JP3544973B2 - 感染性単純ヘルペスウイルス検出用遺伝子工学細胞系およびその方法 - Google Patents
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Description
本発明は概してウイルス診断学に関し、特に、標本中の感染性ヘルペスウイルスを検出するための方法およびこれに利用される細胞系に関する。
技術分野
ヘルペスウイルスによる人間の疾病率および死亡率は次第に増加している。ニューヨークRaven Press社出版、Whitley,R.J.著、『Virology』(1990年)を参照のこと。特に、単純ヘルペスウイルスの1型および2型(以下、総括してHSVという)には毎年多数の人が感染している。免疫適格性患者がHSVに一次感染すると、通常は口唇ヘルペスや性器ヘルペスなどの真菌性症候群につながる。特に性器ヘルペスは今日の性感染症の中で最も多く見られるものの一つである。HSV感染はまたさらに重度の感染症を引き起こすことになる。このうち最も重篤なものとして視力を脅かす角膜炎や生命を脅かす日本脳炎が挙げられる。さらに、新生児や白血病患者、臓器移植レシピエント、AIDS患者などの免疫抑制者におけるHSV関連疾患は次第に流行してきており、困難な問題となっている。
HSV感染に対する治療法は過去10年の間に大きく進歩した。抗ウイルス療法の進歩に伴ってウイルス診断学研究室の果たす役割は次第に大きくなり、HSV感染の早期診断を促進する一層高感度で正確且つ迅速な試験方法に対する必要性が明らかになってきた。
現在、HSV感染の診断には様々な試験方法を利用することができる。このうちほとんどの方法では、ウイルス性抗原すなわち無変化型感染性ウイルスを検出することに関わっている。抗原検出検定法は、迅速且つ特異的であるという利点を有するが、必要な感度に欠けることになる。Kowalski,R.P.およびGordon,Y.J.著、『Ophthal』(1989年)、96:1583〜1586を参照のこと。感染性ヘルペスウイルスの検出方法として最も信頼性の高い試験では、組織培養細胞に標本を接種した後、特徴的な細胞変性効果を顕微鏡観察することに関わる。HSVは広範な連続細胞系において複製する際に比較的培養しやすいウイルスではあるが、組織培養時のウイルス伝播は遅いわりには費用がかかる。近年、臨床標本からウイルスを検出する改良された方法も開発されてきている。例えば、シェルバイアル技術を利用すればHSV検出の感度や速度は大幅に高くなる。この方法を免疫組織学により抗原検出方法と組み合わせれば多くの場合24時間以内にHSVを明確に同定することができる。Gleaves et al.著、『J.Clin.Micro』(1985年)、26:2013〜2017を参照のこと。この種の検定法はウイルス診断学的な用途では好ましいものであるが、非常に手間がかかる上、かなり多くの標本は48時間たってもまだ陽性であると同定できずに残される。近年、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)テクノロジーも技術的に進歩しており、特に脳脊髄駅標本などのHSV検出用に有望と見られるツールが得られている。しかしながら、このテクノロジーではウイルスの核酸を検出するが感染性ウイルスを検出しない。Puchhammer−Stockl,et al.著、『J.Med.Virol.』(1990)、32:77〜82を参照のこと。感染性ウイルスが存在すれば活発なウイルス複製を伴うウイルス感染が起こっていると考えてまず間違いないため、このような感染性ウイルスを検出できると好ましい場合は多い。PCRによってウイルスの核酸を検出しても過去に感染した形跡があることや潜在的感染が認められることが分かるにすぎないであろう。
ヘルペスウイルスに係わる従来の科学的な研究では、一過性分析時にマーカー遺伝子を含有するキメラDNA構造でトランスフェクトした敏感な細胞系を使用し、ウイルスの複製時の遺伝子発現の調節などウイルスの様々な態様を研究していた。Flanagen W.M.およびWagner,E.K.著、『Virus Genes』、1:1:61〜71(1987)を参照のこと。しかしながら、これらの研究は、臨床診断検定に必要な感度および特異性を有する標本でのヘルペスウイルスの診断学的な検出や定量に適した、安定した培養細胞系の染色体に安定的に組み込まれたDNA構造について説明するものではない。
近年、標本における感染性HIVを検出するための方法が開示されている。この方法では、HIV−1 LTRプロモータに関連したE.coli LacZ遺伝子を有するキメラ遺伝子を含有する遺伝子工学的細胞系を利用している。Rccancourt,et al.『J.Virol』(1990)64:2660〜2668;Kimpton,J.およびEmerman,M.『J.Virol』(1992)66:4:2232〜2239を参照のこと。これらの細胞系は標本中のHIVの検出には有用である場合もあるが、特異性に欠けるためウイルス診断学的な検定には適していない。周知のように、リポーター遺伝子を発現させるためにこの種の研究のDNA構造に用いられているHIV−1 LTRプロモータはHIVに対する特異性は持たず、標本中にその他のウイルスが存在すればこのウイルスによってリポーター遺伝子が発現してしまう。特に、標本中にHSVやサイトメガロウイルスが存在する場合にはLTRプロモータは活性化され、標本中にHIVウイルスが全く存在しなくてもリポーター遺伝子は発現する。Mosca,J.D.et al.著、『Nature』(1987)325:67〜70;Mosca,J.D.,et al.著、『Proc.Natl.Acad.Sci.』(1987)84:7408〜7412;PopikおよびPitha著、『Proc.Natl.Acad.Sci.』(1981)88:9572〜9577を参照のこと。診断学的な検定にこのような細胞系を使用すると、実際に標本中にHIV以外のウイルスが含まれている場合にはHIVが存在しているという誤った診断をすることになろう。このように標本中のHIVを検出するために調製された細胞系での特異性に欠けるため、特異性を必要とする診断学的検定には利用できなかった。
従って、コスト効率の良い方法で標本中ヘルペスウイルスを迅速に検出すると同時に診断学的検定に必要な感度や特異性を提供するための方法が望まれている。
発明の概要
本発明の一実施態様によれば、標本中の感染性ヘルペスウイルスの存在を検出するための新規な検定法が提供される。この検定法は、視覚的に観察できるかあるいは簡単に検出できるヘルペスウイルスの存在を同定するための酵素的手段からなる。この検定法では、ヘルペスウイルスを含有する疑いのあるDNAトランスフェクト細胞系に標本を接種し、ヘルペスウイルスの感染サイクルに十分な時間接種を続け、ヘルペスウイルスに感染した細胞の数を検出且つ定量化して、標本中の感染性ヘルペスウイルスビリオンの数を求める。この検定で使用される細胞系は、標本中に感染性ヘルペスウイルスが存在する場合にのみリポーター遺伝子を発現させるよう工学的に処理されたものである。また、この検定法は、標本中のヘルペスウイルスの数を高信頼度で定量化すると共に標本中に1つでもビリオンが存在すればこれを検出できる感度を伴う。
本発明の他の実施態様によれば、上述した検定に使用される新規な細胞系が提供される。この細胞系は、ヘルペスウイルス誘導プロモータおよび酵素についての遺伝子コードを有するキメラ遺伝子によって安定的に形質転換されたされたヘルペスウイルスによる感染に対して敏感なDNAトランスフェクト細胞系である。酵素の発現はヘルペスウイルスの存在に左右され、且つ量的に比例して起こる。好ましい実施態様において、細胞系は安定したハムスター新生仔の腎細胞系であり、そのゲノムは誘導ESVプロモータ(3′)すなわちHSV−1 ICP6プロモータの後ろにE.coli LacZ遺伝子を含有するよう工学的に処理されている。第2の好ましい実施態様では、LacZ遺伝子の代わりにホタルのルシフェラーゼをコード化する遺伝子を使用する。
本発明のさらに他の実施態様によれば、標本中の感染性ヘルペスウイルスの存在を検定するためのキットが提供される。このキットは、検出される所望のヘルペスウイルスによる感染に対して敏感であって且つ誘導可能なヘルペスウイルスプロモータの後ろで容易に検出できる酵素をコード化する、リポーター遺伝子を含むように工学的に処理されたDNA形質転換細胞の供給源と、酵素の発現を検出するのに必要な試薬とを有する。
本発明によって得られる様々な利点として、診断学的検定法として適した、臨床標本中の感染性ヘルペスウイルスの存在を検出するための迅速かつ感度の検定法と;12時間以内に高信頼度の結果の得られる検定法と;自動検定法としての用途に適した検定法と;特定のヘルペスウイルスに対して特異性を呈する検定法と;標本中に1つでも感染性ビリオンがあればこれを検出できる検定法と;ヘルペスウイルスに感染した後にのみリポーター遺伝子を発現させ、その他のウイルスに感染した場合にはこの遺伝子を発現させない検定法と;がもたらされることが分かろう。
【図面の簡単な説明】
第1図は、pYBICP6LacZを示す概略図である。
第2図は、細胞ライゼートについての比色検定法によって測定された感染後の様々な温度での単純ヘルペスウイルス感染BRKICP6LacZ細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を示すグラフである。
第3図は、pYLICP6ffLucAを示す概略図である。
第4図は、細胞ライゼートについての発光検定法によって測定された感染後の様々な温度での単純ヘルペスウイルス感染BRKICP6LucA6細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
第5図は、検定に添加されたウイルス量の測定値としての平均ルシフェラーゼ活性を示す。
第6図は、第5図に示す平均ルシフェナーゼ活性値を得るために使用されるルシフェナーゼ活性の個々のデータ点を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明によれば、標本中の感染性ヘルペスウイルスを検出するための方法と、このような方法に利用する遺伝子工学的に処理された細胞系とが提供される。この方法は、一つの重要な観点において、標本中のヘルペスウイルスの存在を診断学的検定法としての用途に適した方法で検出且つ定量化することができる酵素的検定法である。この方法では、標本中のヘルペスウイルスの存在検出を可能にする安定的に組み込まれたキメラ遺伝子を含有する遺伝子工学的に処理した細胞系を利用する。一般にキメラ遺伝子は、ヘルペスウイルスからの転写開始領域と転写開始領域に作用的に結合する酵素をコード化する構造遺伝子とを有するため、構造遺伝子の発現は転写開始領域によって調節される。ヘルペスウイルスの接種後、細胞は検出可能なレベルで酵素を発現する。
キメラ遺伝子の遺伝子要素は、転写開始領域すなわちプロモータの制御下で酵素を発現させる機能的遺伝子単位として動作する。キメラ遺伝子に使用されるプロモータは、感染性ヘルペスウイルスが存在する場合にのみ構造遺伝子の発現を起こし得るものである。このように、分析対象となる標本に感染性ヘルペスウイルスが存在する場合にしか酵素は発現されない。ここで、「感染性ヘルペスウイルス」という用語は、ウイルスの複製によって新たなウイルスが生成されるか否かに係わらず細胞に進入してウイルスの複製サイクルを開始できる単純ヘルペスウイルスを意味する。
プロモータは、ヘルペスウイルスゲノムから単離した誘導プロモータまたはトランス活性可能なプロモータであると好ましい。ここで、「誘導プロモータまたはトランス活性可能なプロモータ」という用語は、ウイルスによって生成されたトランス活性可能な物質に応答してこのプロモータに作用的に結合されたDNA配列の転写を開始するDNAの転写開始領域である。検定によって検出することが望ましいヘルペスウイルスからの誘導プロモータまたはトランス活性可能なプロモータを本発明のキメラ遺伝子と共に使用してもよい。特に、本発明におけるプロモータとしては、トランス活性能の点からヘルペスウイルスからのβ−プロモータを用いると好ましい。HSVからのプロモータの例として、UL42遺伝子、UL29遺伝子、UL39遺伝子などから得られるプロモータが挙げられる。特に有用なβ−プロモータは、単純ヘルペスウイルス1型遺伝子UL39から単離されたものである。このプロモータはICP6をコード化する(以下、ICP6プロモータまたはICP6と呼ぶ)。ICP6プロモータはHSVビリオン関連トランス活性化因子タンパクVP16によって強くトランス活性化され、通常はHSVへの感染後3〜6時間で発現できる。さらに、ICP6プロモータは非感染細胞では構成的発現を生じず、ヘルペスウイルスに感染すると自プロモータに作用的に結合されている遺伝子を発現する。このようなICP6プロモータの特徴は、有用な診断学的検定に必要な特異性を提供する上で特に有用である。一般に、本発明において有用なプロモータは、そのプロモータを得た特定のヘルペスウイルスに感染していない細胞では構成的発現を生じない。
キメラ遺伝子は、標本中のヘルペスウイルスの可視的検出用のリポーター遺伝子すなわちマーカー遺伝子として機能する酵素をコード化する構造遺伝子を有する。酵素は、細胞について容易に検定できるものあるいは細胞中で容易に検出できるものが好ましい。この目的で特に有用であることが分かっている酵素は、β−ガラクトシダーゼである。細菌性β−ガラクトシダーゼを使用すると好ましく、LacZ遺伝子によってコード化されたE.coliから得られたβ−ガラクトシダーゼが最も好ましい。β−ガラクトシダーゼが好ましいのは、十分に特徴付けられた性質を有し、様々な方法でその存在を検出することができるためである。本発明のキメラ遺伝子におけるリポーター遺伝子として有用な他の酵素として、主に加水分解酵素や酸化還元酵素などが挙げられる。特に、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ルシフェラーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼなどの酵素が有用である。また、キメラ遺伝子は、構造遺伝子に組み込まれ且つそれに固有であり得るものかあるいは異種ソースから得られる末端信号も有する。
β−ガラクトシダーゼの発現を検出する様々な方法が知られており、これらの方法の感度は相対的に良いため、β−ガラクトシダーゼをコード化する遺伝子は本発明において使用される好ましいリポーター遺伝子の1つである。これらの方法には、細胞の色の変化に基づいてβ−ガラクトシダーゼ活性の検出を可能にできる色素原基質あるいは蛍光原基質を用いる組織学的検定も含まれる。色の変化は肉眼あるいは顕微鏡によって検出することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼが存在すれば細胞を青に変える5−ブロモ−4−クロロインドリル−β−D−ガラクトピラノシドなどの色素原基質やフルオレセインジ−β−D−ガラクトピラノシド(FDG)、3−カルボキシウンベリフェリル−β−D−ガラクトピラノシデ、5−ドデカノイルアミノフルオレセイン−ジ−β−D−ガラクトピラノシデ(C12FDG)などの細胞を濃い緑に染める蛍光原基質を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を検出する方法が知られている。β−ガラクトシダーゼ活性の検出に自動比色検定法を利用してもよい。このような検定法では、細胞ライゼートのβ−ガラクトシダーゼ活性用の基質としてONPGを利用し、分光測定法によって酵素活性を検出している。自動蛍光検定法も知られている。
実施例9において後述するように、本発明の検定法における蛍光顕微鏡法によるβ−ガラクトシダーゼの検出は様々な理由で有利である。FDGは細胞に対して比較的不透過性であって、前記のPDGの細胞への運搬に関するプロトコルは、慎重な温度調節、β−ガラクトシダーゼの競合疎外剤や非競合疎外剤の使用の他、浸透圧ショックなどに係わるものである。酵素の定量的な測定にはこのような複雑さが伴う。しかしながら、本発明の方法ではHSV感染細胞を検出するために必要なのはウイルス誘導β−ガラクトシダーゼについての細胞に十分なFDGを入れて十分なFDGを切断し、十分な蛍光を放出して細胞を明るい蛍光色に変えることができるようにするだけでよい。HSV感染細胞は非感染細胞よりもFDGに対する透過性が高い。さらに、BHK細胞は内因性のβ−ガラクトシダーゼの活性や自己蛍光の邪魔になることはほとんどなく、本発明の細胞では構成的β−ガラクトシダーゼ活性は認められないため、非感染細胞では実質的にバックグラウンドの蛍光は生じない。これらのすべての要因の組み合わせによって、FDGを細胞に運搬するという単純な方法にもかかわらず、信号対雑音比を高くすることができる(すなわち、感染細胞と非感染細胞を可視的に簡単に区別できる)。
上述したような蛍光遺伝子基質を使用してのβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の検出手順では、細胞を蛍光遺伝子基質に暴露した後に膜の凍結点未満まで細胞を冷却し、フルオレセインが細胞から拡散してしまうのを防止していた。これは、蛍光顕微鏡法をさらに複雑にしていた(すなわち、この手順では顕微鏡上に冷却チャンバを設ける必要があった)が、この検出手段を本発明による方法と共に用いた場合には不要であることが分かった。感度を損なうことなくFDGへの暴露後15分以内に細胞が観察されるのであれば、細胞を周囲温度に保持することができる。
本発明の方法および細胞系において使用される特に有用な他のリポーター遺伝子として、遺伝子をコード化するホタルのルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェラーゼの発現は、ルシフェリンを酵素基質として使用して既知の発光定量法によって検出することもできる。ルシフェラーゼをリポーター遺伝子として使用すると、比色式あるいは比蛍光式のβ−ガラクトシダーゼ検定法を用いた場合よりも感度が高く、1個の感染性ウイルスを検出できる自動検定法の開発に供し得る酵素学的検定法を提供することができる。
所望のキメラ遺伝子の調製後、当業者間で既知の標準的且つ慣用の方法によってこのキメラ遺伝子をプラスミドに挿入し、さらにプラスミドごと所望の細胞系にトランスフェクトすると好ましい。Maniatis,T.,et al.,Cold Spring Harbor,N.Y.,Cold Spring Harbor Laboratory(1990)を参照のこと。選択する細胞系は、検出対象となるヘルペスウイルスによる感染に対して敏感であって、キメラ遺伝子が細胞の染色体に安定的に組み込まれるようトランスフェクトされる細胞系である。ヘルペスウイルスに対する感染に敏感な細胞系の好ましい例として、ウサギの皮膚の繊維芽細胞、ハムスター新生仔の腎細胞、アフリカミドリザル細胞などが挙げられる。試料内のHSVの検出用の好ましい細胞系として、ゲノムが安定的に組み込まれるハムスター新生仔の腎細胞、HSV−1 ICP6プロモータの後ろにE.coli LacZ遺伝子を有するキメラ遺伝子などが挙げられる。特に、BHKICP6LacZおよびそのクローンとして同定される細胞系が好ましい。標本におけるHSVの検出に用いられる他の好ましい細胞系は、ゲノムが安定的に組み込まれるハムスター新生仔の腎細胞、HSV−1 ICP6プロモータの後ろにホタルのルシフェランス遺伝子を有するキメラ遺伝子などが挙げられる。特に、BHKICP6LucA6およびそのクローンとして同定される細胞系が好ましい。
標本内の感染ヘルペスウイルスの存在を検出するために、各標本のアリコートを標準培養皿内の適当な標準培地にのせ、上述したようなキメラ遺伝子でトランスフェエクトされた細胞系に標本を接種する。液体あるいは人間や動物の体液、血液や精液、鼻咽腔擦過標本、脳脊髄液などに浸せるものであれば標本はどんな物質であってもよい。細胞系および標本を十分な時間をかけて培養し、ヘルペスウイルスの感染サイクルを進行させる。一般に、この培養には3〜12時間かかり、通常は3〜6時間程度である。感染性ヘルペスウイルスが標本内に存在すれば、プロモータを誘導し、マーカー遺伝子を発現させるのに必要なトランス活性化因子が生成される。次いでリポーター遺伝子産物の存在を検定すれば、このマーカー遺伝子を検出・定量化することができる。この方法では特定の標本が感染性ヘルペスウイルスを含有しているか否かを判断することができる。
本発明による方法および細胞系を使用し、EBウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルスなどの感染性ヘルペスウイルスを検出することもできる。特に、本発明は臨床標本における感染性HSVの検出に有用である。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例1
本実施例は、感染性単純ヘルペスウイルスの検出を可能にするように、遺伝子工学的に処理された感受性の細胞系について説明するためのものである。
C.HahnおよびC.Rice(Washington University,St.Louis,Missouri)からハムスター新生仔の腎(RBK−21)細胞を入手した。ウシ胎仔の7%血清(Gibco)によって補足したMEM培地(Gibco−BRL,Gaithesburg,M.D.)に上述した細胞を繁殖させた。Gibco−BRLから入手した試薬を使用し、Maniatis,T.,et al(1990)に記載されているリポソームトランスフェクションプロトコルによってpYSICP6LacZおよびpMAMnaoでこれらの細胞をコトランス フェクトした。プラスミドpYBICP6LacZの基本的な特徴を第1図に示す。このプラスミドは、Dr.Sandra Weller(Univ.of Conn.)から入手したpD6pからのBamH I断片(GoldsteinおよびWeller著、『J.Virol.』、62:196〜205(1988)に記載されているようなICP6−LacZ溶融カセットを含有)を単離し、その断片をベクターpUC8のBamH Iサイトにサブクローニングして調製したものである。プラスミドpMAMneoはSV40初期プロモータ・ネオマイシン耐性遺伝子カセットを含有しており、Glontec,Palo Alto,CAから市販されていた。
G418(Geneticin,Sigma,St.Louis,MO)を含有する培地にトランスフェクト細胞をのせ、G418耐性コロニーを選択した。G418に対する耐性を有するものとして複数の細胞系を同定し、β−ガラクトシダーゼ活性を試験した。このような細胞系であるBHKICP6LacZ−5では、疑似感染後のβ−ガラクトシダーゼ活性やHSV感染後の顕著な活性は検出されなかった。以後の研究用にこの細胞系を選択した。
実施例2
本実施例は、標本内の感染性単純ヘルペスウイルスを検出するための細胞系の能力を示すためのものである。
実施例1で説明した細胞系BHKICP6LacZから細胞を得、標準的な組織培地において様々な感染多重度(m.o.i.)でHSV−1に感染させた。細胞およびウイルスを12時間培地内に放置した後、組織学的染色法によってβ−ガラクトシダーゼについて細胞を検定した。この細胞をpH7.2のリン酸緩衝生理食塩水中(PBS)で3回洗浄し、PBSの2%ホルムアルデヒドおよび0.4%グルタアルデヒド溶液に4℃で5分間固定した。この細胞をPBSで2回洗浄し、組織学的染色液中で室温にて2時間保温した。この溶液は、X−GAL(5−ブロモ−4−クロロ−3 インドリル−β−D−ガラクトプラノシド)1mg/mlと、フェリシアニドカリウム4mMと、フェロシアニドカリウム4mMと、MgCL2 2mMとをPBSに含む。染色液については、使用前に各試薬の濃縮原料溶液を足して新しくした。X−GAL原料溶液はN,N−ジメチルホルムアルデヒド40mg/mlである。細胞をPBSで洗浄して反応を停止させた。この細胞について直接分析と顕微鏡による分析とを行い、室温でPBS内に保管した。
m.o.i.の大きい時には青色の染色状態は肉眼でもはっきりと認められたが、m.o.i.が小さくなるにつれて直接検査しただけでは青色に染まっているようには見えない細胞を顕微鏡で観察した。この結果、多数の非染色細胞の中に青色の細胞が認められた。感染細胞を顕微鏡で観察して分析することにより、青色に染まった細胞が認められた。対象例の細胞は感染しておらず、疑似感染でも細胞が青く染まったものは認められなかった。
実施例3
本実施例は、本発明による細胞系および検定によってどの程度標本内の感染性単純ヘルペスウイルスの数を定量化できるかについて説明するためのものである。
単純ヘルペスウイルスは、感染性ウイルスの力価を1ミリリットル(ml)あたりのプラーク形成単位(pfu)として求めることで慣例的に定量化される。単純ヘルペスウィルスを含有することが分かっているが、その量については未知である溶液について標準的な定量プラーク検定を行った。培地4.5mlを充填したチューブにこの溶液のアリコート(0.5ml)を注入し、10倍溶液にした。得られた希釈試料を同じように10倍に希釈し、この繰り返しにより最終的にはチューブ中に10,000,000倍の希釈液を得た。このようにして、最初の溶液の10−1〜10−7のウィルス濃度の溶液の満たされたチューブを得た。10cm2のウェルに入れたBHK細胞の単層に、最も薄い方から3段階目まで(10−5、10−6、10−7)の希釈液のアリコート(0.5ml)を添加した。これと同じものをもう1つ用意した。1時間放置して細胞にウィルスを吸収させた後、培地をウェルから吸引し、単純ヘルペスウィルスに対する中和抗体(単層の集中領域へのウィルスの拡散を抑制する)を含有する培地と交換した。48〜72時間後、単層に死細胞(プラーク)からなる円形の領域が認められた。各ウェルにおける死細胞の数を計数した。プラークの多すぎる(>100)ウェルやプラークの少なすぎる(<10)ウェルについては計数は行わなかった。ある検定では、10−7倍希釈液を使用した一組のウェルの一方に21個のプラークが観察され、もう一方に17個のプラークが観察された。次に、以下の数式に基づいて開始溶液の力価を求めた。
したがって、上述した実施例の場合ではプラークの平均#=17+21/2=19になる。希釈度は10−7、添加量は0.5mlであった。
したがって、力価は以下のようになる。
16時間後に細胞を固定してβ−ガラクトシダーゼ活性について組織学的に染色した(16時間という時間は単純ヘルペスウィルスの成長サイクルよりも短いため、短すぎてプラークは形成されない)以外は上述した方法と全く同じ方法でBKHICP6LacZ−5細胞上に上述したものと全く同じ希釈液を接種した。反転光顕微鏡を使用して各ウェルにおける青色細胞数を計数した。10−7倍希釈液から誘導した複製ウェルでは、20〜23個の青色細胞が認められた。青色細胞を青色形成単位(bfu)と呼び、上述したものと同じ式を使用して1mlあたりのbfu数を求めた。
以上の説明をまとめると、ウィルス含有溶液を希釈し、同一の希釈液について単純ヘルペスウィルス感染を定量化するための標準的な検定とBKHICP6LacZ−5を使用した組織学的検定の両方を行い、1mlあたりのプラーク形成単位(pfu)の計算値を1mlあたりのbfuに近似した。力価(3.8×10 8bfu/mlおよび4.3×10 8bfu/ml)は、定量プラーク検定の様々な固有のウィルス学的な観点から見れば基本的には等価である。したがって、1個の感染性ウィルスを示す基準としてpfuを使用する場合には、1個の感染性ウィルスを示す基準としてbfuを使用することもできる。
実施例4
本実施例は、本発明による検定では標本中のHSV−1を迅速に検出できるということを説明するためのものである。
実施例2において説明したm.o.i10およびm.o.i0.1で実施例1において説明したようなBHKICP6LacZ細胞をHSV−1に感染させた。細胞の感染後さまざまな時点で細胞を除去し、比色検定法によってβ−ガラクトシダーゼ活性についてlyseして検定した。この時、Maniatis,et al.、Cold Spring Harbor,N.Y.,Cold Spring Harbor Laboratory(1990)に記載されているような標準的な比色β−ガラクトシダーゼ検定における基質としてO−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(ONPG,Sigma,St.Louis,MO)を使用して全細胞ライゼートについて比色検定を実施した。次に、Bradford法に準拠した市販のキット(Bio−Rad,Richmond,CA)を使用して、ライゼートのタンパク測定を実施した。感染後約4時間の時点で酵素活性が検出された。この酵素活性は高m.o.i.で感染させた細胞について感染6時間後にピークに達した。図2はβ−ガラクトシダーゼ活性の検出値と検定時間との関係を示すグラフである。
比較として、同じ感染方法で感染させた細胞を実施例2において説明したような組織学的染色法で検定した。感染約3時間後にいくつかの青色細胞が認められ、高m.o.i.で感染させた細胞については6時間後に殆どの細胞が青色に染まった。低mm.o.i.で感染させた細胞は、感染約6時間後まで殆ど青色染色細胞を発生させなかった。
実施例5
本実施例は、本発明の細胞系および方法の特異性を使用すれば標本中のHSVの存在のみを検出できるということを説明するためのものである。
HSV以外のウィルスを含有するとされている標本をBHKICP6LacZ−5細胞の単層に接種し、β−ガラクトシダーゼ活性について組織学的に検定した。BHKICP6LacZ−5に4種類のウィルスを感染させ、β−ガラクトシダーゼ発現細胞を得た。
St.Louis Children′s HospitalのDiagnostic Virology laboratoryから3種類のウィルス標本を入手した。ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、水痘帯状ヘルペスウィルス(VZV)およびアデノウイルス5型を含有する標本も別途入手した。各標本には、4+細胞変性作用(試料のウィルス量の半定量的な目安であり、1+は最低量、4+は最高量になる)によって誘導した量のウィルスを含有させた。さらに、力価が10 7pfu/mlのSindbisウィルス(Togaウィルス)の実験室菌株を実験室において増殖させた。これら3種類のウィルスの各々の0.5mlアリコートをBHKICP6LacZ−5細胞2.0×10 6の単層に別々に接種した。(細胞系に接種した時の各ウィルスの量は通常この種のウィルスを増殖する際に使用される量であり、各ウィルスについて4+細胞変性作用特性を呈した)。これらのウィルスへの感染後24時間でBHKICP6LacZ細胞を固定し、β−ガラクトシダーゼ活性について組織学的に染色した。上述した4種類のウィルスのどれにも感染していないBHKICP6LacZ−5は、β−ガラクトシダーゼ活性について何らはっきりとした組織学的な兆候を示さなかった。すなわち、顕微鏡で見ても青色細胞は全く認められなかった。BHKICP6LacZをHSV2型に感染させると、HSV1型に感染させた場合と区別できないようなβ−ガラクトシダーゼ活性が認められた。したがって、この方法はHSV−1およびHSV−2(総括的にはHSV)に対して特異的である。
実施例6
本実施例は、HSVの存在について臨床標本を分析するための本発明による細胞系の使用および検定について説明するためのものである。
ウィルス診断学研究室において、時事的に有望な研究が行われた。1991年9月9日から1991年11月28日までの間、HSV検出用に実験室で入手した全標本について、標準的な細胞変性作用(CPE)検定と本発明による方法の両方を行った。全部で96の標本を94例の患者から得た。体の複数の部位(頸部擦過標本、皮膚、口内病変部、気管支肺胞洗浄標本など)から標本を得た。これらの標本はいずれも標準的な生理学的輸送媒質から得たものである。
標準的なCPE検定について、HSVの増殖に一般に用いられている市販の組織培養細胞系(ウサギの皮膚繊維芽)の単層を充填したローラチューブに各標本のアリコート0.2mlを接種した。37℃でローラ装置に1時間保持した後、新鮮な組織培地(最小必須培地+5%ウシ血清)を添加し、細胞をローラ装置と37℃の恒温器に戻した。翌日から7日目まで12時間毎に診断ウイルス学に熟達した者が反転光顕微鏡を通して細胞を顕微鏡観察し、HSVのCPE特性が認められるかどうかを確認した。この分析の結果は実験室での通常の診断機能であった。これらの結果を試験の依頼主である医師に報告した。
CPE検定と同時に、本発明による方法を使用して別の検定を並行して実施した。各標本のアリコート0.2mlをBHKICP6LacZ−5細胞に接種し、上述したものと全く同一のローラー チューブ上で市販の細胞について培養した。接種後(実験室から標本を入手した日や技術者の手に空き具合によって16〜24時間)から上述した方法と全く同じ方法で細胞を処理した。さらに、細胞を固定してβ−ガラクトシダーゼ活性について組織学的に染色した。次にこの細胞を光顕微鏡下で観察して青色細胞の数を確認した。結果を以下の表Iに示す。
表I
標本数 CPE β−ガラクトシダーゼ染色
31 + +
62 − −
0 + −
3 − +
表Iのデータからも分かるように、CPE検定によってHSVを含有していることが確認された31例の標本はいずれもβ−ガラクトシダーゼ染色検定陽性であり、偽陰性はなかった。β−ガラクトシダーゼ染色は「盲検的」すなわちCPE結果についての先入観なしに行った。事実、31例のCPE陽性標本のうち15例は早くて2日、遅いものではこれ以後まで陽性にはならなかった。したがって、組織学的染色を行った時点では、これらの15例のCPE陽性標本はまだ陰性であったことになる。表Iおよび3からも分かるように、技術者がβ−ガラクトシダーゼ染色陽性であるとした標本はCPEでは陰性であった。このうち2例は同一の患者の口腔内から採取したものであった。組織学的に染色した細胞について研究した結果、青色細胞は繊維芽細胞ではなかった(BHKICP6LacZ−5の場合も同様)が、明らかに上皮細胞であった。これらの細胞は患者の口内から採取したものが多く、β−ガラクトシダーゼを発現する細菌によってコロニー化されやすかった。この考えに沿ってこれらの標本について検定を繰り返した。ここで、HSV前のゼロの時点で青色に染まった脂肪は、β−ガラクトシダーゼ活性を誘導するだけの時間はあった。CPE陰性でβ−ガラクトシダーゼ陽性である第3の標本には青色細胞は1つだけであったが、その他の31例の陽性標本には多くの青色細胞が含まれていた。この偽陰性結果については説明はせずにおく。この標本からは(MSV他)どんなウイルスも培養しなかった。本発明による方法でHSVに対する特異性を実験室で観察して確認したところ、最後にはCPE陰性でβ−ガラクトシダーゼ陰性の標本のうちの2例で水痘帯状ヘルペスウイルス(VZV)が増殖していた。
まとめると、本発明による方法は、臨床標本上のHSVを検出するために実験室で用いられている標準的な方法と比較して、有意な(100%)感受性(31/31)を呈した。また、標準的な方法を用いた場合には24時間ではに31例のCPE陽性標本のうちの16例しか検出できず、残りの15例については48〜72時間たってはじめて陽性であると判定できたにすぎないが、本発明による方法では31例の陽性標本すべてを24時間以内に検出できた。この点で本発明は標準的な方法よりも迅速である。
実施例7
本実施例は、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子をリポーター遺伝子として使用してHSVを検出できるということを示すためのものである。ルシフェラーゼを使用するという理論的根拠は、細胞ライゼート上のルシフェラーゼを酵素的に測定した方がβガラクトシダーゼを使用する場合よりも感受性が高いということにある。
実施例1において説明した方法を使用してBHK細胞から細胞系を誘導した。G418を使用して、BHK細胞をpMAMneoおよびpYLICP6ffLucA(ICP6−ホタルルシフェラーゼキメラ遺伝子;第3図にマップを示す)で安定的に形質転換した。pYLICP6fLucAの調製は、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するpTS/T7Luc(Clontec,Palo Alto,CA)から得られた断片1.9kbをpDCICP6−1BのBamH I部位に挿入して行った。このpDCICP6−1BはICP6プロモータの3′末端にBamH I部位を有するものである。ICP6:ルシフェラーゼキメラ遺伝子は溶融タンパクとして発現することはない。このような安定した形質転換細胞系をBHKICP6LucA6と名付けた。
24個のウェル組織培養皿(1ウェルあたりの細胞数2.5〜5.0×10 5個)でBHKICP6LucA6細胞を単層として増殖させた。次に、この細胞を1ウェルあたりHSVを10 3pfuで感染させた。感染後さまざまな時点で細胞をlyseしてルシフェラーゼ活性について検定した。この時の手順は以下の通りである。媒質(MEM+10%ウシ胎仔血清)を吸引採取し、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水1mlで細胞を2回洗浄した。次に溶菌緩衝液(50mM Tris−MES,pH7.8,1mM DTT,1%Triton X−100)を添加した。この培養皿を周囲温度で10分間回転シェーカーに保持した。各細胞ライゼート0.05mlを以下のようなプロトコルでルシフェラーゼ活性について検定した。ルシフェラーゼ反応緩衝液0.150ml(最終反応濃度;50mM Tris−MES,pH7.8,10mM酢酸マグネシウム,2mM ATP)を12×75mmの使い捨てガラス チューブに入れたものに対して、細胞ライゼート0.05mlを静かに添加して混合した。1mMのルシフェリンを0.1mlずつ自動的に注入する発光測定器にこのチューブを配置し、次いでフォトンの放出を10秒間かけて測定した。その数をルシフェラーゼ活性量の測定値としての相対光単位(RLU)として記録した。一般に、無緩衝ルシフェラーゼ0.05mlすなわちBHK細胞ライゼート0.05mlでは、この検定での値は150〜200RLUになる。非感染BHKICP6LucA6細胞ライゼートでは、1細胞あたり4〜8×10 −4RLUすなわち2.5×10 5の細胞0.05mlについて300〜400RLUになる。第4図に、上述したような方法で感染させたBHKICP6LucA6細胞の感染後のルシフェラーゼ活性を時間の関数として示す。同図からも明らかなように、感染後4時間までで非感染細胞バックグラウンドの場合よりもルシフェラーゼ活性は大幅に高くなり、感染後24時間までにはルシフェラーゼ活性は非感染細胞バックグラウンドの場合の5000倍になった。第4図に示すデータは、検定における10 3個の非感染細胞と2.5×10 5個の全細胞について示したものである。RLU/感染細胞対RLU/非感染細胞の比を計算したところ、少なくとも500,000であった。
実施例8
本実施例は、BHKICP6LucA6細胞系および実施例7の方法で細胞ライゼートについての酵素ルシフェラーゼ検定における1個の感染性HSVを検出できるということについて説明するためのものである。
24個のウェル培養皿でBHKICP6LucA6細胞を培養した。この細胞に希釈HSV溶液を接種した。(実施例3で説明した方法で求められた予め定められた力価に基づいて)ウイルス濃度を5pfu/ml、2.5pfu/ml、0.5pfu/ml、0.025pfu/mlに変えて4種類の希釈液を調製した。これらの希釈HSV溶液の各々0.2mlを9個のウェルに別々に接種し、残りの6個のウェルは未感染のままとした(すなわち全部で42ウェル)。したがって、6個のウェルにはウイルスは存在しない。9個のウェルで1pfu、9個のウェルで0.5pfu、9個のウェルで0.1pfu、9個のウェルで0.05pfu。HSVのpfuは離散的なものであるが、これらの数は実際に感染/未感染にかかわらず各ウェルについて何らかの確率を表すものである。この確率は標準的なポアソン式を使用して算出することができる。この細胞を実施例7で説明したような方法でルシフェラーゼについて検定した。これと並行して、全く同じ希釈液をBHK細胞に接種し、7日間CPEについて毎日顕微鏡観察した。
第5図に、ウイルス添加量の測定値として平均ルシフェラーゼ活性を示す。ウイルスの数が増えるにつれて活性も高くなる傾向にはあるが、統計的に有意なものではない。しかしながら、個々のデータ点を分析する(第6図)と個々のpfuを検出できるということは明白である。予想数は、ポアソン確率に基づくPPUを受けるべきウェルの数に等しい。CPE数は、BHR細胞上にCPEが認められたウェルの数に等しい。観察された数は、1個の感染細胞に存在すると思われる量毎に測定したルシフェラーゼ活性が非感染細胞の場合よりも高かったウェルの数に等しい。(これは、3例のウェルを100pfuに感染させ、これらの細胞から得られたRLU測定値を平均して100で割ったものである)。感染ウェルのPoisson予測数と本願発明者らのウイルス力価の正確であるCPE陽性ウェル数とは明らかに相関している。これらの数と非感染細胞バックグラウンドよりもルシフェラーゼ活性が高いウェル数とが相関していることから、本方法を使用して1個の感染細胞を検出でき、よって1個の感染性単純ヘルペスウイルスを検出できるということが分かる。
実施例9
本実施例は、本発明のBHKICp6LcaZ−5細胞系および方法を使用して蛍光顕微鏡でHSV感染細胞(したがって、標本中の感染性HSV)を検出できるということを示すためのものである。この検定の利点は、極めて短時間(4時間)かつ極めて簡単に実施でき、細胞を生きたまま維持できるため、同一の細胞を時間をかけて繰り返し分析できるということである。
約2×10 5のBHKICp6LcaZ−5細胞の単層を市販の組織培養チャンバ/顕微鏡スライド装置上で標準的な培地(MEM+10%ウシ胎仔血清)にて増殖させた。個々のチャンバ内の細胞を倍他0.2ml中のHSV100〜1000pfuに感染させ、あるいは滅菌培地0.2mlに疑似感染させ、37℃の恒温器に保持した。細胞の感染後1時間毎に以下のような処理を実施した。この培地を検定し、PDG(蛍光ジ−β−ガラクトピラノシド,Molecular Probes,Eugene,OR;cat.no.F−1179)4mMを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に交換した。PDGは蛍光原βガラクトシダーゼ基質である。37℃で1分間おいた後、PBS/PDGを検定し、周囲温度で新鮮な培地を添加した。次に、この細胞を反転顕微鏡下において適当なフルオレセイン緑蛍光用のフィルターを使用して螢光光源(Zein Axiovert 35)で速やかに観察した。
疑似感染(すなわち非感染)細胞では可視蛍光は認められなかった。感染細胞では感染1時間後および2時間後には蛍光は認められなかった。しかしながら、感染3時間後には、個々の細胞は低レベルの蛍光を呈した。この値は感染4時間後には増加し、はっきりとした蛍光が認められた。蛍光陽性細胞数は、感染に使用さえたpfu数に相関していた。蛍光は30分でかすかに認められる程度まで弱まった。この細胞を再び37℃の恒温器に戻し、感染6時間後、12時間後、16時間後の時点で全く同一の方法で再度検定した。4〜16時間の間では各時点で全く同一数の蛍光陽性細胞が認められた。
Claims (36)
- 標本中の感染性ヘルペスウイルスを検出するための検出方法であって、
ヘルペスウィルス科の構成種から得られるプロモータであって、UL39遺伝子と相同な配列を有し、且つ前記ヘルペスウィルス科の構成種のヘルペスウィルストランス活性化因子による誘導可能性、前記ヘルペスウィルス科の構成種のトランス活性化因子に対する特異性、ヘルペスウィルスの存在に依存し且つ定量的に比例して発現するリポーター遺伝子に作用的に結合された状態での非構成的発現性という特性を有する前記プロモータを含有するDNA配列で安定的に形質転換させた遺伝子工学処理細胞系を提供するステップと;
細胞系にヘルペスウイルスを含有する疑いのある標本を接種するステップと;
ヘルペスウイルスの感染サイクルを一定時間進行させるステップと;
ヘルペスウイルス感染細胞数を検出且つ定量化し、前記標本中の感染性ヘルペスウイルスビリオン数を求めるステップと;
からなる検出方法。 - 前記ヘルペスウイルス科の構成種は、単純ヘルペスウイルス1型および2型である請求項1記載の方法。
- 前記プロモータは、単純ヘルペスウイルス1型のUL39遺伝子から単離されたものである請求項2記載の方法。
- 前記細胞系に安定的に形質転換されたDNA配列は、前記プロモータに対してすぐ3′に位置するE.coli LacZ遺伝子を含む請求項2記載の方法。
- 前記リポーター遺伝子は、比色光学検定、蛍光光学検定あるいは発光光学検定によって検出可能な酵素をコード化する請求項2記載の方法。
- 前記リポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼあるいはルシフェラーゼをコード化する請求項2記載の方法。
- 前記検出ステップは、組織学的方法/光学顕微鏡によってβ−ガラクトシダーゼを検出することを含む請求項6記載の方法。
- 前記検出ステップは、蛍光原基質を使用してβ−ガラクトシダーゼを検出することを含む請求項6記載の方法。
- 前記蛍光原誘導体を蛍光顕微鏡で検出する請求項8記載の方法。
- 前記蛍光の量を定量的な蛍光光度計で測定する請求項8記載の方法。
- 前記細胞系に安定的に形質転換されたDNA配列は、前記プロモータに対してすぐ3′に位置するルシフェラーゼを含む請求項2記載の方法。
- 前記検出ステップは、発光光度計によってルシフェラーゼの存在を検出することを含む請求項11記載の方法。
- ヘルペスウィルス科の構成種から得られるプロモータであって、UL39遺伝子と相同な配列を有し、且つ前記ヘルペス ウィルス科の構成種のヘルペスウィルストランス活性化因子による誘導可能性、前記ヘルペスウィルス科の構成種のトランス活性化因子に対する特異性、ヘルペスウィルスの存在に依存し且つ定量的に比例して発現するリポーター遺伝子に作用的に結合された状態での非構成的発現性という特性を有する前記プロモータを含有するDNA配列で安定的に形質転換させた遺伝子工学処理細胞系。
- 前記プロモータは単純ヘルペスウイルス1型のUL39遺伝子から単離されたものである請求項13記載の細胞系。
- 前記細胞系に安定的に形質転換された前記DNA配列は、前記プロモータに対してすぐ3′に位置するE.coli lacZ遺伝子を含む請求項13記載の細胞系。
- 前記リポーター遺伝子は、比色光学検定、蛍光光学検定あるいは発光光学検定によって検出可能な酵素をコード化する請求項13記載の細胞系。
- 前記細胞系に安定的に形質転換された前記DNA配列は、前記プロモータに対してすぐ3′に位置するルシフェラーゼを含む請求項13記載の細胞系。
- 前記リポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼをコード化する請求項16記載の細胞系。
- 前記細胞系は、感染しやすい哺乳類細胞系から得られたものである請求項13記載の細胞系。
- 前記細胞系は、ハムスター新生仔の腎臓から得られたものである請求項19記載の細胞系。
- BHKICP6LacZ細胞として同定された請求項15記載の細胞系。
- BHKICP6LucA細胞として同定された請求項17記載の細胞系。
- 標本中の感染性ヘルペスウイルスの存在を検定するためのキットであって、
ヘルペスウィルス科の構成種から得られるプロモータであって、UL39遺伝子と相同な配列を有し、且つ前記ヘルペスウィルス科の構成種のヘルペスウィルストランス活性化因子による誘導可能性、前記ヘルペスウィルス科の構成種のトランス活性化因子に対する特異性、ヘルペスウィルスの存在に依存し且つ定量的に比例して発現するリポーター遺伝子に作用的に結合された状態での非構成的発現性という特性を有する前記プロモータを含有する安定的に形質転換させたDNA配列を有する、ヘルペスウイルスに感染しやすい哺乳類の遺伝子工学処理細胞のサプライと;
前記リポーター遺伝子の発現を検出する試薬のサプライと;
を有するキット。 - 前記プロモータは、単純ヘルペスウイルス1型のUL39遺伝子から単離されたものである請求項23記載のキット。
- 前記細胞系に安定的に形質転換されたDNA配列は、前記プロモータに対してすぐ3′に位置するE.coli LacZ遺伝子を含む請求項23記載のキット。
- 前記細胞系に安定的に形質転換されたDNA配列は、前記プロモータに対してすぐ3′に位置するルシフェラーゼを含む請求項23記載のキット。
- 前記リポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼである請求項23記載のキット。
- 前記試薬は、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド溶液を含む請求項27記載のキット。
- 前記試薬は、o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシドを含む請求項27記載のキット。
- 前記試薬は、フルオレセイン−ジ−β−D−ガラクトピラノシドを含む請求項27記載のキット。
- 前記リポーター遺伝子はルシフェラーゼである請求項23記載のキット。
- 前記試薬はルシフェリンである請求項31記載のキット。
- 遺伝子工学処理細胞系はBHKICP6LacZである請求項1記載の方法。
- 遺伝子工学処理細胞系はBHKICP6LucAである請求項1記載の方法。
- 哺乳類の遺伝子工学処理細胞はBHKICP6LacZである請求項23記載のキット。
- 哺乳類の遺伝子工学処理細胞はBHKICP6LucAである請求項23記載のキット。
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