PT1307564E

PT1307564E - ''compostos e métodos para tratamento e diagnóstico da infecção por clamídia''

Info

Publication number: PT1307564E
Application number: PT01959114T
Authority: PT
Inventors: Steven P Fling; Yasir A W Skeiky; Peter Probst; Ajay Bhatia
Original assignee: Corixa Corp
Priority date: 2000-07-20
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2007-11-21
Also published as: ES2294018T3; US8052975B2; US20110142872A1; HK1067381A1; RU2006120003A; KR20030016423A; RU2003104976A; NZ541013A; HUP0400477A3; IL153904A; HUP0400477A2; WO2002008267A3; ZA200300719B; US20080299142A1; NZ549873A; PL209107B1; JP2004513622A; US20120114684A1; US20080317772A1; DK1307564T3

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSTOS E MÉTODOS PARA TRATAMENTO E DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO POR CLAMÍDIA"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se, em geral, à detecção e tratamento da infecção por Clamídia. Em particular, a invenção refere-se a composições compreendendo polipéptidos compreendendo um antigénio de Chlamydia e à utilização destes polipéptidos para o serodiagnóstico e tratamento da infecção por clamidia.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As clamidias são patogénios bacterianos intracelulares que são responsáveis por uma grande variedade de importantes infecções humanas e animais. A Chlamydia trachomatis é uma das causas mais comuns de doenças sexualmente transmissíveis e pode conduzir a doença inflamatória pélvica (PID), resultando em obstrução das trompas e infertilidade. A Chlamydia trachomatis pode também desempenhar um papel na infertilidade masculina. Em 1990, o custo de tratar a PID nos EUA foi estimado em 4 mil milhões de dólares. O tracoma, devido a infecção ocular com Chlamydia trachomatis é a causa principal de cegueira evitável em todo o mundo. A Chlamydia pneumonia é uma das causas principais de infecções agudas do tracto respiratório em humanos e pensa-se que desempenha também um papel na patogénese da aterosclerose e, em particular, na doença cardíaca coronária.

Verificou-se que os indivíduos com um título elevado de anticorpos contra Chlamydia pneumonia têm uma probabilidade, pelo, menos duas vezes maior de sofrer de doença cardíaca coronária que os indivíduos seroneqativos. As infecções por clamídia constituem, assim, um problema de saúde importante, quer nos EUA, quer em todo o mundo. A infecção por clamídia é muitas vezes assintomática. Por exemplo, na altura em que a mulher procura cuidados médicos para a PID, já poderão ter ocorrido danos irreversíveis que resultam em infertilidade. Persiste, assim, uma necessidade na técnica de vacinas melhoradas e composições farmacêuticas para a prevenção e tratamento das infecções por Chlamydia. A presente invenção responde a esta necessidade e proporciona também outras vantagens relacionadas.

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona composições para a terapia da infecção por Chlamydia. Num aspecto, a presente invenção proporciona composições compreendendo polipéptidos compreendendo um antigénio de Chlamydia com a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID N°: 431, ou uma variante deste antigénio com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da SEQ ID N°: 431, para utilização no estímulo de uma resposta imunitária num doente e para utilização no tratamento ou prevenção da infecção por clamídia. Algumas variantes são imunogénicas, de modo que a capacidade da variante reagir com anti-soros específicos de antigénios não é substancialmente 2 diminuída. Nalgumas formas de realização, o polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de polinucleótidos de SEQ ID N°: 407. A presente invenção proporciona, também, composições compreendendo polinucleótidos que codificam para um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431, para utilização no estímulo de uma resposta imunitária num doente e para utilização no tratamento ou prevenção da infecção por clamídia, por exemplo, a composição compreende um polinucleótido compreendendo ou consiste da sequência de SEQ ID N°: 407.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona proteínas de fusão compreendendo um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431 ou, alternativamente, um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento total da sequência de SEQ ID N°: 431 e um antigénio de Chlamydia conhecido, bem como polinucleótidos que codificam para estas proteínas de fusão, em combinação com um veículo fisiologicamente aceitável ou imunoestimulante, para utilização como suas composições farmacêuticas e vacinas. 3

Dentro de outros aspectos, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um ou mais polipéptidos de Chlamydia compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431, e. g., um polipéptido de acordo com a SEQ ID N°: 431, ou uma molécula de polinucleótido que codifica para um polipéptido deste tipo, tal como um polinucleótido de acordo com a SEQ ID N°: 407 e um veículo fisiologicamente aceitável. A invenção também proporciona vacinas para fins profiláticos e terapêuticos compreendendo um ou mais polipéptidos compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431 ou uma sua variante, com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431 e um imunoestimulante, tal como aqui definido, juntamente com vacinas compreendendo uma ou mais sequências de polinucleótido que codificam para estes polipéptidos e um imunoestimulante.

Também é proporcionada a utilização de (a) um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado por comparação das duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431; ou (b) um polinucleótido que codifica para o polipéptido de (a); na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da infecção por clamídia. 4

Também é proporcionada a utilização de (a) um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado por comparação das duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431; ou (b) um polinucleótido que codifica para o polipéptido de (a) ; para a detecção de infecção por clamídia num doente.

Adicionalmente, é proporciona a utilização de (a) um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado por comparação das duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431; ou (b) um polinucleótido que codifica para o polipéptido de (a); na preparação de um kit de diagnóstico para a detecção da infecção por clamídia num doente.

IDENTIFICADORES DE SEQUÊNCIA A SEQ ID N°: 1 é a sequência de ADN determinada para o clone l-Bl-66 de C. trachomatis. A SEQ ID N°: 4 é a sequência de ADN determinada para o clone 10-C10-31 de C. trachomatis. A SEQ ID N°: 5 é a sequência de aminoácidos prevista para l-Bl-66. 5 A SEQ ID N°: 12 é a sequência de aminoácidos prevista para 10-C10-31. A SEQ ID N°: 31 é a sequência de aminoácidos para um péptido de consenso de 10 monómeros de CtC7.8-12 e CtC7.8-13

A SEQ ID N°: 39 é a sequência de aminoácidos para o péptido CtSwib 52-67 de C. trachomatis LGV II A SEQ id N°: 56 é a sequência de adn determinada para o clone 14-H1-4 de C. trachomatis LGV II, que tem homologia com o gene CT603 antioxidante especifico de tiol. A SEQ ID N°: 57 é a sequência de adn determinada para o clone 12-G3-83 de C. trachomatis LGV II, que tem homologia com a proteína CT622 hipotética. A SEQ ID N°: 59 é a sequência de ADN determinada para o clone 11-H4-28 de C. trachomatis LGV II, que tem homologia com o gene CT396 de dnaK. A SEQ ID N°: 60 é a sequência de ADN determinada para o clone 11-H3-68 de C. trachomatis LGV II, que tem homologia parcial com a proteína PGP6-D de virulência e o gene CT318 ribossomal Ll. A SEQ ID N°: 62 é a sequência de ADN determinada para o clone 11-G10-46 de C. trachomatis LGV II, que tem homologia com a proteína CT610 hipotética. 6 A SEQ ID N°: 87 é a sequência de ADN determinada para o clone 15-H2-76 de C. trachomatis LGV II, que tem homologia parcial com os genes pmpD e SycE e com a ORF de CT089. A SEQ ID N°: 110 é a sequência de ADN determinada para o clone 21-G12-60 de C. trachomatis LGV li, que contém grelhas de leitura aberta parciais para as proteínas hipotéticas CT875, CT229 e CT228. A SEQ ID N°: 111 é a sequência de ADN determinada para o clone 22-B3-53 de C. trachomatis LGV II, que tem homologia com a ORF de CT110 de GroEL. A SEQ ID N°: 114 é a sequência de ADN determinada para o clone 17-C10-31 de C. trachomatis LGV II, que tem homologia parcial com a ORF de CT858. A SEQ ID N°: 115 é a sequência de ADN determinada para o clone 21-C7-8 de C. trachomatis LGV II, que tem homologia com o gene do tipo dnaK. A SEQ ID N°: 407 apresenta a sequência de ADN do serotipo D de comprimento total do gene CT858 de Chlamydia trachomatis. A SEQ ID N°: 431 apresenta a sequência de aminoácidos do serotipo D de comprimento total do gene CT858 de Chlamydia trachomatis. 7

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Fig. 1 mostra títulos do isotipo de anticorpo em ratinhos C57B1/6 imunizados com a proteína SWIB de C. trachomatis. A Fig. 2 mostra as respostas proliferativas de células τ específicas de Chlamydia em esplenócitos de ratinhos C3H imunizados com a proteína SWIB de C. trachomatis. A Fig. 3 mostra as respostas proliferativas específicas de SWIB de C. trachomatis de uma linha de células-T primária (TCT-10 EB) de um dador assintomático. A Fig. 4 ilustra a identificação do epítopo de células τ em SWIB de C. trachomatis com uma linha de células T específica do antigénio (TCL-10 EB).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como referido acima, a presente invenção refere-se em geral a composições para o tratamento de infecção por clamídia. Num aspecto, as composições da presente invenção incluem polipéptidos compreendendo 0 antigénio de Chlamydia de SEQ ID N°: 431 , ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado por comparação das duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431.

Tal como aqui utilizado, o termo "polipéptido" inclui cadeias de aminoácido de qualquer comprimento, incluindo 8 proteínas de comprimento total (í. e., antigénios), em que os resíduos de aminoácido estão ligados por ligações peptídicas covalentes. Assim, um polipéptido compreendendo uma porção imunogénica de um antigénio pode consistir totalmente da porção imunogénica, ou pode conter sequências adicionais. As sequências adicionais podem ser derivadas do antigénio de Chlamydia nativo ou podem ser heterólogas e estas sequências podem (mas não têm que) ser imunogénicas. 0 termo "polinucleótido(s)", tal como aqui utilizado, significa um polímero de cadeia simples ou dupla de desoxirribonucleótido ou bases de ribonucleótido e inclui ADN e moléculas de ARN correspondentes, incluindo moléculas de HnARN e ARNm, ambas cadeias de sentido e anti-sentido e compreende adnc, ADN genómico e ADN recombinante, bem como polinucleótidos total ou parcialmente sintetizados. Uma molécula de HnARN contém intrões e corresponde a uma molécula de ADN geralmente de um modo um-para-um. Uma molécula de ARNm corresponde a uma molécula de HnARN e ADN a partir da qual foram excisados os intrões. Um polinucleótido pode consistir de um gene inteiro, ou qualquer sua porção. Os polinucleótidos de anti-sentido operacionais podem compreender um fragmento do polinucleótido correspondente e a definição de "polinucleótido" inclui, portanto, todos estes fragmentos anti-sentido operacionais.

Os polipéptidos compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência, tal como determinado por comparação de duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431, podem ser utilizados em geral, isolados ou em combinação, para detectar uma infecção por Clamídia num doente. 9

As composições e utilizações da presente invenção incluem também variantes de polipéptidos compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado por comparação das duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431 e polinucleótidos que codificam para estas moléculas de polinucleótido. Estas variantes podem incluir, mas não se limitam a variantes alélicas das sequências da invenção que ocorrem naturalmente. Em particular, as variantes podem incluir outros serotipos de Chlamydiae, tais como os serotipos D, E e F, bem como os vários serotipos LGV que partilham homologia com os polipéptidos e moléculas de polinucleótido aqui descritas. De um modo preferido, os homólogos dos serotipos têm 95-99% de homologia com a(s) sequência de polipéptido correspondente aqui descrita.

Uma variante de polipépido, tal como aqui utilizado, é um polipéptido que difere do polipéptido descrito apenas em substituições e/ou modificações conservadoras, de modo que as propriedades antigénicas do polipéptido são retidas. Numa forma de realização preferida, os polipéptidos variantes diferem de uma sequência identificada por substituição, eliminação ou adição de cinco aminoácidos ou menos. Estas variantes podem geralmente ser identificadas modificando a sequência do polipéptido de referência e avaliando as propriedades antigénicas do polipéptido modificado, utilizando, por exemplo, os processos representativos aqui descritos. Por outras palavras, a capacidade de uma variante reagir com os anti-soros específicos de antigénios pode ser aumentada ou inalterada, em relação à proteína nativa, ou pode ser diminuída em menos de 50% e, de um modo preferido, menos de 20% em relação à proteína 10 nativa. Estas variantes podem ser geralmente identificadas modificando a sequência do polipéptido de referência e avaliando a reactividade do polipéptido modificado com anticorpos ou anti-soros específicos do antigénio, como aqui descrito. As variantes preferidas incluem aquelas em que foram removidas uma ou mais porções, tais como uma sequência líder do terminal N ou domínio transmembranar. Outras variantes preferidas incluem variantes nas quais uma pequena porção (e. g., 1-30 aminoácidos, de um modo preferido 5-15 aminoácidos) foi removida do terminal N e/ou C da proteína madura.

Tal como aqui utilizada, uma "substituição conservadora" é uma em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido que tem propriedades semelhantes, de modo que um especialista na técnica da química de péptidos esperará que a estrutura secundária e natureza hidropática do polipéptido estejam substancialmente inalteradas. As substituições de aminoácidos podem ser geralmente feitas com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, os aminoácidos carregados negativamente incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; os aminoácidos carregados positivamente incluem lisina e arginina; e os aminoácidos com grupos de cabeça polar não carregados com valores de hidrofilicidade semelhantes incluem leucina, isoleucina e valina; glicina e alanina; asparagina e glutamina; e serina, treonina, fenilalanina e tirosina. Outros grupos de aminoácidos que podem representar alterações conservadoras incluem: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) vai, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; e (5) phe, tyr, trp, his. Uma variante também pode, ou alternativamente, conter alterações não conservadoras. Numa forma de realização 11 preferida, os polipéptidos variantes diferem de uma sequência nativa por substituição, eliminação ou adição de cinco aminoácidos ou menos. As variantes também podem (ou alternativamente) ser modificadas, por exemplo, por eliminação ou adição de aminoácidos que têm uma influência minima na imunogenecidade, estrutura secundária e natureza hidropática do polipéptido. As variantes também podem, ou alternativamente, conter outras modificações, incluindo a eliminação ou adição de aminoácidos que têm uma influência minima nas propriedades antigénicas, estrutura secundária e natureza hidropática do polipéptido. Por exemplo, um polipéptido pode ser conjugado com uma sequência de sinal (ou lider) na extremidade do terminal N da proteína que dirige co-traducionalmente ou pós-traducionalmente a transferência da proteína. 0 polipéptido pode também ser conjugado com um ligante ou outra sequência para facilidade de síntese, purificação ou identificação do polipéptido (e. g., poli-His) ou para aumentar a ligação do polipéptido a um suporte sólido. Por exemplo, um polipéptido pode ser conjugado com uma região Fc de imunoglobulina.

Uma "variante" de polinucleótido é uma sequência que difere da sequência de nucleótidos descrita por ter uma ou mais eliminações, substituições ou adições de nucleótidos, de modo que a imunogenecidade do polipéptido codificado não é diminuída, em relação à proteína nativa. 0 efeito na imunogenecidade do polipéptido codificado pode ser geralmente determinado como aqui descrito. Estas modificações podem ser facilmente introduzidas utilizando técnicas de mutagénese convencionais, tais como mutagénese específica do sítio dirigida para oligonucleótidos como ensinado, por exemplo, por Adelman et al. {DNA, 2:183, 1983) . As variantes de nucleótidos podem ser variantes alélicas 12 que ocorrem naturalmente, como discutido a seguir, ou variantes que não ocorrem naturalmente.

Diz-se que duas sequências de nucleótidos ou polipéptidos são "idênticas" se a sequência de nucleótidos ou resíduos de aminoácidos nas duas sequências é a mesma, quando alinhada para uma correspondência máxima, como descrito a seguir. As comparações entre duas sequências são tipicamente realizadas comparando as sequências numa janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de semelhança de sequência. Uma "janela de comparação", tal como aqui utilizado, refere-se a um segmento de, pelo menos, cerca de 20 posições contíguas, normalmente 30 a cerca de 75, 40 a cerca de 50, em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas, após as duas sequências serem alinhadas de forma óptima. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser realizado utilizando o programa Megalign na suíte de programas de bioinformática Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando parâmetros por defeito. Este programa concretiza vários esquemas de alinhamento descritos nas seguintes referências: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5,

Supl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to

Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. e Sharp, P.M. (1989) Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. e Muller W. (1988) Optimal alignments in linear space CABIOS 4:11-17; Robinson, 13 E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) The neighbor joining method. A new method for reconstructing phylogenetic trees Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. e Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principies and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, w.j. e Lipman, D.J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks Proc. Natl.Acad., Sei. USA 80:726-730.

Alternativamente, o alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser realizado pelo algoritmo de identidade local de Smith e Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, pelo algoritmo de alinhamento de identidade de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pela pesquisa de métodos de semelhança de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85: 2444, por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no pacote de programas Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspecção.

Um exemplo ilustrativo de algoritmos que são adequados para determinar a percentagem de identidade de sequência e semelhança de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que estão descritos em Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. O BLAST e BLAST 2,0 podem ser utilizados, por exemplo, com os parâmetros aqui descritos, para determinar a percentagem de identidade de sequência para os polinucleótidos e polipéptidos da invenção. O programa para realizar análises BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) . Num exemplo ilustrativo, as pontuações cumulativas podem ser 14 calculadas utilizando, para sequências de nucleótidos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0 e N (pontuação de penalização para resíduos não correspondentes; sempre < 0) . Para sequências de aminoácidos, pode-se utilizar uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão das correspondências de palavras em cada direcção é parada quando: a pontuação de alinhamento cumulativo sai fora pela quantidade X do seu valor máximo atinqido; a pontuação cumulativa chega a zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou é atingido o final de cada uma das sequências. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleótidos) utiliza como defeito um tamanho de palavra (W) de 11, e uma expectativa (E) de 10 e os alinhamentos da matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915), (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as cadeias.

De um modo preferido, a "percentagem de identidade de sequência" é determinada comparando duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de, pelo menos, 20 posições, em que a porção do polinucleótido ou sequência de aminoácidos na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações (í. e., hiatos) de 20 porcento ou menos, normalmente 5 a 15 porcento, ou 10 a 12 porcento, em comparação com as sequências de referência (que não compreendem adições ou eliminações) para um alinhamento óptimo das duas sequências. A percentagem é calculada determinando o número de posições em que ocorrem as bases de ácido nucleico ou resíduos de aminoácidos idênticos em ambas as sequências, para se obter o número de 15 posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na sequência de referência (i. e., o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100, para se obter a percentagem de identidade de sequência.

Deste modo, a presente invenção proporciona composições e utilizações que envolvem sequências de polipéptidos (e sequências de polinucleótidos que codificam para os referidos polipéptidos) com identidade substancial com as sequências aqui descritas, por exemplo as compreendendo, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou mais de identidade de sequência em comparação com o comprimento total da sequência de referência, utilizando os métodos aqui descritos (e. g., análise blast utilizando parâmetros convencionais como descrito a seguir). Um especialista nesta técnica irá reconhecer que estes valores podem ser adequadamente ajustados para determinar uma identidade correspondente de proteínas codificadas por duas sequências de polinucleótidos tendo em conta a degenerescência dos codões, semelhança de aminoácidos, posicionamento das sequências de leitura e semelhantes.

Os polinucleótidos de utilização na presente invenção, independentemente do comprimento da própria sequência codificante, podem ser combinados com outras sequências de ADN, tais como promotores, sinais de poliadenilação, sitios de enzimas de restrição adicionais, sitios de clonagem múltipla, outros segmentos codificantes e semelhantes, de modo que o seu comprimento global pode variar consideravelmente. Deste modo, é contemplado que se possa utilizar um fragmento de ácido nucleico de praticamente qualquer comprimento, sendo o comprimento total de um modo preferido limitado pela facilidade de preparação e 16 utilização no protocolo de ADN recombinante pretendido. Por exemplo, os segmentos de ADN ilustrativos com comprimentos totais de cerca de 10.000, cerca de 5.000, cerca de 3.000, cerca de 2.000 pares de bases de comprimento e semelhantes (incluindo todos os comprimentos intermediários) são contemplados como úteis em muitas implementações desta invenção.

As variantes de polinucleótido incluem alelos dos genes que codificam para a sequência de nucleótidos aqui descrita. Tal como aqui utilizado, um "alelo" ou "sequência alélica" é uma forma alternativa do gene que pode resultar de, pelo menos, uma mutação na sequência de ácidos nucleicos. Os alelos podem resultar em ARNm alterados ou polipéptidos cuja estrutura ou função pode ou não ser alterada. Qualquer gene pode ter nenhuma, uma ou muitas formas alélicas. As alterações mutacionais comuns que originam alelos são geralmente atribuídas a eliminações, adições ou substituições de nucleótidos naturais. Cada um deste tipo de alterações pode ocorrer isolado ou em combinação com as outras, uma ou mais vezes numa determinada sequência.

Em geral, os antigénios de Chlamydia e as sequências de polinucleótidos que codificam para estes antigénios, podem ser preparados utilizando qualquer um de uma variedade de processos. Por exemplo, as moléculas de polinucleótido que codificam para antigénios de Chlamydia podem ser isoladas de uma biblioteca de expressão genómica ou de ADNc de Chlamydia por pesquisa com uma linha de células T específica de Chlamydia, tal como descrito a seguir e sequenciadas utilizando técnicas bem conhecidas dos especialistas na técnica. Adicionalmente, um polinucleótido pode ser identificado, como descrito em mais detalhe a seguir, por pesquisa de um microarranjo de ADNc para expressão associada a Chlamydia (i. e., expressão que é, pelo menos, duas vezes maior 17 em células infectadas com Chlamydia do que nos controlos, tal como determinado utilizando um ensaio representativo aqui proporcionado). Estas pesquisas podem ser realizadas utilizando um microarranjo Synteni (Paio Alto, CA) de acordo com as instruções do fabricante (e essencialmente como descrito por Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:10614-10619, 1996 e Heller et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 94:2150-2155, 1997). Alternativamente, os polipéptidos podem ser amplificados a partir de ADNc preparado a partir de células que expressam as proteinas aqui descritas. Estes polinucleótidos podem ser amplificados através da reacção em cadeia com polimerase (PCR). Para esta abordagem, podem-se conceber iniciadores específicos de sequência com base nas sequências aqui proporcionadas e estes podem ser adquiridos ou sintetizados.

Os antigénios podem ser produzidos de forma recombinante, como descrito a seguir, inserindo uma sequência de polinucleótido que codifica para o antigénio num vector de expressão e expressando o antigénio num hospedeiro adequado. Os antigénios podem ser avaliados quanto a uma propriedade desejada, tal como a capacidade para reagir com soros obtidos de um indivíduo infectado com Chlamydia, tal como aqui descrito e podem ser sequenciados utilizando, por exemplo, química de Edman tradicional. Ver Edman e Berg, Eur. J. Biochem. 80:116-132, 1967.

As sequências de polinucleótido que codificam para antigénios também podem ser obtidas pesquisando uma biblioteca adequada de ADNc ou adn genómico de Chlamydia para sequências de polinucleótido que hibridam com oligonucleótidos degenerados derivados de sequências de aminoácidos parciais de antigénios isolados. As sequências de oligonucleótidos degeneradas para 18 utilização nesta pesquisa podem ser concebidas e sintetizadas e a pesquisa pode ser realizada, como descrito (por exemplo) em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (e referências ai citadas). A reacção em cadeia com polimerase (PCR) também pode ser utilizada, utilizando os oligonucleótidos acima em métodos bem conhecidos na técnica, para isolar uma sonda de ácidos nucleicos de uma biblioteca de ADNc ou genómica. A pesquisa da biblioteca pode ser então realizada utilizando a sonda isolada.

Pode-se utilizar uma porção amplificada para isolar um gene de comprimento total a partir de uma biblioteca adequada (e. g. uma biblioteca de ADNc de Chlamydia) utilizando técnicas bem conhecidas. Nestas técnicas, pesquisa-se uma biblioteca (ADNc ou genómica) utilizando uma ou mais sondas de polinucleótido ou iniciadores adequados para amplificação. De um modo preferido, selecciona-se uma biblioteca por tamanho para incluir moléculas maiores. As bibliotecas analisadas com iniciadores aleatórios também poderão ser preferidas para identificar regiões de genes 5' e a montante. As bibliotecas genómicas são preferidas para obter intrões e aumentar as sequências 5'.

Para técnicas de hibridação, pode-se marcar uma sequência parcial (e. g. por tradução-nick ou marcação de extremidade com 32P) utilizando técnicas bem conhecidas. Em seguida faz-se a pesquisa de uma biblioteca bacteriana ou de bacteriófagos hibridando filtros contendo colónias bacterianas desnaturadas (ou camadas contendo placas de fagos) com a sonda marcada (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). As colónias de hibridação ou placas são seleccionadas e expandidas 19 e o ADN é isolado para posterior análise. Os clones de ADNc podem ser analisados para determinar a quantidade de sequência adicional, por exemplo, por PCR utilizando um iniciador da sequência parcial e um iniciador do vector. Podem-se gerar mapas de restrição e sequências parciais para identificar um ou mais clones sobreponiveis. A sequência completa pode ser então determinada utilizando técnicas convencionais que podem envolver a produção de uma série de clones de eliminação. As sequências sobreponiveis resultantes são então montadas numa única sequência contigua. Pode-se produzir uma molécula de ADNc de comprimento total ligando fragmentos adequados, utilizando técnicas bem conhecidas.

Alternativamente, existem várias técnicas de amplificação para obter uma sequência codificante de comprimento total a partir de uma sequência de ADNc parcial. Nestas técnicas, a amplificação é geralmente realizada por PCR. Pode-se utilizar qualquer um de uma variedade de kits comercialmente disponíveis para realizar o passo de amplificação. Podem-se conceber iniciadores utilizando técnicas bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Mullis et ai., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989) e também se pode utilizar software bem conhecido na técnica. Os iniciadores têm de um modo preferido 22-30 nucleótidos de comprimento, têm um teor de GC de, pelo menos, 50% e emparelham com a sequência alvo a temperaturas de cerca de 68 °C a 72 °C. A região amplificada pode ser sequenciada como descrito acima e as sequências sobreponiveis podem ser montadas numa sequência contígua.

Uma destas técnicas de amplificação é a PCR inversa (ver Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988) que utiliza 20 enzimas de restrição para produzir um fragmento na região conhecida do gene. 0 fragmento é então circularizado por ligação intramolecular e utilizado como modelo para PCR com iniciadores divergentes derivados a partir da região conhecida. Numa abordagem alternativa, podem-se recuperar sequências adjacentes a uma sequência parcial por amplificação com um iniciador para uma sequência ligante e um iniciador especifico para uma região conhecida. As sequências amplificadas são tipicamente submetidas a um segundo ciclo de amplificação com o mesmo iniciador ligante e um segundo iniciador especifico para a região conhecida. Uma variação neste processo, que utiliza dois iniciadores para iniciar o alongamento em direcções opostas a partir da sequência conhecida, está descrito no documento WO 96/38591. Técnicas adicionais incluem PCR de captura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991) e PCR walking (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60, 1991). Amplificação Mediada por Transcrição ou TMA é outro método que pode ser utilizado para a amplificação de ADN, ARNr ou ARNm, como descrito na Patente N° PCT/US91/03184. Este método não baseado em PCR, autocatalitico e isotérmico utiliza dois iniciadores e duas enzimas: polimerase de ARN e transcriptase inversa. Um iniciador contém uma sequência promotora para polimerase de ARN. Na primeira amplificação, o promotor-iniciador híbrida com o ARNr alvo num sítio definido. A transcriptase inversa cria uma cópia de ADN do ARNr alvo por alongamento a partir da extremidade 3' do promotor-iniciador. O ARN no complexo resultante é degradado e um segundo iniciador liga-se à cópia de ADN. É sintetizada uma nova cadeia de ADN a partir da extremidade do iniciador por transcriptase inversa, criando ADN de cadeia dupla. A polimerase de ARN reconhece a sequência do promotor no modelo de ADN e inicia a transcrição. Cada um dos amplicões de ARN sintetizados re-inicia o processo de TMA e serve como um modelo para um novo 21 ciclo de replicação, levando à expansão exponencial do amplicão de ARN. Podem-se utilizar outros métodos que utilizam amplificação para obter uma sequência de ADNc de comprimento total.

Nalguns casos, é possível obter uma sequência de ADNc de tamanho total por análise de sequências proporcionadas numa base de dados de sinal de sequência expressa (EST - expressed sequence tag), tal como a que está disponível da GenBank. As pesquisas de EST sobreponíveis pode ser geralmente realizada utilizando programas bem conhecidos (e. g. pesquisas NCBI BLAST) e estes EST podem ser utilizados para gerar uma sequência de comprimento total contígua. As sequências de ADNc de comprimento total também podem ser obtidas por análise de fragmentos genómicos.

As variantes de polinucleótidos podem ser geralmente preparadas por qualquer método conhecido na técnica, incluindo síntese química por, por exemplo, síntese química de fosforamidite em fase sólida. Podem-se também introduzir modificações numa sequência de polinucleótidos utilizando técnicas de mutagénese convencionais, tais como mutagénese específica do sítio dirigida por oligonucleótidos (ver Adelman et al., DNA 2:183, 1983). Alternativamente, as moléculas de ARN podem ser produzidas por transcrição in vitro ou in vivo de sequências de ADN que codificam para uma proteína de Chlamydia, ou uma sua porção, desde que o ADN seja incorporado num vector com um promotor de polimerase de ARN adequado (tal como T7 ou SP6). Algumas porções podem ser utilizadas para preparar um polipéptido codificado, como aqui descrito. Além disso, ou alternativamente, pode-se administrar uma porção a um doente, de modo que o polipéptido codificado é produzido in vivo (e. g., 22 transfectando células que apresentam antigénios, tais como células dendriticas, com uma construção de ADNc que codifica para um polipéptido de Chlamydia e administrando as células transfectadas ao doente).

Uma porção de uma sequência complementar a uma sequência codificante (í. e., um polinucleótido de anti-sentido) pode também ser utilizada como sonda, ou para modular a expressão de genes. As construções de ADNc que podem ser transcritas em ARN anti-sentido também podem ser introduzidas em células de tecidos para facilitar a produção de ARN anti-sentido. Pode-se utilizar um polinucleótido anti-sentido, como aqui descrito, para inibir a expressão de uma proteína de Chlamydia. Pode-se utilizar tecnologia de anti-sentido para controlar a expressão de genes através da formação de uma hélice tripla, o que compromete a capacidade da hélice dupla se abrir de forma suficiente para a ligação de polimerases, factores de transcrição ou moléculas reguladoras (ver Gee et al., In Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY; 1994)). Alternativamente, uma molécula de anti-sentido pode ser concebida para hibridar com uma região de controlo de um gene (e. g., um promotor, potenciador ou sítio de iniciação da transcrição) e bloquear a transcrição do gene; ou para bloquear a tradução inibindo a ligação de uma molécula transcrita a ribossomas.

Pode-se também conceber uma porção de uma sequência codificante ou de uma sequência complementar, como uma sonda ou iniciador, para detectar a expressão de genes. As sondas podem ser marcadas com uma variedade de grupos repórter, tais como radionuclidos e enzimas e têm de um modo preferido, pelo menos, 10 nucleótidos de comprimento, de um modo mais preferido, pelo 23 menos, 20 nucleótidos de comprimento e de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 30 nucleótidos de comprimento. Os iniciadores, como referido acima, têm de um modo preferido 22-30 nucleótidos de comprimento.

Qualquer polinucleótido pode ser também modificado para aumentar a estabilidade in vivo. As modificações possíveis incluem, mas não se limitam a, adição de sequências flanqueadoras nas extremidades 5' e/ou 3'; utilização de fosforotioato ou 2' O-metilo em vez das ligações de fosfodiesterase no esqueleto; e/ou a inclusão de bases não tradicionais, tais como inosina, queosina, e vibutosina, bem como acetil-, metil-, tio- e outras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina e uridina.

As sequências de nucleótidos como aqui descritas podem ser ligadas a uma variedade de outras sequências de nucleótidos utilizando técnicas de ADN recombinante estabelecidas. Por exemplo, um polinucleótido pode ser clonado numa variedade de vectores de clonagem, incluindo plasmídeos, fagemideos, derivados do fago lambda e cosmideos. Os vectores de interesse particular incluem vectores de expressão, vectores de replicação, vectores de produção de sondas e vectores de sequenciação. Em geral, um vector irá conter uma origem de replicação funcional em, pelo menos , um organismo, sítios de endonuclease de restrição convenientes e um ou mais marcadores seleccionáveis. Outros elementos irão depender da utilização pretendida e serão evidentes para os especialistas na técnica.

Os polipéptidos sintéticos que têm menos de cerca de 100 aminoácidos e geralmente menos de cerca de 50 aminoácidos podem ser produzidos utilizando técnicas bem conhecidas na 24 técnica. Por exemplo, estes polipéptidos podem ser sintetizados utilizando qualquer uma das técnicas de fase sólida disponíveis comercialmente, tal como o método de síntese em fase sólida de Merrifield, em que os aminoácidos são adicionados sequencialmente a uma cadeia de aminoácidos crescente. Ver Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. 0 equipamento para a síntese automática de polipéptidos está disponível comercialmente de fornecedores como a Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA e pode ser operado de acordo com as instruções do fabricante.

As porções imunogénicas dos antigénios de Chlamydia podem ser preparadas e identificadas utilizando técnicas bem conhecidas, tais como as resumidas em Paul, Fundamental Immunology, 3a ed., Raven Press, 1993, pp. 243-247 e referências aí citadas. Estas técnicas incluem porções de polipéptidos de pesquisa do antigénio nativo, para propriedades imunogénicas. As ELISA representativas aqui descritas podem ser geralmente utilizadas nestas pesquisas. Uma porção imunogénica de um polipéptido é uma porção que, nestes ensaios representativos, produz um sinal nestes ensaios que é substancialmente semelhante ao produzido pelo antigénio de comprimento total. Por outras palavras, uma porção imunogénica de um antigénio de Chlamydia produz, pelo menos, cerca de 20% e de um modo preferido cerca de 100% do sinal induzido pelo antigénio de comprimento total, numa ELISA modelo, como aqui descrito.

Podem-se gerar porções e outras variantes de antigénios de Chlamydia por meios sintéticos ou recombinantes. As variantes de um antigénio nativo podem ser geralmente preparadas utilizando técnicas de mutagénese convencionais, tais como mutagénese específica do sítio dirigida por oligonucleótidos. Também se 25 podem remover secções da sequência de polinucleótido utilizando técnicas convencionais para permitir a preparação de polipéptidos truncados.

Os polipéptidos recombinantes que contêm porções e/ou variantes de um antigénio nativo podem ser facilmente preparados a partir de uma sequência de polinucleótido que codifica para o polipéptido, utilizando uma variedade de técnicas bem conhecidas dos especialistas na técnica. Por exemplo, os sobrenadantes de sistemas hospedeiro/vector adequados que segregam proteina recombinante para o meio de cultura podem ser primeiro concentrados utilizando um filtro comercialmente disponível. Após concentração, o concentrado pode ser aplicado numa matriz de purificação adequada, tal como uma matriz de afinidade ou uma resina de troca iónica. Por fim, pode-se utilizar um ou mais passos de HPLC de fase inversa para purificar posteriormente uma proteína recombinante.

Pode-se utilizar qualquer um de uma variedade de vectores de expressão conhecidos dos especialistas na técnica para expressar polipéptidos recombinantes, como aqui descrito. A expressão pode ser obtida em qualquer célula hospedeira adequada que tenha sido transformada ou transfectada com um vector de expressão que contém uma molécula de polinucleótido que codifica para um polipéptido recombinante. Células hospedeiras adequadas incluem procariotas, células de levedura e eucariotas superiores. De um modo preferido, as células hospedeiras utilizadas são E. colia levedura ou uma linha celular de mamífero, tal como COS ou CHO. As sequências de adn expressas deste modo podem codificar para antigénios que ocorrem naturalmente, porções de antigénios que ocorrem naturalmente, ou outras suas variantes. 26

Em geral, independentemente do método de preparação, os polipéptidos aqui descritos são preparados numa forma isolada, substancialmente pura. De um modo preferido, os polipéptidos são, pelo menos, cerca de 80% puros, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 90% puros e de um modo muito preferido, pelo menos, 99% puros.

Nalgumas formas de realização específicas, um polipéptido pode ser uma proteína de fusão compreendendo vários polipéptidos compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431 ou uma sua variante que tem, pelo menos, 90% de identidade de sequência com esta, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da SEQ ID N°: 431, ou compreendendo, pelo menos, um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante que tem, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da SEQ ID N°: 431 e uma sequência não relacionada, tal como uma proteína de Chlamydia conhecida. Um parceiro de fusão pode, por exemplo, auxiliar no fornecimento de epítopos T ajudantes (um parceiro de fusão imunológica), de um modo preferido epítopos T ajudante reconhecidos por humanos, ou pode auxiliar na expressão da proteína (um potenciador de expressão) com rendimentos mais elevados do que a proteína recombinante nativa. Alguns parceiros de fusão preferidos são ambos parceiros de fusão imunológica e potenciadores de expressão. Outros parceiros de fusão podem ser seleccionados de modo a aumentar a solubilidade da proteína ou a permitir que a proteína seja direccionada para compartimentos intracelulares desejados. Ainda outros parceiros de fusão incluem sinais de afinidade que facilitam a purificação da proteína. Pode-se construir uma sequência de ADN que codifica 27 para uma proteína de fusão na presente invenção utilizando técnicas de ADN recombinantes conhecidas para montar sequências de ADN separadas que codificam para, por exemplo, o primeiro e segundo polipéptidos, num vector de expressão adequado. A extremidade 3' de uma sequência de ADN que codifica para o primeiro polipéptido é ligada, com ou sem um ligante peptídico, à extremidade 5' de uma sequência de ADN que codifica para o segundo polipéptido, de modo que as sequências de leitura das sequências estão em fase, para permitir a tradução de ARNm das duas sequências de ADN numa única proteína de fusão que retém a actividade biológica de ambos, o primeiro e o segundo polipéptido.

Pode-se utilizar uma sequência ligante peptídica para separar o primeiro e o segundo polipéptido por uma distância suficiente para assegurar que cada polipéptido se enrola nas suas estruturas secundária e terciária. Esta sequência ligante peptídica é incorporada na proteína de fusão utilizando técnicas convencionais bem conhecidas na técnica. As sequências ligantes peptídicas adequadas podem ser seleccionadas com base nos seguintes factores: (1) a sua capacidade para adoptar uma conformação alongada flexível; (2) a sua incapacidade para adoptar uma estrutura secundária que poderia interagir com epítopos funcionais no primeiro e segundo polipéptidos; e (3) a ausência de resíduos hidrófobos ou carregados que possam reagir com os epítopos funcionais do polipéptido. As sequências ligantes peptídicas preferidas contêm resíduos de Gly, Asn, e Ser. Também se podem utilizar na sequência ligante outros aminoácidos neutros próximos, tais como Thr e Ala. As sequências de aminoácidos que podem ser utilizadas de forma útil como ligantes incluem as que estão descritas em Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 28 83:8258-8562, 1986; Patente U.S. N° 4935233 e Patente U.S. N° 4751180. A sequência ligante pode ter de 1 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento. Como alternativa à utilização de uma sequência ligante peptidica (quando desejado) podem-se utilizar regiões de aminoácido do terminal N não essenciais (quando presentes) no primeiro e segundo polipéptido, para separar os domínios funcionais e prevenir impedimentos estéricos.

As sequências de adn ligadas estão ligadas de forma operacional a elementos reguladores da transcrição ou tradução adequados. Os elementos reguladores responsáveis pela expressão de ADN estão localizados apenas 5' em relação à sequência de ADN que codifica para os primeiros polipéptidos. De igual modo, os codões de terminação necessários para terminar a tradução e os sinais de terminação da transcrição estão apenas presentes 3' em relação à sequência de ADN que codifica para o segundo polipéptido.

Também se proporcionam composições compreendendo proteínas de fusão, compreendendo um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com esta, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da SEQ ID N°: 431, juntamente com uma proteína imunogénica não relacionada. De um modo preferido, a proteína imunogénica é capaz de desencadear uma resposta de evocação. Exemplos destas proteínas incluem proteínas de tétano, tuberculose e hepatite (ver, por exemplo, Stoute et al. New Engl. J. Med., 336:86-91,1997). 29

Em formas de realização preferidas, um parceiro de fusão imunológica é derivado da proteína D, uma proteína de superfície da bactéria gram-negativa Haemophilus influenza B (documento WO 91/18926) . De um modo preferido, um derivado de proteína D compreende, aproximadamente, a primeira terça parte da proteína (e. g., os primeiros 100-110 aminoácidos do terminal N) e um derivado de proteína D pode ser lipidado. Nalgumas formas de realização preferidas, os primeiros 109 resíduos de um parceiro de fusão de lipoproteína D são incluídos no terminal N para se obter o polipéptido com epítopos de células-τ exógenos adicionais e para aumentar o nível de expressão em E. coli (funcionando assim como um potenciador de expressão). A cauda lipídica assegura a apresentação óptima do antigénio às células que apresentam antigénio. Outros parceiros de fusão incluem a proteína não estrutural do vírus de influenza, NS1 (hemaglutinina). Tipicamente, utilizam-se os 81 aminoácidos do terminal N, embora se possam utilizar diferentes fragmentos que incluem epítopos de T ajudantes.

Noutra forma de realização, o parceiro de fusão imunológica é a proteína conhecida como LYTA, ou uma sua porção (de um modo preferido uma porção do terminal C) . A LYTA é derivada do Streptococcus pneumoniae que sintetiza uma N-acetil-L-alanina amidase conhecida como amidase LYTA (codificada pelo gene LytA; Gene 43:265-292, 1986). A LYTA é uma autolisina que degrada especificamente algumas ligações no esqueleto de peptidoglicano. O domínio do terminal C da proteína LYTA é responsável pela afinidade para a colina, ou para alguns análogos de colina, tais como deae. Esta propriedade foi explorada para o desenvolvimento de plasmídeos que expressam C-LYTA de E. coli útil para a expressão de proteínas de fusão. A purificação de proteínas híbridas que contêm o fragmento C-LYTA no terminal amino foi 30 descrita (ver Biotechnology 10:795-798, 1992). Numa forma de realização preferida, uma porção repetida de LYTA pode ser incorporada numa proteina de fusão. É encontrada uma porção de repetição na região do terminal C, começando no residuo 178. Uma porção de repetição particularmente preferida incorpora os residuos 188-305.

Pode-se ligar um polinucleótido Ral2 derivado de Mycobacterium tuberculosis a um polinucleótido que codifica para um polipéptido compreendendo a sequência SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da SEQ ID N°: 431. As composições de Ral2 e métodos para a sua utilização para potenciar a expressão de sequências de polinucleótidos heterólogas estão descritas no Pedido de Patente U.S. 60/158585. Resumidamente, Ral2 refere-se a uma região de polinucleótido que é uma subsequência de um ácido nucleico de MTB32A de Mycobacterium tuberculosis. A MTB32A é uma serina protease com um peso molecular de 32 KD codificada por um gene em estirpes virulentas e não virulentas de M. tuberculosis. A sequência de nucleótidos e sequência de aminoácidos de MTB32A foram descritas (Pedido de Patente U.S. 60/158585; ver também Skeiky et al., Infection and Immun. (1999) 67:3998-4007. Numa forma de realização, o polipéptido Ral2 utilizado na produção de polipéptidos de fusão compreende um fragmento do terminal C da sequência codificante de MTB32A que é eficaz para potenciar a expressão e/ou imunogenecidade de polipéptidos antigénicos de clamidia heterólogos com os quais está fundido. O polipéptido Ral2 pode também corresponder a um fragmento do terminal C de aproximadamente 14 kD de MTB32A compreendendo alguns ou todos os residuos de aminoácido 192 a 323 de MTB32A. 31

Os ácidos nucleicos recombinantes que codificam para um polipéptido de fusão compreendendo um polipéptido Ral2 e um polipéptido de Chlamydia heterólogo compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da SEQ ID N°: 431, podem ser facilmente construídos por técnicas de engenharia genética convencionais. Os ácidos nucleicos recombinantes são construídos de modo que, de um modo preferido, uma sequência de polinucleótido Ral2 está localizada 5' em relação a uma sequência de polinucleótidos de clamídia heteróloga, seleccionada. Poderá também ser adequado colocar uma sequência de polinucleótidos Ral2 3' em relação a uma sequência de polinucleótidos heteróloga seleccionada, ou inserir uma sequência de polinucleótidos heteróloga num sítio dentro de uma sequência de polinucleótido Ral2.

Adicionalmente, pode-se utilizar qualquer polinucleótido adequado que codifica para uma Ral2, ou uma sua porção, ou outra sua variante na construção de polinucleótidos de fusão recombinantes compreendendo Ral2 e um ou mais polinucleótidos de clamídia compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da SEQ ID N°: 431. Os polinucleótidos Ral2 preferidos compreendem geralmente, pelo menos, cerca de 15 nucleótidos consecutivos, pelo menos, cerca de 30 nucleótidos, pelo menos, cerca de 60 nucleótidos, pelo menos, cerca de 100 nucleótidos, pelo menos, cerca de 200 nucleótidos, ou, pelo 32 menos, cerca de 300 nucleótidos que codificam para uma porção de um polipéptido Ral2.

Os polinucleótidos Ral2 podem compreender uma sequência nativa (i. e., uma sequência endógena que codifica para um polipéptido Ral2 ou uma sua porção), ou podem compreender uma variante desta sequência. As variantes do polinucleótido Ral2 podem conter uma ou mais substituições, adições, eliminações e/ou inserções, de modo que a actividade biológica do polipéptido de fusão codificado não é substancialmente diminuída, em relação a um polipéptido de fusão compreendendo um polipéptido Ral2 nativo. As variantes exibem de um modo preferido, pelo menos, cerca de 70% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 80% de identidade e de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 90% de identidade com uma sequência de polinucleótidos que codifica para um polipéptido Ral2 nativo, ou uma sua porção.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona composições compreendendo um ou mais dos polipéptidos ou proteínas de fusão acima (ou polinucleótidos que codificam para estes polipéptidos ou proteínas de fusão) para induzir imunidade protectora contra a infecção por clamídia num doente. Tal como aqui utilizado, um "doente" refere-se a qualquer animal de sangue quente, de um modo preferido um humano. Um doente pode ter a doença, ou pode estar livre de doença e/ou infecção detectável. Por outras palavras, a imunidade protectora pode ser induzida para prevenir ou tratar a infecção por clamídia.

Neste aspecto, o polipéptido, proteína de fusão ou molécula de polinucleótido estão geralmente presentes numa composição farmacêutica ou vacina. As composições farmacêuticas podem 33 compreender um ou mais polipéptidos, podendo cada um conter uma ou mais das sequências acima (ou suas variantes) e um veiculo fisiologicamente aceitável. As vacinas podem compreender um ou mais dos polipéptidos acima e um imunoestimulante, tal como um adjuvante ou um lipossoma (no qual o polipéptido está incorporado). Estas composições farmacêuticas e vacinas podem também conter outros antigénios de Chlamydia, quer incorporados num polipéptido de combinação, quer presentes num polipéptido separado.

Alternativamente, uma vacina pode conter polinucleótidos que codificam para um ou mais polipéptidos ou proteínas de fusão como descrito acima, de modo que o polipéptido é produzido in situ. Nestas vacinas, os polinucleótidos podem estar presentes em qualquer um de uma variedade de sistemas de fornecimento conhecidos dos especialistas na técnica, incluindo sistemas de expressão de ácido nucleico, sistemas de expressão bacterianos e virais. Os sistemas de expressão de ácido nucleico adequados contêm as sequências de polinucleótido necessárias para expressão no doente (tal como um promotor adequado e sinal de terminação). Os sistemas de fornecimento bacteriano envolvem a administração de uma bactéria (tal como Bacillus-Calmette-Guerriri) que expressa o polipéptido na sua superfície celular. Numa forma de realização preferida, os polinucleótidos podem ser introduzidos utilizando um sistema de expressão virai (e. g., vacínia ou outro vírus pox, retrovírus ou adenovírus) que pode envolver a utilização de um vírus não patogénico (deficiente) . As técnicas para incorporar polinucleótidos nestes sistemas de expressão são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Os polinucleótidos podem também ser administrados como vectores plasmídicos "nus", como descrito, por exemplo, em Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 e revisto por Cohen, Science 34 259:1691-1692, 1993. As técnicas para incorporar ADN nestes vectores são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Um vector retroviral pode transferir ou incorporar adicionalmente um gene para um marcador seleccionável (para auxiliar na identificação ou selecção de células transduzidas) e/ou uma porção de direccionamento para um alvo, tal como um gene que codifica para um ligando para um receptor numa célula alvo especifica, para tornar o vector especifico para um alvo. 0 direccionamento para um alvo pode também ser realizado utilizando um anticorpo, por métodos conhecidos dos especialistas na técnica.

Outras formulações para fins terapêuticos incluem sistemas de dispersão coloidal, tais como complexos de macromoléculas,

nanocápsulas, microesferas, pérolas e sistemas baseados em lipidos, incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas. Um sistema coloidal preferido para utilização como veiculo de fornecimento in vitro e in vivo é um lipossoma (i. e., uma vesícula de membrana artificial). A incorporação de polinucleótidos nus pode ser aumentada incorporando os polinucleótidos dentro e/ou sobre pérolas biodegradáveis, que são eficazmente transportadas para dentro das células. A preparação e utilização destes sistemas é bem conhecida na técnica.

Num aspecto relacionado, uma vacina de polinucleótido como descrito acima pode ser administrada em simultâneo com, ou sequencialmente, quer com um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ id N°: 431, ou uma sua variante que tem, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da 35 SEQ ID N°: 431, ou um antigénio de Chlamydia conhecido. Por exemplo, a administração de polinucleótidos que codificam para um polipéptido da presente invenção, quer "nu", quer num sistema de fornecimento como descrito acima, pode ser seguida de administração de um antigénio de modo a aumentar o efeito imunitário protector da vacina.

Dentro de certos aspectos, os polipéptidos e/ou polinucleótidos podem ser incorporados em composições farmacêuticas ou composições imunogénicas (i. e., vacinas). As composições farmacêuticas compreendem um ou mais destes compostos e um veiculo fisiologicamente aceitável. As vacinas podem compreender um ou mais destes compostos e um imunoestimulante. Um imunoestimulante pode ser qualquer substância que aumenta ou potência uma resposta imunitária a um antigénio exógeno. Exemplos de imunoestimulantes incluem adjuvantes, microesferas biodegradáveis (e. g., poliláctico galáctido) e lipossomas (nos quais o composto é incorporado; ver, e. g., Fullerton, Patente U.S. N° 4235877). A preparação de vacina está descrita em geral em, por exemplo, M.F. Powell e M.J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press (NY, 1995). As composições farmacêuticas e vacinas no âmbito da presente invenção também podem conter outros compostos que podem ser biologicamente activos ou inactivos. Por exemplo, pode estar presente uma ou mais porções imunogénicas de outros antigénios de Chlamydia, quer incorporadas num polipéptido de fusão, quer como um composto separado, na composição ou vacina.

Uma composição farmacêutica ou vacina pode conter ADN que codifica para um ou mais dos polipéptidos como descrito acima, de modo que o polipéptido é produzido in situ. Como referido 36 acima, o ADN pode estar presente em qualquer um de uma variedade de sistemas de fornecimento conhecidos dos especialistas na técnica, incluindo sistemas de expressão de ácido nucleico, sistemas de expressão bacterianos e virais. São bem conhecidas na técnica várias técnicas de fornecimento de genes, tais como as descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998 e referência aí citadas. Os sistemas de expressão de ácidos nucleicos adequados contêm as sequências de ADN necessárias para a expressão no doente (tal como um promotor adequado e sinal de terminação). Os sistemas de fornecimento bacterianos envolvem a administração de uma bactéria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expressa uma porção imunogénica do polipéptido na sua superfície celular, ou segrega um epítopo deste tipo.

Numa forma de realização preferida, o ADN pode ser introduzido utilizando um sistema de expressão virai (e. g., vacínia ou outro vírus pox, retrovírus, adenovírus, baculovírus, togavírus, bacteriófago e semelhantes) que muitas vezes envolve a utilização de um vírus competente para replicação, não patogénico (deficiente) .

Por exemplo, muitos vectores de expressão virai são derivados de vírus da família retroviridae. Esta família inclui os vírus de leucemia de murídeo, vírus de tumor mamário de ratinho, vírus espumosos humanos, vírus de sarcoma de Rous e os vírus de imunodeficiência, incluindo humano, de símio e felino As considerações feitas na concepção de vectores de expressão retrovirais estão discutidas em Comstock et al. (1997).

Kim et al. (1998) desenvolveram vectores de expressão virai baseados no vírus de leucemia de murídeo (MLV), excelentes. Ao 37 criar os vectores MLV, Kim et al. verificaram que toda a sequência gag, juntamente com a região imediatamente a montante podiam ser eliminadas sem afectar de forma significativa o empacotamento virai ou a expressão de genes. Além disso, verificou-se que quase toda a região U3 podia ser substituída com o promotor precoce imediato do citomegalovírus humano, sem efeitos prejudiciais. Adicionalmente, podiam adicionar-se MCR e sítios de entrada de ribossoma internos (IRES), sem efeitos adversos. Com base nas suas observações, Kim et al. conceberam uma série de vectores de expressão baseados em mlv compreendendo uma ou mais das características descritas acima. À medida que mais se foi aprendendo sobre o vírus espumoso humano (HFV), foram observadas características do hfv que são favoráveis para esta utilização como vector de expressão. Estas características incluem a expressão de pol por corte e rearranjo e o início da tradução num codão de iniciação definido. Outros aspectos dos vectores de expressão virai de HFV estão revistos em Bodem et al. (1997).

Murakami et al. (1997) descrevem vectores de retrovírus aviários competentes para a replicação baseados em vírus de sarcoma de Rous (RSY), IRl e IR2, para expressar um gene heterólogo a um nível elevado. Nestes vectores, o IRES derivado do vírus de encefalomiocardite (EMCV) foi inserido entre o gene env e o gene heterólogo. 0 vector IRl retém o sítio aceitador de corte e rearranjo que está presente a jusante do gene env, enquanto que o vector IR2 não o possui. Murakami et al. demonstraram um nível de expressão elevado de vários genes heterólogos diferentes, por estes vectores. 38

Recentemente, foram desenvolvidos vários vectores de expressão retrovirais baseados em lentivírus. Kafri et al. (1997) mostraram uma expressão controlada de genes fornecidos directamente ao fígado e músculo por um vector de expressão baseado no vírus de imunodeficiência humana (VIH). Um benefício do sistema é a capacidade inerente do vih transduzir células que não estão em divisão. Uma vez que os vírus de Kafri et al. são pseudotipados com glicoproteína G do vírus de estomatite vesicular (VSVG), eles podem transduzir uma vasta gama de tecidos e tipos de células.

Foi desenvolvido um grande número de vectores de expressão baseados em adenovírus, essencialmente devido às vantagens oferecidas por estes vectores em aplicações de terapia génica. Os vectores de expressão de adenovírus e métodos que utilizam estes vectores são assunto de várias Patentes dos Estados Unidos, incluindo a Patente dos Estados Unidos N° 5698202, Patente dos Estados Unidos N° 5616326, Patente dos Estados

Unidos N° 5585362, e Patente dos Estados Unidos N° 5518913.

Em Khatri et al., (1997) e Tomanin et al., (1997) estão descritas construções adenovirais adicionais. Khatri et al. descrevem novos vectores de expressão de adenovírus ovinos e a sua capacidade para infectar a concha nasal de bovino e células de rim de coelho, bem como uma gama de tipos de células humanas, incluindo pulmão e fibroblastos de prepúcio, bem como linhas de fígado, próstata, mama, cólon e retina. Tomanin et al., descrevem vectores de expressão adenoviral que contêm o gene de polimerase de ARN de T7. Quando introduzidos em células que contêm um gene heterólogo ligado de forma operacional a um promotor de T7, os vectores foram capazes de conduzir a expressão de genes a partir do promotor de T7. Os autores 39 sugerem que este sistema pode ser útil para a clonagem e expressão de genes que codificam para proteínas citotóxicas.

Os poxvírus são muito utilizados para a expressão de genes heterólogos em células de mamífero. Ao longo dos anos, os vectores têm sido melhorados para permitir a expressão elevada do gene heterólogo e simplificar a integração de genes heterólogos múltiplos numa única molécula. Num esforço para diminuir os efeitos citopáticos e aumentar a segurança, os mutantes do vírus vacínia e outros poxvírus que sofrem infecção abortiva em células de mamífero têm vindo a receber uma atenção especial (Oertli et al., 1997). A utilização de poxvírus como vectores de expressão é revista em Carroll e Moss (1997) .

Os vectores de expressão de togavírus, que incluem vectores de expressão de alfavírus têm sido utilizados para estudar a estrutura e função de proteínas e para fins de produção de proteínas. As características atractivas dos vectores de expressão de togavírus são uma expressão de genes rápida e eficiente, gama de hospedeiros alargada e genomas de ARN (Huang, 1996). Além disso, verificou-se que as vacinas recombinantes baseadas em vectores de expressão alfavirais induzem uma resposta imunitária humoral e celular forte com boa memória imunológica e efeitos protectores (Tubulekas et al., 1997). Os vectores de expressão alfavirais e a sua utilização estão discutidos, por exemplo, em Lundstrom (1997).

Num estudo, Li e Garoff (1996) utilizaram vectores de expressão do vírus da Floresta de SemLiki (SFV) para expressar genes retrovirais e produzir partículas retrovirais em células BHK-21. As partículas produzidas por este método tinham actividade de protease e transcriptase inversa e eram 40 infecciosas. Além disso, não foi possível detectar nenhum vírus ajudante nos repertórios de vírus. Deste modo, este sistema tem características que são atractivas para a sua utilização em protocolos de terapia génica.

Os vectores de expressão de baculovírus têm sido tradicionalmente utilizados para expressar proteínas heterólogas em células de insecto. Exemplos de proteínas incluem receptores de quimoquinas de mamífero (Wang et al., 1997), proteínas repórter, tais como a proteína fluorescente verde (Wu et al., 1997) e proteínas de fusão FLAG (Wu et al.; Koh et al., 1997). Os avanços recentes na tecnologia de vectores de expressão de baculovírus, incluindo a sua utilização em vectores de apresentação de viriões e expressão em células de mamífero são revistos por Possee (1997). Outras revisões sobre vectores de expressão de baculovírus incluem Jones e Morikawa (1996) e 0'Reilly (1997) .

Outros sistemas de expressão virai adequados são descritos, por exemplo, em Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; Patentes U.S. Nos. 4603112, 4769330, e 5017487; WO 89/01973; Patente U.S. N° 4777127; GB 2200651; EP 0345242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al, Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 90:11498-11502,1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; e Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993. As técnicas para incorporar ADN nestes sistemas de expressão são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Noutros sistemas, o ADN pode ser introduzido como ADN "nu", como descrito, por exemplo, em Ulmer 41 et al., Science 259:1745-1749, 1993 e revisto por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. A incorporação de ADN nu pode ser aumentada utilizando ADN para revestir pérolas biodegradáveis que são transportadas de modo eficiente para dentro das células.

Será evidente que uma vacina pode compreender um polinucleótido e/ou um componente polipeptídico, como desejado. Também será evidente que uma vacina pode conter sais farmaceuticamente aceitáveis dos polinucleótidos e/ou polipéptidos. Estes sais podem ser preparados a partir de bases não tóxicas farmaceuticamente aceitáveis, incluindo bases orgânicas (e. g. sais de aminas primárias, secundárias e terciárias e aminoácidos básicos) e bases inorgânicas (e. g. sais de sódio, potássio, litio, amónio, cálcio e magnésio) . Apesar de se poder utilizar qualquer veiculo adequado conhecido dos especialistas na técnica nas composições farmacêuticas da presente invenção, o tipo de veículo irá variar dependendo do modo de administração. As composições da presente invenção podem ser formuladas para qualquer modo de administração adequado, incluindo, por exemplo, administração tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraniana, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. Para administração parentérica, tal como injecção subcutânea, o veículo compreende de um modo preferido água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, pode-se utilizar qualquer um dos veículos acima ou um veículo sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glucose, sacarose e carbonato de magnésio. As microesferas biodegradáveis (e. g. poliglicolato de polilactato) podem também ser utilizadas como veículos para as composições farmacêuticas da presente invenção. As microesferas biodegradáveis adequadas 42 estão descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 4897268 e 5075109.

Estas composições podem também compreender tampões (e. g., solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfato), hidratos de carbono (e. g. glucose, manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos ou aminoácidos, tais como glicina, antioxidantes, bacterioestáticos, agentes quelantes, tais como EDTA ou glutationa, adjuvantes (e. g. hidróxido de alumínio), solutos que tornam a formulação isotónica, hipotónica ou fracamente hipertónica com o sangue de um receptor, agentes de suspensão, agentes espessantes e/ou conservantes. Alternativamente, as composições da presente invenção podem ser formuladas como um liofilizado. Os compostos podem também ser encapsulados dentro dos lipossomas utilizando tecnologia bem conhecida.

Pode-se utilizar qualquer um de uma variedade de imunoestimulantes nas vacinas da presente invenção. Por exemplo, pode-se incluir um adjuvante. A maioria dos adjuvantes contém uma substância concebida para proteger o antigénio contra um catabolismo rápido, tal como hidróxido de alumínio ou óleo mineral e um estimulante da resposta imunitária, tal como o lipido A, proteínas derivadas de Bortadella pertussis ou Mycobacterium tuberculosis. Adjuvantes adequados estão disponíveis comercialmente como, por exemplo, adjuvante incompleto e adjuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); Adjuvante 65 Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); sais de alumínio, tais como gel de hidróxido de alumínio (alum) ou fosfato de alumínio; sais de cálcio, ferro ou zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; glícidos acilados; 43 polissacáridos derivatizados catiónica ou anionicamente; polifosfazenos; microesferas biodegradáveis; lipido A monofosforilo e quil A. Também se podem utilizar como adjuvantes citocinas, tais como GM-CSF ou interleucina-2, -7, ou -12,

Dentro das vacinas aqui proporcionadas, sob circunstâncias seleccionadas, a composição adjuvante pode ser concebida para induzir uma resposta imunitária predominantemente do tipo Thl ou tipo Th2. Níveis elevados de citocinas do tipo Thl (e. g., iFN-γ, TNFa, IL-2 e IL-12) tendem a favorecer a indução de respostas imunitárias mediadas por células a um antigénio administrado. Pelo contrário, níveis elevados de citocinas do tipo Th2 (e. g., (e. g., IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tendem a favorecer a indução de respostas imunitárias humorais. Após a aplicação de uma vacina como aqui proporcionado, um doente irá suportar uma resposta imunitária que inclui respostas do tipo Thl e Th2. Numa forma de realização preferida, em que uma resposta é predominantemente do tipo Thl, o nível de citocinas do tipo Thl irá aumentar para um maior grau do que o nível de citocinas do tipo Th2. Os níveis destas citocinas podem ser facilmente determinados utilizando testes convencionais. Para uma revisão sobre as famílias de citocinas, ver Mosmann e Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173,1989.

Os adjuvantes preferidos a ser utilizados para desencadear uma resposta predominantemente do tipo Thl incluem, por exemplo, uma combinação do monofosforilo lipido A, de um modo preferido o 3-0-desacilado monofosforilo lipido A (3D-MPL), juntamente com um sal de alumínio. Os adjuvantes de MPL estão disponíveis da Corixa Corporation (Seattle, WA; ver Patentes U.S. N°s 4436727; 4877611; 4866034 e 4912094) . Os oligonucleótidos que contêm CpG (em que o dinucleótido de CpG é não metilado) também induzem 44 predominantemente uma resposta de Thl. Estes oligonucleótidos são bem conhecidos e estão descritos, por exemplo, nos documentos WO 96/02555 e WO 99/33488. Também se descrevem sequências de ADN imunoestimulantes, por exemplo, em Sato et ai., Science 273:352, 1996. Outro adjuvante preferido é uma saponina, de um modo preferido QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), que pode ser utilizada isolada, ou em combinação com outros adjuvantes. Por exemplo, um sistema melhorado envolve a combinação de um monofosforilo lipido A e um derivado de saponina, tal como a combinação de QS21 e 3D-MPL, como descrito no documento WO 94/00153, ou uma composição menos reactiva, em que o QS21 é neutralizado com colesterol, como descrito no documento WO 96/33739. Outras formulações preferidas compreendem uma emulsão de óleo-em-água e tocoferol. Uma formulação adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol numa emulsão de óleo-em-água está descrita no documento WO 95/17210.

Outros adjuvantes preferidos incluem Montanide ISA 720 (Seppic, França), SAF (Chiron, Califórnia, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), a série de adjuvantes SBAS (e. g., SBAS-2 ou SBAS-4, disponível da SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium), Detox (Corixa Corporation; Seattle, WA), RC-529 (Corixa Corporation; Seattle, WA) e outros 4-fosfatos de aminoalquilglucosaminida (AGPs), tais como os descritos nos Pedidos de Patente U.S. pendentes com o N° de Série 08/853826 e 09/074720.

Qualquer vacina proporcionada aqui pode ser preparada utilizando métodos bem conhecidos que resultam numa combinação de antigénio, imunoestimulante e um veiculo ou excipiente adequado. As composições aqui descritas podem ser administradas 45 como parte de uma formulação de libertação controlada (i. e., uma formulação tal como uma cápsula, esponja ou gel (composta por polissacáridos, por exemplo) que efectua uma libertação lenta do composto após a administração. Estas formulações podem ser em geral preparadas utilizando tecnologia bem conhecida (ver, e. g., Coombes et al., Vaccine 14:1429-1438, 1996) e administradas por, por exemplo, implantação oral, rectal ou subcutânea, ou por implantação no sitio alvo desejado. As formulações de libertação controlada podem conter um polipéptido, polinucleótido ou anticorpo disperso numa matriz veiculoa e/ou contido num reservatório envolvido por uma membrana de controlo de velocidade.

Os veículos para utilização nestas formulações são

biocompativeis e podem também ser biodegradáveis; de um modo preferido a formulação proporciona um nível relativamente constante de libertação do componente activo. Estes veículos incluem micropartículas de poli (láctido-co-glicólido), bem como poliacrilato, látex, amido, celulose e dextrano. Outros veículos de libertação retardada incluem biovectores supramoleculares, compreendendo um núcleo hidrófilo não líquido (e. g., um polissacárido ou oligossacárido reticulado) e, opcionalmente, uma camada externa compreendendo um composto anfifílico, tal como um fosfolípido (ver, e. g. Patente U.S. N° 5151254 e pedidos PCT WO 94/20078, WO/94/23701 e WO 96/06638). A quantidade de composto activo contida numa formulação de libertação controlada depende do sítio de implantação, da velocidade e duração de libertação esperada e da natureza da condição a ser tratada ou prevenida.

Pode-se utilizar qualquer um de uma variedade de veículos de fornecimento nas composições farmacêuticas e vacinas para facilitar a produção de uma resposta imunitária específica do antigénio que seja dirigida para células infectadas com

Chlamydia.

As vias e frequência de administração de composições farmacêuticas e vacinas, bem como a dosagem, irão variar de indivíduo para indivíduo. Em geral, as composições farmacêuticas e vacinas podem ser administradas por injecção (e. g., intracutânea, intramuscular, intravenosa ou subcutânea), intranasalmente (e. g., por aspiração) ou oralmente. Pode-se administrar entre 1 e 3 doses durante um período de 1-36 semanas. De um modo preferido, administram-se 3 doses, a intervalos de 3-4 meses e podem-se administrar vacinas de reforço periodicamente, a seguir. Poderão ser adequados protocolos alternativos para doentes individuais. Uma dose adequada é uma quantidade de polipéptido ou ADN que, quando administrada como descrito acima, é capaz de produzir uma resposta imunitária num doente imunizado, suficiente para proteger o doente da infecção por Chlamydia durante, pelo menos, 1-2 anos. Em geral, a quantidade de polipéptido presente numa dose (ou produzido in situ pelo ADN numa dose) varia entre cerca de 1 pg a cerca de 100 mg por kg de hospedeiro, tipicamente de cerca de 10 pg a cerca de 1 mg e, de um modo preferido, de cerca de 100 pg a cerca de 1 pg. A quantidade da dose adequada varia com o tamanho do doente, mas será tipicamente na gama de cerca de 0,1 mL a cerca de 5 mL.

Apesar de se poder utilizar qualquer veículo adequado conhecido dos especialistas na técnica nas composições farmacêuticas da presente invenção, o tipo de veículo irá variar dependendo do modo de administração. Para administração parentérica, tal como injecção subcutânea, o veículo compreende 47 de um modo preferido água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, pode-se utilizar qualquer um dos veículos acima, ou um veiculo sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glucose, sacarose e carbonato de magnésio. Também se podem utilizar microesferas biodegradáveis (e. g., poliláctico galáctido) como veículos para as composições farmacêuticas da presente invenção. Microesferas biodegradáveis adequadas estão descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. N° 4897268 e 5075109.

Em geral, um regime de dosagem e tratamento adequado proporciona o(s) composto activo numa quantidade suficiente para se obter um benefício terapêutico e/ou profilático. Pode-se monitorizar uma resposta deste tipo estabelecendo um resultado clínico melhorado em doentes tratados, em comparação com doentes não tratados. Os aumentos nas respostas imunitárias pré-existentes a uma proteína de Chlamydia em geral correlacionam-se com um resultado clínico melhorado. Estas respostas imunitárias podem ser geralmente avaliadas utilizando testes de proliferação, citotoxicidade ou citocina convencionais que podem ser realizados utilizando amostras obtidas de um doente, antes e após o tratamento. A infecção por Chlamydia pode ser detectada numa amostra biológica, utilizando um ou mais polipéptidos compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431 ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da SEQ ID N°: 431, quer isoladas, quer em combinação. Para clareza, o termo "polipéptido" será utilizado quando se descrevem métodos de 48 diagnóstico. No entanto, será evidente para um especialista na técnica que também se podem utilizar proteínas de fusão nestes métodos.

Tal como aqui utilizado, uma "amostra biológica" é uma amostra que contém um anticorpo obtida de um doente. De um modo preferido, a amostra é sangue total, expectoração, soro, plasma, saliva, fluido cerebrospinal ou urina. De um modo mais preferido, a amostra é uma amostra de sangue, soro ou plasma, obtida de um doente. Os polipéptidos são utilizados num ensaio, como descrito a seguir, para determinar a presença ou ausência de anticorpos contra o(s) polipéptido(s) na amostra, em relação a um valor limiar pré-determinado. A presença destes anticorpos indica sensibilização prévia contra antigénios de Chlamydia que pode ser indicativa de infecção por Chlamydia. É conhecida dos especialistas na técnica uma variedade de formatos de ensaio para utilizar um ou mais polipéptidos para detector anticorpos numa amostra. Ver, e. g., Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Numa forma de realização preferida, o ensaio envolve a utilização do polipéptido imobilizado num suporte sólido para se ligar a e remover o anticorpo da amostra. 0 anticorpo ligado pode ser então detectado utilizando um reagente de detecção que contém um grupo repórter. Os reagentes de detecção adequados incluem anticorpos que se ligam ao complexo anticorpo/polipéptido e polipéptido livre marcado com um grupo repórter (e. g., num teste semi-competitivo). Alternativamente, pode-se utilizar um teste competitivo, em que um anticorpo que se liga ao polipéptido é marcado com um grupo repórter e deixa-se que se ligue ao antigénio imobilizado após incubação do antigénio com a amostra. A extensão em que os componentes da 49 amostra inibem a ligação do anticorpo marcado ao polipéptido é indicativa da reactividade da amostra com o polipéptido imobilizado. 0 suporte sólido pode ser qualquer material sólido conhecido dos especialistas na técnica ao qual o antigénio se pode ligar. Por exemplo, o suporte sólido pode ser um poço de teste numa placa de microtitulação ou uma membrana de nitrocelulose, ou outra adequada. Alternativamente, o suporte pode ser uma pérola ou disco, tal como um vidro, fibra de vidro, látex ou um material de plástico, tal como polistireno ou cloreto de polivinilo. 0 suporte pode também ser uma partícula magnética ou um sensor de fibra óptica, tal como os descritos, por exemplo, na Patente U.S. N° 5359681.

Os polipéptidos podem ser ligados ao suporte sólido utilizando uma variedade de técnicas conhecidas dos especialistas na técnica. No contexto da presente invenção, o termo "ligado" refere-se quer a associação não covalente, tal como adsorção, e ligação covalente (que pode ser uma ligação directa entre o antigénio e grupos funcionais no suporte, ou pode ser uma ligação por meio de um agente de reticulação) . É preferida a ligação por adsorção a um poço numa placa de microtitulação, ou a uma membrana. Nestes casos, a adsorção pode ser conseguida contactando o polipéptido, num tampão adequado, com o suporte sólido, durante um período de tempo adequado. 0 tempo de contacto varia com a temperatura, mas é tipicamente entre cerca de 1 hora e 1 dia. Em geral, contactar um poço de uma placa de microtitulação de plástico (tal como polistireno ou cloreto de polivinilo) com uma quantidade de polipéptido que varia entre cerca de 10 ng a cerca de 1 pg e, de um modo 50 preferido, cerca de 100 ng, é suficiente para ligar uma quantidade adequada de antigénio. A ligação covalente do polipéptido a um suporte sólido pode ser geralmente conseguida reagindo primeiro o suporte com um reagente bifuncional que irá reagir com ambos, o suporte e um grupo funcional, tal como um grupo hidroxilo ou amino, no polipéptido. Por exemplo, o polipéptido pode ser ligado a suportes que têm um revestimento de polímero adequado, utilizando benzoquinona, ou por condensação de um grupo aldeído no suporte com uma amina e um hidrogénio activo no polipéptido (ver, e. g., Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, em A12-A13). 0 teste de diagnóstico pode ser um teste imunoadsorvente ligado a enzima (ELISA). Este ensaio pode ser realizado contactando primeiro um antigénio polipeptídico que foi imobilizado num suporte sólido, normalmente o poço de uma placa de microtitulação, com a amostra, de modo que se deixam os anticorpos contra o polipéptido na amostra ligar-se ao polipéptido imobilizado. A amostra não ligada é então removida do polipéptido imobilizado e adiciona-se um reagente de detecção capaz de se ligar ao complexo anticorpo-polipéptido imobilizado. A quantidade de reagente de detecção que permanece ligado ao suporte sólido é então determinada utilizando um método adequado para o reagente de detecção específico.

Mais especificamente, uma vez estando o polipéptido imobilizado no suporte como descrito acima, os sítios de ligação de proteína remanescentes no suporte são tipicamente bloqueados. Pode-se utilizar qualquer agente bloqueador conhecido dos especialistas na técnica, tal como albumina de soro bovino (BSA) 51 ou Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). O polipéptido imobilizado é em seguida incubado com a amostra e deixa-se o anticorpo ligar-se ao antigénio. A amostra pode ser diluída com um diluente adequado, tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da incubação. Em geral, um tempo de contacto adequado (i. e., tempo de incubação) é o período de tempo que é suficiente para detectar a presença de anticorpo numa amostra infectada com HGE. De um modo preferido, o tempo de contacto é suficiente para atingir um nível de ligação que é, pelo menos, 95% do que se obtém no equilíbrio entre anticorpo ligado e não ligado. Os especialistas na técnica irão reconhecer que o tempo necessário para se obter o equilíbrio pode ser facilmente determinado testando o nível de ligação que ocorre durante um período de tempo. À temperatura ambiente, um tempo de incubação de cerca de 30 minutos é geralmente suficiente. A amostra não ligada pode ser em seguida removida por lavagem do suporte sólido com um tampão adequado, tal como PBS contendo Tween 20™ a 0,1%. O reagente de detecção pode ser em seguida adicionado ao suporte sólido. Um reagente de detecção adequado é qualquer composto que se liga ao complexo anticorpo-polipéptido imobilizado e que pode ser detectado por qualquer um de uma variedade de meios conhecidos na técnica. De um modo preferido, o reagente de detecção contém um agente de ligação (tal como, por exemplo, Proteína A, Proteína G, imunoglobulina, lectina ou antigénio livre) conjugado com um grupo receptor. Grupos repórter preferidos incluem enzimas (tal como peroxidase de rábano), substratos, cofactores, inibidores, corantes, radionuclidos, grupos luminescentes, grupos fluorescentes e biotina. A conjugação do agente de ligação ao grupo repórter pode ser conseguida utilizando métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Os agentes de ligação comuns também 52 podem ser adquiridos conjugados com uma variedade de grupos repórter a partir de muitas fontes comerciais (e. g., Zymed Laboratories, San Francisco, CA, e Pierce, Rockford, IL). 0 reagente de detecção é em seguida incubado com o complexo anticorpo-polipéptido imobilizado durante um período de tempo suficiente para detectar o anticorpo ligado. Um período de tempo adequado pode se geralmente determinado a partir das instruções do fabricante, ou testando o nível de ligação que ocorre durante um período de tempo. 0 reagente de detecção não ligado é em seguida removido e o reagente de detecção ligado é detectado utilizando o grupo repórter. 0 método utilizado para detectar o grupo repórter depende da natureza do grupo repórter. Para grupos radioactivos, são geralmente adequados a contagem de cintilação ou métodos autorradiográficos. Também se podem utilizar métodos espectroscópicos para detectar corantes, grupos luminescentes e grupos fluorescentes. A biotina pode ser detectada utilizando avidina, acoplada a um grupo repórter diferente (normalmente um grupo radioactivo ou fluorescente, ou uma enzima). Os grupos repórter de enzima podem ser geralmente detectados por adição de substrato (geralmente para um período de tempo específico), seguido de análise espectroscópica ou outra análise dos produtos de reacção.

Para determinar a presença ou ausência de anticorpos anti-Chlamydia na amostra, o sinal detectado a partir do grupo repórter que permanece ligado ao suporte sólido é geralmente comparado com um sinal que corresponde a um valor limiar pré-determinado. Numa forma de realização preferida, o valor limiar é o sinal médio obtido quando o antigénio imobilizado é incubado com amostras de um doente não infectado. Em geral, uma amostra que produz um sinal que é três desvios padrão acima do valor 53 limiar pré-determinado é considerado positivo para infecção por Chlamydia. Numa forma de realização preferida alternativa, o valor limiar é determinado utilizando uma curva Receiver Operator, de acordo com o método de Sackett et al., Clinicai Epidemiology: A Basic Science for Clinicai Medicine, Little Brown e Co., 1985, pp. 106-107. Em resumo, nesta forma de realização, o valor limiar pode ser determinado a partir de um gráfico de pares de velocidades positivas verdadeiras (i. e., sensibilidade) e velocidades falso positivo (100%-specificidade) que correspondem a cada valor limiar possível para o resultado de teste diagnóstico. O valor limiar no gráfico que é mais próximo do canto superior esquerdo (i. e., o valor que engloba a área maior) é o valor limiar mais preciso e uma amostra que produz um sinal que é mais elevado que o valor limiar determinado por este método pode ser considerado positivo. Alternativamente, o valor limiar pode ser desviado para a esquerda ao longo do gráfico, para minimizar a velocidade falso positiva, ou para a direita, para minimizar a velocidade falso negativa. Em geral, uma amostra que produz um sinal que é mais elevado que o valor limiar determinado por este método, é considerada positiva para infecção por Chlamydia.

Podem-se realizar outros testes de diagnóstico num formato rápido de fluxo corrente ou tira de teste, em que o antigénio está imobilizado numa membrana, tal como nitrocelulose. Num teste de fluxo corrente, os anticorpos na amostra ligam-se ao polipéptido imobilizado, à medida que a amostra passa através da membrana. Um reagente de detecção liga-se então (e. g., proteína A-ouro coloidal) ao complexo anticorpo-polipéptido à medida que a solução que contém o reagente de detecção flui através da membrana. A detecção do reagente de detecção ligado pode ser então realizada como descrito acima. No formato de tira de 54 teste, uma extremidade da membrana à qual o polipéptido está ligado é imersa numa solução que contém a amostra. A amostra migra ao longo da membrana através de uma região que contém o reagente de detecção e até à área do polipéptido imobilizado. A concentração do reagente de detecção no polipéptido indica a presença de anticorpos anti-Chlamydia na amostra. Tipicamente, a concentração do reagente de detecção no sitio gera um padrão, tal como uma linha, que pode ser lido visualmente. A ausência deste padrão indica um resultado negativo. Em geral, a quantidade de polipéptido imobilizado na membrana é seleccionada para produzir um padrão discernível visualmente quando a amostra biológica contém um nivel de anticorpos que seria suficiente para gerar um sinal positivo numa ELISA, como discutido acima. De um modo preferido, a quantidade de polipéptido imobilizado na membrana varia entre cerca de 25 ng a cerca de 1 pg e, de um modo mais preferido, de cerca de 50 ng a cerca de 500 ng. Estes testes podem ser realizados, tipicamente, com uma quantidade muito pequena (e. g., uma gota) de soro ou sangue do doente.

Obviamente, existem muitos outros protocolos de ensaio que são adequados para utilização com polipéptidos compreendendo a sequência de : SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431. As descrições acima pretendem ser apenas a titulo de exemplo. Um exemplo de um protocolo de ensaio alternativo que pode ser utilizado de forma útil nestes métodos é uma transferência Western, em que as proteínas presentes numa amostra biológica são separadas num gel, antes de exposição a um agente de ligação. Estas técnicas são bem conhecidas dos especialistas na técnica. 55

Os reagentes de diagnóstico podem também compreender sequências de AND que codificam para um ou mais polipéptidos compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431.

Os exemplos seguintes são dados a titulo ilustrativo e não limitativo. EXEMPLO METODOLOGICO 1

INDUÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T E PRODUÇÃO DE INTERFERÃO-Y POR ANTIGÉNIOS DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS A capacidade dos antigénios de Chlamydia trachomatis recombinantes induzirem a proliferação de células T e a produção de interferão-γ é determinada como se segue.

As proteínas são induzidas por IPTG e purificadas por cromatografia de afinidade de NY-NTA agarose (Webb et al., J. Immunology 157:5034-5041, 1996). Os polipéptidos purificados são em seguida pesquisados quanto à capacidade para induzir a proliferação de células-T em preparações de PBMC. As PBMCs de doentes com C. trachomatis bem como de dadores normais cujas células-T são conhecidas por proliferarem em resposta a antigénios de Chlamydia, são cultivadas em meio compreendendo RPMI 1640 suplementado com soro humano reunido a 10% e gentamicina 50 pg/mL. Os polipéptidos purificados são 56 adicionados em duplicado a concentrações de 0,5 a 10 pg/mL. Após seis dias de cultura em placas de fundo redondo de 96 poços num volume de 200 pL, removem-se 50 pL de meio de cada poço, para determinação dos niveis de IFN-γ, como descrito a seguir. As placas são em seguida pulsadas com 1 pCi/poço de timidina tritiada, por mais 18 horas, recolhidas e a incorporação de tritio é determinada utilizando um contador gasoso de cintilação. As fracções que resultam numa proliferação em ambas as réplicas três vezes maior do que a proliferação observada em células cultivadas em meio isolado são consideradas positivas. O IFN—γ é medido utilizando um ensaio imunoadsorvente ligado a enzima (ELISA). As placas de ELISA são revestidas com um anticorpo monoclonal de ratinho dirigido contra IFN- -γ humano (PharMingen, San Diego, CA) em PBS durante quatro horas, à temperatura ambiente. Os poços são então bloqueados com PBS contendo leite em pó não gordo a 5% (p/v) durante 1 hora, à temperatura ambiente. As placas são lavadas seis vezes em PBS/Tween-20 a 0,2% e as amostras diluidas 1:2 em meio de cultura nas placas ELISA são incubadas durante a noite à temperatura ambiente. As placas são lavadas mais uma vez e adiciona-se a cada poço soro policlonal de coelho anti-lFN-γ humano diluido 1:3000 em PBS/soro de cabra normal a 10%. As placas são em seguida incubadas durante duas horas à temperatura ambiente, lavadas e adiciona-se anti-IgG de coelho acoplado a peroxidase de rábano (Sigma Chemical So., St. Louis, MO) a uma diluição 1:2000 em PBS/leite em pó não gordo a 5%. Após mais duas horas de incubação à temperatura ambiente, as placas são lavadas e adiciona-se substrato tmb. a reacção é parada após 20 min com ácido sulfúrico 1 N. A densidade óptica é determinada a 450 nm utilizando 570 nm como um comprimento de onda de referência. As fracções que resultam em ambas as réplicas numa 57 DO duas vezes maior do que a DO média para células cultivadas em meio isolado, mais 3 desvios padrão, são consideradas positivas.

Utilizando a metodologia acima, verificou-se que a proteina recombinante 1B1-66 (SEQ ID N°: 5) induz uma resposta proliferativa e a produção de lFN-γ numa linha de células-T especifica de Chlamydia é utilizada para pesquisar uma biblioteca genómica de C. trachomatis LGVII. EXEMPLO METODOLÓGICO 2

PRODUÇÃO DE RESPOSTAS DE ANTICORPO E CÉLULAS-T EM RATINHOS IMUNIZADOS COM ANTIGÉNIOS DE CHLAMYDIA

Realizaram-se estudos de imunogenecidade para determinar as respostas de anticorpo e células-T CD4+ em ratinhos imunizados quer com SWIB purificado, quer com proteínas S13 formuladas com adjuvante Montanide, ou imunizações baseadas em ADN com vectores de expressão pcDNA-3 que contêm as sequências de ADN para SWIB ou S13. SWIB também é designado como clone l-Bl-66 (SEQ ID N°: 1, com a sequência de aminoácidos correspondente proporcionada na SEQ ID N°: 5) e a proteína ribossomal S13 é também designada como clone 10-C10-31 (SEQ ID N°: 4, com a sequência de aminoácidos correspondente proporcionada na SEQ ID N°: 12). Na primeira experiência, imunizaram-se grupos de três ratinhos C57BL/6 duas vezes e monitorizaram-se quanto a respostas de anticorpos e células-T CD4+. As imunizações de ADN foram intradérmicas na base da cauda e as imunizações com polipéptido foram administradas por via subcutânea. Os resultados de testes de incorporação de 3H convencionais de esplenócitos de ratinhos imunizados mostram uma resposta 58 proliferativa forte do grupo imunizado com polipéptido SWIB recombinante (SEQ ID N°: 5). Novas análises por ensaios de indução de cicotinas, como anteriormente descrito, demonstraram que o grupo imunizado com o polipéptido SWIB produziu uma resposta de IFN-γ e IL-4 mensurável. Fizeram-se ensaios subsequentes baseados em elisa para determinar a resposta do isotipo de anticorpo predominante no grupo experimental imunizado com o polipéptido SWIB. A Fig. 1 ilustra que o grupo imunizado com SWIB originou uma resposta humoral que era predominantemente de IgGl.

Numa segunda experiência, os ratinhos C3H foram imunizados três vezes com 10 pg de proteína SWIB purificada (também designada por clone l-Bl-66, SEQ ID N°: 5) formulada quer em PBS, quer Montanide a intervalos de três semanas e fez-se a recolha duas semanas após a terceira imunização. Os títulos de anticorpo dirigido contra a proteína SWIB foram determinados por técnicas baseadas em ELISA convencionais, bem conhecidas na técnica, demonstrando que a proteína SWIB formulada com adjuvante Montanide induziu uma forte reposta imunitária humoral. As respostas proliferativas de células-T foram determinadas por um ensaio baseado em XTT (Scudiero, et al., Câncer Research, 1988, 48:4827). Tal como se pode ver na Fig. 2, os esplenócitos de ratinhos imunizados com o polipéptido SWIB mais Montanide desencadearam uma resposta proliferativa específica de antigénios. Além disso, a capacidade dos esplenócitos de animais imunizados segregarem IFN-γ em resposta ao polipéptido SWIB recombinante solúvel foi determinada utilizando o ensaio indutor de citocinas anteriormente descrito. Os esplenócitos de todos os animais no grupo imunizado com o polipéptido SWIB formulados com adjuvante montanide segregaram 59 IFN-γ em resposta a exposição ao antigénio de Chlamydia SWIB, demonstrando uma resposta imunitária especifica de Chlamydia.

Noutra experiência, os ratinhos C3H foram imunizados em três pontos de tempo separados na base da cauda, com 10 pg de SWIB purificada ou proteína S13 (C. trachomatis, proteína SWIB, clone l-Bl-66, SEQ ID N°: 5, e proteína S13, clone 10-C10-31, SEQ ID N°: 4) formulada com o adjuvante SBAS2 (SmithKline Beecham, Londres, Inglaterra). Os títulos de anticorpo específicos de antigénios foram medidos por ELISA, mostrando que ambos os polipéptidos induziram uma resposta de IgG forte, com títulos entre lxlO-4 a lxlO-5.

Os componentes IgGl e lgG2 desta resposta estavam presentes em quantidades bastante idênticas. As respostas proliferativas de células-T específicas de antigénios determinadas por ensaios de incorporação de 3H convencionais em esplenócitos isolados de ratinhos imunizados eram bastante fortes para SWIB (50.000 cpm acima do controlo negativo) e ainda mais fortes para sl3 (100.000 cpm acima do controlo negativo). A produção de IFN-γ foi determinada por técnicas de ELISA convencionais a partir do sobrenadante da cultura proliferante. A re-estimulação in vitro da cultura com proteína S13 induziu níveis elevados de produção de IFN-γ, aproximadamente 25 ng/mL versus 2 ng/mL para o controlo negativo. A re-estimulação com a proteína SWIB também induziu IFNy, embora numa menor extensão.

Numa experiência relacionada, imunizaram-se ratinhos C3H em três pontos de tempo separados com 10 pg de proteína SWIB ou S13, purificada (C. trachomatis, proteína SWIB, clone l-Bl-66, SEQ ID N°: 5, e proteína S13, clone 10-C10-31, SEQ ID N°: 4) 60 misturada com 10 pg de toxina de cólera. A imunização mucosal foi realizada por inoculação intranasal. As respostas de anticorpo específico de antigénio foram determinadas por técnicas ELISA convencionais. Estavam presentes anticorpos IgG específicos de antigénio no sangue de ratinhos imunizados com SWIB, com títulos que variam entre 1 x 10~3 to 1 x 10-4, mas não detectáveis nos animais imunizados com S13. As respostas de células-T específicas de antigénio de esplenócitos isolados, tal como medido por produção de IFN-γ, originaram resultados semelhantes aos descritos imediatamente acima para a imunização sistémica.

Realizou-se um estudo animal para determinar a imunogenecidade do epítopos de CTL LGVII do serotipo CT529, definido pelo péptido de consenso de 10 monómeros CT529 (CSFIGGITYL - SEQ ID N°: 31), que foi identificado como um epítopo de CTL restrito a H2-Kd. Imunizaram-se ratinhos BALB/c (3 ratinhos por grupo) três vezes com 25 pg de péptido combinado com vários adjuvantes. O péptido foi administrado sistemicamente na base da cauda, quer em sistema adjuvante SKB SBAS-2", SBAS-7 (SmithKline Beecham, Londres, Inglaterra) ou Montanide. O péptido também foi administrado intranasalmente, misturado com 10 pg de toxina de cólera (CT). Utilizaram-se ratinhos não previamente imunizados como controlo. Quatro semanas após a terceira imunização, os esplenócitos foram re-estimulados com blastócitos LPS pulsados com péptido de consenso de 10 monómeros CT529 10 pg/mL a três razões entre efector e blastócitos LPS diferentes: 6, 1,5 e 0,4 a lxlO6 células/mL. Após 2 novas estimulações, as células efectoras foram testadas quanto à sua capacidade para lisar células P815 pulsadas com péptido, utilizando um ensaio convencional de libertação de crómio. Utilizou-se como controlo negativo um péptido não relevante de 61 ovalbumina de ovo de galinha. Os resultados demonstram que se desencadeou uma resposta imunitária significativa contra o péptido de consenso de 10 monómeros CT529 e que foram produzidas células-T especificas de antigénio capazes de lisar alvos pulsados com péptido em resposta à imunização com o péptido. Especificamente, observaram-se actividades liticas especificas de antigénio no grupo auxiliado por SBAS-7 e CT, enquanto que o Montanide e SBAS-2" não conseguiram auxiliar a imunização do epitopo de CTL. EXEMPLO 3

RESPOSTAS IMUNITÁRIAS DE LINHAS DE PBMC E CELULAS-T HUMANAS CONTRA ΑΝΤΙGÉNIOS DE CHLAMYDIA

Os exemplos aqui proporcionados sugerem que há uma população de dadores saudáveis entre a população geral que foi infectada com C. trachomatis e produziu uma resposta imunitária protectora que controla a infecção por c. trachomatis. Estes dadores permaneceram clinicamente assintomáticos e seronegativos para c. trachomatis. Para caracterizar as respostas imunitárias de dadores normais contra antigénios de Chlamydia que foram identificados por clonagem de expressão de CD4, testaram-se PBMC obtidos de 12 dadores saudáveis contra um painel de antigénios de Chlamydia recombinantes, incluindo SWIB de C. trachomatis, C. pneumoniae e S13 de C. trachomatis, C. pneumoniae. Os dados estão resumidos na tabela I a seguir. Todos os dadores eram seronegativos para C. trachomatis, enquanto que 6/12 tinham um titulo de C. pneumoniae positivo. Utilizando um indice de estimulação >4 como resposta positiva, 11/12 dos indivíduos responderam a corpos elementares de C. trachomatis e 12/12 62 responderam a corpos elementares de C. pneumoniae. Um dador, AD104, respondeu à proteína S13 de C. pneumoniae mas não à proteína S13 de C. trachomatis recombinante, indicando uma resposta específica de C. pneumoniae. Três de entre 12 dadores tinham uma resposta específica de SWIB de C. trachomatis, mas não de SWIB de C. pneumoniae, confirmando uma infecção por C. trachomatis. A S13 de C. trachomatis e C. pneumoniae desencadearam uma resposta em 8/12 dadores, sugerindo uma infecção por Chlamydia. Estes dados demonstram a capacidade da SWIB e S13 desencadearem uma resposta de células-τ em pbmc de indivíduos de estudo normais. 63

Tabela I

Resposta imunitária de indivíduos normais contra Chlamydia

Dador Sexo Título de CT CP CT CP CT CP CT CT IgG de EB EB Swib Swib S13 S13 Ipda TSA Chlamydia AD100 masculino negativo ++ ++ + + - ++ ++ - n. t. ADIO 4 feminino negativo +++ ++ - - - ++ - n. t. ADIO 8 masculino CP 1:256 ++ ++ + +/- + + + n. t. ADI 12 feminino negativo + + + + + - + - + /- n. t. AD120 masculino negativo - + - - - - - n. t. AD124 feminino CPI:128 ++ ++ - - - - - n. t. AD128 masculino CPI:512 + ++ - - + + + ++ - ADI 3 2 feminino negativo ++ ++ - - + + - - ADI 3 6 feminino CPI:128 + ++ - - + /- - - - AD140 masculino CPI:256 ++ ++ - - + + - - AD142 feminino CPI:512 ++ + + - - + + + - AD146 feminino negativo + + + + - - + + + + - CT = Chlamydia trachomatis; CP = Chlamydia pneumoníae; EB = corpos elementares de Chlamydia; Swib = proteínas Swib de Chlamydia recombinantes; S 13 = proteína S13 de Chlamydia recombinante; IpdA = proteína IpdA de Chlamydia recombinante; TSA = proteína TSA de Chlamydia recombinante. Os valores representam resultados de ensaios de proliferação convencionais. As respostas proliferativas foram determinadas estimulando 3 x 105 PBMC com 1 x 104 células dendríticas derivadas de monócitos pré-incubadas com os antigénios recombinantes respectivos, ou corpos elementares (EB). Os ensaios foram recolhidos após 6 dias com um pulso de 3H-timidina nas últimas 18h. SI: índice de estimulação + /-: SI~ 4 +: SI> 4 ++: SI 10-30 +++: SI > 30

Numa primeira série de experiências, produziram-se linhas de células-T a partir de um indivíduo feminino saudável (CT-10) com um historial de exposição genital a C. trachomatis, estimulando células-T com corpos elementares de C. trachomatis LGV II, como 64 anteriormente descrito. Embora o indivíduo em estudo tenha sido exposto a C. trachomatis, não houve seroconversão e não se desenvolveram sintomas clínicos, sugerindo que o CT-10 do dador poderá ter desenvolvido uma resposta imunitária protectora contra C. trachomatis, como se pode ver na Fig. 3, uma linha de células-τ específica de Chlamydia primária derivada de CT-10 dador respondeu a SWIB de C. trachomatis, mas não a proteínas recombinantes SWIB de C. pneumoniae, confirmando a exposição de CT-10 a C. trachomatis. 0 mapeamento de epítopos da resposta de células-T a SWIB de C. trachomatis mostrou que este dador respondeu ao mesmo epítopo Ct-SWIB 52-67 (SEQ ID N°: 39) que a linha de células-T TCL-8, como se pode ver na Fig. 4.

Foram produzidas outras linhas de células-T como descrito acima para vários doentes com C. trachomatis. Na Tabela II, está um resumo do perfil clínico dos doentes e respostas proliferativas a vários corpos elementares de C. trachomatis e C. pneumoniae e proteínas recombinantes, como se segue: 65

Resposta pr oliferativa de doentes com C. trachomatis Doentes Manifestação Título CT CP CT CP CT CP CT CT clínica de IgG EB EB Swib Swib S13 S13 IpdA TSA CT-1 NGU negativo + + - + + + + + + + CT-2 NGU negativo + + + + - + + /- - - CT-3 assintomático derramou Eb Dx era HPV Ctl: 512 Cpl:1024 Cpsl:256 + + + + CT-4 assintomático derramou Eb Ctl:1024 + + — — — — — CT-5 BV Ctl:256 Cpl:256 + + + + — + — — — CT-6 Erupção perineal descarga Cpl:1024 + + CT-7 BV Ulcera genital Ct: 512 Cpl:1024 + + + + + CT-8 Não conhecido Não testado + + + + ' ' ' ' ' CT-9 Assintomático Ct:1:128 Cpl:128 + + + + + — + + + + — CT-10 Comichão vulvar moderada negativo + + + + CT-11 BV, pap anormal Ctl:512 + + + + + + — + + + + /- + + + CT-12 assintomático Cpl: 512 + + + + - + + + + - 66 (continuação)

Resposta proliferativa de doentes com C. trachomatis

Manifestação Título CT CP CT CP CT CP CT CT clínica de IgG EB EB Swib Swib S13 S13 IpdA TSA NGU = Uretrite não gonocóccica; BV = Vaginose bacteriana; CT = Chlamydia trachomatis; CP = Chlamydia pneumoniae; EB = corpos elementares de Chlamydia; Swib = proteína Swib de Chlamydia recombinante; SI3 = proteína SI 3 de Chlamydia recombinante; IpdA = proteína IpdA de Chlamydia recombinante; TSA = proteína TSA de Chlamydia recombinante

Os valores representam resultados de testes de proliferação convencionais. As respostas proliferativas foram determinadas estimulando 3 x 105 PBMC com os antigénios recombinantes respectivos, ou corpos elementares (EB). Os ensaios foram recolhidos após 6 dias com um pulso de 3H-thymidine nas últimas 18 horas. SI: índice de estimulação +/-: SI~ 4 +: SI> 4 ++: SI 10-30 +++: SI > 30

Utilizando o painel de indivíduos de estudo assintomáticos (como definido acima) e doentes com C. trachomatis, como resumido nas Tabelas I e II, foi realizado um estudo abrangente sobre as respostas imunitárias de PBMC derivados dos dois grupos. Em resumo, faz-se a cultura de PBMC de doentes com C. pneumoniae, bem como de dadores normais em meio compreendendo RPMI1640 suplementado com soro humano reunido a 10% e gentamicina 50 pg/mL. Os polipéptidos purificados, um painel de antigénios de Chlamydia recombinantes, incluindo SWIB e S13 de C. trachomatis e de C. pneumoniae, bem como IpdA e TSA de C. trachomatis são adicionados em duplicado a concentrações de 0,5 a 10 pg/mL. Após seis dias de cultura em placas de fundo redondo de 96 poços num volume de 100 pL, removem-se 50 pL de meio de cada poço para determinar os níveis de lFN-γ, como descrito a seguir. As placas são em seguida pulsadas com 67 1 pCi/poço de timidina tritiada, por mais 18 horas, recolhidas e a incorporação de tritio é determinada utilizando um contador gasoso de cintilação. As fracções que resultam numa proliferação em ambas as réplicas três vezes superior à proliferação observada nas células cultivadas em meio isolado são consideradas positivas.

As respostas proliferativas aos antigénios de Chlamydiae recombinantes demonstraram que a maioria dos dadores assintomáticos e doentes com C. trachomatis reconheceram o antigénio S13 de C. trachomatis (8/12) e uma maioria dos doentes de C. Trachomatis reconheceu o antigénio S13 de C. penumonia (8/12) sendo que 4/12 dos dadores assintomáticos também reconheceram o antigénio S13 de C. pneumonia. Além disso, seis de entre doze dos doentes com C. trachomatis e quatro de entre doze dos dadores assintomáticos originaram uma resposta proliferativa contra o antigénio ipdA de C. trachomatis. Estes resultados demonstram que o antigénio S13 de C. trachomatis e C. pneumonia, antigénio Swib de C. trachomatis e o antigénio IpdA de C. trachomatis são reconhecidos pelos dadores assintomáticos, indicando que estes antigénios foram reconhecidos durante a exposição a Chlamydía e foi desencadeada uma resposta imunitária contra eles. Isto implica que estes antigénios podem desempenhar um papel em conferir imunidade protectora num hospedeiro humano. Além disso, o antigénio S13 de C. trachomatis e C. pneumonia é reconhecido igualmente bem entre os doentes com C. trachomatis, o que indica portanto que poderão haver epitopos partilhados entre C. trachomatis e C. pneumonia na proteína S13. A Tabela iii resume os resultados destes estudos. 68

Tabela III

Antigénio Dadores Normais Doentes C.t. C. t.-Swib 3/12 0/12 C.p.-Swib 0/12 0/12 C.t.-S13 8/12 8/12 C.p.-S13 4/12 8/12 IpdA 4/12 6/12 TSA 0/12 2/12

Foram iniciados uma série de estudos para determinar a resposta imunitária celular a linhas de células-T de curto prazo produzidas a partir de dadores assintomáticos e doentes com C. trachomatis. As respostas imunitárias celulares foram medidas por ensaios de proliferação convencionais e lFN-γ. Especificamente, a maioria dos antigénios era na forma de clones de E. coli individuais que expressam antigénios de Chlamydia, embora também se tenham utilizado algumas proteínas recombinantes nos ensaios. Os clones de E. coli individuais foram titulados em 1 x 104 células dendríticas derivadas de monócitos e após duas horas a cultura foi lavada e adicionaram-se 2,5 x 104 células-T. Os ensaios utilizando as proteínas recombinantes foram realizados como anteriormente descrito. A proliferação foi determinada após quatro dias com um pulso de 3H-timidina durante as últimas 18 horas. A indução de IFN-γ foi determinada a partir dos sobrenadantes de cultura recolhidos após quatro dias, utilizando ensaios ELISA convencionais, como descrito acima. Os resultados mostram que todos os antigénios de C. trachomatis testados, excepto para C.T. Swib, desencadearam uma resposta proliferativa a partir de uma ou mais linhas de células-T derivadas de doentes com C. trachomatis. Além disso, 69 foram desencadeadas respostas proliferativas a partir de ambos, doentes com C. trachomatis e dadores assintomáticos para os seguintes genes de Chlamydia, CT622, groEL, pmpD, CT610 e rS13. 0 clone 12G3-83 também contém sequências para CT734 e CT764 além de CT622, e assim estas sequências de genes também podem ter epitopos imunorreactivos. De igual modo, o clone 21G12-60 contém sequências para os genes hipotéticos CT229 e CT228 além de CT875; e 15H2-76 também contém sequências de CT812 e CT088, e também partilha homologia com o gene sycE. 0 clone 11H3-61 também contém sequências que partilham homologia com a proteína de virulência PGP6-D. 70

Tabela IV

Clone Antigénio de C.t. (putativo*) TCL de Dadores Assint. TCL de Doentes com C.t. SEQ ID N°: 1B1-66 (E.coli) Swib 2/2 0/4 5 1B1-66 (proteína) Swib 2/2 0/4 5 12G3-83 (E.coli) CT622* 2/2 4/4 57 22B3-53 (E.coli) groEL 1/2 4/4 111 22B3-53 (proteína) groEL 1/2 4/4 111 15H2-76 (E.coli) PmpD* 1/2 3/4 87 11H3-61 (E.coli) rLl* 0/2 3/4 60 14H1-4 (E.coli) TSA 0/2 3/4 56 14H1-4 (proteína) TSA 0/2 3/4 56 11G10-46 (E.coli) CT610 1/2 1/4 62 10C10-17 (E.coli) rS 13 1/2 1/4 62 10C10-17 (proteína) rS13 1/2 1/4 62 21G12-60 (E.coli) CT875* 0/2 2/4 110 11H4-32 (E.coli) dnaK 0/2 2/4 59 21C7-8 (E.coli) dnaK 0/2 2/4 115 17C10-31 (E.coli) CT858 0/2 2/4 114 71 EXEMPLO METODOLÓGICO 4

ESTUDOS DE PROTECÇÃO UTILIZANDO ANTIGÉNIOS DE CHLAMYDIA

1.SWIB

Fizeram-se estudos de protecção em ratinhos para determinar se a imunização com antigénios de clamidia pode ter impacto na doença do tracto genital resultante da inoculação de clamidia. Utilizaram-se dois modelos; um modelo de inoculação intravaginal que utiliza um isolado humano contendo uma estirpe de Chlamydia psittaci (MTW447), e um modelo de inoculação intrauterina que envolve um isolado humano identificado como Chlamydia trachomatis, serotipo F (estirpe Nll). Ambas as estirpes induzem inflamação do tracto genital superior que se assemelha a endometrite e sapingite provocada por Chlamydia trachomatis na mulher. Na primeira experiência, imunizaram-se ratinhos C3H (4 ratinhos por grupo) três vezes com 100 pg do vector de expressão pcDNA-3 contendo ADN de SWIB de C. trachomatis (SEQ ID N°: 1, com a sequência de aminoácidos correspondente proporcionada na SEQ ID N°: 5). As inoculações foram feitas na base da cauda para imunização sistémica. Duas semanas após a última imunização, os animais foram tratados com progesterona e infectados, quer através da vagina, quer por injecção do inoculo no útero. Duas semanas após a infecção, os ratinhos foram sacrificados e os tractos genitais seccionados, corados e analisados para histopatologia. O nível de inflamação foi pontuado (de + para muito suave, a +++++ para muito grave). As pontuações atribuídas a cada oviducto/ovário individual foram somadas e divididas pelo número de órgãos analisados, para se obter uma pontuação média da inflamação para o grupo. No modelo de inoculação uterina, os animais imunizados com o controlo 72 negativo que receberam vector vazio apresentaram uma inflamação consistente com uma pontuação de inflamação média do oviducto/ovário de 6,12, ao contrário de 2,62 para o grupo imunizado com ADN. No modelo de inoculação vaginal e infecção ascendente, os ratinhos imunizados com o controlo negativo tinham uma pontuação de inflamação média de ovário/oviducto de 8,37 versus 5,00 para o grupo imunizado com ADN. Além disso, no último modelo, os ratinhos vacinados não apresentavam sinais de oclusão das trompas, enquanto que os grupos vacinados com o controlo negativo tinham células inflamatórias no lúmen do oviducto.

Numa segunda experiência, os ratinhos C3H (4 ratinhos por grupo) foram imunizados três vezes com 50 pg do vector de expressão pcDNA-3 que contém ADN de SWIB de C. trachomatis (SEQ ID N°: 1, com a sequência de aminoácidos correspondente proporcionada na SEQ ID N°: 5) encapsulada em microesferas de poliláctido co-glicólido (PLG); fizeram-se imunizações intra-peritonealmente. Duas semanas após a última imunização, os animais foram tratados com progesterona e infectados por inoculação de C. psittaci na vagina. Duas semanas após a infecção, os ratinhos foram sacrificados e os tractos genitais seccionados, corados e analisados para histopatologia. O nível de inflamação foi pontuado como anteriormente descrito. As pontuações atribuídas a cada oviducto/ovário individual foram somadas e divididas pelo número de órgãos analisados para se obter uma média de inflamação para o grupo. Os animais imunizados com o controlo negativo que receberam vector vazio encapsulado com PLG apresentavam uma inflamação consistente com uma pontuação de inflamação média de ovário/oviducto de 7,28 versus 5,71 para o grupo imunizado com ADN encapsulado com PLG, 73 a inflamação no peritoneu era de 1,75 para o grupo vacinado versus 3,75 para o controlo.

Numa terceira experiência, imunizaram-se ratinhos C3H (4 por grupo) três vezes com 10 pg de proteína recombinante purificada, quer SWIB (SEQ id N°: 1, com a sequência de aminoácidos correspondente proporcionada na SEQ ID N°: 5), quer S13 (SEQ ID N°: 4, com a sequência de aminoácidos correspondentes proporcionada na SEQ ID N°: 12) misturada com toxina de cólera (CT); a preparação foi administrada intranasalmente por anestesia num volume de 20 pL. Duas semanas após a última imunização, os animais foram tratados com progesterona e infectados, quer por inoculação vaginal de C. psittaci, quer por injecção de C. trachomatis serotipo F no útero. Duas semanas após a infecção, os ratinhos foram sacrificados e os tractos genitais seccionados, corados e analisados para histopatologia. O grau de inflamação foi pontuado como descrito acima. As pontuações atribuídas a cada oviducto/ovário individual foram somadas e divididas pelo número de órgãos analisados, para se obter uma pontuação média de inflamação para o grupo. No modelo de inoculação uterina, os animais imunizados com controlo negativo que receberam toxina de cólera isolada apresentavam uma pontuação de inflamação média do ovário/oviducto de 4,25 (apenas 2 ratinhos analisados; outros 2 morreram) versus 5,00 para o grupo imunizado com sl3 mais toxina de cólera e 1,00 para SWIB mais toxina de cólera. Os animais infectados não tratados tinham uma pontuação média de inflamação do ovário/oviducto de 7. No modelo de inoculação vaginal e infecção ascendente, os ratinhos imunizados com controlo negativo tinham uma pontuação média de inflamação do ovário/oviducto de 7,37 Versus 6,75 para o grupo imunizado com toxina de cólera mais sl3 e 5,37 para o grupo imunizado com SWIB mais toxina de cólera. Os animais infectados 74 não tratados tinham uma pontuação média de inflamação do ovário/oviducto de 8.

As três experiências descritas acima sugerem que se pode obter uma protecção especifica de SWIB. Este efeito protector é mais acentuado no modelo de infecção homóloga, mas ainda está presente quando numa infecção por desafio heterólogo com C. psittaci.

2. CT529/CapI 0 CT529/Capl foi identificado anteriormente como um produto de Chlâmydiâ que estimula CTL CD8+. Neste exemplo, pretendemos confirmar que a imunização com Capl seria protectora num modelo animal de infecção por clamidia.

Para produzir virus de vacinia recombinantes para fornecimento de um fragmento imunogénico de Capl, amplificou-se um fragmento de ADN contendo uma sequência Kozak modificada e os pares de bases 319-530 do gene capl (CT529) a partir de ADN genómico de C. trachomatis L2, utilizando PCR™ e ligou-se em pSCllss (Earl PL, Koenig S, Moss B (1991) Biological and immunological properties of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein: analysis of proteins with truncations and deletions expressed by recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 65:31-41). O ADN foi digerido com Sail e Stul. A porção do gene capl ligado em pSCllss codifica para os aminoácidos 107-176 da proteína Capl, contendo o epítopo de CTL anteriormente identificado dos aminoácidos 139-147. O plasmídeo resultante foi utilizado para transfectar células CV-1 (ATCC# CCL-70; Jensen FC et al., (1964) Infection of human and simian tissue cultures 75 with Rous Sarcoma Virus. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 52: 53-59.) que foram subsequentemente infectadas com o virus vacínia do tipo selvagem. A recombinação homóloga entre o virus do tipo selvagem e o ADN plasmidico produziu virus vacinia recombinantes que foram seleccionados com base quer na expressão de betagalactosidase, quer inactivação de timidina cinase, como descrito anteriormente (Chakrabarti et al., Mol Cell Biol. 1985, 5(12):3403-9). O virus recombinante foi purificado por placas três vezes e titulado após crescimento em células TK-143B humanas. As preparações de vírus foram tratadas com um volume igual de tripsina 0,25 mg/mL durante 30 min, a 37 °C e diluídas em PBS antes da imunização dos ratinhos. Utilizaram-se grupos de 5 ratinhos para todos os grupos experimentais e de controlo. Os dados apresentados a seguir são representativos de três experiências independentes.

Imunizou-se um grupo de ratinhos com 106 vacínia recombinantes i.p. e deixaram-se recuperar durante 3 semanas. Imunizaram-se grupos de controlo negativo quer com tampão isolado, quer com vacínia do tipo selvagem. Como controlo positivo, infectou-se um grupo de ratinhos i.v. com 106 i.f.u. de C. trachomatis. Verificou-se anteriormente que o número de organismos administrados ao grupo de controlo positivo era eliminado no espaço de 2 semanas. Após 3 semanas, os animais em cada um dos grupos foram desafiados i.v. com 106 i.f.u. de c. trachomatis. Três dias após o desafio os ratinhos foram sacrificados e determinou-se o número de i.f.u. por baço. O número médio de organismos encontrados nos baços de animais imunizados com o vírus vacínia que expressam Capl (7,1 x 104) era 2,6-vezes menor (p<0,01; análise da soma de ordens de Wilcoxon) do que nos animais dos grupos de controlo 76 imunizados quer com tampão (1,8 x 105) , quer com vacinia do tipo selvagem (1,9 x 105) . Os animais no grupo positivo tinham 77 vezes menos organismos (2,4 x 103) por baço do que os animais nos grupos de controlo negativo (p<0,01; análise da soma de ordens de Wilcoxon). Estes dados demonstram que a imunização com um fragmento imunogénico de Capl pode originar um nivel de protecção contra a infecção por C. trachomatis estatisticamente significativo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Corixa Corporation Fling, Steven P.

Skeiky, Yasir A. W.

Probst, Peter Bhatia, Ajay

<120> COMPOSTOS E MÉTODOS PARA TRATAMENTO E DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO POR CLAMÍDIA

<130> 210121.46902PC <140> PCT <141> 2001-07-20 <16 0> 18 <170> FastSEQ para Windows versão 3.0/4.0 <210> 1 <211> 481 77

<212> ADN <213> Chlamydia trachomatis <400> 1 ctgaagactt ggctatgttt tttattttga cgataaacct agttaaggca taaaagagtt 60 gcgaaggaag agccctcaac ttttcttatc.accttcttta actaggagtc atccatgagt 120 caaaataaga actctgcttt catgcagcct gtgaacgtat ccgctgattt agctgccatc 180 gttggtgcag gacctatgcc tcgcacagag atcattaaga aaatgtggga ttacattaag 240 gagaatagtc ttcaagatcc tacaaacaaa cgtaatatca atcccgatga taaattggct 300 aaagtttttg gaactgaaaa acctatcgat atgttccaaa tgacaaaaat ggtttctcaa 360 cacatcatta aataaaatag aaattgactc acgtgttcct cgtctttaag atgaggaact 420 agttcattct ttttgttcgt ttttgtgggt attactgtat ctttaacaac tatcttagca 480 g 481 <210> 4 <211> 555

<212> ADN <213> Chlamydia trachomatis < 4 0 0 > 4 cggcacgagc ctaagatgct tatactactt taagggaggc ccttcgtatg ccgcgcatca 60 ttggaataga tattcctgcg aaaaagaaat taaaaataag tcttacatat atttatggaa 120 tagggccagc tctttctaaa gagattattg ctagattgca gttgaatccc gaagctagag 180 ctgcagagtt gactgaggaa gaggttggtc gactaaacgc tcttttacag tcggattacg 240 ttgttgaagg ggatttgcgc cgtcgtgtgc aatctgatat caaacgtctg attactatcc 300 atgcttatcg tggacaaaga catagacttt ctttgcctgt tcgtggtcag agaacaaaaa 360 caaattctcg cacgcgtaag ggtaaacgta aaactattgc aggtaagaag aaataataat 420 ttttaggaga gagtgttttg gttaaaaatc aagcgcaaaa aagaggcgta aaaagaaaac 480 aagtaaaaaa cattccttcg ggcgttgtcc atgttaaggc tacttttaat aatacaattg 540 taaccataac agacc 555 <210> 5 <211> 86

<212> PRT <213> Chlamydia trachomatis 78 < 4 Ο Ο > 5

Met Ser Gin Asn Lys Asn Ser Ala Phe Met Gin Pro Vai Asn Vai Ser 1 5 10 15 Ala Asp Leu Ala Ala Ile Vai Gly Ala Gly Pro Met Pro Arg Thr Glu 20 25 30 Ile Ile Lys Lys Met Trp Asp Tyr Ile Lys Glu Asn Ser Leu Gin Asp 35 40 45 Pro Thr Asn Lys Arg Asn Ile Asn Pro Asp Asp Lys Leu Ala Lys Vai 50 55 60 Phe Gly Thr Glu Lys Pro Ile Asp Met Phe Gin Met Thr Lys Met Val 65 70 75 80 Ser Gin His Ile Ile Lys 85

<210> 12 <211> 122 <212> PRT <213> Chlamydia trachomatis 400> 12 Met Pro Arg Ile Ile Gly Ile Asp Ile Pro Ala Lys Lys Lys Leu Lys 1 5 10 15 Ile Ser Leu Thr Tyr Ile Tyr Gly Ile Gly Pro Ala Leu Ser Lys Glu 20 25 30 Ile Ile Ala Arg Leu Gin Leu Asn Pro Glu Ala Arg Ala Ala Glu Leu 35 40 45 Thr Glu Glu Glu Val Gly Arg Leu Asn Ala Leu Leu Gin Ser Asp Tyr 50 55 60 Val Val Glu Gly Asp Leu Arg Arg Arg Val Gin Ser Asp Ile Lys Arg 65 70 75 80 Leu Ile Thr Ile His Ala Tyr Arg Gly Gin Arg His Arg Leu Ser Leu 85 90 95

Pro Val .Ãrg Gly 100 Gin Arg Thr Lys Thr 105 Asn Ser Arg Thr Arg Lys Gly 110 Lys Arg Lys 115 Thr Ile Ala Gly Lys 120 Lys Lys 79 < 210 > 31 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Produzido no laboratório <400> 31 Cys ; Ser Phe Ile Gly Gly Ile Thr 1 5 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Produzido no laboratório <400> 39

Lys Arg Asn Ile Asn Pro Asp Asp Lys Leu Ala Lys Vai Phe Gly Thr 15 10 15

<210> 56 <211> 829 <212> ADN <213> Chlamydia trachomatis 80 <4Ο Ο> 56 gtactatggg atcattagtt ggaagacagg gtggagaaga gaaagaaatc tctctagcag tttatcctaa agattttacc tatgtttgtc tggtagattt tgaagagcat ggtgcagtcg cacattctcg ttggctcact gtagcgagag ctctgttagc agacccctct tttaaaatat gatcgctcgc tttaagagct actttcctta ttatcaatga tcttccttta gggcgttcca tgatcttctt tgagaaccac ggaatggttt gaatggtgcc ttctgaagag ggattaaaag tgaaagtaag aaagtcgtac agatcttgat tgcagagagc cagcgaggct tcaataatgt cgacgatatt agttagtgaa gtctgagtat caataaagaa gccttcttcc ttgactctaa <210> 57 <211> 1537

<212> ADN <213> Chlamydia trachomatis ctccggattt ttctggtaaa gccgttgttt 60 actttcgtgg taagtatgta gtgctcttct 120 ctacagaatt acatgctttt caagatagat 180 tccttggttg ctccgttgac gacattgaga 240 atgcaggagg gatagaggga acagaatatc 300 cagaagcttt tggtgttttg aatcctgaag 360 tcgataaaca tggggttatt cgtcatgcgg 420 ttgacgagga attgcgtatt ttagattcat 480 gtccagctaa ctggcgttct ggagagcgtg 540 aatacttcca gacgatggat taagcatctt 600 ctgaaaagag aágaaggctt tttaattttc 660 tgaagtctcc gacaccaggc aatgctaagg 720 taaggaaatg aaggccaaag aaatagctat 780 agaatagtat gtcgtatcc 829 <400> 57 acatcaagaa atagcggact cgcctttagt acaacaagat attcaaacga tcacacctag tgggtcagct gcttccgcag gaagtgcggc aagaatttcc ttgttgcttg atgatgtaga ttttcgatct atgatcgaac aatttaatgt agctatggag gctcagctga ctgcgatgtc cccagccgaa atacaagcaa tcaaagatgc agatggttta gctacagcta tgggacaagt ctccgcagga acagctggca ctgtccagat ttcttcgact tcttccagct cttatgcagc aacactgaac tctttatatt ccgaaagcag tgcaaatccc gcgctttcca gaagcgtttc tgcagatgct agccaaagag cagcagaaac tgtatatagc cgcttacagg ttctggattc agcaaatcaa gaagagatta tgcagaagct tgggtatcct gctgttcaga attctgtgga aagagagttt gttgatgggg aacgtagtct acagcccgct ttcattcaac aggtgttggt ttcttaacgt gtgattgaag tttgtgaatt ggctcttttt tcttttcaaa ggaatctcgt ttagttccaa aagaagaaaa tatataaaag cggcagactt cgtggaaaat gtctgtaaag tatccgagaa aaaaggctca ggctcgtgcc cttttctttc ggaatctgtc attggatctg ctgtcttctc tttaggtttc ttgcgcgaga ttttacagcc ggcatccggc ttctcgcgaa gaaaaaagct gaggagcaga ttaatcaagc 60 tggtttggat attcctatcg ttggtccgag 120 aggagcgttg aaatcctcta acaattcagg 180 caatgaaatg gcagcgattg caatgcaagg 240 aaacaatcct gcaacagcta aagagctaca 300 agatcaactg gttggtgcgg atggcgagct 360 tcttgcgcaa gctttgaaac aaccatcagc 420 ggcttttgca gctgccaagg ttggaggagg 480 gaatgtaaaa cagctttaca agacagcgtt 540 agcactttcc gatggatatt ctgcttacaa 600 aagcggcgtg cagtcagcta ttagtcaaac 660 tcgttctggc atagaaagtc aaggacgcag 720 tattgtcaga gatagccaaa cgttaggtga 780 tttgatgtct acgattgtga gcaatccgca 840 cacggcatct attagcaaag ctccacaatt 900 tagcttgcag aagtttgctg cacaattgga 960 cgcagaatct caagagaatg cgtttagaaa 1020 aaacattgct tctctattct ctggttatct 1080 gagggggagc caaaaaagaa tttctttttt 1140 gtctacagaa gtcttttcaa taataagttc 1200 aaaaaactcc taattcattt aaaaagtgct 1260 ctggagggga atcagcagaa agatgcaaga 1320 gaattcggca cgagactacg aaagaaaggt 1380 cgtaagactt aaagttcggc aacacaggct 1440 aaaattttct caagtaacaa gaagatttct 1500 gtataac 1537 81 <210> 59

<211> 552 < 212 > ADN <213> Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis ggccatccac aaattgaggt gctaaagatg ctgctagtgg aaagaagatg aaattcaaca caacgaaaag aagcttctga aaagctgtga aagattacca catattgaga aagtacgcca gcttctgatg agttgagtac gcatccgcag cagcatcttc gatctgaaaa aacatagttt <400> 59 acattcctcc tgctcctcgc acggaatttt acacgtttct ttgaagcaag ctctggatta ttcataaaga ggaagacaaa gaatgatctt tagagccgaa ttgttaaaga aattgaagag ccacaacagc tatcaaagca aagctatgca ggctcaatcc ggccaaacat taactccgaa gaggaagcgc ct <210> 60 <211> 1180 <212> ADN <213> aaccttcgat attgatgcca 60 acgcgaacaa aaaatccgta 120 aatgatccgc gatgcagagc 180 tgtgaaaaat gaagccgatg 240 cgacaaaatt cctgcagaac 300 agcaatcaaa gaagatgctt 360 tcgtatgcaa aaaatcggag 420 tgcagcgaat gctcaaggag 480 cagcacacga cctccagcag 540 552 <400> 60 atcctagcgg taaaactgct tactggtcag ataaaatcca tacagaagca acacgtactt 60 cttttaggag aaaaaatcta taatgctaga aaaatcctga gtaaggatca cttctcctca 120 acaacttttt catcttggat agagttagtt tttagaacta agtcttctgc ttacaatgct 180 cttgcatatt acgagctttt tataaacctc cccaaccaaa ctctacaaaa agagtttcaa 240 tcgatcccct ataaatccgc atatattttg gccgctagaa aaggcgattt aaaaaccaag 300 gtcgatgtga tagggaaagt atgtggaatc tcgtgccgaa ttcggcacga gcggcacgag 360 gatgtagagt aattagttaa agagctgcat aattatgaca aagcatggaa aacgcattcg 420 tggtatccaa gagacttacg atttagctaa gtcgtattct ttgggtgaag cgatagatat 480 tttaaaacag tgtcctactg tgcgtttcga tcaaacggtt gatgtgtctg ttaaattagg 540 gatcgatcca agaaagagtg atcagcaaat tcgtggttcg gtttctttac ctcacggtac 600 aggtaaagtt ttgcgaattt tagtttttgc tgctggagat aaggctgcag aggctattga 660 agcaggagcg gactttgttg gtagcgacga cttggtagaa aaaatcaaag gtggatgggt 720 tgacttcgat gttgcggttg ccactcccga tatgatgaga gaggtcggaa agctaggaaa 780 agttttaggt ccaagaaacc ttatgcctac gcctaaagcc ggaactgtaa caacagatgt 840 ggttaaaact attgcggaac tgcgaaaagg taaaattgaa tttaaagctg atcgagctgg 900 tgtatgcaac gtcggagttg cgaagctttc tttcgatagt gcgcaaatca aagaaaatgt 960 tgaagcgttg tgtgcagcct tagttaaagc taagcccgca actgctaaag gacaatattt 1020 agttaatttc actatttcct cgaccatggg gccaggggtt accgtggata ctagggagtt 1080 gattgcgtta taattçtaag tttaaagagg aaaaatgaaa gaagagaaaa agttgctgct 1140 tcgcgaggtt gaagaaaaga taaccgcttc tcggcacgag 1180 82 <210> 62

<211> 688 <212> ADN <213> Chlamydia trachomatis <4Ο Ο> 62 gtggatccaa aaaagaatct aaaaagccat ctaacacttt atcagcgtca tctttgagaa catgccgcac atccgcttct tcatgttctg atccaaagta ctcagtcaat ccacgaattt cataagaata caaagcagcc actcctgcag aagtagctac tttcgctttt gctgcttcac taactcctag agcaaacaca aactgcttcc cttcatccat caagttatct aacaataact gaatcgcaga taaatattta ggaaaggctt cctgtaattg ctctttagta agctccccct gcatatgctt attttgaata attaaatcta tcatttcttt tcttgactcc acgtaacc acaaagattg cgttacttct tgcgatgcct 60 gcatctcaat gagcgctttt tcttctctag 120 tgaaatatgc atagtcttca ggattggaaa 180 tctctctagc gatacgtgga atttgactct 240 ctaaagaatc tcctgtacac caccgcatga 300 taggctcatg agcctctaac tcttctggag 360 acaaatcaat atgattaggg taaccgttct 420 tacgcgcctc taaatcatcg caacgactat 480 tgatatgtaa ataatagtct ttggcacgag 540 tcgaccattt cacataaaac gtgtgttcta 600 actgatctaa aaaattcata aacacctcca 660 688 <210> 87 <211> 3031 <212> ADN <213> Chlamydia <400> 87 atgtaggccc tcaagcggtt ttattgttag aagatagtca ggctgaagga cagtataggt agaaagatgc agatactctt cccgggaagg atcccgtggt tttccaaggt gtggaccaac gtagttttac gagcagcaac cttgattctc cttttgttgg ggatagtagt aaggctggaa ctggagcggc tttatattct acagaagatc aatttgcatc atgttcttct ctagaacagg ttcatgattg tcaaggattg caggttaaac ctagtgcgaa tgatcatctt ggatttggag ctggagagaa aagtctctat atgcctgcag ctatatcttt tgaaggaaac agcgcgaact ggaaagtgct ttttgtcgct aatgataaaa ctggaggagc gattgcagcc tcttctgata tcaaaggcaa ttgtgcaatt ggaacagagg cttctctagg caccgttctt ttgcaaggga ctgcttcgca aggaggcgcc atttttggca cagtggtttt cagagatagt acagcttgct ttgtttctat tcagaacaat caggctggga gaggaggtat tgcgtgtgga tctttttctt ttgatatttc gaagaattta ggcgcgattt accaaattcg agatctattc gttgggtcta bu taattgtagg agatccaagt tctttccaag 120 tagagcaaag tactttgttc tcagtaacca 180 aggatcaagt ctcttcccaa gggttaattt 240 cccgtgacgg agaatctttt ttaggtattg 300 tcacattaac tgacgtgaaa gcttctttgt 360 ttatctttga aaagattaag ggtggattgg 420 ggggagcttg tgcagctcaa agtattttga 480 actgtactac agccgtgaat gctgaggggt 540 gaggcgcttt ctttgttacg ggttctcttt 600 gagatatggt agttgcgaat tgtgatgggg 660 ttgctaatgg aggagcgatt gctgcctctg 720 agacttcttt tatagagaac cgagctttgt 780 ttgcctttca aaactgcgca gaaçtagttt 840 ataaaggttc tttaggtgga ggggctatat 900 atcacgggat aacttgtgat aataatgagt 960 aaaattgtca gatttctgac aacgaggggc 1020 taggaggagg cgctattgca gctcaagaaa 1080 tttccttcga gggaggtaag gctagtttcg 1140 ccgcaggcgg tgcttctgtt ttagggacta 1200 cgttctctcg tactttatgt acgacctcag 1260 83 atttaggaca aatggagtac cagggaggag ctgagaatgc tggtgtgctc acctttaaag ggaaaattct gggaggagga gcgattttag ccggaggaat ttcttttaca ggaaatgcga agtttccttt attcagcaaa aaagaagggc gagcgatttt aggaagagaa gtagctattc atcgtttgca gtgcagcgaa gaagaagcga ttcatgggat ggatagcact tcgattgttg acgcaatggç acaaggagtc tcaggaggag gaaatggaag cgtcgatttt tctcgaaata tagcttcaga aacctttgct tccagagcaa atttccaagt aacctcatcc ccctctaatt actcgccatc agagaaaacc gctgttatgg taaaatcgga gggcccttcc attcctcctg gcaatctcca agccttacac tctgtagata aaaatagctt aaagcatgaa ggacatgccc ctaaaacctt cttacaatta gtagaagata cattaaatga actggtaggc ccagatactg tccgcgctct taatggctgt tcgcctagaa tggcatcggt tatcacaaat acgctagatg aaccaggtga cttcccacga tcttccttct aatctgagat tccaacgtca cctacctcaa ctgtaataaa aagagcgcgc ttcctttatg ttagggactc aaatcaacag ccctcttact tttggataca acaatgttgc tgtacaaatt gctggagtca tgcttggaaa acttccagag gctttgtcta tcaatggatc tccgcaatct atctctaacc aactctatct ctgtgatcgg ctcgcccgtt acttagttct tttttcgcag aaaggagaac ttccagattt acatgctcta <210> 110 <211> 1461

<212> ADN <213> Chlamydia gagctctatt tggtgaaaat atttctcttt 1320 acaacattgt gaagactttt gcttcgaatg 1380 ctactggtaa ggtggaaatt accaataatt 1440 gagctccaca agctcttcca actcaagagg 1500 gaccactctc ttcaggatat tctgggggag 1560 tccacaacgc tgcagtagta tttgagcaaa 1620 cattattagg ttgttgtgga ggaggcgctg 1680 gcaactcttc agtaagattt ggtaataatt 1740 ctcttttatc taaaacagtg cagttaçctg 1800 ttgctagttt gggaggacgc aatgttctgt 1860 atacatctcc ttcatcgctt cgctccttat 1920 gcgctaattt acatcaaatg cttgcttett 1980 agtttctagt gaatggcatg gtagcagatt 2040 caaaattgca agtatatatg acggaactaa 2100 gcttttttga tagaaatatt gggaacttgg 2160 ctattccatc cttaacgaca ggaaatttaa 2220 aattcccttc ctcttccaaa gctcaaaagg 2280 gtcctcaaac tgaagtttta aacttattct 2340 tattctctgg agctgaaaàa aaacagcagc 2400 cgataaatgc ggataatgag gattatccta 2460 ctagtacgcc tcctcatgct ccagtacctc 2520 cacagcctcc atcaccctaa cttgtaaaaa 2580 caaaatcaat ttgaacaact ccttactgaa 2640 cctgattcca ataatgcctg tatagttcgc 2700 gaagaggatg gtaattcagg atttttagtt 2760 aataccttta gacaaaaaat tttcaaagct 2820 aatattaaag gcactctagg atacggtgaa 2880 cttaacatga cctatctaaa tggagaaaag 2940 catgccaata tctggatgca atctatctca 3000 9 3031 <400> 110 ctatctatga agttatgaat atggatctag ggcactatca ggacccaaga gcttcagatt tgcctagaag cccatatcct actccacctt atgtagaagc agggttccgt gaggcagttt atgtagtgac acagccgcaa gagcgtattc gtgatatgct taccaacggg tcacagacat aagtcgatag ggaataaact ggtatctacc aagaagaaat tctctttggt gggcttcttt attatctcgt gccgctcgtg ccgaattcgg attgccaaga gttggaagaa aaaatattag gctccattga ggaggatgct aaacaagaaa ggttgcaaca aaatcagaac acttgcagtc ctgagaataa ggcattatcg gagcggctgc taaagactcc tcagatattg catctgagag gttctgcatg ttgcggattt atagtgattt aaacacgaag atcttttgcg gtacagcasg 60 atgacctccc acgtgctagc gactatgatt 120 tgccttctag atatcagcta cagaatatgg 180 atgcttcttt tgtagcagga atgtacaatt 240 ccaatagtca gcaggtggaa gggattctgc 300 ttagcaacct gatgcagcgt tgggatagag 360 ataggtttgt atcaaaaaac taagcccacc 420 ttttattcaa aaaagaaagc cctcttcaag 480 cacgagcggc acgaggagct gtaagtaagt 540 atttgtgtaa gcgtcatgcc gcaacaattt 600 ttcgtcatca gacagaaagg tttaaacagc 660 aattaacagc agagttgtgt aaattgagat 720 aggtgcaggc atcccgtcgt aaaaaataat 780 ttaggggttc cttttgctta cggcgcttta 840 gcgagtaaag cgccgttctg atacagtttt 900 84 tccgctttaa aaataaaaag gtggaaaaat tttaccgttg ccaacagctt cctgcgtaga gaatacttgt tccaaaattt tggatatagc cgctggggta ttagctttgg ttttgtgcgc tcctgcatta attattggat ctgcttgtgt atcctcttat gctagcttag aagcaaaaaa ttcagaagag aaggacgctt tggcctccgt tcttacggac gatctccaag ctttggaagc ggacagatta gagaaaaatg agcaagcttt ctacacaaga tggttggata g <210> 111 <211> 267 <212> ADN <213> Chlamydia gagtactact attagcggag acgcttcttc 960 gacaaaatct acttcgtctt caacaaaagg 1020 tttagctatc gtaggcgctt tagttgttgt 1080 tagcaatgtc atatttactg taataggtat 1140 gggtgcggga atatctcgtc ttatgtatcg 1200 tgttttggct gagcaacgtt tgcgtaatct 1260 ctctttcatt aataagatgt ttctgcgagg 1320 taaggtaatg gaatttgaga ttgattgttt 138Ô attgtccgat gtgcgcttag ttttatctag 1440 14 61 <400> 111 gtcctcttct tattatagca gaagacattg acagaattcg tggaggattc cgggtttgcg gaaaagctat gttggaagac atcgctatct tgggcatgaa attagaaaac gctaacttag tttctaaaga agacacgacc atcgtcg <210> 114 <211> 976 <212> ADN <213> Chlamydia aaggcgaagc tttagctact ttggtcgtga 60 cagttaaagc tccaggcttt ggagatagaa 120 taactggcgg tcaactcatt agcgaagagt 180 ctatgttagg taaagctaaa aaagttatcg 240 267 <400> 114 aggtggatgg ggcgcctgtc caagatgtgc ggactgcagc tgaagagtcg gctgctttaa ggcacaaagt accttctggg cgcactactt gagaagttcg tgtgaaatgg cgttatgttc ctccttctat cagggctcca cagttacaga atgatgcgtt tcatcggtct agttcgctat cagagcttcg caatcattat gcaacgagtg ccgatgggtt tctccctgtc attgggcctg cttatatttc ttcggtgact gatggggatg ttcctacata tagttggcag gacatggaag aagaatttgc taagattatt caagtatttt aaacgaacaa cccaggtggt agtgtccttt accgtccttt agaacttcct aaacatagaa ctttagattg gttaaccctg ttggaaaacg tgggagacaa catggaagga tatactgtgg ttggacgtca agtattgaat tgttggagta ctctttttgg ttttga tcgctactct atatggaagc aatcacaaag 60 gaacactatt ttctcgcatg gcctctttag 120 taaagattcg tcgtcctttt ggtactacga 180 ctgaaggtgt aggagatttg gctaccatag 240 aatcgatgag aagctttttc cctaagaaag 300 tctactctcc aatggttccg catttttggg 360 gtttgaaaag cgggtacaat attgggagta 420 ttatatggga gtcggagggt cttttccgcg 480 gtaagagcca taaagtagga tttctaagaa 540 attttgatcc ttcaggaccg cctccttggg 600 cttctaatac agaagctttg attatcgacc 660 atctttatgc actgctttcc atgttgacag 720 tgattctgac tcaggatgaa gtggttgatg 780 tagacacaaa cgtggagtct cgccttgctc 840 atctacaggt tgccgagtat ttaaaaagct 900 aaggggatat cgagttatca acacctattc 960 976 85 < 210 > 115 <211> 995 <212> ADN <213> Chlamydia

Chlamydia trachomatis serotipo D < 4 Ο Ο > 115 ttatcctaga aatttggtgt tcaatatgag tatcgaccta gggacgacca actcttgcgt tattgcctct tctgaaggaa ctcgtactac aactcttgtt ggaattcctg caaaacgtca ttctactaag cgattcatcg gtagaaaatt cccctacaaa gttgctccta actcgaaagg gtacactcca gaagaaatcg gcgctcagat ttatctcgga gaaacagtaa cggaagcagt tcaaagagct tctacaaaag atgctggacg tcctgaacca acagcggccg ctcttgctta cgccgtcttc gacttaggag gaggaacttt agtttttgaa gttctctcaa ccaacgggga agtcatcatc aactggatgc ttgatgaatt agataacatg gctttgcaaa gattgaaaga tggtgtatcg tctactgaaa tcaatcagcc acatttggct ttaactctaa ctcgcgctca gcgaaccaaa caaccttgtg ctcaggcttt <210> 407 <211> 1827 <212> ADN <213> cgaaaaaaga aagtctaaca aaattattgg 60 ctctgttatg gaaggtggcc aacctaaagt 120 tccttctatc gttgctttta aaggtggcga 180 ggcagtaacc aatcctgaaa aaacattggc 240 ctctgaagtc gaatctgaaa ttaaaacagt 300 agatgcggtc tttgatgtgg aacaaaaact 360 cctcatgaag atgaaggaaa ctgctgaggc 420 cattaccgta ccagcttact ttaacgattc 480 tatcgcagga ttagatgtta aacgcattat 540 tggtattgat aaggaaggag ataaaaaaat 600 cgatatttct atcttggaaa tcggtgacgg 660 tactcacttg ggaggagacg acttcgacgg 720 caaaaaacaa gaaggcattg atctaagcaa 780 tgctgctgaa aaagcaaaaa tagaattgtc 840 attcatcact atcgacgcta atggacctaa 900 attcgaacac ctagcttcct ctctcattga 960 aaaag 995 86 < 4 Ο Ο > 407 atgggttttt ggagaacatc gattatgaaa atgaatagga tttggctatt actgcttacc 60 ttttcttctg ccatacattc tcctgtacaa ggagaaagct tggtttgcaa gaatgctctt 120 caagatttga gttttttaga gcatttatta caggttaaat atgctcctaa aacatggaaa 180 gagcaatact taggatggga tcttgttcaa agctccgttt ctgcacagca gaagcttcgt 240 acacaagaaa atccatcaac aagtttttgc cagcaçgtcc ttgctgattt tatcggagga 300 ttaaatgact ttcacgctgg agtaactttc tttgcgatag aaagtgctta ccttccttat 360 accgtacaaa aaagtagtga cggccgtttc tactttgtag atatcatgac tttttcttca 420 gagatccgtg ttggagatga gttgctagag gtggatgggg cgcctgtcca agatgtactc 480 gctactctat atggaagcaa tcacaaaggg actgcagctg aagagtcggc tgctttaaga 540 acactatttt ctcgcatggc ctctttaggg cacaaagtac cttctgggcg cactacttta 600 aagattcgtc gtccttttgg tactacgaga gaagttcgtg tgaaatggcg ttatgttcct 660 gaaggtgtag gagatttggc taccatagct ccttctatca gggctccaca gttacagaaa 720 tçgatgagaa gctttttccc taagaaagat gatgcgtttc atcggtctag ttcgctattc 780 tactctccaa tggttccgca tttttgggca gagcttcgca atcattatgc aacgagtggt 840 ttgaaaagcg ggtacaatat tgggagtacc gatgggtttc tccctgtcat tgggcctgtt 900 atatgggagt cggagggtct tttccgcgct tatatttctt cggtgactga tggggatggt 960 aagagccata aagtaggatt tctaagaatt cctacatata gttggcagga catggaagat 1020 tttgatcctt caggaccgcc tccttgggaa gaatttgcta agattattca agtattttct 1080 tctaatacag aagctttgat tatcgaccaa acgaacaacc caggtggtag tgtcctttat 1140 ctttatgcac tgctttccat gttgacagac cgtcctttag aacttcctaa acatagaatg 1200 attctgactc aggatgaagt ggttgatgct ttagattggt taaccctgtt ggaaaacgta 1260 gacacaaacg tggagtctcg ccttgctctg ggagacaaca tggaaggata tactgtggat 1320 ctacaggttg ccgagtattt aaaaagcttt ggacgtcaag tattgaattg ttggagtaaa 1380 ggggatatcg agttatcaac gcctattcct ctttttggtt ttgagaagat tcatccacat 1440 cctcgagttc aatactctaa accgatttgt gttttgatca atgagcaaga cttttcttgt 1500 gctgacttct tccctgtagt tttgaaagac aatgatcgag ctcttattgt tggtactcga 1560 acagctggag ctggaggatt tgtctttaat gtgcagttcc caaatagaac tggaataaaa 1620 acttgttctt taacaggatc attagctgtt agagagcatg gtgccttcat tgagaacatc 1680 ggagtcgaac cgcatatcga tctgcctttt acagcgaatg atattcgcta taaaggctat 1740 tccgagtatc ttgataaggt caaaaaattg gtttgtcagc tgatcaataa cgacggtacc 1800 attattcttg cggaagatgg tagtttt 1827

<210> 431 <211> 609 <212> PRT

<213> Chlamydia trachomatis serotipo D 87 <4 Ο Ο> 431

Met Gly Phe Trp Arg Thr Ser Ile Met Lys Met Asn Arg Ile Trp Leu 5 10 15 Leu Leu Leu Thr Phe Ser Ser Ala Ile His Ser Pro Vai Gin Gly Glu 20 25 30 Ser Leu Vai Cys Lys Asn Ala Leu Gin Asp Leu Ser Phe Leu Glu His 35 40 45 Leu Leu Gin Vai Lys Tyr Ala Pro Lys Thr Trp Lys Glu Gin Tyr Leu 50 55 60 Gly Trp Asp Leu Vai Gin Ser Ser Vai Ser Ala Gin Gin Lys Leu Arg 65 70 75 80 Thr Gin Glu Asn Pro Ser Thr Ser Phe Cys Gin Gin Vai Leu Ala Asp 85 90 95 Phe Ile Gly Gly Leu Asn Asp Phe His Ala Gly Vai Thr Phe Phe Ala 100 105 110 Ile Glu Ser Ala Tyr Leu Pro Tyr Thr Vai Gin Lys Ser Ser Asp Gly 115 120 125 Arg Phe Tyr Phe Vai Asp Ile Met Thr Phe Ser Ser Glu Ile Arg Vai 130 135 140 Gly Asp Glu Leu Leu Glu Vai Asp Gly Ala Pro Vai Gin Asp Vai Leu 145 150 155 160 Ala Thr Leu Tyr Gly Ser Asn His Lys Gly Thr Ala Ala Glu Glu Ser 165 170 175 Ala Ala Leu Arg Thr Leu Phe Ser Arg Met Ala Ser Leu Gly His Lys 180 185 190 Vai Pro Ser Gly Arg Thr Thr Leu Lys Ile Arg Arg Pro Phe Gly Thr 195 200 205 Thr Arg Glu Vai Arg Vai Lys Trp Arg Tyr Vai Pro Glu Gly Vai Gly 210 215 220 Asp Leu Ala Thr Ile Ala Pro Ser Ile Arg Ala Pro Gin Leu Gin Lys 225 230 235 240 Ser Met Arg Ser Phe Phe Pro Lys Lys Asp Asp Ala Phe His Arg Ser 245 250 255 Ser Ser Leu Phe Tyr Ser Pro Met Vai Pro His Phe Trp Ala Glu Leu 260 265 270 Arg Asn His Tyr Ala Thr Ser Gly Leu Lys Ser Gly Tyr Asn Ile Gly 275 280 285 Ser Thr Asp Gly Phe Leu Pro Vai Ile Gly Pro Vai Ile Trp Glu Ser 290 295 300 Glu Gly Leu Phe Arg Ala Tyr Ile Ser Ser Vai Thr Asp Gly Asp Gly 305 310 315 320 Lys Ser His Lys Vai Gly Phe Leu Arg Ile Pro Thr Tyr Ser Trp Gin 88 325 330 335

Asp Met Glu Asp Phe Asp Pro Ser Gly Pro Pro Pro Trp Glu Glu Phe 340 345 350

Ala Lys Ile Ile Gin Vai Phe Ser Ser Asn Thr Glu Ala Leu Ile Ile 355 360 365

Asp Gin Thr Asn Asn Pro Gly Gly Ser Vai Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu 370 375 380

Leu Ser Met Leu Thr Asp Arg Pro Leu Glu Leu Pro Lys His Arg Met 385 390 395 400

Ile Leu Thr Gin Asp Glu Vai Vai Asp Ala Leu Asp Trp Leu Thr Leu 405 410 415

Leu Glu Asn Vai Asp Thr Asn Vai Glu Ser Arg Leu Ala Leu Gly Asp 420 425 430

Asn Met Glu Gly Tyr Thr Vai Asp Leu Gin Vai Ala Glu Tyr Leu Lys 435 440 445

Ser Phe Gly Arg Gin Vai Leu Asn Cys Trp Ser Lys Gly Asp Ile Glu 450 455 460

Leu Ser Thr Pro Ile Pro Leu Phe Gly Phe Glu Lys Ile His Pro His 465 470 475 480

Pro Arg Vai Gin Tyr Ser Lys Pro Ile Cys Vai Leu Ile Asn Glu Gin 485 490 495

Asp Phe Ser Cys Ala Asp Phe Phe Pro Vai Vai Leu Lys Asp Asn Asp 500 505 510

Arg Ala Leu Ile Vai Gly Thr Arg Thr Ala Gly Ala Gly Gly Phe Vai 515 520 525

Phe Asn Vai Gin Phe Ρχο Asn Arg Thr Gly Ile Lys Thr Cys Ser Leu 530 535 540

Thr Gly Ser Leu Ala Vai Arg Glu His Gly Ala Phe Ile Glu Asn Ile 545 550 555 560

Gly Vai Glu Pro His Ile Asp Leu Pro Phe Thr Ala Asn Asp Ile Arg 565 570 575

Tyr Lys Gly Tyr Ser Glu Tyr Leu Asp Lys Vai Lys Lys Leu Vai Cys 580 585 590

Gin Leu Ile Asn Asn Asp Gly Thr Ile Ile Leu Ala Glu Asp Gly Ser 595 600 605

Phe

Lisboa, 8 de Novembro de 2007 89

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo: (a) um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431, ou (b) um polinucleótido que codifica para o polipéptido de (a); para utilização na estimulação de uma resposta imunitária num doente.
2. Composição compreendendo: (a) polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431, ou (b) um polinucleótido que codifica para o polipéptido de (a); para utilização no tratamento ou prevenção da infecção por clamídia.
3. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, compreendendo um polipéptido compreendendo a sequência de 1 SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade com esta, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima uma janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, compreendendo um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431.
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo um polipéptido que é um polipéptido de fusão.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo um polipéptido que consiste da sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431.
7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, compreendendo um polinucleótido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 407.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, compreendendo um polinucleótido que consiste da sequência de SEQ ID N°: 407.
9. Composição farmacêutica compreendendo uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um veiculo fisiologicamente aceitável. 2
10. Vacina compreendendo uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um imunoestimulante.
11. Utilização de (a) um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade com esta, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima uma janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431, ou (b) um polinucleótido que codifica para o polipéptido de (a); na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da infecção por clamídia.
12. Utilização de (a) um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima uma janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431, ou (b) um polinucleótido que codifica para o polipéptido de (a); para a detecção da infecção por clamídia num doente.
13. Utilização de (a) um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N°: 431, ou uma sua variante com, pelo menos, 90% de identidade com ela, tal como determinado comparando as duas sequências alinhadas de forma óptima numa janela de comparação de todo o comprimento da sequência de SEQ ID N°: 431, ou (b) um polinucleótido que codifica para o polipéptido de (a) ; na preparação de um kit de diagnóstico para a detecção da infecção por clamídia num doente. Lisboa, 8 de Novembro de 2007 3