WO2006068133A1 - Ｎｆａｔ２発現抑制方法 - Google Patents

Ｎｆａｔ２発現抑制方法 Download PDF

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WO2006068133A1
WO2006068133A1 PCT/JP2005/023356 JP2005023356W WO2006068133A1 WO 2006068133 A1 WO2006068133 A1 WO 2006068133A1 JP 2005023356 W JP2005023356 W JP 2005023356W WO 2006068133 A1 WO2006068133 A1 WO 2006068133A1
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nfat2
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glycine
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Tatsuo Takeya
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National University Corporation NARA Institute of Science and Technology
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    • G01N2800/108—Osteoporosis

Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing the expression of NFAT2, which is a transcription factor in the osteoclast differentiation process. More specifically, a method for suppressing the expression of NFAT2 by suppressing the signal transduction pathway of L-serine and Z or L-glycine, and further, the prevention and Z or treatment of NFAT2-related diseases by controlling the expression of NFAT2. It relates to drugs and their screening methods.
  • Bone tissue performs bone remodeling (remodeling) by repeating bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts.
  • osteoporosis or “rheumatoid arthritis” develops, bone resorption exceeds bone formation, resulting in a decrease in bone mass.
  • “Daishi bone disease” is a pathological condition caused by bone resorption failure, and there is an abnormality in osteoclast differentiation and there is no osteoclast in bone tissue or there is an abnormality in osteoclast function. If it is not possible to resorb bone, it is thought to occur in some cases.
  • osteoporosis is caused by the loss of the balance between bone resorption and bone regeneration and increased formation of osteoclasts responsible for osteolysis.
  • this mature osteoclast is a multinucleated cell, it is known that the NFAT2 (NFATcl) gene is essential in the process of cell fusion! / ⁇ (See Patent Document 1.)
  • NFAT2 NFATcl
  • Examples of techniques for controlling osteoclast formation using such signal transmission include methods for promoting or suppressing Ca 2+ signaling (see Patent Document 1) and methods including a step for promoting or inhibiting IFN signaling. (See Patent Documents 2 and 3).
  • these methods need to be administered locally because they control Ca 2+ signaling, or have problems such as antigenicity and inability to be administered orally because they are administered proteins. Therefore, development of a new screening method based on a new mechanism has been demanded.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-154132
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. 2002Z024228
  • Patent Document 3 International Publication No. 2002Z024229 Pamphlet
  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for NFAT2-related diseases such as osteoporosis based on a novel mechanism, a method for preventing or treating NFAT2-related diseases such as osteoporosis, and prevention or treatment of NFAT2-related diseases such as osteoporosis. It aims to provide a screening method for therapeutic drugs.
  • osteoclast progenitor cells receive signals from RANKL and express various genes responsible for the progression of differentiation.
  • the inventor has independently discovered the gene expression by microarray analysis and the differentiation suppression by cell seeding density using the mouse cell line RA W264 and the osteoclast differentiation system that has the ability of RANKL protein last year.
  • the transcriptional regulator NFAT2 whose expression is induced by RANKL is important for the formation of multinucleated cells. Normally, NFAT2 is phosphorylated in the cytoplasm and inactive in osteoclast progenitor cells.
  • Ca 2+ and Ca 2+ — CaM bind and become active.
  • NFAT2 is dephosphorylated by the hydrated calcium. Dephosphorylated NFAT2 migrates into the nucleus approximately 24-48 hours after RANKL stimulation, destroying various enzymes responsible for cell fusion and osteolysis Induces gene expression related to bone cell formation and functional expression. Conversely, osteoclast precursor cells treated with tacrolimus (hereinafter also referred to as FK506), an inhibitor of NFAT2, do not differentiate into osteoclasts.
  • tacrolimus hereinafter also referred to as FK506
  • FK506 an inhibitor of NFAT2
  • the present inventor confirmed that the amino acid L-serine or L-glycine is essential for the expression of the NFAT2 gene, and that the NFAT2 gene is not expressed in the state where L-serine and L-glycine are deficient. As a result, it was found that osteoclasts do not fuse and osteoclasts do not mature, and the present invention was completed. That is, the present invention relates to a method for controlling the expression of NFA T2 essential for osteoclast formation, a drug and a medicament for use in the control, and a screening method thereof, more specifically, the present invention relates to
  • L-serine analog is D-serine, L-homoserine, their salts or their The method according to (4) above, which is a tellurium,
  • a method for screening a substance that affects osteoclast formation wherein (a) signal transduction of L-serine and Z or L dalysin in osteoclast precursor cells in the presence of a sample containing a test substance. Detection of inhibition or promotion, and (b) suppression of signal transduction of L-serine and Z or L glycine for suppression of osteoclast formation, or promotion of signal transmission of L serine and Z or L glycine.
  • a step associated with promoting bone cell formation (a) signal transduction of L-serine and Z or L dalysin in osteoclast precursor cells in the presence of a sample containing a test substance. Detection of inhibition or promotion, and (b) suppression of signal transduction of L-serine and Z or L glycine for suppression of osteoclast formation, or promotion of signal transmission of L serine and Z or L glycine.
  • a method for screening a substance that antagonizes L-serine involved in osteoclast formation and (a) a step of culturing osteoclast precursor cells in a medium containing a test substance, L-serine and RANKL. And (b) detecting inhibition of L-serine and Z or L-glycine signaling in osteoclast precursor cells, and
  • a method for screening L-serine and Z or L glycine-like substances involved in osteoclast formation comprising (a) a test substance and RANKL, Culturing osteoclast progenitor cells in a medium containing no H and Z or L glycine, and (b) detecting the promotion of L serine and Z or L glycine signal transduction in osteoclast progenitor cells.
  • the present invention provides:
  • NFAT2 expression can be suppressed, so that osteoclast precursor cell strength can be suppressed.
  • osteoclast precursor cell strength can be suppressed.
  • bone destruction by osteoclasts can be effectively suppressed.
  • a drug that regulates NFAT2 expression, particularly NFAT2 gene expression through a signal pathway that targets NFAT2 of the present invention, particularly NFAT2 gene is associated with NFAT2-related diseases, such as normally mineralized bone matrix.
  • the present invention can provide a screening system for a novel NFAT2 expression control method by measuring the effective concentrations of L-glycine and Z or L-serine, and is therefore useful for searching for a novel NFAT2 expression control agent.
  • FIG. 1 is a diagram showing differentiation of mouse RAW264 cells into osteoclasts in in vitro experiments.
  • MN cells indicate multinucleated cells.
  • FIG. 2 shows the results of Western blotting of RAW264 cell extract.
  • Medium Fi Fresh medium
  • Ci conditioned medium (same in the diagram below).
  • FIG. 3 shows the results of Western blotting of RAW264 cell extract after RANKL stimulation.
  • FIG. 4 A) shows the results of Western blotting of NFAT2-siRNA-expressing cell extract, and B) shows NFAT2-siRNA-expressing cells after RANKL stimulation.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the seeding cell density of RAW264 cells and the polygonal cell formation rate.
  • a cell density of 1 indicates 2.5 x 10 4 cells Zwell.
  • FIG. 6 shows the results of Western blotting of RAW 264 cell extract after RANKL stimulation in low density seeding or high density seeding of RAW264 cells.
  • FIG. 7 shows the results of Western blotting of RAW264 cell extracts after RAWKL stimulation after seeding RAW264 cells with different cell densities.
  • a cell density of 1 indicates 2.5 x 10 4 cells Zwell.
  • FIG. 8 is a diagram showing RAW264 cells when differentiation is induced in different media and the differentiation induction efficiency of the cells.
  • FIG. 9 shows changes in medium components and the influence of NEAA on NFAT2 expression in RAW264 cells.
  • FIG. 10 shows the effect of NEA A on NFAT2 expression in RAW264 cells seeded with high density or with high density.
  • L indicates low density sowing and H indicates high density sowing.
  • FIG. 11 shows the effect of NEAA on NFAT2 expression in RAW264 cells.
  • FIG. 12 is a diagram showing the influence of NEAA on RAW264 cell proliferation.
  • FIG. 13 shows the influence of amino acids on NFAT2 expression in RAW264 cells using Conditioned medium.
  • A represents alanine
  • D represents aspartic acid
  • E represents dartamic acid
  • G represents glycine
  • N represents asparagine
  • P represents proline
  • S serine
  • FIG. 14 shows the influence of amino acids on NFAT2 expression in RAW264 cells using Fresh medium.
  • FIG. 15 shows the effect of serine analogs on NFAT2 expression in RAW264 cells using Fresh medium.
  • Ser represents serine (the same in the following figures)
  • D represents D-serine
  • L Homo represents L homoserine.
  • FIG. 16 shows the influence of D-serine on NFAT2 expression in RAW264 cells.
  • FIG. 17 is a diagram showing cell density-dependent multinucleated cell formation of osteoclast precursor cells.
  • A) The results of differentiation induction of osteoclast progenitor cells obtained from mouse bone marrow cells at different cell densities into osteoclasts are shown in relation to the number of TRAP-positive cells and the cell concentration.
  • B) shows the morphology of multinucleated cells.
  • FIG. 18 is a graph showing the decrease of sesamerine in the medium and the expression of NFA T2 depending on the L-serine concentration in high-density culture.
  • FIG. 19 shows the influence of cell density and L-serine on c-Fos expression.
  • A) Western blotting shows the expression of c-Fos when RAW264 cells seeded at low honey were cultured in the presence of RANKL.
  • c) Western blotting shows the expression of c-Fos and NFAT 2 after RAW264 cells are seeded at low density and cultured in a medium supplemented with NEAA, L-serine or L-glycine. The numerical value of each lane shows the following.
  • FIG. 20 is a diagram showing the influence of L-serine on the differentiation of bone marrow cells into osteoclasts.
  • A) Shows the effect of L-serine on bone marrow cell proliferation. The vertical axis shows the results of measuring the degree of cell growth / death by MTT activity. The serine concentration XI on the horizontal axis is equal to the normal amount (0.1 mM).
  • B) The effect of L-serine on the formation of multinucleated cells in bone marrow-derived osteoclast precursor cells. The left figure shows the amount of multinucleated cells formed, and the right figure shows the cell morphology. * Indicates that there is a significant difference (P ⁇ 0.05) according to Student 'st test.
  • the left figure shows the amount of multinucleated cells, and the right figure shows the morphology of GFP-expressing cells and NFAT2-expressing cells (TRAP staining).
  • the present invention relates to a method for suppressing the expression of NFAT2. More specifically, osteoclast formation is suppressed by suppressing L-serine and Z- or L-glycine signaling pathways in osteoclast precursor cells and suppressing NFA T2 expression, particularly NFAT2 gene expression.
  • the present invention also relates to a method of inhibiting, and further to a preventive and Z or therapeutic agent for NFAT2-related diseases by controlling the expression of NFAT2, and a screening method thereof.
  • the present invention will be described.
  • L-serine and Z or L-glycine signaling pathway is a signal transduction essential for osteoclast formation from osteoclast progenitor cells along with RANKL (receptor activator of NF ⁇ B ligand) pathway A route that can be an independent route or a route that responds to another route.
  • the signal transduction pathway of L-serine and Z or L-glycine is different from the above signal transduction pathway, and L-serine and Z or L-glycine are involved in part of the different transduction pathway and NFAT2 is expressed.
  • a transmission pathway in which the NFAT2 gene is expressed is also included.
  • Ostoclast refers to a fusion of mononuclear osteoclast precursor cells differentiated from monocyte / macrophage cells originating from hematopoietic stem cells (hereinafter abbreviated as CFU-M). Multinucleated giant cells (Suda, T. et al., Endocr., Rev. XXV, p.
  • Osteoclasts secrete collagenase that digests the bone matrix and show bone resorption.
  • mature osteoclasts express tartrate-resistant acid phosphatase (hereinafter abbreviated as TRAP), calcitonin receptor, and vitronectin receptor.
  • TRAP tartrate-resistant acid phosphatase
  • TRAP or calcitonin receptor calcitonin receptor
  • vitronectin receptor can be used as an indicator of osteoclast formation (bone resorption marker). Therefore, osteoclast formation is at least one of these indicators. Judgment can be made based on the measurement.
  • Osteoclasts are preferably TRAP-positive and have bone resorption activity. Osteoclasts also share CFU-M force as described above.
  • the differentiation can be performed by, for example, bone marrow monocyte / macropnage precursor cells (BMMs) isocratic macrophage colony s timulating factor; M-CSF), Intai-Leukine-3 (IL-3), Granulocyte-Macroph Ding ⁇ , Ncoloni ' ⁇ Stimulating Factor (GM-CSF), 1, 25-Dihydroxy In the presence of vitamin D3 (1, 25 (OH) D)
  • BMMs bone marrow monocyte / macropnage precursor cells
  • M-CSF isocratic macrophage colony s timulating factor
  • IL-3 Intai-Leukine-3
  • GM-CSF Granulocyte-Macroph Ding ⁇
  • GM-CSF Ncoloni ' ⁇ Stimulating Factor
  • osteoclasts can be observed, for example, according to the literature (Yasuda, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95th, p. 3597-602 (1998)).
  • S can.
  • a bone slice can be prepared and bone resorption can be observed.
  • osteoclast formation both in vivo and in vitro by identifying multinucleated giant cells by microscopic observation, known detection methods such as TRAP staining and detection of calcitonin receptor or vitronectin receptor expression. Can be detected.
  • the bone resorption ability can be evaluated by a known method, for example, a Pit formation assay method for measuring the pit formation area on the ivory slice.
  • the “osteoclast precursor cell” includes monocytes / macrophage cells that can differentiate into osteoclasts, and more specifically, cells whose proliferation is promoted in response to M-CSF or the like. Is preferred. Osteoclast precursor cells are cells contained in the bone marrow or spleen It may be an immortalized cell line. Osteoclast precursor cells can also be separated from hematopoietic stem cells in vitro.
  • “suppressing L-serine and Z or L glycine signal transduction pathway” is a signal transduction pathway that transmits L-serine and Z or L glycine concentrations and their functional information, and includes NFAT2 This refers to the suppression of signal transduction pathways involved in the expression of NFATcl (hereinafter referred to as NFAT2), particularly the expression of the NFAT2 gene, and also includes the inhibition or suppression of signal transduction itself.
  • NFAT2 NFAT2
  • L-serine and Z or L glycine antagonists are administered to reduce the effective concentration of L-serine and Z or L glycine, L-serine and Z or L glycine metabolism, These include the ability to substantially reduce the concentration of L-serine and Z or L-glycine by promoting modification and Z or degradation, and to block the receptors for L-serine and Z- or L-glycine with antibodies.
  • the signal transduction pathway may suppress any expression of binding protein such as a receptor or a transporter that senses the concentration of L-serine, L-glycine, or their derivatives.
  • Its binding protein strength includes suppression of NFAT2 expression, particularly suppression of signal transduction pathway leading to expression of NFAT2 gene.
  • a signal indicating that the concentration or activity of L-serine and Z- or L-glycine is substantially reduced can be transmitted to suppress the expression of NFAT2, particularly the expression of the gene for NFAT2, it is possible to suppress any part of the signal transduction pathway. May be.
  • signals are transmitted via substances synthesized from L-serine and Z or L-glycine, or metabolites generated from L-serine and Z- or L-glycine (including lipids and sugars with serine added). This also includes cases where the suppression of NFAT2 expression, particularly the suppression of NFAT2 gene expression.
  • L-serine and Z or L-glycine in order to suppress the signal transduction pathway of L-serine and Z or L-glycine, it is a transduction pathway different from the signal transduction pathway of serine and Z or L-glycine, and at least part of the different transduction pathway.
  • L-serine and Z or L-glycine when L-serine and Z or L-glycine are involved and NFAT2 is expressed, particularly when the NFAT2 gene is expressed, it also includes inhibiting the involvement (action) of L-serine and Z or L-glycine.
  • NFAT2 is one of the transcription factors that are dephosphorylated and translocated into the nucleus and activated in a Ca + -calcuulin-dependent manner. NFAT2 was discovered as a factor that regulates the production of cytoforce-in in T cells, but plays an important role in the function or sorting of many cells (Crabtree, GR and Olson, EN, Cell, No. 1). 109 ⁇ : S67-S79, 2000) o Therefore, such functions and functions can be suppressed by suppressing the expression of NFAT2 by the method or agent of the present invention.
  • NFAT2 the base sequence of human NFAT 2 mRNA is shown in Accession number NM-006162, and the amino acid sequence of the protein is shown in NP-006153.
  • NFAT2 includes fragments, homologues, homologues, derivatives, and mutants, provided that the biological function is equivalent to that of NFAT2 represented by the above specific amino acid sequence alone. Is done.
  • homologues include N FAT2 of other species such as mice and rats that correspond to human NFAT2, and these are identified by HomoloGene (http: ZZwww.ncbi.nlm.nih.gov ZHomoloGeneZ), etc. It can be identified a priori from the base sequence of the generated gene.
  • mouse NFAT2 mRNA is Accession number AF239169, AF087434 (Isoform a), and AF049606 (Isoform b), and the amino acid sequences of the NFAT2 proteins encoded by these are AAC36725, AAC 36725, and AAC0550, respectively. This is shown!
  • Variants also include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, and variants having amino acid sequences modified by artificial deletions, substitutions, additions and insertions.
  • the above-mentioned mutant includes a protein or (poly) peptide having no mutation and an amino acid sequence of at least about 70%, preferably about 80%, more preferably about 95%, and still more preferably about 97%. Things can be mentioned.
  • Suppression of NFAT2 expression includes suppression of NFAT2 gene expression, transcription and Z or translation of NFAT2 gene, and transcriptional repression through suppression of NFAT1 expression and activity (Zhou B et. Al., J Biol. Chem., 277, p. 10704, 2002), NFAT2 mRNA destabilization, NFAT2 protein degradation, exogenously cleaves antisense nucleic acid or NFAT2 mRNA against NFAT2 mRNA Inhibition of NFAT2 expression by expressing ribozyme or RNAi is included.
  • Preferred U ⁇ NFAT2 expression The suppression of NFAT2 gene is suppressed.
  • a gene in the sense of including not only double-stranded DNA but also each sense strand and antisense strand constituting the single-stranded DNA.
  • the length is not particularly limited. Therefore, in this specification, unless otherwise specified, a gene (DNA) has double-stranded DNA including human genomic DNA and single-stranded DNA (positive strand) including cDNA and a sequence complementary to the positive strand. Single-stranded DNA (complementary strand) and any of these fragments are included.
  • the gene or DNA includes not only a gene or DNA represented by a specific nucleotide sequence but also a protein having a biological function equivalent to the protein encoded by these (for example, homologues, homologues, mutants and derivatives). Etc.) are included.
  • Examples of the gene or DNA encoding such a homologue, mutant or derivative include a gene or DNA that also has a base sequence ability to hybridize with a complementary sequence of a specific base sequence under stringent conditions.
  • the stringent conditions here are nucleic acids that bind complexes or probes as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). Can be determined based on the melting temperature (Tm).
  • the post-hybridization washing conditions usually include conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”.
  • the complementary strand is preferably one that maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under strong conditions.
  • the more stringent hybridization conditions are approximately “0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C”, and more stringent hybridization conditions (washing conditions after hybridization).
  • a complementary chain a strand having a nucleotide sequence that is completely complementary to the base sequence of the target positive strand, and at least about 90%, preferably about 95% of the strand.
  • An example is a chain having a homologous nucleotide sequence.
  • a substance that antagonizes L-serine refers to a lower L-serine concentration or activity in the L-serine and Z- or L-glycine signal transduction pathway.
  • examples of such substances include amino acid analogs of L-serine and Z or L-daricin.
  • Typical examples include, but are not limited to, D-serine and L-homoserine, which are amino acid analogs that can suppress the L-serine and Z- or L-glycine signaling pathways, and express NFAT2 (preferably NFAT2 residues). Anything can be used as long as it can suppress the expression of the gene).
  • NFAT2 The expression of NFAT2 can be observed by Western plot, for example, by adding a substance that antagonizes L-serine to cultured cells as in Example 10. Since the differentiation of osteoclasts can be determined using the index of polynuclearization (cell fusion), TRAP, calcitonin receptor, vitronectin receptor, collagenase expression or bone resorption ability, The effect of a substance that antagonizes L-serine and Z or L-glycine is determined using the negative indicator as an indicator.
  • L-serine analog typically refers to an amino acid analog of L-serine, but is not limited thereto.
  • the L-serine analog may be any substance that is structurally or functionally similar to all or part of L-serine, for example, acts in competition with L-serine in vivo.
  • L-serine receptor may be a substance designed by drug design from L-serine receptor and a substance that antagonizes L-serine.
  • pharmaceutically acceptable salts of L-serine include alkali metal (potassium, sodium, lithium, etc.) salts, alkaline earth metal (calcium, magnesium, etc.) salts, ammonium salts (tetramethylammonium salts), and the like.
  • L-Um salt tetrabutylammonum salt, etc.
  • organic amine triethylamine, methylamine, dimethylamine, etc.
  • acid adduct salt organic acid salt (hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide) Sulfate, phosphate, nitrate, etc.) or organic acid salt (acetate, lactate, tartrate, oxalate, fumarate, maleate, benzoate, kenate, methanesulfonate , Glucuronate, dalconate, etc.
  • L-serine ester include And esters of lower alkyl groups such as ru, ethyl and propyl.
  • the L-serine analog may be a hydrate or a solvate.
  • Hydrates or solvates are preferably non-toxic and water-soluble. Examples of the hydrate include monohydrate, dihydrate, 1Z2 hydrate, or 4Z3 hydrate. Examples of the solvate include alcohol-based solvates such as an adduct of ethanol. Is mentioned.
  • L-serine-like substances include D-serine and L-homoserine.
  • D-serine or L-homoserine may be a salt thereof or an ester thereof.
  • the salts include all pharmaceutically acceptable ones.
  • examples of the salt include the above-described pharmaceutically acceptable salts of L-serine.
  • Examples of the ester form include the above-described ester forms of L-serine.
  • Specific examples of D-serine, L-homoserine, their salts, or esters thereof include D-serine methyl ester hydrochloride and L 2 O strong oil homoserine.
  • a substance that antagonizes L-serine is brought into contact with the signal transduction pathway of L-serine and Z- or L-glycine.
  • the contact includes contact with a protein in which L-serine and Z or L-glycine act or associate, or contact with, for example, a cell, tissue or individual having the signal transduction pathway.
  • the ability to antagonize L-serine for example, compete with L-serine and Z or L-glycine, etc. Inhibits or suppresses signal transmission.
  • the method of the present invention by suppressing the signal transduction pathway of L-serine and Z or L-glycine, it is possible to suppress the expression of NFAT2, particularly the expression of the NFAT2 gene.
  • NFAT2 When the expression of NFAT2 is suppressed, osteoclast formation is inhibited.
  • Osteoclasts are cells that absorb bone, and abnormalities in the cells cause NFAT2-related diseases such as osteoporosis and bone diseases such as marble bone disease and immune diseases. Therefore, the method of the present invention can be used in a method for preventing or treating NFAT2-related diseases such as bone diseases and immune diseases such as osteoporosis and marble bone disease.
  • NFAT2 induces a site-in force that activates immune responses such as interleukin 2 (IL 2). Since it is known to have a conducting activity, the method of the present invention can also be used for immunosuppression.
  • IL 2 interleukin 2
  • the method of the present invention it is preferable to contact and Z or introduce a substance that antagonizes L-serine, such as D-serine, into osteoclast precursor cells.
  • a substance that antagonizes L-serine such as D-serine
  • osteoclast progenitor cells By contacting osteoclast progenitor cells with substances that antagonize L-serine, such as D-serine and L-homoserine, efficiently disrupt NFAT2 expression in osteoclast precursor cells, especially by suppressing NFAT2 gene expression. It can inhibit bone cell formation.
  • the method of the present invention comprises administration of an effective amount of a substance that antagonizes L-serine, such as D-serine, L-homoserine, a salt thereof or an ester thereof, to a mammal.
  • the administration may be either oral administration or parenteral administration as long as the signal transduction pathway of L serine and Z or L glycine in the living body can be suppressed.
  • Substances that antagonize L-serine, such as D-serine and L-homoserine, which are used in the method for suppressing the expression of the NFAT2 gene of the present invention, can suppress the formation of osteoclasts.
  • it can be used as a preventive or therapeutic agent for autoimmune arthritis such as rheumatoid arthritis, osteopenic disease such as osteoporosis, or as an immunosuppressive agent such as immune disease.
  • One embodiment of the present invention includes administration of D-serine, for example.
  • Administration of D-serine suppresses NFAT2 expression, particularly NFAT2 gene expression.
  • the concentration of D-serine necessary for this suppression is about 5 to 20 times, preferably about 10 times that of L-serine.
  • the method for suppressing NFAT2 expression is also preferably used in combination with a drug or the like that inhibits osteoclast formation.
  • a drug or the like that inhibits osteoclast formation examples include an inhibitor of calci-eurin.
  • Inhibitors of calcineurin include FK506, cyclosporin A (CyAZCsA), and analogs thereof.
  • the screening method of the present invention can be performed, for example, using an osteoclast differentiation system. wear. That is, the screening method of the present invention comprises the following steps (a) and (b): (a) L-serine and Z or L glycine signaling in osteoclast precursor cells in the presence of a sample containing the test substance. Detecting the suppression or promotion of
  • osteoclast precursor cells for example, bone marrow macrophage cells.
  • bone marrow macrophage cells are preferably used. More specifically, BMMs, RAW264.7 cells (macrophage-like cells; sometimes abbreviated as RAW264 cells), embryonic stem cells (ES cells), and the like. RAW264 cells are preferred.
  • mouse RAW264 cells (RIKEN Cell Bank; HYPERLINK HYPERLINK "htt p: ZZ www.rtc.riken.go.jpZ CELL / HTML / RIKEN" http: //www.rtc.riken.go.jpZ CELL / HTML / RIKEN ⁇ http: / / www. Rtc. Riken. Go. Jp / CELL / HTML / RIKEN Cell Bank. (Available from Html) can be divided into osteoclasts by adding RANKL, a differentiation inducer. Is a known cell (Biochem. Biophys. Res. Commun. 282, 278-283 (2001)).
  • osteoclast precursor cell force For osteoclast formation, it is usually preferable to stimulate osteoclast precursor cells with RANKL in the presence of M-CSF. Specifically, for example, to form osteoclasts from BMM or ES cells, RANKL stimulation is performed in the presence of M-CSF.
  • concentration of M-CSF and RANKL can be adjusted as appropriate.
  • the concentration of M-CSF is about 1 to 20 ngZmL, preferably about 5 to 15 ngZmL, more preferably about 8 to 12 ngZmL.
  • the concentration of RANKL is about 10 to 20 Ong / mL, preferably about 50 to 150 ngZmL, more preferably about 80 to 120 ngZmL.
  • cells that differentiate into osteoclasts in response to RANKL in an M-CSF-independent manner such as RAW264 cells, can be used to form osteoclasts, even in the absence of M-CSF. Since differentiation is possible, only RANKL stimulation needs to be performed.
  • the concentration of RNAKL The degree is the same as the above-described concentration.
  • osteoclasts in which frozen rat osteoclast progenitor cells (derived from bone marrow), a dedicated medium containing M-CSF and RANKL, and dentin slices for Pit formation assay are set.
  • a culture kit manufactured by Hokudo Co., Ltd.
  • the like can also be preferably used.
  • the sample containing the test substance is not particularly limited, for example, a library of amino acid analogs, a library of synthetic low molecular weight substances, purified proteins, expression products of gene libraries, libraries of synthetic peptides, cell extraction Liquids, cell culture supernatants, plant extracts, microorganism-derived substances, and the like.
  • NFAT2 expression can be detected using a known method such as Western blot, dot blot or slot blot, for example, using an antibody that specifically binds to NFAT2.
  • a known method such as Western blot, dot blot or slot blot, for example, using an antibody that specifically binds to NFAT2.
  • the Western plot method uses an NFAT2 antibody as a primary antibody, then a chemiluminescent reagent such as HRP (horseradish bar oxidase) as a secondary antibody, a radioisotope such as 125 ⁇ , and a fluorescent substance.
  • HRP horseradish bar oxidase
  • a labeled antibody (antibody that binds to the primary antibody) labeled with a signal such as chemiluminescence, radioisotope, fluorescent substance, etc. of the obtained labeled compound, the fluorescence emission detector, radiation measuring instrument, It can be carried out by detecting and measuring with a fluorescence detector or the like.
  • NFAT2 expression is preferably detected by detecting the expression level of a gene.
  • the detection of the NFAT2 gene at the gene expression level uses the RNA prepared from the cells or a polynucleotide complementary to the RNA transcribed from the RNA and the promoter region of the NFAT2 gene or NFAT2 gene, for example.
  • RNA prepared from the cells or a polynucleotide complementary to the RNA transcribed from the RNA and the promoter region of the NFAT2 gene or NFAT2 gene, for example.
  • Northern blotting and RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
  • NFAT2 binding sequence [GGAAAA and its similar sequences (eg, GGAAAN, etc., N is A, T, C, or G), Macian, F. et al., Oncogene, XXV, p. 2476-2489. , 2001], preferably NFAT2 and transcription factor AP-1 (activator monoprotein 1) binding sequence [TGA [GZC] TCA and similar sequences (eg, TGNNTCA, etc., where N is A, T, C, or G) ,: Bio Science New DNA containing the term library “transcription factor”, experimental medicine separate volume, Yodosha, pp. 204-205] is preferred.
  • a DNA having a desired reporter gene bound downstream of the DNA can also be preferably used.
  • transcription from the NFAT2 promoter can be monitored by quantifying the expression level of the reporter gene using reporter activity or the like as an index.
  • specific examples of the promoter sequence include a TRAP promoter and a calcitonin promoter (P3 promoter).
  • the reporter gene include luciferase gene, fluorescent protein gene (GFP, YFP, BFP, etc.), chloramphee-cole acetyltransferase gene, monogalactosidase gene, and the like.
  • genes induced by NFAT2 include TRAP, calcitonin receptor, cathepsin K, canolepoc anhydrase II (carbonic anhydrase II; CA 11), or a gene such as matrix metalloproteinase (MMP) 9.
  • Promoter sequences containing the NFAT2 binding sites of these genes can be suitably used as promoters linked to the reporters.
  • These genes are induced in the final segment of osteoclasts and contain multiple NFAT2 and AP-1 binding sites (Anusaksathien, O. et al., J Biol. Chem., 276, p. 22663). -22674, 2001; David, P. et al., J.
  • the detection and quantification of the expression level of the NFAT2 gene is performed by connecting a marker gene such as a luciferase gene to the gene region that controls the expression of the NFAT2 gene (expression control region)! Can also be carried out by measuring the activity of the protein derived from the marker gene.
  • the screening method for an NFAT2 expression control substance of the present invention includes a method for searching for a target substance using the expression level of the marker gene as an index.
  • the concept of “NFAT2 gene” includes a fusion gene between the expression control region of the NFAT2 gene and a marker gene.
  • the marker gene includes a structural residue of an enzyme that catalyzes a luminescence reaction or a color reaction.
  • the gene is preferred.
  • reporter genes such as chloramphenicol acetyltransferase gene, j8 glucurodase gene, j8 galactosidase gene, and equorin gene may also be used. it can.
  • the expression control region of the NFAT2 gene for example, about 1 kb upstream of the transcription initiation site of the gene, preferably about 2 kb can be used. Creation of the fusion gene and measurement of the activity derived from the marker gene can be performed by known methods.
  • Suppression or promotion of NFAT2 protein or NFAT2 gene expression as an indicator is based on the expression level of the reporter gene by the NFAT2 protein or NFAT2 gene or NFAT2 inducible promoter in a control cell without adding a test substance. This can be done by comparing the expression level of the NFAT2 protein or the gene in the cells to which the test substance is added. For example, the expression level of the NFAT2 protein or the gene in the cell to which the test substance is added is about 90% or less, preferably 40% or less of the expression level of the NFAT2 protein or the gene in the control cell to which no test substance is added.
  • the test substance suppresses signal transduction of L-serine and Z or L-glycine in osteoclast precursor cells when it is lower than 30%, particularly preferably lower than 20%, particularly preferably lower than 10%.
  • the expression level of the NFAT2 protein or the gene in the cell to which the test substance is added is about 110% or more of the expression level of the NFAT2 protein or the gene in the control cell to which the test substance is not added, preferably Is 120% or higher, more preferably 130% or higher, particularly preferably 150% or higher
  • the test substance is a candidate for promoting L-serine and Z or L glycine signaling in osteoclast precursor cells It can be selected as a substance.
  • association between the suppression or promotion of NFAT2 protein or NFAT2 gene expression as an indicator and the suppression or promotion of osteoclast formation is related to the formation of osteoclasts when the expression of NFAT2 protein or NFAT2 gene as an indicator is suppressed.
  • osteoclast formation should be promoted to the same extent.
  • the screening method of the present invention provides a candidate substance that becomes an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for bone metabolic abnormalities related to osteoclast formation by searching for substances that suppress the expression of NFAT2 or NFAT2 gene. To do.
  • Selection of candidate substances can be performed using as an indicator that the expression of NFAT2 or NFAT2 gene induced by the expression inducer is suppressed by the presence of the test substance. That is, the expression of NFAT2 or NFAT2 gene in cells contacted with a test substance in the presence of an expression inducer is lower than that of a control cell that does not contact the test substance in the presence of an expression inducer! /! Control cells.
  • the test substance can be selected as a candidate substance. Specifically, L-serine and Z or L-glycine signal transduction is measured by the above method in the presence of a sample containing the test substance, and a substance that promotes or suppresses the signal transduction is selected compared to the control.
  • Control conditions include the absence of the test substance or a lower dose, typically in the absence of the test substance (e.g., only the carrier used to add the test substance). (Addition).
  • the test substance containing a lower dose is used as a control condition, the dose dependency of the substance becomes clear.
  • NFAT2 expression or NFAT2 gene expression in cells contacted with a test substance in the presence of an expression inducer is lower than that in positive control cells contacted with a known compound that regulates osteoclast formation.
  • the test substance can be selected as a candidate substance by becoming or becoming higher.
  • a substance that promotes or suppresses signal transduction of L-serine and Z- or L-glycine can be selected as compared with the case in the presence of the compound used as a positive control. In such screening, a substance having a higher effect than that of a compound used as a positive control can be obtained.
  • NFAT2 NFAT2 gene
  • the screening method of the present invention searches for substances that promote the expression of NFAT2 or the NFAT2 gene, and thus is a candidate substance that serves as an active ingredient for the prevention and Z or therapeutic agent of bone metabolic disorders related to osteoclast formation. Is to provide.
  • Selection of candidate substances can be performed using as an indicator that the expression of NFAT2 or NFAT2 gene induced by the expression inducer is promoted by the presence of the test substance. That is, the expression of NFAT2 or NFAT2 gene in cells contacted with a test substance in the presence of an expression inducer is higher than that of a control cell that does not contact the test substance in the presence of an expression inducer!
  • the test substance can be selected as a candidate substance.
  • L-serine and Z or L-glycine signal transduction is measured by the above method in the presence of a sample containing the test substance, and a substance that promotes or suppresses the signal transduction is selected compared to the control. Control conditions and the like are the same as in the search for a substance that suppresses the expression of NFAT2 and Z or NFAT2 gene.
  • Examples of the medium used in the screening method of the present invention include a natural medium, a semi-synthetic medium, a synthetic medium, a solid medium, a semi-solid medium, and a liquid medium.
  • a natural medium a nutrient medium that is used for culturing animal cells, particularly hematopoietic stem cells, it is possible to use s / m.
  • Examples of such a medium include Dulbecco's Modified Eagles' Medium (DMEM), Ham's Nutrient Mixture Fl 2, Hamco's 5A medium, and McCoy's 5A medium.
  • Minimum MEM medium Minimum Essential Medium; MEM
  • ⁇ -MEM medium a-modified Minimum Essential Medium; a-MEM
  • RPMI1640 medium Iscov's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)
  • IMDM Iscov's Modified Dulbecco's Medium
  • StemPro34 Invitrogen
  • X—VIVO 10 Cell
  • X—VIVO 15 Cell
  • HPGM Cell Technology
  • StemSpan H3000 Stemline II
  • Stemline II Stemline II
  • QBSF-60 Quality Biological Company
  • the screening method of the present invention can be performed using, for example, an in vitro assay system for osteoclast formation.
  • non-contact bone marrow cells (5 ⁇ 10 5 cells per well of a 24-well plate) are cultured for 2 days in, for example, a MEM containing about 10 ng / mL of M-CSF, and soluble in about 10 mL / mL
  • the sample containing the test substance is added here and cultured.
  • an osteoporosis model mouse by ovariectomy or an endotoxin-induced bone resorption animal model The system using is used.
  • an osteoclast-forming system from ES cells can be used.
  • a screening system using ES cells cells lacking a desired gene involved in osteoclast formation can be used. If an osteoclast-forming system from gene-deficient ES cells is used, useful information can be obtained depending on which signal pathway of the osteoclast-forming signal the test substance is involved in.
  • the test used is a candidate for a substance that regulates osteoclast formation.
  • Substances isolated by this screening method are useful for controlling osteoclast formation, and are also useful for developing preventive and therapeutic agents for bone metastasis.
  • the screening method of the present invention is also a method for examining the effect of a substance on osteoclast formation, a substance that suppresses osteoclast formation can be identified by this method.
  • the screening method of the present invention can be used to screen for a substance that antagonizes L-serine involved in osteoclast formation.
  • a test substance is added to a medium containing L-serine and RANKL, and osteoclast precursor cells are cultured, and signal transduction of L-serine and Z or L-glycine in osteoclast precursor cells is performed as described above. It is preferable to measure.
  • the test substance can be identified as an antagonist of L-serine.
  • the identified L-serine antagonist can be preferably used as a substance that suppresses osteoclast formation.
  • the degree of the suppression is the expression level of the NFAT2 protein or the gene in the cells to which the test substance is added.
  • the expression level is about 90% or less, preferably 40% or less, more preferably 30% or less, particularly preferably 20% or less, and particularly preferably 10% or less.
  • a medium that does not contain L-glycine it is preferable to use a medium that does not contain L-glycine. Specifically, for example, a medium in which ⁇ -MEM force L-glycine is removed and any L-serine is added to the medium is prepared, and the prepared medium is used.
  • BMM or ES cells can be cultured in the presence of M-CSF and RANKL, or RAW264 cells can be cultured in the presence of RANKL.
  • concentrations of M-CSF and RA NKL are the same as those described above.
  • the screening method of the present invention is also a method for screening L-serine and Z- or L-glycine-like substances involved in osteoclast formation.
  • the test substance is added to the medium excluding L-serine and L-glycine and the osteoclast precursor cells are cultured, and L-serine and osteoclast precursor cells in the osteoclast precursor cells are cultured in the same manner as described above. It is preferred to measure Z or L glycine signaling. If the measurement shows that NFA T2 expression or NFAT2 gene expression is promoted, the test substance can be identified as L-serine and Z- or L-glycine-like substances.
  • the identified L-serine and Z or L glycine-like substance can be preferably used as a substance that promotes osteoclast formation.
  • the degree of the promotion is determined by the expression level of NFAT2 protein in the cells to which the test substance is added or the gene is not added to the test substance.
  • a medium in which ⁇ -MEM is also removed from L-serine and L-glycine is prepared, and for example, BMM or ES cells are cultured in the presence of M-CS and RANKL using the prepared medium.
  • BMM or ES cells are cultured in the presence of M-CS and RANKL using the prepared medium.
  • RAW264 cells are cultured in the presence of RANKL.
  • concentrations of M-CSF and RANKL are the same as those described above.
  • the substance obtained by the screening of the present invention can be used as an inhibitor or promoter of osteoclast formation.
  • the conditions for administration of the substance for clinical application can be determined using the osteoclastogenic system described herein. That is, by using the above-described test method, administration conditions including dosage, administration interval, and administration route can be examined, and conditions under which appropriate preventive or therapeutic effects can be obtained can be determined.
  • Such a substance becomes a medicament for prevention or treatment of NFAT2-related diseases and the like.
  • the substance may be used as it is or in a known pharmaceutically acceptable additive such as excipients (for example, lactose, sucrose, glucose, starch, crystalline cellulose, etc.), binders (for example, starch paste, hydroxypropyl cellulose, Carmellose solution, gum arabic solution, gelatin solution, sodium alginate solution, etc.
  • excipients for example, lactose, sucrose, glucose, starch, crystalline cellulose, etc.
  • binders for example, starch paste, hydroxypropyl cellulose, Carmellose solution, gum arabic solution, gelatin solution, sodium alginate solution, etc.
  • Lubricant eg, magnesium stearate, talc, stearic acid, calcium stearate, etc.
  • disintegrant eg, starch, carmellose sodium, calcium carbonate, etc.
  • solvent eg, water for injection, sterile purified water, physiological Salt solution, buffer solution, vegetable oil, etc.
  • emulsifier eg, polyoxyl 40 stearate, sorbitan sesquioleate, polysorbate 80, sodium lauryl sulfate, lauromacrogol, gum arabic, popidone, etc.
  • suspending agent eg canolemellose, methyl) Noresenorelose, hydroxypropenoresenololose, hydroxypropinolemethylcellulose, popidone, etc.
  • stabilizers eg sodium bisulfite, sodium thiosulfate, sodium edetate, sodium citrate, ascorbic acid, dibutylhydroxytoluene) N ), Preservative
  • the pharmaceutical composition is prepared in a dosage form (tablet, pill, capsule, powder, granule, syrup, etc., orally administered; injection, infusion, external preparation, suppository, etc.) ) Etc., it can be administered orally or parenterally.
  • the pharmaceutical composition may be a sustained-release preparation or a DDS (drug deli- nory) preparation together with a controlled release substance.
  • the release controlling substance include ⁇ -hydroxycarboxylic acids known per se (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.), hydroxydicarboxylic acids (eg, malic acid, etc.), hydroxytricarboxylic acids (eg, cuenic acid).
  • Etc. and other polymers synthesized by non-catalytic dehydration polycondensation, copolymers or mixtures thereof, poly- ⁇ -cyanacrylic acid esters, poly-amino acids (eg, poly- ⁇ -benzyl-L And biodegradable polymer substances such as maleic anhydride copolymers (eg, styrene maleic acid copolymers).
  • Administration to patients depends on the nature of the active ingredient and the dosage form to be prepared, for example, transdermal, intranasal, transbronchial, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, intraarticular, subcutaneous, spinal cord It can be performed intracavitary, intraventricularly, or orally, but is not limited thereto. Administration can be systemic or local, but when side effects due to systemic administration are a problem, local administration to the lesion site is preferred. Dosage, administration method, tissue migration of the active ingredient of the pharmaceutical composition, therapeutic purpose, although it varies depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., those skilled in the art can appropriately select them.
  • the pharmaceutical composition can be used as a preventive and Z or therapeutic agent for NFAT2-related diseases.
  • NFAT2-related diseases include osteoporotic diseases in which bone mass is reduced by osteoclasts, or osteosclerotic diseases due to osteoclast formation failure or dysfunction.
  • bone softening diseases include primary osteoporosis, age-related (senile) osteoporosis, secondary osteoporosis and the like.
  • Secondary osteoporosis is caused by endocrine / metabolic abnormalities (eg, hyperparathyroidism, gonadal dysfunction, Turner syndrome, anorexia nervosa syndrome, Klinefelter syndrome, etc.), inflammation (eg, rheumatoid arthritis, etc.) , Based on congenital diseases (eg osteogenesis imperfecta, homocystinuria, mastocytosis, mastocytoma, mastocytosis, etc.), based on blood diseases (eg multiple myeloma, etc.), based on drugs (For example, steroid osteoporosis). Examples of osteosclerotic diseases include marble bone disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention usually contains about 0.1 to 90% by mass of the therapeutic agent (the above substance) by weight of the total composition.
  • the dosage varies depending on the type of active ingredient, administration route, administration subject or patient's age, body weight, symptoms, etc., and cannot be specified unconditionally, but for parenteral administration, about 0.0001 to 1000 mg / kg body weight per kg is preferred.
  • Preferably ⁇ is about 0.001 to 300 mg, more preferably about 0.01 to: LOOmg.
  • these dosage rates may be adjusted accordingly. preferable.
  • the administration can be divided into 1 to several times, and can be administered about 1 to 5 times a day.
  • the target individuals include humans or mice, non-human mammals such as rats, rabbits, inu or monkeys, and other vertebrates.
  • Application to non-human mammals is also useful as a model for developing preventive or therapeutic methods for human bone destructive diseases or osteosclerotic diseases.
  • New therapeutic protocols to prevent osteoporotic dysfunction and dysfunction in N FAT2-related diseases such as osteoporosis and bone destruction in autoimmune arthritis and marble bone disease Can be developed.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful for the treatment and prevention of NFAT2-related diseases.
  • the pharmaceutical composition containing a substance that suppresses L serine and Z or L glycine signaling in osteoclast progenitor cells of the present invention is used for the treatment and prevention of osteopenic diseases involving bone resorption by osteoclasts and Z Or it is useful for prevention.
  • Specific diseases that are the main treatment targets include autoimmune arthritis, particularly including rheumatoid arthritis (RA).
  • RA rheumatoid arthritis
  • Rheumatoid arthritis is an autoimmune chronic inflammatory disease in which the proliferated synovium actively invades osteochondral, resulting in multiple joint destruction.
  • the preventive and Z or therapeutic agent for N FAT2-related diseases of the present invention is suitably used to prevent this joint bone destruction.
  • N FAT2-related diseases to which the NFAT2-related disease prevention and Z or therapeutic agents of the present invention can be applied include periodontal disease.
  • the preventive and Z or therapeutic agent for NFAT2-related diseases of the present invention includes bone resorption by osteoclasts including giant cell tumor, cancer bone metastasis, and pigmented villonodular synovitis (PVS). It can also be applied to various diseases in which hyperactivity is a disease state. It is also expected to be applied to the treatment of osteoporosis and hypercalcemia of cancer.
  • the pharmaceutical composition containing a substance that promotes the signal transmission of L-serine and Z or L-glycine in osteoclast precursor cells of the present invention is an osteosclerotic disease caused by osteoclast formation or functional failure, Useful for prevention and Z or treatment of bone resorption disorders. Therefore, the preventive and Z or therapeutic agent for NFAT2-related diseases of the present invention can be used for diseases based on osteoclast dysplasia or dysfunction such as marble bone disease. [0044] The present invention can also be used in combination with other NFAT2 expression-suppressing (or promoting) agents or osteoclast formation-inhibiting (or promoting) agents.
  • kits for the treatment of osteopenic disease which includes a kit containing a calci-eurin inhibitor and D-serine.
  • a calci-eurin inhibitor in combination with D-serine, a synergistic inhibitory effect on osteoclast formation can be expected.
  • cyclosporin A and FK506 are particularly preferable.
  • non-essential amino acid was purchased from Nacalai Tesque (Kyoto), and L-homoserine and D-serine were purchased from Sigma (USA). [ 3 H] -L-serine was purchased from Amersham Bioscience. When various non-essential amino acids were added individually, they were adjusted to the same concentration as the final concentration when the above mixture was used. L-homoserine and D-serine will be described each time.
  • SpectraZPor (registered trademark) 6 regenerated nitrocellulose dialysis membrane (MWCO lOOO) [manufactured by Spectrum Laboratories Inc.] was used for dialysis of serum.
  • the dialysis membrane was cut to about 10 cm and rinsed easily with distilled water for culture.
  • the dialysis membrane was immersed in a 5% sodium bicarbonate solution containing 10 mM EDTA, washed at 60 ° C. for 1 hour, and then washed with 1 L of distilled water for culture for 5 minutes. This washing with distilled water for culture was repeated three times. After washing, blood is applied to the dialysis membrane The supernatant was added and dialyzed overnight at 4 ° C.
  • a MEM As a medium for inducing osteoclast progenitor cells from mouse bone marrow cells, a MEM [manufactured by Sigma] was dissolved in 1 L of distilled water for culture, and autoclaved at 120 ° C for 15 minutes. After high-pressure steam sterilization, lOOmL of rabbit fetal serum (FBS) was added to the medium cooled to room temperature, and M-CSF [manufactured by Sigma] was added to a final concentration of 5 ngZmL.
  • FBS rabbit fetal serum
  • Mouse monocyte macrophage-derived cell line RAW264 was seeded on a 10 cm plate and cultured in 10 mL of the above medium at 37 ° C. and CO concentration of 5%. Cells on one side of the plate
  • Mouse bone marrow cells IX 10 6 Z-wells are seeded on a 24-well plate, cultured in a-MEM with 10% FBS, 5 ng ZmL M—CSF at 37 ° C, CO concentration 5%, non-adherent
  • the PCR method was Pfx DNA polymerase (GIBCO-BRL) and 5 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 52 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 1 minute were performed in a 50 L system according to the attached protocol. Thereafter, a cycle of 94 ° C for 15 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 1 minute was performed for 15 cycles.
  • the RANKL gene obtained by amplification by the PCR method was cleaved with the restriction enzyme Mnul, and the C-terminal region 244 amino acids of RANKL was converted to GST (glutathione S-transferase) of pGEX-2TK vector (Amersham Pharmacia Biotech).
  • the vector pGEX-2TK-RANKL was constructed by inserting into BamHI and EcoRI sites located downstream of the coding region.
  • This p GEX-2TK-RANKL [soluble GST-RANKL] and standard vector pGEX — 2TK [GST protein] was introduced into Escherichia coli JM109 and used to express recombinant protein.
  • Super Broth Teryptone Peptone [manufactured by DIFCO] 2.5 g, Bact Yeast Extract [manufactured by DIFCO] 15 g, NaCl [manufactured by Nacalai Tester] 5 g ZlL HO) with ampicillin added at a final concentration of 50 ng ZmL.
  • the main culture was performed at 37 ° C with 5 mL of the nutrient solution until the absorbance of the medium (wavelength: 600 nm) was in the range of 0.6 to 0.8. Thereafter, IPTG (Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 0.25 mM, protein expression induction was started, and the cells were cultured at 18 ° C. for about 12 hours.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • Glutathione Sepharose (registered trademark) 4B (50% s lurry [Amersham Pharmacia Biotech AB]) in the amount of 1Z1000 of the main culture solution was equilibrated in advance with NETN buffer, and the supernatant was added to the supernatant. The reaction was allowed to proceed for 8 hours at ° C.
  • RAW264 Itoda ⁇ or 2. 5 X 10 4 cells in cells ⁇ or 24-well play Bok, 3. 5 cm play ⁇ or 10 X 10 4 cells in Bok, 20 X 10 4 cells in 6cm plate, the 10cm plates 50 X 10 Seeding to 4 pieces The cells were cultured at 37 ° C and CO concentration of 5% for 24 hours. Then contains soluble RANKL
  • the medium was changed (0 hour), and the cells were cultured at 37 ° C and CO concentration of 5%. 72 hours later, freshly prepared again
  • osteoclasts The induction of osteoclasts was performed according to the method shown in Takahashi, N. et al., Generating murine and steoclasts form bone marrow Methods Mol. Med. (2003), pp. 1 29-144.
  • Osteoclast precursor cells obtained from bone marrow cells by the method shown in [Culture and maintenance of cells] were seeded on 24 well plates at 1 ⁇ 10 4 Z-wells and cultured for one day. Thereafter, 500 ngZmL of RANKL and lOOngZmL of M-CSF were added and induction was performed. Every 3 days, the medium was replaced with fresh medium containing the above-mentioned amounts of RANKL and M-CSF.
  • the NFAT2 gene or the GFP gene for comparison was incorporated into the retroviral vector pCX 4puro, and each expression vector was obtained by drug selection with puromycin.
  • These expression vectors were introduced into the packaging cell line Platinum-E (Plat E) together with the pE-eco vector and pGP vector (Takara), and the cells were cultured for 48 hours. The supernatant was filtered with a 0.22 ⁇ pore filter to obtain a stock of retovirus. Osteoclast precursor cells were cultured overnight in the presence of retrovirus, followed by induction of differentiation into osteoclasts as described above.
  • acetic acid pH 5.2
  • 0.026M tartaric acid 0.1% acetic acid (pH 5.2) containing 0.026M tartaric acid and 0.1M acetic acid (pH 5.2) containing 12.5mg / mL naphthol AS—BI phosphate mixed in a 24: 1 ratio to F
  • a solution containing AST GARNET GBC in an appropriate amount and passed through a 0.8 m filter was used as a TRAP dyeing solution.
  • 500 L of TRAP staining solution was placed on the cell-fixed plate and reacted at 37 ° C for 1 hour or longer. At this point, cells with TRAP activity are reddish purple. After the reaction, the TRAP staining solution was removed and the plate was washed with ultrapure water (Fig. 1; TRAP-stained MN cells).
  • the culture plate was transferred to ice after a certain time, and the culture supernatant was removed. After washing the cells twice with PBS cooled to 4 ° C, an appropriate amount of EBC Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 120 mM NaCl, 0.5% NP—40, ImM EDTA, 0.5 mM)
  • the cell extract was frozen in liquid nitrogen and stored at 80 ° C.
  • the amount of protein in the prepared cell extract was measured by the Bradford method, the protein amount of each sample was made the same, and then separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis
  • the protein was transferred onto a PVDF membrane [Poly VinyliDene Fluoride; manufactured by Millipore] by wet blotting using a blotting tank. After transfer, the PV DF membrane was washed with PBS for 5 minutes and blocked with 5% Skim MilkZPBS for 1 hour.
  • the primary antibody diluted with 5% BSAZPBS was reacted for 2 hours or more.
  • the PVDF membrane was washed with PBS for 5 minutes, PBST for 10 minutes, and PBS for 5 minutes in this order.
  • the PV DF membrane was reacted with a secondary antibody diluted with 5% Skim MilkZPBS for 45 minutes at room temperature, then PBS for 5 minutes, PBST (Phosphate Buffered SalineZTween) for 10 minutes, and PBS for 5 minutes in this order.
  • the PVDF membrane was washed, and the separated proteins were detected by ECL (Amersham Bioscience) or ECL Plus (Amersham Bioscience).
  • Figure 2 shows the results of Western blotting using these protocols under the following conditions.
  • NFAT2 10 to 20 ⁇ L / lane ⁇ detected with ECL plus (about 1 to 5 minutes)
  • the medium was collected and passed through a 0.2 m filter to remove the cells. This was used as a low density recovery medium.
  • 40 ⁇ 10 5 RAW264 cells were seeded on a 10 cm plate, and a medium collected by the same method was used as a high-density collection medium.
  • the medium is 37 ° C, CO concentration is 5%
  • Fresh medium The medium that had been cultured for 24 hours in 2 was designated as Fresh medium. These media were stored at 4 ° C, and the necessary amount of soluble RANKL was added to these media when osteoclast differentiation was induced.
  • Middle force of NFAT2 gene sequence A target sequence (5, —GGTACGTACGGATATCA GG—3 ′; SEQ ID NO: 3) was selected, and the corresponding DNA was incorporated into a pSUPER vector (Oligo Engin, US) for expression. This vector was introduced into RAW264 cells together with a neomycin resistance cassette, and an NFAT2-siRNA expressing cell line was selected.
  • NFAT2-siRNA expression cell prepared in Example 2 was confirmed.
  • Cell lines were used.
  • two clones, KD-l and KD-4, are shown as representative examples of the NFAT2-siRNA-expressing cell line.
  • MOCK is a strain into which the vector itself used to express siRNA has been introduced (FIG. 4A).
  • the number of cells When seeding RAW264 cells in a dish, the number of cells is increased to 0.5, 1, 2, 4, 4 or 8 times the cell density (2.5 10 4 cells 7 wells) for normal differentiation. After adjustment, differentiation into osteoclasts was induced under the same conditions. Each cell was stained with TRAP after the induction, and stained with TRAP positive cells. As a result, the higher the cell density, the higher the cell density under normal conditions, the lower the efficiency of osteoclast separation (the rate of formation of multinucleated cells). The formation of was almost undetectable (Fig. 5).
  • V a cell line prepared with mouse bone marrow cell force instead of RAW264 cells.
  • the cell number was set at a cell density (1.0 ⁇ 10 4 Z-rules) that normally induces cell sorting. They were prepared 5 times, 1 time, 2 times, 4 times, 8 times, 16 times, and 32 times, and induced to differentiate into osteoclasts under the conditions shown in “Example 1”. After the induction of each cell, TRAP positive cells were stained. As a result, it was confirmed that the formation of osteoclasts did not occur as the cell density increased as in the case of RAW264 cell mouse cells (FIGS. 17A and B). In this way, the same phenomenon as that of RAW264 cells was reproduced in the bone marrow cell line that more closely reflects in vivo phenomena.
  • Fig. 8 compares the formation efficiency of multinucleated cells between the conditioned medium and fresh medium after 96 hours.
  • NFAT2 expression changes In order to investigate the relationship between changes in medium components, NFAT2 expression changes, and multinucleated cell formation, we investigated the factors involved in the formation of multinucleated cells using NFAT2 expression as an index. Possible causes of changes in medium components were (1) some inhibitory factor was secreted under high-density culture, and (2) medium components changed under high-density culture. Therefore, create a conditioned medium with [pre-NEAA (+)] in the presence of NEAA and [pre-NEAA (-)] in the absence. Then, the effect of adding NEA A (post-NEAA) to the subsequent culture (low density) in the collected conditioned medium was investigated.
  • NEAA may play an important role in the expression of NFAT2.
  • Gin since there was concern about how NEAA might affect the growth of RAW264 cells themselves, in order to confirm that NEAA does not affect the growth of cells itself, (Gin), NEAA and RAW264 cells were cultured for 24 hours in the presence or absence of serum. As a result, cell growth and survival were greatly influenced by the presence or absence of serum and glutamine. It was found that there was almost no effect on the presence or absence of non-essential amino acids (Fig. 12).
  • Fig. 16 the effect of D-serine on the formation of multinucleated cells was examined (Fig. 16). As a result, the following were divided. (1) No influence from serum dialysis treatment (Fig. 16A), (2) A force that progresses to the middle of L-serine without L-serine (Fig. 16B), (3 ) After 4 days of culture with D-serine + RANKL, cell viability deteriorates (Fig. 16C), (4) L-serine restores survival (Fig. 16D), (5) Further excess D-serine When applied, the formation efficiency of multinucleated cells decreases again (Fig. 16E).
  • Example 10 From the experimental results of Example 10, it was shown that L-serine is involved in NFAT2 expression and multinucleated cell formation among a plurality of serine structural isomers.
  • NFAT2 expression is dependent on L-serine, the following experiment was performed.
  • RAW264 cells were cultured for 2 hours in a normal medium in the presence of 10% FBS under normal density conditions (2.5 10 4 7 wells; hereinafter the same for normal density).
  • L-serine added to the medium was prepared so as to have a concentration of 0 times, 0.1 times, 0.3 times, and 1 times the normal amount (X 1; 0. ImM).
  • the expression level of NFAT2 in the cultured cells was confirmed by Western blotting using an anti-NFAT2 antibody (FIG.
  • RAW264 cells low Seeded at density (low: 2.5 X 10 4 Z-well) or high density (high: 2 X 10 5 Z-well), in the presence of RANKL [(+) RANKL] or in the absence [(-) RANKL] and cultured in a normal medium containing [ 3 H] -L-serine (10 ⁇ Ci / mL) for 24 hours.
  • L-serine present in 10 L of medium was measured using a scintillation counter with 3 H radioactivity as an index.
  • the abundance of L-serine in the medium decreased in proportion to the culture time, and the rate of decrease was higher under high density conditions than under low density conditions (FIG. 18A). Since there was no significant change in the amount of L-serine decrease with or without RANKL, the decrease in the amount of L-serine in the medium was mainly due to the cell seeding density. From the above results, it was confirmed that the inhibition of multinucleated cell formation due to an increase in cell density was caused by a decrease in the expression level of NFAT2 due to a decrease in the abundance of L-serine in the medium.
  • NFAT2 transcription factor 279, 26475- 26480. Since the expression of NFAT2 decreases in proportion to the cell density, the expression of cFos under the same conditions as in Example 3 was examined.
  • RAW264 cells were cultured at normal density in the presence of RANKL for 48 hours, collected at multiple time points, and c-Fos protein level was measured by Western blotting using anti-c Fos antibody (FIG. 19A).
  • the expression level of c-Fos protein decreased from 12 hours to 24 hours after RANKL stimulation. After culturing RAW264 cells at low density (normal density) and high density (8 times) for 24 hours, the amount of c Fos protein in each cell lysate is Western blotted using anti-c-Fos antibody. As a result, it was shown that the amount of c-Fos protein decreased under high-density conditions (FIG. 19B).
  • osteoclast precursor cells are cultured at a normal density and in the presence or absence of L-serine. Induction of osteoclasts was performed. 48 o'clock After interculture, Western blotting was performed using anti-c Fos antibody or anti-NFAT2 antibody to detect the protein expression of c-Fos and NFAT2. As a result, the expression of c Fos and NFAT2 decreased in the absence of L-serine, and it was confirmed in bone marrow cells reflecting the living body by the ability to express these two molecules SL serine dependence. ( Figure 20C).
  • the method of the present invention is useful as a method for preventing or treating NFAT2-related diseases.
  • the medicament of the present invention can be used for various diseases related to NFAT2, such as osteoporosis, autoimmune arthritis, Paget's disease or rheumatoid arthritis, and various osteopenic diseases and bone sclerosis diseases such as marble bone disease, Alternatively, it is useful as a drug with few side effects on immune diseases and the like.
  • the screening method of the present invention is useful for searching for novel NFAT2 expression regulators.

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Abstract

　本発明は、Ｌ－セリン及び／又はＬ－グリシンのシグナル伝達経路を抑制するＮＦＡＴ２の発現を抑制する方法に関する。本発明の方法により、ＮＦＡＴ２の発現を抑制又は促進する物質を探索するスクリーニング方法を提供できる。スクリーニング方法により選択された薬剤は、新規なメカニズムに基づくＮＦＡＴ２関連疾患、例えば骨粗鬆症等の予防又は治療剤として有用である。  

Description

明 細 書
NFAT2発現抑制方法
技術分野
[0001] 本発明は、破骨細胞分ィ匕過程における転写因子である NFAT2の発現を抑制する 方法に関する。より詳しくは、 Lーセリン及び Z又は L—グリシンのシグナル伝達経路 を抑制することにより NFAT2の発現を抑制する方法、更には、 NFAT2の発現を制 御することによる NFAT2関連疾患の予防及び Z又は治療薬及びそのスクリーニン グ方法に関する。
背景技術
[0002] 骨組織は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とを繰り返すことにより、 骨再構築（リモデリング)を行っている。しかし、「骨粗鬆症」や「慢性関節リウマチ」を 発症すると、骨吸収が骨形成量を上回るため、骨量の減少が見られる。一方、「大理 石骨病」は、骨吸収不全が原因となる病態であり、破骨細胞の分化に異常があって 骨組織に破骨細胞が存在しない場合や破骨細胞の機能に異常があって骨吸収が 行えな 、場合等に発症するものと考えられて 、る。
従来、骨粗鬆症の治療法としては、カルシウム剤の直接投与、カルシトニン、ビスホ スホネートの使用、副甲状腺ホルモン（PTH)、成長ホルモン等のホルモン剤の投与 、ビタミン D3の投与等が行われてきた力 いずれも決定的な治療方法とは言えない。 カルシウム剤は非常に大量に摂取する必要があり、カルシトニンは抗体の出現や経 口投与が不可能であり、ホルモン剤は副作用が強ぐビタミン D3は効果が低いという 欠点があった。また、破骨細胞分化因子（receptor activator of NF κ B ligan d;以下、 RANKLと略記する。 )に対する抗 RANKL抗体等も候補にあがっているが 、蛋白質の場合には抗原性や経口投与できない等の問題がある。そこで、新規な骨 粗鬆症治療薬の開発が求められていた。
[0003] また、骨粗鬆症は骨吸収と骨再生のバランスが崩れ、骨分解を担う破骨細胞の形 成が亢進することによって引き起こされる。この成熟破骨細胞は多核の細胞であるが 、細胞が融合する過程で NFAT2 (NFATcl)遺伝子が必須であることが知られて！/ヽ る（特許文献 1参照。 ) oそこで NFAT2遺伝子の発現を抑制することができれば破骨 細胞の成熟を抑制でき、骨粗鬆症を予防又は治療できる可能性がある。かかるシグ ナル伝達を利用して破骨細胞形成を制御する技術としては、 Ca2+シグナル伝達を 促進又は抑制する方法 (特許文献 1参照。）、 IFNシグナル伝達を促進又は抑制する 工程を含む方法 (特許文献 2、 3参照。）等が知られている。しかし、これらの方法は C a2+のシグナル伝達を制御することから局所的に投与する必要があり、あるいは、蛋 白質を投与することから抗原性、経口投与不可等の問題があった。そこで新規な機 構に基づく新規なスクリーニング方法の開発が求められていた。
特許文献 1 :特開 2004— 154132号公報
特許文献 2：国際公開第 2002Z024228号パンフレット
特許文献 3：国際公開第 2002Z024229号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、新規なメカニズムに基づく NFAT2関連疾患、例えば骨粗鬆症等の予 防又は治療薬、 NFAT2関連疾患、例えば骨粗鬆症等の予防又は治療方法及び N FAT2関連疾患、例えば骨粗鬆症等の予防又は治療薬のスクリーニング方法を提供 することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 破骨細胞分ィ匕過程において、破骨細胞前駆細胞では RANKLからのシグナルを 受けて分化の進行を担う様々な遺伝子が発現する。発明者は先年マウス細胞株 RA W264と分ィ匕誘導因子 RANKL蛋白質力 なる破骨細胞分ィ匕誘導系を用いて、マイ クロアレイ解析による遺伝子発現と細胞播種密度による分化抑制という独自に見出し た現象とを組み合わせることにより、 RANKLにより発現が誘導される転写制御因子 NFAT2が多核細胞形成に重要であることを明らかにした。通常、破骨細胞前駆細 胞では NFAT2は細胞質でリン酸ィ匕されており不活性な状態であるが、 RANKLから のシグナルを受けると、 Ca2+と Ca2+— CaMが結合して活性ィ匕されたカルシ-ユーリ ンにより NFAT2は脱リン酸化される。脱リン酸化された NFAT2は RANKLによる刺 激後約 24〜48時間で核内へ移行し、細胞融合や骨分解反応を担う諸酵素群等破 骨細胞の形成や機能発現に関わる遺伝子発現を誘導する。逆に、 NFAT2の阻害 剤であるタクロリムス（以下、 FK506ともいう。）ゃシクロスポリンで処理した破骨細胞 前駆細胞は、破骨細胞へと分化しない。
[0006] 最近、発明者は上記と同じ実験系を用いて、培地成分中のアミノ酸 Lーセリン又は L—グリシンのいずれかが RANKLによる NFAT2の誘導に必須であることを見出し た。このことを確かめるために、 Lーセリンのアナログを用いて確かめたところ、 D セ リンや L ホモセリンが L セリンの活性を拮抗阻害し、 NFAT2の誘導、多核細胞の 形成を抑制することが分力つたことから、この現象には分子構造の特異性を認識する メカニズムが働いていることが示唆された。先に述べたように、破骨細胞の相対的な 活性ィ匕による骨吸収の乱れは骨粗鬆症等の骨疾患の要因であることから、アミノ酸の Lーセリンならびに L—グリシンによる破骨細胞の形成と活性の制御は骨代謝疾患に 対する新 、分子標的薬への道を開くものである。
[0007] 本発明者は、アミノ酸である Lーセリン又は L—グリシンが NFAT2遺伝子の発現に 必須であること、そして、 Lーセリン及び L—グリシンが欠乏した状態では、 NFAT2遺 伝子が発現せず、その結果として破骨細胞の融合がおこらず破骨細胞が成熟しな 、 ことを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、破骨細胞形成に必須の NFA T2の発現を制御する方法、該制御に用いるための薬剤及び医薬、並びにそのスクリ 一-ング方法に関し、より具体的には、本発明は、
(1) Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達経路を抑制することを特徴と する NFAT2の発現を抑制する方法、
(2) NFAT2発現の抑制が、 NFAT2遺伝子発現の抑制によるものであることを特 徴とする前記（1)記載の方法、
(3) Lーセリン及び Z又は L—グリシンのシグナル伝達経路の抑制を Lーセリンと拮 抗する物質とを接触させることによって行うことを特徴とする前記（1)又は（2)記載の 方法、
(4) Lーセリンと拮抗する物質が Lーセリン類似物質であることを特徴とする前記 (3) 記載の方法、
(5) L セリン類似物質が D セリン、 L—ホモセリン、それらの塩又はそれらのエス テル体であることを特徴とする前記 (4)記載の方法、
(6) 前記（1)〜（5)のいずれかの方法により、 NFAT2の発現を抑制することを特徴 とする NFAT2関連疾患の予防及び Z又は治療方法、
(7) Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達経路を抑制することを特徴と する NFAT2関連疾患の予防及び Z又は治療方法、
(8) NFAT2関連疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする前記（6)又は（7)記載の 予防及び Z又は治療方法、
(9) 有効量の D セリン、 L ホモセリン、それらの塩又はそれらのエステル体の投 与を含むことを特徴とする、生体内での Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル 伝達経路抑制プロセス、
(10) Lーセリンと拮抗する物質を含有することを特徴とする NFAT2関連疾患の予 防及び Z又は治療剤、
(11) Lーセリンと拮抗する物質が D セリン、 L—ホモセリン、それらの塩又はそれ らのエステル体であることを特徴とする前記（10)記載の予防及び Z又は治療剤、
(12) NFAT2関連疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする前記（10)又は（11)記 載の予防及び Z又は治療剤、
(13) 破骨細胞形成に及ぼす物質をスクリーニングする方法であって、（a)被検物 質を含む試料の存在下、破骨細胞前駆細胞における Lーセリン及び Z又は L ダリ シンのシグナル伝達の抑制又は促進を検出する工程、及び (b)前記 Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達の抑制を破骨細胞形成の抑制に、又は前記 L セリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達の促進を破骨細胞形成の促進に関連 付ける工程、を含む方法、
(14) 破骨細胞形成に係わる Lーセリンと拮抗する物質をスクリーニングする方法で あって、（a)被検物質、 Lーセリン及び RANKLを含有する培地で、破骨細胞前駆細 胞を培養する工程、及び (b)破骨細胞前駆細胞における Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達の抑制を検出する工程、を含む方法、及び
(15) 破骨細胞形成に係わる Lーセリン及び Z又は L グリシン様作用を有する物 質をスクリーニングする方法であって、（a)被検物質及び RANKLを含有し、 L セリ ン及び Z又は L グリシンを含有しない培地で破骨細胞前駆細胞を培養する工程、 及び (b)破骨細胞前駆細胞における L セリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝 達の促進を検出する工程、を含む方法、
に関する。
[0008] さらに、本発明は、
(16) NFAT2関連疾患を予防及び Z又は治療する医薬を製造するための L セリ ンと拮抗する物質の使用、
(17) L セリンと拮抗する物質が D セリン、 L ホモセリン、それらの塩又はそれ らのエステル体であることを特徴とする前記（16)記載の使用、及び
(18) NFAT2関連疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする前記（16)又は（17)記 載の使用、
に関する。
発明の効果
[0009] 本発明により、 NFAT2の発現の抑制、特に NFAT2遺伝子の発現を抑制すること ができるので、破骨細胞前駆細胞力 破骨細胞への分ィ匕を抑制することができる。そ の結果、破骨細胞による骨破壊を効果的に抑制することができる。また、本発明の N FAT2、特に NFAT2遺伝子を標的とするシグナル経路により NFAT2の発現、特に NFAT2遺伝子の発現を制御する薬剤は、 NFAT2に関連する疾患、例えば正常に 石灰化された骨基質が量的に減少する骨粗鬆症、自己免疫性関節炎、パジェット病 もしくは関節リウマチを含む様々な骨減少性疾患及び骨癌、又は破骨細胞の機能不 全によって骨の構築および再構築の異常が生じる骨硬化疾患あるいは免疫性疾患 等に対する薬剤として有用である。また、本発明は、 L グリシン及び Z又は L セリ ンの実効濃度を測定することによる新規な NFAT2の発現制御方法のスクリーニング 系を提供できるので新規な NFAT2の発現制御剤の探索に有用である。
図面の簡単な説明
[0010] [図 l]in vitro実験におけるマウス RAW264細胞から破骨細胞への分化を示す図 である。図中 MN cellsは多核細胞を示す。
[図 2]RAW264細胞抽出液のウェスタンブロッテイングの結果を示す図である。図中 mediumの Fiま Fresh medium, Ciま conditioned medium す (以下の図に おいて同じ)。
[図 3]RANKL刺激後の RAW264細胞抽出液のウェスタンブロッテイングの結果を 示す図である。
[図 4]A)は NFAT2— siRNA発現細胞抽出液のウェスタンブロッテイングの結果を 示す図であり、 B)は RANKL刺激後の NFAT2— siRNA発現細胞を示す図である
[図 5]RAW264細胞の播種細胞密度と多角細胞形成率の関係を示す図である。図 中細胞密度 1倍は 2. 5 X 104細胞 Zwellを示す。
[図 6]RAW264細胞の低密度播種又は高密度播種における RANKL刺激後の RA W264細胞抽出液のウェスタンブロッテイングの結果を示す図である。
[図 7]異なる細胞密度での RAW264細胞を播種し、 RANKL刺激後の RAW264細 胞抽出液のウェスタンブロッテイングの結果を示す図である。図中細胞密度 1倍は 2. 5 X 104細胞 Zwellを示す。
[図 8]異なる培地で分化誘導した場合の RAW264細胞と、該細胞の分化誘導効率 を示す図である。
[図 9]RAW264細胞での NFAT2発現における培地成分の変化と NEAAの影響を 示す図である。
[図 10]低密度播種又は高密度播種 RAW264細胞での NFAT2発現における NEA Aの影響を示す図である。図中 Lは低密度播種を、 Hは高密度播種を示す。
[図 11]RAW264細胞での NFAT2発現における NEAAの影響を示す図である。
[図 12]RAW264細胞増殖に対する NEAAの影響を示す図である。
[図 13]Conditioned mediumを用いた RAW264細胞での NFAT2発現における アミノ酸の影響を示す図である。図中 Aはァラニン、 Dはァスパラギン酸、 Eはダルタミ ン酸、 Gはグリシン、 Nはァスパラギン、 Pはプロリン、 Sはセリンを示す（以下の図にお いて同じ)。
[図 14]Fresh mediumを用いた RAW264細胞での NFAT2発現におけるアミノ酸 の影響を示す図である。 [図 15]Fresh mediumを用いた RAW264細胞での NFAT2発現におけるセリンァ ナログの影響を示す図である。図中 Serはセリン（以下の図において同じ）を、 Dは D ーセリンを、 L Homoは L ホモセリンを示す。
[図 16]RAW264細胞での NFAT2発現における D セリンの影響を示す図である。
[図 17]破骨細胞前駆細胞の細胞密度依存的な多核細胞形成を示す図である。 A)マ ウス骨髄細胞カゝら得た破骨細胞前駆細胞を異なる細胞密度で播種したものを破骨 細胞へ分化誘導した結果を TRAP陽性細胞数と細胞濃度との関係で示す。 B)は多 核細胞の形態を示す。
[図 18]高密度培養での培地中のしーセリンの減少と L セリン濃度に依存する NFA T2の発現を示す図である。 A)RAW264細胞を低密度あるいは高密度で播種し、 R ANKL存在下あるいは非存在下で培養を行なったときの、培地中の Lーセリンの量 変化を示す。 B)RAW264細胞を異なる濃度の L セリンを添加した培地で培養した 後の RAW264細胞での NFAT2の発現をウェスタンブロッテイングの結果で示す。
[図 19]c— Fosの発現に対する細胞密度と L—セリンの影響を示す図である。 A)低蜜 度播種した RAW264細胞を RANKLの存在下で培養したときの c—Fosの発現をゥ エスタンブロッテイングの結果で示す。 B) RAW264細胞を低密度播種及び高密度 播種で培養し、 c Fosの発現をウェスタンブロッテイングの結果で示す。図中 Low は低密度播種を、 Highは高密度播種を示す。 c)RAW264細胞を低密度播種して NEAA、 L -セリン又は L -グリシンを添カ卩した培地で培養した後の c— Fosと NFAT 2の発現をウェスタンブロッテイングの結果で示す。各レーンの数値は以下を示す。 1 ： NEAAを添カ卩しな!/ヽ培地で培養した RAW264細胞； 2： L セリンを添カ卩した培地 で培養した RAW264細胞； 3： L グリシンを添カ卩した培地で培養した RAW264細 胞； 4： Lーセリンと L—グリシンを添カ卩した培地で培養した RAW264細胞； 5： L セリ ンを含まな ヽ NEAAを添カ卩した培地で培養した RAW264細胞； 6： L グリシンを含 まな!/ヽ NEAAを添カ卩した培地で培養した RAW264細胞； 7： L—セリンと L グリシン を含まな ヽ NEAAを添カ卩した培地で培養した RAW264細胞； 8： NEAAを添カ卩した 培地で培養した RAW264細胞。
[図 20]骨髄細胞の破骨細胞への分ィ匕における L セリンの影響を示す図である。 A) 骨髄細胞の増殖に対する L セリンの影響を示す。縦軸は細胞増殖 ·細胞死の度合 いを MTT活性によって計測した結果を示す。横軸のセリン濃度 X Iは通常量 (0. 1 mM)に等しい。 B)骨髄由来破骨細胞前駆細胞の多核細胞形成に対する Lーセリン の影響を示す。図左は多核細胞の形成量を示し、図右は細胞の形態を示す。 *は S tudent' s t testにより有意差（Pく 0. 05)のあることを示す。 C)破骨細胞前駆細 胞を RANKLと M— CSFで刺激した後 48時間培養した細胞溶解物のウェスタンブ ロッテイングの結果を示す。 D)レトロウイルス感染を介して NFAT2を強制発現させた 骨髄細胞における多核細胞形成に対する Lーセリンの影響示す。図左は多核細胞 の形成量を示し、図右は GFP発現細胞と NFAT2発現細胞の形態 (TRAP染色）を 示す。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明は、 NFAT2の発現を抑制する方法に関する。より詳しくは、破骨細胞前駆 細胞における Lーセリン及び Z又は L—グリシンのシグナル伝達経路を抑制し、 NFA T2の発現の抑制、特に NFAT2遺伝子の発現を抑制することによって、破骨細胞形 成を抑制する方法、更には、 NFAT2の発現を制御することによる NFAT2関連疾患 の予防及び Z又は治療薬及びそのスクリーニング方法に関する。以下、本発明につ いて、説明する。
[0012] 「Lーセリン及び Z又は L—グリシンのシグナル伝達経路」とは、 RANKL (recepto r activator of NF κ B ligand)経路と並ぶ破骨細胞前駆細胞から破骨細胞の 形成に必須のシグナル伝達経路をいい、独立した経路であってもよぐ他の経路と応 答する経路であってもよい。また、 Lーセリン及び Z又は L—グリシンのシグナル伝達 経路には、前記シグナル伝達経路と異なる伝達経路であって、その異なる伝達経路 の一部で Lーセリン及び Z又は L—グリシンが係わり NFAT2が発現、特に NFAT2 遺伝子が発現するような伝達経路も包含する。従って、破骨細胞前駆細胞において Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達を促進することにより、該細胞の破 骨細胞への分ィ匕を促進することができ、逆にし セリン及び Z又は L グリシンのシ グナル伝達を遮断することにより、該前駆細胞の破骨細胞への分化を阻害することが できる。 前記「破骨細胞（osteoclast)」とは、造血幹細胞を起源とする単球 ·マクロファージ 系細胞（以下、 CFU— Mと略記する。）より分化した単核の破骨細胞前駆細胞が融 合して开滅される多核巨細胞（Suda, T. et al. , Endocr. , Rev.第 20卷， p. 34 5, 1999年)をいう。破骨細胞は、骨基質を消化するコラゲナーゼを分泌し、骨吸収 能を示す。また、一般に成熟した破骨細胞には、酒石酸抵抗性酸フォスファタ一ゼ（ 以下、 TRAPと略記する。）、カルシトニン受容体、ビトロネクチン受容体が発現する。 このため、コラゲナーゼ、 TRAP又はカルシトニン受容体、ビトロネクチン受容体を破 骨細胞形成の指標（骨吸収マーカー）とすることができるので、破骨細胞形成は、こ れらの指標のうち、少なくとも 1つの測定に基づいて判断することができる。破骨細胞 は、 TRAP陽性であって、かつ骨吸収活性を持つ細胞が好ましい。破骨細胞は、上 記したように CFU— M力も分ィ匕する。該分化は、具体的には、例えば、骨髄単球'マ クロファ ~~ン糸目 ij駆糸田胞 (bone marrow monocyte/ macropnage precursor cells ; BMMs)等力 マクロファージコロニー刺激因子 (macrophage— colony s timulating factor; M— CSF)、インタイ一ロイキン一 3 (IL— 3)、顆粒球-マクロフ 丁 ~~、ンコロニ' ~~刺激因子 (granulocyte— macrophage colony— stimulating fa ctor ; GM— CSF)、 1, 25—ジヒドロキシビタミン D3 (1, 25 (OH) D )等の存在下
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で RANKLの刺激により行なわれ得る。
破骨細胞の开成は、例えば、文献（Yasuda, H. et al. , Proc. Natl. Acad. Sc i. USA,第 95卷， p. 3597— 602 (1998年））に従って観察すること力 Sできる。具体 的には、例えば個体であれば、骨切片を作成して骨吸収を観察することができる。ま た、顕微鏡観察により多核巨細胞を同定したり、 TRAP染色や、カルシトニン受容体 又はビトロネクチン受容体の発現の検出等の公知の検出方法等により、 in vivo及 び in vitro両方で破骨細胞形成を検出することができる。骨吸収能は、公知の方法 、例えば象牙切片上のピット形成面積を測定する Pit formation assay法等により 評価できる。
前記「破骨細胞前駆細胞（osteoclastprecursor cell)」は、破骨細胞に分化し得 る単球 ·マクロファージ系細胞を含み、より特定すれば、 M— CSF等に応答して増殖 が促進される細胞が好ましい。破骨細胞前駆細胞は、骨髄又は脾臓に含まれる細胞 であってもよぐ不死化した細胞株であってもよい。また、破骨細胞前駆細胞は造血 幹細胞から in vitroで分ィ匕させることもできる。
本明細書において、「Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達経路を抑 制する」とは、 Lーセリン及び Z又は L グリシンの濃度ならびにそれらの機能情報を 伝達するシグナル伝達経路であって、 NFAT2 (NFATclとも呼ばれる力 以下 NF AT2に統一）の発現、特に NFAT2遺伝子の発現に関与するシグナル伝達経路を 抑制することをいい、シグナル伝達そのものを阻害又は抑制することも含まれる。シグ ナル伝達経路を抑制することには、 Lーセリン及び Z又は L グリシンの拮抗物質を 投与して Lーセリン及び Z又は L グリシンの実効濃度を低下させること、 Lーセリン 及び Z又は L グリシンの代謝、修飾及び Z又は分解を促進することにより実質的に Lーセリン及び Z又は L グリシンの濃度を低下させること、ならびに L セリン及び Z又は L グリシンの受容体を抗体によりブロックすることも含まれる力 これらに限ら れない。また、シグナル伝達経路は、該経路のいずれの部分が抑制されてもよぐ例 えば Lーセリンもしくは L グリシン又はそれらの誘導体の濃度を感知する受容体又 は輸送体等の結合蛋白質の発現抑制やその結合蛋白質力 NFAT2の発現抑制、 特に NFAT2遺伝子の発現に至るシグナル伝達経路の抑制等を含む。要するに L セリン及び Z又は L グリシンの濃度あるいは活性が実質的に低下したというシグナ ルを伝達して NFAT2の発現の抑制、特に NFAT2の遺伝子の発現を抑制できれば シグナル伝達経路の如何なる部分の抑制であってもよい。この場合、 L セリン及び Z又は L グリシンを原料として合成される物質又は Lーセリン及び Z又は L グリシ ンから生成される代謝産物 (セリンが付加された脂質、糖等を含む)を介するシグナ ル伝達により NFAT2の発現の抑制、特に NFAT2遺伝子の発現が抑制される場合 も含まれる。また、シグナル伝達経路の 1ケ所に限らず複数の箇所が抑制されてもよ い。また、 Lーセリン及び Z又は L—グリシンのシグナル伝達経路を抑制するには、前 記しーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達経路と異なる伝達経路であって 、その該異なる伝達経路の少なくとも一部にお 、て L セリン及び Z又は L グリシ ンが係わり NFAT2が発現、特に NFAT2遺伝子が発現する場合において、該 L セリン及び Z又は L グリシンの係わり（作用）を抑制することも包含される。 [0015] NFAT2は、 Ca +—カルシ-ユーリン依存性に脱リン酸ィ匕されて核移行し、活性ィ匕 される転写因子の 1つである。 NFAT2は、 T細胞におけるサイト力イン産生を制御す る因子として発見されたが、多くの細胞の機能又は分ィ匕において重要な役割を果た す（Crabtree, G. R. and Olson, E. N. , Cell,第 109卷： S67— S79, 2000年 ) o従って、本発明の方法又は薬剤により NFAT2の発現を抑制することでそのような 機能や分ィ匕を抑制することができる。 NFAT2の具体例としては、例えば、ヒト NFAT 2 mRNAの塩基配列は Accession number NM— 006162に、蛋白質のァミノ 酸配列は NP— 006153に示されている。また、 NFAT2には、上記特定のアミノ酸 配列で示される NFAT2だけでなぐ NFAT2と生物学的機能が同等であることを限 度として、その断片、同族体 (ホモログ)、誘導体、及び変異体が包含される。ここで 同族体（ホモログ）としては、ヒトの NFAT2に対応するマウスやラット等他生物種の N FAT2が例示でき、これらは HomoloGene (http:ZZwww. ncbi. nlm. nih. gov ZHomoloGeneZ)等により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定するこ とができる。例えば、マウス NFAT2 mRNAの塩基配列は Accession number AF239169、 AF087434 (ァイソフォーム a)、及び AF049606 (ァイソフォーム b)に 、これらがコードする NFAT2蛋白質のアミノ酸配列はそれぞれ AAC36725、 AAC 36725、及び AAC0550【こ示されて!/、る。
また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び 人為的に欠失、置換、付加及び挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有 する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のない蛋白質又は (ポリ） ペプチドと、アミノ酸配列が少なくとも約 70%、好ましくは約 80%、より好ましくは約 9 5%、さらにより好ましくは約 97%相同なものを挙げることができる。
[0016] NFAT2の発現の抑制には、 NFAT2遺伝子の発現の抑制、 NFAT2遺伝子の転 写及び Z又は翻訳の抑制、 NFAT1の発現及び活性抑制を介した転写抑制（Zhou B et. Al. , J. Biol. Chem. ,第 277卷， p. 10704, 2002年）、 NFAT2 mR NAの不安定化の促進、 NFAT2蛋白質の分解の促進、外来的に NFAT2 mRNA に対するアンチセンス核酸もしくは NFAT2 mRNAを切断するリボザィム又は RNA i等を発現することによる NFAT2の発現阻害等が含まれる。好ま Uヽ NFAT2の発現 の抑制は、 NFAT2遺伝子の発現の抑制である。
本明細書において遺伝子（又は DNA)とは、 2本鎖 DNAのみならず、それを構成 するセンス鎖及びアンチセンス鎖と 、つた各 1本鎖 DNAを包含する意味で用いられ る。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において 遺伝子（DNA)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノム DNAを含む 2本鎖 DNA及び c DNAを含む 1本鎖 DNA (正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する 1本鎖 DNA (相補鎖）、及びこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該遺伝子又は DNAに は、特定の塩基配列で示される遺伝子又は DNAだけでなぐこれらによりコードされ る蛋白質と生物学的機能が同等である蛋白質 (例えば、同族体 (ホモログ)、変異体 及び誘導体等）をコードする遺伝子又は DNAが包含される。かかる同族体、変異体 又は誘導体をコードする遺伝子又は DNAとしては、ストリンジヱントな条件下で、特 定塩基配列の相補配列とハイブリダィズする塩基配列力もなる遺伝子又は DNAを 挙げることができる。
ここでストリンジェントな条件は、 Berger and Kimmel (1987, Guide toMol ecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Acade mic Press, San Diego CA)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合 する核酸の融解温度 (Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダィズ 後の洗浄条件として、通常「1 X SSC、 0. 1%SDS、 37°C」程度の条件を挙げること ができる。相補鎖は力かる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダィズ状態を 維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダィズ条 件 (ノヽイブリダィズ後の洗浄条件）として「0. 5 X SSC、0. 1%SDS、42°C」程度、さ らに厳しいハイブリダィズ条件 (ハイブリダィズ後の洗浄条件）として「0. 1 X SSC、 0 . 1%SDS、 65°C」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相 補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列力 なる 鎖、並びに該鎖と少なくとも約 90%、好ましくは約 95%の相同性を有する塩基配列 力もなる鎖を例示することができる。
「Lーセリンと拮抗する物質」とは、前記 Lーセリン及び Z又は L—グリシンのシグナ ル伝達経路において、 Lーセリンの濃度あるいは活性を実際よりも低く伝えることがで きる物質をいう。このような物質の例としては、例えば、 Lーセリン及び Z又は L ダリ シンのアミノ酸アナログ等が挙げられる。典型的には、 D セリンや L—ホモセリンが 挙げられるがこれらに限られず、アミノ酸アナログであって、 Lーセリン及び Z又は L —グリシンのシグナル伝達経路を抑制でき、 NFAT2の発現 (好ましくは NFAT2遺 伝子の発現)を抑制できるものであれば制限無く用いることができる。 NFAT2の発現 は、例えば実施例 10のように培養細胞に L セリンと拮抗する物質を添加してウェス タンプロットにより観察することができる。破骨細胞への分ィ匕は、多核化 (細胞融合）、 TRAP,カルシトニン受容体、ビトロネクチン受容体、コラゲナーゼの発現あるいは骨 吸収能の 、ずれかを指標として判断することができるので、これらの指標がネガティ ブであることを指標として Lーセリン及び Z又は L グリシンと拮抗する物質の効果を 柳』定することちでさる。
「L セリン類似物質」とは、典型的には L セリンのアミノ酸アナログをいうがこれに 限られない。 Lーセリン類似物質としては、 Lーセリンの全部又は一部と構造的又は 機能的に類似し、例えば生体内で Lーセリンと競合して作用するもの等であればよい また、 L セリン類似物質には、 L セリンの光学異性体、 L セリンに側鎖を有す る誘導体、 Lーセリンの薬学的に許容される塩又はエステル、 Lーセリンを原料として 合成される物質及び L セリンカゝら生成する代謝産物 (セリンが付加された脂質、糖 などを含む)であって、 L セリンと拮抗する物質も含まれるがこれらに限定されない。 また、 Lーセリン受容体からドラッグデザインによりデザインされた物質であって、 L— セリンと拮抗する物質であってもよい。 L セリンの薬学的に許容される塩としては、 例えばアルカリ金属 (カリウム、ナトリウム、リチウム等）の塩、アルカリ土類金属 (カル シゥム、マグネシウム等）の塩、アンモ-ゥム塩 (テトラメチルアンモ -ゥム塩、テトラブ チルアンモ-ゥム塩等）、有機アミン（トリェチルァミン、メチルァミン、ジメチルァミン等 )の塩、酸付加物塩 [無機酸塩 (塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リ ン酸塩、硝酸塩等)又は有機酸塩 (酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シユウ酸塩、フマル 酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、クェン酸塩、メタンスルホン酸塩、グルクロン酸塩 、ダルコン酸塩等）など]が挙げられる。 L セリンのエステル体としては、例えばメチ ル、ェチル、プロピル等の低級アルキル基のエステル体が挙げられる。 また、上記 Lーセリン類似物質は水和物又は溶媒和物であってもよい。水和物又は 溶媒和物は非毒性かつ水溶性であることが好ましい。水和物としては、例えば 1水和 物、 2水和物、 1Z2水和物又は 4Z3水和物等が挙げられ、溶媒和物としては、エタ ノールの付加物等のアルコール系溶媒和物等が挙げられる。
[0019] Lーセリン類似物質としては、例えば D セリンや L—ホモセリン等が好ましく挙げら れる。 D—セリンや L—ホモセリンは、その塩又はそれらのエステル体であってもよい 。前記塩には薬学的に許容されるものすべてが含まれる。該塩としては、上記した L ーセリンの薬学的に許容される塩が挙げられる。エステル体としては、上記した Lーセ リンのエステル体が挙げられる。 D セリンや L—ホモセリン、それらの塩又はそれら のエステル体としては、具体的には、例えば D セリンメチルエステル塩酸塩や L O 力フエオイルホモセリンなどが挙げられる。
[0020] NFAT2の発現の抑制、特に NFAT2遺伝子の発現を抑制する方法としては、 L セリン及び Z又は L—グリシンのシグナル伝達経路に、 Lーセリンと拮抗する物質を 接触させること等が挙げられる。前記接触は、 Lーセリン及び Z又は L—グリシンが作 用又は会合する蛋白質との接触あるいは前記シグナル伝達経路を有する例えば細 胞、組織又は個体等との接触が含まれる。前記接触の結果、 Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達経路において、例えば Lーセリンと拮抗する物質力 L- セリン及び Z又は L グリシンと例えば競合する等して Lーセリン及び Z又は L ダリ シンのシグナルの伝達を阻害又は抑制する。
[0021] 本発明の方法によれば、 Lーセリン及び Z又は L—グリシンのシグナル伝達経路を 抑制することにより、 NFAT2の発現の抑制、特に NFAT2遺伝子の発現を抑制する ことができる。 NFAT2の発現が抑制されると、破骨細胞の形成が阻害される。破骨 細胞は骨を吸収する細胞であり、その細胞の異常は NFAT2関連疾患、例えば骨粗 鬆症ゃ大理石骨病等の骨疾患や免疫疾患の原因となる。このため、本発明の方法 は、 NFAT2関連疾患、例えば骨粗鬆症や大理石骨病等の骨疾患や免疫疾患を予 防又は治療する方法に用いることができる。また、 NFAT2は破骨細胞の成熟以外 にもインターロイキン 2 (IL 2)等のように免疫反応を活性ィ匕するサイト力インの誘 導活性を有することが知られていることから、本発明の方法は免疫抑制にも利用でき る
[0022] 本発明の方法は、破骨細胞前駆細胞に Lーセリンと拮抗する物質、例えば D セリ ンを接触及び Z又は導入させることが好まし 、。破骨細胞前駆細胞と Lーセリンと拮 抗する物質、例えば D セリンや L ホモセリンを接触させることにより、破骨細胞前 駆細胞での NFAT2の発現、特に NFAT2遺伝子の発現の抑制を通して、効率よく 破骨細胞形成を阻害することができる。
本発明の方法は、哺乳動物に有効量の Lーセリンと拮抗する物質、例えば D セリ ン、 L ホモセリン、それらの塩又はそれらのエステル体の投与を含む。該投与は、 生体内の L セリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達経路を抑制できれば経 口投与又は非経口投与の 、ずれでもよ 、。
[0023] 本発明の NFAT2遺伝子の発現を抑制する方法に用いられる Lーセリンと拮抗する 物質、例えば D セリンや L—ホモセリンは、破骨細胞の形成を抑制することができる ので、 NFAT2関連疾患、例えば関節リウマチ等の自己免疫性関節炎や、例えば骨 粗鬆症等の骨減少性疾患の予防又は治療剤に、あるいは例えば免疫疾患等の免疫 抑制剤として用いることができる。
本発明の実施形態の 1つとして、例えば D セリンの投与が挙げられる。 D セリン を投与することにより、 NFAT2の発現、特に NFAT2遺伝子の発現が抑制される。こ の抑制に必要な D セリンの濃度は L セリンの約 5〜20倍、好ましくは約 10倍程度 である。
[0024] また、本発明の NFAT2発現の抑制、特に NFAT2遺伝子の発現を抑制する方法 は、破骨細胞の形成を阻害する薬剤等と併用することも好ましい。破骨細胞の形成を 阻害する薬剤としては、例えばカルシ-ユーリンの阻害剤等が挙げられる。カルシ- ユーリンの阻害剤としては、 FK506、 cyclosporin A(CyAZCsA)及びそれらの類 似体等が挙げられる。これらのカルシ-ユーリン阻害剤と、本発明に力かる L セリン と拮抗する物質、例えば D セリンや L ホモセリンを同時に投与することにより、骨 吸収をより効率よく抑制することが可能となる。
[0025] 本発明のスクリーニング方法は、例えば破骨細胞分ィ匕誘導系を用いて行うことがで きる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は次の工程 (a)及び (b)を含む：（a) 被検物質を含む試料の存在下、破骨細胞前駆細胞における Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達の抑制又は促進を検出する工程、
(b)前記 L セリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達の抑制を破骨細胞形成 の抑制に、又は前記 L セリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達の促進を破 骨細胞形成の促進に関連付ける工程。
[0026] 力かるスクリーニング方法に用いられる細胞としては破骨細胞への分ィ匕が可能であ る、例えば破骨細胞前駆細胞等を挙げることができる。破骨細胞への分ィ匕が可能な 破骨細胞前駆細胞であれば何れの細胞であっても制限なく用いることができるが、例 えば、骨髄マクロファージ系細胞等が好ましく用いられる。より具体的には、 BMMs、 RAW264. 7細胞（マクロファージ様細胞; RAW264細胞と略記することもある。）又 は胚性幹細胞 (ES細胞)等が挙げられる。好ましくは RAW264細胞である。特に、マ ウス RAW264細胞（RIKEN Cell Bank; HYPERLINK HYPERLINK "htt p:ZZ www. rtc. riken. go. jpZ CELL/HTML/RIKEN" http： / / www . rtc. riken. go. jpZ CELL/ HTML/ RIKEN ^ http： / / www. rtc. riken. g o. Jp/CELL /HTML/RIKEN Cell Bank. Htmlから入手可能）は、分化 誘導物質である RANKLの添加で破骨細胞に分ィ匕することが知られている細胞であ る（Biochem. Biophys. Res. Commun. 282, 278— 283 (2001) )。
[0027] 本発明のスクリーニング方法において、破骨細胞前駆細胞力 破骨細胞形成には 、通常、 M— CSFの存在下に RANKLで破骨細胞前駆細胞を刺激するのが好まし い。具体的には、例えば BMM又は ES細胞等から破骨細胞を形成させるには、 M— CSF存在下で RANKL刺激を行う。 M— CSF及び RANKLの濃度は適宜調節する ことができる。例えば M— CSFの濃度は約 l〜20ngZmL、好ましく約 5〜15ngZm L、より好ましくは約 8〜12ngZmL程度である。また、 RANKLの濃度は約 10〜 20 Ong/mL,好ましく約 50〜150ngZmL、より好ましくは約 80〜120ngZmL程度 である。また、 M— CSF非依存的に RANKLに応答して破骨細胞に分化する細胞、 例えば RAW264細胞等は、破骨細胞形成にお!、て M— CSFが存在しなくても破骨 細胞に分化できるので、 RANKL刺激のみ行なえばよい。この場合、 RNAKLの濃 度は、上記した濃度と同様である。また、本発明のスクリーニング方法においては、例 えば凍結ラット破骨細胞前駆細胞 (骨髄由来）と M— CSF、 RANKLを含有した専用 培地、更に Pit formation assay用に象牙質切片をセットした破骨細胞培養キット (株式会社ホクドー製)等も好ましく用いることができる。
[0028] 被検物質を含む試料としては特に制限はなぐ例えば、アミノ酸類縁体のライブラリ 一、合成低分子物質のライブラリー、精製蛋白質、遺伝子ライブラリーの発現産物、 合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出物、微生物由 来物質等が挙げられる。
[0029] Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達の検出は、 NFAT2の発現を指 標におこなうことができる。 NFAT2の発現は、例えば NFAT2と特異的に結合する 抗体を用いて、ウェスタンブロット、ドットブロット又はスロットブロット等の公知の方法 を用いて検出することができる。具体的には、例えばウェスタンプロット法は、一次抗 体として NFAT2抗体を用いた後、二次抗体として例えば HRP (西洋わさびバーオ キシダーゼ)等の化学発光試薬、 125ι等の放射性同位元素、蛍光物質等で標識した 標識抗体 (一次抗体に結合する抗体)を用い、得られる標識化合物の化学発光、放 射性同位元素、蛍光物質等に由来するシグナルをィ匕学発光検出器、放射線測定器 、蛍光検出器等で検出し、測定することによって実施できる。
[0030] また、 NFAT2の発現は、前記した蛋白質を指標とする以外に、遺伝子発現レベル の検出を指標とすることも好まし ヽ。遺伝子発現レベルの NFAT2遺伝子の検出は、 前記細胞カゝら調製した RNA又は該 RNAから転写された当該 RNAに対して相補的 なポリヌクレチドと、例えば、 NFAT2遺伝子又は NFAT2遺伝子のプロモーター領 域等を用いて、例えばノーザンブロット法、 RT—PCR (Reverse Transcription P olymerase Chain Reaction)法等公知の方法の他、 DNAチップ等を利用して実 施できる。前記遺伝子としては、 NFAT2結合配列〔GGAAAA及びその類似配列（ 例えば GGAAAN等， Nは A, T, C,又は G) , Macian, F. et al. , Oncogene, 第 20卷， p. 2476- 2489, 2001年〕を含む DNA、好ましくはさらに NFAT2及び 転写因子 AP— 1 (ァクチベータ一プロテイン 1)結合配列〔TGA[GZC]TCA及 びその類似配列（例えば TGNNTCA等、 Nは A, T, C,又は G)、： Bio Science新 用語ライブラリー「転写因子」、実験医学 別冊，羊土社， pp. 204— 205〕を含む D NAが好ましい。また、前記 DNAの下流に所望のレポーター遺伝子を結合したもの も好ましく用いることができる。レポーター遺伝子を結合することにより、レポーター活 性等を指標としてレポーター遺伝子の発現量を定量することにより NFAT2プロモー ターからの転写をモニターできる。具体的なプロモーター配列としては、 TRAPプロ モーター、又はカルシトニンプロモーター（P3プロモーター）等が挙げられる。レポ一 ター遺伝子としてはルシフェラーゼ遺伝子、蛍光蛋白質遺伝子（GFP, YFP, BFP 等）、クロラムフエ-コール.ァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、 一ガラクトシダーゼ 遺伝子等が挙げられる。また、 NFAT2により誘導される遺伝子としては、 NFAT2に 依存的な、例えば、 TRAP,カルシト-ンレセプター（calcitonin receptor)、カテ プシン K(cathepsin K)、カノレポ-ックアンヒドラーゼ II (carbonic anhydrase II； CA 11)、又はマトリックスメタ口プロティナーゼ（matrix metalloproteinase； MM P) 9等の遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子の NFAT2結合部位を含むプロモ 一ター配列を前記レポーターに連結するプロモーターとして好適に用いることができ る。これらの遺伝子は破骨細胞の最終分ィ匕において誘導され、複数の NFAT2及び AP—1結合部位を含む（Anusaksathien, O. et al. , J Biol. Chem. ,第 27 6卷， p. 22663- 22674, 2001年； David, P. et al. , J. Cell Physioll. ,第 88卷， p. 89- 97, 2001年； Motyckova, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 98卷， p. 5798- 5803, 2001年； Reddy, S. V. et al. , J. Bone Mi ner Res. ,第 10卷， p. 601— 606, 1995年）。
また NFAT2遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、 NFAT2遺伝子の発現を制 御する遺伝子領域 (発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子等のマーカー 遺伝子をつな!/、だ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来の 蛋白質の活性を測定することで実施することもできる。本発明の NFAT2の発現制御 物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的 物質を探索する方法も包含される。この意味にお!、て「NFAT2遺伝子」の概念には 、 NFAT2遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。な お、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺 伝子が好ましぐ具体的には上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフエニコ ール 'ァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、 j8グルクロ-ダーゼ遺伝子、 j8ガラクトシ ダーゼ遺伝子、及びェクオリン遺伝子等のレポーター遺伝子もまた使用することがで きる。ここで NFAT2遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子の転写開始 部位上流約 lkb、好ましくは約 2kbを用いることができる。融合遺伝子の作成、及び マーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
[0032] 指標とする NFAT2蛋白質又は NFAT2遺伝子発現の抑制又は促進は、被検物 質を添カ卩しな 、対照細胞での NFAT2蛋白質又は NFAT2遺伝子もしくは NFAT2 誘導性プロモーターによるレポーター遺伝子の発現量と、被検物質を添加した細胞 における NFAT2蛋白質又は前記遺伝子の発現量を比較することにより行なうことが できる。例えば被検物質を添加した細胞における NFAT2蛋白質又は前記遺伝子の 発現量が、被検物質を添加しない対照細胞での NFAT2蛋白質又は前記遺伝子の 発現量の約 90%以下、好ましくは 40%以下、さらに好ましくは 30%以下、特に好ま しくは 20%以下、とりわけ好ましくは 10%以下に低くなる場合に、当該被検物質を破 骨細胞前駆細胞における Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達を抑制 する候補物質として選択することができる。また逆に、例えば被検物質を添加した細 胞における NFAT2蛋白質又は前記遺伝子の発現量が、被検物質を添加しない対 照細胞での NFAT2蛋白質又は前記遺伝子の発現量の約 110%以上、好ましくは 1 20%以上、さらに好ましくは 130%以上、特に好ましくは 150%以上に高くなる場合 に、当該被検物質を破骨細胞前駆細胞における Lーセリン及び Z又は L グリシン のシグナル伝達を促進する候補物質として選択することができる。
また、指標とする NFAT2蛋白質又は NFAT2遺伝子発現の抑制又は促進と破骨 細胞形成の抑制又は促進との関連付けは、指標とする NFAT2蛋白質又は NFAT2 遺伝子発現が抑制される場合は、破骨細胞形成も同程度に抑制されるものとし、指 標とする NFAT2蛋白質又は NFAT2遺伝子発現が促進される場合は、破骨細胞形 成も同程度に促進されるものとする。
[0033] 通常、骨粗鬆症と!/、つた骨代謝異常疾患に罹患した患者の骨組織には、特異的に 、破骨細胞の分化'活性ィ匕の亢進が見られるとともに NFAT2 (NFAT2遺伝子）が発 現している。すなわち、本発明のスクリーニング方法は NFAT2又は NFAT2遺伝子 の発現を抑制する物質を探索することによって、破骨細胞形成に関連する骨代謝異 常疾患の予防又は治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
候補物質の選別は、発現誘導物質によって誘導される NFAT2の発現又は NFAT 2遺伝子の発現が被検物質の存在によって抑制されることを指標にして実施できる。 すなわち発現誘導物質存在下で被検物質を接触させた細胞の NFAT2の発現又は NFAT2遺伝子の発現が、発現誘導物質存在下で被検物質を接触させな!/ヽ対照細 胞に比して低くなることをもって、当該被検物質を候補物質として選択することができ る。具体的には被検物質を含む試料の存在下、上記方法で Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達を測定し、対照に比べ該シグナル伝達を促進又は抑制す る物質を選択する。対照の条件としては、該被検物質を含まないか、あるいはより低 用量で含む場合であり、典型的には、被検物質の非存在下 (例えば被検物質の添加 に用いた担体のみの添加）における場合が挙げられる。また、対照の条件として、被 検物質をより低い用量で含む場合を用いれば、物質の用量依存性が明らかとなる。 また、発現誘導物質存在下で被検物質を接触させた細胞の NFAT2の発現又は NF AT2遺伝子の発現が、破骨細胞形成を調節する公知の化合物を接触させる陽性対 照細胞に比して低くなること又は高くなることをもって、当該被検物質を候補物質とし て選択することもできる。この場合、陽性対照として用いたィ匕合物の存在下における 場合と比べ、該 L セリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達を促進又は抑制さ せる物質を選択できる。このようなスクリーニングにおいては、陽性対照とした化合物 に比べより高 、効果を有する物質を得ることができる。
また、大理石骨病といった骨代謝異常疾患に罹患した患者は、破骨細胞の形成不 全等が見られるとともに NFAT2 (NFAT2遺伝子）の発現が低下している。すなわち 、本発明のスクリーニング方法は NFAT2又は NFAT2遺伝子の発現を促進する物 質を探索することによって、破骨細胞形成に関連する骨代謝異常疾患の予防及び Z 又は治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
候補物質の選別は、発現誘導物質によって誘導される NFAT2の発現又は NFAT 2遺伝子の発現が被検物質の存在によって促進されることを指標にして実施できる。 すなわち発現誘導物質存在下で被検物質を接触させた細胞の NFAT2の発現又は NFAT2遺伝子の発現が、発現誘導物質存在下で被検物質を接触させな!/ヽ対照細 胞に比して高くなることをもって、当該被検物質を候補物質として選択することができ る。具体的には被検物質を含む試料の存在下、上記方法で Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達を測定し、対照に比べ該シグナル伝達を促進又は抑制す る物質を選択する。対照の条件等は、上記 NFAT2及び Z又は NFAT2遺伝子の発 現を抑制する物質の探索と同様である。
[0035] 本発明のスクリーニング方法に用いられる培地としては、天然培地、半合成培地、 合成培地、固形培地、半固形培地、液体培地などが挙げられるが、破骨細胞前駆細 胞を破骨細胞に分ィヒさせるために用いられるものであり、動物細胞、特に造血幹細 胞の培養に用いられる栄養培地であれば!/、ずれも好ましく用いることができる。この ような培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco ' s Modified Eagles' s Medium ; DMEM)、ハム F 12培地（Ham ' s Nutrient Mixture Fl 2)、マッコイ 5A培地（McCoy' s 5A medium)、最小 MEM培地（Minimum Es sential Medium ; MEM)、 α— MEM培地 ( a—modified Minimum Essenti al Medium ; a - MEM)、 RPMI1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Isocov e ' s Modified Dulbecco ' s Medium ;IMDM)、 StemPro34 (インビトロジェン 社）、 X— VIVO 10 (ケンブレックス社）、 X— VIVO 15 (ケンブレックス社）、 HPG M (ケンブレックス社）、 StemSpan H3000 (ステムセルテクノロジ一社）、 Stemline II (シグマアルドリッチ社)又は QBSF—60 (クオリティバイオロジカル社)などが挙げ られる。
[0036] より具体的には、本発明のスクリーニング方法は、例えば破骨細胞形成の in vitro アツセィ系を用いて行うことができる。具体的には、例えば、非接触性骨髄細胞（24 穴プレートの 1ゥエル当たり 5 X 105細胞）を約 10ng/mLの M— CSFを含む例えば a MEMで 2日間培養し、約 lOOngZmLの可溶性 RANKL、約 lOngZmLの M — CSFの存在下でさらに 3日間培養して破骨細胞を形成させる系を利用できる。ここ に被検物質を含む試料を添カ卩して培養する。また、 in vivoの系であれば、例えば 卵巣摘出等による骨粗鬆症モデルマウスやエンドトキシン誘導性骨吸収動物モデル を用いた系が挙げられる。さらには、 ES細胞からの破骨細胞形成系を利用すること ができる。 ES細胞を用いたスクリーニング系においては、破骨細胞形成に関わる所 望の遺伝子を欠損する細胞を用いることができる。遺伝子欠損 ES細胞からの破骨細 胞形成系を用いれば、被検物質が破骨細胞形成シグナルのどのシグナル経路に関 与するのかにっ 、て、有益な情報を得ることができる。
このスクリーニングの結果、被検物質を含む試料の添カ卩により、対照の条件下と比 較して Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達が有意に促進又は抑制され れば、用いた被検試料は破骨細胞形成を調節する物質の候補となる。このスクリー- ング方法により単離される物質は、破骨細胞形成を制御するために有用であり、骨代 謝疾患の予防薬や治療薬の開発の上でも有用である。
また本発明のスクリーニング方法は、破骨細胞形成に及ぼす物質の効果を検査す る方法でもあるので、本方法により、破骨細胞形成を抑制する物質を同定することが できる。
また、本発明のスクリーニング方法を用いて、破骨細胞形成に係わる L セリンと拮 抗する物質をスクリーニングすることもできる。この場合、 L セリンと RANKLを含有 する培地に被験物質を添加して、破骨細胞前駆細胞を培養し、上記と同様に破骨細 胞前駆細胞における Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達を測定するこ とが好ましい。測定の結果、 NFAT2の発現又は NFAT2遺伝子の発現の抑制が認 められるか前記発現が認められなければ、被験物質が Lーセリンの拮抗物質であると 同定できる。同定された L セリンの拮抗物質は、破骨細胞形成を抑制する物質とし て好ましく用いることができる。前記抑制の程度は、被検物質を添加した細胞におけ る NFAT2蛋白質又は前記遺伝子の発現量力 被検物質を添加しないで培養した 破骨細胞前駆細胞 (対照細胞)での NFAT2蛋白質又は前記遺伝子の発現量の約 90%以下、好ましくは 40%以下、さらに好ましくは 30%以下、特に好ましくは 20% 以下、とりわけ好ましくは 10%以下である。この場合において、 L—グリシンを介して NFAT2又は NFAT2遺伝子が発現する場合を除外するため、培地は L グリシン を含有しないものを用いるのが好ましい。具体的は、例えば α—MEM力 L グリシ ンを除 、た培地に任意の L セリンを添加した培地を調製し、調製した培地を用いて 、例えば BMM又は ES細胞を M— CSF及び RANKLの存在下で培養を行う力、あ るいは例えば RAW264細胞を RANKLの存在下で培養を行う。 M— CSF及びRA NKLの濃度は上記した濃度と同様である。
[0038] また、本発明のスクリーニング方法は、破骨細胞形成に係わる Lーセリン及び Z又 は L グリシン様物質をスクリーニングする方法でもある。この場合においては、上記 した培地の成分力 L セリン及び L グリシンを除いた培地に被験物質を添加して 破骨細胞前駆細胞を培養し、上記と同様に破骨細胞前駆細胞における Lーセリン及 び Z又は L グリシンのシグナル伝達を測定することが好ましい。測定の結果、 NFA T2の発現又は NFAT2遺伝子の発現の促進が認められれば、被験物質が L セリ ン及び Z又は L グリシン様物質であると同定できる。同定された Lーセリン及び Z 又は L グリシン様物質は、破骨細胞形成を促進する物質として好ましく用いることが できる。前記促進の程度は、被検物質を添加した細胞における NFAT2蛋白質又は 前記遺伝子の発現量が、被検物質を添加しな!ヽで培養した破骨細胞前駆細胞 (対 照細胞)での NFAT2蛋白質又は前記遺伝子の発現量の約 110%以上、好ましくは 120%以上、さらに好ましくは 130%以上、特に好ましくは 150%以上である。具体 的には、例えば α—MEM力も L セリン及び L グリシンを除いた培地を調製し、調 製した培地を用いて、例えば BMM又は ES細胞を M— CS及び RANKLの存在下 で培養を行うか、あるいは例えば RAW264細胞を RANKLの存在下で培養を行う。 M— CSF及び RANKLの濃度は上記した濃度と同様である。
[0039] 本発明のスクリーニングにより得られた物質は、破骨細胞形成の阻害剤又は促進 剤として用いることができる。臨床適用のための物質の投与条件は、本明細書に記 載した破骨細胞形成系を用いて決定することができる。すなわち、上記検査方法を 用いて投与量、投与間隔、投与ルートを含む投与条件を検討し、適切な予防又は治 療効果が得られる条件を決定することができる。このような物質は、 NFAT2関連疾 患等に対する予防又は治療のための医薬となる。物質はそのままもしくは自体公知 の薬学的に許容できる所望の添加剤、例えば賦形剤 (例えば乳糖、白糖、ブドウ糖、 デンプン、結晶セルロース等）、結合剤（例えばデンプン糊液、ヒドロキシプロピルセ ルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液等 )、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カル シゥム等）、崩壊剤（例えばデンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウム等）、溶 剤 (例えば注射用水、滅菌精製水、生理食塩水、緩衝液、植物油等)、乳化剤 (例え ばステアリン酸ポリオキシル 40、セスキォレイン酸ソルビタン、ポリソルベート 80、ラウ リル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴール、アラビアゴム、ポピドン等）、懸濁剤（例えば カノレメロース、メチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメ チルセルロース、ポピドン等）、安定剤（例えば亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリ ゥム、ェデト酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、ァスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトル ェン等）、保存剤 (例えばパラォキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチル、 パラォキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化べンザル コユウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、界面活性剤 (例えばポリソルベート 80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等)などと混合して医薬 組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する剤形 (錠剤、丸剤 、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤 、坐剤等の非経口投与剤等)などに応じて経口投与又は非経口投与することができ る。また、上記医薬組成物は、放出制御物質と共に徐放性製剤、 DDS (ドラッグデリ ノリー)製剤とすることもできる。前記放出制御物質としては、自体公知の例えば α— ヒドロキシカルボン酸類（例、グリコール酸，乳酸，ヒドロキシ酪酸等），ヒドロキシジ力 ルボン酸類 (例、リンゴ酸等），ヒドロキシトリカルボン酸 (例、クェン酸等)などの 1種以 上から無触媒脱水重縮合で合成された重合体、共重合体あるいはこれらの混合物、 ポリ一 α—シァノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例、ポリ一 γ—ベンジル一 L グ ルタミン酸等）、無水マレイン酸系共重合体 (例、スチレン マレイン酸共重合体等） などの生体内分解性高分子物質等が挙げられる。
患者への投与は、有効成分の性質や調製される剤形に応じて、例えば経皮的、鼻 腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内 、又は経口的に行われ得るがそれらに限定されない。投与は全身的又は局所的にさ れ得るが、全身投与による副作用が問題となる場合には病変部位への局所投与が 好ましい。投与量、投与方法は、医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、 患者の体重や年齢、症状等により変動するが、当業者であれば適宜選択することが 可能である。
[0041] 上記医薬組成物は、 NFAT2関連疾患の予防及び Z又は治療剤として用いること ができる。 NFAT2関連疾患としては、破骨細胞により骨量が低下する骨軟ィ匕性疾患 又は破骨細胞の形成不全や機能不全による骨硬化性疾患が挙げられる。骨軟化性 疾患としては、例えば原発性骨粗鬆症、加齢性 (老人性)骨粗鬆症、続発性骨粗鬆 症等が挙げられる。続発性骨粗鬆症としては、内分泌 ·代謝異常によるもの（例えば 副甲状腺機能亢進症、性腺機能不全症、 Turner症候群、神経性食思不振症候群 、 Klinefelter症候群等）、炎症によるもの（例えば慢性関節リウマチ等）、先天性疾 患に基づくもの（例えば骨形成不全症、ホモシスチン尿症、肥満細胞症、肥満細胞 腫、 mastocytosis等）、血液疾患に基づくもの（例えば多発性骨髄腫等）、薬剤に基 づくもの（例えばステロイド骨粗鬆症等）が挙げられる。骨硬化性疾患としては、例え ば大理石骨病等が挙げられる。
[0042] 本発明の医薬組成物は、通常、総組成物の重量で、約 0. 1〜90質量％の治療薬 物 (上記物質)を含む。投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象又は患者 の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、非経口投与では、一 曰当たり体重 lkg当たり約 0. 0001〜1000mg、好まし <は約 0. 001〜300mg、より 好ましくは約 0. 01〜： LOOmgである。しかし、疾患状態、体重、及び治療に対する患 者の個々反応、治療薬物が投与される組成物の種類、及び投与形態、病気の経過 の段階に依存して、これら投与速度を適宜調整することが好ましい。従って、上記し た最小投与量より少なく使うことがときには適量であり、一方、他の場合には治療効 果を得るために上限を越える必要がある。投与は 1〜数回に分けて行うことができ、 一日約 1〜5回投与することができる。対象となる個体としては、例えばヒト又はマウス 、ラット、ゥサギ、ィヌもしくはサル等の非ヒト哺乳動物、及びその他の脊椎動物が挙 げられる。非ヒト哺乳動物への適用は、ヒト骨破壊性疾患又は骨硬化疾患に対する 予防法又は治療法を開発するためのモデルとする上でも有用である。これにより、 N FAT2関連疾患、例えば骨粗鬆症や自己免疫性関節炎における骨破壊や大理石 骨病等における破骨細胞の形成不全や機能不全を予防する新たな治療プロトコル を開発することができる。
本発明の医薬組成物は、 NFAT2関連疾患の治療及び予防に有用である。特に 本発明の破骨細胞前駆細胞における L セリン及び Z又は L グリシンのシグナル 伝達を抑制する物質を含有する医薬組成物は、破骨細胞による骨吸収が関与する 骨減少性疾患の治療予防及び Z又は予防に有用である。主要な治療対象となる具 体的疾患としては、特に関節リウマチ (rheumatoidarthritis ;RA)を含む自己免疫 性関節炎が挙げられる。関節リウマチは、自己免疫性の慢性炎症性疾患であり、増 殖した滑膜が活発に骨軟骨へと侵入し、多発性の関節破壊をもたらす。本発明の N FAT2関連疾患の予防及び Z又は治療剤は、この関節骨破壊を防止するために好 適に用いられる。
また、本発明の NFAT2関連疾患の予防及び Z又は治療剤が適用され得る他の N FAT2関連疾患としては、歯周病が挙げられる。また、本発明の NFAT2関連疾患の 予防及び Z又は治療剤は、巨細胞腫、癌骨転移、及び色素性絨毛結節滑膜炎 (pig mented villonodular synovitis ;PVS)を含む、破骨細胞による骨吸収亢進を病 態とする様々な疾患に対しても適用され得る。また、骨粗鬆症及び癌の高カルシウム 血症の治療への適用も期待される。さらに、パジェット病、肝炎やエイズに伴う骨量減 少、白血病や多発性骨髄腫に伴う骨吸収'骨破壊、人工関節周囲の骨吸収 (ルース ユング）に対する予防及び Z又は治療にも適用され得る (Rodan, G. A. & Marti n, T. J. , Science,第 289卷， p. 1508— 1514 (2000)； Kong, Y. Υ. et al. , Nature,第 402卷， p. 304— 309 (1999)； Takayanagi, H. et al. , Arthritis Rheum. ,第 43卷， p. 259- 269 (2000)； Honore, P. et al. , Nat. Med. ,第 6卷， p. 521— 528 (2000) )。本発明により、破骨細胞の形成及び機能の制御によ る新たな治療介入が可能となる。
また、本発明の破骨細胞前駆細胞における Lーセリン及び Z又は L—グリシンのシ グナル伝達を促進する物質を含有する医薬組成物は、破骨細胞の形成又は機能不 全による骨硬化性疾患や骨の吸収障害の予防及び Z又は治療に有用である。従つ て、本発明の NFAT2関連疾患の予防及び Z又は治療剤は、大理石骨病等の破骨 細胞の形成不全又は機能不全に基づく疾患に用いることができる。 [0044] また本発明は他の NFAT2発現抑制（又は促進)剤や破骨細胞形成阻害 (又は促 進)剤と併用することもできる。そのような併用例としては、例えば、骨減少性疾患の 治療のためのキットであって、カルシ-ユーリン阻害剤、及び D—セリンを含むキット が挙げられる。カルシ-ユーリン阻害剤と D—セリンとを併用することによって、破骨細 胞形成に関して相乗的な抑制効果を得ることが期待できる。カルシ-ユーリン阻害剤 としては、特にシクロスポリン A及び FK506が好ましく挙げられる。
[0045] 本明細書に記載した発明は、当業者であれば様々な改変を容易に思 、つくことが 可能であろうが、それらの態様は本発明の範囲に含まれる。なお本明細書に引用さ れた文献は、本明細書の一部として組み込まれる。以下、実施例により本発明をさら に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例 1
[0046] [1]培地の調製
9. 4gの Eagle' s MEM [-ッスィ社製]を 1Lの培養用蒸留水に溶かし、 120°C、 1 5分間、高圧蒸気滅菌した。高圧蒸気滅菌後、室温まで冷ました培地に、 10mLの滅 菌済みの培養用蒸留水で溶力した 0. 292gの L—グルタミン [-ッスィ社製]、 25mL の 7. 5%炭酸水素ナトリウム、 10mLの非必須アミノ酸混合液（non— essential am ino acid:NEAA;L—セリン， L—ァラニン， L—グリシン， L—ァスパラギン酸， L— グルタミン酸， L—プロリン及び L—ァスパラギン各 lOmM) [GIBCO— BRL社製]、 lOOmLのゥシ胎児血清 (FBS)を添加した。非必須アミノ酸の各成分はナカライテス ク社 (京都）、 L -ホモセリン及び D -セリンはシグマ社 (米国)力もそれぞれ購入した 。 〔3H〕—L—セリンはアマシャム'バイオサイエンスから購入した。各種非必須アミノ 酸を個別に添加する場合は、上記混合液を使用した際の最終濃度と同じ濃度になる ようにカ卩えた。また、 L—ホモセリン及び D—セリンに関しては、その都度記述する。血 清の透析には SpectraZPor (登録商標） 6 再生ニトロセルロース透析膜 (MWCO lOOO) [Spectrum Laboratories Inc.製]を用いた。まず、 10cm程度に透析膜 を切って培養用蒸留水で簡単に濯いだ。次に、透析膜を 10mM EDTAを含む 5% 炭酸水素ナトリウム溶液に浸し、 60°C、 1時間洗浄した後に 1Lの培養用蒸留水で 5 分間洗浄した。この培養用蒸留水での洗浄は 3回繰り返した。洗浄後は透析膜に血 清を入れ、 4°Cで一晩透析処理を行った。
マウス骨髄細胞からの破骨細胞前駆細胞誘導のための培地は、 a MEM [シグ マ社製]を 1Lの培養用蒸留水に溶かし、 120°C、 15分間、高圧蒸気滅菌した。高圧 蒸気滅菌後、室温まで冷却した培地に lOOmLのゥシ胎児血清 (FBS)を添加し、終 濃度 5ngZmL〖こなるように M— CSF [シグマ社製]を添加した。
[0047] [2]細胞の培養と維持
マウスの単球マクロファージ由来細胞株 RAW264を 10cmプレートに播種し、 37 °C、 CO濃度 5%において、 10mLの上記培地で培養した。プレート一面に細胞が
2
増えたら、増殖した細胞の 1Z10を継代し、以後 3日ごとに継代を行った。
マウス骨髄細胞 I X 106個 Zゥエルを 24ゥエルプレートに播種し、 10%FBS、 5ng ZmL M— CSF入りの a—MEM中で 37°C、 CO濃度 5%で一日培養し、非接着
2
性の細胞のみを回収した。これをさらに lOOngZmL M— CSF存在下で培養し、 3 日間培養後に浮遊細胞を除去したものを破骨細胞前駆細胞とした。
[0048] [3]可溶性 RANKLの調製
RANKL遺伝子を有するマウスストローマ細胞 ST2から RNAを抽出し、次!、で抽 出した RNA 3 μ gから作成した cDNA 1 μ gを铸型として、配列番号 1に示す配列 (5， 一 CAATTGCGGATCCTAACAGAATATCAG— 3，）を有するオリゴヌタレ ォチドをセンスプライマー、配列番号 2に示す配列（5， - CAATTGGAAATGAG TCTCAGTCAATG 3，）を有するオリゴヌクレオチドをアンチォセンスプライマー として PCR法を行って、 RANKL遺伝子を増幅した。なお、 PCR法は Pfx DNA p olymerase (GIBCO— BRL社製）を用い、付属のプロトコルに従って 50 Lの系で 94°C15秒、 52°C30秒、及び 68°C1分のサイクルを 5サイクル行った後、 94°C15秒 、 56°C30秒、 68°C1分のサイクルを 15サイクル行うことによって実施した。かかる PC R法で増幅させて得られた RANKL遺伝子を制限酵素 Mnulで切断し、 RANKLの C末端領域 244アミノ酸を pGEX—2TKベクター（Amersham Pharmacia Biote ch社製）の GST (glutathione S— transferase)のコード領域の下流に位置する B amHIと EcoRI部位に挿入してベクター pGEX— 2TK— RANKLを作製した。この p GEX—2TK— RANKL [可溶性 GST— RANKL]及び、標準ベクターである pGEX — 2TK [GST蛋白質]をそれぞれ大腸菌 JM109へ導入して組換え蛋白質の発現に 用いた。これらの大腸菌を最終濃度 50ngZmLになるようにアンピシリンを添加した Super Broth (Tryptone Peptone[DIFCO社製] 2. 5g, Bact YeastExtract [DIFCO社製] 15g, NaCl [ナカライテスタ社製] 5gZlL H O)培地に入れて 37
2
°Cで一夜前培養し、続いて OD Super Broth培地 500mLあたりに対して、前培
600
養液 5mL加えて 37°Cで、培地の吸光度（波長： 600nm)が 0. 6〜0. 8の範囲にな るまで主培養を行った。その後 IPTG (Isopropyl— β - D - thiogalactopyranosid e)を最終濃度 0. 25mMになるように添加し、蛋白質の発現誘導を開始し、 18°Cで 約 12時間培養した。
上記で培養した大腸菌を集菌後、上清を捨てて力ゝら菌体を NET緩衝液 (20mM Tris-HCl pH8. 0, lOOmM NaCl, ImM EDTA [ナカライテスタ社製])で 2 回洗浄した。再び上清を捨て、氷上にて主培養液の 1Z250量の NETN緩衝液（20 mM Tris-HCl pH8. 0, lOOmM NaCl, ImM EDTA, 0. 5%NP— 40 [シ ダマ社製])に大腸菌を懸濁し、超音波処理 (30秒， 2回）を行って大腸菌を破壊した 。主培養液量の 1Z1000量の Glutathione Sepharose (登録商標） 4B (50% s lurry [Amersham Pharmacia Biotech AB社製]をあらかじめ NETN緩衝液 で平衡ィ匕させておき、先の上清にカ卩ぇ 4°Cで 8時間反応させた。 Wash buffer (20 mM NaCl, 4mM MgCl - 6H O, ImM 2— ME, 20mM HEPES pH7. 4
2 2
[ナカライテスタ社製])で 3回洗い、ビーズ lmLあたり 1. 6mLの Glutathione— Na CI buffer (lOOmM Tris-HCl pH8. 0, lOOmM NaCl, 20mM glutathio ne [ナカライテスタ社製] ; pHがアルカリ側であることを確認する。）を加え、 1時間以 上反応させて可溶性 RANKLを溶出した。破骨細胞分化誘導に対する LPSの影響 を極力防ぐために内毒素除去カラム（Detoxi— Gel Endotoxin Removing Gel [PIERCE])に通した。得られた可溶性 RANKLは適量を分注して液体窒素で凍結 して 80°Cで保存した。分化誘導を行う際は適宜解凍して用 ヽた。
[4]RAW264細胞の分化誘導
RAW264糸田胞 ίま 24穴プレー卜に ίま 2. 5 X 104個、 3. 5cmプレー卜に ίま 10 X 104 個、 6cmプレートには 20 X 104個、 10cmプレートには 50 X 104個になるように播種 し、 37°C、 CO濃度 5%において 24時間培養した。その後、可溶性 RANKLを含む
2
培地と交換し (0時間）、 37°C、 CO濃度 5%で培養した。 72時間後、再び新しく調製
2
した可溶性 GST— RANKLを含む新鮮培地と交換し、 37°C、 CO濃度 5%で 24時
2
間培養した。この一連の操作により、 RANKL添加 96時間後にプレート一面に破骨 細胞の形成が確認できる（図 1)。
[5]骨髄細胞からの破骨細胞の分化誘導
破骨細胞への分ィ匕誘導は Takahashi, N. et al. , Generating murine o steoclasts form bone marrow Methods Mol. Med. (2003) , pp. 1 29 - 144.に示す方法に従った。
骨髄細胞から [細胞の培養と維持]で示す方法によって得た破骨細胞前駆細胞を 2 4ゥエルプレートに 1 X 104個 Zゥエルで播種し、一日培養した。その後 500ngZmL の RANKLと lOOngZmLの M— CSFを添カ卩し、誘導を行なった。 3日ごとに前述の 量の RANKLと M— CSFを含む新鮮培地に交換した。
[6]レトロウイルスによる NFAT2の強制発現
NFAT2遺伝子あるいは比較対象として GFP遺伝子をレトロウイルスベクター pCX 4puroに組み込み、ピューロマイシンによる薬剤選択で各々の発現ベクターを得た。 これらの発現ベクターをパッケージング細胞株 Platinum— E (Plat E)に pE— eco ベクター及び pGPベクター (Takara社製）とともに導入し、この細胞を 48時間培養し た。上清を 0. 22 μ ηι pore filterでフィルトレーシヨンしたものをレトウィルスのストツ クとした。破骨細胞前駆細胞をレトロウイルス存在下で一晩培養し、続いて前述の通 り破骨細胞への分化誘導を行なった。
[7]細胞固定と TRAP染色
上記 [4]により破骨細胞が形成されたプレートの培地をサクシヨンで除き、 500 L のリン酸緩衝生理食塩水（PBS)を加えてプレートを洗い、 PBSを完全に取り除く。こ の操作をもう一度繰り返した後に、 500 Lのメタノールを静かにカ卩え、 30秒経過後 にメタノールを除 、てプレートをよく乾かした。
0. 1M酢酸（pH5. 2)を含む 0. 026M酒石酸と、 0. 1M酢酸（pH5. 2)を含む 12 . 5mg/mL naphthol AS— BI phosphateを 24 : 1の割合で混合した溶液に F AST GARNET GBCを適量カ卩え、 0. 8 mフィルターに通した溶液を TRAP染 色液とした。細胞固定したプレートに 500 L の TRAP染色液をカ卩え、 37°Cで 1時 間以上反応を行った。この時点で、 TRAP活性を有する細胞は赤紫色を呈する。反 応後、 TRAP染色液を除き、超純水でプレートを洗浄した（図 1 ;TRAP— stained MN cells)。
[0051] [8]骨吸収活性
形成された多核細胞が骨吸収活性を有することを確認した。ヒドロキシアパタイトプ レー HBD Bio Coat (BD Bioscience製）〕上で分化誘導を行い、多核細胞形成 後に、 von kossa染色法により、分解されたリン酸カルシウムを測定した（図 1 ;HA plates) o分解された領域が白く見える。
[0052] [9]細胞抽出液の調製
特記しない場合は、一定時間後培養プレートを氷上に移し、培地上清を除去した。 4°Cに冷やした PBSで細胞を 2回洗浄後、適量の EBC Lysis buffer (50mM Tr is-HCl pH8. 0, 120mM NaCl, 0. 5% NP— 40, ImM EDTA, 0. 5mM
PMSF, lOOKIU/mL Aprotinine, 20mM NaF, 2mM Na VO；)を加えて
3 4 細胞を搔き取り、氷上で 30分間静置した。その後、ピペッティングにより細胞を破壊し 、遠心（15, OOOrpm, 4°C, 10分）後、上清のみを氷上のエツペンドルフチューブに 移し、これを細胞抽出液とした。細胞抽出液は液体窒素で凍結して、 80°Cで保存 した。
NEAAの添加効果を調べる実験においては、 35mm径プレートに 1 X 105個の細 胞を播種し、一晩〜 24時間後に RANKL刺激を行った。一定時間（9— 24時間）後 に培地を除き、 5秒ほど傾けてさらに残った培地を除き、 PBSで洗わずそのまま 30 Lの EBC Lysis bufferで細胞を洗浄（リンス）し、スクレイパーで回収した。その後 、 5分間 100°Cで加熱し、超音波破砕機（トミー）で 10秒間、 5回の処理を行い、細胞 を破壊した。遠心（15, OOOrpm, 4°C, 10分）後、上清のみを氷上のエツペンドルフ チューブに移し、これを細胞抽出液とした。細胞抽出液は液体窒素で凍結して、 8 0°Cで保存した。 調製した細胞抽出液の蛋白質量を Bradford法により測定し、各サンプルの蛋白質 量を同一にした後、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS— PAGE)により分 離した。泳動後、ブロッテイングタンクを用いて、ウエット式ブロッテイングにより PVDF 膜 [Poly VinyliDene Fluoride； Millipore社製]に蛋白質を転写した。転写後、 PV DF膜を PBSで 5分間洗浄し、 5% Skim MilkZPBSで 1時間、ブロッキングした。 P BSで 5分間、 PBSTで 10分間、 PBSで 5分間、 PBSで 5分間の順で PVDF膜を洗浄 した後、 5%BSAZPBSで希釈した一次抗体を 2時間以上反応させた。反応後、 PB Sで 5分間、 PBSTで 10分間、 PBSで 5分間の順で PVDF膜を洗浄した。次に、 PV DF膜を、 5% Skim MilkZPBSで希釈した二次抗体を室温で 45分間反応させた 後、 PBSで 5分間、 PBST (Phosphate Buffered SalineZTween)で 10分間、 PBSで 5分間の順で PVDF膜を洗浄し、 ECL[Amersham Bioscience社製]、又 は ECL Plus [Amersham Bioscience社製] で分離された蛋白質を検出した。 これらのプロトコルで下記の条件でウェスタンブロッテイングを行った結果を図 2に 示す。
ウェスタンブロッテイングに用いた抗体：
'抗マウス NFAT2 抗体 [Santa Cruz社製] (1Z500希釈）
'抗マウス c Fos抗体 [Santa Cruz社製] (1Z5000希釈）
'抗マウス j8—actin抗体 [シグマ社製] (1Z8000希釈）
二次抗体として、
•ャギ抗体に対して、ゥシ抗ャギ IgG HRP [Santa Cruz社製]
'マウス f几体に対して、羊 f几マウス IgG HRP conjugated [ Amersham Bioscien ce社製]
'ラビット抗体に対して、プロテイン A— HRP [Amersham Bioscience社製 Γ 用いたサンプル量：
NFAT2 : 10〜20 μ L/lane→ECL plusで検出（1〜5分くらい）
actin：〜 5 μ LZlane→ECLで検出（1分以下）
以下の実施例におけるウェスタンブロッテイングにおいて、該条件は上記と同様で ある。 [0054] [11]回収培地（conditioned medium)の調製法
5 X 105個の RAW264細胞を 10cmプレートに播種し、 37°C、 CO濃度 5%におい
2
て、一夜培養した。翌日、プレートから培地を除き、 PBSで 2回洗浄した後に、培地を 10mL注入し、 37°C、 CO濃度 5%において 24時間培養した。その後、プレートから
2
培地を回収し、これを 0. 2 mフィルターに通して細胞を取り除いた。これを低密度 回収培地とした。また、 40 X 105個の RAW264細胞を 10cmプレートに播種し、同様 の方法で回収した培地を高密度回収培地とした。また、培地を 37°C、 CO濃度 5%
2 において 24時間培養しただけの培地を、 Fresh mediumとした。これらの培地を 4 °Cにて保存し、破骨細胞の分ィ匕誘導を行う際は、これらの培地に必要量の可溶性 R ANKLを加えた。
実施例 2
[0055] NFAT2siRNAの設計と RAW264細胞への導入、発現クローンの単離
NFAT2 遺伝子の配列の中力 標的配列（5，— GGTACGTACGGATATCA GG— 3'；配列番号 3)を選び、該当する DNAを pSUPER ベクター （Oligo Engi ne, US)に組み込み発現させた。このベクターをネオマイシン耐性カセットとともに RAW264細胞に導入し、 NFAT2 - siRNA発現細胞株を選択した。
実施例 3
[0056] NFAT2の誘導
「材料と手法」で示した条件下で RAW264細胞を播種し、 RANKL刺激をカ卩えるこ とにより、分化誘導を行った。 RANKL刺激（=0時間）後、経時的に細胞抽出液を調 製し、抗 NFAT2抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより、 NFAT2の発現を確 認した（図 3)。 RANKL刺激後少なくとも 12時間から NFAT2蛋白質の発現が確認 されるとともに、 48時間以降もその発現が確認された。なお、 /3—actinは、使用した 蛋白質量を確認するためのものである（以下の実験においても同様)。
実施例 4
[0057] [1]多核細胞形成に及ぼす NFAT2発現の効果
RANKL刺激により RAW264細胞から多核細胞が形成される過程で NFAT2が 果たして!/ヽる役割を確かめるために、実施例 2で作成した NFAT2 - siRNA発現細 胞株を使用した。ここでは、前記 NFAT2— siRNA発現細胞株の代表例として 2つ のクローン、 KD—l, KD— 4を示す。これらの株では確かに NFAT2の蛋白質の発 現レベルが著しく低下しているのが確認できる。なお、 MOCKとは、 siRNAを発現 するために用いたベクターそのものを導入した株である（図 4A)。 RAW264親細胞 株を RANKL刺激した場合では、 96時間後に多核の細胞の形成が、 GST刺激では 単核細胞がそれぞれ見られるのに対し、 KD- 1あるいは KD— 4を同じ条件で分ィ匕 誘導をかけても、多核細胞の形成が見られない（図 4B)。このことから、 NFAT2の発 現が多核細胞形成に必須であることが分かる。
[0058] [2]多核細胞形成効率に及ぼす細胞播種密度の効果
ディッシュに RAW264細胞を播種する際に、細胞数をそれぞれ、通常分化誘導を 行う細胞密度（2. 5 104個7ゥェル）の0. 5倍、 1倍、 2倍、 4倍、 8倍に調整し、同 一条件下で破骨細胞への分化誘導を行った。それぞれの細胞は誘導終了後 TRAP 染色を行い、 TRAP陽性細胞を染色した。その結果、通常条件下での細胞密度をピ ークにして細胞密度が高くなるほど、破骨細胞の分ィ匕誘導効率 (多核細胞形成率） は減少し、 8倍の細胞密度では破骨細胞の形成はほとんど確認できなカゝつた（図 5)。 この際、細胞密度が 0. 5倍のプレートでも分化誘導効率が約 60%まで低下したが、 これはプレート中の細胞の絶対数が少な 、ため、必然的に形成される破骨細胞も少 なくなったことが原因だと考えられる（図 6)。
[0059] [3]骨髄細胞の多核細胞形成効率に及ぼす細胞播種密度の効果
同様の現象は RAW264細胞のかわりにマウス骨髄細胞力 調製した細胞系にお V、ても見られた。マウス骨髄細胞力も誘導した破骨細胞前駆細胞を 24ゥエルプレート に播種する際に、細胞数をそれぞれ、通常分ィ匕誘導を行なう細胞密度（1. 0 X 104 個 Zゥヱル）の 0. 5倍、 1倍、 2倍、 4倍、 8倍、 16倍、 32倍に調製し、「実施例 1」で示 した条件下で破骨細胞への分化誘導を行なった。それぞれの細胞の誘導終了後 TR AP陽性細胞を染色した。その結果、 RAW264細胞マウス細胞の場合と同様に細胞 密度が高くなるほど破骨細胞の形成が起こらなくなることが確認された（図 17A、 B)。 このように、より生体内の現象を反映する骨髄細胞系でも RAW264細胞と同様の現 象が再現された。 実施例 5
[0060] NFAT2の発現に及ぼす細胞播種密度の効果
図 3、 4の結果は、 NFAT2の発現が多核細胞形成への進行に重要であることを示 唆している。そこで、 NFAT2蛋白質の発現が細胞密度に依存していることをウェスタ ンブロッテイングで確認した。なお、プレートに播種した細胞密度は分化誘導を行う細 胞密度のそれぞれ 1倍 (2. 5 X 104個 Zゥェル )、 2倍、 4倍、 8倍密度に調整し、 RA NKL刺激後、同一条件下で 24時間培養した細胞の抽出液を用いた。その結果、 N FAT2蛋白質の発現が、細胞密度に依存 (反比例）して減少することが確認された ( 図 7)。
実施例 6
[0061] 多核細胞の形成に及ぼす培地成分の効果
上に記したように、高密度〔8倍密度：（2 X 105個 Zゥエル)〕で細胞を播種すると、 通常の条件で分化誘導を行っても多核細胞の形成効率は著しく低下する。この原因 を明らかにするために、高密度で播種した培養プレートから 24時間後に培地（condi tioned medium)を回収し、その培地を用いて通常条件下 (低密度播種)で分ィ匕誘 導を行った。 96時間後、 conditioned mediumと新鮮培地（fresh medium)とで 多核細胞の形成効率を比較したのが図 8である。
この実験から、 conditioned mediumを用いた場合には、例え細胞数が低密度で あっても、分ィ匕誘導の効率が低下していることが分かる。このことから、高密度で培養 した結果、培地成分に何らかの変化が生じ、それが多核細胞形成を抑制していること が示唆された。
実施例 7
[0062] NFAT2の発現回復における NEAAの効果
培地成分の変化と NFAT2の発現変化ならびに多核細胞形成との関連を調べるた めに、 NFAT2の発現を指標にして、多核細胞の形成に関わる要因を探った。培地 成分が変化する原因として、（1)高密度培養下で何か阻害活性因子が分泌される、 ( 2)高密度下で培地の成分が変化する、が考えられた。そこで、 NEAAの存在下 [pr e - NEAA ( + ) ]、非存在下 [pre - NEAA ( -) ]で conditioned mediumを作 成し、その後回収した conditioned mediumで次の培養（低密度）を行う際に NEA Aを添カ卩する効果（post— NEAA)を調べた。その結果、 conditioned medium調 製時の NEAA(pre— NEAA)の有無は大して重要ではなぐむしろ後力 添カ卩する NEAA (post—NEAA)の影響が大きいことが分かった（図 9)。従って、（低密度で） 培養を開始する時点で NEAAをカ卩えるかどうかが、 NFAT2の発現に重要であること が示唆された。このことを確かめるために、 NEAAを省いた場合に、 NFAT2の発現 にどのような影響が出るかを調べた（図 10)。その結果、低密度培養下 (L)で post— NEAAを加えると、 conditioned mediumでも NFAT2の発現が誘導されることが 再確認された。新鮮培地で、高密度培養条件下 (H)で培養する際に NEAAを抜くと 、 NFAT2への抑制効果が増大することから、培地中に阻害活性が存在するという可 能性よりも、 NEAAの有無が阻害活性の有無と連関して 、る可能性がより強く示唆さ れた。以上のことをさらに確認するために、高密度培地を作成する際に、 FBS、ダル タミン酸ならびに NEAAをカ卩える時期を conditioned medium作成時（pre— )ある いは RANKL添加時 (post—）に設定して、前述と同様に低密度の条件で細胞培養 を行った。結論として、 RANKL添カ卩時（ = post)に、 NEAAを加えると誘導レベル が高くなることが明らかとなった。すなわち、 NEAAの添カ卩の有無が NFAT2の発現 レベルと密接に関連して 、ることが分力つた（図 11)。
実施例 8
[0063] RAW264細胞の増殖に対する NEAAの効果
上記の実験は、 NEAAが NFAT2の発現に重要な役割をして ヽることを示唆するも のであった。し力し、 NEAAが RAW264細胞の増殖自身に何力影響を与えている のではないかという懸念があつたので、 NEAAが細胞の増殖そのものには影響しな いということを確かめるために、グルタミン（Gin)、 NEAAならびに血清の有無の条件 で 24時間 RAW264細胞を培養した。その結果、細胞の増殖ならびに生存は血清、 グルタミンの有無に大きく影響される力 非必須アミノ酸の有無には殆ど影響されな いことが分力つた（図 12)。
実施例 9
[0064] NEAA中のセリン及びグリシンの効果 これまでの実験より、 NEAAが NFAT2の発現に関わることが示唆されたので、 NE AA混合液に含まれる 7種類のアミノ酸のうちどのアミノ酸が重要なのかを決定するた めの実験を行った（図 13)。まず、血清はアミノ酸を始めとして様々な物質、分子を含 んでいるため、ノ ックグラウンドの要因となる可能性がある。そこで、アミノ酸を含む低 分子量分子を除くため、これ以後透析処理を行った血清 (F * )を用いた。 Conditio ned mediumについて、調製時の NEAA (pre— NEAA)の有無は重要ではなく、 むしろ後から添加する NEAA (post— NEAA)の影響が大きいことを再確認できた。 図 13の右 7レーンでは 7種の NEAAのうち、各アミノ酸を順次一つずつ抜いたものを 用意し、 RANKLと同時に conditioned mediumに戻した。セリンを除去した NEA Aではシグナルの回復が弱くなつている。なお、この実験は RANKL刺激後 12時間 の細胞溶解液を用いて実験を行った。
図 13で行なった実験からは、セリンの関与が示唆された。しかし、その条件下では NEAA全種類を戻しても回復のレベルが限られたものであり、ダイナミックレンジが小 さくなつてしまうきらいがあつたので、より定量的に行うために、新鮮培地 (F)を作成す る際に順次アミノ酸を抜いた NEAAを用いた実験を行った（図 14)。その結果、セリ ンがな!/、と、他の NEAA成分があっても NFAT2の誘導が著しく低下することが分か つた。逆に、他の NEAAがない状態でセリンのみを戻すと、ほぼ完全に NFAT2の発 現レベルが回復した。また、グリシンでも少し回復が見られた。これらのことから、 NE AAの中でもセリンが決定的な要因であることが明ら力となった。
実施例 10
セリンアナログによる NFAT2発現、多核細胞形成への阻害効果
以上の結果から、 MEM培地を用いた RAW264細胞からの多核細胞形成過程に おいて、 RANKL刺激により NFAT2が誘導される際に、 NEAAとしてはセリンの存 在が必要十分であることが示唆された。また、グリシンにも弱いながら同様の誘導活 性が認められた。これらのことから、セリンの構造異性体 (Lーセリン、 D—セリン、 L- ホモセリン)を用いることにより、その NFAT2誘導活性を拮抗阻害的に抑制できる可 能性が考えられたので、まず、 D—セリン及び L—ホモセリンという 2種類の物質を用 いてその可能性を検証した。 まず、 D セリン及び L ホモセリンともそれ自身では NFAT2の発現を誘導する活 性を示さな力つた。一方、 D セリンを、 L セリンに対して過剰量をカ卩えていつたとこ ろ、 10倍量添加した場合に、 L セリンによる NFAT2の発現活性を抑制することが 確かめられ、一方で L ホモセリンでは D セリンに比べて弱 、阻害活性が認められ た（図 15)。
次に、 D セリンの多核細胞形成への影響を調べた（図 16)。その結果、以下のこ とが分力つた。（1)血清の透析処理による影響はない（図 16A)、（2) L セリンがな いと分ィ匕の途中までは進行する力 多核細胞の形成は殆ど見られない（図 16B)、 (3 ) D—セリン +RANKLによる 4日間の培養後、細胞の生存率が悪くなる（図 16C)、 ( 4) L セリンにより生存は回復する（図 16D)、（5)さらに過剰量の D セリンを作用さ せると、再び多核細胞の形成効率が落ちる（図 16E)。
実施例 11
[0066] [1]Lーセリン依存的な NFAT2の発現
実施例 10の実験結果から、複数のセリン構造異性体の内、 Lーセリンが NFAT2の 発現と多核細胞形成に関与することが示された。 NFAT2の発現が Lーセリンに依存 することを確かめるために次の実験を行なった。 RAW264細胞を通常密度条件（2. 5 104個7ゥェル;以下、通常密度において同じ。）、 10%FBS存在下の通常培地 で 2時間培養を行なった。その際、培地に添加する L—セリンをそれぞれ通常量（X 1 ;0. ImM)の 0倍、 0. 1倍、 0. 3倍、 1倍の濃度になるように調製した。培養後の細 胞における NFAT2の発現量を、抗 NFAT2抗体を用いたウェスタンブロッテイング によって確認した（図 18B)。その結果、 RAW264細胞中の NFAT2蛋白発現量は 培地中の Lーセリン存在量に比例して増加することが示された。 Lーセリンを含まな ヽ 培地（X 0)では NFAT2の発現は見られなかった。このことから、 NFAT2の発現に はし セリンが必要であり、さらにその効果は量依存的であることが確かめられた。
[0067] [2]L—セリンの存在量に及ぼす細胞播種密度の効果
多核細胞形成が細胞播種密度によって影響を受けることから、高密度になるにつ れて培地中のしーセリンの量が減少して 、ることが考えられた。そこで高密度での細 胞播種を行なつたときの培地中の L セリンの濃度を測定した。 RAW264細胞を低 密度（low: 2. 5 X 104個 Zゥエル）あるいは高密度（high: 2 X 105個 Zゥエル）で播 種し、 RANKL存在下〔（ + )RANKL〕あるいは非存在下〔（―）RANKL〕で〔3H〕 - L—セリン（10 μ Ci/mL)を含む通常培地で 24時間培養した。複数のタイムポイント (0. 5, 1, 2, 4, 8, 24時間）で培地 10 L中に存在する L—セリンを3 Hの放射能を 指標としてシンチレーシヨンカウンターを用いて測定した。その結果、培養時間に比 例して培地中の Lーセリンの存在量が低下し、その減少率が高密度条件下では低密 度条件下よりも高 、ことが示された（図 18A)。 RANKLの有無によって L—セリンの 減少量に大きな変化がないことから、培地中の Lーセリンの存在量の減少は、主に細 胞播種密度によることが明ら力となった。以上の結果から、細胞密度の上昇による多 核細胞形成阻害は、培地中の Lーセリンの存在量の低下に起因する NFAT2の発現 量減少が原因となることが確かめられた。
実施例 12
[0068] [1]骨髄細胞の増殖に対する Lーセリンの効果
NEAAの存在、中でも Lーセリンが NFAT2の発現に重要な役割を果たしているこ とが明らかとなり、次に RAW264細胞のかわりにマウス骨髄細胞について、 Lーセリ ンの効果を検討した。まず、 L—セリンがマウス骨髄細胞の増殖に関与するかどうか を調べるため、骨髄細胞を透析処理した FBSを用いて 3日間培養した。その際、添 加する Lーセリンの濃度を通常（X I ;0. ImM)の 0倍、 0. 1倍、 0. 3倍、 3倍、 10倍 とし、その他については「実施例 1」に示したとおりである。細胞の増殖は、 MTTアツ セィを測定することにより評価した。 MTTアツセィは MTT cell growth kit (Ch emicon International Inc. Ca, USA)を用いた。その結果、 L—セリンは NFA T2の発現に必要であるものの、細胞の増殖にはほとんど影響しな 、ことがわかった（ 図 20A)。これは RAW264細胞を用いた「実施例 8」に記載の実験と同様の結果で ある。
[0069] [2]骨髄細胞の多核細胞形成に対する Lーセリンの効果
次に、骨髄細胞において多核細胞形成と L—セリンの関係を確かめた。骨髄細胞 から誘導した破骨細胞前駆細胞を通常密度で播種し、 Lーセリン単独ある!/、は Lーセ リン非存在の NEAAを培地中に添加した場合について、それぞれ「実施例 1」に示し た方法で破骨細胞誘導を行ない、 5日間培養後に TRAP染色を行なった。その結果 Lーセリン非存在下では破骨細胞前駆細胞の多核細胞形成が抑制されると 、う、 RA W264細胞の場合と同様の結果を得た（図 20B)。
実施例 13
[0070] [l]c fosの発現におよぼす Lーセリンの効果
現在、 NFAT2の発現には転写因子 c— fosが関わっていることが知られている（Ta kayanagi, H et al. , 2002, Dev. Cell, 3, 889— 901 ;Matsuo, K et al. , 2004, J. Biol. Chem. 279, 26475— 26480)。 NFAT2の発 現は細胞密度に比例して減少することから、実施例 3と同様の条件下での c Fosの 発現を調べた。 RAW264細胞を通常密度、 RANKL存在下で 48時間培養し、複数 のタイムポイントで回収後、抗 c Fos抗体を用 、たウェスタンブロッテイングによって c— Fos蛋白量を測定した（図 19A)。 c— Fos蛋白の発現量は RANKL刺激後 12時 間から 24時間をピークに発現が減少した。また、 RAW264細胞を低密度 (通常密度 )および高密度 (8倍)で 24時間培養後、各々の細胞溶解液中の c Fos蛋白質の発 現量を抗 c— Fos抗体を用いてウェスタンブロッテイングにより比較したところ、高密度 条件下では c— Fos蛋白質量は減少することが示された（図 19B)。
以上の結果から、 c— Fosの発現もまた細胞密度依存的であることが示された。更に c— Fosと L セリンの関係を調べるために以下のような実験を行なった。 RAW264 細胞を低密度 (通常密度）に播種し、 NEAAと L セリン及び Z又は L グリシンを異 なる組み合わせで培地に添加したものをそれぞれ 24時間培養した。 24時間後に細 胞を回収し、抗 NFAT2抗体および抗 c Fos抗体を用いたウェスタンブロッテイング を行なった（図 19C)。その結果、 NFAT2及び c— Fosはともに L セリン依存的に 発現することが示された。従って Lーセリンは c— Fosの発現制御を介して NFAT2の 発現を制御して！/ヽる可能性が示された。
[0071] [2]骨髄細胞の c Fos及び NFAT2発現におよぼす Lーセリンの効果
さらに骨髄細胞力 誘導される破骨細胞における c Fos及び NFAT2の発現が L ーセリン依存的に起こることを確かめるため、破骨細胞前駆細胞を通常密度で培養 し、 L セリン存在下あるいは非存在下で破骨細胞への分ィ匕誘導を行なった。 48時 間培養後抗 c Fos抗体あるいは抗 NFAT2抗体を用いたウェスタンブロッテイング を行ない、 c— Fosと NFAT2それぞれの蛋白質発現を検出した。その結果、 L セリ ン非存在下では c Fosおよび NFAT2の発現は減少しており、これら 2分子の発現 力 SL セリン依存的であること力 より生体を反映している骨髄細胞においても確かめ られた（図 20C)。
[0072] [3]骨髄細胞の多核細胞形成に対する NFAT2の効果
これまでの結果から、骨髄細胞にお!、ても破骨細胞への分化誘導時の多核細胞形 成にはしーセリンと NFAT2の発現が重要であることが示された。ここで L セリンと N FAT2の両方の発現が多核細胞形成過程に必須力どうかを検討するために、レトロ ウィルス感染を介して NFAT2を強制発現させた破骨細胞前駆細胞を通常密度で培 養し、 Lーセリン存在下あるいは非存在下で破骨細胞への分ィ匕誘導実験を行なった 。 5日間培養後に TRAP染色を行なった結果、 Lーセリン非存在下においても NFA T2の強制発現によって Lーセリン存在下とほぼ同量の多核細胞形成が行なわれるこ とが明らかとなった（図 20D)。 NFAT2のかわりに GFPを発現させた細胞ではセリン 非存在下では多核細胞形成が起こらな力つたことから、多核細胞形成には NFAT2 が必須であり、 Lーセリンの存在がなくとも NFAT2さえ発現すれば破骨細胞の形成 力 S起こることが示された。
産業上の利用可能性
[0073] 本発明の方法は、 NFAT2関連疾患の予防又は治療方法として有用である。また、 本発明の薬剤は、 NFAT2に関連する疾患、例えば骨粗鬆症、自己免疫性関節炎、 パジェット病又は関節リウマチを含む様々な骨減少性疾患及び骨癌、又は大理石骨 病等の骨硬化性疾患、あるいは免疫性疾患等に対する副作用の少な 、薬剤として 有用である。また、本発明のスクリーニング方法は、新規な NFAT2の発現制御剤の 探索に有用である。

Claims

請求の範囲
[I] Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達経路を抑制することを特徴とする NFAT2の発現を抑制する方法。
[2] NFAT2発現の抑制力 NFAT2遺伝子発現の抑制によるものであることを特徴と する請求の範囲第 1項記載の方法。
[3] Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達経路の抑制を Lーセリンと拮抗す る物質とを接触させることによって行うことを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項 記載の方法。
[4] Lーセリンと拮抗する物質が Lーセリン類似物質であることを特徴とする請求の範囲 第 3項記載の方法。
[5] L セリン類似物質が D セリン、 L ホモセリン、それらの塩又はそれらのエステ ル体であることを特徴とする請求の範囲第 4項記載の方法。
[6] 請求の範囲第 1項〜第 5項のいずれかの方法により、 NFAT2の発現を抑制するこ とを特徴とする NFAT2関連疾患の予防及び Z又は治療方法。
[7] Lーセリン及び Z又は L—グリシンのシグナル伝達経路を抑制することを特徴とする
NFAT2関連疾患の予防及び Z又は治療方法。
[8] NFAT2関連疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求の範囲第 6項又は第 7項 記載の予防及び Z又は治療方法。
[9] 有効量の D セリン、 L—ホモセリン、それらの塩又はそれらのエステル体の投与を 含むことを特徴とする、生体内での Lーセリン及び Z又は L—グリシンのシグナル伝 達経路抑制プロセス。
[10] Lーセリン及び Z又は L グリシンと拮抗する物質を含有することを特徴とする NFA T2関連疾患の予防及び Z又は治療剤。
[II] Lーセリンと拮抗する物質が D セリン、 L—ホモセリン、それらの塩又はそれらのェ ステル体であることを特徴とする請求の範囲第 10項記載の予防及び Z又は治療剤。
[12] NFAT2関連疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求の範囲第 10項又は第 1
1項記載の予防及び Z又は治療剤。
[13] 破骨細胞形成に及ぼす物質をスクリーニングする方法であって、（a)被検物質を含 む試料の存在下、破骨細胞前駆細胞における L セリン及び Z又は L グリシンの シグナル伝達の抑制又は促進を検出する工程、及び (b)前記 Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達の抑制を破骨細胞形成の抑制に、又は前記 Lーセリン 及び Z又は L グリシンのシグナル伝達の促進を破骨細胞形成の促進に関連付け る工程、を含む方法。
[14] 破骨細胞形成に係わる Lーセリンと拮抗する物質をスクリーニングする方法であつ て、（a)被検物質、 Lーセリン及び RANKLを含有する培地で、破骨細胞前駆細胞を 培養する工程、及び (b)破骨細胞前駆細胞における L セリン及び Z又は L グリシ ンのシグナル伝達の抑制を検出する工程、を含む方法。
[15] 破骨細胞形成に係わる Lーセリン及び Z又は L グリシン様作用を有する物質をス クリーニングする方法であって、（a)被検物質及び RANKLを含有し、 Lーセリン及び Z又は L グリシンを含有しな!ヽ培地で破骨細胞前駆細胞を培養する工程、及び (b )破骨細胞前駆細胞における Lーセリン及び Z又は L グリシンのシグナル伝達の促 進を検出する工程、を含む方法。
[16] NFAT2関連疾患を予防及び Z又は治療する医薬を製造するための Lーセリンと 拮抗する物質の使用。
[17] Lーセリンと拮抗する物質が D セリン、 L—ホモセリン、それらの塩又はそれらのェ ステル体であることを特徴とする請求の範囲第 16項記載の使用。
[18] NFAT2関連疾患が骨粗鬆症であることを特徴とする請求の範囲第 16項又は第 1 7項記載の使用。
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