JP2015051000A - 炎症の予防または軽減のために、細胞表面受容体を調節する方法 - Google Patents

炎症の予防または軽減のために、細胞表面受容体を調節する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】口腔内においてある種が有害であるかどうかを決定して、口腔細菌種を識別する方法、及び薬剤の抗炎症効果を決定する方法の提供。
【解決手段】口腔細菌種の少なくとも一つの細菌、または細菌の一部を、歯肉細胞と接触させる工程、及び、指標化合物の存在を検出する工程を含み、指標物質の実質的な非存在は、その細菌種が有害種ではないことを示す。有害細菌又はその細菌の一部の存在下で、細胞と薬剤とを接触させる工程、及び、指標化合物の存在を検出する工程を含み、指標物質の実質的な非存在は、その薬剤が抗炎症薬剤であることを示す。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明
関連する出願の参照
［0001］ 本明細書は、2006年1月10日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願シリア
ル番号60/757,751の利益を請求し、その内容は本明細書中で参照として援用される。
発明の背景
［0002］ 哺乳類口腔の軟組織は、炎症の最初期の兆候を示すことが知られている。こ
の一般的な低いレベルの炎症は、歯肉炎、及び／または、歯周炎に至る可能性がある。前
記炎症は、少なくとも一部分は、口腔内に存在する細菌による結果であると一般的に考え
られている。さらに、口腔組織の炎症は、手術、局所損傷、外傷、壊死、不適切な口腔衛
生、または様々な全身性の原因により、引き起こされ得る。
［0003］ これらの疾患及び状態に関与する細胞性構成要素には、上皮組織、歯肉線維
芽細胞、及び循環白血球が含まれ、これらすべては細菌により産生される病原因子に対す
る宿主応答に寄与すると、一般的に考えられている。これらの口腔内感染に関与する細菌
性病原体のいくつかは知られているが、多くは未知か、または同定されていないままであ
る可能性がある。これら多数の口腔の疾患において、特定の型の細菌による感染は、しば
しば、病因学的事象であるが、その病状または症状の発症機序は、宿主応答を介する。抗
菌剤の使用は、使用された口腔内の細菌数を減少させ、さらに、炎症の軽減をもたらし得
る。しかしながら、この方法は、前記殺菌が無差別に達せられること（有益な口腔細菌及
び有害な口腔細菌の両方が死に得る）、また、それは用量及び時間に敏感であることより
、不都合である。
［0004］ 口腔組織の細菌感染は、宿主の免疫応答を刺激し、そして、重大な組織損傷
をもたらす炎症性メディエーターをアップレギュレートすることにより、治癒過程を減少
させる。これらの代謝産物は、歯肉炎、歯周炎、骨髄炎、及び他の炎症性疾患の主要なメ
ディエーターであると指摘されている。
［0005］ 炎症機構の一つは、哺乳類の特定の膜貫通受容体を介することが報告されて
いる。例えば、Toll様受容体（TLR）は、糖鎖付加された膜貫通タンパク質であり、リガ
ンド誘導性のオリゴマー化によって一度活性化されると、細胞内で免疫応答を開始し、最
終的に、サイトカイン、インターロイキン、及び、炎症状態を仲介するその他の分子の発
現をもたらす。
［0006］ 専門分野において、このような炎症効果の診断、治療、及び予防に有用な，
薬剤及び技術が必要とされている。
発明の概要
［0009］ 本発明には、口腔内においてある種が有害であるかどうかを決定して、口腔
細菌種を識別する方法が含まれる。前記方法には、口腔細菌種の少なくとも一つの細菌、
または細菌の一部を、歯肉細胞と接触させる工程、及び、指標化合物の存在を検出する工
程が含まれる。指標物質の実質的な非存在は、その細菌種が有害種ではないことを示す。
［0010］ 薬剤の抗炎症効果を決定する方法もまた、本発明の範囲内に含まれる。前記
方法には、有害細菌またはその細菌の一部の存在下で、細胞と薬剤とを接触させる工程、
及び、指標化合物の存在を検出する工程が含まれる。指標物質の実質的な非存在は、その
薬剤が抗炎症薬剤であることを示す。
発明の詳細な説明
［0011］ 本発明は、(1)有害細菌種と有益な口腔細菌とを識別する方法、及び(2)特定
の薬剤の抗炎症効果を決定する方法を提供する。トリクロサンを使用して、細胞における
Toll様受容体の調節を防ぐ方法もまた、提供する。
［0012］ 本明細書中で使用される場合、“炎症”とは、組織の損傷または破壊によっ
て誘導される、有害物質及び損傷組織の両方を、破壊、減弱、または隔離する、局所的な
保護応答をいう。急性の形態では、痛み、熱、赤み、及び、腫れ、により特徴づけられる
。組織学的には、炎症は、透過性の上昇及び血流の増加を伴う細動脈、毛細血管、及び小
動脈の拡張；血漿タンパク質を含む液体の滲出、及び、炎症部位への白血球の移動を含む
、複雑な一連の事象を伴う。炎症は、炎症促進性細胞メディエーター、または例えば、抗
原と抗体との相互作用の結果としてまたは感作されたリンパ球への抗原の作用によって放
出される物質のレベルの上昇に応答する。ひいては、抗炎症薬剤は、薬剤処理をされてい
ない同様の細胞と比較して、細胞におけるこれら組織学的効果の質、及び／または量を減
少させるあらゆるものである。
［0013］ 本発明は、一つには、口腔において特定の細菌種または株が有害であるかど
うかを決定するために、その細菌種または株を評価する方法を提供する。“有害である”
とは、その存在が、作用された細胞による炎症メディエーターの産生をもたらす、病原細
菌を意味する。いくつかの細菌株／種は、有害であることが報告されており、下記表1の
ものが含まれる：
Figure 2015051000
表1：有害であることが報告されている口腔細菌
［0014］ 本方法には、評価される口腔細菌の少なくとも一つの細菌種または株を、少
なくとも一つの歯肉細胞と接触させることが含まれる。あるいは、歯肉細胞は、細菌の一
部、細胞膜、細胞質内容物、細菌の代謝最終産物若しくは代謝副産物、及び／または毒性
因子と、接触され得る。
［0015］ この工程は、例えば、細菌または細菌の一部の培養、及び歯肉細胞の培養を
維持し、そして、それらの培養物を混ぜ合わせることによって、in vitroで行われ得る。
あるいは、接触は、口腔への適切な運搬ビヒクル中の細菌培養物の適用によって、in viv
oで行われ得る。
［0016］ 前記接触の後、一つまたはそれ以上の指標物質が検出され得る。そのような
指標物質には、中間化合物、酵素、タンパク質、RNA、DNA、及び、サイトカイン及び他の
炎症促進性メディエーターの細胞内産生に関与する他の分子を含む、通常の宿主の免疫応
答の経過において産生されることが既知であるか、または発見されるべきあらゆるものが
含まれる。好ましくは、指標物質は、（例えば図2に示されるように）Toll様受容体のい
ずれかの調節によって産生されるものであり、それには例えばTLR2、3、4、5、7及び9、N
Fk-B経路の分子、サイトカイン、インターロイキン（例えば1、6、8、12）、腫瘍壊死因
子（TNF）、ペプチダーゼ、及び、インターロイキンをコードする、またはTNFサブユニッ
ト及び／またはインターロイキンをコードするmRNA、ケモカイン（例えばCCL5、CCL4、CC
L3、及びCC10）、及び、マトリックスメタロプロテアーゼが含まれる。
［0017］ 選択された指標物質の検出は、専門分野において既知または開発中の、いか
なる様式においても行うことができ、また、相対測定、または、絶対測定であり得る。検
出は、選択された指標物質の量の直接測定により達せられ得る。あるいは、放射性及び／
または蛍光マーカー、抗体、特異的な遺伝子の遺伝子発現レベルの変化、mRNA分析、マイ
クロアレイ分析、及び／または、抗酸化状態の変化といった、さらなる検出系を用いる、
間接的な測定により達せられ得る。例えば、指標物質が酵素である場合、試料を適切な基
質にさらし、そして酵素触媒反応の最終産物を測定して、酵素指標物質の存在または非存
在を決定し得る。発明のこの観点での実施において、選択された指標物質の実質的な非存
在は、細菌種／株が有害ではない、すなわち、炎症促進性メディエーターの産生を開始さ
せるといった様式で、細胞に影響を及ぼさないことを示す。
［0018］ 本発明にはまた、特定の薬剤の抗炎症能または効果、すなわち、病原性細菌
に暴露された組織において炎症を軽減または除去する薬剤の効能を、評価する方法が含ま
れる。本方法には、評価される薬剤の選択が含まれる。前記薬剤は、タンパク質、ペプチ
ド、有機分子、無機分子、または同様のものいずれかの結合物であり得る。
［0019］ いくつかの状況下で、評価のため選択される薬剤は口腔において顕著な殺菌
効果を示さないことが望ましいであろう。例えば、薬剤は、最小阻止濃度（MIC）が0、約
5％より少ない、約10％より少ない、約20％より少ない、及び、約30％より少ない値を示
すものより選択され得る。
［0020］ MIC検査には、一般に、適切な溶媒中での活性薬剤溶液の調製、及び、それ
に続く可溶化された活性物の連続的希釈が含まれる。選択された細菌（これらは、各細菌
が、独自の特殊化した増殖及び操作プロトコールを必要とする、一連の細菌であり得る）
の標準懸濁液を、各濃度の希釈された活性物に加える。細菌＋活性物は37℃で、適切な条
件下で培養され、そして細菌の増殖は、通常、48時間の培養の後に測定される。
［0021］ MIC検査の対照には、添加した溶媒または賦形剤の非存在下での細菌増殖を
測定する、増殖対照が含まれる。さらなる対照は、試験に使用される培地の無菌性を測定
する。活性薬剤を可溶化するのに使用される溶媒の細菌への効果は、これらの検査におい
て含まれる最終の一連の対照である。
［0022］ 培養に続いて、プレートを、マイクロプレート分光光度計で610 nmで測定す
る。結果から、細菌増殖を阻害する活性薬剤の最低濃度として読みとる。高い活性濃度で
は、細菌は増殖せず（測定値は低い吸光度を示す）、また、低い活性濃度では、細菌は増
殖する（測定値は高い吸光度を示す）。細菌増殖を停止させる最も低い活性濃度は、MIC
として定義される。対照は以下の結果となる：
［0023］ 培地の無菌性-細菌の増殖なし
［0024］ 細菌増殖の測定-培養は十分な増殖の証明を示す。
［0025］ 活性薬剤の可溶化に使用される溶媒は細菌を阻害するべきではない（それら
は基本的に無害でなければならない）。
［0026］ 特定の薬剤の抗炎症能または効果を評価する方法には、細胞を病原性または
有害な細菌と接触させる工程が含まれる。接触させる細胞は、in vitroまたはin vivo、
原核細胞または真核細胞であってよく、また、培養細胞株または臨床試料より入手されて
もよい。
［0027］ 本方法における使用に適した病原性または有害な細菌には、選択される細胞
に免疫応答を誘導するように作用する、専門分野で既知または発見されるべきあらゆるも
のが含まれる。前記細菌には、例えば上記表1に記載されるものが含まれ得る。
［0028］特定の薬剤の抗炎症能または効果を評価する方法には、一つまたはそれ以上の
指標化合物の存在または非存在を検出する工程が含まれる。指標化合物及び検出方法と検
出系は、上述されるもののいずれかであり得る。
［0029］また、本発明には、口腔組織細胞とトリクロサンとの接触によりその細胞上の
Toll様受容体の調節を防ぐ方法とともに、上述のアッセイにより、抗炎症効果を示すこと
が見い出された薬剤を含有する、経口製剤が含まれる。
［0030］ 発明はまた、トリクロサンといった化合物を、組織へのMIC以下の濃度で適
用することにより、口腔組織の炎症を軽減または予防する方法も提供する。MIC以下の濃
度によって。
［0007］ 図1は、微生物と接触する細胞の表面を示す概略図である。 ［0008］ 図2は、Toll様受容体（TLR）1、2、3、4、5、6、7及び9のシグナル経路を、各TLRの調節により産生される様々な分子とともに示す。

Claims (26)

  1. （a） 口腔細菌種の少なくとも一つの細菌、または細菌の一部を、歯肉細胞と接触、
    させる工程；及び、
    （b） 指標化合物の存在を検出する工程
    を含む、口腔細菌種を識別する方法であって、この場合、指標物質の実質的な非存在は、
    その細菌種が有害種ではないことを示す、前記方法。
  2. 歯肉細胞がin vitroのものである、請求項1の方法。
  3. 歯肉細胞が、哺乳類の口腔内のin situのものである、請求項1の方法。
  4. 指標物質が、Toll様受容体の調節によって産生される分子からなる群より選択される、
    請求項1の方法。
  5. 指標物質が、TLR2、TLR3、及びTLR4の調節によって産生される分子からなる群より選択
    される、請求項1の方法。
  6. 指標物質が、TLR5、TLR7、及びTLR9の調節によって産生される分子からなる群より選択
    される、請求項1の方法。
  7. 指標物質が、NF-κB経路の分子からなる群より選択される、請求項1の方法。
  8. 指標物質が、サイトカイン及びインターロイキンからなる群より選択される、請求項1
    の方法。
  9. 指標物質が、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、及びTNF-αからなる群より選択される、請求
    項1の方法。
  10. 指標分子が直接的に検出される、請求項1の方法。
  11. 指標物質が間接的に検出される、請求項1の方法。
  12. 少なくとも一つの細菌が、臨床試料より入手される、請求項1の方法。
  13. 有害細菌またはその細菌の一部の存在下で、細胞と薬剤とを接触させる工程、及び、指
    標化合物の存在を検出する工程を含む、薬剤の抗炎症効果を決定する方法であって、この
    場合、指標物質の実質的な非存在は、その薬剤が抗炎症性薬剤であることを示す、前記方
    法。
  14. 細胞が原核細胞である、請求項13の方法。
  15. 細胞が真核細胞である、請求項13の方法。
  16. 指標物質が、Toll様受容体の調節によって産生される分子からなる群より選択される、
    請求項13の方法。
  17. 指標物質が、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7及びTLR9の調節によって産生される分子か
    らなる群より選択される、請求項13の方法。
  18. 指標物質が、NF-κB経路の分子からなる群より選択される、請求項13の方法。
  19. 指標物質が、サイトカイン及びインターロイキンからなる群より選択される、請求項
    13の方法。
  20. 指標物質が、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、及びTNF-αからなる群より選択される、請求
    項13の方法。
  21. 指標分子が直接的に検出される、請求項13の方法。
  22. 薬剤が、約20％より少ないMICを示す薬剤より選択される、請求項13の方法。
  23. Toll様受容体とトリクロサンとを接触させることを含む、哺乳類口腔細胞においてToll
    様受容体の調節を防ぐ方法。
  24. 細胞が歯肉細胞である、請求項23の方法。
  25. Toll様受容体が、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7及びTLR9より選択される、請求項23の
    方法。
  26. 口腔組織の炎症を軽減または予防する方法であって、その方法が、MIC以下のレベルで
    組織にトリクロサンを適用することになる濃度のトリクロサンを含む組成物を、口腔組織
    へ適用することを含む、前記方法。
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