TWI481870B - 用於軟組織疾病診斷及作為用於口腔保健干預的標靶之蛋白質生物標記 - Google Patents

用於軟組織疾病診斷及作為用於口腔保健干預的標靶之蛋白質生物標記 Download PDF

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TWI481870B
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Description

用於軟組織疾病診斷及作為用於口腔保健干預的標靶之蛋白質生物標記
此處描述用以鑑定可應用於治療口腔的疾病或病況之化合物的方法。
就某個方面來說，牙周病的特徵在於牙周有機基質異常並過度地分解。這個基質包括牙齦(gingiva)、牙周韌帶(periodontal ligament)、齒堊質(cementum)以及齒槽骨(alveolar bone)。這些結果導致牙周炎(periodontitis)的臨床表現，包括牙齦萎縮(gingival recession)、牙周袋形成(pocket formation)、喪失接附(loss of attachment)以及最終牙缺失。受牙周病影響的牙周組織生成一些不同的發炎媒介物。若發生牙周病時，這些媒介者中的一些被觀察到在破壞過程中似乎扮演核心角色，引領若干研究者細查使用某些發炎媒介物作為針對進行性損傷(progressive lesions)的生物標記的可能性(Sorsa,T. et al. Arch. Oral. Biol. 35: 193S-196S,1990;Page,R. C.,J. Periodont. Res. 26:230-242,1991)。
本發明包括一種用以診斷一哺乳動物體內的牙周病的方法，包含有：從該哺乳動物獲得一牙齦和/或唾液樣本、偵測一生物標記在該牙齦樣本中的存在、偵測該生物標記在該樣本中的位準，以及依據偵測到的生物標記位準診斷該生物帶有牙周病。
一生物標記是選自於下列所構成之群組中的至少一者：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13。
本發明亦包括一種用以診斷一哺乳動物體內的牙周病的方法，包含有從該哺乳動物獲得一牙齦和/或唾液樣本、偵測一生物標記在該樣本中的存在、偵測該生物標記在該樣本中的位準、將該生物標記在該樣本中的位準與和牙周病的生物標記位準相關聯的預定參考值比較，以及當該樣本中的生物標記位準對應於和牙周病相關聯的預定參考值的生物標記位準時，診斷該哺乳動物帶有牙周病。
本發明亦包括一種用以診斷一哺乳動物體內的牙周病的方法，包含有從該哺乳動物獲得一牙齦和/或唾液樣本、偵測一生物標記在該樣本中的存在、偵測該生物標記在該樣本中的位準、將該生物標記在該樣本中的位準與一對照組樣本中的相同生物標記的位準比較，其中當偵測到該生物標記在該生物樣本中的位準相對於該對照組樣本改變時，該哺乳動物被診斷帶有牙周病。
在一個方面，生物標記在該樣本中的位準相對於對照組樣本還多。
本發明包括一種用以偵測一哺乳動物體內的牙周病的生物標記平台(panel)，其包含有兩個或多個選自於下列所構成之群組中的生物標記：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13，其中該等生物標記是得自於一被診斷為帶有牙周病的哺乳動物的一牙齦和/或唾液樣本。
本發明進一步包括一種用以監測一哺乳動物體內的牙周病的方法，包含有在一第一時間點從該哺乳動物獲得一第一牙齦和/或唾液樣本、在一第二時間點從該哺乳動物獲得一第二牙齦和/或唾液樣本、偵測至少一生物標記在該第一與第二樣本中的存在、偵測該至少一生物標記在該第一與第二樣本中的位準，以及比較生物標記在該第一與第二樣本中的位準，其中相對於該第一樣本，該生物標記在該第二樣本中的減低表示哺乳動物體內的牙周病減少。
本發明包括一種用以治療一哺乳動物體內的牙周病的方法，包含有令一細胞與一下調至少一個選自於下列所構成之群組中的劑接觸：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13，其中生物標記(等)的下調與和牙周病有關的至少一症狀相關聯。
本發明亦包括一種鑑定一種可用於治療一哺乳動物體內的牙周病的方法，該方法包含有令一細胞與一測試化合物接觸以及決定該測試化合物是否會下調至少一選自於下列所構成之群組中的生物標記：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13，其中生物標記(等)的下調表示該測試化合物可應用於治療牙周病。
本發明進一步包括一種用以診斷一哺乳動物體內的齒齦炎(gingivitis)的方法，包含有從該哺乳動物獲得一牙齦和/或唾液樣本、偵測一生物標記在該樣本中的存在、偵測該生物標記在該樣本中的位準、依據偵測到的生物標記位準診斷該生物帶有齒齦炎。
本發明亦包括一種用以診斷一哺乳動物體內的齒齦炎的方法，包含有從該哺乳動物獲得一牙齦和/或唾液樣本、偵測一生物標記在該樣本中的存在、偵測該生物標記在該樣本中的位準、將該樣本中的生物標記位準與和齒齦炎的生物標記位準相關的預定參考值比較，以及當該生物標記在該樣本中的位準對應於與齒齦炎相關聯的參考值的生物標記位準時，診斷該哺乳動物帶有齒齦炎。
本發明亦包括一種用以診斷一哺乳動物體內的齒齦炎的方法，包含有從該哺乳動物獲得一牙齦和/或唾液樣本、偵測一生物標記在該樣本中的存在、偵測該生物標記在該樣本中的位準，以及生物標記在該樣本中的位準與一對照組樣本中的相同生物標記相比較，其中當在該牙齦和/或唾液樣本中偵測到生物標記位準相對於對照組樣本增加時，該哺乳動物被診斷帶有齒齦炎。
本發明包括一種用以監測一哺乳動物體內的齒齦炎的方法，包含有在一第一時間點從該哺乳動物獲得一第一牙齦和/或唾液樣本、在一第二時間點從該哺乳動物獲得一第二牙齦和/或唾液樣本、偵測至少一生物標記在該第一與第二樣本中的存在、偵測該至少一生物標記在該第一與第二樣本中的位準，以及比較生物標記在該第一與第二樣本中的位準，其中相對於該第一樣本，在該第二樣本中該生物標記位準相對於該第一樣本減低表示減低哺乳動物的齒齦炎。
本發明亦包括一種用以治療一哺乳動物體內的齒齦炎的方法，包含有令一細胞與一下調至少一選自於下列所構成之群組中的劑接觸：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13，其中下調至少一生物標記與和減低齒齦炎有關的至少一症狀相關聯。在一個方面，生物標記位準回復到被認可為正常的位準。在另一個方面，生物標記位準回復到基線位準。
本發明亦包括一種鑑定一可應用於治療一哺乳動物體內的齒齦炎的方法，該方法包含有令一細胞與一測試化合物接觸以及決定該測試化合物是否會下調至少一選自於由下列所構成之群組中的生物標記：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13，其中下調至少一生物標記表示該測試化合物可應用於治療齒齦炎。
詳細說明
在本技藝中需要針對生物標記位準的診斷和/或預測試驗，包括在牙周病狀態下會升高的生物標記。此等生物標記包括FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13。在本技藝中也需要針對牙周病的診斷和/或預測試驗，它們可以評估發炎媒介物在一牙齦樣本(諸如齦溝液(gingival crevicular fluid,GCF))或在一唾液樣本中的位準。另外，亦需要在有需求的患者中針對牙周病的療法，其包含有抑制FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13的一或多者的升高位準。
舉例來說，基質金屬蛋白質13(matrix metalloprotease 13,MMP-13；亦熟知為CLG3)在牙周炎以及牙周病中是一個主要的破壞性膠原蛋白酶。MMP-13可以在患病的牙周組織與齦溝液，還有唾液中發現到。此酵素的位準與牙周炎臨床指標是正相關的。換言之，升高，或”高於正常”的MMP-13位準是牙周病的徵兆。可以MMP-13酵素、RNA或生物活性為材料來測量。抑制MMP-13的活性和/或出現可應用於治療牙周病。
如此處所提及的牙周病的下列生物標記也可以使用個別的酵素、蛋白質、RNA或生物活性來偵測或測量到的位準。升高或”超過正常的”位準的下列生物標記，不論是單獨或與一或多者彼此組合，亦為牙周病的徵兆。至於MMP-13，抑制MMP-13的活性和/或出現可應用於治療牙周病：FAS(亦知曉為ALPS1A和APO-1)涉及細胞凋亡，並且形成”DISC”，一種在結合配位子之後誘發死亡的傳訊複合物。
介白素1-β(IL-1B)是一種發炎性細胞激素，涉及抵禦感染的哺乳動物免疫反應。
介白素8(IL-8；亦知曉為3-10C以及AMCF-1)是C-X-C趨化素家族的一員，並且在標的嗜中性球顆粒球中涉及誘發趨化性(chemotaxis)作為先天性免疫反應的一部份。
基質金屬蛋白酶9(MMP-9；亦知曉為GELB與CLG4B)是一種明膠酶(gelatinase)，它在牙周病中也是一個主要的破壞性基質金屬蛋白酶。
防禦素β4(defensin beta 4)(DEFB4；亦知曉為BETA2與DEFB-2)是一種防禦素。DEFB4是一種受到發炎所局部調節的抗生素肽。
細胞自溶酶S(cathepsin S)(CTSS；亦知曉為MGC3886)，C1肽酶家族的一員，是一種對MHCII型分子展示抗原性蛋白質/肽扮演角色的半胱胺酸蛋白酶(cysteine protease)。
介白素17B(IL-17B；亦知曉為IL-20)是一種IL-17相關的細胞激素。IL-17B刺激IL-1B與TNF-α從單核球釋出。
硫胱胺酸蛋白酶徵召領域家族成員10(casspase recruitment domain family member 10)(CARD10；亦知曉為BIMP1與CARMA3)涉及細胞凋亡傳訊。CARD10也會活化NF-κ-B並且屬於與細胞膜相關聯的鳥酸激酶家族(guanylate kinase family)。
雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan)(BGN；亦知曉為DSPG1與PG-S1)是一種含有兩個附接的醣胺聚多醣鏈(glycosaminoglycan chains)的基質蛋白多醣，且與核心蛋白聚糖(decorin)相關。咸信會結合到膠原蛋白纖維並轉讓(transfer)生長因子β。
B-因子、裂解素(properdin)(BF；亦知曉為CFAB與GBG)是補體活化的替代路徑的一個組分。活化的次單位是涉及預活化之B淋巴球增生的絲胺酸蛋白酶(serine protease)。
介白素12A(IL-12A；亦知曉為CLMF)是一種作用於T細胞以及自然殺手細胞的細胞激素，並且涉及Th1以及Th2細胞的分化，還有干擾素γ的T-細胞依賴性誘導。
介白素6(IL-6；亦知曉為BSF2與HGF)是一種活化細胞表面傳訊複合物的免疫調節性細胞激素。它扮演前-以及抗-發炎性細胞激素，並且刺激對創傷的免疫反應，包括對外來病原體的反應。
脂籠蛋白8(lipocalin 8,LCN8)在哺乳動物中隸屬於涉及免疫系統所致之發炎與解毒作用過程的蛋白質的一個家族。
乳過氧化酶(lactoperoxidase)(LPO；亦知曉為SPO)是一種涉及宿主抵禦對抗感染的抗氧化酵素。
如通篇所使用的，範圍用作為描述各個與每個在該範圍內之數值的簡略表達方式。在該範圍內的任何數值可以選定作為範圍的末端。另外，所有此處引用的參考文獻以它們的整體併入作為參考文獻。若本揭示內容中的定義與引用參考文獻中的定義有衝突，本揭示內容決定。
“牙周病”，如此處所使用的術語，涵括牙周炎、齒齦炎以及齒齦疾病。
“齒齦炎”，如此處所用的，意謂牙齦組織的發炎，一種在牙齦內發炎的病況並且在骨頭以及牙周韌帶中沒有損傷。
如此處所用的，術語“牙周炎”意指牙周有機基質(包括齒齦、牙周韌帶、齒堊質以及齒槽骨)的異常或過量分解。牙周炎的臨床表現包括，但不限於，牙齦萎縮、牙周袋形成、喪失基質接附以及齒與骨缺失。齒齦炎的特徵在於早期牙周炎、中度牙周炎或重度牙周炎。不過，齒齦炎不應限定為僅有那些在此處所提出的症狀與後遺症，就像為習於該項技藝者所理解的。在其他的症狀中，早期牙周炎的臨床表現是下列一或多者：在探測(probing)之後出血；出現牙周袋(3至4 mm)；局部區域萎縮；接附喪失(3至4 mm)；骨缺失(例如，水平的)；以及第I型根叉侵犯區(class I furcation invasion areas)。在其他的症狀中，中度牙周炎的臨床表現是下列一或多者：出現牙周袋(4至6 mm)；出現接附喪失(4至6 mm)；在探測之後出血；第I級和/或第II級根叉侵犯區；第I型牙可動性(tooth mobilith)；骨缺失(例如，水平和/或垂直)；以及1/3的支撐齒槽骨喪失(亦即，齒冠對齒根比為1：1)。重度牙周炎的臨床表現是下列一或多者：在探測之後出血；出現牙周袋(超過6 mm)；接附喪失(超過6 mm)；第II級和/或第III級根叉侵犯區；第II型和/或第III型牙可動性；骨缺失(例如，水平和/或垂直)；以及超過1/3的支撐齒槽骨喪失(亦即，齒冠對齒根比為2：1或更多)。牙周炎被區分為小類，包括，但不限於：成人牙周炎(例如與菌斑相關的)；早發型牙周炎(例如，青春前期、青少年、快速進展型以及類似者)；與全身性疾病有關的牙周炎；壞死性潰瘍性牙周炎(necrotizing ulcerative periodontitis)；頑固性牙周炎(refractory periodontitis)；植體周圍組織炎(peri-implantitis)以及類似者。
術語“治療(treating)”，如此處所用的，意指在令一哺乳動物與本發明的一口服組成物接觸和/或依據本發明的一方法之後可偵測到負面病況改善或減輕病況的症狀。
術語“治療牙周炎”將理解為包括在哺乳動物體內預防牙周炎，以及在哺乳動物體內抑制一或多種與牙周炎有關聯的現存病況的進展。如此處所用的，術語“抑制(inhibit)”以及“抑制(inhibition)”意指與未經處理(諸如治療性處理和/或預防結果)的病況相較之下，部分抑制或完全抑制牙周炎。因此，依據本發明治療牙周炎包括減少、抑制、改善、減輕、減小、停止或根除一或多種此處所提及的症狀和/或後遺症。
如此處所用的，“病理性過量(pathological excess)”意指活性超過一個可接受的正常位準。舉例來說，“病理性過量”的基質金屬蛋白酶活性通常是一個超過在非疾病狀態中所發現到的位準的基質金屬蛋白酶活性位準。如此處所用的，“病理性過量的基質金屬蛋白酶活性”是一個與牙周炎有關的基質金屬蛋白酶活性位準。
如此處所用的，術語“基線(baseline)”意指在一不良事件(adverse event)之前一藥劑(例如，生物標記)存在於一個體體內的位準，或者是一在治療性處理之後可能存在的位準。一生物標記的“基線”位準，例如，可以是被認為會反映“正常的”或“健康的”個體的生物標記位準。另擇地，一生物標記的“基線”位準可以反映存在於牙周病發病之前的位準，其中生物標記的位準在牙周病發病之前可能因為與牙周病不相干的病況而上升超過“正常的”或“健康的”位準。在第二個實例中，治療個體而使生物標記位準回復到“基線”位準可以反映出“治療牙周炎”，儘管在這個實例中基線位準已上升超過一個可接受的“健康”位準。
如此處所用的，術語“下調(down regulate)”意指減少酵素活性、減少酵素活性的位準、減少蛋白質和/或編碼此蛋白質之核酸的位準，或降低一蛋白質(諸如MMP-8、MMP-9以及MMP-13的一或多者)的存在的生化效用。
術語“牙齦樣本(gingival sample)”，如此處所用的，意指得自於，在或鄰近牙齦的組織、細胞、液體。
“齦溝液(gingival crevicular fluid)”以及“GCF”，如此處所用的，意指在齦溝中收集從鬆弛的牙齦滲出而生成的血漿的滲出液(transudate)。
如此處所用的，術語“診斷”意指決定或偵測特定疾病、病症、醫學病況或風險的存在。
“前齒齦炎病況(pre-gingivitis condition)”，如此處所用的術語，意指一種不完全涉及齒齦炎的病況，而是“正常”以外的任一種傾向齒齦炎的病況，以及一種若置之不理的話可能發展出齒齦炎的病況。
如此處所用的，術語“偵測試劑”意指一種生物或化學實物。一“偵測劑”可以是一種添加至一組成物的額外試劑，或者它可以是一個組成物的一種起始成分，扮演一偵測劑(例如，可見FRET抗體技術)。
本發明的若干具體例提供鑑定一種可應用於治療口腔的疾病或病況之化合物的方法，該方法包含有：從一受口腔的疾病或病況所苦的哺乳動物獲得一第一牙齦樣本；從該哺乳動物的口腔獲得一第二牙齦樣本；令該第一樣本與一測試化合物接觸；令該第二樣本與一正對照組接觸，其中該正對照組是一種已知會下調一或多種生物標記表現的化合物；測量該等生物標記的一或多者的表現受到該測試化合物下調的程度；測量該等生物標記的一或多者的表現受到該正對照組下調的程度；以及將該等生物標記的一或多者的表現受到該測試化合物下調的程度與該等生物標記的一或多者的表現受到該正對照組下調的程度相比較；其中將該等生物標記的一或多者的表現下調至與該正對照組相同或更大的程度的測試化合物，是一種可應用於治療口腔的疾病或病況的化合物。
在若干具體例中，該一或多種生物標記是選自於下列所構成的群組：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13。在又一個具體例中，該正對照組下調FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13的表現。
在若干具體例中，口腔的疾病或病況是齒齦炎或牙周炎。
在若干具體例中，該正對照組是鹵化聯苯醚。在其他具體例中，該正對照組是三氯沙(triclosan)。
又其他的具體例提供方法，其中該測試化合物將該等生物標記的一或多者的表現下調至要比該正對照組還大的程度。
在若干具體例中，該測試化合物將FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13的表現下調至要比該正對照組還大的程度。在進一步的具體例中，該正對照組下調MMP-9的表現。在又其他的具體例中，該正對照組下調MMP-13的表現。
在一個方面，本發明的特徵在於用以診斷一哺乳動物體內的牙周病的方法，包含有從該哺乳動物獲得一牙齦樣本、偵測一生物標記在該牙齦樣本中的存在、偵測該生物標記在該牙齦樣本中的位準，依據所偵測到的生物標記位準診斷該生物帶有牙周病。該生物標記是選自於下列所構成之群組的至少一者：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13。在一具體例中，一哺乳動物是一人類。
一牙齦樣本可以是藉由任一種目前該技藝中所熟知，或未被發現的方法獲得。亦即，該發明不限於取得一牙齦樣本的方法。藉由一個非限定實例，一牙齦樣本可以透過從口腔獲得一口部組織樣本而被獲得。牙齦樣本，包括牙齦生物檢體，是依據慣常的牙科操作程式所獲得的。口部組織包括，但不限於得自於口腔的纖維母細胞以及上皮細胞，以及得自於牙周膜(periodontum)與牙齦的組織和/或細胞樣本。
習於技藝者將理解到如何鑑定牙齦樣本中的一個生物標記，包括一與牙齦樣本有關和/或由牙齦樣本分泌的生物樣本。一個用於偵測一生物標記的存在的例示性方法，包含有從一測試個體的口腔獲得一牙齦樣本以及令該樣本與能夠偵測一或多種此處所述的生物標記(例如，MMP-9或MM-13)的一化合物或一劑，例如，生物標記核酸(例如，尤其是mRNA、基因組DNA)或由該生物標記核酸所編碼的生物標記肽(例如，尤其是肽片段或蛋白質)接觸，以使得在生物樣本中偵測到一生物標記核酸或由該核酸編碼的生物標記肽的存在。在一個具體例中，用以偵測生物標記mRNA或生物標記基因組DNA的一劑是一個能夠與生物標記mRNA或基因組DNA雜交的標記核酸探針。該核酸探針可以是，例如，一個全長生物標記核酸或其蛋白質。供使用於本發明的診斷分析的其他適當探針描述於此處。
在另一個具體例中，用以偵測生物標記肽的一個劑是一種能夠結合到一生物標記肽的抗體，諸如一種帶有一可偵測到的標記的抗體。抗體可以是多株或單株。可以使用一個完整的抗體，或其片段(例如，Fab或F(ab’)2 )。關於探針或抗體，術語“經標記(labeled)”意欲涵括藉由將一可偵測到的物質偶合(亦即，物理連結)到探針或抗體而直接標記探針或抗體，以及藉由與另一個直接標記的試劑的反應間接地標記探針或抗體。間接標記的實例包括使用一螢光標記的二級抗體偵測一級抗體以及以生物素在末端標記的DNA探針，以使得它能夠以螢光標記的鏈抗生物素蛋白被偵測到。
如此處所使用的術語，“牙齦樣本”(以及術語“生物樣本”)意欲包括分離自一個體之口腔的組織、細胞以及生物性液體，以及存在於一個體的口腔內的組織、細胞以及液體。一個唾液樣本可以或可以不含有與牙齦相同的某些或全部組分。亦即，本發明的偵測方法可用來在活體外以及活體內偵測一生物樣本中的生物標記mRNA、肽(例如，蛋白質)，或基因體DNA。藉由非限定實例，用於偵測生物標記mRNA的活體外技術包括北方雜交以及原位雜交。用於偵測生物標記肽的活體外技術包括酵素結合免疫吸附分析法(ELISAs)、西方墨點法、免疫沉澱法以及免疫螢光法。用於偵測生物標記基因組DNA的活體外技術包括南方雜交。用於偵測生物標記肽的活體外技術包括將一經標記的抗-生物標記抗體引入至一個體的口腔內。舉例來說，該抗體可標記有一放射性生物標記，它在一個體中的存在以及位置可以藉由標準成像技術而被偵測到。
生物標記的位準可以使用任一種該技藝中所熟知，或尚未被發現的方法而被定量。亦即，本發明不限制定量一生物標記的方法。用於定量一生物標記的方法可包括那些在這裡的其他地方所提出的用於偵測生物標記的方法，或者此等方法的適當修飾，有如為那些習於技藝者所理解的。在一個具體例中，一種以ELISA為基礎的分析用來定量一生物標記(例如，使用PGE2 定量IL-1B)。在另一個具體例中，一種以流式細胞儀為基礎的方法用來定量一生物標記(例如，LUMINEX技術，包括流式細胞儀與以雷射為基礎的偵測)。
在一個方面，當一個選自於由下列所構成之群組的生物標記上升超過在該技藝中被認為是正常的位準時，一個哺乳動物被診斷為帶有牙周病：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13。將理解到任一種特定的生物標記的“正常”位準可能是一個單獨的數值，或者它實際上可以是生物標記的一個濃度範圍。生物標記的一“正常”位準與健康狀態，或者與沒有或本質上沒有牙周病的健康狀態相關。此等數值以及範圍在該技藝中為已知的，或者可以由習於技藝者使用該技藝中所熟知的方法(包括，但不限於，對得自於已知不帶有牙周病，或另擇地牙周病的症狀的哺乳動物的個體族群之牙齦樣本實施生物標記偵測分析)來確認。在另一個具體例中，就一個特定哺乳動物個體而言，生物標記的“正常”位準可以針對那個特定的哺乳動物個體在該哺乳動物個體已知不帶有牙周病，或牙周病的症狀之時而決定。
一生物標記的“正常”位準、數值或範圍可在哺乳動物體內使用作為有關牙周病不存在，或本質上不存在的預定參考值。在另一個方面，一個超過生物標記的正常值或範圍的數值可在哺乳動物體內使用作為有關牙周病存在的預定參考值。
在一個具體例中，一種用以在一哺乳動物體內診斷牙周病的方法包含有從該哺乳動物獲得一牙齦和/或唾液樣本、偵測一生物標記在該樣本中的存在、偵測該生物標記在該樣本中的位準，以及將該生物樣本中的生物標記位準與和牙周病的生物標記位準有關的預定參考值相比較；以及當該樣本中的生物標記位準對應於與牙周病的之參考值的生物標記位準時，診斷該哺乳動物帶有牙周病，其中該生物標記是選自於下列所構成之群組中的至少一者：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13。在一個具體例中，該牙周病是牙周炎。在另一個具體例中，該牙周病是齒齦炎。
在另一個具體例中，一種用以診斷一哺乳動物體內的牙周病的方法包含有從該哺乳動物獲得一牙齦和/或唾液樣本、偵測一生物標記在該樣本中的存在、偵測該生物標記在該樣本中的位準、將該牙齦和/或唾液樣本中的生物標記位準與一對照組樣本中的同一生物標記的位準相比較，其中當在該牙齦和/或唾液樣本中偵測到生物標記相對於該對照組樣本改變位準時，診斷該哺乳動物帶有牙周病，其中該生物標記是選自於下列所構成之群組中的至少一者：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13。在一個方面，該牙齦和/或唾液樣本中的生物標記位準相對於該對照組樣本還大。在一個具體例中，該牙周病是牙周炎。在另一個具體例中，該牙周病是齒齦炎。
本發明亦提供一種用以偵測一哺乳動物體內的牙周病的生物標記平台(panel)，其包含有兩個或多個選自於下列所構成之群組中的生物標記：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13，其中該等生物標記是得自於經診斷帶有牙周病的哺乳動物的牙齦和/或唾液樣本。在一個具體例中，該牙周病是牙周炎。在另一個具體例中，該牙周病是齒齦炎。
本發明亦包括一種用以監測一哺乳動物體內的牙周病的方法，包含有在一第一時間點從該哺乳動物獲得一第一牙齦和/或唾液樣本、在一第二時間點從該哺乳動物獲得一第二牙齦和/或唾液樣本、偵測至少一生物標記在該第一與第二樣本中的存在、偵測該至少一生物標記在該第一與第二樣本中的位準，以及比較生物標記在該第一與第二樣本中的位準，其中該第二樣本中的生物標記位準相對於該第一樣本降低表示哺乳動物體內的牙周病減低，並且其中該至少一生物標記是選自於下列所構成的群組：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13。在一個具體例中，該牙周病是牙周炎。在另一個具體例中，該牙周病是齒齦炎。
在一個方面，本發明的特徵在於一種用以治療一哺乳動物體內的牙周病的方法，其中該哺乳動物具有升高位準的至少一選自於下列所構成之群組中的生物標記：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13。如他處所述，超過正常位準的一或多個此等生物標記可以使用任一種此處所揭示或該技藝中所熟知的方法決定，並且若適當的話與牙周病相關聯。因此本發明的特徵在於一種用以治療一帶有牙周病之哺乳動物體內的牙周病的方法，該方法包含有令一細胞與一會下調至少一選自於下列所構成之群組中的生物標記接觸：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13，其中下調該生物標記與降低和牙周病有關的至少一症狀相關聯。
在一個具體例中，一個生物標記下調劑包含在一口服組成物中，且該口服組成物被投藥給一哺乳動物以治療牙周病。
在一種藉由將一口服組成物投藥至哺乳動物的口腔中來治療牙周炎的方法中，一或多個生物標記的活性可如他處所述般被降低。一或多個生物標記可以如他處所述般被降低，例如，有關降低MMP-9在一哺乳動物的口腔中的量，就像有關降低MMP-9在一哺乳動物的口腔中的量。亦即，MMP可以在核酸以及蛋白質層面的一者或兩者上降低，藉此而降彽MMP-9在口腔中的活性。相同地，下調MMP-9或降低MMP-9的位準可能受到核酸以及蛋白質位準中的一者或兩者作用所影響，如他處詳細說明般。
在另一個方面，本發明提供一種在一有需要的哺乳動物體內鑑定一可應用於治療牙周病之化合物的方法，包含有令一細胞與一測試化合物接觸以及決定該測試化合物是否會下調下列生物標記的一或多者：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13。下調該等生物標記的至少一者表示該測試化合物可應用於治療一患有牙周病的哺乳動物體內的牙周病，其中生物標記位準的增加與牙周病有關和/或是牙周病的症狀。在一個具體例中，該牙周病是牙周炎。在另一個具體例中，該牙周病是齒齦炎。
在一個具體例中，一種治療牙周病的方法包含有投藥由此處所述的篩選分析法鑑定出的一藥劑，或者抑制牙周病的一或多個生物標記的劑的組合，其中該等劑的至少一者是一種由此處所述的篩選分析法鑑定出的藥劑。
在一個具體例中，本發明提供一種用以治療牙周病的方法，包含有下列步驟：將一治療有效量的藥劑(會抑制牙周病)投藥給有需要此治療的個體。如此處所界定的，一治療有效量的藥劑(亦即，一有效劑量)的範圍從0.001至30 mg/kg體重，較佳地0.01至25 mg/kg體重，更佳地0.1至20 mg/kg體重，以及又更佳地1至10 mg/kg、2至9 mg/kg、3至8 mg/kg、4至7 mg/kg、或5至6 mg/kg。習於技藝者將理解到，某些因素可能會影響有效治療一個體所需的劑量，包括，但不限於疾病或病症的嚴重性、先前的治療、個體的整體健康和/或年齡，及其他存在的疾病。另外，以一治療有效量的抑制劑治療一個體可包括一個單一治療，或者，較佳地，可包括一系列治療。亦將理解到，供使用於治療的有效劑量可能會隨著一特定治療的療程而增加或減少。劑量上的改變可能是因為如此處所述的診斷分析結果。藉由實例，該藥劑單獨地投藥，作為一藥學組成物的部分，或者是在其他的組成物中作為一口服組成物的部分。
藉由非限定實例，MMP-9的位準可以透過令一細胞與TNFα接觸而在活體外確認。在一個具體例中，一細胞是一單核球。在令一細胞與TNFα接觸之後，以蛋白質或核酸層面來偵測MMP-9的位準。在一個方面，MMP-9的位準亦於存在有一抗菌劑的情況下藉由令一細胞與TNFα接觸而在活體外確認。在一個具體例中，該抗菌劑是2,2,4’-三氯-2’-羥基聯苯醚。在本發明的一個方面，2,2,4’-三氯-2’-羥基聯苯醚是一種應用於下調此處所述之生物標記的劑。應用於測定一生物標記位準的分析法尤其包括任一種可應用於結合和/或功能活性測定的分析法。此等分析法的實例包括，但不限於，以LUMINEX為基礎的分析法、抗體-抗原分析法、肽切割分析法、比色分析法。
在本發明的一個具體例中，藉由偵測MMP-9位準來測量MMP-9的下調在活體外是透過於一抗菌劑的存在下令一細胞與TNFα接觸而確定以及與在活體外透過於沒有一抗菌劑(諸如，2,2,4’-三氯-2’-羥基聯苯醚)存在的情況下令一細胞與TNFα接觸而確定的MMP-9位準比較，除此之外其中的實驗條件是相同的。在有抗菌劑存在的情況下，MMP-9蛋白、核酸或酵素活性的位準要比在沒有抗菌劑存在的情況下還低表示該抗菌化合物會下調MMP-9。將理解到，本發明的其他生物標記也可以類似的方式分析。此外，MMP-9或任一種其他生物標記可以針對下調而被分析，使用任一種可應用於這個目的的藥劑，包括，但不限於如同被鑑定為可應用於治療他處所提及牙周炎的藥劑。
將理解到，活體外測量一生物標記的下調可能是與一活體內效果、發現或結果相關聯。藉由非限定實例，將理解到，活體外測量MMP-9的下調可能是與一活體內效果、發現或結果相關聯。在一個方面，在活體外測量到MMP-9的下調證實活體內的發現，包括，但不限於治療牙周病，一種在活體內降低一生物標記和/或生物標記活性的病理性過量的方法，以及一種在活體內鑑定一可應用於治療牙周病和/或減低生物標記和/或生物標記活性之病理性過量的方法。參見，例如，Modeer et al.(1996) J. Clin. Periodont.,23:927-933。在另一個方面，在活體外測量到之生物標記的下調預測活體內的結果，包括，但不限於治療牙周病，一種在活體內降低生物標記和/或生物標記活性之病理性過量的方法，以及一種在活體內鑑定一可應用於治療牙周病和/或減低生物標記和/或生物標記活性之病理性過量的方法。
在一個方面，本發明提供一種在一有需要的哺乳動物的口腔內降低至少一生物標記之病理性過量的方法，包含有將一會下調選自於下列所構成之群組中的至少一生物標記之藥劑的口服組成物投藥至該哺乳動物的口腔：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、BE、IL-12A、IL-6、LCN8、LPO以及MMP-13，該藥劑呈一個在該哺乳動物的口腔內有效降低該生物標記位準的量，其中抑制該生物標記位準會治療牙周病。在一個具體例中，本發明提供一種在一有需要的哺乳動物的口腔內降低至少一生物標記，例如MMP-9或MMP-13，的病理性過量的方法，包含有將一含有2,2,4’-三氯-2’-羥基聯苯醚的口服組成物投藥至該哺乳動物的口腔內，該2,2,4’-三氯-2’-羥基聯苯醚呈一個在該哺乳動物的口腔內有效降低MMP-9或MMP-13位準的量，其中抑制MMP-9或MMP-13位準會抑制結締組織基質金屬組份的過量分解。
一生物標記可在口腔內以如此處所提出的多種方式中的一者減低。在一個具體例中，一生物標記可以藉由如他處所提及地於核酸層次下調該生物標記而在口腔內被減低。這樣的減低可以造成編碼該生物標記的核酸的一或多者(例如，mRNA)以及被表現至口腔內的生物標記蛋白/酵素降低。雖然提供此處所提及的揭示內容，減低編碼一生物標記的mRNA，例如，可以藉由多種技術中的一或多者而達致，如同為習於技藝者所理解的。實例包括減低編碼該生物標記之mRNA的轉錄以及編碼該生物標記之mRNA的分解/去除。
在另一個具體例中，一生物標記可以藉由直接減低生物標記蛋白的量而在口腔中減低。雖然提供此處所提及的揭示內容，減低生物標記蛋白可藉由多種技術中的一或多者而達致，如同為習於技藝者所理解的。實例尤其包括經由一小分子抑制劑結合/複合該生物標記、經由一天然或生物衍生的分子抑制、蛋白分解生物標記，以及以親和性為基礎從口腔中清除該生物標記。減低一生物標記的藥劑可以是一種如此處所述的藥劑，諸如2,2,4’-三氯-2’-羥基聯苯醚(三氯沙)。，或者它可以是另一種抗菌劑。如此一來，本發明提供治療患有牙周病之個體的方法。
在另一個方面，本發明提供治療一有需要的哺乳動物體內的牙周病的方法，包含有令該哺乳動物口腔內的一細胞與下調此處所提及之一生物標記的藥劑接觸。依據本發明，下調該生物標記與減低和牙周病相關聯的至少一症狀相關。
在一個方面，此處所提及的一口服組成物治療牙周病的能力是藉由比較2,2,4’-三氯-2’-羥基聯苯醚對於生物標記下調的效果與該口服組成物對於生物標記下調的效果而確定。在另一個方面，任一種口服組成物治療牙周炎的能力是藉由在活體外或活體內比較該口服組成物的效果與此處所提及之口服組成物的效果而確定。
在一個方面，在活體外所測量到的生物標記下調證實活體內的發現，包括，但不限於治療牙周炎，一種在活體內減低生物標記(例如，金屬蛋白酶和/或金屬蛋白酶活性)的病理性過量的方法，以及一種鑑定一在活體內可應用於治療牙周炎和/或降低生物標記或生物標記活性之病理性過量的方法。參見，例如，Golub et al.,Inflamm. Res.(1997) 46:310-9,Preshaw et al.,J. Clin. Periodontol.(2004) 31:697-707;Mantyla et al.,J. Periodontal. Res.(2003) 38:436-439;Lorencini et al.,Histol. Histopathol.(2009) 24:157-166；以及Pozo et al.,J. Periodontal Res.(2005) 40:199-207。
本發明進一步包括一種供使用於本發明的方法中的口服組成物，諸如一牙粉。在一個方面，一口服組成物包含有一可用於治療牙周病的藥劑。在一個例示性具體例中，該劑是一種非陽離子抗菌劑。參見，例如，美國專利第5,288,480號，其以它的整體併入此處做為參考文獻。該非陽離子抗菌劑呈一為0.25-0.35%以重量計的有效抗菌斑量存在於該口服組成物中，較佳地0.3%。該抗菌劑本質上為水-不溶性，代表它於25℃下在水中的溶解度少於1%以重量計並且可能甚至少於0.1%。在一個具體例中，該抗菌劑是2,2,4’-三氯-2’-羥基聯苯醚。在一個具體例中，該抗菌劑是多西環素(doxycycline)。在另一個具體例中，該口服組成物包含有兩種或多種抗菌劑。在另一個具體例中，該口服組成物包含有一個抗菌劑以外的劑，並且可以或可以不含有一或多種額外的劑(抗菌劑)。
在一個具體例中，一抗菌劑-增強劑(AEA)會增強將該抗菌劑投遞至口腔表面並且將其維持在口腔表面。在一個方面，一AEA包含有一黏著材料。參見美國專利第5,288,480號有關可應用於本發明之AEA材料的材料以及組成物的描述，以及有關可應用於本發明之口服組成物(諸如牙粉組成物)的一般性描述。藉由非限定實例，一組成物中的黏著材料是一種具有數量平均分子量介於100,000與2,500,000以內的聚合物。在一個方面，該黏著材料是選自於下列的聚合物：聚乙烯膦酸、聚1-膦醯基丙烯磺酸、聚(β苯乙烯膦酸)、α苯乙烯膦酸、合成陰離子聚合聚羧酸鹽、順丁烯二酐、順丁烯二酸，以及甲基乙烯基醚。在另一個方面，該黏著分子是一種具有甲基乙烯基醚以及順丁烯二酐的聚合物。
如此處所用的，一“投遞-增強基團(delivery-enhancing group)”意指一種將AEA(攜帶抗菌劑)附接或實質上、依附地、黏合地，不然就是鍵結至口部(例如，牙齒與牙齦)表面的基團，藉此將該抗菌劑“投遞”至此等表面。在另一個具體例中，“投遞-增強基團”意指一種將抗菌劑以外的一劑選擇性地附接或實質上、依附地、黏合地，不然就是鍵結至口部，藉此將該抗菌劑“投遞”至此等表面。在又另一個具體例中，“投遞-增強基團”將至少一抗菌劑以及至少一非抗菌劑投遞至牙齒。通常為疏水性的有機停留-增強基團將該劑和/或抗菌劑附接不然就是鍵結至AEA，藉此增進抗菌劑停留於AEA並且間接地停留於口腔表面。在一些例子中，抗菌劑的附接通常是透過其被AEA物理性捕獲而發生，特別是當AEA是一種交聯聚合物，其結構固有地提供增加的位置供用於此等捕獲。在交聯聚合物出現較高的分子量、在交聯部分更為疏水性仍會進一步增進抗菌劑被物理性捕獲至交聯AEA聚合物或被交聯AEA聚合物所捕獲。
在一個例示性牙粉中，在有保濕劑的情況下，一口服可接受的載體包含一水相。水典型地呈至少3%以重量計的量存在，一般為3-35%而保濕劑較佳地為甘油或山梨糖醇，典型地總計6.5-75%或80%以牙粉的重量計，更典型地10-75%。雖然在本發明中不是必需的，一個促進抗菌劑溶解於唾液中的額外成分可以併入水-保濕劑載體中，其中0-25-0.35%的水不可溶非陽離子抗菌劑選擇性地存在。此等選擇性的助溶劑包括保濕劑多元醇，諸如丙二醇、二丙烯甘醇以及己烯乙二醇、賽路蘇(cellosolves)諸如甲基賽路蘇(methyl cellosolve)與乙基賽路蘇(ethyl cellosolve)、在一個直鏈中含有至少12個碳的植物油與蠟，諸如橄欖油、蓖麻油以及石蠟脂以及酯，諸如乙酸戊酯、乙酸乙酯與苯甲酸苄酯。如此處所用的“丙二醇”包括1,2-丙二醇以及1,3-丙二醇。必須避免有效量的聚乙二醇(特別是具有分子量為600或更高者)，因為聚乙二醇會有效地抑制非陽離子抗菌劑的抗菌活性。例如，當與三氯沙呈一為25三氯沙：1 PEG 600的重量比存在時，聚乙二醇(PEG) 600會降低在沒有聚乙二醇存在下佔優勢的三氯沙之抗菌活性達10-20因數。
一口服組成物的pH通常落在4.5至10的範圍內並且在另一個方面，6.5至7.5。值得注意的是，本發明的組成物可以呈低於5的pH口服地施用而大體上不會去除鈣質或者損傷琺瑯質。pH可以利用酸(例如檸檬酸或苯甲酸)或鹼(例如，氫氧化鈉)或緩衝物(就像使用檸檬酸鈉、苯甲酸鹽、碳酸鹽或碳酸氫鹽、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等)來控制。
可使用任一種研磨顆粒並且可選自於碳酸氫鈉、磷酸鈣(例如二水合磷酸二鈣)、硫酸鈣、沉澱碳酸鈣、矽(例如水合矽)、氧化鐵、氧化鋁、珍珠岩(perlite)、塑膠粒子(例如聚乙烯)，以及它們的組合。特別地，該磨料可以選自於磷酸鈣(例如二水合磷酸二鈣)、硫酸鈣、沉澱碳酸鈣、矽(例如水合矽)、焦磷酸鈣以及組合。可使用任一種類型的矽，諸如沉澱矽或矽膠。較佳的是商業上可取得的矽，諸如INEOS AC43，可得自於Ineos Silicas，Warrington，英國。亦可依據本發明使用其他磨料。如同在美國專利第4,358,437號中所提，呈磨料形式的碳酸鈣的粉末形式構成此等磨料的一個重要分類。這些磨料的實例是經輾磨的石灰石或大理石、白堊(chalks)[諸如霰石(aragonite)、方解石(calcite)或它們的混合物]，以及合成沉澱白堊(諸如工業水廠白堊)。一般而言，碳酸鈣應具有一少於40微米的重量中位直徑，較佳地少於15微米。第二種類型的磨料是粉末狀矽，特別地如同在美國專利第3,538,230號中所定義的矽乾凝膠(silica xerogels)。一種以矽為主的組份可包含有具有一平均粒徑從1-100 μm的矽粒子，包括任何落在那個範圍內的粒子大小。
在一個具體例中，一口服組成物選擇性地包含有一矽研磨劑。該研磨劑可以是矽材料，諸如水化矽膠、矽乾凝膠或複合無定形鹼金屬鋁矽酸鹽或鋯矽酸鹽或沉澱矽。膠體矽材料包括那些以SYLOID為商標名販售者，諸如那些販售為SYLOID 72以及SYLOID 74。沉澱矽包括那些以ZEODENT為商標名販售者，諸如ZEODENT 113以及ZEODENT 115與ZEODENT 119。一口服組成物可包含有一呈量從0-36%的矽研磨劑。在另一個具體例中，一口服組成物可包含有一呈量從0.01-36%的矽研磨劑。
在未意欲受到理論束縛而達致本發明的優點，咸信即使沒有針對一抗菌劑(例如，2,2,4’-三氯-2’-羥基聯苯醚)的專用助溶材料存在的情況下，當該劑的量為0.25%-0.35%以重量計且存在有聚羧酸鹽時，存在有充份的該劑以藉由下調MMP-8、MMP-9或MMP-13的至少一者達到治療牙周炎。這同樣適用於此處所述的其他水-不溶性非陽離子抗菌劑。
一口服組成物(例如，牙粉)亦可含有一呈足以提供25 ppm至5,000 ppm的氟化物離子之氟化物離子的來源或提供氟的組份做為抗齲齒劑。這些化合物在水中可以是微溶的或者是完全水溶性的。它們的特徵在於它們能夠在水中釋放氟化物離子的能力以及與口服製品中的其他化合物大體上沒有非所欲的反應。在這些材料中，尤其偏好無機氟化物鹽類，諸如可溶性鹼金屬、鹼土金屬鹽，例如氟化鈉、氟化鉀、氟化銨、氟化鈣、氟化銅[諸如氟化銅(I)]、氟化鋅、氟化鋇、氟矽酸鈉、氟矽酸銨、氟鋯酸鈉、氟鋯酸銨、一氟磷酸鈉、一以及二氟磷酸鋁，以及氟化焦磷酸鈉鈣。較佳的是鹼金屬以及氟化錫，諸如氟化鈉與氯化錫(II)，一氟磷酸鈉以及它們的混合物。典型地，至於鹼金屬氟化物，以製品的重量為基礎，這個組份以高至2%以重量計的量存在，並且較佳地落在0.05%至1%的範圍內。至於一氟磷酸鈉，該化合物呈一為0.1-3%的量存在，並且在一個具體例中0.7-0.8%。
在一個方面，一組成物進一步包含有選自於下列的一劑：錫離子劑；一氟化物化合物；氟化鈉、氯已定(chlorhexidine)；雙胍啶(alexidine)；海克替啶(hexetidine)；血根鹼(sanguinarine)；羥基氯苯胺(benzalkonium chloride)；柳醯胺苯(salicylanilide)；度米芬(domiphen bromide)；鯨蠟基吡啶鹽酸鹽(cetylpyridinium chloride,CPC)；十四烷基氯化吡啶(tetradecylpyridinium chloride,TPC)；N-十四烷基-4-乙基氯化吡啶(N-tetradecyl-4-ethylpyridinium chloride,TDEPC)；奧替尼啶(octenidine)；地莫匹醇(delmopinol)；奧他匹洛(octapinol)；乳酸鏈球菌素(nisin)；鋅離子劑；銅離子劑；精油；呋喃酮(furanones)；殺菌素、月桂醯精胺酸(ethyllauroyl arginate)、木蘭的萃取物、金屬離子來源、精胺酸碳酸氫鹽(arginine bicarbonate)、厚樸酚(honokiol)、厚朴酚(magonol)、熊果酸(ursolic acid)、松蘿酸(usnic acid)、桑色素(morin)、沙棘的萃取物、一過氧化物、一酵素、一茶樹(Camellia)萃取物、一類黃酮、一黃烷(flavan)、氫化聯苯醚、肌酸，以及蜂膠。
在下面的實施例中進一步說明本發明。該等實施例僅為說明並且絕不會限制如同所述以及所請求的發明範疇。實施例1：MMP-9製備以及特徵鑑定
U937細胞以及RPMI 1640培養基是得自於ATCC。人類MMP-9 ELISA套組(QUANTIKINE)是得自於R＆D Systems。胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)是得自於VWR，以及青黴素-鏈黴素溶液與腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor α,TNFα)是得自於Sigma。
將人類白血病U937單核球淋巴瘤細胞培養於補充有10% FBS以及1%青黴素-鏈黴素溶液的RPMI 1640培養基中。細胞在37℃下培育於含有5% CO2以及95%空氣的濕化環境中。在處理之前，將細胞轉移至含有1% FBS的RPMI過夜。將細胞平盤培養在一個48孔平盤中。細胞培養基包括TNFα(250 mg/mL)、三氯沙(1 ppm)，兩劑一起或沒有劑(對照組)。細胞在處理之後培育歷時24小時。收集條件培養基並且儲存於-80℃直到要分析。依據商業化ELISA操作步驟(圖1)，條件培養基的樣本針對MMP-9進行酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)。
以TNFα予以刺激的U937細胞在MMP-9位準上產生增加。呈1 ppm的三氯沙在經TNFα刺激的U937細胞中明顯地降低MMP-9位準。
表1：有關圖1的數據，證實三氯沙對於MMP-9生成的效果。
實施例2：MMP-13的製備以及特徵鑑定
副甲狀腺素(大鼠PTH 1-34)是購自於Sigma。將UMR 106-01細胞培養於補充有25 mM Hepes pH 7.4、1%非必需胺基酸、100單位/ml青黴素、100 μg/ml鏈黴素、5%胎牛血清的Engle氏最低必需培養基(Eagle’s minimal essential medium,EMEM)。依據下列方法執行即時定量RT-PCR：將UMR 106-01細胞種植在12-孔平盤中並且在培養基中培養歷時2-3天。當細胞匯聚，將細胞培養基替換為1%胎牛血清歷時過夜供用於細胞飢餓。將細胞以牙粉預培養歷時15分鐘並且接著以PTH(10-8 M)予以培育歷時4小時。
使用TRIzol試劑從有或沒有以PTH予以刺激的UMR 106-01細胞中分離出總RNA。依據製造商的指示，使用Invitrogen SUPERSCRIPT套組將總RNA(0.1 μg)逆轉錄為cDNA。使用引子對cDNA進行PCR，引子的序列列示在表2中。藉由將2.5 μl的cDNA加入至含有各個引子(0.2 μM)以及12.5 μl的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG(Invitrogen)的PCR混合物(22.5 μl)來擴增所有cDNAs。反應在50℃下預培養歷時2分鐘而藉由UDG將含有dU的DNA予以去除，接著在95℃下歷時2分鐘以將UDG去活化並活化Taq。PCR程式持續49個循環：在95℃下歷時15秒的變性、引子在60℃下歷時30秒的黏合以及延長。基因表現的相對定量是藉由使用2-δ δ CT法而被決定，其中基因表現的倍數變化是相對於對照組樣本。所有的樣本是以β-肌動蛋白予以標準化。
在全部的實驗重複至少3次的情況下，所有的結果是以三重複測量的平均值±標準偏差(S.E.)來表示。使用司徒頓試驗(Student’s test)來執行統計分析。
以PTH予以刺激的UMR細胞在MMP-13表現上產生增加。呈10 ppm、4 ppm以及1 ppm的三氯沙在經PTH刺激的UMR細胞中明顯地減低MMP-13表現。含有10 ppm三氯沙的牙粉漿體在經PTH刺激的UMR細胞中明顯地減低MMP-13表現。
表2：引子序列
實施例3：有關抗-發炎活性的分析
藉由分析抑制IL-1B、IL-6、IL-8、GM-CSF和/或TNF-α的能力分析化合物關於抗發炎活性的潛力。評估在生物樣本(例如，唾液)中或在活體外樣本(例如，細胞培養物上澄液)中所發現到的細胞激素和/或發炎標記。例如，在一特定的標記濃度下產生一百分比量的抑制(percent amount of inhibition)並且用來與以相同方式評估的其他標記比較。
從與牙齦卟啉單胞菌接觸的細胞培養物(Porphyromonas gingivalis-contacted cell culture)製備細胞培養物上澄液。細胞培養物可依據任一種該技藝中所熟知的方法製備。例如，牙齦細胞培養在含有0.5%血清[含有胎牛血清(FBS)]的96-孔平盤中過夜。翌日，移除培養基並加入新鮮無FBS培養基且將平盤培育在37℃下直到要進一步使用。藉由將100 μl經加熱-殺死的牙齦卟啉單胞菌(HKPG)加入10 ml培養基中而使用HKPG來製備另一個培養基原液(stock of medium)。
一測試劑(例如，標記)藉由將2 μl劑加入至含有108 /ml HKPG的198 μl培養基而從1%原液(stock)預先稀釋。該測試劑接而使用含有HKPG的培養基稀釋至一最終濃度為1 ppm至0.5 ppm(鏡像平盤)。一負對照組是沒有HKPG或測試劑的培養基。正對照組是含有HKPG的培養基。
以培養基洗滌含有測試劑稀釋液的微量培養盤1次。將鏡像平盤的條件培養基加入至細胞平盤的相同樣本位置並且培育過夜。翌日，從各孔移除50 μl培養基供使用於以流式細胞儀為基礎的分析(例如，LUMINEX)中。
製備用於LUMINEX 5-PLEX分析的試劑。藉由將285 ml去離子水加入至15 ml原液洗滌液製備洗滌溶液。藉由將2.25 ml洗滌溶液加入至0.25 ml的10x珠粒原液來製備配於稀釋溶液中的分析珠粒。藉由將9 ml去離子水加入至1 ml的10x經生物素化偵測物製備經生物素化的抗體，1X。藉由將9 ml去離子水加入至1 ml的10x鏈抗生物素蛋白-RPE原液製備鏈抗生物素蛋白-RPE，1x。
有關5-PLEX分析，藉由下列產品指示以及還原分析稀釋劑(例如，唾液)或藉由使用50%分析稀釋劑/50%培養基製備標準品。容許標準品蛋白質在室溫下再水合(rehydrate)歷時10分鐘(必須在1小時內使用)。依據連續稀釋配於分析稀釋液(唾液)或50%分析稀釋劑/50%培養基中的還原標準品(藉由執行系列稀釋來製備1：729稀釋樣本)作出標準品曲線。
有關5-PLEX分析，藉由將0.2 ml洗滌溶液吸移至各孔中、等待15-30秒，接而使用真空歧管(vacuum manifold)吸出溶液而預先濕潤平盤孔。振盪-攪動經稀釋的珠粒溶液歷時30秒，接著在使用於分析之前以音波處理歷時至少30秒。將經稀釋的珠粒溶液(25 μl)置入各孔中並避光。將洗滌溶液(0.2 ml)加入至各孔，並且在15-30秒之後使用真空歧管吸出洗滌溶液。重複洗滌步驟，接著擦乾平盤底部的殘餘液體。將培育緩衝液(50 μl)加入至各孔中，繼而將100 μl的適當標準品稀釋液加入各個指定孔中，繼而為50 μl分析稀釋劑，接著將50 μl的樣本加入至指定的樣本孔中。平盤在室溫下於迴轉式振盪器上以500-600 RPM振盪速度培育歷時2小時。
使用真空歧管將液體從平盤孔中移除，並且將0.2 ml洗滌溶液加入至各孔，培育歷時15-30秒，接著重複洗滌步驟，繼而將平盤底部擦乾。將經生物素化的偵測物抗體(1x，100 μl)加入至各孔並且在室溫下於迴轉式振盪器上以500-600 RPM振盪速度培育1小時。使用真空歧管將液體從孔中移除，繼而如上所述般洗滌。將鏈抗生物素蛋白-RPE(1x，100 μl)加入至各孔。接而在室溫下於迴轉式振盪器上以500-600 RPM振盪速度培育平盤歷時30分鐘。
在培育平盤之時，準備LUMINEX100儀器以供分析。使用真空歧管將液體從平盤孔中移除，並且將0.2 ml洗滌溶液加入至孔中，培育歷時10秒，繼而重複洗滌步驟2次。將洗滌溶液(100 μl)加入至各孔並且在室溫下於迴轉式振盪器上以500-600 RPM振盪速度培育平盤歷時2-3分鐘。接著移除平盤的蓋子並且嵌入LUMINEX100以供讀取和分析。
標準品曲線的樣本濃度是使用適當的曲線擬合軟體(curVe-fitting software)而決定。各個濃度的測試劑的細胞激素抑制是藉由首先將在細胞激素在正對照組中的位準減去在有該劑的情況下的細胞激素位準。數值接而除以正對組組的細胞激素位準，並乘以100以產生各個特定劑的百分比抑制。
藉由將具有已知濃度的各種標記樣本的吸光值作圖亦可針對任一種標記產生標準品曲線。接而可使用標準品曲線幫助決定在後續試驗以及分析中的標記濃度。
實施例4：標記以及疾病狀態的免疫化學分析
對抗下列標記培育抗體：FAS、IL-1B、IL-8、MMP-9、DEFB4、CTSS、IL-17B、CARD10、BGN、IL-12A、IL-6、LCN8、B-因子以及LPO。有關抗體生產的領域篩選是依據包括特異性、免疫原性、疏水性以及cDNA可利用性的要件來執行。各個標的序列從cDNA模板予以PCR-擴增並且插入至2個原核細胞表現載體中，一個用於生產抗體而一個用於親合性配位子生產。
亦進行使用商業上可取得的抗體的測試。商業上可取得的抗體的西方墨點分析法指出就用於額外的分析以及試驗來說IL-6與MMP-9是理想的候選物。
將蛋雞(Leghorn and Rhode Island Red)注射抗體。在第1次加強免疫的10天以及第2次加強免疫的5天之後收集測試樣本。以重組型蛋白質/肽使用西方墨點法或ELISA分析測試樣本。使用親合性純化來純化抗體。Jurkat、A549、HELA以及HEK293細胞的細胞萃取物用來測試該等抗體。
對抗IL-6、MMP-9以及BFa(B-因子)的抗體用於一免疫組織化學(IHC)研究中以鑑定生物標記的存在和/或在組織中與各種不同健康與疾病狀態相關聯的位準。從3位帶有齒齦炎的個體(2名為輕度病例而1名為中度病例)中獲得牙齦組織樣本。亦從5名帶有健康牙齦的個體中獲得牙齦組織。產生經石蠟-包埋福馬林-固定的組織切片供用於分析。從具有發炎、出血、腫脹以及表面質地改變的臨床證據之牙齦組織來源取得多個擦洗物(swipes)。健康的牙齦來源是來自於拔牙或齒冠修復。檢體資訊包括探測深度、牙齒數，收取到的牙齦的區域以及數量。對照組組織就IL-6以及BFa而言是正常的骨髓，而乳癌組織是MMP-9。
MMP-9在健康組職以及帶有齒齦炎的組織中顯示濃烈的染色。例如，MMP-9結果可以組合其他此處所提及之生物標記的數據(例如得自於其他MMP的數據)而在一患者中產生牙周病的詳細診斷。IL-6僅在單核細胞中有染色，與西方墨點結果一致(亦即，與Jurkat細胞反應)。針對使用抗-IL-6抗體以及抗-BFa抗體以及經石蠟包埋的組織比較健康以及患病組織可以觀察到相關趨勢，但是不如MMP-9所得到者明顯。
本發明已藉由參照某些較佳具體例而說明於此處。然而，因為各種不同的改變對於那些習於該技藝者而言將會是明顯的，本發明不被視為限定於此。在任何地方所引用的所有專利案、專利申請案以及參考文獻以它們的整體併入此處做為參考文獻。
第1圖說明2,4,4’-三氯-2’-羥基聯苯醚在單核球的TNFα-誘發的MMP-9生成上的效果。
〈110〉 美國棕欖公司
〈120〉 用於軟組織疾病診斷及作為用於口腔保健干預的標靶之蛋白質生物標記
〈130〉 US 61/165,674
〈160〉 4
〈210〉 1
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈223〉 大鼠MMP-13基因 意義
〈400〉
〈210〉 2
〈211〉 22
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈223〉 大鼠MMP-13基因 反義
〈400〉
〈210〉 3
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈223〉 大鼠-肌動蛋白基因 意義
〈400〉
〈210〉 4
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈223〉 大鼠-肌動蛋白基因 反義
〈400〉

Claims (4)

  1. 一種鑑定可用於治療口腔齒齦炎或牙周炎之化合物的方法，該方法包含有：從一受口腔的疾病或病況所苦的哺乳動物獲得第一牙齦樣本；從該哺乳動物的口腔獲得第二牙齦樣本；令該第一樣本與一測試化合物接觸；令該第二樣本與一正對照組接觸，其中該正對照組是一種已知會下調一或多種生物標記表現的化合物，其中該一或多種生物標記是選自於下列所構成的群組：MMP-9以及MMP-13，而該正對照組是鹵化聯苯醚或三氯沙；測量該等生物標記的一或多者的表現受到該測試化合物下調的程度；測量該等生物標記的一或多者的表現受到該正對照組下調的程度；以及將該等生物標記的一或多者的表現受到該測試化合物下調的程度與該等生物標記的一或多者的表現受到該正對照組下調的程度相比較；其中將該等生物標記的一或多者的表現下調至一個與該正對照組相同或更大的程度的測試化合物，是一種可用於治療口腔的疾病或病況的化合物。
  2. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該測試化合物將該等生物標記的一或多者的表現下調至一個要比該正對照組還大的程度。
  3. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該正對照組下調MMP-9的表現。
  4. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該正對照組下調MMP-13的表現。
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