnetpartikeln können diese mit den an ihnen anhaftenden Reaktionsprodukten mittels einer Magnetvorrichtung von der restlichen Probe getrennt werden. Die Magnetvorrichtung kann hierzu vorzugsweise als erfindungsgemäß von dem Roboterarm bzw. dessen Greifvorrichtung aufnehmbare Funktionseinheit ausgebildet sein und wenigstens einen Permanentmagneten umfassen. Fährt man mit dieser Magnetvorrichtung an dem Reaktionsgefäß entlang, so schlagen sich die Magnetpartikel in unmittelbarer Nähe der Magnetvorrichtung an der Wandung des Reaktionsgefäßes nieder und folgen deren Bewegung. Somit ist es möglich, sie in einem konisch zulaufenden unteren Ende des Reaktionsgefäßes zu sammeln. Hierdurch kann insbesondere für Gefäße mit einem Volumen von zwischen etwa 20 ml und etwa 200 ml, vorzugsweise zwischen etwa 20 ml und etwa 70 ml, ein praktikables, einfaches und vollautomatisches Werkzeug zur Durchführung einer Magnetseparation bereitgestellt werden.
Als weitere Funktionseinheit kann ein Barcode-Leser an den Roboterarm angekoppelt werden. Ein solcher Barcode-Leser kann verschiedenste Aufgaben übernehmen, beispielsweise die Erkennung von mittels Barcodes gekennzeichneten Probenröhrchen, Modulen oder Racksystemen, die sich im Arbeitsbereich des Labor-Roboters befinden. Die von dem Barcode-Leser erfassten Daten können einer Steuereinheit zugeführt werden, welche diese bei der Steuerung/Regelung der Bewegung des Roboterarms oder/und der Betätigung der Greifvorrichtung oder/und des Betriebs der Magnetvorrichtung oder/und des Betriebs der Pipettiereinheit berücksichtigt.
Festzuhalten ist, dass die vorstehend diskutierten Funktionseinheiten als nicht abschließende Aufzählung der in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Labor-Roboter einsetzbaren Funktionseinheiten zu verstehen sind. Neben diesen gibt es noch weitere, dem Fachmann bekannte Funktions- einheiten, die bei der Automatisierung von Abläufen in Laboren chemischer oder molekularbiologischer Art genutzt werden und die durch Vorsehen einer Angriffsstelle für die Greifvorrichtung sowie durch Vorsehen einer Gegenorientiervorrichtung, beispielsweise eines Orientierdorns, zu einer Funktionseinheit im erfindungsgemäßen Sinne gemacht werden können. Als Beispiel sei lediglich eine Rührvorrichtung genannt.
Die erfindungsgemäßen Aufgaben wurden weiterhin gelöst durch einen Reagenzienkit für die Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß er a) negativ geladene Partikel aus einem Polymermaterial, b) ein Reagenz I bestehend aus einem Gemisch eines geladenen oder ungeladenen Detergens und einem aliphatischen Alkohol, oder/und ein Reagenz II, bestehend aus einer wässrigen Lösung mindestens eines chaotropen Salzes und gegebenenfalls einem aliphatischen
Alkohol, und c) eine Proteinase-Lösung enthält.
Der Begriff "biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente" bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Strukturen in zu untersuchenden Proben, aus denen Nukleinsäuren durch Lyse freigesetzt werden müssen. Insbesondere sind Zellen, einschließlich bakterieller oder Hefe-Zellen, sowie Viren von dieser Definition umfasst.
Der erfindungsgemäße Reagenzienkit beinhaltet als Reagenzien I oder/und II Zusammensetzungen mit überraschend einfachen Rezepturen, die für eine effektive Lyse der Proben, d.h. der biologischen, nukleinsäurehaltigen Kompartimente, eingesetzt werden können. Des weiteren ermöglichen die im erfindungsgemäßen Reagenzienkit enthaltenen Reagenzien I und II eine sofort nach der Lyse stattfindende Bindung der freigesetzten Nukleinsäuren an die Polymerpartikel, ohne daß der Puffer gewechselt bzw. Zugabe anderer Substanzen nötig ist. Durch Einsatz von neutralen kationischen oder anionischen Detergenzien in hohen Konzentrationen zusammen mit aliphatischen Alkoholen kann eine besonders effiziente und vollständige Lyse erreicht werden, was insbesondere auf Proben zutrifft, welche Hefezellen enthalten. Bei Verwendung des Reagenz II enthaltend eine wäßrige Lösung mindestens eines chaotropen Salzes kann eine besonders effektive Lyse von Proben enthaltend Vollblut bewirkt werden. Für alle anderen Anwendungsfälle sind die Reagenzien I und II ebenfalls geeignet, wobei für den jeweiligen Anwendungsfall die bessere Eignung des einen oder anderen Reagenz vom Fachmann vorab leicht bestimmt werden kann.
Der erfindungsgemäße Reagenzienkit ermöglicht die Durchführung der Lyse von Zellen oder Viren und Bindung der Nukleinsäuren an Partikel sowie die Abtrennung der Partikel von der Probenlösung in einem quasi Einschrittverfahren, in dem zu einer Mischung aus Partikeln, Reagenz I oder II und Proteinaselösung die Probensubstanz zugegeben wird, und nach entsprechender Inkubation die Probenlösung wieder abgetrennt werden kann unter Zurücklassung der aus den Zellen abgetrennten Nukleinsäuren in an die Polymerpartikel gebundener Form. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung enthält der Reagenzienkit zusätzlich noch Waschpuffer oder/und Elutionspuffer zur Abtrennung der Nukleinsäuren von den Polymerpartikeln.
Der erfindungsgemäße Reagenziensatz beinhaltet damit in besonders bevorzugter Ausführungsform alle Reagenzien zur Durchführung einer Nukleinsäureisolierung aus Proben. Dabei besteht die Möglichkeit, die Reagenzien zunächst einzeln, also jeweils in separaten Flaschen, im Reagenziensatz vorzuhalten und erst unmittelbar vor der Anwendung eine stabile Arbeitslösung herzustellen. Dies hat den Vorteil, daß je nach Probe sehr unterschiedliche Lyseprinzipien angewandt werden können. So wurde überraschenderweise festgestellt, daß ein Puffer mit Natriumdodecylsulfat zusammen mit Ethanol für die Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe besonders vorteilhaft ist, während ein Puffer mit Guanidiniumthiocyanat und gegebenenfalls Ethanol für den Aufschluß und die Isolierung von Nukleinsäuren aus Vollblut besser geeignet ist.
Der erfindungsgemäße Reagenzienkit enthält daher in einer bevorzugten Ausführung in separaten Flaschen die Reagenzien A) Partikel, B) Reagenz I mit Detergenz/Alkohol-Gemisch, C) Reagenz II mit hochmolaren Salzen von chaotropen Verbindungen und gegebenenfalls vorzugsweise einem aliphatischen Alkohohl sowie D) eine Proteinaselösung.
Darüber hinaus kann der erfindungsgemäße Reagenzienkit auch eine oder mehrere Arbeitslösungen, enthaltend Mischungen aus A, B und D sowie aus A, C und D gebrauchsfertig vorhalten.
Ein erfindungsgemäßer Reagenzienkit, der sowohl Reagenz I als auch Reagenz II beinhaltet, ist geeignet für die Isolierung von Nukleinsäuren aus einer großen Vielzahl von Proben, wobei jeweils bezogen auf die Anwendung die letztendliche Herstellung der Arbeitslösung durch den Anwender erfolgt. Selbstverständlich ist auch ein Reagenzienkit im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt, welcher nur eines der beiden Reagenzien beinhaltet und daher besonders geeignet ist für z.B. die Isolierung von Nukleinsäuren aus Hefe-enthaltenden Proben bzw. Vollblut. Die Anwendung eines der Reagenzien bei anderen Proben soll durch diese bevorzugten Anwendungen nicht eingeschränkt sein.
Wie bereits erwähnt, können weitere Komponenten des erfindungsgemäßen Reagenzienkits Waschlösungen für die Partikel sein, die in einer separaten Flasche abgefüllt sind. Zur Elution der Nukleinsäure von den Partikeln wird ein Elutionspuffer benötigt, der sich insbesondere durch niedrige lonenstärke auszeichnen sollte. Diese Komponente kann ebenfalls ein Teil des erfindungsgemäßen Reagenziensatzes sein . Sowohl geeignete Waschlösungen als auch Elutionspuffer sind im Prinzip dem Fachmann bekannt.
Die Funktionsweise der einzelnen Bestandteile des erfindungsgemäßen Reagenzienkits wird im Folgenden geschildert:
Eine Probe wird mit einer Arbeitslösung enthaltend die Bestandteile A, B, D oder A, C, D versetzt und inkubiert. Im Einzelfall kann die Inkubation bei höherer Temperatur stattfinden. Die Arbeitslösung bewirkt gleichzeitig den Aufschluß der Probe, die Freisetzung der Nukleinsäuren sowie die Bindung an die Partikel, die Bestandteil der Arbeitslösung sind. Die Partikel werden abgetrennt, der klare Überstand abgesaugt und verworfen. Die Partikel werden danach in einer geeigneten Waschlösung gewaschen, wobei sich alkoholische Lösungen wiederum aus Gründen der einfachen Mischbarkeit als besonders vorteilhaft erwiesen. Insbesondere Wasser/Ethanol- oder allgemein Wasser/aliphatischer Alkohol-Gemische im Verhältnis 70 bis 30 Teile Wasser mit 30 bis 70 Teilen Alkohol ergeben im Rahmen der Erfindung befriedigende Ergebnisse. Der Waschprozeß wird je nach Probe ein- oder mehrmals wiederholt und die gewaschenen und abgeschiedenen Partikel mit einem Puffer niedriger lonenstärke aufgenommen, so daß die Nukleinsäuren desorbieren und in Lösung gehen. Danach kann eine Weiterverarbeitung z. B. für eine PCR-Amplifikation erfolgen.
In einer bevorzugte Ausführungsform der Erfindung enthält der Reagenzienkit als negativ geladene Partikel solche aus Polystyrol oder Polyvinylalkohol, wobei die Partikel aus Polyvinylalkohol eine besonders bevorzugte Ausführungsform darstellen.
Obwohl es prinzipiell natürlich möglich ist, nicht magnetisch beeinflussbare Partikel zu verwenden, ist es bevorzugt, magnetisch beeinflußbare Partikel vorzusehen, welche bei der Isolierung der Nukleinsäuren besonders leicht über einen Magneten an einer Stelle im Reaktionsgefäß konzentriert werden können und von denen die verbleibende Probenlösung besonders einfach abgetrennt werden kann.
Bevorzugt weisen die Partikel im Reagenzienkit einen durchschnittlichen Durchmesser von 0, 1 bis 1 00 μm und insbesondere von 1 bis 1 0 μm auf. Partikel dieser Durchmesser erlauben eine gute und effektive Bindung von Nukleinsäuren.
Die negative Ladung der Partikel beruht in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf der Anwesenheit von Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Partikel. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt eingezusetzende Partikel sind z.B. in der EP 0 843 591 beschrieben.
Bevorzugt enthält das Reagenz I des erfindungsgemäßen Reagenzienkits als Detergens Natriumdodecylsulfat oder Cetylammoniumbromid (CTAB), vorzugsweise jeweils in einer Menge von 1 bis 1 0% bezogen auf das Reagenzvolumen. Als aliphatischer Alkohol ist in Reagenz I vorzugsweise Ethanol enthalten, wobei eine Konzentration von mindestens 40 Vol. % zu guten Ergebnissen führt und daher bevorzugt ist.
Reagenz II enthält bevorzugt wässrige Lösungen von Guanidiniumhydro- chlorid oder -thiocyanat, wobei wiederum Konzentrationen dieser Salze von 2 bis 8 M bevorzugt sind.
Auch Reagenz II kann einen aliphatischen Alkohol wie für Reagenz I beschrieben enthalten, was vorteilhaft sein kann durch Herabsetzen der Viskosität der Probe.
Die Reagenzien I und II enthalten ggf. weitere übliche und geeignete Pufferund/oder Hilfssubstanzen. Beispielhaft für Puffersubstanzen sei TRIS/HCI genannt, Hilfssubstanzen können z.B. Komplexbildner wie EDTA sein. Der pH-Wert der Reagenzien wird vorzugsweise auf ungefähr den physiologischen pH eingestellt.
Die im erfindungsgemäßen Reagenzienkit enthaltene Proteinase dient zur Vermeidung von Störungen aufgrund der Anwesenheit von Proteinen nach Aufschluss der biologischen, nukleinsäurehaltigen Kompartimente. Bevorzugt wird hierzu im erfindungsgemäßen Reagenzienkit Proteinase K eingesetzt, wobei die Menge an eingesetzter Proteinase bei der Nukleinsäure-Isolierung von der Menge der vorhandenen Zellen und damit von der Menge der Proteine abhängig ist. Geeignete Konzentrationen von Proteinase kann der Fachmann leicht ermitteln.
Der erfindungsgemäße Reagenzienkit ermöglicht eine leichte und schnelle Isolierung von Nukleinsäuren aus Proben, insbesondere für die anschließende Durchführung einer PCR-Reaktion und ist insbesondere zur Anwendung mit einem erfindungsgemäßen Laborroboter vorgesehen und geeignet. Da lediglich Probe zu z. B. einer vorbereiteten Arbeitslösung enthaltend alle anderen notwendigen Komponenten zugegeben werden muß, nach Separierung der Partikel über einen z.B. einen Magneten leicht die verbleibende Probenlösung entfernt werden kann und nach ggf. nötigem Waschen eluiert werden kann unter Gewinnung der Nukleinsäuren, kann ein entsprechendes Verfahren nämlich leicht automatisiert werden. Lediglich ca. 4 Pipettierschritte sind nötig bis zur letztendlichen Probengewinnung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Probe gleichzeitig mit negativ geladenen Partikeln aus einem Polymermaterial und einem Reagenz, bestehend aus einem Gemisch eines geladenen oder ungeladenen Detergens und einem aliphatischen Alkohol, oder bestehend aus einer wässrigen Lösung mindestens eines chaotropen Salzes und gegebenenfalls ebenfalls einem aliphatischen Alkohol versetzt, die Partikel in geeigneter Weise von der überstehenden Lösung abtrennt, ggf. wäscht und entweder die an die Partikel gebundenen Nukleinsäuren direkt für weitere Verfahren, z.B. PCR, verwendet, oder die an die Partikel gebundenen Nukleinsäuren mittels eines Elutionspuffers von den Partikeln löst.
Dieses Verfahren ist insbesondere geeignet und vorteilhaftzur Durchführung mit dem erfindungsgemäßen Laborroboter.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im Prinzip unter Verwendung der oben bereits für den erfindungsgemäßen Reagenzienkit beschriebenen Komponenten durchgeführt, weshalb für eine nähere Beschreibung der Komponenten auf die obigen Ausführungen verwiesen wird. Es ist dabei bevorzugt, eine Proteinase, vorzugsweise Proteinase K zur Vermeidung von Störungen durch Proteine zuzusetzen. Die verwendeten Partikel und Reagenzien entsprechen den oben beschriebenen, ebenso wie geeignete Wasch- und Elutionspuffer, die ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Besonders bevorzugt wird zum Waschen mindestens 60 %iges Ethanol eingesetzt. Es ist außerdem bevorzugt, zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Proben enthaltend Hefen, ein Reagenz enthaltend Detergens und Alkohol entsprechend Reagenz I zu verwenden, wogegen zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Vollblut insbesondere ein Reagenz enthaltend chaotrope Salze entsprechend Reagenz II eingesetzt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann prinzipiell zur Isolierung von DNA oder RNA angewandt werden, wobei allerdings die Isolierung von DNA bevorzugt ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Amplifikation oder/und Bestimmung von Nukleinsäuren mittels einer Polymerase-Ketten-Reaktion, bei dem die zu amplifizierende Nukleinsäure aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe mit Hilfe des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. mit Hilfe des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Reagenzienkits isoliert wird. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist nämlich auch darin zu sehen, daß die Nukleinsäuren sowohl noch an den Polymerpartikeln als auch nach der Abtrennung von den Polymerpartikeln im Elutionspuffer unmittelbar zu einer PCR Reaktion eingesetzt werden können. Die PCR-Reaktion oder/und die Identifizierung der Nukleinsäuren z. B. durch Sequenzierung können nach an sich bekannten Methoden durchgeführt werden.
Durch die erfindungsgemäßen Verfahren sowie den erfindungsgemäßen Reagenzienkit werden einfach und leicht automatisierbare Möglichkeiten zur Pröbenvorbereitung für die PCR bereitgestellt, die eine erhebliche weitere Vereinfachung bei der Analyse von Nukleinsäurehaltigen Proben darstellen und insbesondere mit einem erfindungsgemäßen Laborroboter ausgeführt werden können. Die Erfindung wird im folgenden an Ausführungsbeispielen und an Hand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert werden. Es stellt dar:
Fig. 1 eine Perspektivansicht einer ersten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Labor-Roboters;
Fig. 2 eine Ansicht zur Erläuterung des Aufbaus eines Roboterarms einer zweiten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Labor-Roboters;
Fig. 3 eine Seitenansicht einer Greifvorrichtung;
Fig. 4 eine geschnittene Seitenansicht einer Angriffseinheit, die allen erfindungsgemäßen Funktionseinheiten gemeinsam ist;
Fig. 5a eine als Gabelrahmen ausgebildete Funktionseinheit;
Fig. 5b eine Ansicht zur Erläuterung der Funktion des Gabelrahmens gemäß Fig. 5a;
Fig. 6 eine grobschematische Ansicht einer als Pipettenspitzenträger ausgebildeten Funktionseinheit;
Fig. 7a eine grobschematische Ansicht zur Erläuterung der Funktion einer als Magnetvorrichtung ausgebildeten Funktionseinheit;
Fig. 7b eine abgewandelte Ausführung der Magnetvorrichtung gemäß
Fig. 7a; und
Fig. 8 eine grobschematische Ansicht einer als Barcode-Leser ausgebildeten Funktionseinheit; In Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßer Labor-Roboter allgemein mit 1 0 bezeichnet. Er umfasst eine Grundplatte 1 2 mit einer Arbeitsfläche 1 4 sowie ein Gehäuse 1 6, in welchem zwei Roboterarme 1 8 und 20 verschiebbar gelagert sind. Ferner ist in dem Gehäuse 1 6 eine Steuereinheit 22 zur Steuerung bzw. Regelung der Bewegung der Roboterarme 1 8, 20 untergebracht.
Die beiden Roboterarme 1 8, 20 weisen jeweils einen Hauptarm 1 8a bzw. 20a auf, der sich im Wesentlichen orthogonal zu einer im Wesentlichen vertikalen Frontfläche 1 6a des Gehäuses 1 6 erstreckt und dessen eines Ende in dem Gehäuse 1 6 längs einer Bahn 24 horizontal hin- und herbewegbar ist (Bewegung in Y-Richtung). An jedem der Hauptarme 1 8a, 20a ist ein sich im Wesentlichen vertikal, d.h. in Z-Richtung, erstreckender Nebenarm 1 8b, 20b angeordnet, der zum einen längs des zugehörigen Hauptarms 1 8a bzw. 20a verlagert werden kann (Bewegung in X-Richtung) und zum anderen in Vertikalrichtung verstellt werden kann (Bewegung in Z-Richtung) . Bei dem Labor-Roboter 10 handelt es sich also um einen typischen Vertreter des Typs kartesischer XYZ-Labor-Roboter.
Am unteren Ende des Nebenarms 1 8b bzw. 20b ist eine erfindungsgemäße Greifvorrichtung 26 angebracht, deren Betrieb ebenfalls von der Steuereinheit 22 gesteuert bzw. geregelt werden kann und deren Aufbau weiter unten an Hand von Fig. 3 näher erläutert werden wird. Mit Hilfe der Greifvorrichtungen 26 kann eine Reihe von Funktionseinheiten, die in Parkbereichen 28 der Arbeitsfläche 14 abgestellt sind und deren Aufbau und Funktion mit Bezug auf Fig. 4 bis 8 näher erläutert werden wird, aufgenommen und zur Behandlung von Proben eingesetzt werden. Die die Proben aufnehmenden Mikrotitrationsplatten 30 (siehe Fig. 5b) können beispielsweise in Abstellbereichen 34, 36 der Arbeitsfläche 1 4 bereitgestellt und mittels des Roboterarms 1 8 bzw. 20 in einen Bearbeitungsbereich 38 trans- portiert werden. Nach Abschluss der Behandlung der Proben können die Mikrotitrationsplatten 30 dann wieder zu einem der Abstellbereiche 34, 36 gebracht werden. In Fig. 2 ist lediglich der Vollständigkeit halber der Roboterarm 1 1 8 einer anderen Art von Labor-Roboter dargestellt. Der Roboterarm 1 1 8 weist einen Schlitten 1 1 8c auf, der längs einer Schiene 1 24 linearbeweglich gelagert ist. Der Hauptarm 1 1 8a und der Nebenarm 1 1 8b des Roboterarms 1 1 8 sind ähn- lieh wie ein menschlicher Ober- bzw. Unterarm am Schulter- bzw. Ellenbogengelenk an dem Schlitten 1 1 8c bzw. aneineinder verschwenkbar gelagert. Am freien Ende des Unterarms 1 1 8b ist eine Greifvorrichtung 1 26 angeordnet.
Die Greifvorrichtung 26 bzw. 1 26 kann, wie vorstehend bereits erläutert worden ist, so ausgeführt sein, wie dies aus der EP-A-0 734 768 (bzw. der DE-U-295 05 652, der DE-U-295 05 707 oder der DE-U-295 1 5 990) oder aus der DE-A-1 98 01 1 78 hervorgeht. D.h. sie ist längs einer im Gebrauch im Wesentlichen vertikal verlaufenden Achse A länglich ausgebildet und umfasst gemäß Fig. 3 eine Greifzange 40 sowie ein Gehäuse 42. In dem Gehäuse 42 ist eine Betätigungsvorrichtung 44 aufgenommen, welche das Öffnen und Schließen der Greifzange durch eine Bewegung eines Stellglieds 46 in Richtung der Achse A steuert.
Die Betätigungsvorrichtung 44 kann dabei gemäß der DE-A-1 98 01 1 78 als aktive Betätigungsvorrichtung ausgebildet sein, welche die Bewegung des Stellglieds 46 mittels eines Kraftgeräts, beispielsweise eines Elektromagneten, herbeiführt. Es ist jedoch auch möglich, die Betätigungsvorrichtung 44 gemäß der EP-A-0 734 768 als passive Betätigungsvorrichtung auszuführen, welche die Bewegung des Stellglieds 46 nach Art eines Kugelschreibers oder Druckbleistifts aus einer Bewegung der Greifvorrichtung ableitet. In beiden Fällen ermöglicht jedoch die Tatsache, dass die Greifzange im Wesentlichen innerhalb einer Projektion P des Gehäuses 42 in Richtung der Achse A angeordnet ist, einen in horizontaler Richtung schlanken Aufbau der Greifvorrichtung 26 bzw. 1 26, was deren Bewegung im Bereich der Arbeitsfläche 1 4 des Labor-Roboters 1 0 erleichtert. Sämtliche nachfolgend noch zu erläuternden Funktionseinheiten weisen eine Angriffseinheit 50 (siehe Fig. 4) auf, die ausschließlich dazu bestimmt ist, mit der Greifvorrichtung 26, 1 26 zusammenzuwirken. Die Angriffseinheit 50 verfügt zum einen über eine Zapfenhülse 52, wie sie beispielsweise aus der EP-A-0 734 769 von den Deckeln her bekannt ist, welche die die Proben aufnehmenden Gefäße verschließen. An dem Zapfen 52a dieser Zapfenhülse 52 greift die Greifzange 40 der Greifvorrichtung 26, 1 26 an, um die Funktionseinheit aufzunehmen und zu einer bestimmten Position des Arbeitsbereichs 1 4 des Labor-Roboters zu bewegen.
Nachdem sowohl die Greifzange 40 als auch die Zapfenhülse 52 im Wesentlichen rotationssymmetrisch ausgebildet sind, ist die Angriffseinheit 50 ferner mit einem Positionierstab 54 versehen, der bei der Annäherung der Greifvorrichtung 26, 1 26 an die Funktionseinheit in eine Aufnahmeöffnung 48 eingeführt wird, die am Gehäuse 42 der Greifvorrichtung 26, 1 26 ausgebildet bzw. angeordnet ist. Dieser Eingriff von Positionierstab 54 und Aufnahmeöffnung 48 stellt sicher, dass die Funktionseinheit beim Verfahren im Arbeitsbereich 1 4 des Labor-Roboters 1 0 bzw. bei der Durchführung ihrer bestimmungsgemäßen Funktion stets die gewünschte Relativorientie- rung bezüglich der Greifvorrichtung 26, 1 26 bzw. bezüglich des gesamten Labor-Roboters 10 beibehält. Zur Erleichterung des Einführens der Positionierstabs 54 in die Aufnahmeöffnung 48 sind sowohl am Positionierstab 54 als auch an der Aufnahmeöffnung 48 Einweisungsschrägflächen 54a bzw. 48a ausgebildet.
Die Tatsache, dass die Zapfenhülse 52 genauso ausgebildet ist, wie die Deckel, welche die die Proben aufnehmenden Gefäße verschließen, hat den Vorteil, dass die Greifvorrichtung 26, 1 26 sowohl zum Transport der Funktionseinheiten als auch zum Verdeckein der Probengefäße verwendet werden kann. Vom Material her sind die beide Zapfenhülsen jedoch unterschiedlich. Während die Deckel üblicherweise aus verformbarem Kunststoff, beispielsweise Polypropylen oder dergleichen, hergestellt sind, wird die Zapfenhülse 52 der Angriffseinheit 50 bevorzugt aus Metall gefertigt sein, um der höheren mechanischen Beanspruchung genüge leisten zu können.
Festzuhalten ist, dass die Aufnahmeöffnung 48 nicht notwendigerweise eine allseits umschlossene Öffnung zu sein braucht. Vielmehr genügt es, wenn sie im Zusammenspiel mit dem Positionierstab 54 eine Drehung der Funktionseinheit um die Achse A der Greifvorrichtung 26, 1 26 verhindert. Hierzu sind lediglich zur Umfangsrichtung um die Achse A im Wesentlichen orthogonal verlaufende Anschlagflächen erforderlich.
Festzuhalten ist ferner, dass es grundsätzlich auch möglich ist, den Positionierstab an der Greifvorrichtung und die Aufnahmeöffnung an der Funktionseinheit vorzusehen. Insbesondere im Hinblick auf den Einsatz der Greifvorrichtung 26, 1 26 zum Verdeckein der Probengefäße ist jedoch die in Fig. 3 und 4 dargestellte Ausführung bevorzugt.
In Fig. 5a ist ein Gabelrahmen 60 als ein erstes Beispiel einer bei dem erfindungsgemäßen Labor-Roboter 1 0 einsetzbaren Funktionseinheit dargestellt, die nach Art der Gabel eines Gabelstaplers zum Transport von Mikrotitrationsplatten 30 aus den Abstellbereichen 34, 36 der Arbeitsfläche 1 4 des Labor-Roboters zum Behandlungsbereich 38 und umgekehrt dient. Der Gabelrahmen 60 ist im Wesentlichen U-förmig ausgebildet, wobei am Basisschenkel 60c der U-Form die Angriffseinheit 50 angebracht bzw. ausgebildet ist, während die beiden anderen Schenkel 60a und 60b die Zinken der Aufnahmegabel bilden.
Wie in Fig. 5b gezeigt, werden die Mikrotitrationsplatten 30 bevorzugt auf Lagerböcken 62 abgestellt. Der hierdurch zwischen der Arbeitsfläche 1 4 und der Mikrotitrationsplatte 30 vorhandene Abstand erleichtert das Untergreifen der Mikrotitrationsplatte 30 durch den Gabelrahmen 60. Darüber hinaus können die Lagerböcke 62 zum Temperieren, d.h. Kühlen oder Erwärmen, der Mikrotitrationsplatten 30 genutzt werden. Mit Hilfe von den Lagerböcken 62 entsprechenden Lagerstangen können in den Abstellbereichen 34 und 36 schließlich sogenannte "Hotels" realisiert werden, in denen eine Mehrzahl von Mikrotitrationsplatten 30 in Übereinander- anordnung aufgenommen werden können.
Beim Transport ruht die Mikrotitrationsplatte 30 auf einer oberen Fläche 60d der Schenkel 60a, 60b und 60c des Gabelrahmens 60. Um ein unbeabsichtigtes Herabrutschen der Mikrotitrationsplatte 30 von dem Gabelrahmen 60 verhindern zu können, sind diese Schenkel an ihren Außenseiten mit einem Steg 60e versehen, der sich in dem dargestellten Ausführungsbeispiel über die gesamte Länge der Schenkel 60a und 60b und in den Endbereichen des Basisschenkels 60c erstreckt.
Der Gabelrahmen 60 ist eines der wichtigsten Module für Laborroboter, da die sichere Bewegung von Mikrotitrationsplatten, die als Reaktionsgefäße, als Probengefäße und andere Aufgaben benutzt werden, eine wichtige Aufgabe bei der Automatisierung von Laborprozessen darstellt.
Als weiteres Beispiel einer bei dem erfindungsgemäßen Labor-Roboter 1 0 einsetzbaren Funktionseinheit ist in Fig. 6 grobschematisch ein Pipettenspitzenhalter 70 dargestellt. Unterhalb der Zapfenhülse 52 ist eine Andockeinheit 72 zur lösbaren Aufnahme von Pipettenspitzen 74 angeordnet. Ein von einer (nicht dargestellten) Pipettiereinheit kommender Schlauch 76 mündet in die untere Fläche 72a der Andockeinheit 72. Der von der Greif- Vorrichtung 26, 1 26 ergriffene Pipettenspitzenhalter 70 bildetzusammen mit dem Roboterarm 1 8 bzw. 1 1 8 einen herkömmlichen Pipettier-Roboter. Daher brauchen der genaue Aufbau und die genaue Funktion der Andockeinheit 72 hier nicht näher erläutert zu werden.
Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Automatisierung von Laborprozessen ist die Magnetseparation. In der Molekularbiologie werden häufig mit bestimmten Reagenzien beschichtete Magnetpartikel als Festphase benutzt. Die Magnetpartikel besitzen dabei in der Regel einen Durchmesser von zwischen etwa 0, 5 μm und etwa 50 μm und befinden sich in dem Probenvolumen, das einen Inhalt in der Größenordnung von 1 ml bis 500 ml, vorzugsweise 30 ml bis 1 00 ml, haben kann, üblicherweise in Suspension.
Bei der Magnetseparation geht es nun darum, diese Magnetpartikel an den Wandungen des Probengefäßes abzuscheiden, um anschließend die im Probenvolumen zurückbleibenden Überstände beispielsweise durch die vorstehend beschriebene Pipettier-Funktionseinheit 70 entfernen zu können. Hierzu muss das Reaktionsgefäß an einen Magneten, in der Regel einen Permanentmagneten, beispielsweise aus Neodyn, herangeführt werden. Derartige auch für den Einsatz bei Verbundgefäßen geeignete Magnetsysteme können beispielsweise von der Anmelderin bezogen werden. Ferner sei auf die WO-A-92/04961 verwiesen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Labor- Roboters 1 0 können die Mikrotitrationsplatten 30 problemlos auf einen solchen Magnetseparator gestellt werden. Nach dem Abpipettieren der Überstände können die Mikrotitrationsplatten 30 dann zum Waschen der Magnetpartikel wieder in einen Abstellbereich 34, 36 zurücktransportiert werden.
Eine weitere Variante der Magnetseparation ist in Fig. 7a dargestellt, welche zur Erläuterung des Aufbaus und der Funktion einer Magnetseparations- Funktionseinheit 80 dient. Unterhalb ihrer Angriffseinheit 50 weist die Magnetseparations-Funktionseinheit 80 einen Permanentmagneten 82 auf, der beispielsweise aus Neodyn gefertigt sein kann. Dieser Permanentmagnet 82 kann mit Hilfe des Roboterarmes 1 8 unter der Steuerung/Regelung durch die Steuereinheit 22 an den oberen Bereich 84a eines Reaktionsgefäßes 84 angenähert werden. Dort verharrt er für eine gewisse Zeit, die stark vom Durchmesser des Reaktionsgefäßes abhängt und üblicherweise in der Größenordnung von 1 0 Sekunden bis 5 Minuten liegt. Danach kann der Permanentmagnet 82 in einer Mehrzahl von Schritten entlang eines Fahrweges 86 bewegt werden, wobei er immer wieder verharrt, um sicherzu- stellen, dass alle bislang aufgesammelten Magnetpartikel an der Wandung des Reaktionsgefäßes nachgerutscht sind. Auf diese Weise befinden sich am Ende des Fahrwegs 86 alle Magnetpartikel in der Spitze 84b des Reaktionsgefäßes 84.
Wie in Fig. 7b grobschematisch dargestellt ist, kann die Magnetseparations- Funktionseinheit 1 80 auch eine Mehrzahl von Permanentmagneten 1 82 aufweisen, die in einer Halterung 1 88 um eine Öffnung 1 88a für das Reaktionsgefäß herum angeordnet sind. Auch mit diesem Magnetseparator 1 80 kön- nen die Magnetpartikel am Boden des Reaktionsgefäßes gesammelt werden.
Schließlich ist in Fig. 8 eine Barcode-Leseeinheit 90 dargestellt, welche einen an der Angriffseinheit 50 angebrachten Barcode-Leser 92 umfasst. Die den Barcode-Leser 92 mit der Steueeinheit 22 verbindenden Datenleitungen sind in Fig. 8 der Übersichlichkeit halber nicht gezeigt. Barcode-Leser spielen bei der Automatisierung von Laborprozessen eine große Rolle, da die Kennzeichnung von Proben mittels Barcodes immer üblicher wird, um eine eindeutige Identifizierung zu ermöglichen. In komplexen Roboterumgebungen ist es daher erforderlich, die von einem Barcode-Leser 92 bereitgestellten Informationen an die Steuereinheit, die beispielsweise von einem Computer, etwa einem PC, gebildet sein kann, zu übermitteln und dort bei der Steuerung der Bewegungen des Roboterarms 1 8 bzw. 20 sowie der weiteren Prozessabläufe zu berücksichtigen. Nur so kann sichergestellt werden, dass stets die richtige Probe der richtigen Behandlung unterzogen wird.
Beispiele
1 .) Bindung vonΛ-Hindlll-Marker-DNAan Magnetpartikel, beschichtet mit
Carboxylgruppen, als Adsorber und magnetischer Abscheidung.
0,5 μg Λ-Hindlll-Marker-DNA in 1 0 μl bidest. Wasser wurden in einer Thermosprint-Platte [Fa. Innova, Mannheim] mit einer Arbeitslösung hergestellt aus 250 μg Partikeln aus Polyvinylalkohol (hergestellt nach EP 0 843591) in 5μl bidest. Wasser, 5 μl Proteinase K-Lösung [1 373196, Fa. Röche, Mannheim] und 130μl BILATEST-Lysepuffer 1 (SDS) bestehend aus 5% Natriumdodecylsulfat [L4390, Fa. Sigma, München], 100 mM Tris/HCI [T2584, Fa. Sigma, München], 10 mM EDTA [E5134, Fa. Sigma, München], 0% bis 80% Ethanol [5054.1, Fa. Roth, Karlsruhe] versetzt.
Anschließend werden die Partikel mit einem Magneten abgetrennt, der Überstand abgenommen und die Partikel mit 150μl 80% Ethanol [5054.1, Fa. Roth, Karlsruhe] in bidest. Wasser gewaschen. Dieser Vorgang wird einmal wiederholt; danach werden die Partikel in 150 μl BILATEST- Elutionspuffer bestehend aus 10 mM Tris/HCI pH 7,0 [s.o.] und 1 mM EDTA [s.o.] resuspendiert, bei 65°C für 5 min inkubiert und mit einem Magneten wie zuvor abgetrennt. Die gereinigte Nukleinsäure wird im Überstand abgenommen. Die Analyse in einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [A9311, Fa. Sigma, München]) ergibt ein Bild wie Fig.9.
Fig.9
Spur Inhalt
1, 2 Eluat aus Beispiel 1 1, Lysepuffer mit 0% Ethanol
3, 4 Eluat aus Beispiel 11, Lysepuffer mit 10% Ethanol
5, 6 Eluat aus Beispiel 11 , Lysepuffer mit 20% Ethanol
7, 8 Eluat aus Beispiel 11 , Lysepuffer mit 30% Ethanol
9, 10 Eluat aus Beispiel 11 , Lysepuffer mit 40% Ethanol
11, 12 Eluat aus Beispiel 11 , Lysepuffer mit 50% Ethanol
13, 14 Eluat aus Beispiel 11, Lysepuffer mit 60% Ethanol
15, 16 Eluat aus Beispiel 11 , Lysepuffer mit 70% Ethanol
17, 18 Eluat aus Beispiel 11, Lysepuffer mit 80% Ethanol
M Marker (Λ-Hindlll): .23,1 |9,4|6,6|4,4|2, 312,010,56 KB
Die Bindung der DNA an die Magnetpartikel ist deutlich abhängig von der Ethanol-Konzentration, unter 50 % Ethanolkonzentration ist kaum Bindung zu beobachten. 2.) Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe mit Partikeln, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und Zentrifugation.
Zunächst wird für einen Testansatz eine Arbeitslöung hergestellt aus 250 μg Partikeln aus Polyvinylalkohol (hergestellt nach EP 0 843 591 ) in 5 μl bidest. Wasser, 5 μl Proteinase K-Lösung [1 373 1 96, Fa. Röche, Mannheim] und 1 30 μl BILATEST-Lysepuffer I (SDS) bestehend aus 5 % Natriumdodecylsulfat [L4390, Fa. Sigma, München], 1 00 mM Tris/HCI [T2584, Fa. Sigma, München], 10 mM EDTA [E51 34, Fa. Sigma, München], 50 % Ethanol [5054.1 , Fa. Roth, Karlsruhe].
Für einen Testansatz werden 1 08 Hefe-Zellen (Saccharomyces cerevisiae) in 1 0 μl Volumen in einer Thermosprint-Platte [Fa. Innova, Mannheim] mit 1 40 μl dieser Arbeitslösung versetzt und 1 5 min. bei 37 °C inkubiert. Anschließend werden die Partikel in einer Zentrifuge [Nr. 581 0R; Fa. Eppendorf, Hamburg] für 2 min , 1 000 rpm in einem Mikrotitrationsplattenrotor [Nr. A-4-62; Fa. Eppendorf, Hamburg] zentrifugiert, der Überstand abgenommen und die Partikel mit 1 50 μl 80 % Ethanol [5054. 1 , Fa. Roth, Karlsruhe] in bidest. Wasser gewaschen. Dieser Vorgang wird einmal wiederholt; danach werden die Partikel in 1 50 μl BILATEST-Elutionspuffer bestehend aus 1 0 mM Tris/HCI pH 7,0 [s.o.] und 1 mM EDTA [s.o.] resuspendiert, bei 65 °C für 10 min inkubiert und durch Zentrifugation wie zuvor abgetrennt. Die gereinigte Nukleinsäure wird im Überstand abgenommen . Die Analyse in einem Standard- Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [A931 1 , Fa. Sigma, München]) ergibt ein Bild wie Fig. 1 0.
Fig. 10 Spur Inhalt
1 Eluat aus Beispiel 2 2 Wiederholung Spur 1
M Marker (Λ-Hindlll) : 23, 1 | 9,41 6,6 14,41 2,3 1 2,010,56 KB 3.) Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und magnetischer Abscheidung.
Beispiel 2 wurde wiederholt, statt der Zentrifugation wurden die Partikel jedoch mit einem Dauermagnet [Fa. Rheinmagnet, Neunkirchen] abgetrennt.
Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.] analysiert und in Fig. 1 1 dargestellt.
Fig. 1 1
Spur Inhalt
M Marker M-Hindlll) : 23, 1 1 9,41 6,614,41 2,3 1 2,010,56 KB
1 Eluat aus Beispiel 3
2 Wiederholung Spur 1
4.) Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und magnetischer Abscheidung.
Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei die Elution nicht bei 65 °C, sondern bei Raumtemperatur durchgeführt wurde.
Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.] analysiert und in Fig. 1 2 dargestellt.
Fig. 12 Spur Inhalt
1 Eluat aus Beispiel 4 2 Wiederholung Spur 1
M Marker M-Hindlll) : 23, 1 1 9,41 6,6 i 4,41 2,3 1 2,010,56 KB 5.) Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und magnetischer Abscheidung.
Beispiel 3 und 4 wurden im direkten Vergleich wiederholt.
Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.]) analysiert und in Fig. 1 3 dargestellt.
Fig. 13 Spur Inhalt
M Marker M-Hindlll) : 23, 1 1 9,4 | 6,614,41 2,3 1 2,01 0, 56 KB 1 , 2 Eluat aus Beispiel 5, Elution bei RT 3, 4 Eluat aus Beispiel 5, Elution bei 65 °C
Die Elution bei RT führt zu einer geringeren Elution von kleineren Nukleinsäure-Molekülen, z.B. RNA (die unteren beiden Banden in Spur 3 und 4) . Diese Selektivität kann zur Trennung von verschiedenen Nukleinsäuremolekülen ausgenutzt werden.
6.) Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und magnetischer Abscheidung.
Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei Lysepuffer mit SDS oder mit CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid, 91 61 .1 , Fa. Roth, Karlsruhe) verglichen wurden, jeweils mit 50 % Ethanol oder ohne Ethanol. Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.]) analysiert und in Fig. 1 4 dargestellt. Fig. 14
Spur Inhalt
M Marker M-Hindlll) : 23, 1 | 9,41 6,6 j 4,41 2,3 1 2,010,56 KB
1 , 2 Eluat aus Beispiel 6, Lysepuffer mit 5 % SDS 3, 4 Eluat aus Beispiel 6, Lysepuffer mit 5 % SDS und 50 % Ethanol
5, 6 Eluat aus Beispiel 6, Lysepuffer mit 5 % CTAB
7, 8 Eluat aus Beispiel 6, Lysepuffer mit 5 % CTAB und 50 % Ethanol
CTAB kann statt SDS eingesetzt werden, ohne Ethanol findet jedoch in beiden Fällen keine Bindung der genomischen DNA statt. In Kontrollversuchen wurde gezeigt, dass der Zellauf schluss auch ohne Ethanol erreicht wird, die geringe Ausbeute bei den Proben ohne Ethanol ist daher auf die geringe Bindung der DNA in Abwesenheit von Ethanol zurückzuführen.
7.) Isolierung von Nukleinsäuren aus EDTA-Kaninchenvollblut mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und Guanidiniumthiocynat-Lösung
Zunächst wird für einen Testansatz eine Arbeitslösung hergestellt aus 250 μg Partikeln aus Polyvinylalkohol (hergestellt nach EP 0 843 591 ) in 5 μl bidest. Wasser, 5 μl Proteinase K-Lösung ( 1 373 1 96, Fa. Röche, Mannheim) und 1 30 μl BILATEST-Lysepuffer II (Gu-SCN) bestehend aus 6 M Guanidiniumthiocynat [G9277, Fa. Sigma, München], 1 00 mM Tris/HCI [T2584, Fa. Sigma, München], 1 mM EDTA [E51 34, Fa. Sigma, München], 2,5 % Natriumlaurylsulfat (L91 50 Fa. Sigma, München), pH 7,0. 1 0 μl EDTA-Kaninchenvollblut werden mit 1 40 μl der zuvor beschriebenen Arbeitslösung versetzt und 1 5 min bei 37 °C verschlossen inkubiert. Anschliessend werden die Partikel mit einem Dauermagnet auf den Boden gezogen und der Überstand abgenommen. Die Partikel werden mit 1 50 μl 80 % Ethanol [5054.1 , Fa. Roth, Karlsruhe] in bidest. Wasser gewaschen. Dieser Vorgang wird einmal wiederholt; danach werden die Partikel in 1 50 μl BILATEST-Elutionspuffer bestehend aus 10 mM Tris/HCI pH 7,0 [s.o.] und 1 mM EDTA [s.o.] resuspendiert, bei 65 °C für 10 min inkubiert, wie zuvor abgetrennt und die gereinigte Nukleinsäure im Überstand abgenommen. Die Analyse in einem Standardagaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [Fa. Sigma, München] ergibt ein Bild wie Fig. 1 5.
Fig. 1 5 Spur Inhalt M Marker M-Hindlll): 23, 1 1 9,41 6,6 14,41 2,31 2,010,56 KB
1 Eluat aus Beispiel 7 unverdünnt
2 Wiederholung Spur 1
3 Eluat aus Beispiel 7 1 : 10 verdünnt
4 Wiederholung Spur 3
8.) Isolierung von Nukleinsäuren aus einem Gemisch von EDTA- Kaninchenvollblut und Hefezellen mittels Magnetpartikeln, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber.
1 08 Hefezellen in 1 0 μl EDTA-Kaninchenblut wurden sowohl wie Beispiel 3 als auch wie Beipiel 7 behandelt. Die Analyse in einem Standardagaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o]) ergibt ein Bild wie Fig. 1 6.
Fig. 16
Spur Inhalt
1 Eluat aus Beispiel 8 mit Lysepuffer aus Beispiel 2
2 Wiederholung Spur 1 3 Eluat aus Beispiel 8 mit Lysepuffer aus Beispiel 7
4 Wiederholung Spur 3
M Marker M-Hindlll): 23, 1 19,4| 6,614,412,3 1 2,0 j 0,56 KB Aus dieser Darstellung ergibt sich der Hinweis, dass sich die Hefezellen mit dem SDS-Lysepuffer aus Beispiel 1 und 2 selektiv lysieren lassen, während Vollblut sich selektiv mit dem Guanidin-Puffer aus Beispiel 4 lysieren lässt.
9.) Isolierung von Nukleinsäuren aus humanem EDTA-Vollblut mittels Magnetpartikein, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber und Guanidiniumthiocynat-Lösung
Beispiel 7 wurde mit humanem Vollblut wiederholt. Die Analyse in einem Standardagaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [Fa. Sigma, München]) ergibt ein Bild wie Fig. 1 7.
Fig. 17 Spur Inhalt
1 Eluat aus Beispiel 9 mit Lysepuffer aus Beispiel 7
2 Wiederholung Spur 1
M Marker M-Hindlll) : 23, 1 1 9,4 j 6,6 14,41 2,3 1 2,01 0,56 KB
3 Eluat aus Beispiel 9 mit Lysepuffer aus Beispiel 2 4 Wiederholung Spur 3
10.) Isolierung von Nukleinsäuren aus der humanpathogenen Hefe Candida albicans mittels Magnetpartikein, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber
Der Versuch aus Beispiel 4 wurde mit 1 08 Zellen der humanpathogenen Hefe Candida albicans wiederholt. Diese Hefe zeichnet sich durch eine besonders starke und schwer zu lysierende Zellwand aus. Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.] analysiert und in Fig. 1 8 dargestellt. Fig. 18 Spur Inhalt
M Marker M-Hindlll) : 23, 1 1 9,41 6,614,41 2,3 1 2,010, 56 KB
1 Eluat aus Beispiel 10
2 Wiederholung Spur 1
1 1 .) Isolierung von Nukleinsäuren aus dem gram-positiven Bakterium Lactococcas lactis mittels Magnetpartikein, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber
Der Versuch aus Beispiel 4 wurde mit dem gram-positiven Bakterium Lactococcus lactis wiederholt. Gram-positive Bakterien besitzen ebenfalls eine besonders starke und schwer zu lysierende Zellwand. Es wurden Lysezeiten von 1 min bis 1 5 min verwendet.
Als Ergebnis wurde das Eluat mit einem Standard-Agaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [s.o.] analysiert und in Fig. 1 9 dargestellt.
Fig. 19 Spur Inhalt
M Marker M-Hindlll): 23, 1 1 9, j 6,614,4 | 2,3 1 2,010,56 KB
1 , 2 Eluat aus Beispiel 10, Lyse 1 min
3, 4 Eluat aus Beispiel 1 0, Lyse 5 min
5, 6 Eluat aus Beispiel 1 0, Lyse 10 min 7, 8 Eluat aus Beispiel 1 0, Lyse 1 5 min
Der Aufschluss verläuft sehr schnell, bereits nach 1 min erhält man eine hohe DNA-Ausbeute. Dies entspricht auch den Beobachtungen bei unseren Versuchen mit den Hefen, die ebenfalls schon nach 1 min aufgeschlossen werden konnten. 12.) Isolierung von Nuleinsäuren aus Hefe mittels Agarose-Partikeln beschichtet mit Glutaminsäure
Der Versuch aus Beispiel 4 wurde mit Agarosepartikeln, beschichtet mit Glutaminsäure (G2759, Fa. Sigma, München) wiederholt. Das Ergebnis war ähnlich dem in Fig. 1 2 gezeigten Ergebnis von Beispiel 4, allerdings war die Ausbeute wesentlich geringer.
13.) PCR-Experimente a) Hefe
Mit der isolierten Hefe-DNA aus Beispiel 3 wird eine PCR (US 4 683 1 95) mit den Primern
KV80: 5'-GCG GAT CCT TAA GTC CAA TCG TCA AAA TT-3' KV102: 5'-GCG AAT TCG TAT CTT CTT TGC CCA AGG AA-3'
[Fa. MWG Biotech AG, Ebersberg bei München] durchgeführt. Mit diesen Primern wird ein 496 bp-Fragment aus dem BCYI-Gen der Hefe amplifiziert. Die PCR-Ansätze enthalten die folgenden Bestandteile:
0, 5 μL Primer-Lösung 1 (50 pmol μL"1 in H2O bidest)
0, 5 μL Primer-Lösung 2 (50 pmol μL"1 in H2O bidest)
2 μL dNTP-Lösung, Konzentration der Nukleotide je 5 mM (Eurogentec, Seraing, Belgien)
4 L MgCI2-Lösung 25 mM (Eurogentec)
5 μL 1 0 x PCR-Puffer (Eurogentec)
0, 5 u Taq-Polymerase (Eurogentec) bis zu 30 μL DNA- oder Probenlösung
in einem Gesamtvolumen von 50 μL. Während des Ansatzes wird die PCR- Platte auf 4°C gekühlt. Nach Zugeben der letzten Lösung werden die Proben einmal mit einer Pipette gemischt. Die PCR wird in Thermosprint- Platten [Fa. Innova GmbH, Mannheim) im Primus 96 Plus [MWG Biotech AG, München] durchgeführt. Das Programm umfasst die folgenden Schritte:
Deckelheizung auf 1 1 0°C
3 min 94°C 27 Zyklen mit 30 s 94°C 30 s 50°C - 2 min 72 °C
5 min 72°C Kühlung auf 4°C Nach der PCR werden die Proben mit 1 5 - 20% Gel-Ladepuffer mit EDTA [Sigma, München] versetzt. Die Amplifikate wurde auf einem Standardagarosegel ( 1 ,6 %) analysiert (in Fig. 20 dargestellt) .
Fig. 20
Spur Inhalt
1 30 μL DNA-Lösung
2 Wiederholung von Spur 1
3 1 0 μL DNA-Lösung
4 Wiederholung von Spur 3
5 1 μL DNA-Lösung
6 Wiederholung von Spur 5
7 0, 1 μL DNA-Lösung
8 Wiederholung von Spur 7
9 0,01 μL DNA-Lösung
1 0 Wiederholung von Spur 9
1 1 0,001 μL DNA-Lösung
1 2 Wiederholung von Spur 1 1
b) Hu imanblut Mit der isolierten Human-DNA aus Beispiel 9 wird eine PCR (US 4 683 1 95) mit den Primern ß-Af: 5'-TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA-3' ß-Ar: 5'-CTA GAA GCA TTT GCC GTG GAC GAT GGA GGG-3'
[Fa. MWG Biotech AG, Ebersberg bei München] durchgeführt. Mit diesen Primern wird ein 600 bp-Fragment aus dem ß-Actin-Gen des Menschen amplifiziert.
Die PCR-Ansätze werden wie unter a) beschrieben vorgenommen. Nach der PCR werden die Proben mit 1 5 - 20 % Gel-Ladepuffer mit EDTA [Fa. Sigma, München] versetzt. Die Amplifikate wurde auf einem Standardagarosegel ( 1 ,6 %) analysiert (in Fig. 21 dargestellt) .
Fig. 21 Spur Inhalt
1 30 μL DNA-Lösung
2 Wiederholung von Spur 1
3 1 0 μL DNA-Lösung
4 Wiederholung von Spur 3 5 1 μL DNA-Lösung
6 Wiederholung von Spur 5
7 0, 1 μL DNA-Lösung
8 Wiederholung von Spur 7
9 0,01 μL DNA-Lösung 1 0 Wiederholung von Spur 9
1 1 0,001 μL DNA-Lösung
1 2 Wiederholung von Spur 1 1 M Marker 1 00 bp-Leiter
14) Isolierung von Nukleinsäuren aus humanem EDTA-Vollblut mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber. Bei Blutprobenvolumen über 25μl erhöht ein vorgeschalteter Erythrozytenlyse-Schritt die Ausbeute an DNA wesentlich. Zur Erythrozytenlyse werden die Vollblutproben (EDTA-, Citrat- oder Heparin- Vollblut) vor der DNA-Isolierung im Verhältnis 1 : 1 ,4 mit Erythrozytenlysepuffer ( 1 0mM Tris-HCI pH7, 5 [T2584, Fa. Sigma, München], 300mM Saccharose [9097, Fa. Roth, Karlsruhe], 5mM MgCI2 [M2670, Fa. Sigma, München], 1 % Triton X-1 00 [3051 , Fa. Roth, Karlsruhe]) gemischt und 30s bei 1 4.000g abzentrifugiert. Das Pellet wird einmal in demselben Puffer resuspendiert und anschliessend wieder abzentrifugiert.
Zur DNA-Isolierung wird zunächst eine Arbeitslösung hergestellt aus 250μg Partikeln aus Polyvinylalkohol, hergestellt nach EP 0 843 591 in 5 μl bidest. Wasser, 5 μl Proteinase K ([1 3731 96, Fa. Röche, Mannheim], 20mg ml"1 in 1 0mM Tris-HCI pH7[s. o.]) und 1 30 μl BILATEST-Lysepuffer II (Gu-SCN) bestehend aus 3 M Guanidiniumthiocynat [G9277, Fa. Sigma, München], 3% Natriumlauroylsulfat [L91 50, Fa. Sigma, München], 1 00 mM Tris/HCI pH7,0 [s. o.], 1 mM EDTA [E51 34, Fa. Sigma, München], 50% Ethanol [9065, Fa. Roth, Karlsruhe] .
1 0 l bzw. 25μl humanes Vollblut (EDTA-, Citrat- oder Heparin-Vollblut) werden mit 1 40 μl der zuvor beschriebenen Arbeitslösung versetzt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Bei Probenvolumen von 50μl und 1 00μl wird zunächst die oben beschriebene Erythrozytenlyse durchgeführt, das Pellet wird nach der zweiten Zentrifugation in 140μl der zuvor beschriebenen Arbeitslösung resuspendiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend werden die Partikel mit einem Dauermagnet an die Wand gezogen und der Überstand abgenommen. Die Partikel werden mit 1 50 μl
Waschpuffer ( 10mM Tris-HCI pH7, 5 [s. o.], 1 mM EDTA [s. o.], 80%
Ethanol [s. o.]) gewaschen, wobei der DNA-Magnetpartikelkomplex nicht resuspendiert wird.. Dieser Vorgang wird mindestens einmal wiederholt; danach wird der Komplex 5min luftgetrocknet, um Ethanolreste zu entfernen.
Zur Elution werden die Magnetpartikel in 1 50 μl BILATEST-Elutionspuffer ( 1 0 mM Tris/HCI pH 7,0 [s.o.], 1 mM EDTA[s.o.]) oder Wasser resuspendiert, bei 65 °C für 5 min inkubiert und wie zuvor abgetrennt. Die gereinigt Nukleinsäure wird im Überstand abgenommen.
Die Analyse in einem Standardagaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [Fa. Sigma, München] ergibt ein Bild wie Fig. 22.
Spur Inhalt
M Marker (λ-Hind\\\) : 23, 1 | 9,4 | 6,6 | 4,4 | 2,3 | 2,0 j 0,56 KB 1 Eluat (Lysezeit 1 min) aus Beispiel 1 unverdünnt
2 Wiederholung Spur 1
3 Eluat (Lysezeit 5min) aus Beispiel 1 unverdünnt
4 Wiederholung Spur 3
5 Eluat (Lysezeit 1 0min) aus Beispiel 1 unverdünnt 6 Wiederholung Spur 5
7 Eluat (Lysezeit 1 5min) aus Beispiel 1 unverdünnt
8 Wiederholung Spur 7
15) Automatisierte Isolierung von Nukleinsäuren aus humanem EDTA-Vollblut mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber, und direkter Verwendung der Magnetpartikel (ohne Elution) als PCR-Template (HLA-SSP-PCR) unter Einsatz des BILATEC AUTOSPRINT- Pipettierroboters.
Die automatisierte DNA-Isolierung aus EDTA-Vollblut wird mit dem BILATEST DNA 2-Reagenziensatz unter Einsatz des BILATEC AUTOSPRINT- Pipettierroboters durchgeführt. Bei Probenvolumen über 25μl wird zur Erhöhung der DNA-Ausbeute ein Erythrozytenlyse-Schritt vorgeschaltet. Die Vollblutproben (EDTA-, Citrat- oder Heparin-Vollblut) werden hierzu vor der DNA-Isolierung im Verhältnis 1 : 1 ,4 mit Erythrozytenlysepuffer ( 1 0mM Tris-HCI pH7,5 [T2584, Fa. Sigma, München], 300mM Saccharose [9097, Fa. Roth, Karlsruhe], 5mM MgCI2 [M2670, Fa. Sigma, München], 1 % Triton X-1 00 [3051 , Fa. Roth, Karlsruhe]) gemischt und 30s bei 1 4.000g abzentrifugiert. Optional wird das Pellet einmal in demselben Puffer resuspendiert und anschliessend wieder abzentrifugiert. Die Schritte der Erythrozytenlyse werden zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch manuell durchgeführt.
Zur DNA-Isolierung wird zunächst eine Arbeitslösung hergestellt aus 250μg Partikeln aus Polyvinylalkohol, hergestellt nach EP 0 843 591 in 5 μl bidest. Wasser, 5 μl Proteinase K ([ 1 3731 96, Fa. Röche, Mannheim], 20mg ml"1 in 1 0mM Tris-HCI pH7[s. o.]) und 1 30 μl BILATEST-Lysepuffer II (Gu-SCN) bestehend aus 3 M Guanidiniumthiocynat [G9277, Fa. Sigma, München], 3% Natriumlauroylsulfat [L91 50, Fa. Sigma, München], 100 mM Tris/HCI pH7,0 [s. o.], 1 mM EDTA [E51 34, Fa. Sigma, München], 50% Ethanol [9065, Fa. Roth, Karlsruhe]. Das Mischen der Arbeitslösung wird von dem Pipettierroboter AUTOSPRINT übernommen, der die Reagenzien aus den Vorratsflaschen im Reagenzienblock (Position 4) entnimmt und in einem speziellen Gefäss im selben Block mischt. Die Lösungen 1 (Magnetpartikel) und 2 (Proteinase K) werden vor der Entnahme mehrfach durch Aufnahme und Abgabe der Flüssigkeit gemischt. Die Lysemischung wird anschliessend vor der Verteilung ebenfalls auf dieselbe Weise gemischt.
1 0 μl bzw. 25μl humanes Vollblut (EDTA-, Citrat- oder Heparin-Vollblut) werden durch den AUTOSPRINT aus der Probenposition (7) entnommen und in die Arbeitsplatte (Position 5) gegeben. Anschliessend werden die Ansätze 5 min bei Raumtemperatur inkubiert (Lyse) . Bei Probenvolumen von 50μl und 1 00μl wird zunächst die oben beschriebene Erythrozytenlyse durchgeführt. Das Pellet nach der zweiten Zentrifugation wird durch den AUTOSPRINT in 1 40μl der zuvor beschriebenen Arbeitslösung resuspendiert (mehrfache Aufnahme und Abgabe der Flüssigkeit), in die Arbeitsplatte transferiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend werden die Partikel mit einem Dauermagnet an die Wand gezogen. Hierzu wird die Platte vom AUTOSPRINT auf den Magnetseparator überführt (Position 6), wobei der spezielle systemeigene Plattengreifer verwendet wird. Nach der Abtrennung der Magnetpartikel ( 1 min) wird der Überstand abgesaugt. Die Platte wird wieder auf Position 5 transferiert, anschliessend werden werden 1 50 μl Waschpuffer ( 1 0mM Tris-HCI pH7,5 [s. o.], 1 mM EDTA [s. o.], 80% Ethanol [s. o.]) zu den Partikeln gegeben, wobei der DNA-Magnetpartikelkomplex nicht zerstört wird.. Dieser Vorgang wird mindestens einmal wiederholt; danach wird der Komplex 5min luftgetrocknet (auf dem Magnetseparator, Position 6), um Ethanolreste zu entfernen.
Nach der Lufttrocknung wird die Arbeitsplatte auf Position 5 transferiert. Die Partikel werden mit 1 00μl Elutionspuffer ( 1 0 mM Tris/HCI pH 7,0 [s.o.], 1 mM EDTA[s.o.]) oder Wasser versetzt und 3min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschliessend werden die Partikel durch mehrfache Aufnahme und Abgabe resuspendiert und direkt als PCR-Template eingesetzt. Die thermische Behandlung zur Elution sowie die Abtrennung der Magnetpartikel entfallen bei diesem Versuch, was zu einer wesentlichen Zeitersparnis führt. Die Magnetpartikel beeinflussen bis zu einer Endkonzentration im PCR- Ansatz von 1μg μl'1 die PCR-Reaktion nicht.
Die Analyse in einem Standardagaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [Fa. Sigma, München] ergibt ein Bild wie Fig. 23.
Erklärung zu Fig. 23:
Spur Inhalt M Marker (λ-Hind\\\) : 23, 1 j 9,41 6,61 4,4 | 2,31 2,0 | 0, 56 KB
1 Beads nach Elution aus Beispiel 2, 1 0μl Blut
2 Beads nach Elution aus Beispiel 2, 25μl Blut
3 Beads nach Elution aus Beispiel 2, 50μl Blut, Erythrozytenlyse 4 Beads nach Elution aus Beispiel 2, 1 00μl Blut Erythrozytenlyse
6 Eluat aus Beispiel 2, 1 0μl Blut
6 Eluat aus Beispiel 2, 25μl Blut
7 Eluat aus Beispiel 2, 50μl Blut, Erythrozytenlyse
8 Eluat aus Beispiel 2, 1 00μl Blut Erythrozytenlyse 9 Beads ohne Elution aus Beispiel 2, 10μl Blut
1 0 Beads ohne Elution aus Beispiel 2, 25μl Blut
1 1 Beads ohne Elution aus Beispiel 2, 50μl Blut, Erythrozytenlyse
1 2 Beads ohne Elution aus Beispiel 2, 1 00μl Blut Erythrozytenlyse
Mit aus 50μl EDTA-Vollblut isolierter DNA wurde eine HLA-DRB-PCR durchgeführt (Biotest-Testkit) . Bei der DNA-Isolierung wurde zunächst eine Erythrozytenlyse durchgeführt, die Magnetpartikelmenge wurde auf 1 00μg reduziert. Je 10μl PCR-Reaktion wurden 3μl Lösung mit resuspendierten Magnetpartikein eingesetzt (Gesamtvolumen der resuspendierten Magnetpartikel 100μl) . Der Ansatz erfolgt so, dass die DNA mit einem fertigen Mastermix und Wasser gemischt wird und der entstandene Mix auf die PCR-Platte mit den getrockneten Primern verteilt wird. Dieser Schritt wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch manuell durchgeführt, soll aber auch automatisiert werden.
Die Analyse der PCR-Produkte (Programm nach der Vorschrift für den Biotest HLA-DRB-SSP-Kit) in einem Standardagaroseflachbettgel ( 1 ,6 % Agarose [Fa. Sigma, München] ergibt ein Bild wie Fig. 24.
Ablauf der automatisiserten DNA-Isolierunq aus humanem EDTA-Vollblut mit dem BILATEC AUTOSPRINT-Pipettierroboter Notwendige Vorbereitungsschritte:
a. Initialisieren des AUTOSPRINT-Roboters und der AUTOSPRINT
FOCUS-Software. b. Einsetzen der Racks mit Wechselspitzen (zur Vermeidung von Kontaminationen werden sterile Filterspitzen eingesetzt) und der THERMOSPRINT-Arbeitsplatte, Vorbereitung des Wechselspitzenabwurfs (Dekontaminationsbeutel), c. Einsetzen der BILATEST DNA 2-Lösungen in den Reagenzienblock (Position 4, Flaschen werden nach Vorlageschema verteilt. Der
Reagenzienblock nimmt je eine Flasche der Lösungen 1, 2, 3 oder 4 [je nach Probe] und 6 sowie zwei Flaschen der Lösung 5 auf. Ebenfalls im Reagenzienblock befindet sich die Flasche zum Mischen der gebrauchsfertigen Lyselösung durch den Roboter). d. Einsetzen der Proben (in einer THERMOSPRINT-Platte, bis zu 96 Proben gleichzeitig).
Das Probenvolumen kann bis zu 25μl EDTA-Vollblut betragen (bei vorgeschalteter Erythrozytenlyse kann das Ausgangsvolumen bis 100μl EDTA-Vollblut betragen; das Pellet nach der Erythrozytenlyse wird entweder manuell mit Wasser oder PBS resuspendiert [Volumen 25μl] oder vor der Verteilung der Proben vom AUTOSPRINT-Roboter in 50 - 100μl Elutionspuffer [Lösung 6] resuspendiert).
Ablauf der automastisierten DNA-Isolierunq:
Mischen der Lyselösung (für N Proben [N + 2] x 140//I Lyselösung).
1. Entnahme der Magnetpartikelsuspension mit frischer Wechselspitze.
Die Magnetpartikel (Position 4) werden zunächst durch fünfmalige Aufnahme und Abgabe des vollen Wechselspitzenvolumens resuspendiert, anschliessend wird die benötigte Menge ([N + 2] x 5 μl) entnommen und in das Gefäss für die Lyselösung (Position 4) überführt.
2. Entnahme der Proteinase K-Lösung mit frischer Wechselspitze. Die Lösung (Position 4) wird zunächst durch fünfmalige Aufnahme und Abgabe des vollen Wechselspitzenvolumens gemischt, anschliessend wird die benötigte Menge ([N + 2] x 5μl) entnommen und in das Gefäss für die Lyselösung (Position 4) überführt.
3. Entnahme des Lysepuffers mit frischer Wechselspitze (Position 4; benötigte Menge [N + 2] x 1 30μl) und Überführung in das Gefäss für die Lyselösung (Position 4).
4. Mischen der gebrauchsfertigen Lyselösung durch fünfmalige Aufnahme und Abgabe des vollen Wechselspitzenvolumens (es wird die Wechselspitze von Schritt 3. verwendet) .
Verteilen der Proben
5. Überführung mit einer frischen Wechselspitze je Probe von je 1 0 - 25μl Vollblut oder resuspendierten Erythrozytenlyse-Pellets aus der Probenplatte (Position 7) in die Arbeitsplatte (Position 5) . Die Proben werden vor der Aufnahme durch einmalige Aufnahme und Abgabe gemischt. Falls die Erythrozytenlyse-Pellets nicht manuell resuspendiert wurden, werden durch den AUTOSPRINT-Roboter die Erythrozytenlyse-Pellets durch fünfmalige Aufnahme und Abgabe in 50 - 1 00μl Lysepuffer (Position 4) resuspendiert und anschliessend mit der selben Wechselspitze in die Arbeitsplatte (Position 5) überführt.
Lyse der Proben
6. Mit einer frischen Wechselspitze wird die Lyselösung durch f ü n f m a l i g e A u f n a h m e u n d A b g a b e d e s v o l l e n Wechselspitzenvolumens gemischt, anschliessend werden je 140μl zu den Proben gegeben. Durch die Kombination von Geometrie der THERMOSPRINT-Platte und Abgabegeschwindigkeit des Roboters wird eine vollständige Mischung von Probe und Lyselösung erreicht. Die Wechselspitze kommt nicht in Kontakt mit der Probe und muss daher nicht gewechselt werden.
7. Lyse der Proben durch Inkubation für 5min bei Raumtemperatur.
Waschen der Magnetpartikel-DNA-Komplexe
8. Überführung der Arbeitsplatte von Position 5 auf den Magnetseparator (Position 6) .
9. 1 min Inkubation zur Abtrennung des Magnetpartikel-DNA- Komplexes.
1 0. Absaugen der Lyselösung. Der Roboter verwendet für jede Probe eine frische Wechselspitze, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Bei der Verarbeitung identischer Parallelproben (Probenvolumen grösser 25μl Vollblut bzw. 1 0Oμl Vollblut mit vorgeschalteter Erythrozytenlyse) kann der Spitzenwechsel entfallen. Das Absaugen erfolgt durch Aufsaugen von 1 60μl, 5s Wartezeit und anschliessendes Aufsaugen des restlichen Volumens aus der Spitze der THERMOSPRINT-Gefäße.
1 1 . Überführung der Arbeitsplatte von Position 6 auf Position 5. 1 2. Zugabe von je 1 60μl Waschpuffer. Die Wechselspitze kommt nicht in Kontakt mit der Probe und muss daher nicht gewechselt werden.
1 3. 1 min Inkubation.
14. Überführung der Arbeitsplatte von Position 5 auf den Magnetseparator (Position 6) . 1 5. 1 min Inkubation zur Abtrennung des Magnetpartikel-DNA- Komplexes. 1 6. Absaugen der Waschlösung. Der Roboter verwendet für jede Probe eine frische Wechselspitze, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Bei der Verarbeitung identischer Parallelproben (s. o.) kann der Spitzenwechsel entfallen. Das Absaugen erfolgtdurch Aufsaugen von
1 60 μl, 5s Wartezeit und anschliessendes Aufsaugen des restlichen Volumens aus der Spitze der THERMOSPRINT-Gefässe. 1 7. Überführung der Arbeitsplatte von Position 6 auf Position 5.
1 8. Zugabe von je 1 60μl Waschpuffer. Die Wechselspitze kommt nicht in Kontakt mit der Probe und muss daher nicht gewechselt werden.
1 9. 1 min Inkubation 20. Überführung der Arbeitsplatte von Position 5 auf den Magnetseparator (Position 6) .
21 . 1 min Inkubation zur Abtrennung des Magnetpartikel-DNA- Komplexes.
22. Absaugen der Waschlösung. Der Roboter verwendet für jede Probe eine frische Wechselspitze, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Bei der Verarbeitung identischer Parallelproben (s. o.) kann der Spitzen Wechsel entfallen. Das Absaugen erfolgt durch Aufsaugen von 1 60μl, 5s Wartezeit und anschliessendes Aufsaugen des restlichen Volumens aus der Spitze der THERMOSPRINT-Gefässe. 23. 5 min Inkubation bei Raumtemperatur zur Trocknung der Proben (Entfernen des Restethanols aus dem Waschpuffer) .
Resuspendierung der Magnetpartikel
24. Überführung der Arbeitsplatte von Position 6 auf Position 5. 25. Zugabe von je 1 0Oμl Elutionspuffer oder Wasser. Die Wechselspitze kommt nicht in Kontakt mit der Probe und muss daher nicht gewechselt werden.
26. Inkubation 3 min zur Anlösung der Magnetpartikel-DNA-Komplexe.
27. Resuspendierung der Magnetpartikel durch fünfmalige Aufnahme und Abgabe des gesamten Probenvolumens. Es wird für jede Probe eine frische Wechselspitze verwendet!
Die Magnetpartikelsuspension aus Schritt 26 kann direkt als PCR-Template eingesetzt werden (s. HLA-PCR; manuelle Verteilung oder automatisierter Ansatz der PRC-Reaktionen durch den AUTOSPRINT-Roboter) . 16) Isolierung von Nukleinsäuren aus Fleisch/Wurst mittels
Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber.
Zur DNA-Isolierung werden stecknadelkopfgrosse Fleisch- oder Wurstproben in 1 45 μl BILATEST-Lysepuffer X (Gu-SCN) bestehend aus 3 M G uanid in iumthiocyn at [G 9277, Fa . Sig ma , M ünchen] , 3 % Natriumlauroyisulfat [Fa. Sigma, München], 1 00 M Tris/HCI pH7,0 [s. o.] und 1 mM EDTA [E51 34, Fa. Sigma, München], und 5μl Proteinase K- Lösung ([1 3731 96, Fa. Röche, Mannheim; 20mg ml"1 in 1 0mM Tris-HCI pH7[s. o.]) mechanisch zerquetscht und 30min bei 65 °C in Eppendorf reaktionsgefässen geschüttelt.
Nach der Inkubation werden die Proben abzentrifugiert und der Überstand mit 1 50μl Ethanol [9065, Fa. Roth. Karlsruhe] und 250 μg Partikeln aus Polyvinylalkohol, hergestellt nach EP 0 843 591 , in 5 μl bidest. Wasser gemischt. Zur DNA-Bindung werden die Proben 5min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend werden die Partikel mit einem Dauermagnet auf den Boden gezogen und der Überstand abgenommen. Die Partikel werden mit 1 50 μl Waschpuffer ( 1 0mM Tris-HCI pH7,5 [s. o.], 1 mM EDTA [s. o.], 80% Ethanol [s. o.]) gewaschen, wobei der DNA-Magnetpartikelkomplex nicht resuspendiert wird.. Dieser Vorgang wird mindestens einmal wiederholt; danach wird der Komplex 5 min luftgetrocknet, um Ethanolreste zu entfernen.
Die Magnetpartikel werden in 1 00 μl Wasser resuspendiert. 2μl dieser Proben werden direkt oder nach Elution der DNA und Abtrennung der Partikel in einer PCR-Reaktion mit MT2 und MT1 1 -Primern eingesetzt (Gesamtvolumen des PCR-Ansatzes 50μl) . Die Analyse in einem Standardagaroseflachbettgel ( 1 ,6 % Agarose [Fa. Sigma, München] ergibt ein Bild wie Fig. 26. Spur Inhalt
M Marker (λ-Hind\\\) : 23, 1 1 9,41 6,6 1 4,41 2,3 1 2,01 0,56 KB
1 PCR-Produkt mit aus Salami isolierter DNA, Beads direkt eingesetzt
2 PCR-Produkt mit aus Salami isolierter DNA, DNA eluiert 3 PCR-Produkt mit aus Putenfleisch isolierter DNA, Beads direkt eingesetzt
4 PCR-Produkt mit aus Putenfleisch isolierter DNA, DNA eluiert
17) Isolierung von Nukleinsäuren aus Pflanzen mittels Magnetpartikel, beschichtet mit Carboxylgruppen, als Adsorber.
Das Pflanzenmaterial (Weizen-Blattstückchen) wird in 100 - 300 μl Extraktionspuffer mechanisch zerkleinert und der entstehende Extrakt durch Zentrifugation geklärt. 75 μl des klaren Überstandes werden mit einem Gemisch aus 10Oμg Magnetpartikein aus Polyvinylalkohol, hergestellt nach EP 0 843 591 in 75 μl Ethanol (9065, Fa. Roth, Karlsruhe) versetzt und gemischt. Das Gemisch wird zur DNA-Bindung 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend werden die Partikel mit einem Dauermagnet auf den Boden gezogen und der Überstand abgenommen. Die Partikel werden mit 1 50 μl Waschpuffer ( 10mM Tris-HCI pH7,5 [s. o.], I mM EDTA [s. o.], 80% Ethanol [s. o.]) gewaschen, wobei der DNA-Magnetpartikelkomplex nicht resuspendiert wird.. Dieser Vorgang wird mindestens zweimal wiederholt; danach wird der Komplex 5min luftgetrocknet, um Ethanolreste zu entfernen.
Die Magnetpartikel werden anschliessend in 10Oμl BILATEST-Elutionspuffer ( 1 0 mM Tris/HCI pH 7,0 [s.o.], 1 mM EDTA[s.o.]) oder Wasser resuspendiertund direkt in der PCR verwendet. Die Analyse der isolierten DNA in einem Standardagaroseflachbettgel (0,8 % Agarose [Fa. Sigma, München] ergibt ein Bild wie Fig. 27. Spur Inhalt
M Marker (λ-Hinά\\\): 23,119,4| 6,61 ,412,3 j 2,01 0,56 KB 1 Eluat aus Beispiel X unverdünnt

Claims

Ansprüche
1 . Labor-Roboter ( 1 0) mit wenigstens einem in einem vorbestimmten Arbeitsbereich ( 1 4) bewegbaren Roboterarm ( 1 8, 20), an welchem eine Greifvorrichtung (26) zum Ergreifen mindestens einer durch den Roboterarm ( 1 8, 20) zu bewegenden Funktionseinheit (60, 70, 80, 90) angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass an dem Roboterarm ( 1 8, 20) bzw. der Greifvorrichtung (26) ferner eine Orientiervorrichtung (48) vorgesehen ist, welche mit einer an der Funktionseinheit (60, 70, 80, 90) gewünschtenfalls vorgesehenen Gegenorientiervorrichtung (54) zusammenwirkt, um der Funktionseinheit (60, 70, 80, 90) und dem Roboterarm ( 1 8, 20) bzw. der Greifvorrichtung (26) eine vorbe- stimmte feste Relativorientierung zu verleihen.
2. Labor-Roboter nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und gewünschtenfalls dem Kennzeichen des Anspruchs 1 , dadurch gekennzeichnet, dass an dem Roboterarm ( 1 8, 20) bzw. der Greifvorrichtung (26) ferner eine Orientiervorrichtung (48) vorgesehen ist und dass wenigstens zwei Funktionseinheiten (60, 70, 80, 90) vorgesehen sind, wobei wenigstens eine der Funktionseinheiten (60, 70, 80, 90) eine Gegenorientiervorrichtung (54) aufweist, welche der am Roboterarm ( 1 8, 20) vorgesehenen Orientiervorrichtung (48) zusammenwirkt, um der Funktionseinheit (60, 70, 80, 90) und dem
Roboterarm ( 1 8, 20) bzw. der Greifvorrichtung (26) eine vorbestimmte feste Relativorientierung zu verleihen.
3. Labor-Roboter nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine der Vorrichtungen, nämlich die
Orientiervorrichtung oder die Gegenorientiervorrichtung, einen Orientierungsdorn (54) umfasst und dass die jeweils andere Vor- richtung, nämlich die Gegenorientiervorrichtung oder die Orientiervorrichtung, eine Aufnahme (48) für den Orientierungsdorn (54) umfasst.
4. Labor-Roboter nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass an dem Orientierdorn (54) oder/und der Aufnahme (48) wenigstens eine Einweisungsschräge (54a, 48a) vorgesehen ist.
5. Labor-Roboter nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Greifvorrichtung (26) nach Art einer Verdeckelungs-Greifvorrichtung ausgebildet ist.
6. Labor-Roboter nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Greifvorrichtung (26) länglich ausgebildet ist und wenigstens ein Greifwerkzeug (40) sowie eine Betätigungsvorrichtung (44) zur Betätigung des Greifwerkzeugs (40) umfasst, wobei das Greifwerkzeug (40) im Wesentlichen innerhalb einer Projektion (P) der Betätigungsvorrichtung (44) in Richtung der Längsachse (A) der Greifervorrichtung (26) angeordnet ist.
7. Labor-Roboter nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Betätigungsvorrichtung (44) elektrisch, beispielsweise elektromagnetisch, oder/und hydraulisch oder/und pneumatisch betätigbar ist.
8. Labor-Roboter nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Betätigung der Greifvorrichtung (26) von einer Bewegung des Roboterarms ( 1 8, 20) abgeleitet wird.
. Labor-Roboter nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass an der Funktionseinheit (60, 70, 80, 90) eine Angriffsstelle für die Greifvorrichtung (26) vorgesehen ist, beispielsweise ein Angriffszapfen (52a) oder eine Angriffsvertiefung.
0. Labor-Roboter nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Roboterarm ( 1 8, 20) in einem vorbestimmten Arbeitsbereich ( 1 4) des Labor-Roboters ( 1 0) im Wesentlichen frei im Raum bewegbar ist.
1 . Labor-Roboter nach einem der Ansprüche 1 bis 1 0, dadurch gekennzeichnet, dass im Arbeitsbereich ( 1 4) des Labor- Roboters ( 1 0) eine Mehrzahl von Parkpositionen (28) für Funktionseinheiten (60, 70, 80, 90) vorgesehen ist.
2. Labor-Roboter nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Funktionseinheit (60) einen Gabelrahmen umfasst, der vorzugsweise zum Transport wenigstens einer Mikrotitrationsplatte (30) ausgebildet ist.
3. Labor-Roboter nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Funktionseinheit (70) zumindest einen Teil einer Pipettiervorrichtung umfasst.
4. Labor-Roboter nach einem der Ansprüche 1 bis 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Funktionseinheit (80) eine Magnetvorrichtung umfasst.
5. Labor-Roboter nach Anspruch 1 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnetvorrichtung (80) wenigstens einen Permanentmagneten (82) umfasst.
1 6. Labor-Roboter nach einem der Ansprüche 1 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Funktionseinheit (90) eine Barcode-Lesevorrichtung umfasst.
1 7. Labor-Roboter nach einem der Ansprüche 1 bis 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuereinheit (22) vorgesehen ist zur Steuerung bzw. Regelung der Bewegung des Roboterarms ( 1 8, 20) oder/und der Betätigung der Greifvorrichtung (26) oder/und des Betriebs der Barcode-Lesevorrichtung (90) oder/und des Betriebs der Magnetvorrichtung (80) oder/und des Betriebs der Pipettiereinheit
(70) .
1 8. Labor-Roboter nach einem der Ansprüche 1 bis 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass im Arbeitsbereich ( 14) des Labor- Roboters ( 10) wenigstens eine Lagervorrichtung (62) für eine
Mikrotitrationsplatte (30) vorgesehen ist.
1 9. Reagenzenkit für die Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe, dadurch gekennzeichnet, dass er a) negativ geladene Partikel aus einem Polymermaterial, b) ein Reagenz I bestehend aus einem Gemisch eines geladenen der ungeladenen Detergens und einem aliphatischen Alkohol, oder/und ein Reagenz II, bestehend aus einer wässrigen Lösung mindestens eines chaotropen Salzes und gegebenenfalls einem aliphatischen Alkohol, und c) eine Proteinase-Lösung enthält.
20. Reagenzienkit nach Anspruch 1 9, dadurch gekennzeichnet, daß er negativ geladene Partikel aus Polystyrol oder insbesondere aus Polyvinylalkohol enthält.
21 . Reagenzienkit nach Anspruch 1 9 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel magnetisch beeinflußbar sind.
22. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 1 9 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel einen durchschnittlichen Durchmesser von 0, 1 bis 100 μm und insbesondere von 1 bis 10 μm aufweisen.
23. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 1 9 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel Carboxylgruppen an der Oberfläche aufweisen.
24. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 1 9 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz I als Detergens
Natriumdodecylsulfat oder DTAB, vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 10 % enthält.
25. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 1 9 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß Reagenz I oder/und Reagenz II als aliphatischen Alkohol Ethanol, vorzugsweise in einer Konzentration von mindestens 40 Vol. % enthält.
26. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 1 9 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß Reagenz II als chaotrope Salze
Guanidiniumhydrochlorid oder Guanidiniumthiocyanat, vorzugsweise in Konzentrationen von 2 bis 8 M enthält.
27. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 1 9 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Proteinase K-Lösung enthält.
28. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 1 9 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien I oder/und II weitere Puffer- oder/und Komplexbildungssubstanzen enthalten.
29. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 1 9 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien I und II einen pH-Wert von 6 bis 8 aufweisen.
30. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 1 9 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich d) Waschpuffer oder/und e) Elutionspuffer zur Ablösung der an die Partikel gebundenen Nukleinsäuren enthält.
31 . Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige Kompartimente enthaltenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe gleichzeitig mit negativ geladenen Partikeln aus einem Polymermaterial und einem Reagenz, bestehend aus einem Gemisch eines geladenen oder ungeladenen
Detergens und einem aliphatischen Alkohol, oder bestehend aus einer wässrigen Lösung mindestens eines chaotropen Salzes und gegebenenfalls einem aliphatischen Alkohol versetzt, danach die Partikel in geeigneter Weise von der überstehenden Lösung abtrennt, ggf. wäscht und entweder die an die Partikel gebundenen
Nukleinsäuren direkt für weitere Verfahren verwendet oder die an die Partikel gebundenen Nukleinsäuren mittels eines Elutionspuffers von den Partikeln löst.
32. Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich zu dem Reagenz eine Proteinase, vorzugsweise Proteinase-K, zusetzt.
33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß man als Partikel aus Polymermaterial Polystyrol oder insbesondere Polyvinylalkoholpartikel einsetzt.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß man magnetisch beeinflußbare Partikel verwendet und diese mit Hilfe eines Magneten von der überstehenden Lösung separiert.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß man Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0, 1 bis 1 00 μm und insbesondere von 1 bis 10 μm verwendet.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß man Partikel mit Carboxylgruppen an der Oberfläche verwendet.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Proben enthaltend Hefezellen ein Reagenz enthaltend Natriumdodecylsulfat oder DTAB, vorzugsweise in Mengen von 1 bis 1 0 % verwendet.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz als aliphatischen Alkohol Ethanol, vorzugsweise in einer Konzentration von mindestens 40 Vol. % verwendet.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung von Nukleinsäuren i n sbeso nd ere a us Vol l bl ut ei n Reagenz enth altend Guanidiniumhydrochlorid oder Guanidiniumthiocyanat, vorzugsweise jeweils in Konzentrationen von 2 bis 8 M, verwendet.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß man den Reagenzien weitere
Puffersubstanzen und/oder Komplexbildner zusetzt.
41 . Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß man die separierten mit Nukleinsäuren beladenen Partikel mit einem Waschpuffer enthaltend mindestens 60
% Ethanol wäscht.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 41 , dadurch gekennzeichnet, daß man es unter Verwendung eines Reagenzienkits nach einem der Ansprüche 1 9 bis 30 durchführt.
43. Verfahren zur Amplifikation oder/und Bestimmung von Nukleinsäuren mittels einer Polypnerase-Ketten-Reaktion (PCR), dadurch gekennzeichnet, daß man die zu amplifizierenden Nukleinsäuren aus einer biologische, nukleinsäurehaltige
Kompartimente enthaltenden Probe mit Hilfe eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 31 bis 42 gewinnt und die Amplifikationsreaktion sowie ggf. die Bestimmung nach an sich bekannten Methoden bewirkt.
44. Verwendung eines Labor-Roboters nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2 zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 31 bis 43.
PCT/EP2000/007711 1999-08-09 2000-08-08 Labor-roboter und verfahren und reagenzienkit zur isolierung von nukleinsäuren WO2001010554A2 (de)

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