CN111551715A - 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒 - Google Patents

一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111551715A
CN111551715A CN202010417201.7A CN202010417201A CN111551715A CN 111551715 A CN111551715 A CN 111551715A CN 202010417201 A CN202010417201 A CN 202010417201A CN 111551715 A CN111551715 A CN 111551715A
Authority
CN
China
Prior art keywords
novel coronavirus
ser
thr
leu
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010417201.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111551715B (zh
Inventor
刘萍
黄爱龙
栾大伟
张振斌
张丽辉
王程飞
刘汉昆
寇悦
汪德强
陈娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioscience Tianjin Diagnostic Technology Co ltd
Chongqing Medical University
Original Assignee
Bioscience Tianjin Diagnostic Technology Co ltd
Chongqing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioscience Tianjin Diagnostic Technology Co ltd, Chongqing Medical University filed Critical Bioscience Tianjin Diagnostic Technology Co ltd
Priority to CN202010417201.7A priority Critical patent/CN111551715B/zh
Publication of CN111551715A publication Critical patent/CN111551715A/zh
Priority to PCT/CN2020/129718 priority patent/WO2021232714A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111551715B publication Critical patent/CN111551715B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，包括抗FITC抗体酶标板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体。本发明试剂盒与现有核酸检测试剂盒相比操作简便，高通量，高灵敏度，速度快，成本低，对实验室要求低等。

Description

一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒
技术领域
本发明属于免疫分析检测技术领域，尤其是涉及一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒。
背景技术
冠状病毒属于单股正链RNA病毒，既往已知感染人的冠状病毒有6种，即HCoV-229E、HCoV-OC43、SARSr-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERSr-CoV。新型冠状病毒(2019-nCoV)属于第7种。
新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种先前未在人类中发现的新型冠状病毒，即2019新型冠状病毒。经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况中存在经气溶胶传播的可能。患者初始症状多为发热，乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。
目前临床实验室的检测方法主要依靠核酸检测，但核酸检测要在有条件和资质的实验室进行，存在检测时间长、样本采集要求高、步骤多、场地和设备要求高等不足，难以大规模开展。而用免疫测定进行抗体检测则可用于对高危人群的筛检，IgM可用于新型冠状病毒感染肺炎原发感染中后期临床辅助诊断或者流行病学监测，如何实现这一临床辅助诊断，成为亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，与现有核酸检测试剂盒相比具有操作简便，速度快，成本低，对实验室要求低等特点。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，包括抗FITC抗体酶标板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体。
优选的，FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原包括如表1所示的4种合成多肽或包括如表1所示的4种合成多肽的氨基酸序列的重组抗原，
表1合成多肽的氨基酸序列
Figure BDA0002495482960000021
FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原可以为具有如表2所示氨基酸序列：
表2重组抗原的氨基酸系列信息
Figure BDA0002495482960000022
Figure BDA0002495482960000031
优选的，新型冠状病毒抗原包括4种合成多肽时，4种合成多肽的质量比为(0.5-2)：(0.5-2)：(0.5-2)：(0.5-2)；优选的，1:1:1:1。
优选的，所述FITC标记新型冠状病毒抗原的制备包括以下步骤，
1)将新型冠状病毒抗原装入透析袋中，用0.02-0.1M pH8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析1-2h，当新型冠状病毒抗原为合成多肽时，省略该步骤；
2)当新型冠状病毒抗原为重组抗原时，将FITC与新型冠状病毒抗原按摩尔比(2-4):1进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；
当使用新型冠状病毒合成多肽时，将FITC与合成多肽按摩尔比1:(1-3)进行混合，避光37℃反应6-12h。
3)将上述步骤2)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
优选的，还包括TMB显色剂A液和B液、以及终止液；所述终止液为浓硫酸，盐酸，氢氧化钠中的一种。
优选的，还包括稀释液；MES 2-5g/L；NaCl 2-10g/；BSA 5-20g/L；葡聚糖2000 1-5g/L；Tween-20 1-5mL/L；ProClinTM300 1-5mL/L；pH8.0±0.20。
优选的，FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的工作浓度均为0.01～0.5μg/mL。
优选的，抗FITC抗体酶标板的制备包括如下步骤，将抗FITC抗体用0.02-0.05M磷酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，同时加入到透明塑料酶标板中，2-8℃包被16-24小时；弃去孔内液体，用pH7.4 PBS缓冲液洗板，然后加入含质量浓度0.5-2％BSA，1-5％的海藻糖的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4-12小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。
优选的，辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的制备方法如下，
A：辣根过氧化物酶(HRP)活化
1)配置5-10mg/mL HRP溶液；
2)配置10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应0.5-2h；
4)配置浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤3)配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应10-30min，活化即完成，放-20℃保存(保存时间不超过3个月)；
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体
1)将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1M pH8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析0.5-2h；
2)将标记原料与活化的HRP按质量比1:(1:4)进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；
3)配置浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液，按1mgHRP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存
抗FITC抗体酶标板，酶标板的固相载体为96孔或48孔的透明微孔板，孔间平均变异不高于10％。功能性：配对其他合格组分，能确保2019-nCoV IgM抗体测定的阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度和稳定性。储存于2～8℃。
FITC标记新型冠状病毒抗原，需满足(1)外观：澄清，呈橙黄色，无混浊沉淀。(2)功能性：配对其他合格组分，能确保2019-nCoV IgM抗体测定的阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度和稳定性。储存于2～8℃。
辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体，需满足(1)外观：澄清透明，无混浊沉淀。(2)功能性：配对其他合格组分，能确保2019-nCoV IgM抗体测定的阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度和稳定性。储存于2～8℃。
可以根据需要提供企业参考品，包括阴性参考品，阳性参考品，最低检出限参考品，精密度参考品。
阴性参考品，对20份企业阴性参考品(N1-N20)进行检测，不得出现假阳性，阴性参考品符合率20/20。制备，选取20份新型冠状病毒IgM抗体阴性血清样本，其中包含甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体等阳性干扰样本，灭活后经一定倍数稀释后，每份分装量为0.5mL，-20℃保存。
阳性参考品，对10份企业阳性参考品(P1-P10)进行检测，不得出现假阴性，阳性参考品符合率10/10。制备，选取10份不同发病时间、发病程度及抗体不同反应强度的新型冠状病毒IgM抗体阳性血清样本，灭活后经一定倍数稀释后，每份分装量为0.5mL，-20℃保存。
最低检出限参考品，对企业检出限参考品L1-L4进行检测，L1和L2应检为阳性，L3可检为阳性或阴性，L4应检出阴性。制备，选取5份不同发病时间的新型冠状病毒IgM抗体阳性血清样本，灭活后混合，按照一定比例稀释，分别得到L1-L4，每份分装量为0.5mL，-20℃保存。
精密度参考品，检测应满足以下精密度，(1)批内精密度：检测企业精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据阳性质控品测定结果(S/CO)的平均值
Figure BDA0002495482960000061
与标准差(SD)，根据公式(1)计算变异系数(CV)，结果应符合以下要求①阴性质控品：阴性检出率应为100％(n＝20)；②弱阳性质控品：阳性检出率应≥90％(n＝20)；③阳性质控品：阳性检出率为100％，且CV≤10％(n＝20)。变异系数(CV％)＝SD/平均值×100％…………公式(1)
(2)批间精密度：计算，用三批试剂盒检测企业参考品中精密度阳性质控品，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差(SD)，根据公式(1)计算变异系数(CV)，结果应符合以下要求：检测企业参考品中精密度阳性质控品，阳性检出率应为100％，且CV≤15％。
试剂盒中还应包括阴性对照以及阳性对照试剂，其中阴性对照，制备方法：将含牛血清白蛋白的缓冲液加入体积浓度1％的ProClinTM 300。分装，贴标签，储存于2～8℃。其中缓冲液的配方为：5-15g/L BSA，0.01-0.02mol/L PBS(pH值：7-8，有效期：14个月)
阳性对照，制备方法：取5份阳性人血清混合，经56℃热灭活45分钟，用含牛血清白蛋白的缓冲液稀释至适合的工作浓度，加入体积浓度1-5％ProClinTM 300，分装，贴标签，储存于2～8℃。其中缓冲液的配方为：5-15g/L BSA，0.01-0.02mol/L PBS(PH值：7-8，有效期：14个月)。
本发明一种新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)采用的是酶联免疫分析(ELISA)测定系统，该系统由免疫反应系统和酶标仪测定系统组成，用酶标仪读取免疫反应后的产物与显色剂所产生OD值来指示免疫反应物的存在与否及其含量的高低，以此达到对抗原或抗体物质含量的检测。具有灵敏度高、特异性强等优点。
本产品采用间接法原理检测人血清中的新型冠状病毒IgM抗体。将FITC标记新型冠状病毒重组抗原或合成多肽和样本加入到酶标板反应孔中，若样本中含有新型冠状病毒IgM抗体，则与以上试剂中的合成多肽或重组抗原形成复合物，结合到包被板上，洗掉游离成分。将辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体加入反应管中，辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体作为二抗，与样本中的IgM抗体结合，并形成辣根过氧化物酶标记抗体-IgM抗体-复合物，洗掉游离成分。加入显色液A、显色液B，在37±1℃条件下反应。加入终止液，选择酶标仪450nm检测OD值。
相对于现有技术，本发明所述的一种新型冠状病毒IgM的酶免检测试剂盒，具有以下优势：
Figure BDA0002495482960000071
附图说明
图1为实施例的ROC曲线分析图；
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，包括抗FITC抗体酶标板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体、企业参考品，阴性对照，阳性对照，底物液，浓缩洗液，生理盐水，反应管。
抗FITC抗体酶标板的制备方法为：将抗FITC抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，同时加入到96孔透明塑料酶标板中，2-8℃包被16-24小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含0.5-5％BSA，2-5％的海藻糖的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干20-24小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。
所述FITC标记新型冠状病毒抗原的制备包括以下步骤，
1)将FITC与新型冠状病毒合成多肽按摩尔比1:1进行混合，避光37℃反应12h。
2)将上述步骤1)完成的标记液用0.01M PBS于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
其中，新型冠状病毒抗原为4种合成多肽按相同质量比混合；4种合成多肽的氨基酸序列如下所示，
表1合成多肽的氨基酸序列
Figure BDA0002495482960000091
需要说明的是，本申请使用的FITC标记的新型冠状病毒合成多肽可为以上方法合成，也可以通过其他现有的常规方式合成，只要能够达到将FITC与新型冠状病毒合成多肽连接就可以。
20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和质量浓度2％Proclin300。
阴性对照以及阳性对照试剂，其中阴性对照，制备方法：将含牛血清白蛋白的缓冲液加入1％体积浓度的ProClinTM 300。分装，贴标签，储存于2～8℃。其中缓冲液的配方为：10g/L BSA，0.02mol/L PBS(pH值：7-8，有效期：14个月)
阳性对照，制备方法：取5份阳性人血清混合，经56℃热灭活45分钟，用含牛血清白蛋白的缓冲液稀释至工作浓度，加入ProClinTM 300，分装，贴标签，储存于2～8℃。其中缓冲液的配方为：10g/L BSA，0.02mol/L PBS(pH值：7-8，有效期：14个月)。
稀释液的制备包括如下步骤，在1.7L工艺用水中，加入7.96gMES、9g NaCl，搅拌至完全溶解；再加入20g BSA、5g葡聚糖2000搅拌过夜至完全溶解；再加入2.0mLTween-20、4.0mL ProClinTM300，搅拌30分钟。用纯化水定容至2L，用pH计测定其pH值，用6M HCl或2MNaOH调整pH值在8.0±0.20范围内的要求。
采用改良高碘酸钠氧化法将鼠抗人IgM单克隆抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度0.01～0.5μg/mL，并加入10％酶稳定剂，储存于2～8℃；
改良过碘酸钠氧化法步骤包括：
A：辣根过氧化物酶(HRP)活化
1)配置10mg/mL HRP溶液；
2)配置12.8mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应30min；
4)配置浓度为20μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3)以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存(保存时间不超过3个月)；
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体
1)将待标记原料装入透析袋中，用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2)将标记原料与活化的HRP按质量比1:3进行混合，之后用0.05M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析24h(期间换液2-3次)；
3)配置浓度为2mg/mL的NaBH4水溶液，按1mgHRP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01M PBS于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
本发明试剂盒的反应步骤：
1、将试剂盒各组分在室温(18～25℃)下平衡30分钟。
2、配液：用纯化水将20倍浓缩洗液按1:20稀释(475mL纯化水加25mL浓缩洗液)。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。
样品分析过程：
1、样本处理：取1mL生理盐水，加入20μL样本，混匀，用漩涡混匀仪混匀5秒，静止15分钟后开始实验。
2、根据实验需要取出适量的包被板条。设置阳性对照、阴性对照各2孔，空白孔1孔，其余为待检样本孔。每孔先加入50μL FITC标记新型冠状病毒抗原(合成多肽)，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
3、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗一次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
4、加入50μL处理后样本或阴性、阳性对照、预留空白对照。
5、手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应30分钟。
6、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
7、加入50μL辣根过氧化酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体。
8、手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
9、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
10、每孔加入显色液A、显色液B各50μL，在37±1℃条件下反应15分钟。
11、每孔加入50μL终止液，选择酶标仪450nm检测OD值。
该产品临床试验以《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》明确的疾病确诊/排除标准为对比，选取684例病例，其中确诊病例282例，排除病例402例。
该实施例制备的试剂盒检测效果评价如下：
以下检测使用的仪器是：酶标仪型号：HBS-1101；生产厂家：南京德铁实验设备有限公司。
1、稳定性
1.1设计要求：试剂盒37±1℃放置7天，外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度检测结果均应符合设计要求。
1.2试验方法：将试剂盒在37℃存放7天后取出，检测企业参考品。
1.3试验结果
表3
Figure BDA0002495482960000121
表4检测数据
Figure BDA0002495482960000122
Figure BDA0002495482960000131
Figure BDA0002495482960000141
Figure BDA0002495482960000151
2.精密度
2.1设计要求
2.1.1批内精密度：检测企业参考品中3个不同水平精密度参考品，应符合以下要求
2.1.1.1精密度参考品N：阴性检出率应为100％(n＝20)；
2.1.1.2精密度参考品L：阳性检出率应≥90％(n＝20)；
2.1.1.3精密度参考品CV：阳性检出率为100％，且CV≤10％(n＝20)。
2.1.2批间精密度：检测企业参考品中精密度参考品CV，阳性检出率应为100％，且CV≤15％。
2.2试验方法
2.2.1批内精密度：检测企业精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据测定结果(S/CO)的平均值
Figure BDA0002495482960000153
与标准差(SD)，根据公式(2)计算变异系数(CV)，结果应符合2.1.1要求。
变异系数(CV％)＝SD/平均值×100％…………公式(2)
2.2.2批间精密度：用三批试剂盒检测企业参考品中精密度参考品CV，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差(SD)，根据公式(2)计算变异系数(CV)，结果应符合2.1.2要求。
2.3企业精密度参考品测定结果
表5
Figure BDA0002495482960000152
Figure BDA0002495482960000161
Figure BDA0002495482960000171
3、灵敏度以及特异性
表6排除2019-nCoV感染的部分检测结果
Figure BDA0002495482960000172
Figure BDA0002495482960000181
表7确诊2019-nCoV感染的部分检测结果
样本编号 性别 年龄 诊断 发光值 S/CO IgM判断 核酸
EM-0005 男 31 确诊 0.8223 8.22 + +
EM-0006 男 30 确诊 0.6666 6.67 + +
EM-0033 女 57 确诊 1.8572 18.57 + +
EM-0035 女 58 确诊 1.6255 16.26 + +
EM-0235 男 48 确诊 0.8928 8.93 + +
EM-0236 女 34 确诊 1.5510 15.51 + +
EM-0244 女 53 确诊 1.5025 15.03 + +
EM-0246 女 60 确诊 0.3227 3.23 + +
EM-0369 男 33 确诊 1.0774 10.77 + +
EM-0371 女 32 确诊 1.9214 19.21 + +
EM-0408 男 72 确诊 0.4456 4.46 + +
EM-0410 女 43 确诊 0.4289 4.29 + +
EM-0586 男 37 确诊 0.9151 9.15 + +
EM-0656 女 60 确诊 0.4388 4.39 + +
根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析，具体结果如下表所示，ROC曲线分析图如图1所示。
表8
曲线下的面积
检验结里变量：ELISA-IgM
Figure BDA0002495482960000191
检验结果变量：VAR00008在正的和负的实际状态组之间
至少有一个结。统计量可能会出现偏差。
a.在非参数假设下
b.零假设：实面积＝0.5
样本S/CO≥1，检测结果判为阳性；样本S/CO＜1，检测结果判为阴性。其中S/CO值为检测样本的OD值/cutoff值。通过ROC曲线确定试剂盒在不同cutoff值的情况下，试剂盒灵敏度及特异性的表现，筛选出最优的cutoff值，其值为0.1。
ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.959，表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高。
上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司
<120> 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Gly Pro Val Pro Leu Ala Ile Ala Gly Thr Pro Leu Ile Thr Ser
1 5 10 15
Leu His Thr Pro Ile Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly
20 25
<210> 2
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
20 25 30
Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
35 40 45
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro
1 5 10 15
Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser
20 25
<210> 4
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln
20 25 30
Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr
35 40
<210> 5
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly
195 200
<210> 6
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg
1 5 10 15
Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro
20 25 30
Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu
35 40 45
Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln
50 55 60
Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser
65 70 75 80
Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr
85 90 95
Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly
100 105 110
Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln
115 120 125
Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg
130 135 140
Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Ala
145 150 155 160
Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile
165 170 175
Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu
180 185 190
Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro
195 200 205
Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp
210 215 220
Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp
225 230 235 240
Ser Thr Gln Ala
<210> 7
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser
325
<210> 8
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
1 5 10 15
Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
20 25 30
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
35 40 45
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
50 55 60
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
65 70 75 80
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
85 90 95
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
100 105 110
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
115 120 125
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
130 135 140
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
145 150 155 160
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
165 170 175
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
180 185 190
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
195 200 205
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
210 215 220
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
225 230 235 240
Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys
245 250 255
Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr
260 265 270
Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro
275 280 285
Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser
290 295 300
Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro
305 310 315 320
Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser
325 330 335
Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala
340 345 350
Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly
355 360 365
Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
370 375 380
Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr
385 390 395
<210> 9
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser
1 5 10 15
Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu
20 25 30
Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys
35 40 45
Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe
50 55 60
Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp
65 70 75 80
Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr
85 90 95
Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro
100 105 110
Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe
115 120 125
Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp
130 135 140
Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe
145 150 155 160
Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala
165 170 175
Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr
180 185 190
Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala
195 200 205
Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn
210 215 220
Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln
225 230 235 240
Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val
245 250 255
Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser
260 265 270
Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg
275 280 285
Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly
290 295 300
Arg
305
<210> 10
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser
1 5 10 15
Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu
20 25 30
Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser
35 40 45
Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val
50 55 60
Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg
100 105 110
Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser
115 120 125
Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln
130 135 140
Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala
145 150 155 160
His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe
165 170 175
Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn
180 185 190
Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn
195 200 205
Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu
210 215 220
Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly
225 230 235 240
Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile
245 250 255
Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp
260 265 270
Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr
275 280 285
Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala
290 295

Claims (9)

1.一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：包括抗FITC抗体酶标板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原包括如下所示的4种合成多肽或包括如下所示的4种合成多肽的氨基酸序列的重组抗原，
Figure FDA0002495482950000011
3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：新型冠状病毒抗原包括4种合成多肽时，4种合成多肽的质量比为(0.5-2)：(0.5-2)：(0.5-2)：(0.5-2)。
4.根据权利要求1～3任一项所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：所述FITC标记新型冠状病毒抗原的制备包括以下步骤，
1)将新型冠状病毒抗原装入透析袋中，用0.02-0.1M pH8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析1-2h，当新型冠状病毒抗原为合成多肽时，省略该步骤；
2)当新型冠状病毒抗原为重组抗原时，将FITC与新型冠状病毒抗原按摩尔比(2-4):1进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；
当使用新型冠状病毒合成多肽时，将FITC与合成多肽按摩尔比1:(1-3)进行混合，避光37℃反应6-12h；
3)将上述步骤2)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：还包括TMB显色剂A液和B液、以及终止液；所述终止液为浓硫酸，盐酸，氢氧化钠中的一种。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：还包括稀释液；MES 2-5g/L；NaCl 2-10g/L；BSA 5-20g/L；葡聚糖2000 1-5g/L；Tween-20 1-5mL/L；ProClinTM300 1-5mL/L；pH 8.0±0.20。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的工作浓度均为0.01～0.5μg/mL。
8.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：抗FITC抗体酶标板的制备包括如下步骤，将抗FITC抗体用0.02-0.05M磷酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，同时加入到透明塑料酶标板中，2-8℃包被16-24小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含质量浓度0.5-2％BSA，1-5％的海藻糖的的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4-12小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。
9.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的制备方法如下，
A：辣根过氧化物酶(HRP)活化
1)配置5-10mg/mL HRP溶液；
2)配置10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比1：(1-3)混匀，2-8℃避光反应0.5-2h；
4)配置浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤3)配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应10-30min，活化即完成，放-20℃保存(保存时间不超过3个月)；
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体
1)将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1M pH8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析0.5-2h；
2)将标记原料与活化的HRP按质量比1:(1-5)进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；
3)配置浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液，按1mgHRP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
CN202010417201.7A 2020-05-18 2020-05-18 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒 Active CN111551715B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010417201.7A CN111551715B (zh) 2020-05-18 2020-05-18 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒
PCT/CN2020/129718 WO2021232714A1 (zh) 2020-05-18 2020-11-18 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010417201.7A CN111551715B (zh) 2020-05-18 2020-05-18 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111551715A true CN111551715A (zh) 2020-08-18
CN111551715B CN111551715B (zh) 2022-04-22

Family

ID=71998902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010417201.7A Active CN111551715B (zh) 2020-05-18 2020-05-18 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN111551715B (zh)
WO (1) WO2021232714A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112114141A (zh) * 2020-09-11 2020-12-22 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒
WO2021232714A1 (zh) * 2020-05-18 2021-11-25 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒
WO2021232713A1 (zh) * 2020-05-18 2021-11-25 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgG抗体的酶联免疫法检测试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101377504A (zh) * 2008-04-16 2009-03-04 北京科美东雅生物技术有限公司 一种检测弓形虫IgM抗体的化学发光免疫分析测定试剂盒
CN102914645A (zh) * 2012-11-12 2013-02-06 武汉伊艾博科技有限公司 用于免疫吸附反应过程中抗体在固相载体上固定的方法
US20150212068A1 (en) * 2012-08-20 2015-07-30 Novassay Sa Cholyl-L-Lysyl-Fluorescein Assay
CN111122864A (zh) * 2020-03-25 2020-05-08 中山生物工程有限公司 新型冠状病毒IgG抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10914731B2 (en) * 2019-02-21 2021-02-09 Qinxue DING Method of removing non-specific binding signals using microparticle assay
EP3869199B1 (en) * 2020-02-20 2022-02-09 EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG A method and reagents for the diagnosis of sars-cov-2
DE202020102077U1 (de) * 2020-04-15 2020-05-11 Protzek Gesellschaft für Biomedizinische Technik GmbH Vorrichtung zur gezielten Prüfung auf eine erfolgte Infektion mit dem Coronavirus-SARS-CoV-2
CN111337672B (zh) * 2020-05-18 2020-09-08 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgG抗体的酶联免疫法检测试剂盒
CN111551715B (zh) * 2020-05-18 2022-04-22 天津博奥赛斯生物科技股份有限公司 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101377504A (zh) * 2008-04-16 2009-03-04 北京科美东雅生物技术有限公司 一种检测弓形虫IgM抗体的化学发光免疫分析测定试剂盒
US20150212068A1 (en) * 2012-08-20 2015-07-30 Novassay Sa Cholyl-L-Lysyl-Fluorescein Assay
CN102914645A (zh) * 2012-11-12 2013-02-06 武汉伊艾博科技有限公司 用于免疫吸附反应过程中抗体在固相载体上固定的方法
CN111122864A (zh) * 2020-03-25 2020-05-08 中山生物工程有限公司 新型冠状病毒IgG抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021232714A1 (zh) * 2020-05-18 2021-11-25 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒
WO2021232713A1 (zh) * 2020-05-18 2021-11-25 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgG抗体的酶联免疫法检测试剂盒
CN112114141A (zh) * 2020-09-11 2020-12-22 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021232714A1 (zh) 2021-11-25
CN111551715B (zh) 2022-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111337682B (zh) 一种新型冠状病毒IgM/IgG磁微粒化学发光免疫检测试剂盒
CN111551715B (zh) 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒
CN111337672B (zh) 一种新型冠状病毒IgG抗体的酶联免疫法检测试剂盒
CN111413496B (zh) 一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体化学发光法检测试剂盒
CN111337673B (zh) 一种用于新型冠状病毒免疫检测的合成多肽组合物及应用
CN101160413B (zh) 一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及检测方法
CN108490166B (zh) 一种改良实验缓冲液及其应用
CN107894508A (zh) 一种用于塞内卡病毒抗体检测的固相竞争elisa试剂盒及其应用
CN107741495A (zh) 一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心elisa试剂盒及其应用
CN111474340B (zh) 一种用于新型冠状病毒检测的酶标记的抗原、制备方法及试剂盒与应用
CN111007257A (zh) 一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体检测免疫阻断层析试剂盒及其应用
CN113321715B (zh) 新型冠状病毒抗原及其检测用途
CN101178404A (zh) 人类免疫缺陷病毒抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒及其制备方法
CN108535486A (zh) 一种基于铕标记的氯霉素免疫荧光测定方法
CN109239348A (zh) 胃泌素释放肽前体检测试剂盒用抗体及试剂盒
CN111707827B (zh) 一种乙型肝炎表面抗原检测试剂盒
CN105606803B (zh) 幽门螺杆菌抗体含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒
CN112114141A (zh) 一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒
CN104833804A (zh) 一种幽门螺杆菌IgG抗体ELISA半定量检测试剂盒及其应用
CN111458498A (zh) 一种手足口ev71抗原检测试剂盒
CN112710842B (zh) hsCRP检测试剂盒和hsCRP的检测方法
CN109507420A (zh) 水牛大片形吸虫抗体的快速检测方法
JPS6228666A (ja) 生物学的試料中の抗原及び抗体検出法及び検出用支持体
CN212159821U (zh) 猪流行性腹泻病毒IgA和IgG抗体检测试剂盒
Elzein et al. Differentiation of foot-and-mouth disease virus strains using a competition enzyme-linked emmunosorbent assay

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 300300 building 14, international medical device Industrial Park, No. 16, Wujing Road, economic and Technological Development Zone, Dongli District, Tianjin

Applicant after: Tianjin boasaisi Biotechnology Co.,Ltd.

Applicant after: Medical University Of Chongqing

Address before: 300300 building 14, international medical device Industrial Park, Liujing Road, Dongli Development Zone, Dongli District, Tianjin

Applicant before: BIOSCIENCE (TIANJIN) DIAGNOSTIC TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Applicant before: Medical University Of Chongqing

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant