CN113801191B - 一种检测衣原体的多肽探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药生物技术和医学检验技术领域，具体涉及一种检测衣原体的多肽探针及其应用。本发明所述多肽探针是一段肽链Ac‑Lys Asn Ser Ser‑x，Ac代表N末端乙酰化，x代表C末端偶联的用比色分析的对硝基苯胺pNA或荧光化合物7‑氨基‑4‑甲基香豆素AMC或生物素荧光素酶底物生物素Luc化合物。发明所述多肽探针可定量检测衣原体质控物，用于活细胞成像或对衣原体蛋白酶的释放或在胞浆定位或在小动物感染模型上实时监测感染中应用。

Description

一种检测衣原体的多肽探针及其应用
技术领域
本发明属于医药生物技术和医学检验技术领域，具体涉及一种检测衣原体的多肽探针及其应用。
背景技术
衣原体科衣原体属(Chlamydia spp.)微生物包括感染人的沙眼衣原体(C.trachomatis)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)，猪衣原体(C.suis)、鼠衣原体(C.muriradum)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、猫衣原体(C.felis)、豚鼠衣原体(C.caviae)、流产的流产嗜性衣原体(C.abortus)、反刍动物衣原体(C.pecorum)等，其中很多是人或动物感染的重要病原体。沙眼衣原体感染不但可以引起沙眼，甚至致盲，沙眼衣原体泌尿生殖道感染是最为常见的性传播疾病病，引起尿道炎，女性盆腔炎、输卵管损伤，导致宫外孕甚至不孕。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)估计，全球每年有近亿人新的CT感染病例发生，同时在发展中国家发生率也呈逐年上升趋势。此外，性传播沙眼衣原体还可以增加人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的机率。流产嗜性衣原体及鹦鹉热衣原体是引起猪、牛、羊等多种动物流产、死胎、弱胎等慢性接触性疾病的一种重要病原体,孕妇也可感染而发生流产，给我国养殖业带来巨大的经济损失；而鹦鹉热衣原体还是人兽共患病重要病原体，有可能为恐怖分子用于生物武器。因此，建立快速、准确的诊断方法是预防和控制衣原体感染的重要措施，对人民健康和农业发展具有重要意义。
目前，针对衣原体感染有一系列常见传统的检测方法，如细胞培养法、直接免疫荧光法、聚合酶链反应法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法等。但是目前临床上各种沙眼衣原体的检测手段仍然存在不同程度的缺陷，特别是对于临床弱阳性的样本无法得到十分准确可靠的检测结果。因此摸索并建立一种特异性强、简便快速的沙眼衣原体检测技术，对于沙眼衣原体诊断和预防具有重要的意义。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种检测衣原体的多肽探针及其应用。本发明将一段肽链与特定化合物偶联制作底物，当含衣原体的裂解液或衣原体蛋白酶作用于该底物时，由于酶切割释放该特定化合物产生具有包括颜色改变、产生经激发产生荧光的化合物、或者荧光素酶底物。利用比色、荧光强度、荧光成像或者测定生物素荧光强度的变化，实现不同显色信号的差异，作为检测衣原体的指标。案例说明该测定方法选用的肽链片段特异性强，可用于实时检测衣原体的质控物，在相关领域有较好的适用性。
衣原体属微生物属于革兰氏阴性病原体，是一类严格胞内原核微生物，采取寄生的方式在真核细胞内利用二分裂方式增殖。在感染复制过程中，衣原体与宿主细胞交换小分子物质，同时衣原体可能利用物质释放抑制宿主细胞抗微生物免疫应答。基因序列分析显示，引起人类疾病的衣原体很多主要基因及蛋白序列高度同源，比如鹦鹉热衣原体与嗜肺炎衣原体外膜主蛋白基因的同源性为71％，与沙眼衣原体之间为68％。以沙眼衣原体D型序列为参考，对其基因组序列分析，发现基因组编码16个蛋白酶，其中以丝氨酸蛋白酶以及天门冬氨酸蛋白酶为主，但是这些酶在感染过程中的作用缺乏了解，也缺少实时监控蛋白酶释放的探针及物质。因此发明一种检测衣原体的质控物，为提高衣原体检测研究技术，开发相关产品，探索衣原体诊断和治疗新方法提供了更为可靠的实验评估工具，包括开发人及牛羊衣原体相关预防、诊断、评分等技术有着十分广泛的应用；在基础医学研究应用方面，可以利用该方法进行沙眼衣原体感染活细胞成像检测以及相关盆腔炎、不孕不育等机制的实验性探索，对沙眼衣原体的潜在药物和技术进行效果评估。
本发明所建立的检测衣原体的方法在研究其感染过程、治疗药物靶标研究方面可提供客观有效的实验数据级评估，具有应用价值。
本发明的技术方案：
检测沙眼衣原体质控物的构建：
衣原体蛋白酶特定切割底物的确定：
文献报道衣原体蛋白酶可以切割不同宿主蛋白，比如CT441以及同属衣原体对应的同源蛋白酶都可以特异切割p65蛋白底物。基于此信息，本发明设计了一个由4个氨基酸组成的探针，其特点是其N末端进行乙酰化处理，C末端氨基酸为丝氨酸并与pNA偶联，探针基本形式为Ac-Lys Asn Ser Ser-pNA。这里Lys Asn Ser Ser为必须序列，C末端为丝氨酸(Ser，S)残基，Ac修饰的N末端可以延伸，延伸序列不影响该探针功能；C末端后续基团可以是但不局限于pNA，AMC，Luc等用于比色、荧光以及生物素酶活性检测的标记物等。
本发明所述检测衣原体的多肽探针是将一段肽链Ac-Lys Asn Ser Ser-x，Ac代表N末端乙酰化，x代表C末端偶联的用比色分析的对硝基苯胺pNA或荧光化合物7-氨基-4-甲基香豆素AMC或生物素荧光素酶底物生物素Luc化合物；
反应及检测通式如下：
Figure BDA0003217808830000031
Figure BDA0003217808830000032
Figure BDA0003217808830000033
这里，pNA是对硝基苯胺，当多肽底物被衣原体蛋白酶切割后，pNA作为游离基团被释放，在405nm测定游离pNA，检测衣原体的感染情况。
这里，AMC是7-氨基-4-甲基香豆素，是一种荧光染料，与多肽序列结合时无法产生荧光，当该底物水解后AMC被释放，游离的7-氨基-4-甲基香豆素即可产生荧光(ex/em:380nm/460nm)，根据激发的荧光强度可以检测衣原体感染情况。
以Ac-Lys Asn Ser Ser为基序，C末端偶联AMC制备荧光探针，将不同剂量的探针加在感染或未感染的细胞上，37℃孵育10分钟，在荧光光度计上测定荧光强度，检验探针裂解情况，与加入的衣原体关联，得出感染剂量曲线；结合荧光显微镜技术，该探针还可以用于衣原体感染过程中蛋白酶在细胞中的定位，蛋白酶的释放以及影响蛋白酶释放的外界刺激因素等。
这里，Luc指不同来源的荧光素(luciferin)，与多肽序列结合时无法被荧光素酶利用发光，当该底物水解后释放Luc，游离的Luc在合适条件下是荧光素酶底物，可以通过检测光强度测定。
以Ac-Lys Asn Ser Ser为基序，C末端偶联荧光素探针(Ac-Lys Asn Ser Ser-Luc)，当酶解释放Luc后可以作为荧光素酶的底物，用于定量检测衣原体酶活性和感染情况。
本发明所提供的检测沙眼衣原体的质控物，其特点是：鉴定出一段沙眼衣原体蛋白酶特异性切割的序列，将其基团结合形成稳定底物，利用该肽链被衣原体蛋白酶特异性切割的特点，建立检测沙眼衣原体的质控物的方法。该测定方法选用的肽链片段特异性强，可用于实时检测衣原体的质控物，在相关领域有较好的适用性。本发明所建立的检测衣原体的方法在研究其感染过程、治疗药物靶标研究方面可提供客观有效的实验数据级评估，具有应用价值。
本发明的有益效果是
本发明的检测沙眼衣原体的质控物及其应用具有普通检测方法及质控物无法实现的应用价值：
1)底物中的肽链片段容易制备、能稳定保存且无生物传染危险性；
2)利用探针监测细胞内衣原体质控物蛋白酶表达，实时研究细胞和组织感染情况；
3)通过化学荧光物质或生物素荧光，将生物信号转化为光信号，相比传统衣原体检测方法更加灵敏；
4)通过质控物对衣原体感染的动物或组织进行活体快速检测；
附图说明
图1、用于衣原体检测。x轴：对应的衣原体数，y轴：OD405值。
图2、用于不同衣原体种类检测。x轴：对应的衣原体种，y轴：OD405值。
图3、用于活细胞感染检测。x轴：对应的衣原体数目，y：荧光强度(x100)，实线为衣原体裂解液，斜线为热灭活衣原体裂解液对照。
图4、衣原体感染小鼠检测。感染剂量，斜线(1x103/只)，点线(1x104/只)，实线(1x105/只)，最左面未感染对照。
图5、衣原体疫苗保护小鼠感染。实线，PBS对照；斜线，灭活MoPn免疫；点线，灭活人衣原体免疫。
具体实施方式
以下通过沙眼衣原体及具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可根据本发明具体实施例作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的本质精神，均属于本发明所附权利要求的范围。
实施例1、衣原体检测：
以不同感染复数(MOI)的沙眼衣原体(C.trachomatis LGV2)感染Hela 229细胞，36小时后收取细胞，以下裂解液在冰上裂解细胞(143mM NaCl,50mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM DTT,1％Nonidet P-40,0.1％SDS)，4℃，1500g离心5分钟，收取上清液，此为衣原体裂解液。
按0.1mg/ml将探针溶于去离子水，置冰上。
在96孔酶标板上，每孔添加0，1，3，10，30μl衣原体裂解液，复孔，以裂解液补齐每孔体积至100μl。然后将配制好的探针按每孔1.0μl添加，37℃孵育30分钟，在405nm比色测定吸光度。将0μl衣原体裂解液读数设置为零，绘制吸光度曲线(图1)，x轴：对应的衣原体数，y轴：OD405值，复孔测定。
实施例2、不同衣原体种类检测：
以不同种类衣原体感染HeLa229细胞，感染复数为1，感染24小时后收取细胞，制备裂解液，与Ac-Lys Asn Ser Ser-pNA探针在37℃孵育30分钟，在405nm读取吸收值，检查衣原体探针切割，做图(图2)。所用衣原体包括C.trachomatis lymphogranuloma venereum2,LGV2；C.trachomatis D,CtD；C.trachomatis of mouse pneumonitis,MoPn。x轴：对应的衣原体种，y轴：OD405值，复孔测定。
实施例3、活细胞感染检测：
以不同感染复数的沙眼衣原体感染HeLa229细胞，24小时后，在感染和未感染的细胞上添加Ac-Lys Asn Ser Ser-AMC探针，置37℃培养箱10分钟，在荧光显微镜下直接镜检荧光，拍照(ex/em:380nm/460nm)。
以不同感染复数的沙眼衣原体感染HeLa229细胞，24小时后，在感染和未感染的细胞上添加Ac-Lys Asn Ser Ser-AMC探针，置37℃培养箱10分钟，然后以PBS轻洗细胞2次，以上述裂解液裂解细胞，转移至酶标板，于荧光分光光度计读取荧光强度(ex/em:380nm/460nm)(图3)，x轴：对应的衣原体数目，y：荧光强度(x100)，实线为衣原体裂解液，斜线为热灭活衣原体裂解液对照。
实施例4、衣原体感染小鼠检测：
以不同C.muridarum细菌量，按文献报道方法通过阴道感染雌性C3H/HeN小鼠，每组3只小鼠，于感染后比如第10天在小鼠外阴部以移液器头加10μl探针(Ac-Lys Asn SerSer-pNA，0.5mg/ml)，20分钟后以棉签刮取外阴分泌物，置于含200μl PBS缓冲液的EP管中，离心，液体转移至酶标板，于405nm读取吸收值。未感染小鼠的OD值做对照，做图(图4)，感染剂量，斜线(1x103/只)，点线(1x104/只)，实线(1x105/只)，最左面未感染对照。
实施例5、衣原体疫苗保护小鼠感染：
按文献方法，以甲醛灭活的小鼠MoPn衣原体或者人沙眼衣原体Ct D滴鼻免疫易感C3H/HeN小鼠，PBS做对照，4周后按文献报道方法以小鼠衣原体MoPn(1x105衣原体/只)阴道感染小鼠，在感染后的第10天以移液器头滴加10μl探针，20分钟后以棉签取样，转移至含PBS缓冲液的EP管中，离心，在酶标板测定405nm读数(图5)。实线，PBS对照；斜线，灭活MoPn免疫；点线，灭活人衣原体免疫。

Claims (4)

1.一种检测衣原体的含多肽的探针，其特征是将一段肽链Ac-Lys Asn Ser Ser-x，Ac代表N末端乙酰化，x代表C末端偶联的用比色分析的对硝基苯胺pNA或荧光化合物7-氨基-4-甲基香豆素AMC或生物素荧光素酶底物生物素Luc化合物。
2.根据权利要求1所述含多肽的探针，其特征是定量检测衣原体质控物。
3.根据权利要求2所述含多肽的探针,其特征是检测衣原体的质控物用于活细胞成像或对衣原体蛋白酶的释放或在胞浆定位。
4.根据权利要求2所述含多肽的探针，其特征是检测衣原体的质控物在小动物感染模型上实时监测感染中的应用。
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