KR20090039733A - 톨-유사 수용체를 사용한 세포 파이로젠 테스트 - Google Patents

톨-유사 수용체를 사용한 세포 파이로젠 테스트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내독소 및 다른 파이로젠에 근거한, 병원균 및 병원균 스펙트럼의 정성적 및 정량적 분석과 확인을 위한 방법, 시약 및 키트에 관련된다.
파이로젠, 톨-유사 수용체

Description

톨-유사 수용체를 사용한 세포 파이로젠 테스트{CELLULAR PYROGENIC TEST USING TOLL-LIKE RECEPTOR}
본 발명은 내독소 및 다른 파이로젠에 근거한, 병원균 및 병원균 스펙트럼의 정성적 및 정량적 분석과 확인을 위한 방법, 시약 및 키트에 관련된다.
신속하고 신뢰성 있는 병원균 스펙트럼의 확인은, 예를 들어 패혈증 환자에서 표적 감염 치료를 위하여 병원에서의 임상 진단에 매우 중요하다.
패혈증과 패혈증에 관련된 다기관 기능부전(multiorgan failure)은 세계적으로 가장 중요한 사망 요인이고 미해결된 의학 문제의 하나이다. 줄잡아 약 500,000 명의 환자가 매년 "혈액 중독(blood poisoning)"의 결과로 사망하는데, 이는 매일 1400 명에 이른다. 중증 패혈증 환자의 치료로 인한 보건 예산에 대한 부담은 매년 미국에서 1700만 달러에 이른다. 생명을 위협하는 질병 증상과 병리생리적 변화의 총합을 패혈증(sepsis; septicemia, blood poisoning)으로 지칭한다. 이는 감염 병소로부터 혈류를 따라 침투하는 병원성 미생물과 그 산물에 의해 야기된다. 결과적으로 개시되는 면역 반응은 내인성 매개물질(사이토카인; cytokines)의 형성을 유도한다. 이것은 염증 캐스케이드(cascade)를 활성화시키고, 그 결과로 더 이상 제어될 수 없는 전신적 염증 반응이 야기된다. 강력한 치료 수단에도 불구하고, 예후 는 좋지 않고 사망률이 약 50%이다. 예후는 늦은 치료 개시, 경계가 불분명한 감염 병소 또는 미확인 병원균의 경우에 특히 나쁘다.
패혈증을 일으키는 병원균은 보통 박테리아, 주로 이. 콜리(E. coli)와 같은 그람-음성 박테리아, 다른 장내 박테리아, 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 엔테로박터 종(Enterobacter species), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 나이제리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 및 박테로이데스(Bacteroides) 뿐 아니라, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 뉴모니아에(Staphylococcus pneumoniae) 및 다른 스타필로코쿠스와 같은 통상의 그람-양성 박테리아; 희귀 진균, 바이러스 또는 기생충(세균혈증, 진균혈증, 바이러스혈증, 기생충혈증)이다. 인터류킨, 종양 괴사 인자, 히스타민, 세로토닌, 산소 라디칼 및 프로테아제와 같은 내인성 매개물질의 분비는 소위 미생물 구조체(예를 들어 내독소, 외독소, 수퍼항원)의 유리에 의하여 자극된다. 백혈구 및 체액성 방어 시스템의 활성화에 의해, 이들은 패혈성 쇼크의 전형적인 변화를 유도한다. 순환하는 미생물 항원에 대한 반응으로서의 전신적 염증은 패혈증과 패혈성 쇼크의 병리의 중요한 특징이다. 지질다당류(LPS; lipopolysaccharide), 박테리아 세포벽의 성분, 펩티도글리칸(peptidoglycans) 또는 리포테이콘산(LTA; lipoteichonic acid)과 비특이적 면역 방어 세포의 접촉시, 천연 면역이 활성화되고 초기 단계의 감염 사이토카인이 다른 면역 세포에 의해 분비된다. 비록 이들 사이토카인도 방어 반응에서 중요한 역할을 하지만, 예를 들어 활성화된 호중구가 염증 부위로 유인되고, 사이토카인과 박테리 아 물질의 혈류 중 유입은 좋지 않은 병리적 요인의 연쇄를 유도한다. 이러한 염증 반응에 수반되는 복잡한 임상 증상을 전신적 염증 반응 시스템(SIRS; systemic inflammatory response system)으로 호칭한다.
패혈증의 존재 또는 이러한 질병이 의심되는 경우, 치료는 적시에 이루어져야 한다. 따라서, 신속하고 신뢰성 있게 패혈증 환자의 병원균 스펙트럼을 확인할 기회는 많지 않다. 통상적인 패혈증 진단은 보통 다음 임상적 샘플의 반복적인 채취로 이루어진다: 항생체 치료의 개시 전 저항성 측정과 함께 병원균 확인을 위한 혈액과 소변 배양, 가래, 변, 상처 분비물. 이전 방법으로 패혈증에서 병원균을 검출할 확률은 30 내지 50%이다. 이것은 미생물학적 검사를 위한 몇 가지 배양, 정맥혈 샘플 또는 소변으로부터 균 배양 실험을 세팅하는 것에 의해서만 이루어질 수 있다. 샘플을 접종하여 액체 영양 배지에서 배양한다. 이 방법은 귀중한 시간을 필요로 하고 종종 병원균을 확인할 수 없게 되는데, 이는 생체 병원균에서만 가능하기 때문이다. 샘플이 항생제 치료 중에 채취된다면, 배양 실험은 보통 성공적이지 않다. 결과적으로, 널리 예상되는 항생제, 항진균제, 항바이러스제 및/또는 항기생충제 치료가 여전히 사용된다. 세포벽 성분과 같은 병원균의 발열성 물질은 이 방법으로 검출될 수 없다.
결론적으로, 패혈증 병원균 또는 병원균 스펙트럼의 검출 및 분류를 허용하는 신속하고도 간단한 시험 시스템이 요구된다.
파이로젠(pyrogen)은 열-생산 물질로, 식균작용을 할 수 있는 내인성 세포(면역 세포)를 유도하여 염증촉진 인터류킨(주로 IL-1 및 IL-6)과 종양 괴사 인자- α(TNF-α)를 합성하며, 이어서 "본래의 파이로젠"으로서 신체의 온도 중추에 영향을 줌으로써 열 생산을 증가시키고 감소된 열 방출이 일어나도록 하는 소위 발열성 물질이다. 가장 강력한 활성 파이로젠은 그람-음성 박테리아로부터 유래된다. 파이로젠은 균일한 물질 그룹이 아니다. 이들은 기생충뿐만 아니라 미생물(비병원성 및 병원성 박테리아, 진균 및 바이러스)의 대사 산물과 세포벽 성분, 예를 들어 내독소, 외독소 또는 수퍼항원을 포함한다.
파이로젠은 주로 안정제 용액과 같은 파이로젠-함유 액체의 주사 또는 주입 중, 박테리아 오염된 저장 혈액, 비파이로젠-프리(nonpyrogen-free) 주사 시린지, 주입 장치 등의 사용 중에 임상적으로 중요하다. 비발열성(apyrogenicity)의 결여는 소위 "수혈 사고"의 주요 원인으로, 고열, 쇼크, 소모성 응고병증(consumption coagulopathy) 및 급성 신부전이 수반된다. 특히 오늘날에는, 이를 통해 파이로젠이 신체에 도달할 수 있는 추가적 위험 요인으로 중추 정맥 카테터, 장기간의 튜브-섭식 및 장기간의 인공호흡이 포함된다.
파이로젠은 보통 내열성이고 투석 가능한 물질로, 예를 들어 지질다당류-단백질-지질 복합체, LPS이다. 따라서, 인간 또는 동물 신체에 사용하기 위한 주입 용액, 기구 및 장치에 대한 보통의 멸균 방법은 이들 파이로젠 물질을 제거하기에 충분하지 않다. 추가적인 세정 단계가 필수적이다. 비발열성은 신체에 이러한 산물을 사용하기 위한 필수적인 조건이다. 인간 또는 동물 신체에 밀착하는 모든 산물은, 이들이 혈류로 투여되기 때문이거나, 또는 신체에서 장시간 동안 소비되기 때문에 충분히 비발열성이어야 한다.
존재하는 파이로젠 물질의 스펙트럼은 병원균 또는 병원균 스펙트럼에 의존한다. 병원균은 병원균-전형적이거나 병원균-특이적 파이로젠 패턴, 소위 병원균-관련 미생물 패턴(pathogen-associated pyrogen patterns) 또는 PAMPs를 형성한다. 어떤 병원균 또는 병원균 스펙트럼의 분류는 PAMPs의 확인 및 분류에 의해 일어날 수 있다.
샘플에서 파이로젠 또는 PAMPs를 검출하기 위해서는(파이로젠 시험) 주로 3 가지의 상용되는 검출 방법 또는 시험이 현재 사용 가능하다. 한 가지 알려진 시험은 토끼 파이로젠 시험이다. 이것은 파이로젠에 대한 동물의 "열 반응"에 기초한다. 이는 토끼의 귀 정맥으로 시험 물질을 투여하는 동물 실험이다. 물질에 대한 동물 신체의 방어 반응을 검출하기 위해, 수 시간 후에 직장 열을 측정한다. 이 시험은 시간이 소모되고 비용이 많이 들며, 의도된 동물의 고통과 관련된다. 내독소 및 비-내독소 파이로젠은 검출될 수 있지만 확인되지는 않는다. 바이러스에 대한 시험은 가능하지 않다. PAMPs의 상세는 가능하지 않다. 인간에 대한 이동성 역시 논쟁중이다.
다른 알려진 시험은 리물루스 아메보사이트 라이제이트 시험(LAL; Limulus amebocyte lysate test)이다(예를 들어, Cambrex Bioscience 또는 Charles River Co.). 이것은 파이로젠으로 알려진 어떤 물질에 대한 절지동물의 방어 반응에 기초한다. LAL에서는 리물루스 폴리페무스(Limulus polyphemus)의 혈액 세포로부터 효소전구체가 회수되어 그람-음성 박테리아 내독소를 통해 활성 효소로 전환된다. 내독소의 양은, 예를 들어 효소 기질 전환에 의한 광도계의 사용에 의해 정량적으로 측정될 수 있다. 이 방법은 알려진 토끼 시험보다 민감하고 더 표준화 가능하지만, 그람-음성 유기물의 내독소만 측정된다(예를 들어, 지질다당류 LPS; 검출 한계: 3 pg/mL). 이러한 내독소는 알려진 파이로젠 물질의 작은 분율만을 나타낸다. 다른 파이로젠은 인식되지 않는다. 그러나, 최근 그람-양성 병원균이 그람-음성 박테리아에 비해 중요성이 증가하고 있다.
마지막으로 알려진 다른 시험은 면역 파이로젠 시험, 예를 들어 엔도세이프 IPT(Endosafe IPT, Charles River Co.)이다. 이것은 존재하는 파이로젠에 대한 인간 세포의 열 반응에 기초한다. 이는 생체 혈액 세포로부터의 파이로젠 물질에 대한 반응으로서 사이토카인 IL-1이 분비되는 인간 전혈 시험으로, ELISA에 의해 정량적으로 측정될 수 있다(검출 한도: 20-50 pg/mL). 이 시스템은 또한 그람-양성 병원균의 파이로젠도 측정한다. 그러나, 이 시험은 여전히 많은 시간과 작업 요구도가 관련된다. 인간 전혈을 준비하는데, 이는 잠재적으로 병원성이다. PAMPs의 상세는 가능하지 않다.
알려진 시험들은 시간 소모적이고 잘 구비된 실험실을 필요로 한다(ELISA 시험, 인간 혈액 처리, 동물 실험). 결과적으로 파이로젠의 검출을 위하여 간단히 실시될 수 있는 신속한 시험 시스템에 대한 요구가 있다. 또한, 병원균 또는 병원균 스펙트럼과 관련된 결론을 이끌어낼 수 있도록 하기 위해, 파이로젠 패턴 PAMP의 상세를 위한 시험 시스템에 대한 요구도 있다. 이것은 파이로젠의 존재가 중요한 역할을 하는 감염성 질환, 특히 패혈증의 진단 및 치료에 유리하다.
임플란트나 기구(카테터 등)와 같은 의학적 장비, 공여 조직, 주사 가능한 약물 및 의학적 제품에서의 파이로젠 잔류물에 대한 개선된 시험을 위한 요구가 있다. 또한, 식품, 식품 첨가물, 식품이나 약물의 원료 및 출발물질에서 파이로젠 물질 및 균의 개선된 검출 및 그 확인을 위한 식품 산업 및 의약 산업에서의 요구도 있다.
소위 톨-유사 수용체(toll-like receptors; TLR, TLRs)가 패혈증 및 신체에서 파이로젠의 존재에 수반되는 유사한 감염성 질병의 병리 과정에 관련된다고 알려져 있다. TLRs은 파이로젠에 대한 내인성 반응을 매개한다. 미생물에 의해 촉발되는 패혈증에서 박테리아 성분은 TLRs을 통해 숙주의 면역 세포를 자극한다.
TLRs은 약 200 아미노산의 류신-풍부 세포외 영역 및 세포질 영역을 갖는 고도로 보존된 막통과(transmembrane) 단백질이다. 세포질 영역에서의 이들의 상동성 으로 인해 이들은 인터류킨-1 수용체/톨-유사 수용체 수퍼패밀리에 속한다. 세포질 TlR 영역의 특성은 신호 전달에 필수이다. 세포외 영역은 다른 병원성 분자 구조의 인식에 직접 참여하고 IL-1 수용체의 것과는 첨예하게 다르다. IL-1 수용체의 세포외 부분은 3 개의 면역 글로불린 영역으로 구성되는 한편, TLRs은 18 내지 26 LRR 각각 24 내지 29 아미노산 길이를 갖는다. 드로소필라(Drosophila)로부터 알려진 단백질 "톨(toll)"과는 대조적으로, TLRs은 외래 구조에 의해 직접 활성화된다. 따라서, 10 개의 다른 인간 TLRs와 마우스의 13 TLRs이 확인되었다. 이들은 면역 시스템의 다른 세포 타입, 주로 단핵구, 대식세포, 수지상 세포뿐 아니라 B 및 T 세포에서 발현된다. TLRs은 플라스마 멤브레인에 위치하고; TLR-3, TLR-7 및 TLR-9는 핵산 모티브에 의해 활성화되고 세포내 구획에서 발견될 수 있다.
TLR-2는 박테리아 지질단백질 및 리포테이코산을 포함하여 그람-양성 박테리아로부터 많은 PAMPs의 인식에 필수적이다. TLR-3은 이중-가닥 바이러스 RNA의 인식에 관련된다. TLR-4는 주로 LPS에 의해 활성화된다. TLR-5은 박테리아 플라젤린(flagellin)을 검출한다. TLR-7 및 TLR-8은 합성된 작은 항바이러스 분자와 단일-가닥의 RNA를 인식한다. TLR-9는 소포체(ER; endoplasmic reticulum)에서 검출되고, CpG 모티브, 예를 들어 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 자극 후 엔도좀/리소좀 구획으로 재소집된다. CpG 모티브는 핵산 가닥이 있는 영역으로, 여기에 사이토신(C) 및 구아닌(G) 성분이 예상치 못한 빈도("p"는 "C"와 "G" 성분 모두와 결합하는 포스페이트 그룹을 나타낸다)로 존재하며; 이러한 CpG 모티브는 박테리아와 바이러스의 게놈에서 특히 자주 발견되지만 척추동물에서는 발견되지 않는다.
톨-유사 수용체의 길항제는, 예를 들어 바이러스-유도된 유두종을 치료하기 위한 피부과에서의 사용이 증가하고 있다. 새로운 TLR 길항제의 스크리닝을 위한 시험 시스템에 대한 요구가 있다.
인간 면역 시스템의 활성화 개념은 암 치료에 중요하다. CPG 7909(Coley Pharmaceutical Group)와 같은 물질은 이런 방식으로 면역-조절 작용을 야기하고, 따라서 화학요법제의 효능을 개선시킬 수 있다. 새로운 CpG 모티브(올리고데옥시뉴클레오타이드)의 스크리닝을 위한 시험 시스템의 요구가 있다.
본 발명은 주로 파이로젠의 특이적 검출(특이적 파이로젠 시험)을 위한 방법 및 약제를 제공하는 기술적 문제를 기초로 한다. 다른 기술적 문제는 인간 또는 동물 신체의 감염에서 병원균 또는 병원균 스펙트럼의 특이적 검출을 위한 방법 및 약제의 준비에 관련된다. 또 다른 기술적 문제는 신규의 TLR 길항제 및/또는 신규의 CpG 모티브의 스크리닝을 위한 방법 및 약제의 준비에 관련된다.
이러한 기술적 문제는, 청구항 1에 따른 특징적 양상으로 샘플에서 파이로젠의 특이적 검출을 위한 형질전환 세포 또는 세포주의 제조에 의해 본질적으로 해결된다. 이 세포는 바람직하게는 부착성이다. 하나의 변형에서 이 세포는 바람직하게는 현탁액 중에 있다.
본 발명에 따르면, 형질전환 세포 또는 세포주는 게놈 중에 (a) 적어도 하나의 톨-유사 수용체(TLR)를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 또는 유전자들, 및 (b) 적어도 하나의 리포터 유전자를 갖는데, 이는 NF-κB에 의해 유도 가능한 프로모터의 발현 제어 하에 있다. 이 세포 또는 세포주는 게놈 중에 바람직하게는 또한 CD14 수용체를 코딩하는 유전자를 갖는다. 본 발명에 따른 세포 또는 세포주는 바람직하게는 섬유모세포, 바람직하게는 포유동물 섬유모세포, 특히 쥐의 섬유모세포 타입 NIH-3T3에 기초한다. TLR은 바람직하게는 플라스미드를 통해 공동수용체 (coreceptor) CD14 (MD2)로 함께 형질감염된다.
따라서 본 발명은, 바람직하게는 섬유모세포 NIH-3T3에 기초하여, 형질전환된 세포주를 공급하는 것을 제안하는데, 이는 적어도 하나의 TLR을 발현하고 바람직하게는 CD14 공동수용체를 공동발현한다. TLR-4 및 CD14의 공동발현(co-expression)이 특히 바람직하다. 본 발명자는 놀랍게도 이러한 형질전환 세포가, 발현된 TLR을 특이적으로 활성화시키는 파이로젠과 접촉하여, 예를 들어 색 반응에 의해 검출될 수 있고 어떤 조건 하에서 정량화될 수 있는, 수용체 유전자에 의해 코딩되는 효소 활성을 발현한다는 것을 발견하였다. 따라서, 파이로젠, PAMPs 및 다른 TLR-활성화 물질의 검출을 위해 세포 시험 시스템이 제공된다.
이 시험 시스템의 선택성과 감도는 높다. 감도는 약 1 내지 10 pg/mL LPS이다. 이것과 비교하여, 통상의 파이로젠 시험 시스템의 감도는 약 3 내지 10 pg/mL (LAL) 또는 20-50 pg/mL(IPT)이다.
본 발명에 따른 시험 시스템은 CO2 가스 처리 등 세포 배양 실험실 장비 없이도 가능하고, 따라서 특별한 실험실 장비 없이도 어떠한 사용자라도 간단히 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 교시를 특징으로 하는 주요 시험 방법은 모든 TLRs(예를 들어, 사람 TLRs 1-10)을 위한 세포주로 확장되어 모든 PAMPs가 선택적으로 인식되고 확인될 수 있다. 따라서, 간단하고 신속한 세포 시험 시스템이 유리하게도 제공될 수 있으며, 이는 하나 이상의 파이로젠 또는 (병원균-관련 미생물학적 패턴) PAMPs의 특이적 검출뿐만 아니라 이들의 정량도 가능하게 한다. 이론에 구애됨 없이, TLRs의 활성화는 전사 인자 NF-κB에 의한 다른 사이토카인의 생산을 유도하는 신호 변환 경로를 유도한다. MyD88 및 IRAK1과 같은 많은 단백질이 이 신호 캐스케이드에 포함되어 있다. 이 신호 캐스케이드는 전사 인자 NF-κB의 활성화를 통해 염증촉진 사이토카인의 유도 및 생산을 유도한다. 사이토카인 종양 괴사 인자(TNF), 인터류킨-1(IL-1) 및 인터류킨-6(IL-6)은, 이 과정에서 가장 중요한 중앙 및 초기에 포함되는 매개체로 여겨진다. TLRs의 활성화 후, 어댑터 분자의 소집과 염증촉진 사이토카인의 생산이 일어난다. 이들 사이토카인의 분비는 면역 시스템의 자극을 유도하고 침투하는 미생물에 대하여 방어한다. 그러나, 급격하게 지나친 생산은 패혈증 또는 패혈증 쇼크를 유도할 수 있다. 패혈증의 진단과 관련해서는, 주로 TLR-2 및 TLR-4가 바람직하다. TLR-2가 펩티도글리칸, 리포펩티드 및 LTA와 같은 그람-양성 박테리아의 성분을 인식하는 반면, TLR-4는 그람-음성 박테리아의 세포벽의 주성분인 LPS의 수용체이다. 그러므로, TLR-2 및 TLR-4는 그람-양성 및 그람-음성 패혈증에서 신호-전달 수용체로 우수하고, 따라서 병원균 스펙트럼의 분류에 바람직하게 사용된다. 표 1은 각각의 인간 TLRs의 상세를 보여준다.
리간드/파이로젠 기원 TLR 타입
세포벽 성분 (펩티도글리칸, 리포펩티드, 리포테이콘산) 박테리아 TLR 1/TLR 2 (이종이량체)
리포프로테인 박테리아 TLR 2
리포펩티드 마이코플라스마 TLR 2/TLR 6 (이종이량체)
자이모겐 효모, 진균 TLR 2/TLR 6 (이종이량체)
이중-가닥 RNA 바이러스 TLR 3
지질다당류(LPS) 그람-음성 박테리아 TLR 4, CD 14
열쇼크 단백질 60 (Hsp 60) 인간/진균 TLR 4
플라젤린 박테리아 TLR 5
단일-가닥 RNA 바이러스 TLR 7/TLR 8 (이종이량체)
비메틸화된 CpG 모티브 박테리아, 바이러스 TLR 9
병원균-특이적 PAMPs의 확인에 의해, 패혈증-유발 병원균의 신속한 확인 가능성이 얻어진다. 패혈증 환자는 본 발명에 따른 세포 시험 시스템으로 신속하게 표적 방식으로 치료될 수 있다.
바람직한 변형에서, 형질전환 세포는 적어도 2 개의 다른 TLRs를 공동 발현하여 TLR 이종이량체(heterodimer)의 형성이 일어나는데, 이는 그들 자신의 특이성을 갖는다(표 1 참조). 따라서 이 세포는 바람직하게는 제 1의 톨-유사 수용체 타입(TLR 타입)을 코딩하는 유전자(들) 및 추가로 제 2 톨-유사 수용체 타입(TLR 타입)을 코딩하는 유전자(들)를 갖는다.
"리포터 유전자(reporter gene)"는 숙주 유기체 내에서 본질적으로 발현되지 않거나 무의미하게 발현하는, 유도 가능한 프로모터의 제어 하에 효소 활성을 위해 코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자 또는 유전자 구조체를 의미한다. 코딩된 효소 활성의 발생은 리포터 유전자 프로모터의 유도를 나타낸다. 리포터 유전자와 유도 가능한 프로모터는 바람직하게는 리포터 유전자 플라스미드에 놓인다. 전사 인자에 의해 리포터 유전자 프로모터를 유도하는 것에 제안되는데, 이는 이론에 구애됨 없이, TLR-유도된 세포내 신호 캐스케이드의 성분이다. 본 발명에 따라 제안된 적어도 하나의 리포터 유전자는 바람직하게는 전사 인자인 "핵 인자 카파-B (nuclear factor kappa-B"(NF-κB)의 제어 하에 있다. TLR의 활성화에서, 세포질에 국소화된 결합된 NF-κB가 분비되고 세포 핵으로 장소가 이동된다. 바람직한 NF-κB 유도 가능한 프로모터는 셀렉틴(selectin) 또는 ELAM-1(endothelial cell leukocyte adhesion molecule-1) 프로모터이다.
바람직한 리포터 유전자는 SEAP(secreted alkaline phosphatase)로, 바람직하게는 ELAM-1 프로모터의 제어하에 있고, 바람직하게는 리포터 유전자 플라스미드의 형태이다. 다른 바람직한 리포터 유전자는 β-갈락토시다제 유전자 lacZ로, 바람직하게는 ELAM-1 프로모터의 제어하에 있고, 바람직하게는 리포터 유전자 플라스미드의 형태이다. 다른 바람직한 리포터 유전자는 루시퍼라제 유전자로, 바람직하게는 ELAM-1 프로모터의 제어하에 있고, 바람직하게는 리포터 유전자 플라스미드의 형태이다. 다른 바람직한 리포터 유전자는 GFP(green fluorescent protein)로, 바람직하게는 ELAM-1 프로모터의 제어하에 있고, 바람직하게는 리포터 유전자 플라스미드의 형태이다. 해당하는 적용에 적합한 어떠한 다른 프로모터라도 자연스럽게 사용할 수 있는데, 이는 TLR의 결합 또는 활성화에 의해 유발되는 신호 캐스케이드에 의해 조절되는 특성을 갖는다.
TLR은 바람직하게는 10 개의 현재 알려진 인간 TLRs로부터 선택된다. 본 발명은 알려진 인간 TLRs만으로 제한되지 않음이 이해될 것이다. 추가로 지정되는 TLRs가 본 발명에 포함된다. 따라서, 본 발명에 따른 다른 목적은 적어도 하나의 아직 추가로 지정되지 않은 TLR 변형체의 유전자를 갖고 이 TLR 변형체를 발현하는 형질전환 세포 또는 세포주이다.
본 발명의 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 1(TLR-1)을 발현한다. 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 2(TLR-2)를 발현한다. 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 3(TLR-3)을 발현한다. 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 4(TLR-4)를 발현한다. 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 5(TLR-5)를 발현한다. 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 6(TLR-6)을 발현한다. 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 7(TLR-7)을 발현한다. 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 8(TLR-8)을 발현한다. 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 9(TLR-9)를 발현한다. 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 10(TLR-10)을 발현한다. 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 1(TLR-1) 및 인간 TLR 타입 2(TLR-2)로부터의 이종이량체 수용체를 발현한다. 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 7(TLR-7) 및 인간 TLR 타입 8(TLR-8)로부터의 이종이량체 수용체를 발현한다. 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 인간 TLR 타입 6(TLR-6) 및 인간 TLR 타입 2(TLR-2)로부터의 이종이량체 수용체를 발현한다. 본 발명은 또한 TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8, TLR-9 및 TLR-10으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 다른 TLRs의 공동 발현과 관련된다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 다음 이종이량체와 관련된다: TLR-1/TLR-2; TLR-1/TLR-3; TLR-1/TLR-4; TLR-1/TLR-5; TLR-1/TLR-6; TLR-1/TLR-7; TLR-1/TLR-8; TLR-1/TLR-9; TLR-1/TLR-10; TLR-2/TLR-3; TLR-2/TLR-4; TLR-2/TLR-5; TLR-2/TLR-6; TLR-2/TLR-7; TLR-2/TLR-8; TLR-2/TLR-9; TLR-2/TLR-10; TLR-3/TLR-4; TLR-3/TLR-5; TLR-3/TLR-6; TLR-3/TLR-7; TLR-3/TLR-8; TLR-3/TLR-9; TLR-3/TLR-10; TLR-4/TLR-5; TLR-4/TLR-6; TLR-4/TLR-7; TLR-4/TLR-8; TLR-4/TLR-9; TLR-4/TLR-10; TLR-5/TLR-6; TLR-5/TLR-7; TLR-5/TLR-8; TLR-5/TLR-9; TLR-5/TLR-10; TLR-6/TLR-7; TLR-6/TLR-8; TLR-6/TLR-9; TLR-6/TLR-10; TLR-7/TLR-8; TLR-7/TLR-9; TLR-7/TLR-10; TLR-8/TLR-9; TLR-8/TLR-10; TLR-9/TLR-10. 이들은 단독으로 또는 적어도 다른 TLR 또는 TLR 이종이량체와 함께 조합하여 공동 발현될 수 있다.
그러나, 본 발명은 인간 TLRs로 제한되지 않는다. 특히 동물 실험 적용 및 수의학적 목적을 위해, 동물에서 감염성 질병의 치료를 위해, 본 발명에 따른 세포는 동물 TLR, 바람직하게는 포유류 TLR을 발현하도록 제안된다. TLR은 쥐 TLRs로부터 특히 바람직하게 선택된다. 본 발명의 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 1(mTLR-1)을 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 2(mTLR-2)를 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 3(mTLR-3)을 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 4(mTLR-4)를 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 5(mTLR-5)를 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 6(mTLR-6)을 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 7(mTLR-7)을 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 8(mTLR-8)을 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 9(mTLR-9)를 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 10(mTLR-10)을 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 11(mTLR-11)을 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 12(mTLR-12)를 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형에서, 세포 또는 세포주는 적어도 쥐의 TLR 타입 13(mTLR-13)을 발현한다.
본 발명의 바람직한 변형에서는, 특이적으로 적어도 하나의 TLR 또는 TLR 이종이량체를 발현하는 본 발명에 따른 단일 형질전환 세포 또는 세포주만이 제공되는 것은 아니며, 이들은 이하에서 "세포 타입"으로 지칭된다. 본 발명에 따른 한 "세트"의 적어도 두 개의 다른 세포 타입은, 각각 다른 TLRs 또는 TLR 이종이량체를 발현하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 다른 세포 타입은 각각 다른 TLRs 또는 TLR 이종이량체를 발현하는 것이 특히 바람직하다. 이론에 구애됨 없이, 파이로젠 군집의 개별 파이로젠은 각각 하나 또는 몇 개의 특이적 TLRs 및/또는 TLR 이종이량체에 특이적으로 결합한다. 이런 방식으로 샘플의 파이로젠 스펙트럼 및/또는 개별 파이로젠의 간단한 특성화가 가능하다. 예를 들어, TLR-2와 TLR-6으로부터 이종이량체를 발현하는 세포 타입은 마이코플라스마 파이로젠 및 효모 파이로젠의 특이적 검출을 허용한다. 예를 들어, TLR-3를 발현하는 세포 타입과 TLR-9를 발현하는 세포타입의 세트는 이중-가닥 RNA를 갖는 바이러스의 특이적 검출을 허용한다.
따라서, 본 발명의 목적은 또한, 그 안에 적어도 하나의 세포 타입, 바람직하게는 몇 개의 다른 세포 타입이 도입되고, 부착되거나 현탁액으로서 배양되는 세포 배양 용기, 바람직하게는 세포 배양 플레이트, 멀티웰 플레이트이다. 가장 간단한 경우 세포는, 예를 들어 콜라겐 필름에 부착하여, 세포 배양 용기의 표면에 놓인다. 그러나, 현탁액 중 배양이 바람직하다. 3D 바이오매트릭스 위 또는 안에서 배양(incubation/culturing)하는 것도 가능하다. 세포 배양 지지체의 어드레스 가능한 하부 구획 위 또는 안으로 다른 세포 타입을 도입하는 것도 가능하다. 본 발명은 플레이트, 용기 또는 웰 위에 세포를 접종하고, 다음 사용을 위해 저장, 바람직하게는 냉동하거나 동결 보존하는 것을 제안한다. 이렇게 준비된 플레이트, 용기 또는 웰은, 파이로젠 및 다른 TLR-활성화 또는 조절 물질(TLR 길항제)을 위한 대응하는 시험을 위해 단시간 내에 필요에 따라 사용될 수 있다. 가장 간단한 경우, 세포를 갖는 플레이트 등은 해동되어 시험할 샘플과 함께 배양된다. 리포터 유전자-중재된 효소 활성은 공지의 방식으로 검출되고, 시험하는 물질, 파이로젠 또는 PAMP에 의한 TLR의 특이적 활성화의 존재 또는 부재를 세포 타입 내에서 나타낸다.
세포 배양 용기는 바람직하게는 키트로 공급된다. 키트는 앞서 기술된 세포 배양 용기 또는 분석 지지체 내에 상기 특징을 갖는 세포를 포함하고, 시험의 즉각적인 수행을 위해 특히 냉동 상태로 공급되는 것이 바람직하다. 키트의 사용 중, 유리하게도 CO2 배양기와 같은 비싼 세포 배양 조건은 필요치 않다. 키트는 색깔 변화를 검출하기 위한 장비를 갖는 병원의 간단한 실험실에서 운영될 수 있다. 가장 간단한 경우, 즉각적으로 인식 가능한 색깔 변화가 특이적 TLR 활성화를 위해 충분하다. 색깔 변화의 패턴으로부터, 키트 사용자는 파이로젠 스펙트럼 및/또는 병원균 타입에 관한 결론을 도출할 수 있다.
샘플 중 파이로젠의 특이적 검출을 위한 본 발명에 따른 키트는, 유도 가능한 리포터 유전자에 의해 코딩되는 효소를 위한 적어도 하나의 기질을 포함하는 배양 용기, 바람직하게는 검출 배지 중에 상기 청구항의 하나에 따른 적어도 하나의 형질전환된 세포를 포함한다. 적어도 2 개의 구획 또는 웰을 갖는 세포 배양 용기 또는 플레이트를 포함하는 키트가 바람직한데, 여기에는 적어도 제 1 TLR 타입 또는 이종이량체를 발현하는 적어도 하나의 형질전환 세포가 제 1 웰에 함유되고 적어도 제 2 TLR 타입 또는 이종이량체를 발현하는, 제 1 형질전환 세포와 다른 제 2 형질전환 세포는 제 2 웰에 함유된다.
따라서, 본 발명의 특히 바람직한 변형은 다음을 제시한다: 바람직하게는 검출 배지뿐 아니라, 바람직하게는 적어도 인간 TLR-1을 발현하는 제 1 형질전환 세포를 포함하는 제 1 웰, 바람직하게는 적어도 인간 TLR-2을 발현하는 제 2 형질전환 세포를 포함하는 제 2 웰, 그리고 바람직하게는 적어도 인간 TLR-3를 발현하는 제 3 형질전환 세포를 포함하는 제 3 웰, 바람직하게는 적어도 인간 TLR-4를 발현하는 제 4 형질전환 세포를 포함하는 제 4 웰, 바람직하게는 적어도 인간 TLR-5를 발현하는 제 5 형질전환 세포를 포함하는 제 5 웰, 바람직하게는 적어도 인간 TLR-6를 발현하는 제 6 형질전환 세포를 포함하는 제 6 웰, 바람직하게는 적어도 인간 TLR-7을 발현하는 제 7 형질전환 세포를 포함하는 제 7 웰, 바람직하게는 적어도 인간 TLR-8을 발현하는 제 8 형질전환 세포를 포함하는 제 8 웰, 바람직하게는 적어도 인간 TLR-9을 발현하는 제 9 형질전환 세포를 포함하는 제 9 웰, 바람직하게는 적어도 인간 TLR-10을 발현하는 제 10 형질전환 세포를 포함하는 제 10 웰을 갖는 하나 또는 그 이상의 세포 배양 용기로 구성되는 키트.
본 발명의 다른 목적은 또한 샘플에서 파이로젠의 특이적 검출 방법이다. 본 발명에 따르면, 이 방법은 적어도 다음 단계를 포함한다: 샘플의 제조, 적어도 하나의 특이적 TLR 또는 특이적 TLR 이종이량체를 발현하는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 형질전환 세포 또는 세포주의 제조; 이 샘플을 세포와 접촉시켜 소위 샘플-세포 복합체를 형성하는데, 이는 특히 세포에 샘플 성분을 결합시키는 것을 특징으로 한다; 효소 활성의 유도를 위해 샘플-세포 복합체를, 바람직하게는 약 37 ℃에서 약 3 내지 약 24 시간 동안 배양하고, 리포터 유전자에 의해 유도된 효소 활성을 검출하는데, 여기에서 효소 활성은 세포 또는 세포주의 TLR 타입 또는 TLR 이종이량체 또는 길항적 활성 성분에 특이적인 파이로젠의 존재를 나타낸다.
리포터 유전자에 의해 유도된 효소 활성의 검출은, 세포의 유도 가능한 리포터 유전자에 의해 코딩되는 효소에 대한 기질을 포함하는 검출 배지를 제공하고, 유도된 샘플-세포 복합체를 검출 배지 중에서, 바람직하게는 약 37 ℃에서 바람직하게는 약 30 내지 약 240 분 동안 배양하는 것에 의해 일어나는데, 여기에서 효소 활성은 효소적으로 전환된 기질의 검출에 의해 검출되고 바람직하게는 정량화된다. 효소적으로 전환된 기질의 정량화 및 이에 따른 효소 활성은 특이적 파이로젠 또는 TLR-활성화 기질(TLR-길항제; CpG-모티브 등)의 농도 및 활성과 관련된 결과를 허용한다.
효소 활성은 바람직하게는 알칼리 포스파타제 활성으로, 이는 바람직하게는 SEAP에 의해 중재된다. 알칼리 포스파타제는 알칼리성 매질 중에서 인산 에스테르의 가수분해에 대한 촉매 작용을 하는 효소이다. 5-브로모-4-클로로인돌릴 포스페이트(BCIP)가 바람직하게는 기질로서 사용된다. 다음에 효소 활성의 검출은 청색 변화 및/또는 청색 침전, 암청색의 불용성이고 쉽게 인식 가능한 진한 남색 침전에 의해 일어난다.
다른 변형에서, 기질은 p-니트로페닐 포스페이트(pNPP)이고 알칼리 포스파타제 활성은 pNPP의 가수분해에 따른 용액의 황색 변화에 의해 나타난다. 용액의 황색 변화는 바람직하게는 광도계에 의해 검출 및 정량화된다. 광도계 분석은 바람직하게는 약 405 ㎚에서 일어난다. 샘플에서의 파이로젠 또는 TLR-활성 성분의 농도는 extinction으로부터 검출될 수 있다. 새포내 검출되는 리포터 유전자도 정량화할 수 있도록, 세포를 용해하고 염료를 이들로부터 배출시켜야 한다. 직접적인 세포내 검출은 NaOH를 통한 세포내 염료의 용출에 의해 일어나고; 이로 인해 세포내 정량 분석이 가능하다. 비중 측정 평가(half-tones에 의한) 또한 정량화를 위해 가능하다.
다른 바람직한 변형에서, 효소 활성은 β-갈락토시다제 활성이고 기질은 바람직하게는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드(X-Gal)이다. 효소 활성의 검출은 청색 변화 및/또는 청색 침전에 의해 일어난다.
다른 바람직한 변형에서, 효소 활성은 루시페라제 활성이고 기질은 바람직하게는 루시페린이다. 임의로 추가 첨가된 ATP 및 Mg2 +의 존재 중, 효소 활성은 발광(화학발광 분석)에 의해 표시된다.
샘플은 본 발명에 따른 방법 또는 시험 시스템에 의해 분석될 수 있으며, 특히 인간 또는 동물 신체로부터의 임상적 샘플이다. 샘플은 패혈증의 경우, 바람직하게는 혈액, 바람직하게는 전혈이다. 다른 임상적 샘플은 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 분변, 조직 생검, 기관지 세척액, 뇌척수액, CSF, 임파액, 활액 등으로, 예를 들어 감염의 타입에 따른 위한 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은, 바람직하게는 본 발명의 방법에 따라, 그리고/또는 바람직하게는 본 발명에 따른 키트를 사용하여, 임상적 샘플에서 파이로젠의 특이적 검출을 위한 형질전환 세포의 사용이다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 형질전환 세포 또는 세포주는 비발열성을 위한 산물의 시험을 위해 시험 시스템에 사용될 수 있다는 것을 보여주었다. 파이로젠 오염의 측정 또는 비발열성을 위한 시험 방법을 사용할 경우, 샘플은 바람직하게는 의학적 기구 또는 의학적 산물(MP; medical product)의 시험편(specimen) 또는 생체외 진단용 시약(IVD; in vitro diagnostic agent) 또는 약물, 약물 성분, 식품, 식품 성분 또는 식품이나 약물의 원료 물질 또는 출발 물질이다. 이들은 수술 기구, 캐뉼러, 시린지, 주입 세트, 혈액백 및 수혈 세트, 투석 세트 및 장비, 상처 커버, 봉합 재료, 임플란트, 보철, 카테터, 주입 용액, 세척 용액 등을 포함한다. 샘플은 동물 기원의 이식물, 조직, 세포 및 이 내용물 또는 이 기원의 산물 뿐만 아니라, 인간 기원의 이식물, 조직 및 세포, 그리고 이 내용물 또는 이 기원의 산물로부터 선택되도록 제안된다. 또한, 샘플은 미용 물품 및 화장품으로부터 선택되는 것도 제안된다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은, 바람직하게는 본 발명의 방법에 따라, 그리고/또는 바람직하게는 본 발명에 따른 키트를 사용하여, 이러한 산물의 비발열성 시험을 위한 형질전환 세포의 사용이다.
또한 놀랍게도, 본 발명에 따른 형질전환 세포 또는 세포주는 일군의 후보 물질에서 TLR 길항제의 특성을 갖는 활성 성분을 발견하고 이들의 효능을 정량화하기 위한 시험 시스템에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은, 바람직하게는 본 발명의 방법에 따라, 그리고/또는 바람직하게는 본 발명에 따른 키트를 사용하여, TLR 길항제의 특성을 갖는 활성 성분의 스크리닝을 위한 형질전환 세포의 사용이다.
마지막으로 놀랍게도, 본 발명에 따른 형질전환 세포 또는 세포주는 일군의 후보 물질의 특이적 TLR, 특히 TLR-9를 활성화시키는 CpG-모티브를 갖는 올리고뉴클레오티드를 발견하고 이들의 효능을 정량화하기 위한 시험 시스템에 사용될 수 있음이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은, 바람직하게는 본 발명의 방법에 따라, 그리고/또는 바람직하게는 본 발명에 따른 키트를 사용하여, CpG-모티브를 갖는 올리고뉴클레오티드의 스크리닝을 위한 형질전환 세포의 사용이다.
도 1은 본 발명에 따른 시험 방법(리간드 LPS를 갖는 TLR-4/CD14 (MD2)의 실시예에서)의 모식도를 보여준다.
도 2는 해동 후 및 BCIP 기질을 갖는 검출 배지와 100 ng/mL LPS(4-웰 우측) 첨가 후 SEAP 리포터 플라스미드를 갖는 NIH-3T3 클론 4/5 TLR-4/CD14를 보여준다.
도 3은 10 pg/mL 내지 100 pg/mL LPS; 기질: BCIP를 갖는 NIH-3T3 TLR-4/CD14 시험 시스템의 유도를 보여주는데; 음성 대조군은 유도되지 않았거나 ssRNA40로 유도되었다.
도 4는 NIH-3T3 클론 4/5 TLR-4/CD14의 감도 검출을 보여준다; LPS는 특이적 으로 10 pg/mL까지 검출 가능, 검출 배지 첨가 후 2 시간: 광도계 분석.
도 5는 NIH-3T3 클론 4/(5) TLR-4/CD14의 감도 검출을 보여준다; LPS는 특이적으로 1 pg/mL까지 검출 가능, 검출 배지 첨가 후 2 시간: 광도계 분석.
도 6 및 7은 비교 실험: TLR-4/CD14 SEAP로 형질감염되고 100 ng/mL LPS로 유도된 HEK 블루 293 섬유모세포 및 다른 293 섬유모세포를 가지고 실시한 TLR-4 시험; 유도된 대조군 및 비유도된 대조군 모두 청색 색상 변화를 보여준다; 이들 세포에서 특이적 검출은 가능하지 않다.
도 8은 비교 실험: TLR-4/CD14 SEAP로 형질감염되고 100 ng/mL LPS로 유도된 HEK 블루 293 섬유모세포 및 다른 293 섬유모세포를 가지고 실시한 TLR-4 시험; 세포 펠렛의 SDS-PAGE/웨스턴 블롯 분석, 일차 항체: 항-SEAP 및 항-마우스 POD 결합된 이차 항체, 표지: 미리 염색된 표준 SeeBlue®Plus2: 알칼리 포스파타제(SEAP); 동일한 양으로 발현된 유도된 세포 및 비유도된 대조군 세포 모두에서 HEK 293 및다른 293 세포(K2 및 K4)에서; 이들 세포에서 특이적 검출은 가능하지 않다.
도 9는 시험 시스템의 특이성을 보여준다: NIH-3T3 TLR-4/CD14 시험 시스템은 비특이적 파이로젠(각 25 ㎍/mL); ODN(TLR-9을 위한 리간드), PGN(TLR-2를 위한 리간드), Poly IC으로 유도되었다; 색깔 변화는 일어나지 않으며, 시험은 특이적으로 반응한다.
도 10은 NIH-3T3 TLR-4/CD14 클론 4/5의 페이스 대조 레코딩을 보여준다: 30,000 세포/웰 접종되고, 30% FCS, 80 mmol/L HEPES 및 5% DMSO 중에 100 μL, 3 일 내지 4 주 동안 -80℃에서 동결; 37℃, CO2 없는 습한 환경에서 밤새 부착,
도 11은 100 pg/mL LPS 및 100 pg/mL ssRNA40으로 유도된 동결 및 재해동된 NIH-3T3 TLR-4/CD14 SEAP P40에 대하여 시행된 본 발명에 따른 TLR-4 시험을 보여준다. 24 시간 후 유도, 3 시간 후 검출; 유도된 세포의 특이적인 청색 착색이 관찰된다.
도 12는 2 ㎍/mL 플라젤린으로 유도된 NIH-3T3 클론 TLR-5 SEAP에서 시행된 본 발명에 따른 TLR-5 시험을 보여준다; 유도된 세포의 특이적인 청색 착색이 관찰된다.
도 13은 비교 실험: 2 ㎍/mL 플라젤린으로 유도된 TLR-5 SEAP로 형질감염된 HELA 세포로 시행한 TLR-5 시험; 유도된 세포 및 비유도된 대조군 양쪽 다 강한 청색 착색을 보인다. 이 세포주로는 어떠한 특이적 유도도 가능하지 않다.
실시예 1: TLR -4 특이적 시험 시스템
방법
TLR -4로 형질감염
세포주 NIH-3T3를 TLR-4/CD14 복합체 및 리포터 유전자 플라스미드 SEAP/ELAM-1로 형질감염시켰다.
내독소(LPS)-중재의 TLR-4의 유도는 신호 캐스케이드에 따라 전사 인자 NF-κB의 활성화를 유도한다. 리포터 유전자 SEAP의 발현은 NF-κB에 의해 유도 가능 한 ELAM-1 프로모터에 의해 제어된다. NF-κB 활성화 및 이에 따른 SEAP의 특이적 분비는 내독소 지질다당류 LPS에 의한 TLR-4의 유도시 일어난다.
시험의 시행
밀도 30,000 내지 200,000 세포/웰(24-웰)(다른 웰 용적의 세포 수에 해당)의 NIH-3T3 TLR-4/CD14 클론 4/5 P35를 부착을 위해 0.5% FCS 배지 o/n에 500 μL/웰로 접종하였다.
다음날 LPS o/n으로 유도가 일어난다(+ 음성 대조군: ssRNA40은 TLR-4/CD14에 의해 검출될 수 없다).
다음날 300 μL/웰 검출 배지로 배양하는 것에 의해 검출이 일어나는데, 검출 배지는 유도된 세포로 직접 첨가된다: 유도된 세포에서 SEAP 활성은 검출 배지에서 기질 BCIP를 암청색의 불용성 최종 산물(인디고)로 전환시킨다. 대체 방법으로서, 유도된 세포에서 SEAP 활성은 검출 배지에서 기질 pNPP를 담황색의 가용성 착색 복합체로 전환시키는데, 이는 약 405 ㎚에서 광도계로 측정된다. 광도계 분석은 검출 배지의 첨가 약 2 시간 후에 일어난다.
동결 및 24-웰 플레이트를 갖는 시험 키트의 사용
하나의 변형에서, 형질감염된 세포주를 이에 대응하는 분석 포맷으로 동결시킨다: 대응하는 밀도(각 500 μL(24-웰) 중에 200,000 세포/웰)의 세포 배양-웰-플레이트(멀티웰 플레이트).
사용자는 이미 시험 플레이트에 넣어 드라이아이스로 냉각시킨 대응하는 배지에 8 내지 10의 다른 세포주를 갖는 분석 키트를 받는다. 분석은 패키지로부터 꺼내 37 ℃ 캐비넷에서 직접 배양할 수 있다.
키트의 해동 후, 밤새 세포의 부착을 위해 DMEM 배양 배지를 첨가한다. HEPES 완충액을 갖는 배지는 가열 캐비넷에서, 즉 CO2 가스처리 없이 시험 세포의 배양을 허용한다. 배양은 시험마다 100 ng/mL LPS의 첨가에 의해 실시된다. 검출은 300 μL/웰 BCIP 검출 배지의 첨가에 의해 24 시간 후에 시행된다.
결과
a) 해동된 시험 시스템
도 2는 해동 후 3T3 NIH 클론 4/5 TLR-4/CD14에서 100 ng/mL LPS와 음성 대조군의 결과를 보여준다. 유도된 세포에서 SEAP 활성은 검출 배지에서 기질 BCIP를 암청색의 불용성 최종 산물(인디고)로 전환시킨다.
고가의 대형 장비와 세포 배양 실험실(무균 작업대와 CO2 배양기 등) 없이 작동할 수 있는 신속하고 간단한 검출 시스템이 TLR-4/CD14로 안정적으로 형질감염된 세포에 근거하여 LPS를 위하여 개발되었다. 이것은 신속하게 시행될 수 있고 다루기 간편하다.
b) 감도
도 3은 10 pg/mL 내지 100 pg/mL LPS를 갖는 NIH-3T3 클론 4(5) TLR-4/CD14 SEAP 시험 시스템의 유도를 보여준다. 검출 배지의 기질은 BCIP이다. 음성 대조군은 유도되지 않았고, 다른 음성 대조군은 비특이적으로 ssRNA40에서 유도되었다.
도 4는 NIH-3T3 클론 4(5) TLR-4/CD14 SEAP의 감도 검출을 10 pg/mL LPS까지 특이적으로 보여준다. 도 5는 NIH-3T3 클론 4/(5) TLR-4/CD14 SEAP의 감도 검출을 1 pg/mL LPS까지 특이적으로 보여준다.
시험 시스템의 감도는 약 1 내지 2 pg/mL LPS에 있다.
c) 특이성
상기 NIH-3T3 TLR-4/CD14 SEAP 시험 시스템은 TLR-4가 결합하지 않은 대량의 비특이적 파이로젠(25 ㎍/mL ODN, PGN, Poly IC 각각)으로 유도되었다: ODN, PGN, Poly IC는 TLR-9, 2 및 3에 의해 인식되지만 TLR-4에 의해서는 인식되지 않았다. 도 5는 결과를 보여준다: TLR-4-특이적 시스템에서는 극히 높은 비특이적 파이로젠 분율에서도 어떠한 색상 변화도 볼 수 없다; TLR-4 시험은 특이적이다.
실시예 2: 비교 실험
방법
HEK 블루 293 섬유모세포 및 다른 293 섬유모세포를 TLR-4/CD14 SEAP로 형질감염시키고 100 ng/mL LPS로 유도하였다. 모든 다른 공정 인자는 본 발명에 따른 실시예 1에서와 같이 선택하였다.
또한, 유전자 발현의 웨스턴 블롯 분석은 공지의 방식으로 시행하였다: 1차 항원: 항-SEAP; 복합체 2차 항원: 항-마우스 POD; 표지: SeeBlue® Plus2; 미리 착색된 표준품.
결과
도 6 및 7은 착색 시험의 결과를 보여준다: 유도된 세포 뿐 아니라 유도되지 않은 대조군도 청색의 색상 변화를 보여준다. HEK 블루 293 및 클론 4(K4)와 같은 다른 293 세포에서는 어떠한 특이적 유도도 없었고 따라서 시험 시스템의 설정이 가능하지 않다.
도 8은 100 ng/mL LPS로 유도 후 세포 펠렛의 SDS-PAGE/웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다: 알칼리 포스파타제는 비유도된 대조군 세포에서 유도된 세포와 동일한 양으로 HEK 293 및 다른 293 세포(K2 및 K4)에서 발현되고; 이들 세포에서 TLR-활성화 물질, 파이로젠, PAMPs의 특이적 검출은 가능하지 않다.
실시예 3: 96-웰 규모 및 CO 2 -없는 배양에서의 분석
방법
멀티웰 플레이트(96-웰)에서 NIH-3T3 LR-4/CD14 SEAP P40 세포를 100 μL 배지(DMEM 80 mmol/L HEPES, 30% FCS 및 5% DMSO)에서 30,000 세포/웰의 밀도로 현탁하여 -80 ℃에서 동결시켰다.
-80 ℃에서 72 시간 내지 4 주 후, 37 ℃에서 CO2-없이 100 μL 배지를 첨가하여 세포를 해동시켰다.
24 시간 후, 부착을 배지(DMEM 0.5% FCS)로 변경하고 100 μL에서 30 pg/mL LPS 또는 30 pg/mL ssRNA 33(대조군)와 함께 세포를 유도시켰다.
24 시간 후, 검출 배지로 배지 변경을 실시하였다. 대체 방법으로서는, 100 μL/웰 검출 배지를 유도 시간 후 직접 웰에 첨가한다.
결과
도 11은 결과를 보여준다: 늦어도 3 내지 24 시간 후 유도된 효소 활성의 검 출이 뚜렷하다. 검출 배지가 유도 시간 후 웰로 직접 첨가되는 경우, 신호는 1 내지 3 시간 후 검출 가능하다.
실시예 4: CO 2 -없는 배양에서의 조직학
방법
멀티웰 플레이트 상에 NIH-3T3 TLR-4/CD14 SEAP 세포를 100 μL 배지(30% FCS, 80 mmol/L HEPES)에 30,000 세포/웰의 밀도로 접종하였다. CO2 없는 습한 대기 중 37 ℃에서 밤새 부착이 일어났다.
결과
도 10은 웰에서 부착된 세포의 페이스 대조 레코딩을 보여준다: HEPES-완충 배지 중 37 ℃ 가열 캐비넷에서 배양하는 동안 세포가 성장한다. 이 도면은 본래의 세포 단층을 보여준다.
실시예 5: TLR -5-특이적 시험 시스템
방법
TLR -5로 형질감염
세포주 NIH-3T3를 TLR-5 및 리포터 유전자 플라스미드 SEAP로 형질감염시켰다. 방법은 실시예 1에 대응된다.
시험의 시행
NIH-3T3 클론 TLR-5는 0.5% FCS 배지 중 500 μL/웰에서 30,000 내지 200,000 세포/웰(24-웰)의 밀도로 접종하였다; 유도는 2 ㎍/mL 플라젤린으로 일어 나고; 300 μL/웰 BCIP를 갖는 검출 배지로 배양하는 것에 의해 검출.
결과
도 12는 발색 시험의 결과를 보여준다: 유도된 세포의 특이적 청색 착색이 일어났다; 비유도된 대조군 세포는 어떠한 청색 착색도 보여주지 않는다.
본 발명은 내독소 및 다른 파이로젠에 근거한, 병원균 및 병원균 스펙트럼의 정성적 및 정량적 분석과 확인을 위한 방법, 시약 및 키트에 관련된다.

Claims (63)

  1. 게놈 중에 다음을 포함하는, 샘플에서 파이로젠의 특이적 검출을 위한 형질전환 세포:
    (a) 적어도 하나의 톨-유사 수용체(toll-like receptor; TLR)를 코딩하는 유전자 또는 유전자들, 및
    (b) NF-κB에 의해 유도 가능한 프로모터의 발현 제어 하에 있는 적어도 하나의 리포터 유전자.
  2. 제 1 항에 있어서, 세포는 포유동물 섬유모세포(fibroblast)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  3. 제 2 항에 있어서, 세포는 타입 NIH-3T3의 쥐의 섬유모세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항에 있어서, 세포는 제 1 톨-유사 수용체 타입(TLR type)을 코딩하는 유전자 또는 유전자들과, 추가로 제 2 톨-유사 수용체 타입(TLR type)을 코딩하는 유전자 또는 유전자들을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항의 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD14 수용체를 코딩하는 유전자를 추가로 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  6. 제 5 항에 있어서, CD14 수용체는 인간 TLR 타입 4(TLR-4)와 조합하여 공동-발현되는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항의 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자는 분비된 알칼리 포스파타제(secreted alkaline phosphatase; SEAP)를 코딩하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항의 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자는 β-갈락토시다제(β-galactosidase)를 코딩하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항의 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자는 루시퍼라제(luciferase)를 코딩하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항의 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자는 GFP를 코딩하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항의 어느 한 항에 있어서, 유도 가능한 프로모터는 셀 렉틴(selectin, endothelial cell leukocyte adhesion molecule-1; ELAM-1) 프로모터인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 1(TLR-1)을 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 2(TLR-2)를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 3(TLR-3)을 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 4(TLR-4)를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 5(TLR-5)를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 6(TLR-6)을 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 7(TLR-7)을 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 8(TLR-8)을 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 9(TLR-9)를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 10(TLR-10)을 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 1(TLR-1) 및 인간 TLR 타입 2(TLR-2)를 위한 이종이량체 수용체(heterodimeric receptor)를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 6(TLR-6) 및 인간 TLR 타입 2(TLR-2)를 위한 이종이량체 수용체를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR 타입 7(TLR-7) 및 인간 TLR 타입 8(TLR-8)을 위한 이종이량체 수용체를 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항의 어느 한 항에 있어서, 공동수용체(coreceptor) 타입 CD14(MD2)를 추가로 발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
  26. 다음을 포함하는, 샘플에서 파이로젠의 특이적 검출을 위한 키트:
    제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 형질전환 세포를 갖는 배양 용기.
  27. 제 26 항에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트:
    유도 가능한 리포터 유전자에 의해 코딩되는 효소를 위한 기질을 포함하는 검출 배지.
  28. 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트:
    적어도 제 1 TLR 타입을 발현하는 적어도 제 1 형질전환 세포가 제 1 웰에 함유되고, 제 1 형질전환 세포와 다르고 적어도 제 2 TLR 타입을 발현하는 제 2 형 질전환 세포가 제 2 웰에 함유되는, 적어도 2 개의 구획 또는 웰을 갖는 세포 배양 용기 또는 플레이트.
  29. 제 28 항에 있어서, 인간 TLR-1을 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 인간 TLR-2을 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  31. 제 28 항 내지 제 30 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR-3을 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  32. 제 28 항 내지 제 31 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR-4을 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  33. 제 28 항 내지 제 32 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR-5을 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  34. 제 28 항 내지 제 33 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR-6을 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  35. 제 28 항 내지 제 34 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR-7을 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  36. 제 28 항 내지 제 35 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR-8을 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  37. 제 28 항 내지 제 36 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR-9을 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  38. 제 28 항 내지 제 37 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR-10을 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  39. 제 28 항 내지 제 38 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR-2 및 인간 TLR-6의 이종이량체를 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  40. 제 28 항 내지 제 39 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR-2 및 인간 TLR-1의 이종이량체를 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  41. 제 28 항 내지 제 39 항의 어느 한 항에 있어서, 인간 TLR-7 및 인간 TLR-8의 이종이량체를 발현하는 형질전환 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  42. a) 적어도 하나의 톨-유사 수용체(toll-like receptor; TLR) 또는 특이적 TLR 이종이량체를 발현하는, 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 형질전환 세포 및 샘플의 제조,
    b) 샘플을 세포와 접촉시키고,
    c) 샘플-세포 복합체를 배양하여 유도시키고, 그리고
    d) 유도된 리포터 유전자에 의해 중재되는 효소 활성의 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에서 파이로젠의 특이적 검출을 위한 방법에서,
    효소 활성의 검출은 TLR 타입 또는 TLR 이종이량체에 특이적인 파이로젠의 존재를 나타내는 것인 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 단계 d)는 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    d1) 세포의 유도 가능한 리포터 유전자에 의해 코딩되는 효소를 위한 기질을 포함하는 검출 배지의 제조, 그리고
    d2) 유도 가능한 리포터 유전자에 의해 중재되는 효소 활성의 검출을 위한 검출 배지에서 유도된 샘플-세포 복합체의 배양.
  44. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서, 효소 활성은 알칼리 포스파타제 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 기질은 5-브로모-4-클로로인돌릴 포스페이트(BCIP)이고 검출은 청색 변화 및/또는 청색 침전에 의해 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 기질은 p-니트로페닐 포스페이트(pNPP)이고 검출은 용액의 황색 변화에 의해 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 용액의 황색 변화는 광도 측정에 의해 정량화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서, 효소 활성은 β-갈락토시다제 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 기질은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드(X-Gal)이고 검출은 청색 변화 및/또는 청색 침전에 의해 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서, 효소 활성은 루시페라제 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 기질은 임의로 ATP 및 Mg2 +가 추가된 루시페린이고, 검출은 발광(luminescence)에 의해 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서, 효소 활성은 GFP인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 42 항 내지 제 50 항의 어느 한 항에 있어서, 샘플은 인간 또는 동물 신체로부터의 임상적 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 42 항 내지 제 50 항의 어느 한 항에 있어서, 샘플은 의학적 기구 또는 의학적 산물(medical product)의 시험편(specimen)인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 42 항 내지 제 50 항의 어느 한 항에 있어서, 샘플은 약물, 약물 성분, 식품, 식품 성분 또는 식품이나 약물의 원료 물질 또는 출발 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 42 항 내지 제 56 항의 어느 한 항에 있어서, 단계 c) 유도를 위한 샘플-세포 복합체의 배양은 약 37 ℃에서 적어도 약 1 시간 최대 약 24 시간 동안 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 임상적 샘플에서 파이로젠의 특이적 검출을 위한 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항에 따른 형질전환 세포의 용도.
  59. 산물의 비발열성 시험을 위한 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항에 따른 형질전환 세포의 용도.
  60. TLR 길항제의 특성을 갖는 활성 성분의 스크리닝을 위한 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항에 따른 형질전환 세포의 용도.
  61. CpG 모티브를 갖는 올리고뉴클레오티드의 스크리닝을 위한 제 1 항 내지 제 25 항의 어느 한 항에 따른 형질전환 세포의 용도.
  62. 제 58 항 내지 제 61 항의 어느 한 항에 있어서, 제 26 항 내지 제 41 항에 따른 키트가 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  63. 제 58 항 내지 제 61 항의 어느 한 항에 있어서, 제 42 항 내지 제 57 항의 어느 한 항에 따른 방법이 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
KR1020097001520A 2006-07-07 2007-07-05 톨-유사 수용체를 사용한 세포 파이로젠 테스트 KR20090039733A (ko)

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