KR20090068376A - 염증 질환에서 4-1ｂｂ 리간드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지속적인 염증에 대한 신규 치료 개입물로서, 4-1BBL 차단제뿐만 아니라 상기 차단제를 포함하는 약학적 조성물 및 제조 물품을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한, 종양 괴사 인자의 지속적인 생성을 감소시키는 방법을 제공한다.

4-1BBL

Description

염증 질환에서 4-1ＢＢ 리간드 {4-1BB LIGAND IN INFLAMMATORY DISEASES}

관련 출원

본 출원은 2006 년 10 월 16 일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 60/852,022, 및 2007 년 5 월 11 일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 60/917,561 을 우선권으로 주장하며, 상기 두 출원 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 삽입되어 있다.

연방 지원 연구에 관한 언급

본 출원에 관한 연구는 미국 정부 (GM67101, AI41637, 및 AI54696) 로부터 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 가질 수 있다.

대식세포에서 종양 괴사 인자 (TNF) 와 같은 전염증성 사이토카인을 생성하는 것은 선천성 면역 반응을 개시하고 패혈증과 같은 질환을 동반하는 전신성 염증 상태를 유지하는데 필수적이다 (Beutler, Nature 430:257-63 (2004); Cohen, Nature 420:885-91 (2002)). 톨-유사 수용체 (Toll-like receptor, TLR) 는 1 차 선천성 면역반응 센서로서, 각각은 미생물 기원의 특정 분자에 반응한다 (Janeway & Medzhitov, Annu. Rev. Immunol. 20:197-216 (2002)). TLR4 는 리포폴리사카라이드 (LPS) 내독소에 대한 수용체이고, 골수종 분화 1 차 반응 유전자 88 (MyD88) 및 톨/인터루킨-1 수용체/내성 어댑터 단백질 (TRIF) (TICAM-1 이라고도 함) 과 같은 신호화 어댑터를 보충함 (recruitting) 으로써 LPS 에 반응한다. 이러한 보충은 IRAK 패밀리 (family) 구성원 및 TNF 수용체-연관 인자 6 (TRAF6) 의 상호작용 및 활성화를 가능하게 하고, 이는 이어서 염증 사이토카인 생성을 조절하는 NF-κB 및 MAP 키나아제 경로를 활성화시킨다 (Akira & Takeda, Nat. Rev. Immunol. 4:499-51 1 (2004)).

NF-κB 및 MAP 키나아제 경로는 리포폴리사카라이드 (LPS) 를 처리한 지 수 시간 내에 대식세포에서 일시적으로 활성화되더라도, TNF 와 같은 전염증성 사이토카인의 생성은 24 시간까지 지속될 수 있다. 따라서, 염증 사이토카인의 생성은 시작 후에 이후의 "지속" 기간 ("sustained" phase) 이 후속되는 것을 특징으로 하는 염증 과정의 일부이다. 지속 기간은 정상적으로는 염증 유도 (trigger) 가 해결되었을 때 종료한다. 지속적인 사이토카인 생성은 염증 상태의 유지 및 염증 질환의 발달에 매우 중요한데, 그 이유는 염증 조절에 있어서 와해의 정점을 이루는 많은 사건들이 지속적인 염증 반응이 종료될 즈음에 생기기 때문이다. 따라서, 지속적인 TNF 생성은 많은 염증 질환의 병리학과 연관 있다.

따라서, 지속적인 TNF 생성에 영향을 줄 수 있는 제제는 염증 질환 치료제의 개발에 유용할 것이다.

발명의 개요

본 발명은 대식세포 활성화를 매개하는데 중요한 전염증성 사이토카인의 생성에 있어서, 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 의 역할을 발견한 것을 포함한다. 특히, 본 발명은 4-1BBL 이 염증을 초래하는 종양 괴사 인자 (TNF) 의 지속적인 생성에 중요한 후기 신호화 사건에서 작용한다는 발견을 포함한다. 후기 사이토카인 생성에 있어서의 4-1BBL 의 기능은 4-1BB 에 독립적이다. 따라서, 본 발명은 알려진 4-1BBL 의 수용체 4-1BB 에 독립적인 4-1BBL 의 신규 기능에 관한 것이고, 염증 사이토카인의 생성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 4-1BBL 안타고니스트 및 차단제, 뿐만 아니라 그러한 안타고니스트 및 차단제를 포함하는 약학적 조성물 및 제조 물품을 제공한다. 또한, 본 발명은 4-1BBL 차단제 및 안타고니스트를 검사하는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 측면은 4-1BBL 차단제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물로서, 여기서, 4-1BBL 차단제는 : (a) 4-1BBL 에 특이적인 안타고니스트성 항체 ; (b) 세포 내 4-1BBL 핵산으로부터의 발현을 감소시키기에 효과적인 올리고뉴클레오타이드 ; 및 (c) 용해성 4-1BB 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 치료적 유효량의 차단제가 상기 조성물에 사용될 수 있다.

본 발명의 한 측면은 4-1BBL 차단제, 및 항염증 약물인 제 2 약제를 포함하는 약학적 조합물로서, 여기서, 4-1BBL 차단제는 : (a) 4-1BBL 에 특이적인 안타고니스트성 항체 ; (b) 세포 내 4-1BBL 핵산으로부터의 발현을 감소시키기에 효과적인 올리고뉴클레오타이드 ; 및 (c) 용해성 4-1BBL 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 치료적 유효량의 차단제 및/또는 항염증 약물이 조성물에 사용될 수 있다. 항염증 약물은 종양 괴사 인자에 특이적인 항체일 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 4-1BBL 에 특이적인 키메라성 또는 인간화된 항체 이다.

본 발명의 또다른 측면은 포유류 4-1BBL 에 특이적으로 결합하는 용해성 4-1BB 이다. 일부 구현예에서, 포유류 4-1BBL 은 인간, 마우스, 토끼, 돼지 또는 말의 것이다. 일부 구현예에서, 용해성 4-1BB 는 인간 A-I BB 폴리펩타이드의 아미노산 23 내지 아미노산 186 ; 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 24 내지 아미노산 187 ; 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 186 ; 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 187 ; 또는 또다른 포유류 4-1BB 에 있는 상응하는 영역에 상응하는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 용해성 4-1BB 는 SEQ ID NO: 7, 8, 20 또는 21 의 서열을 갖는다.

본 발명의 또다른 측면은 4-1BBL 차단제를 함유하는 용기, 및 염증의 감소, 및/또는 염증 사이토카인 생성의 감소를 위한 4-1BBL 차단제의 용도에 대한 지침을 포함하는 제조 물품이다. 일부 구현예에서, A-1 BBL 차단제의 용도에 관한 지침은 염증 상태의 치료에 있어서 4-1BBL 차단제의 용도에 관한 지침을 포함한다. 치료적 유효량의 차단제는 용기 내에 제공될 수 있다.

일부 구현예에서, 염증 상태는 류마티스 관절염, 유년성 류마티스 관절염, 건선 관절염, 건선, 강직성 척추염, 크론병, 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 유년성 만성 관절염, 골다공증, 또는 과민성 장 증후군이다.

본 발명의 또다른 측면은 4-1BBL 차단제를 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 염증 사이토카인의 생성을 감소시키는 방법이다. 치료적 유효량의 차단제를 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 염증 상태를 겪 고 있거나 또는 그럴 위험에 있는 포유류를 규명하는 방법을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 포유류는 인간, 마우스, 토끼, 돼지 또는 말이다.

본 발명의 또다른 측면은 4-1BBL 차단제를 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 염증을 감소시키는 방법이다. 치료적 유효량의 차단제를 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 포유류는 인간, 마우스, 토끼, 돼지 또는 말이다.

본 발명의 또다른 측면은 하기 단계를 포함하는, 4-1BBL 차단제를 검사하는 방법이다 : (a) 4-1BBL 발현 세포를 후보 제제와 접촉시키는 단계 ; 및 (b) 상기 후보 제제가 염증 사이토카인의 생성을 감소시키는지, 또는 상기 후보 제제가 4-1BBL 올리고머화를 예방하는지 측정하는 단계로서, 상기 후보 제제가 염증 사이토카인의 생성을 감소시키거나 또는 4-1BBL 올리고머화를 예방한다면 상기 제제는 4-1BBL 차단제이다. 일부 구현예에서, 염증 사이토카인은 종양 괴사 인자 또는 IL-6 이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포, 대식세포, 및/또는 RAW264.7 세포이다.

본 발명의 또다른 측면은 하기 단계를 포함하는, 4-1BBL 차단제를 검사하는 방법이다 : (a) 후보 제제를 포유류에 투여하는 단계 ; 및 (b) 상기 후보 제제가 포유류에서 염증을 감소시키거나 또는 염증 사이토카인의 생성을 감소시키는지를 측정하는 단계로서, 여기서, 상기 후보 제제가 포유류에서 염증을 감소시키거나 또는 염증 사이토카인의 생성을 감소시킨다면 이는 4-1BBL 차단제임. 일부 구현예에서, 포유류는 염증 상태를 갖고 있다. 일부 구현예에서, 염증 사이토카인 은 종양 괴사 인자 또는 IL-6 이다. 일부 구현예에서, 염증 사이토카인의 생성은 20%, 25%, 30%, 또는 30% 가 넘게 감소된다. 일부 구현예에서, 포유류는 마우스, 래트, 토끼, 또는 돼지이다.

본 발명의 일부 구현예에서, 4-1BBL 은 포유류 4-1BBL 이다. 일부 구현예에서, 4-1BBL 은 인간, 마우스, 래트, 토끼, 돼지 또는 말의 것이다. 일부 구현예에서, 4-1BBL 은 SEQ ID NO: 1 또는 2 에서 나타낸 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 차단제는 4-1BBL 에 특이적인 키메라성 또는 인간화된 항체이다. 일부 구현예에서, 차단제는 SEQ ID NO: 10 ~ 15, 22 ~ 38, 및 45 ~ 56 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 차단제는 인간 4-1BBL 에 결합하는 용해성 4-1BB 이다. 일부 구현예에서, 용해성 4-1BB 는 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 23 내지 아미노산 186 ; 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 24 내지 아미노산 187 ; 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 186 ; 또는 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 187 에 상응하는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 차단제는 SEQ ID NO: 7, 8, 20 또는 21 에 나타낸 서열을 갖는 용해성 4-1BB 이다. 일부 구현예에서, 염증 사이토카인은 종양 괴사 인자 또는 IL-6 이다.

달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 보편적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 수행에 사용될 수 있더라도, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기술된다. 언급된 모든 공 개물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문헌은 그 전체가 참조로써 본원에 삽입된다. 아미노산 지정은 약기하지 않은 명칭 (full name), 3-자, 또는 1-자 지정용어를 포함할 수 있으며, 이는 본 발명이 속한 당 기술분야의 당업자가 보편적으로 이해하는 것들이다. 분쟁의 경우, 정의를 포함하여 본 명세서는 조절을 할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시적인 것이고, 제한하려는 것은 아니다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구항에서 분명해질 것이다.

도 1A ~ 1D 는 4-1BBL 이 TLR4-상호작용 단백질임을 나타내는 결과이다. (A) TLR4 의 아미노산 653 ~ 839, 및 4-1BBL 의 아미노산 5 ~ 254 (클론 1), 4-1BBL 의 아미노산 3 ~ 254 (클론 2), 주요 음성 (dominant negative) p38α (AF), p53 또는 라민을 암호화하는 발현 플라스미드로 트랜스펙션된 효모 세포의, 히스티딘 결핍 배지 상에서의 성장. 관련없는 단백질을 제외하고, 4-1BBL 은 TLR4 세포내 도메인과 상호작용한다. (B) 빈 플라스미드 (대조군), 또는 헤마글루티닌-태깅된 4-1BBL (HA-4-1BBL) 및 Flag-태깅된 TLR4 또는 IL-3R 을 발현하는 플라스미드로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션 후 24 시간째에 파쇄시킨 293T 세포의 면역어세이 ; 파쇄물의 2/3 를 항-헤마글루티닌 (HA) 을 사용해 면역침전 (IP) 시켰다. IL-3R 이 아닌 TLR4 가 4-1BBL 에 의해 침전되었다. (C) GFP-태깅된 4-1BBL, 및 Flag-태깅된, TLR4, 시토졸 도메인이 결여된 TLR4 (TLR4-ΔCyt), 세포외 도메인이 결여된 TLR4 (TLR4-ΔExt) 또는 IL-3R (좌측), 또는 Myc-태깅된, TLR4 또 는 P712H 치환이 있는 TLR4 (TLR4-P712H ; 우측) 를 발현하는 플라스미드로 트랜스펙션시킨 293T 세포의 면역어세이 ; 파쇄물을 항-Flag 또는 항-Myc 를 사용해 면역침전시켰다. TLR4 세포내 도메인은 4-1BBL 과의 상호작용에 참여하고, TLR4 Toll-IL-1R 도메인의 특정 부위는 4-1BBL 및 MyD88 과 상호작용한다. (D) Flag-태깅된 TLR4, 및 GFP 단독, 또는 GFP-태깅된, 4-1BBL, 시토졸 도메인이 결여된 4-1BBL (4-1BBL-ΔCyt), 세포외 도메인이 결여된 4-1BBL (4-1BBL-ΔExt) 또는 시토졸의 도메인만 함유하는 4-1BBL (4-1BBL-Cyt) 을 발현하는 플라스미드로 트랜스펙션시킨 293T 세포의 면역어세이. 4-1BBL 의 시토졸 도메인 및 세포막 관련물질은 4-1BBL 이 TLR4 와 상호작용하는데 필요하다. IP : 면역침전 ; IB : 면역블로팅. 결과는 2 ~ 3 번의 독립적인 실험의 대표값이다.

도 2A ~ 2D 는 생체 내에서의 4-1BBL 의 억제 효과를 나타내는 결과이다. (A) 체중 25 g 당 LPS 0.5 mg 을 복강 내 주사한 야생형 및 4-1BBL-결핍 마우스의 생존. 4-1BBL 녹아웃 (KO) 마우스는 LPS 의 치사 효과에 대해 내성이었다. 아이소타입 대조군 IgG2a 또는 항-4-1BBL (체중 25 g 당 250 μg) 과 함께, 체중 25 g 당 LPS 300 μg (B) 또는 LPS 500 μg (C) 을 복강 내 주사한 야생형 마우스의 생존. 야생형 마우스에 대한 LPS 의 치사 효과는 항-4-1BBL 의 투여에 의해 약화되었다. (D) LPS 를 주사한 야생형 또는 4-1BBL-결핍 마우스의 혈청 내 TNF 의 ELISA. LPS-유도 TNF 생성은 야생형 마우스와 비교해 4-1BBL KO 마우스에서 훨씬 더 낮았다. 로그-순위 테스트를 (A) 및 (B) 에 사용하였다. (A) 에서 P = 0.0017 ; (B) 의 좌측 패널에서 P = 0.018 ; (B) 의 우측 패널에서 P = 0.048. (C) 에서 데이타는 평균 ± s.d 로 나타내었다. *, P < 0.005, **, P < 0.001 (Student's t-테스트).

도 3A ~ 3H 는 4-1BBL 이 LPS-자극 대식세포에서의 지속적인 TNF 생성에 필요하다는 것을 보여주는 결과이다. (A) 야생형 (WT) 또는 4-1BBL-결핍 (4-1BBL KO) 복막 대식세포를 비처리 (주입물 없음) 또는 LPS (100 ng/mL ; LPS) 로 24 시간 동안 처리한 후, 배양 배지에서의 TNF, IL-6, IL-1β 또는 IL-12 의 p40 사슬 (IL-12p40) 의 ELISA. 하부 우측, IL-1β (10 ng/mL ; 대조군) 에 의해 유도된 IL-6 의 생성. 4-1BBL-결핍 대식세포는 야생형 대식세포보다 TNF, IL-6 및 IL-12 를 덜 생성하였다. (B 및 C) LPS 를 처리한 배양 배지에서, 야생형, 및 4-1BBL-결핍 대식세포 (B) 또는 4-1BB-결핍 대식세포 (4-1BB KO ; C) 의 TNF 생성에 대한 ELISA (시간, 수평축). 4-1BBL 은 LPS 자극 후 더 늦은 시간 동안의 TNF 생성에 필요하였으나, 4-1BB 는 지속적인 LPS-유도 TNF 생성의 촉진에는 필요하지 않았다. (D) LPS 로 처리한 야생형 및 4-1BBL-결핍 대식세포에 의한 TNF mRNA 의 정량적 PCR (시간, 수평축). AU : 임의 단위 (arbitrary unit). TNF mRNA 는 LPS 자극 후 2 시간째에 4-1BBL-결핍 및 야생형 대식세포에서 유사한 양에서 피크를 이루었으나, LPS 자극 후 더 이후의 시간에서는 야생형 대식세포에서보다 4-1BBL-결핍 세포에서 TNF mRNA 가 훨씬 더 적었다. (E) LPS (100 ng/mL ; 시간, 상기 레인 (lane) 로 자극한 야생형 및 4-1BBL-결핍 대식세포에서의 TNF 및 글리세르알데하이드 인산염 탈수소효소 (GAPDH ; 대조군) 전사율에 대한 핵 진행 (nuclear run-on) 분석의 RNA 도트 블롯). LPS 는 4-1BBL-결핍 및 야생형 대식 세포 둘 다에서 LPS 자극 후 1 시간째에 Tnf 전사를 유도하였으나, Tnf 전사는 LPS 처리 후 더 이후의 시간에서는 4-1BBL-결핍 대식세포에서 감소하였다. (F) LPS 자극 후 3 시간째에 야생형 및 4-1BBL-결핍 대식세포에서 TNF mRNA 의 안정성에 대한 실시간 PCR 분석. 액티노마이신 D (10 μg/mL) 는 전사를 억제시키는데 사용되었다. 값은 0 시간째의 값 (100% 로 설정) 에 대해 남아있는 % 이다. 4-1BBL 의 소실은 TNF mRNA 의 안정성에 있어서 상당한 영향을 가졌다. (G) LPS 로 자극한 야생형 및 4-1BBL-결핍 대식세포의 핵 추출물에 대한 EMSA (시간, 상기 레인) 를 방사성표지 프로브를 사용해 평가하였다 (좌측 가장자리). 4-1BBL 소실은 LPS-유도 NF-κB 활성화 또는 LPS-유도 전사 인자 AP-1 의 활성화에 아무런 영향을 주지 못하였다. (H) LPS 로 처리한 야생형 또는 4-1BBL-결핍 대식세포의 파쇄물에 대한 면역블로팅 (시간, 상기 레인). NF-κB 및 MAP 키나아제 경로는 4-1BBL 소실에 의해 유의하게 영향을 받지 않았다. p-, 인산화된 것, 대조군에 대하여, *, P < 0.01, 및 **, P < 0.005, (Student's t-테스트). 데이타는 3 벌 중복의 평균 ± 표준편차이고 (A ~ D), 2 ~ 3 번의 실험의 대표값이다 (A ~ H).

도 4A ~ 4D 는 4-1BBL 이 RAW264.7 대식세포에서의 지속적인 TNF 생성에 필요함을 나타내는 결과이다. (A) RAW 264.7 세포를 p억제자-함유 (pSuppressor-containing) 대조군 siRNA, 또는 4-1BBL-siRNA#1 또는 #2 를 사용해 안정하게 트랜스펙션시켰다. 4-1BBL 의 단백질 수준을 면역블로팅에 의해 측정하였다. (B) TNF 생성을 지시된 시간 동안 LPS (100 ng/mL) 로 처리한 대조군 및 4-1BBL 녹 다운 세포에서 측정하였다. (C) 펩티도글리칸 (PG, 10 μg/mL), 폴리I:C (25 μg/mL), LPS (100 ng/mL), CpG (5 μg/mL), 또는 배양 배지로 24 시간 동안 처리한 대조군 및 4-1BBL 녹다운 (knockdown) 세포에서 TNF 생성을 측정하였다. siRNA 는 둘 다 RAW264.7 세포에서 4-1BBL 발현을 효과적으로 녹다운시켰고 (A), LPS- 및 다른 TLR 리간드-유도 TNF 생성을 억제시켰다 (B 및 C). 4-1BBL 은 I-κB-α 분해에서 반영된 바와 같이 RAW264.7 세포에서 LPS-유도 NF-κB 활성화에 아무런 영향을 갖지 않았다 (D). 데이타는 2 벌 중복으로 수행된 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차로서 나타낸다. *, P < O.05, 및 **, P < 0.01 대 (versus) 대조군. (a) 의 결과는 3 번의 실험의 대표값이다.

도 5A ~ 5B 는 4-1BB 가 RAW264.7 대식세포에서 LPS-유도 TNF 생성에 관여하지 않음을 나타내는 결과이다. (A) RAW264.7 세포를 p억제자-함유 대조군 siRNA, 4-1BB-siRNA#1 또는 #2 로 안정하게 트랜스펙션시켰다. 4-1 BB mRNA 를 RT-PCR 에 의해 시험하였다. (B) LPS (100 ng/mL) 로 24 시간 동안 처리한 후 대조군 및 4-1BB 녹다운 세포에서 TNF 생성을 측정하였다. 작은 간섭 (Small interfering) RNA 는 RAW264.7 세포에서 4-1BB 생성을 효과적으로 녹다운시켰으나 (A), LPS-유도 TNF 생성에 있어서는 아무런 효과가 나타나지 않았다 (B). 데이타는 2 벌 중복으로 수행된 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차로서 나타낸다.

도 6A ~ 6D 는 4-1BBL 이 대식세포에서의 TLR-리간드-유도 TNF 생성에 관여함을 나타내는 결과이다. (A) 293T 세포를 Flag-TLR2, Flag-TLR3, Flag-TLR4, 또는 Flag-TLR9 와 함께, 빈 (대조군) 또는 HA-4-1BBL 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다. 세포를 트랜스펙션시킨 지 24 시간 후에 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 항-Flag 항체를 사용해 면역블로팅하거나, 또는 항-HA 를 사용해 면역침전시킨 다음 항-HA 및 항-flag 항체를 사용해 면역블로팅하였다. 테스트된 모든 TLR 은 공-면역침전 어세이에서 4-1BBL 에 의해 감쇠하였다 (pulled down). (B) 야생형 및 4-1BBL-결핍 대식세포를 Pam3 (1 μg/mL), 폴리I:C (25 μg/mL), LPS (100 ng/mL), R848 (100 nM), CpG (5 μg/mL), IL-1β (10 ng/mL), 또는 배양 배지 (없음) 로 처리하였다. TNF 생성을 처리한 지 24 시간 후에 측정하였다. Pam3 (TLR2 리간드)-, 폴리I:C (TLR3 리간드)-, R848 (TLR7&8 리간드)-, CpG (TLR9 리간드)-유도 TNF 생성은 4-1BBL KO 세포에서 감소하였다. (C) 야생형 및 TLR4-결핍 대식세포를 0, 1, 2.5 또는 5 μg/mL 의 CpG DNA 로 처리하고, 24 시간 동안 인큐베이션시키거나, 또는 (D) 1 μg/mL 의 CpG DNA 로 처리하고 배양 상청액을 지시된 시점에서 수합하여 TNF 생성을 측정하였다. 낮은 투여량의 CpG (1 μg/mL) 를 사용하였을 때, TLR4-결핍 대식세포에서 TLR9-유도 TNF 생성의, 작으나 통계적으로 유의한 감소가 있었다. 데이타는 3 벌 중복의 평균 ± 표준편차로서 나타낸다. *, P<0.05, **, P<0.0\ , 및 ***, PO.005. 결과는 2 ~ 4 번의 실험의 대표값이다.

도 7A ~ 7F 는 4-1BBL 유도 및 세포 표면 위치화가 LPS-처리 대식세포에서의 지속적인 TNF 생성에 필요함을 나타내는 결과이다. (A) LPS 로 처리한, 야생형 대식세포, 및 TLR4 (TLR4 KO), MyD88 (MyD88 KO) 또는 TRIF (TRIF KO) 결핍 대식세 포의 파쇄물에서의 4-1BBL 의 면역블로팅 (시간, 상기 레인). LPS 는 대식세포에서의 4-1BBL 의 빠른 발현을 TLR4-, MyD88-, 및 TRIF-의존성 방식으로 유도한다. (B) 전처리 없이 놔둔 (주입물 없음) 또는 NF-κB (20 μM 술파살라진), p38 (10 μM SB203580), Jnk (5 μM SP600125) 또는 MEK (10 μM PD98059) 의 억제제로 1 시간 동안 전처리한 다음 LPS 로 처리한 야생형 대식세포에서의 4-1BBL mRNA 의 준정량적 PCR (시간, 상기 레인). LPS-유도 4-1BBL mRNA 는 NF-κB 억제제 술파살라진 및 프로테아좀 억제제 MG-132 에 의해 효과적으로 억제되었다 (데이타 나타내지 않음). 또한, p38 억제제 SB203580, Jnk 억제제 SP600125, 및 Mek 억제제 PD98059 가 또한 4-1BBL 발현에 대해 어느 정도 억제 효과를 가졌다. (C) LPS-유도 4-1BBL mRNA (1 시간 처리 ; LPS), 또는 4-1BBL 을 암호화하는 재조합 아데노바이러스 (Adv) 로 감염시킨 후 18 시간째에 4-1BBL mRNA 를 이소적으로 (ectopically) 발현하는 것의 안정성에 대한 실시간 PCR 분석. 액티노마이신 D 를 사용하여 전사를 억제시켰다. 값은 0 시간째의 값 (100% 로 설정) 에 대해 남아있는 % 이다. mRNA 안정성에 있어서 LPS-유도 변경은 또한 LPS-유도 4-1BBL 발현과 관계있었다. (D) 0.1% 사포닌으로 투과성 있도록 만든 세포에서 LPS (시간, 키 (key)) 로 처리한 야생형 복막 대식세포에 의한 4-1BBL 발현의 유세포분석 : 우측, 표면 발현 ; 좌측, 총 발현. LPS-유도 4-1BBL 은 세포 표면 상에 위치한다. (E) 브레펠딘 A (3 μg/mL) 를 사용해 (+) 또는 사용하지 않고 (-) 1 시간 동안 예비인큐베이션한 다음 LPS (시간, 좌측 가장자리) 로 처리하고 항-4-1BBL 을 사용해 면역염색한 야생형 복막 대식세포의 면역형광 현미경. 본 래 크기, x 100. 브레펠딘 A 는 소포체에서 골지체로의 전위를 억제시킴으로써 단백질이 세포 표면에까지 전위하는 것을 차단한다. (F) E 에서 기술된 바와 같이 처리한 세포의 파쇄물 내 4-1BBL 및 TNF mRNA 의 준정량적 PCR. 브레펠딘 A 는 1 시간 후에 4-1BBL mRNA 의 LPS-유도 증가에 영향을 미치지 않았고 또한 LPS-유도 TNF mRNA 에도 영향을 미치지 않았으나, 2, 4 및 6 시간째에는 TNF mRNA 를 감소시켰다. GAPDH (A,B,F) : 글리세르알데하이드 인산염 탈수소효소 (로딩 대조군). 데이타는 3 번의 독립적인 실험의 대표값이다.

도 8 A ~ 8F 는 IL-1β 가 아닌 TLR 리간드가 대식세포에서 4-1BBL 발현을 유도함을 지시하는 결과이다. 야생형 대식세포를 LPS, IL-1β, 폴리I:C, 펩티도글리칸, CpG DNA, 또는 R848 로 지시된 시간 동안 처리하였다. 비처리 (주입물 없음), LPS, 또는 IL-1β 로 24 시간 동안 처리한 세포의 배양 상청액을 수합하고, IL-6 수준을 ELISA 에 의해 측정하였다. (B) 의 데이타는 3 벌 중복실험의 평균 ± 표준편차로서 나타낸 것이다. 항-4-1BBL 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 4-1BBL 발현을 분석하였다. GAPDH 를 대조군으로서 사용하였다. 결과는 2 ~ 3 번의 실험의 대표값이다.

도 9A ~ 9G 는 4-1BBL 의 발현 및 가교가 TNF 생성을 유도함을 지시하는 결과이다. 다양한 투여량 (상기 레인 및 수평축) 의 비처리 아데노바이러스 (대조군) 또는 4-1BBL 을 발현하는 아데노바이러스로 감염시킨, 야생형 대식세포 (A), 야생형 및 4-1BB-결핍 대식세포 (B), 야생형 및 TLR4-결핍 대식세포 (C), 야생형 및 TLR2-결핍 대식세포 (D), 또는 야생형 및 TRIF-결핍 대식세포 (E) 에 의한 4- 1BBL 의 면역블로팅 (상기) 및 TNF 생성의 ELISA (하기). PFU : 플라크-형성 단위. 4-1BBL 발현은 투여량 의존적 방식으로 TNF 생성을 유도하였으나 (A), 4-1BB 를 필요로 하지 않았다 (B). TNF 유도는 TLR4-/- 마우스로부터 단리한 대식세포에서 부분적으로 손상되고 (C), TLR2-결핍 대식세포에서 더 낮았다 (D). TNF 유도는, TRIF 결손이 4-1BBL-유도 TNF 생성에 대해 아무런 영향을 미치지 못하였기 때문에 TRIF 에 독립적이었다 (E). (F) 야생형 대식세포, 또는 4-1BBL, MyD88, TRIF, TLR2, TLR4, 또는 MyD88 및 TRIF 둘 다가 결핍된 대식세포에 의한 TNF 생성의 ELISA 로서, 상기 세포들을 염소 항-인간 Fc (항-Fc; 1.5 μg/mL), 4-1BB-Fc (5 μg/mL), 둘 다와 함께, 또는 배양 배지 단독 (주입물 없음) 으로 24 시간 동안 처리하였다. 2 개 초과의 4-1BBL 분자의 가교가 TNF 생성을 유도하는데 필요하다. (G) 배양 배지 (주입물 없음), 또는 LPS 단독, 또는 Fc, 4-1BB-Fc 또는 항-4-1BBL (α-4-1BBL ; 0, 2 또는 5 μg/mL, 각각 총 5 μg/mL 에 아이소타입 항체 IgG2a 를 첨가하였음) 과의 조합물과 함께 24 시간 동안 인큐베이션시킨 야생형 대식세포에 의한 TNF 생성의 ELISA. 4-1BB-Fc 및 항-4-1BBL 항체 둘 다 LPS-유도 TNF 생성을 억제하였다. *, P < 0.05, **, P < 0.01 , 및 ***, P < 0.005, 대 (versus) 대조군 (Student's t-테스트). 데이타는 3 벌 중복 샘플의 평균 ± 표준편차이고 2 ~ 4 번의 실험의 대표값이다.

도 10A ~ 10I 는 2 개의 연속적인 TLR4 복합체가 존재함을 지시한다. (A) LPS 로 처리한 야생형 대식세포의 면역어세이 (시간, 상기 레인) ; 총 세포 파쇄물 (파쇄물 ; 상부), 또는 항-TLR4, 항-MyD88 또는 항-4-1BBL 을 사용해 면역침 전시킨 파쇄물을 항-4-1BBL, 항-TLR4 및/또는 항-MyD88 을 사용한 면역블로팅에 의해 분석하였다. 점선은 아이소타입 항체 (면역침전에 대한 음성 대조군) ; 굵은 선은 4-1BBL 또는 MyD88 의 면역블로팅에 대한 양성 대조군이다. LPS-처리 대식세포에서, MyD88-TLR4 복합체는 초기 세포내 반응에 관여하고, 4-1BBL-TLR4 복합체는 TNF 생성을 지속하는데 관여한다. (B) flag-4-1BBL 이 아닌 Flag-TLR4 가 MyD88 에 의해 감쇠 (pull down) 되었고, 이는 MyD88 이 4-1BBL 과 상호작용할 수 없음을 지시한다. (C) 4-1BBL 은 TRAF6 와 상호작용하나 TRAF2 와는 상호작용하지 않는다. (D) TRAF6 의 녹다운은 LPS, 폴리I:C, 및 IL-1β 유도 사이토카인 생성에 손상을 주었으나, TNF-유도 IL-6 생성에는 아무런 영향을 미치지 않았다. (E) GFP 를 발현하는 아데노바이러스 (Adv-GFP) 또는 4-1BBL 을 발현하는 아데노바이러스 (Adv-4-1BBL) 로 감염시킨 (시간, 상기 레인) 야생형 대식세포로부터의 핵 추출물에 대한 ELISA 를 방사성표지 프로브를 사용해 분석하였다 (좌측 가장자리). LPS (하부 우측), LPS-처리 샘플 (NF-κB 에 대한 양성 대조군). 4-1BBL 의 발현은 CREB 및 C/EBP 를 활성화시켰으나 NF-κB 는 활성화시키지 않았다. (F) E 에서 기술된 바와 같이 처리한 세포의 총 파쇄물 내 다양한 단백질 (좌측 가장자리) 에 대한 면역블로팅. (G) 야생형 대식세포를 4-1BBL 을 발현하는 아데노바이러스로 감염시키고 감염 후 6 시간째에 NF-κB (20 μM 술파살라진), p38 (10 μM SB203580), Jnk (5 μM SP600125) 또는 MEK (10 μM PD98059) 의 억제제를 처리하고 감염 후 24 시간째에 상기 세포에 의한 TNF 생성의 ELISA 를 분석하였다. *, P < 0.01 , 및 **, P < 0.005, 대 (versus) 대조군 (Student's t-테스트). (H) 상부, 4-1BBL 을 발현하는 아데노바이러스로 감염시킨 (시간, 상기 레인) 야생형 대식세포 내 TNF mRNA 의 준정량적 PCR. 하부, 아데노바이러스로 18 시간 동안 감염시키거나, 또는 LPS 로 1 시간 동안 처리한 야생형 대식세포 내 TNF mRNA 의 안정성. 액티노마이신 D 를 사용하여 전사를 억제시켰다. 값은 0 시간째의 값 (100% 로 설정) 에 대한 남아있는 % 이다. 데이타는 3 벌 중복샘플의 평균 ± 표준편차를 나타내고 (G), 2 번 (A,G,H), 3 번 (E) 또는 4 번 (F) 의 실험의 대표값이다. 4-1BBL 을 발현하는 세포에서는 IκBα 의 분해가 관찰되지 않았다 (F). 4-1BBL 의 발현은 p38, Jnk 및 Erk 의 어느 정도의 인산화를 유도하였고 (F), p38, Jnk 및 Erk (NF-κB 는 아님) 의 억제는 4-1BBL-매개 TNF 생성을 감소시켰다 (G). 4-1BBL 의 소실은 후기 시간에서 더 낮은 LPS-유도 TNF mRNA 전사를 초래한 한편, 4-1BBL 과발현은 더 많은 TNF mRNA 를 초래하였다 (H). TNF 전사체는 4-1BBL 과발현 세포 및 LPS-처리 세포에서 유사한 반감기를 가졌다 (H). (I) LPS-처리 대식세포에서 후속한 신호화의 모델. TLR4-LPS 연결은 수 시간 내에 TNF 를 포함한 염증 유전자의 MyD88- 및 TRIF-의존적 발현을 초래한다. 4-1BBL 은 이러한 초기 반응에 의해 유도되고, 그것이 TLR 과 상호작용하는 세포 표면으로 옮겨져서, TNF 와 같은 염증 유전자의 지속적인 발현을 위한 신호화를 개시한다.

도 11A ~ F 는 IL-6 유도에 있어서 4-1BBL 의 관여를 예시하는 데이타를 요약한 것이다. 4-1BBL-/- 마우스는 야생형 마우스보다 LPS 에 반응하여 IL-6 를 유의하게 적게 생성한다 (A). 야생형 마우스의 대식세포는 4-1BBL-/- 마우스의 대식세포보다 유의하게 더 많은 IL-6 를 생성하였다 (B). Pam3, 폴리I:C, LPS, R848, 및 CpG 로 처리한 야생형 대식세포는 동일한 유도자로 처리한 4-1BBL-/- 대식세포보다 유의하게 더 많은 IL-6 를 생성하였다 (C). LPS 및 4-1BB-Fc 와 함께 인큐베이션시킨 대식세포는 LPS 단독으로 인큐베이션시킨 대식세포보다 유의하게 더 적은 IL-6 를 생성하였고, LPS 및 증가하는 농도의 항-4-1BBL 항체로 인큐베이션시킨 대식세포는 감소하는 수준의 IL-6 생성을 나타내었다 (D). 4-1BBL 발현이 4-1BBL-특이적 siRNA 에 의해 감소되는 RAW264.7 세포는 대조군 siRNA 로 처리한 RAW264.7 세포보다 유의하게 더 적은 IL-6 를 생성한다 (E). 4-1BBL 발현이 4-1BBL-특이적 siRNA 에 의해 감소되고 펩티도글리칸 (PG, 10 μg/mL), 폴리I:C (25 μg/mL), LPS (100 ng/mL), CpG (5 μg/mL) 로 처리된 세포는 대조군 siRNA 로 트랜스펙션시키고 펩티도글리칸 (PG, 10 μg/mL), 폴리I:C (25 μg/mL), LPS (100 ng/mL), CpG (5 μg/mL) 로 처리한 세포보다 유의하게 더 적은 IL-6 를 생성한다 (도 11F).

도 12 는 마우스 4-1BBL (A) 및 인간 4-1BBL (B) 의 구조 도메인을 예시하는 도식 도해이다. "Cyt" 는 세포질 도메인을 지시하고, "TM" 은 막관통 도메인을 지시하고, "Ext" 는 세포외 도메인을 지시하고, "Sig" 는 신호 펩타이드를 지시한다.

도 13 은 마우스 4-1BB (A), 인간 4-1BB (B), 및 용해성 마우스 4-1BB-인간 Ig-Fc 융합 단백질 (C) 의 구조 도메인을 예시하는 도식 도해이다. "Cyt" 는 세포질 도메인을 지시하고, "TM" 은 막관통 도메인을 지시하고, "Ext" 는 세포외 도메인을 지시하고, "Sig" 는 신호 펩타이드를 지시한다.

본 발명은 대식세포 활성화에서 전염증성 사이토카인의 생성에 있어서 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 의 역할을 발견한 것을 포함한다. 특히, 본 발명은 4-1BBL 이 과도하게 지속되는 염증을 초래하는, TNF 와 같은 염증 사이토카인의 지속적인 생성을 초래하는 후기 신호화 사건에서 작용을 한다는 발견을 포함한다. 후기 신호화에 있어서 4-1BBL 의 역할은 4-1BB 와는 독립적이다. 따라서, 본 발명은 4-1BBL 차단제, 뿐만 아니라 TNF 및 IL-6 와 같은 염증 사이토카인의 생성을 4-1BB-독립적인 방식으로 감소시키는 방법에 사용될 수 있는 상기 차단제를 포함하는 약학적 조성물 및 제조 물품을 제공한다. 본 발명은 염증을 감소시키는 방법, 염증 사이토카인의 생성을 감소시키는 방법, 뿐만 아니라 4-1BBL 차단제를 검사하는 방법을 제공한다.

4-1 BBL 폴리펩타이드 및 핵산

본원에서 기술되는 연구는 대식세포에서의 TNF 발현의 초기 유도 및 지속적인 TNF 생성이 초기 및 후기 신호화 사건에 의해 조절된다는 것을 보여준다. 대식세포에서의 톨-유사 수용체 (TLR) 4-매개 TNF 생성은 일반적으로 수 시간 내에 일어나고 거의 하루 동안 지속된다 ([Galanos 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5939-43 (1979)] 참조). 지속적인 TNF 생성은 세포 표면 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 에 의해 조절되는 후기 TLR-신호화를 포함한다. 4-1BBL 은 골수종 분화 1 차 반응 유전자 88 (MyD88) 및 톨/인터루킨-1 수용체/내성 어댑터 단백질 (TRIF) 과는 독립적으로 작용하나, TNF 수용체-연관 인자 6 (TRAF6) 에는 의존적이다. 따라서, 신호전달복합체 (signalsome) TLR4/MyD88/TRIF 는 염증 유전자의 개시 및 초기 발현에 관여하는 한편, 후기의 4-1BBL 은 지속적인 TNF 생성에 관여한다. 4-1BBL 은 염증 자극에 반응하여 대식세포에서 초기에 유도되는 단백질 중 하나이고 대식세포 활성화의 초기에만 유도된다. 새로 합성된 4-1BBL 은 세포 표면 상으로 자리를 옮기고 후기의 지속적인 TNF 생성을 위한 새로운 신호화 기 (phase) 를 발생한다. 따라서, TNF 또는 IL-6 와 같은 염증 사이토카인의 과도한 생성, 또는 지속적인 염증 반응의 조절의 실패와 연관된 질환은 4-1BBL 폴리펩타이드의 활성 또는 4-1BBL 핵산으로터의 발현을 억제시키거나 또는 감소시킬 수 있는 제제로 치료될 수 있다.

4-1BBL (4-1BB 리간드) 은 활성화된 B 세포 및 대식세포와 같은 활성화된 항원 제시 세포 상에서 발현되는 유형 II 세포 표면 당단백질의 TNF 패밀리의 구성원이다. 4-1BBL 폴리펩타이드는 당업계에 알려져 있고, 마우스, 토끼, 돼지, 개, 소, 원숭이 또는 인간과 같은 임의의 기원의 것일 수 있다. 마우스 4-1BBL 폴리펩타이드의 한 예는 하기이다 (GenBank Accession number NP_033430) :

인간 4-1BBL 폴리펩타이드의 한 예는 하기이다 (GenBank Accession number P41273) :

4-1BBL 은 기능 또는 서열을 바탕으로 규명될 수 있다. 예를 들어, 본 발명이 부분적으로는, 대식세포에서, 4-1BBL 이 4-1BB 에 독립적인 방식으로 TNF 생성을 매개한다는 발견을 바탕으로 하더라도, 4-1BBL 은 T 세포-수용체 활성화 동안에 공동자극 신호를 생성하기 위해, 활성화된 CD4 및 CD8 T 세포 상에서 발현되는 막관통 단백질의 TNF 수용체 슈퍼패밀리 중 하나의 구성원인 4-1BB 와 상호작용하는 것으로 알려져 있다 (Watts, Annu. Rev. Immunol. 23:23-68 (2005)). 또한, 인간 및 마우스 4-1BBL 의 기능성 도메인은 도 12 에 예시된다.

본원에 사용된 바와 같이 "4-1BBL" 또는 "4-1BBL 폴리펩타이드" 는 전장 폴리펩타이드의 임의의 생물학적으로 활성인 절편, 뿐만 아니라 생물학적으로 활성인 4-1BBL 에 관한 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용하기에 적합한 임의의 절편을 포함한다. 따라서, 4-1BBL 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 2 에 나타낸 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일반적으로, 용어 "실질적으로 동일한" 은 아미노산 서열이 보존성 아미노산 치환, 또는 하나의 아미노산을 동일 부류의 또다른 아미노산으로 치환 (예를 들어, 발린 대신에 글리신, 아르기닌 대신에 리신), 또는 단백질의 기능을 파괴하지 않는 아미노산 서열의 위치에 위치한 하나 이상의 비-보존성 치환, 소실 또는 삽입에 의해서만 대조군 서열과 상이함을 의미한다. 폴리펩타이드 (또는 핵산) 서열은 그것이 대조군 서열과 약 50% 의 상동성, 예를 들어 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 95% 초과의 상동성을 나타낸다면 대조군 서열과 실질적으로 동일하다. 4-1BBL 폴리펩타이드는 예를 들어, SEQ ID NO: 1 및 2 와 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상 또는 95% 초과 동일할 수 있다.

4-1BBL 핵산은 4-1BBL 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 RNA 의 중합체이다. 4-1BBL 핵산은 게놈 DNA 뿐만 아니라 전령 RNA 일 수 있다. 상기 핵산은 플라스미드 벡터 또는 바이러스 DNA 내에 삽입될 수 있다. 상기 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥, 원형 또는 선형일 수 있다. 4-1BBL 핵산의 예는 제한 없이, SEQ ID NO. 1 및 2 로 나타낸 마우스 및 인간 4-1BBL 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 것들을 포함한다. 마우스 4-1BBL 폴리펩타이드를 암호화하는 4-1BBL 핵산 (SEQ ID NO: 1) 의 예는 Accession Number NM_009404 하에 GenBank 에서 찾을 수 있는 하기 서열이다 :

인간 4-1BBL 폴리펩타이드를 암호화하는 4-1BBL 핵산 (SEQ ID NO: 2) 의 예는 Accession Number U03398 하에 GenBank 에서 찾을 수 있는 하기 서열이다 :

4-1BBL 핵산은 또한, SEQ ID NO: 1 및 2 에 나타낸 폴리펩타이드 서열의 절편을 암호화할 수 있는데, 단, 상기 핵산은 상기 논의된 바와 같이 4-1BBL 특이적 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용하기에 적합한 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드 또는 절편을 암호화한다.

일반적으로 4-1 BBL 차단제

4-1BBL 차단제는 4-1BBL 의 발현 및/또는 활성을 억제 또는 감소시키는 거대분자 또는 소분자일 수 있다. 4-1BBL 차단제는 4-1BBL 의 활성을 억제 또는 감소시킬 수 있다. 그러한 4-1BBL 차단제의 예에는 제한 없이, 4-1BBL-특이적 항체, 용해성 형태의 4-1BB, 및 브레펠딘 A 와 같이 단백질이 세포 표면으로 전위하는 것을 방해하는 제제 또는 소분자가 포함된다. 이들 4-1BBL 차단제는 4-1BBL 올리고머화를 방해함으로써 작용하고/거나, 또는 TNF 생성에 관여하는 후기 신호화 사건에서 TLR 및 TRAF6 와 같은 적절한 신호화 분자와의 상호작용을 방해한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "4-1BBL 올리고머화" 는 TNF 또는 IL-6 와 같은 염증 사이토카인의 4-1BBL-매개 생성에 필요한 4-1BBL 분자의 응집물의 형성을 말한다. 4-1BBL 올리고머화는 2 개 초과의 4-1BBL 분자의 응집물, 예를 들어 3 또는 4 개의 4-1BBL 분자의 응집물의 형성을 말한다. 4-1BBL 이 세포 표면에 위치하는 것이 후기 신호화 기 동안의 적절한 작용에 필요하기 때문에, 4-1BBL 차단제는 또한, 단백질이 세포 표면으로 전위하는 것을 방해할 수 있다.

4-1BBL 차단제는 또한, 4-1BBL 핵산으로부터의 발현을 억제 또는 감소시킴으로써 작용할 수 있다. 4-1BBL 차단제는, 세포에 의해 생성되는 4-1BBL 의 양이 변경되도록 전사 또는 번역 수준에서 작용할 수 있다. 4-1BBL 차단제는 4-1BBL mRNA 전사체의 생성을 감소시키거나 또는 mRNA 전사체의 안정성을 감소시킬 수 있다. 이들 차단제에는, 제한 없이, 안티센스 RNA, siRNA 및 리보자임과 같은 올리고뉴클레오타이드가 포함된다. 그러한 올리고뉴클레오타이드-기재 4-1BBL 차단제는 생리학적 조건 하에 (예를 들어, 약 37℃, pH 7 내지 7.8, 및 생리학적 농도의 전해질) 또는 엄격한 또는 고도로 엄격한 상태에서 4-1BBL 핵산에 혼성화하고 4-1BBL 핵산으로부터의 발현을 억제 또는 감소시킬 수 있다. 이들 차단제는 4-1BBL 발현 또는 활성에 관여하는 다른 분자의 억제제를 또한 포함할 수 있다.

올리고뉴클레오타이드는 길이가 3 개 초과의 뉴클레오타이드인 리보스 뉴클레오타이드 또는 데옥시리보스 뉴클레오타이드의 중합체이다. 올리고뉴클레오타이드에는 자연 발생 뉴클레오타이드 ; 합성, 개질된, 또는 포스포로티올레이트와 같은 슈도 (pseudo)-뉴클레오타이드 ; 뿐만 아니라, P³², 비오틴 또는 디곡시게닌과 같은 검출 표지를 갖는 뉴클레오타이드가 포함된다.

4-1BBL 핵산의 발현을 감소시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드, 즉, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 4-1BBL 핵산에 완전히 상보성일 수 있다. 대안적으로, 서열 간의 일부 변이성이 허용될 수 있다. 생리학적 상태, 예를 들어 생리학적 온도 및 염 농도 하에, 또는 엄격한 또는 고도로 엄격한 혼성화 조건 하에, 4-1BBL 핵산에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드는 4-1BBL 핵산의 발현을 억제시키기에 충분히 상보성이다. 일반적으로, 엄격한 혼성화 조건은 정의된 이온 강도 및 pH 에서의 특이적 서열에 대한 열적 용융점 (T_m) 보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. 그러나, 엄격한 상태는 선택된 서열의 열적 용융점보다 약 1℃ 내지 약 20℃ 더 낮은 범위 내의 온도를 포함하며, 이는 본원에서 달리 정의되지 않는 한 원하는 수준의 엄격성에 의존한다. 예를 들어, 4-1BBL 암호화 서열에 정확히 상보성인 인접 (contiguous) 뉴클레오타이드의 2, 3, 4, 또는 5 개 이상의 스트레치를 포함하는 억제성 올리고뉴클레오타이드 (각각은 인접 암호화 서열에 상보성이지 않은 인접 뉴클레오타이드의 스트레치에 의해 분리되어 있음) 는 4-1BBL 핵산의 기능을 억제시킬 수 있다. 일반적으로, 인접 뉴클레오타이드의 각각의 스트레치의 길이는 4, 5, 6, 7, 또는 8 개 이상의 뉴클레오타이드이다. 비-상보성 개입 서열의 길이는 1, 2, 3, 또는 4 개 뉴클레오타이드일 수 있다. 당업자는 센스 핵산에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드의 계산된 용융점을 쉽게 사용하여, 특정 표적 핵산의 발현을 억제시키는데 관용적일 미스매칭의 정도를 측정할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드-기재 4-1BBL 차단제에는 예를 들어, 작은 방해 (small interfering) RNA (siRNA), 안티센스 핵산 또는 리보자임을 포함한다.

4-1BBL 차단제는 4-1BBL 의 발현 및/또는 활성을 임의의 양만큼, 예를 들어, 2%, 5%, 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 95% 또는 100% 억제 또는 감소시킨다. 4-1BBL 의 활성은 지속적인 TNF 생성에 대한 검사, 4-1BBL 이 TLR 또는 TRAF6 와 상호작용하는지의 측정, 예를 들어, 그리고 4-1BBL 이 세포 표면에 있는지의 측정과 같이 본원에 기술된 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업계에 알려진 방법을 사용해 측정될 수 있다. 4-1BBL 의 발현은 또한, 4-1BBL 전사체의 수준을 측정하기 위한 노던 혼성화 또는 4-1BBL 폴리펩타이드의 수준을 측정하기 위한 웨스턴 혼성화를 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업계에 알려진 방법을 사용해 측정될 수 있다.

다양한 유형의 4-1BBL 차단제의 예는 하기에 상세히 논의된다.

4-1 BBL -특이적 항체

4-1BBL 차단제는 4-1BBL 폴리펩타이드에 대한 안타고니스트성 항체일 수 있다. 용어 "항체" 는 면역글로불린 분자, 예를 들어 모노클로날 항체, 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부위를 말한다. 모노클로날 항체는 특정 항원 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체 분자 집단이다. 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부위는 F(ab) 및 F(ab')2 절편을 포함한다. 항-4-1BBL 항체는 제한 없이, 쥣과, 키메라성, 인간화된 및/또는 완전히 인간 항체를 포함한다. 쥣과 항체는 쥣과 공급원으로부터 완전히 유래된 항체, 예를 들어, 마우스 골수종 세포 및 마우스 B-림프구 세포의 융합에 의해 생성된 쥣과 하이브리도마 유래의 항체이다. 키메라성 항체는 비-인간 공급원, 예를 들어 쥣과 또는 영장류 유래의 가변 영역, 및 인간 공급원 유래의 불변 영역을 갖는 항체이다. 인간화된 항체는 마우스 공급원 유래의 항원-결합 영역, 예를 들어 상보성 결정 영역 및 인간 공급원 유래의 잔여 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 완전히 인간 항체는 인간 세포의 항체, 또는 인간 항체 유전자를 갖는 유전자 도입 마우스 유래의 항체이다.

4-1BBL 폴리펩타이드에 대한 항체는 4-1BBL-특이적 항체이고, 그리하여 4-1BBL 이 아닌 폴리펩타이드에 결합하지 않고 4-1BBL 폴리펩타이드에 결합할 것이다. 4-1BBL-특이적 항체는 적절한 4-1BBL 기능을 방해 또는 차단하는 안타고니스트 항체이다. 예를 들어, 도 2A ~ D 를 참조한다. 안타고니스트 항체는 예를 들어, 2 개 초과의 4-1BBL 의 올리고머화를 방해하거나 또는 지속적인 TNF 생성에 관여하는 하류 신호화 분자, 예를 들어 TLR 또는 TRAF6 에의 결합을 차단할 수 있어서, 염증 사이토카인이 생성을 감소시킨다. 예를 들어, 그러한 안타고니스트 항체는 2 개의 4-1BBL 과 결합하고, 사이토카인 생성을 매개하는데 필요한 2 개 초과의 4-1BBL 의 응집물의 형성을 방지할 수 있다. 그러한 안타고니스트 항체는 또한, 사이토카인 생성을 매개하는데 필요한 TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9 및 TRAF6 와 같은 하류 신호화 분자에의 결합을 방해하는 영역에서 4-1BBL 에 결합할 수 있다.

항-4-1BBL 항체가 안타고니스트 항체인지는 본원에 기술된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, TNF 와 같은 염증 사이토카인의 생성은 항체의 존재 또는 부재 하에 측정될 수 있다. 항체가 존재하여 염증 사이토카인 생성의 수준 또는 기간을 감소시킨다면 상기 항체는 안타고니스트 항체이다.

항체 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 4-1BBL 폴리클로날 항체는 단리된 4-1BBL 폴리펩타이드 또는 4-1BBL 폴리펩타이드의 항원 절편을 사용해 적합한 포유류를 면역화시킴으로써 제조할 수 있다. 포유류는 예를 들어, 토끼, 염소, 또는 마우스일 수 있다. 4-1BBL 폴리펩타이드 또는 항원 절편은 재조합 DNA 기술을 사용해 발현, 화학적 합성에 의해 제조, 또는 표준 단백질 정제 기술을 사용해 정제될 수 있다. 면역화 후 적절한 시간에, 항체 분자를 포유류, 예를 들어 포유류의 혈액 또는 기타 체액에서 단리하고, 표준 기술을 사용해 추가로 정제할 수 있는데, 상기 표준 기술에는 제한 없이, 암모늄 술페이트를 사용한 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 또는 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피가 포함된다. 또한, 포유류의 항체-생성 세포는 단리될 수 있고, 4-1BBL 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 제조하는데 사용될 수 있다. 모노클로날 항체-분비 하이브리도마 세포의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, [Kohler 및 Milstein, Nature 256:495-97 (1975)] 및 [Kozbor 등 Immunol Today 4: 72 (1983)] 를 참조한다. 4-1BBL 모노클로날 항체는 또한, 재조합 DNA 분자로부터의 발현, 또는 4-1BBL 폴리펩타이드를 사용한 재조합 결합 면역글로불린 라이브러리의 스크리닝과 같이, 당업계에 알려진 다른 방법을 사용해 제조될 수 있다.

키메라성 및 인간화된 모노클로날 항체 제조 방법은 또한 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어,재조합 DNA 기술을 포함하는 방법이다. 키메라성 항체는 항체 분자의 비-인간 가변 영역 및 인간 불변 영역을 암호화하는 핵산으로부터 발현되어 제조될 수 있다. 예를 들어, [Morrison 등, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6851 (1984)] 를 참조한다. 인간화된 항체는 비-인간 항원-결합 영역 (상보성 결정 영역) 및 인간 가변 영역 (항원-결합 영역 없음) 및 인간 불변 영역을 암호화하는 핵산으로부터 발현되어 제조될 수 있다. 예를 들어, [Jones 등, Nature 321 :522-24 (1986)] ; 및 [Verhoeven 등, Science 239:1534-36 (1988)] 을 참조한다. 완전히 인간 항체는 인간 중쇄 및 경쇄 유전자만을 발현하는 유전자조작된 유전자 도입 마우스를 면역화함으로써 제조할 수 있다. 이 경우, 치료적으로 유용한 모노클로날 항체를 통상의 하이브리도마 기술을 사용해 수득할 수 있다. 예를 들어, [Lonberg & Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)] 를 참조한다. 항체 디자인 및 제조에 관여하는 핵산 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, [Batra 등, Hybridoma 13:87-97 (1994)] ; [Berdoz 등, PCR Methods Appl. 4: 256-64 (1995)] ; [Boulianne 등 Nature 312:643-46 (1984)] ; [Carson 등, Adv. Immunol. 38:274-31 1 (1986)] ; [Chiang 등, Biotechniques 7:360-66 (1989)] ; [Cole 등, Mol. Cell. Biochem. 62:109-20 (1984)] ; [Jones 등, Nature 321 : 522-25 (1986)] ; [Larrick 등, Biochem Biophys. Res. Commun. 160:1250-56 (1989)] ; [Morrison, Annu. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992)] ; [Morrison 등, Proc. Nat'l Acad. Sci USA 81 : 6851-55 (1984)] ; [Orlandi 등, Pro. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-37 (1989)] ; [Sandhu, Crit. Rev. Biotechnol. 12:437-62 (1992)] ; [Gavilondo & Larrick, Biotechniques 29: 128-32 (2000)] ; [Huston & George, Hum. Antibodies. 10: 127-42 (2001)] ; [Kipriyanov & Le Gall, Mol. Biotechnol. 26: 39-60 (2004)] 를 참조한다.

용해성 4-1 BB

4-1BBL 차단제는 또한, 용해성 4-1BB 분자일 수 있다. 4-1BB 는 활성화된 T 세포 상에 발현되는 유형 I 막관통 단백질의 TNF 수용체 집단의 구성원이다. [Watts, Annu. Rev. Immunol. 23:23-68 (2005)] 를 참조한다. 마우스 4-1BB 의 예는 하기 서열로서, 이는 Accession Number NP_035742 하에 GenBank 에서 찾을 수 있다 :

인간 4-1BB 의 예는 하기 서열로서, 이는 Accession Number NP_001552 하에 GenBank 에서 찾을 수 있다 :

4-1BB 폴리펩타이드는 전형적으로 마우스 및 인간 폴리펩타이드에 대하여 도 13 에 나타낸 신호 서열, 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인을 포함한다.

용해성 4-1BB 는 4-1BB 가 생성되는 세포에 막관통 단백질로서 부착되지 않고 4-1BBL 의 활성을 억제 및/또는 감소시킬 수 있는 4-1BB 폴리펩타이드를 말한다. 예를 들어, 용해성 4-1BB 는 전장 4-1BB 의 세포외 도메인으로 이루어진 단일 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "전장 4-1BB" 는 이를 암호화하는 내인성 핵산을 갖는 세포에 의해 발현되는 폴리펩타이드이다. 전장 4-1BB 는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 가질 것이다. 전장 4-1BB 는 신호 펩타이드를 가질 수도 있고 또는 가지지 않을 수도 있다. 반대로, 용해성 4-1BB 는 막관통 단백질로서 세포에 부착되지 않는 한 전장 이외의 4-1BB 의 형태이다. 용해성 4-1BB 폴리펩타이드의 예는 전장 폴리펩타이드의 세포외 도메인에 상응하는 폴리펩타이드, 또는 4-1BB 의 C-말단에, 면역글로불린 분자의 Fc 절편, 예를 들어, IgG1 Fc 절편, 또는 GFP, HA, 및 FLAG 및 GST 와 같은 임의의 통상의 단백질성 태그 또는 융합 부분과 같은 관계없는 폴리펩타이드 분절이 융합된 4-1BB 의 세포외 도메인으로 이루어진 융합 폴리펩타이드이다. 용해성 4-1BB 는 실시예에서 논의된 마우스 4-1BB/Fc 와 같은 단일 폴리펩타이드 또는 이량체일 수 있다. 이량체이기도 한 용해성 4-1BB 의 예는 실시예 부문에서 논의된 마우스 4-1BB/인간Ig-Fc 폴리펩타이드이다.

용해성 4-1BB 폴리펩타이드의 예는 하기 서열을 갖는 마우스 4-1BB 의 세포외 도메인이다 :

용해성 4-1 BB 폴리펩타이드의 또다른 예는 하기 서열을 갖는 인간 4-1BB 의 세포외 도메인이다 :

용해성 4-1BB 폴리펩타이드의 다른 예에는 각각 SEQ ID NO: 20 및 21 에 나타낸 마우스 4-1BB 의 처음 186 개의 아미노산, 또는 인간 4-1BB 의 처음 185 개의 아미노산이 포함된다.

용해성 4-1BB 폴리펩타이드가 4-1BBL 의 활성을 억제 또는 감소시킬 수 있는 한, 상기 용해성 4-1BB 폴리펩타이드는 또한 SEQ ID NO: 7, 8, 20 또는 21 의 N 또는 C 말단에 하나 이상의 추가 아미노산을 가질 수 있었고, 상기 폴리펩타이드가 세포에 의해 생성된다면, 이는 세포 막 내에 막관통 단백질로서 혼입되지 않는다. 예를 들어, 용해성 4-1BB 폴리펩타이드는 상기 언급된 바와 같이 예를 들어, 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 인간 IgG 의 Fc 부위, 히스티딘 태그, 또는 임의의 관계없는 아미노산 서열에 융합된 SEQ ID NO: 7, 8, 20 또는 21 로 이루어진 융합 단백질일 수 있다. 용해성 4-1BB 폴리펩타이드는 또한, 절편이 생물학적으로 활성인 한, 즉, 절편이 4-1BBL 활성을 억제 또는 감소시킬 수 있는 한, 세포외 도메인의 절편, 예를 들어, SEQ ID NO: 7, 8, 20 및 21 의 절편일 수 있다. 절편이 생물학적 활성을 가지는지, 즉, 절편이 4-1BBL 활성을 억제 또는 감소시킬 수 있는지를 측정하는 방법에는, 제한 없이, 본원에서 논의되고 예시된 방법들, 예를 들어, LPS 에 반응하여 대식세포와 같은 세포에 의한 염증 사이토카인의 생성을 측정하는 방법이 포함되고, 4-1BB, 용해성 4-1BB, 및 그의 생물학적으로 활성인 절편의 존재는 임의의 공급원일 수 있다. 예를 들어, 이들은 마우스, 토끼, 돼지, 개, 소, 원숭이 또는 인간으로부터 단리될 수 있다. 이들은 CHO, S2 및 이. 콜라이 (E. coli) 와 같은 숙주 세포, 또는 돼지 또는 원숭이 또는 토끼와 같은 숙주 동물 내에서 재조합 핵산으로부터 발현된 다음, 당업자에게 알려진 단백질 정제 기술을 사용해 단리될 수 있다. 대안적으로, 이들은 통상의 펩타이드 합성 방법에 의해 합성될 수 있다. 용해성 4-1 BB 는 펩티다제 분해에 의해 전장 폴리펩타이드의 제조물로부터 수득될 수 있다. 마우스 4-1BB-인간 Ig-Fc 폴리펩타이드와 같은 융합 단백질의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 포함하는 방법이 포함된다. 더욱 구체적으로, 관련 4-1BB 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 Fc 절편을 암호화하는 핵산에 연결한 다음 적합한 숙주 세포 내에서 발현시킬 수 있다. 이미 융합 부분을 암호화하고, 4-1BB 를 암호화하는 핵산 또는 그의 생물학적으로 활성인 절편이 클로닝될 수 있는 많은 발현 벡터가 시판된다. 본 발명자들이 사용한 용해성 4-1BB 는 회사 제품이다.

4-1 BBL -특이적 안티센스 RNA

안티센스 RNA 는 예를 들어, 전사 및/또는 번역을 억제시킴으로써, 4-1BBL 의 발현을 특이적으로 감소시키는데 사용될 수 있다. 안티센스 RNA 는 4-1BBL 을 암호화하는 센스 핵산에 상보적이다. 예를 들어, 안티센스 RNA 는 이중-가닥 cDNA 분자의 암호화 가닥에 상보적일 수 있거나, 또는 mRNA 서열에 상보적일 수 있다. 안티센스 RNA 는 전체 암호화 가닥 또는 그의 단지 한 부위에 상보적일 수 있다. 안티센스 RNA 는 또한, 4-1BBL 을 암호화하는 핵산의 비암호화 영역의 전부 또는 일부에 상보적일 수 있다. 비-암호화 영역은 암호화 영역 옆에 있는 5' 및 3' 영역, 예를 들어, 5' 및 3' 비번역 서열을 포함한다. 안티센스 RNA 의 길이는 일반적으로 6 개 이상의 뉴클레오타이드이나, 약 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다 더 긴 올리고뉴클레오타이드가 또한 사용될 수 있다. 안티센스 RNA 는 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어, 안티센스 RNA 를 암호화하는 발현 벡터로부터 또는 발현 카세트로부터의 발현에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 안티센스 RNA 는 자연 발생 뉴클레오타이드, 또는 RNA 의 생물학적 안정성을 증가시키거나 또는 안티센스 RNA 및 센스 핵산 간에 형성된 이합체의 생리학적 안정성을 증가시키도록 디자인된 개질된 뉴클레오타이드를 사용한 화학 합성에 의해 제조될 수 있다. 개질된 뉴클레오타이드의 예에는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이폭산틴, 산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1- 메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸 시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥스아세트산, 위부톡소신 (wybutoxosine), 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5- 메틸우라실, 우라실-5-옥스아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥스아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린이 포함된다. 따라서, 본 발명의 안티센스 RNA 는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라 개질된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, SEQ ID NO: 3 및 4 에서 제공된 서열에 상보적이고 길이는 상기 논의된 바와 같은 길이일 수 있다.

4-1 BBL -특이적 SiRNA

작은 방해 RNA 는 4-1BBL 폴리펩타이드의 수준이 감소되도록 4-1BBL 번역을 특이적으로 감소시키는데 사용될 수 있다. SiRNA 는 서열-특이적 방식으로 전사-후 유전자 침묵을 매개한다. 예를 들어, http://www.ambion.com/techlib/hottopics/rnai/rnai_may2002_print.html (2006 년 5 월 10 일에 최종적으로 검색됨 (retrieved)) 를 참조한다. 일단 RNA-유도 침묵 복합체에 혼입되면, siRNA 는 복합체를 동종 mRNA 전사체로 가져간 다음, 상기 전사체가 복합체에 의해 절단되게 함으로써, 동종 내인성 mRNA 전사체의 절단을 매개한다. siRNA 는 G 단백질 mRNA 전사체의 임의의 영역에 동종성일 수 있다. 상동성 영역의 길이는 30 개 이하 뉴클레오타이드, 바람직하게는 25 개 미만 뉴클레오타이드, 및 더욱 바람직하게는 약 21 내지 23 개 뉴클레오타이드일 수 있다. SiRNA 는 전형적으로 이중 가닥이고, 2 개-뉴클레오타이드 3' 오버행 (overhang), 예를 들어, 3' 오버행 UU 디뉴클레오타이드를 가질 수 있다. siRNA 를 디자인하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, [Elbashir 등 Nature 41 1 : 494-498 (2001)] ; [Harborth 등 Antisense Nucleic Acids Drug 13: 83-106 (2003)] 을 참조한다. 전형적으로, AA 에서 시작하는 표적 부위는센스 및 안티센스 siRNA 가닥 둘 다에 대해 3' UU 오버행을 가지고, 대략 50% G/C 함량을 가진 것을 선택한다. SiRNA 는 화학적으로 합성, 시험관 내 전사에 의해 생성, 또는 siRNA 발현 벡터 또는 PCR 발현 카세트로부터 발현될 수 있다. 예를 들어, http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506html (2006 년 5 월 10 일에 최종적으로 검색됨) 을 참조한다. siRNA 가 발현 벡터 또는 PCR 발현 카세트로부터 발현되는 경우, siRNA 를 암호화하는 삽입물은 siRNA 헤어핀 내로 접히는 RNA 전사체로서 발현될 수 있다. 따라서, RNA 전사체는 센스 siRNA 서열을 가질 수 있는데, 이 센스 siRNA 는 헤어핀 루프뿐만 아니라, 3' 말단에 U 열을 형성하는 스페이서 서열에 의해 그의 역 상보성 안티센스 siRNA 서열과 연결된다. 헤어핀 루프는 임의의 적절한 길이일 수 있는데, 예를 들어, 3 내지 30 개 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는, 3 내지 23 개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC 및 UUCAAGAGA (SEQ ID NO: 9) 를 포함하여 다양한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. SiRNA 는 또한, 직접, 또는 형질전환 유전자 (transgene) 또는 바이러스를 통해 도입되는 이중-가닥 RNA 의 절단에 의해 생체 내에서 생성될 수 있다. RNA-의존성 RNA 중합효소에 의한 증폭은 일부 개체에서 일어날 수 있다.

4-1BBL mRNA 전사체에 혼성화할 수 있는 siRNA 서열의 예는 하기 서열 및 그의 상보성 서열을 포함한다 :

그의 상보성 서열은 하기이다 :

마우스 4-1BBL 을 표적으로 하는 작은 방해 RNA 는 또한 하기를 포함한다 :

그의 상보성 서열은 하기이다 :

본 발명의 추가의 siRNA 서열은 SEQ ID NO: 18 및 19 및 그의 상보성 서열, 뿐만 아니라 하기를 포함한다 :

본 발명의 siRNA 는 혈청 내, 순환 시, 또는 포유류 세포와 같은 생리학적 상태 하에 그의 안정성을 증가시키도록 화학적으로 개질될 수 있다. 본 발명의 화학적으로-개질된 siRNA 는 콜레스테롤-공액된, 지질 캡슐화된 및 항체-연결된 siRNA 인 것들을 포함한다. 본 발명의 작은 방해 RNA 는 고밀도 지단백질과 같은 다른 소수성 지질 분자와 공액되어 친유성 컨쥬게이트를 형성할 수 있거나, 또는 센스 또는 안티센스 가닥 상에서 부분 포스포로티오에이트 골격 및 2'-O-메틸 당 (sugar) 개질을 가질 수 있다. siRNA 의 친유성 컨쥬게이트는 스테아로일 (C 18) 및 도코사닐 (C22) 과 같은 포화된, 알킬 사슬에 공액된 것들, 뿐만 아니라, 리소콜릭산 및 올레일아민의 하이브리드 (리소콜릭-올레일, C43) 에 공액된 것들을 포함한다.

4-1 BBL -특이적 리보자임

4-1BBL 차단제는 또한, 리보자임일 수 있다. 리보자임은 동종 영역을 갖는 mRNA 와 같은 단일-가닥 핵산을 절단할 수 있는 촉매 활성을 가진 RNA 분자이다. 예를 들어, [Cech, Science 236: 1532-1539 (1987); Cech, Ann. Rev. Biochem. 59:543-568 (1990); Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 605-609 (1992); Couture and Stinchcomb, Trends Genet. 12: 510-515 (1996)] 을 참조한다. 리보자임은 4-1BBL mRNA 전사체를 촉매 절단하는데 사용될 수 있고, 그리하여 mRNA 의 번역을 억제시킬 수 있다. 예를 들어, [Haseloff 등, 미국 특허 제 5,641,673 호] 를 참조한다. 4-1BBL 핵산에 대한 특이성을 갖는 리보자임은 SEQ ID NO: 3 및 4 의 뉴클레오타이드 서열을 바탕으로 디자인될 수 있다. 고도로 서열 특이적인 방식에서 트랜스로 (in trans) RNA 분자를 절단할 수 있는 리보자임의 디자인 및 구축 방법이 개발되었고 당업계에 기술되었다. 예를 들어, [Haseloff 등, Nature 334:585-591 (1988)] 를 참조한다. 리보자임은 분리된 (discrete) "혼성화" 영역을 리보자임 내로 조작함으로써 특이적 RNA 에 표적화될 수 있다. 혼성화 영역은 리보자임이 표적과 특이적으로 혼성화할 수 있게 하는, 표적 RNA 에 상보적인 서열을 함유한다. 예를 들어, [Gerlach 등, EP 321,201] 를 참조한다. 표적 서열은 SEQ ID NO: 3 또는 4 의 뉴클레오타이드 서열로부터 선택되는 약 10, 12, 15, 20, 또는 50 개 인접 뉴클레오타이드의 분절일 수 있다. 더 긴 상보성 서열을 사용하여 표적에 대한 혼성화 서열의 친화성을 증가시킬 수 있다. 리보자임의 혼성화 영역 및 절단 영역은 본질적으로 관련이 있고 ; 따라서, 상보성 영역을 통한 표적 RNA 에의 혼성화 시, 리보자임의 촉매 영역은 표적을 절단할 수 있다. 대안적으로, 4-1BBL 을 암호화하는 mRNA 를 사용하여, 특이적 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA 를 RNA 분자 풀 (pool) 로부터 선택할 수 있다. 예를 들어, [Bartel & Szostak, Science 261 : 141 1-1418 (1993)] 을 참조한다.

다른 4-1 BBL 차단제

4-1BBL 차단제에는 또한, 이들 분자의 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오타이드 또는 분자 그 자체의 활성의 억제제를 포함하여, 4-1BBL 발현 또는 활성에 관여하는 다른 분자의 억제제가 포함된다. 4-1BBL 발현 또는 활성에 관여하는 분자에는 예를 들어, NF-κB; CREB; C/EBP; TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, 및 TLR9 를 포함하여 TLR; MyD88; TRIF; p38; Jnk; Mek; 및 TRAF6 이 포함될 것이다. 이들 분자의 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드-기재 4-1BBL 차단제에 대해 상기에서 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드와 유사하다. 이에는 4-1BBL 발현 또는 활성에 관여하는 선택된 분자에 대한 siRNA (예를 들어 SEQ ID NO: 18 및 19), 안티센스 핵산 또는 리보자임이 포함된다. 활성 억제제에는 예를 들어, NF-κB 억제제 술파살라진, 프로테아좀 억제제 MG-132, p38 억제제 SB203580, Jnk 억제제 SP600125, 및 Mek 억제제 PD98059 가 포함된다.

염증 감소

4-1BBL 차단제는 염증 질환 상태의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 4-1BBL 차단제는 TNF 또는 IL-6 와 같은 염증 사이토카인의 과다-생성을 감소시킴으로써 염증을 감소시킬 것이다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 포유류에서 염증 사이토카인의 생성을 감소시키는 방법을 제공한다. 포유류는 염증 상태를 겪고 있는 포유류 또는 그러한 상태의 위험에 있는 포유류일 수 있다.

염증 상태에는 제한 없이, 류마티스 관절염, 유년성 류마티스 관절염, 건선 관절염, 건선, 강직성 척추염, 크론병, 과민성 장 증후군, 전신적으로 발병된 유년성 만성 관절염, 및 골다공증이 포함된다. 염증 상태를 겪고 있는 포유류는 염증 상태의 알려진 증후를 바탕으로 규명될 수 있다. 예를 들어, 크론병 또는 류마티스 관절염을 앓고 있는 포유류는 동일 종의 상기 질환을 앓고 있지 않는 포유류와 비교해, IL-1, IL-6, MCP-1 및 TNF 와 같은 전염증성 사이토카인의 생성 수준 또는 기간의 증가를 나타낼 수 있다. 상기 증가는 5%, 10%, 15%, 20% 또는 20% 초과와 같은 양일 수 있다. 염증 상태의 다른 증후에는 제한 없이, 병리학적 염증 및 관절 파괴가 포함된다. 염증 상태의 위험에 있는 포유류는 예를 들어, [Vyse & Todd, Cell 85:31 1-18 (1996); Kinne 등 Arthritis Research 3:319-330 (2001) 및 Rioux & Abbas, Nature 435:584-9 (2005)] 에서 논의된 바와 같은 유전적 이상을 바탕으로 규명될 수 있다.

4-1BBL 차단제는 많은 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로의 예에는 비경구, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 흡입에 의해, 경피 (국소), 경점막, 및 직장 투여가 포함된다. 전신 투여는 경점막 또는 경피 수단에 의해 수행될 수 있다. 폴리펩타이드-기재 차단제는 예를 들어, 필요로 하는, 또는 의사에 의해 결정된 피부 밑으로 주사에 의해 투여될 수 있다. 상기 차단제는 또한 수 시간에 걸쳐 정맥내 주사에 의해 주입될 수 있다. 안티센스 또는 siRNA 와 같은 올리고뉴클레오타이드-기재 4-1BBL 차단제는 벡터에 삽입될 수 있고 유전자 치료 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 치료 벡터는 정맥 내 주사, 국소 투여 또는 입체정위 주사에 의해 개체에 전달될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,328,470 호 및 [Chen 등, PNAS 91 :3054 (1994)] 를 참조한다. 따라서, 4-1BBL 차단제는 조직에의 직접 주사 또는 그 자리에서의 발생에 의해 개체에 투여될 수 있다. 대안적으로, 상기 차단제는 선택된 세포를 표적화하도록 개질된 다음 전신으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 분자는 그것이 선택된 세포 표면 상에 발현된 수용체 또는 항원에 결합하도록 개질될 수 있다. 다른 소분자 유형 차단제는 경구 투여될 수 있다.

4-1BBL 차단제는 단독으로, 또는 알려진 항염증 약제, 예컨대, 아달리무마브 (Adalimumab (Humira®)), 에팔리주마브 (Efalizumab (Raptiva®)), 에타네르셉트 (Etanercept (Enbrel)), 일플릭시마브 (Infliximab (Remicade®)), 메토트렉세이트 (methotrexate (Rheumatrex)), 및 오말리주마브 (Omalizumab (Xolair®)) 와 같은 제 2 약제와 병용하여 사용될 수 있다.

포유류에 투여되는 투여량은 4-1BBL 발현 또는 활성을 감소시키기에 적절한 양일 수 있다. 투여량은 유효 투여량 또는 그의 적절한 분획일 수 있다. 이는 연령, 신체 상태, 크기, 체중, 치료되는 상태, 상태의 중증도 및 임의의 수반되는 치료를 포함하여 개별 환자의 변수에 따라 다를 것이다. 적절한 투여량을 결정하는 요소는 당업자에게 잘 알려져 있고, 일상적인 실험을 통해 처리될 수 있다. 예를 들어, 물리화학적, 독성학적 및 약물동력학적 특성의 측정은 표준 화학 및 생물학적 어세이를 사용하고, 화학, 약물동력학 및 독성학 분야에서 알려진 수학 모델링 기술을 통해 수행될 수 있다. 치료적 유용성 및 투여 섭생은 상기 기술의 결과, 및 적절한 약물동력학적 및/또는 약물동력학적 모델의 사용을 통해 외삽될 수 있다. 환자에 투여되는 정확한 양은 주치의의 책임일 것이다. 그러나, 4-1BBL 차단제는 포유류 체중 kg 당 약 0.05 내지 약 2000 mg, 바람직하게는 포유류 체중 kg 당 약 1 내지 약 200 mg 의 투여량으로 경구, 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드-기재 차단제는 포유류 체중 kg 당 0.05 내지 500 mg, 바람직하게는 포유류 체중 kg 당 0.5 내지 50 mg 의 투여량으로 투여 (예를 들어, 경구 또는 주사에 의해) 될 수 있다. 성인 인간에 대한 투여량 범위는 일반적으로 4 내지 40,000 mg/일 및 바람직하게는 40 내지 4,000 mg/일이다. 본 발명의 특정 제제가 장기간 작용하기 때문에, 첫날에 80 내지 4,000 mg 의 초기 투여량을 투여한 다음, 다음 날들에는 20 내지 1,000 mg 의 더 낮은 투여량을 투여하는 것이 유리하다. 환자는 또한, 의학적인 이유, 생리학적인 이유 또는 사실상 다른 이유에서, 더 낮은 투여량 또는 허용가능한 투여량을 주장할 수 있다. 약학적 조합물의 성분으로서 제형되는 제 2 약제의 유효량은 제 2 약제의 제조업자의 권고, 주치의의 판단을 따를 것이고, PHYSICIAN'S DESK REFERENCE 에서 지시된 바와 같은 양 및 투여량에 대한 프로토콜과 투여 요소에 의해 가이드될 것이다. 치료 방법의 유효성은 장애의 알려진 증상 또는 증후의 향상에 대해 환자를 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 염증의 개선은 전염증성 사이토카인 생성, 예를 들어 IL-1, IL-6, TNF 또는 MCP-1 생성의 수준 및 기간을 모니터링함으로써 검출될 수 있다. 전염증성 사이토카인 생성 수준 또는 기간의 감소, 예를 들어 5%, 10%, 15%, 20% 또는 20% 초과의 감소는 환자에서의 향상을 지시한다.

4-1 BBL 차단제의 약학적 조성물

4-1BBL 차단제는 포유류에 투여하기에 적합한 약학적 조성물 (본원에서, 본 발명의 약학적 조성물) 내에 혼입될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 활성제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 구 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 당업계에 알려진 임의의 그리고 모든 용매, 분산 배지, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 의미하고, 이들은 포유류에의 약학적 투여에 융화가능하다. 통상의 배지 또는 제제가 활성 화합물과 비융화가능성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학적 조성물에서 그의 용도가 고려된다. 또한, 보충 활성 화합물이 약학적 조성물 내에 포함될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 또한 상기 기술된 바와 같이 제 2 항염증 약제를 포함할 수 있다.

치료적 유효량의 차단제가 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 그러한 치료적 유효량의 차단제는 일반적으로 흥미있는 세포 또는 조직, 또는 포유류에서 4-1BBL 발현 또는 활성을 감소시키기에 충분하다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량의 차단제는 염증을 감소시키기에 충분한 양이다. 치료적 유효량의 차단제의 예는 전술한 부문에 기술된 투여량이다. 따라서, 4-1BBL 차단제는 포유류 체중 kg 당 약 0.05 내지 약 2000 mg, 바람직하게는 포유류 체중 kg 당 약 1 내지 약 200 mg 의 투여량으로 투여될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드-기재 차단제는 포유류 체중 kg 당 0.05 내지 500 mg, 바람직하게는 포유류 체중 kg 당 0.5 내지 50 mg, 예를 들어, kg 당 1, 3, 5 mg 의 투여량으로, 경구 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 성인의 투여량 범위는 일반적으로 일일 4 내지 40,000 mg 및 바람직하게는 일일 40 내지 4,000 mg 이다. 본 발명의 특정 제제가 장기간 작용하기 때문에, 첫날에 80 내지 4,000 mg 의 초기 투여량을 투여한 다음, 다음 날들에는 20 내지 1,000 mg 의 더 낮은 투여량을 투여하는 것이 유리하다.

본 발명의 약학적 조성물은 원하는 투여 경로에 융화가능하도록 제형된다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 (1) 주사용수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제 ; (2) 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제 ; (3) 아스코르브산 또는 나트륨 비술파이트와 같은 항산화제 ; (4) 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제 ; (5) 아세테이트, 시트레이트 또는 인산염과 같은 완충제, 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성 조정용 제제를 포함한다. pH 는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기를 사용해 조정할 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 1 회용 주사기 또는 다중 투여 바이알 내에 밀폐시킬 수 있다.

약학적 조성물은 또한, 4-1BBL 차단제의 성질을 바탕으로 제형 및 투여될 수 있다. siRNA 와 같은 올리고뉴클레오타이드-형 4-1BBL 차단제는 [Li & Rossi, Methods Mol. Biol. 309:261-72 (2005)] 에서 기술된 바와 같은 벡터-기재 전달 시스템을 사용하여, [Song 등, Nat. Med. 9:347-51 (2003); Soutschek 등, Nature 432: 173-178 (2004); Morrissey 등, Nat. Biotechnol 23:1002-1007 (2005); Song 등, Nat. Biotechnol. 23:709-717 (2005)]; 및 [Wolfrum 등, Nat. Biotechnol. 25: 1 149-1 157 (2007)] 에서 기술된 바와 같은 콜레스테롤-공액된, 지질 캡슐화된 및 항체-연결된 것을 포함하여 화학적으로-개질된 siRNA 및 siRNA 의 고압 정맥 내 주사를 사용하여 전달될 수 있다. siRNA 및 리보자임과 같은 올리고뉴클레오타이드-형 4-1BBL 차단제는 또한, [Yano 등, In vivo Antitumor Activity of a New Cationic Liposome siRNA Complex, in NON-VIRUS GENE THERAPY, Springer Tokyo, 2005] 에서 기술된 바와 같이 양이온 리포좀을 사용하여 전달될 수 있다.

주사에 적합한 약학적 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균처리수, 또는 인산염 완충 식염수를 포함한다. 조성물은 제조업자의 조건 및 보관 하에 멸균 및 안정해져야 하고, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물에 의한 오염에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 분산 배지 또는 용매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하여, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지시킴으로써, 및 계면활성제를 사용하여 달성될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 사용하여 달성될 수 있다. 등장성제, 또는 흡수를 지연시키는 제제 (예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴) 와 같은 다른 성분이 포함될 수 있다.

멸균 주사액은 상기 기술된 바와 같이, 필요한 대로, 적절한 용매 내에서 필요한 양의 활성제를 활성 성분 중 하나 또는 조합물과 혼입하고 이어서 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 분산액은 상기 기술된 바와 같이, 염기성 분산 배지 및 다른 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 활성 화합물을 혼입함으로써 제조될 수 있다. 주사액 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법에는 진공 건조 및 동결-건조가 포함되고, 이로써 이전의 멸균-여과된 용액에서 활성 성분 및 임의의 추가로 필요한 성분의 분말이 수득된다.

경구 조성물은 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함할 수 있다. 이들은 젤라틴 캡슐에 밀페될 수 있거나 또는 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되거나, 또는 정제, 트로키, 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한, 유동성 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 약학적으로 융화성의 결합제 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐, 트로키 등은 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다 : 미세결정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제 ; 전분 또는 락토스와 같은 부형제 ; 알긴산 또는 옥수수 전분과 같은 붕괴제 ; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 ; 콜로이드성 이산화규소와 같은 유동화제 ; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제 ; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 풍미제와 같은 풍미제.

흡입에 의한 투여를 위해, 조성물은 적합한 압축 불활성 기체 (propellant), 예를 들어, 이산화탄소와 같은 기체 또는 흡입기를 함유하는 가압된 용기 또는 분산기 (dispenser) 로부터 에어로졸 분무의 형태로 전달될 수 있다.

경점막 또는 경피 투여를 위해, 벽을 침투하기에 적절한 당업계에 알려진 침투제를 사용할 수 있다. 이러한 침투제에는 경점막 투여를 위한 세제, 담즙염 및 푸시딘산 유도체가 포함되고, 이는 예를 들어, 비내 스프레이를 사용하여 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해서는, 활성 화합물이 당업계에 일반적으로 알려진 연고, 고약, 젤 또는 크림으로 제형된다.

한 구현예에서, 본 발명의 제제는 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템과 같은 서방성 제형과 같이, 체내에서의 빠른 소거에 대해 제제를 보호할 담체를 사용해 제조될 수 있다. 생분해가능한 생물융화성의 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 중합체에는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 포함된다. 상기 제제의 제조 방법은 당업자가 알게 될 것이다. 바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 감염된 세포를 표적으로 하는 것을 포함하여, 리포좀 현탁액이 또한 약학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업계에 알려진 방법을 사용해 제조될 수 있다.

경구 또는 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제형될 수 있다. 구 "투여량 단위 형태" 는 치료될 개체에 대해 단일 (unitary) 투여량으로서 맞춰진 물리적으로 분리된 단위를 말하고, 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 예정된 양의 활성 화합물을 함유하고 있다. 투여량 단위 형태에 대한 자세한 사항은 활성 화합물의 독특한 특징, 및 달성될 특정 치료 효과에 따라 다르다.

유전자 치료 벡터의 약학적 제제는 허용가능한 희석제 내에 유전자 치료 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 유전자 전달 비히클이 포매된 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위한 지침과 함께, 용기, 팩 또는 분산기 내에 포함될 수 있다. 그러한 제조 물품은 지속적인 염증의 치료를 위한 4-1BBL 차단제의 사용 지침을 포함할 것이다. 또한, 그러한 제조 물품은 염증 치료를 위한 제 2 약제의 사용 지침을 포함할 것이다.

스크리닝 어세이

본 발명은 또한, 신규 4-1BBL 차단제에 대한 스크리닝 방법을 포함한다. 신규 4-1BBL 차단제는 4-1BBL 올리고머화, TRAF6 또는 TLR 과 같은 다른 신호화 분자와 4-1BBL 과의 상호작용, 또는 4-1BBL 의 세포 막으로의 전위를 방해하는 능력을 바탕으로 규명될 수 있다.

4-1BBL 올리고머화를 방지할 수 있는 4-1BBL 차단제는 후보 제제의 존재 및 부재 하에 세포 기재 어세이에서 규명될 수 있다. 2 개의 4-1BBL 의 결합을 매개하는 존재인 후보 제제는 4-1BBL 의 올리고머화, 즉, 3 개 이상의 4-1BBL 의 응집물의 형성을 방지할 4-1BBL 차단제이다. 일반적으로, 2 개의 4-1BBL 의 결합은 이스트 투 하이브리드 시스템 (yeast two hybrid systems) ([Fields & Song, Nature 340:245-46 (1989) 참조), 및 β-락타메이즈 (lactamase) 상보성 어세이와 같은 단백질 절편 상보성 어세이 (http://www.abrf.org/JBT/articles/JBT0012/jbt0012.html (2006 년 9 월 8 일에 마지막으로 검색됨 (visited) 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 표준 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 이스트 투 하이브리드 시스템에서, 2 개의 4-1BBL 융합 단백질은 효모 세포에서 발현될 수 있다. 하나의 융합 단백질은 DNA-결합 도메인에 융합된 4-1BBL 로 이루어지고, 제 2 융합 단백질은 전사 활성화 도메인에 융합된 4-1BBL 로 이루어진다. 4-1BBL 의 결합은 효모가 정의된 배지 상에서 성장할 수 있게 하는 리포터 유전자의 활성화를 초래한다. β-락타메이즈 상보성 어세이에서, 2 개의 β-락타메이즈 효소 절편인 Bla(a) 및 Bla(b) 는 각각 아미노산 26 ~ 196 및 198 ~ 290 으로 이루어져 있으며, (Gly₄Ser)₃ 링커에 의해 4-1BBL 과 융합될 수 있다. 한 쌍의 4-1BBL-Bla(a) 및 4-1BBL-Bla(b) 로 트랜스펙션시킨 세포를 CCF2/AM 을 사용해 로딩한다. CCF2/AM 은 세포막을 가로질러 분산되고, 세포질 에스터라제는 그의 에스테르 관능기를 가수분해하여, β-락타메이즈 기질 CCF2 를 방출한다. 409 nm 에서, CCF2 내 쿠마린 공여자를 여기 (excitation) 하면, 520 nm 에서, FRET 가 녹색 형광을 방출하는 형광단 수용체로 가게 한다. 2 개의 4-1BBL 이 결합하면, 2 개의 β-락타메이즈 절편이 근처로 오게 되어, 완전한 형태의 β-락타메이즈가 생성된다. 이러한 β-락타메이즈는 추가로 CCF2 를 가수분해하고, 공여자 및 수용체를 분리하여 FRET 붕괴를 초래한다. 그 결과, 단리된 쿠마린 공여자가 447 nm 에서 청색 형광을 방출한다. 이는 현미경 하에서 관찰되거나 또는 유세포분석기에 의해 측정될 수 있다. 2 개의 결합.

4-1BBL 과 신호화 분자와의 상호작용을 억제 또는 감소시킬 수 있는 4-1BBL 차단제는 세포-기재 방법을 사용하여 규명될 수 있다. 상기 어세이의 예는 본원에 기술되어 있다. (b) 후보 제제를 사용해, TLR 또는 TRAF6 과 같은 신호화 분자와 4-1BBL 과의 상호작용을 억제 또는 감소시킬 수 있는 4-1BBL 차단제를 규명한 다음, 4-1BBL 이 신호화 분자와 상호작용하는지를 측정하는 세포-기재 방법이 기술된다. 대안적으로, TLR 또는 TRAF6 와 4-1BBL 과의 상호작용을 억제하는 제제는 4-1BBL 응집에 관해 상기에서 기술된 것과 유사한 세포 기재 스크리닝을 사용하여 규명될 수 있다. 예를 들어, 4-1BBL-효모 DNA 결합 단백질 및 TRAF6-효모 전사 활성화 도메인, 또는 TRAF6-효모 DNA 결합 단백질 및 4-1BBL-효모 전사 활성화 도메인은 상기 기술된 바와 같은 이스트 투-하이브리드 시스템에서 사용될 수 있다. 유사하게는, 4-1BBL-Bla(a) 및 TRAF6-Bla(b) 또는 TRAF 6-Bla(a) 및 4-1BBL-Bla(b) 로 이루어진 융합 단백질을 사용하여, 상기 기술된 바와 같은 4-1BBL 과 TRAF6 와의 상호작용을 검사할 수 있다.

4-1BBL 의 세포 표면으로의 전위를 억제 또는 감소시킬 수 있는 4-1BBL 차단제는 4-1BBL 을 발현하는 세포를 선택된 제제와 접촉시키고, 4-1BBL 이 세포 막으로 위치하는지를 측정함으로써 규명될 수 있다. 상기 세포는 RAW264.7세포주와 같은 포유류 세포일 수 있다.

4-1BBL 차단제는 또한, 세포-기재 또는 염증 동물 모델을 사용하여 규명될 수 있다. 세포-기재 어세이의 예는 본원에 기술된다. 예를 들어, 적절한 자극, 예를 들어, LPS 에의 노출에 반응하여 TNF, IL-6, IL-1 또는 MCP-1 과 같은 염증 사이토카인을 발현하는 세포를 후보 제제와 접촉시킨다. 후보 제제와 접촉되었던 세포에 의한 염증 사이토카인 생성을 후보 제제와 접촉되지 않았던 세포에서의 것과 비교한다. 세포-기재 어세이를 위해, 염증을 유도하는 LPS 와 같은 자극에 반응하여 염증 사이토카인을 생성할 수 있는 임의의 세포를 사용할 수 있다. 이러한 세포에는, 예를 들어, RAW264.7 세포, 1 차 쥣과 대식세포, 및 1 차 인간 단핵구가 포함된다. 유사하게는, 4-1BBL 차단제는 염증 동물 모델을 사용하여 규명될 수 있다. 예를 들어, 포유류에 후보 제제를 투여할 수 있고, TNF 또는 IL-6 과 같은 염증 사이토카인의 생성, 또는 체온 증가 또는 관절 부어오름과 같은 과다하게 지속된 염증과 연관된 다른 관찰가능한 표현형을 측정할 수 있고, 후보 제제를 투여받지 못한 유사한 동물의 것과 비교할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기술될 것이며, 하기 실시예는 청구항에서 기술된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.

실시예 1 - 재료 및 방법

마우스 및 시약. TLR2-결핍, TLR4-결핍, MyD88-결핍, TRIF-결핍 (LPS2) 및 TRIF- 와 MyD88-둘 다 결핍 마우스를 [Hoebe 등, Nature 424:743-48 (2003)]; 및 [Kim 등, J. Exp. Med. 197: 1441-52 (2003)] 에서 기술된 바와 같이 하였다. 4-1BBL-결핍 마우스를 [DeBenedette 등, J. Immunol. 163:4833-41 (1999)] 에서 기술된 바와 같이 C57BL/6 마우스에 8 회 역교배시켰다. 4-1BB-결핍 마우스를 [Vinay, J. Immunol. 173:4218-29 (2004)] 에서 기술된 바와 같이 C57BL/6 마우스에 7 회 이상 역교배시켰다. 성별- 및 연령-매칭된 마우스를 동일한 실험에 사용하였다.

복막 대식세포, RAW264.7 및 293T 세포의 제조 및 배양은 [Kim 등, J. Exp. Med. 197:1441-52 (2003)] 에 기술된 바와 같이 하였다. 성별- 및 연령-매칭된 4-1BBL-결핍 및 야생형 (WT) 마우스에 LPS 를 복강 내 주사하였다. 혈청 샘플을 수합하고, 생존율을 모니터링하였다. 동물 사용 프로토콜은 [Institutional Animal Care] 및 [Use Committee at The Scripps Research Institute] 에서 승인받았다.

하기 시약을 사용하였다 : Pam₃CysSer(Lys)₄ (EMC microcollections GmbH) ; 이.콜라이 O111:B4 의 LPS (List Biological Laboratories) ; 포스포로티오에이트- 안정화된 CpG DNA 및 R-848 (Invivogen) ; 폴리I:C (Amersham Biosciences) ; 펩티도글리칸 (Fluka) ; IL-1β 및 TNF (R&D systems) ; 재조합 마우스 4-1BB-Fc 및 항-4-1BBL (R&D systems) ; 4-1BBL 에 대한 모노클로날 항체 (클론 TKS-1, e-Bioscience) ; 항-Flag were (Sigma) ; 항-GFP were (Clontech) ; HA, Myc, MyD88, TLR4, 및 TRAF6 에 대한 항체 (Santa Cruz Biotechnology) ; Alexa Fluor 594-공액된 당나귀 (donkey) 항-염소 IgG (Molecular Probes) ; 항-AU-1 (Covance) ; 항-GAPDH (Chemicon) ; 브레펠딘 A (Biolegend) ; 및 술파살라진, SB203580, SP600125, 및 PD98059 (Calbiochem).

플라스미드, 재조합 아데노바이러스 및 PCR. 포유류 발현 벡터를, 전장, 세포외 도메인-소실 (ΔExt), 또는 시토졸 도메인-소실 (ΔCyt) 인간 4-1BBL cDNA 를 사용하여 구축하였거나, 또는 전장, pro712his 돌연변이체, 세포외 도메인-소실 (ΔExt), 또는 시토졸 도메인-소실 (ΔCyt) 인간 TLR4 cDNA 를 사용하여 구축하였다. 이들 cDNA 를 GFP (pEGFP-C1 에서), Flag (pcDNA3 에서), 또는 HA (pcDNA3 에서) 와 융합하였다. 복제-결여 아데노바이러스-5-발현 마우스 4-1BBL (Adv-4-1BBL), 또는 대조군으로서 형질전환 유전자 없음 (Adv-대조군) 을 [Bukczynski 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 :1291-1296 (2004)] 에서 인간 4-1BBL 에 대해 기술된 바와 같은 '2 개 플라스미드 회수 (two plasmid rescue)' 방법을 사용하여 제조하였다.

[Kim 등, J. Exp. Med. 197:1441-52 (2003)] 에서 기술된 바와 같이 준정량 적 PCR 을 수행하였다. 실시간 PCR 을 위해, 프라이머로서 올리고(dT)₁₂ 를 사용하여 cDNA 를 제조하기 위해, 0.5 μg 의 총 RNA 를 사용하였다. SYBR 녹색 PCR Master Mix 키트 (Applied Biosystems) 를 실시간 PCR 분석에서 사용하였다.

전장, 시토졸 도메인, 세포외 도메인-소실 (ΔExt), 또는 시토졸 도메인-소실 (ΔCyt) 인간 4-1BBL cDNA 를 GFP (pEGFP-C1), flag (pcDNA3 에서), 또는 HA (pcDNA3 에서) 와 융합된 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. [Bukczynski 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 :1291-1296 (2004)] 에서 이미 기술된 바와 같이, 동일한 방법을 사용해 복제-결핍 아데노바이러스-5 발현 마우스 4-1BBL (Adv-4-1BBL) 또는 대조군으로서 형질전환 유전자 없음 (Adv-대조군) 을 제조하였다. 마우스 4-1BBL (#1,5'-GCTCTATGGCCTAGTCGCT-3' (SEQ ID NO: 14); #2,5'-GCAAAGCCTCAGGTAGATG-3' (SEQ ID NO: 15)), 마우스 4-1BB (#1,5'-ACCTGTAGCTTGGGAACATTT-3' (SEQ ID NO: 16); #2,5'-AATACAATCCAGTCTGCAAGA-3' (SEQ ID NO: 17)), 또는 아무것도 없음 (대조군) 을 표적으로 하는 siRNA 가닥을 발현하도록 p억제자에 올리고뉴클레오타이드를 클로닝하였다. 인간 IL3R, TLR 2, 3, 4 또는 9 cDNA 가닥을 pcDNA3-flag 발현 벡터에 클로닝하였다.

트랜스펙션 . 293T 세포를 제조업자의 프로토콜 (Invitrogen) 에 따라 Lipofectamine 2000 을 사용하여 발현 벡터에 트랜스펙션시키고, 세포 파쇄물을 24 시간 후에 제조하였다. siRNA 트랜스펙션을 위해, 마우스 대식세포 세포주 RAW264.7 에 폴리아민 (Ambion) 을 사용하여, siRNA 표적화 마우스 TRAF6 (#1, 5'- GGAUCAUCAAGUACAUUGUTT-3' (SEQ ID NO: 18) ; #2,5'- GGGCUACGAUGUGG AGUUUTT-3' (SEQ ID NO: 19) ; Ambion 에서 미리-디자인된 siRNA), 또는 대조군으로서 GFP 를 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션한 지 2 일 후에, 세포를 자극물과 함께 인큐베이션하였다. 세포 파쇄물 또는 배양 상청액을 24 시간 후에 제조하여, 웨스턴 블로팅에 의해 TRAF6 의 녹다운, 또는 ELISA 에 의해 TNF-α 의 생성을 분석하였다.

전기영동 이동도 ( Electrophoretic mobility shift ), 핵 진행, 및 이스트 투-하 이브리드 어세이. 핵 추출물을 이전에 기술된 프로토콜에 따라 제조하였다. [γ-³²P] ATP 를 사용한 특이적 올리고뉴클레오타이드의 방사성표지화 및 EMSA 를 Promega 의 프로토콜에서 권고된 바와 같이 수행하였다. [Han 등, Biochim. Biophys. Acta 1090:22-28 (1991)] 에서 기술된 바와 같이 런-온 (run-on) 분석에 의해 TNF 전사율을 측정하였다. [Han 등, Nature 386:296-299 (1997)] 에서 기술된 바와 같이 혼합된 인간 태아 뇌 및 비장 cDNA 라이브러리를 사용하여, 기술된 바와 같이 이스트 투-하이브리드 스크리닝을 수행하였다. 세포내 단백질 도메인 (아미노산 653 ~ 839) 에 걸쳐 있는 (spanning) 인간 Tlr4 부위를 pAS2 벡터에 하위클로닝하였고, 미끼로서 사용하였다. 5 x 10⁶ 형질전환체를 스크리닝하였다.

4-1 BBL 또는 4-1 BB -녹다운 안정한 세포주의 생성. RAW 264.7 세포를 p억제자-4-1BBL, 4-1BB, 또는 빈 벡터를 사용해 안정하게 트랜스펙션시켰다. 세포 의 선별을 위해, 500 μg/mL 의 G418 이 든 배양 배지에서 세포를 2 주 동안 인큐베이션시키고, 그런 다음 풀링하였다 (pooled). G418 이 든 배지에서 세포를 유지시켰다.

유세포분석 . 복막 대식세포를 얼음 상의 PBS, 5% FCS, 0.01% 나트륨 아자이드 (FACS 완충액) 내에서 현탁시켰다. 피코에리트린이 공액된 4-1BBL-특이적 항체 (클론 TKS-1, eBioscience) 를 사용하여, 표면 4-1BBL 발현을 평가하였다. 고정화-침투화 완충액 (Biolegend) 내에서 세포를 고정하고 침투시킨 후, 총 4-1BBL 발현을 평가하였다. 세포를 침투화 완충액 내 피코에리트린-공액된 4-1BBL 항체를 사용하여 염색한 다음, FACS 완충액을 사용해 세정하였다. 피코에리트린-공액된 래트 IgG2a, κ 를 아이소타입 대조군으로서 사용하였다.

면역조직화학 및 면역어세이 . 복막 대식세포를 커버 글라스 상에 심고, 4% 포름알데하이드를 사용해 고정하고, 0.5% Triton X-100 이 든 PBS 내에서 인큐베이션시킴으로써 침투화시켰다. 2% BSA 를 사용해 차단시킨 후, 세포를 항-마우스 4-1BBL 과 함께 인큐베이션시키고, 이어서 Alexa Fluor 594-공액된 당나귀 항-염소 IgG 에서 인큐베이션시켰다. AxioVision 3.1 소프트웨어 (Carl Zeiss, Inc.) 를 사용해 형광 이미지를 가시화하였다. 대식세포 배양액의 상청액 또는 마우스 혈청을 수합하고, TNF 또는 IL-6 농도를 제조업자의 프로토콜에 따라 효소-연결된 면역흡착 어세이 (ELISA) 키트 (eBioscience) 에 의해 측정하였다. 면역침전 및 면역블로팅 과정에서 사용되는 항체는 도면에 지시되어 있다. 실험 과정은 [Zhou 등, Mol. Cell. Biol. 26:3824-34 (2006)] 에서와 같이 기술된다.

사이토카인의 측정. 대식세포 배양 상청액 또는 마우스 혈청을 수합하고, TNF-α 또는 IL-6 농도를 제조업자의 프로토콜에 따라 효소-연결된 면역흡착 어세이 (ELISA) 키트 (eBioscience) 에 의해 측정하였다.

통계 분석. 카플란-마이어 플롯 (Kaplan-Meier plot) 을 구축하고, 로그-순위 테스트를 사용하여, 마우스의 생존율의 차이를 측정하였다. 혈청 TNF 의 통계적으로 유의한 차이를 Student's t-테스트에 의해 측정하였다.

실시예 2 - 4-1 BBL 은 TLR4 -상호작용 단백질이다.

이스트 투-하이브리드 스크리닝을 사용하여, TLR4 의 세포내 도메인과 상호작용하는 단백질을 규명하였다. pGAD10 벡터에서 4-1BBL (5 ~ 254 aa) (클론 1), 4-1BBL (3 ~ 254 aa) (클론 2), p38((AF), p53, 또는 라민과 함께 pAS2-TLR4 (653 ~ 839 aa) 를 사용해 효모 세포를 트랜스펙션시켰다. "미끼 및 재물 (bait and prey)" 상호작용을 히스티딘 결핍 배지 상에서의 효모 성장에 의해 확인하였다. 7 개의 양성 클론 중 2 개가 4-1BBL, 세포 표면 유형 II 막관통 단백질인 것으로 드러났다 ([Goodwin 등, Eur. J. Immunol. 23:2631-2641 (1993)] 및 [Alderson 등, Eur. J. Immunol. 24:2219-2227 (1994)] 참조). 관계없는 단백질이 아닌 4-1BBL 은 TLR4 세포내 도메인과 상호작용하고, 이는 미끼 벡터에서 암호화되는 TLR4 세포내 도메인 및 재물 벡터에서 암호화되는 4-1BBL 을 함유하는 효모 세포가 His 3 리포터 유전자의 상호작용-매개 발현으로 인해 히스티딘 결핍 배지에서 성장할 수 있었다는 발견에 의해 나타났다 (도 1A).

상호작용을 확인하기 위해, HA-4-1BBL 을 293 세포에서 flag-TLR4 또는 flag-IL-3 수용체 (IL-3R) 와 함께 또는 없이 공동-발현시키고, 그의 관계를 공-면역침전에 의해 측정하였다. 293T 세포를 빈 pcDNA3 벡터 (대조군) 또는 빈 pcDNA3 벡터와 조합된 4-1BBL 발현 벡터, flag-TLR4 또는 flag-IL-3R 발현 벡터로트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24 시간째에 세포를 파쇄시켰다. 세포 파쇄물 중 2/3 를 항-HA 항체를 사용해 면역침전시켰다. 파쇄물 및 면역침전물을 항-flag 및 항-HA 항체를 사용해 면역블로팅하였고, 그 결과는 IL-3R 이 아닌 TLR4 가 4-1BBL 에 의해 감쇠 (pull down) 되었음을 지시하였다 (도 1B).

4-1BBL 과 TLR4 간의 상호작용을 특징화하기 위해, 하기 실험을 수행하였다.

GFP-4-1BBL, 및 Flag-TLR4, 시토졸 도메인이 없는 Flag-TLR4 (ΔCyt), 세포외 도메인이 없는 Flag-TLR4 (ΔExt), Flag-IL-3R, Myc-TLR4, 또는 Myc-TLR4-P712H (Lps^d) 를 발현하는 플라스미드로 트랜스펙션시킨 293T 세포를 사용하여 면역어세이를 수행하였다. 세포 파쇄물을 항-Flag 또는 항-Myc 를 사용해 면역침전시키고, 세포 파쇄물 및 면역침전물을 지시된 항체를 사용해 면역블로팅하였다. 결과는, TLR4 세포내 도메인이 4-1BBL 과의 상호작용에 관여하나, TLR4 TIR 도메인 내 돌연변이 (Lps^d, Pro712H) 는 TLR4 와 4-1BBL 간의 상호작용에 실질적인 효과가 없음을 지시하였다 (도 1C). Lps ^d 돌연변이는 TIR 도메인과 MyD88 간의 상호작용을 붕괴시키나, TIR 도메인의 구조를 붕괴시키지는 않기 때문에 ([Xu 등, Nature 408: 11 1-15 (2000)] 참조), TLR4 TIR 도메인의 특정 부위는 4-1BBL 및 MyD88 와 상호작용할 수 있다.

또한, GFP, GFP-4-1BBL, 시토졸 도메인이 없는 GFP-4-1BBL (ΔCyt), 세포외 도메인이 없는 GFP-4-1BBL (ΔExt), 또는 시토졸 도메인만 있는 GFP-4-1BBL (Cyt) 을 발현하는 벡터와 함께, flag-TLR4 발현 벡터로 트랜스펙션시킨 293T 세포를 사용하여 면역어세이를 수행하였다. 세포 파쇄물을 항-flag 항체를 사용해 면역침전시키고, 항-flag 및 항-GFP 항체를 사용해 면역블로팅하였다. 결과는, TLR4 와 상호작용하는 4-1BBL 에 대해, 이는 그의 시토졸 도메인을 함유해야 하고, 시토졸 도메인이 없는 4-1BBL, 또는 TLR4 를 사용해 공동-면역침전된 4-1BBL 시토졸 도메인 단독 둘 다가 아닌 것으로서, 세포막과 연관있어야 한다 (도 1D).

실시예 3 - 4-1 BBL 이 결핍된 마우스는 LPS -유도 치사에 대해 더욱 내성이 있다.

4-1BBL 의 생체 내 효과를 측정하기 위해, 4-1BBL 결핍 마우스를 분석하였고, 그 결과는 하기와 같다. 4-1BBL 결핍 마우스는 살아있고, 번식력이 있으며 건강하다. 이들 마우스는 정상적인 림프구 기관을 가지나, 바이러스에 대한 CD8⁺ T 기억 세포는 결핍되어 있음을 나타낸다. 야생형 및 4-1BBL-결핍 마우스에서의 복막 대식세포의 수는 유사하다 (데이타 나타내지 않음). LPS 를 4-1BBL-결핍 마우스 및 야생형 마우스에 복막내 주사한 것은, 4-1BBL-결핍 마우스가 LPS 의 치사 효과에 대해 야생형 마우스보다 더 내성이 있음을 나타내었다 (도 2A). 주목할만하게는, 야생형 마우스에 대한 LPS 의 치사 효과는 항-4-1BBL 의 투여에 의해 약화되었다 (도 2B, C). 4-1BBL 소실의 생체 내 효과는 대식세포 에서의 4-1BBL-매개 TNF 생성의 결핍, 및/또는 다른 계통의 세포에서의 4-1BBL 에 의한 4-1BB 의 활성화의 결핍을 초래할 수 있었다. 흥미롭게도, 자연 살해 (NK) 세포 및 NKT 세포를 더 적게 가지기 때문에, 4-1BB 결핍 마우스는 또한 LPS 및 갈락토사민의 주사에 의해 유도되는 사망에 대해 내성이 있다. 그러나, 4-1BBL-결핍 및 4-1BB-결핍 마우스에서의 LPS 내성은 상이한 원인에서 비롯된 것이어야 하는데, 그 이유는 4-1BBL-결핍 마우스는 정상 수의 NK 및 NKT 세포를 가지고 있기 때문이다 (데이타 나타내지 않음).

실시예 4 - 4-1 BBL 은 지속적인 TNF 생성에 관여한다.

A. 생체 내 연구

4-1BBL 이 TLR4-매개 숙주 반응에 관여하는지 알아보기 위해, 4-1BBL 녹아웃 (KO) 및 야생형 마우스에 0.5 mg 투여량의 이.콜라이 LPS 를 하기와 같이 접종하였다. 4-1BBL-/- 및 야생형 마우스에 0.5 mg 의 LPS 를 복강 내 주사하고, 2 시간 및 6 시간째에 수합된 혈청 내 TNF 수준을 측정하였다.

결과는, LPS-유도 TNF 생성이 야생형 마우스와 비교해 4-1BBL KO 마우스에서 훨씬 더 낮았음을 지시한다 (도 2D). 구체적으로, LPS 는 혈청 TNF 농도의 빠른 증가를 유도하였고, 상기 농도는 LPS 주사 후 1 시간째에 피크를 이루었다. 4-1BBL-결핍 마우스 내 혈청 TNF 농도는 LPS 주사 후 1 시간째에 야생형 마우스의 TNF 농도와 대략 유사하였고, 그 이후의 시간에서는 야생형 마우스의 농도보다 더 낮았다 (도 2D). 이들 데이타는 하기 논의되는 시험관 내 데이타와 일치하고 (도 3A), 여기서, 4-1BBL 소실만이 LPS 처리 후 더 후기의 시간에서의 TNF 생성에 영향을 미쳤으며 ; 그러나, LPS 에 의한 생체 내 TNF 유도는 시험관 내에서보다 더 빠른 것으로 나타났다.

B. 1 차 대식세포를 사용한 연구

대식세포가 LPS-접종된 마우스에서 TNF 의 1 차 공급원이기 때문에 (Beutler 등, Nature 316:552-554 (1985)), 4-1BBL KO 및 야생형 마우스의 복막 대식세포를 단리하고, LPS 자극 후 TNF 생성을 측정하였다.

우선, LPS 자극 후 24 시간째에 4-1BBL-결핍 및 야생형 대식세포의 배지에서 사이토카인을 측정함으로써, 대식세포에서 LPS-유도 사이토카인 생성에 대한 4-1BBL 의 효과를 알아보았다. 4-1BBL-결핍 대식세포는 야생형 대식세포보다 TNF, IL-6, 및 IL-12 를 더 적게 생성하였다 (도 3A). IL-1β 발현은 4-1BBL 의 부재에 의해 영향을 받지 않거나 또는 단지 약간만 영향을 받았다 (도 3A). 4-1BBL-결핍 대식세포는 IL-1β 를 사용한 자극 후 야생형 양의 IL-6 를 생성하였고, 이는 4-1BBL 이 LPS-유도 세포성 사이토카인 반응에 선택적으로 관여함을 제안한다 (도 3A).

또한, LPS 유도 후 6, 12 및 18 째의 TNF 생성을 알아보았다. 4-1BBL-/- 및 야생형 마우스의 복막 대식세포를 6 웰 디쉬에 웰 당 2 x 10⁶ 개로 플레이팅한 다음, LPS (100 ng/mL) 로 처리하였다. 배지 내 TNF 수준을 6, 12 및 18 째에 측정하였다. 흥미롭게도, 처음 LPS 자극 3 시간 동안에 TNF 생성은 4-1BBL KO 대식세포에서 정상이었으나, 상기 시점 후에는 거의 완전히 소멸되었으며 (도 3B), 이는 4-1BBL 이 TNF 생성의 추가 증가, 즉, LPS 자극 후 더 이후의 시간 동안의 생성을 유도하는데 필수적임을 지시한다.

4-1BBL 은 본래 공동-자극 기능을 가진 T-세포 표면 수용체인 4-1BB 의 리간드로서 클로닝되었다 ([Goodwin 등, Eur. J. Immunol 23:2631- 2641 (1993)] 참조). 4-1BB 는 또한 대식세포에서 발현되기 때문에, 4-1BB 가 LPS-처리 세포에서의 4-1BBL-매개 TNF 발현에 관여하는지를 알아보았다. 하기 실험은 LPS-유도 TNF 생성에 있어서 4-1BB 의 관여를 알아보기 위해 수행하였다.

예상치 못하게도, 4-1BB 의 존재는 지속적인 LPS-유도 TNF 생성을 촉진시키기 위해서는 4-1BBL 에 필요하지 않았는데, LPS-유도 TNF 의 양이 야생형 및 4-1BB-결핍 대식세포에서 유사하였기 때문이었다 (도 3C). 따라서, 4-1BBL-4-1BB 상호작용은 대식세포에서 일어나지 않거나, 또는 이들은 간단히는 대식세포 TNF 생성을 지속하는데 있어서 역할을 하지 않는다.

C. RA W264 .7 대식세포를 사용한 연구

대식세포 세포주 RAW264.7 에서 4-1BBL 의 기능이 1 차 대식세포에서의 기능과 유사한지를 알아보기 위해, siRNA 를 사용하여 하기와 같이 4-1BBL 발현을 녹다운시켰다. 간략하게는, 대조군 siRNA, 또는 4-1BBL-siRNA#1 또는 #2 를 함유하는 p억제자를 사용해 안정하게 RAW 264.7 세포를 트랜스펙션시켰다. 4-1BBL 의 단백질 수준을 면역블로팅에 의해 측정하였다. TNF 생성을, (1) 3, 9 및 24 시간 동안 LPS 로 처리한 대조군 및 4-1BBL 녹다운 세포에서, 및 (2) 펩티도글리칸 (PG, 10 μg/ml), 폴리I:C (25 μg/ml), LPS (100 ng/mL), CpG (5 μg/mL), 또는 비처리 배양 배지 (주입물 없음) 로 24 시간 동안 처리한 대조군 및 4-1BBL 녹다운 세포에서 측정하였다. 결과는, siRNA 둘 다 RAW264.7 세포에서 4-1BBL 을 효과적으로 녹다운시키고 (도 4A), LPS- 및 다른 TLR 리간드-유도 TNF 생성을 억제시켰으며 (도 4B, C), 따라서, 4-1BBL 의 역할이 RAW264.7 및 1 차 대식세포 세포에서 동일함을 나타내었다. 4-1BBL 은 RAW264.7 세포에서 LPS-유도 NF-κB 활성화에는 아무런 역할을 가지지 않는데, 그 이유는 LPS (100 ng/mL) 로 15, 30, 40, 50, 60 및 90 분 동안 처리한 대조군 및 4-1BBL 녹다운 RAW 세포가 동일한 I-κB-α 분해를 나타내었기 때문이다 (도 4D).

다음, RAW264.7 세포에서 4-1BB 발현을 하기와 같이 siRNA 를 사용하여 녹다운시켰다. RAW264.7 세포를 대조군 siRNA, 4-1BB siRNA#1 또는 #2 를 함유하는 p억제자로 안정하게 트랜스펙션시켰다. 4-1BB mRNA 를 RT-PCR 에 의해 측정하였다. LPS 를 24 시간 동안 처리한 후 대조군 및 4-1BB 녹다운 세포에서 TNF 생성을 측정하였다. siRNA 는 RAW264.7 세포에서 4-1BB 를 매우 효과적으로 녹다운시켰으나, 상기 녹다운은 LPS-유도 TNF 생성에는 영향을 미치지 않았다 (도 5A-B). 다음, 4-1BB 는 대식세포에서 LPS-유도 TNF 생성에 관여하지 않는 것이 분명하고, 따라서, 지속적인 TNF 생성의 조절에 있어서 4-1BBL 과 연관이 없다. 종합하면, LPS-처리 대식세포에서 TNF 생성을 지속하는데 있어서 4-1BBL 의 4-1BB-독립적 기능은 또한 siRNA 를 사용해 4-1BBL 및 4-1BB 를 녹다운시킴으로써 RAW264.7 대식세포 세포주에서 관찰되었다 (도 4A ~ C 및 도 5 A ~ B).

D. 전사 연구

4-1BBL 이 전사 및/또는 전사 후 단계에서 TNF 발현에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 4-1BBL-결핍 및 야생형 대식세포 내 TnfmRNA 를 다양한 기간의 LPS 처리 후에 측정하였다 (도 3D). TnfmRNA 의 발현은 LPS 자극 후 2 시간째에 4-1BBL-결핍 및 야생형 대식세포에서 유사한 양의 피크를 이루었으나 ; LPS 자극 후 이후의 시간 동안에는 4-1BBL-결핍 세포 내 TnfmRNA 양이 야생형 대식세포 내의 양보다 훨씬 더 적었다 (도 3D). 이러한 데이타는 TNF 단백질 데이타와 일치하고 (도 3B), 4-1BBL 이 TnfmRNA 전사체의 발현에 영향을 미침을 지시한다.

4-1BBL 이 Tnf 의 전사에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 핵 진행 분석을 수행하였다. LPS 는 야생형 및 4-1BBL-결핍 대식세포 둘 다에서 LPS 자극 후 1 시간째에 Tnf 전사를 유도하였으나 ; LPS 처리 후 이후의 시간에서 4-1BBL-결핍 대식세포에서는 Tnf 전사가 감소하였다 (도 3E).

4-1BBL-결핍 대식세포에서 LPS 자극 후 후기 시간에 발견된 더 적은 TnfmRNA 양이 또한 mRNA 안정성의 변화로 인한 것인지 알아보기 위해, 본 발명자들은 LPS 자극 후 3 시간째에 4-1BBL-결핍 및 야생형 대식세포에서 TnfmRNA 의 반감기를 측정하였다. 4-1BBL 소실은 TnfmRNA 의 안정성에 실질적인 영향을 주었다 (도 3F). 따라서, 4-1BBL 은 TNF 생성의 전사 및 전사 후 조절 둘 다에 영향을 준다.

4-1BBL 소실이 NF-κB 및 다른 전사 인자의 LPS-유도 활성화에 영향을 주는지를 하기와 같이 전기이동도 어세이 (EMSA) 에 의해 측정하였다. 4-1BBL-/- 및 야생형 대식세포를 LPS 로 1, 2, 4, 8 및 12 시간 동안 자극한 다음, 핵 추출물 제조를 위해 수합하였다. 방사성표지-프로브를 사용해 EMSA 를 수행하였다. 결과는, 4-1BBL 소실이 LPS-유도 NF-kB 활성화 (2 시간째 피크를 이루는 초기 반응) 에 영향을 주지 않았음을 지시한다 (도 3G). 이는 도 3B 의 데이타와 일치하고, LPS-유도 TNF 생성이 처음 3 시간 내에 4-1BBL 소실에 의해 영향을 받지 않았음을 보여준다. 4-1BBL 소실은 또한, LPS-유도 AP-1 활성에 영향을 거의 주지 않거나 또는 아무런 영향을 주지 않았다 (도 3G). 대조적으로, LPS 자극 후 8 시간째에 발생하는 LPS-유도 CREB 및 C/EBP 활성화는 4-1BBL 소실에 의해 유의하게 억제되었다 (도 3G). 손상된 CREB 및 C/EBP 활성화는 4-1BBL-결핍 대식세포에서 지속적인 TNF 생성의 결여에 기여할 수 있다.

LPS-유도 신호화 경로, NF-κB 및 MAP 키나아제 경로를 알아보기 위해, 야생형 및 4-1BBL KO 마우스의 복막 대식세포를 LPS (100 ng/mL) 로 0.5, 1, 2, 4 및 6 시간 동안 처리하고, 세포 파쇄물을 항-IκB-α, 항포스포-ERK (p-ERK), 항-포스포-JNK (p-JNK), 항-포스포-p38 (p-p38), 항-4-1BBL, 또는 항-GAPDH 항체를 사용하여 면역블로팅하였다. 결과는, NF-kB 의 억제제 (IκB-α) 의 분해 속도가 4-1BBL KO 및 야생형 세포에서 동일하며 (도 3H), 한편, 4-1BBL KO 세포에서 ERK1/2, JNK1/2, 및 p38 MAP 키나아제 활성화 (인산화) 는 야생형 세포에서와 동일하거나 또는 약간 더 낮았다 (도 3H).

따라서, TLR4 의 초기 신호 하류는 4-1BBL 소실에 의해 영향을 받지 않는 것으로 보이고, 신호화 경로 (도 3H) 및 전사 인자 (도 3G) 의 활성화를 분석한 데이타는 TNF 생성을 분석한 데이타와 일치한다 (도 3B). 추가로, 이는 TLR4 의 초 기 신호화가 4-1BBL 녹아웃 대식세포에서 그대로 보존된다는 것을 지지한다.

실시예 5 - 4-1 BBL 은 TLR2 , TLR3 , TLR4 및 TLR9 과 상호작용하고, 대식세포에서 TLR2 -, TLR3 -, TLR4 - 및 TLR9 -매개 TNF 생성에 관여한다.

4-1BBL 이 TLR4-매개 세포성 반응에 선택적으로 관여하는지 알아보기 위해, HA-4-1BBL 을 flag-TLR2, flag-TLR3, flag-TLR4, 또는 flag-TLR9 를 사용해 하기와 같이 공동-발현시켰다. 293T 세포를 flag-TLR2, flag-TLR3, flag-TLR4, 또는 flag-TLR9 와 함께, 빈 (대조군) 또는 HA-4-1BBL 발현 벡터를 사용해 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24 시간째에 세포를 파쇄시켰다. 세포 파쇄물을 항-flag 항체를 사용해 면역블로팅하거나, 또는 항-HA 를 사용해 면역침전시킨 다음 항-HA 및 항-flag 을 사용해 면역블로팅하였다. 결과는, 테스트된 모든 TLR 이공동-면역침전 어세이에서 4-1BBL 에 의해 감쇠 (pull down) 되었음을 지시한다 (도 6A). flag-IL-3R 이 4-1BBL 을 사용해서는 공동-면역침전되지 않았기 때문에 공동-면역침전은 특이성을 가진다 (도 6A).

4-1BBL 이 TLR2-, 3-, 4-, 또는 9-매개 세포성 반응에 관여하는지 알아보기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 야생형 및 4-1BBL-/- 대식세포를 Pam3 (1 μg/mL), 폴리I:C (25 μg/mL), LPS (100 ng/mL), R848 (100 nM), CpG (5 μg/mL), IL-1β (10 ng/mL), 또는 비처리 배양 배지 (주입물 없음) 로 처리하였다. 처리한 지 24 시간 후에 TNF 생성을 측정하였다. 결과는, Pam3 (TLR2 리간드)-, 폴리I:C (TLR3 리간드)-, R848 (TLR7&8 리간드)-, CpG (TLR9 리간드)-유도 TNF 생성이 4-1BBL KO 세포에서 감소되었음을 지시한다 (도 6B). IL-1β-유도 TNF 생 성이 4-1BBL KO 세포에서 정상이었기 때문에 상기 효과는 TLR 특이적이다 (도 6B). 따라서, 4-1BBL 은 모두 아니라면, 많은 상이한 TLR 의 신호화에 관여한다.

실시예 6 - 4-1 BBL 유도 및 세포 표면 위치화는 LPS -처리 대식세포에서의 지속적인 TNF 생성에 필요하다.

4-1BBL 은 대부분의 조직에서 검출가능하지 않고, 단지 낮은 수준만이 대식세포 및 수지상 세포에서 발현된다 ([Futagawa 등, Int. Immunol. 14:275-286 (2002)] 참조). LPS-처리 대식세포에서 지속적인 TNF 생성에 있어서 4-1BBL 의 역할을 분석하기 위해, 야생형, TLR4-/-, MyD88-/-, 및 TRIF-/- 마우스에서 단리한 대식세포를 LPS 로 0.5, 1, 2, 4, 및 8 시간 동안 처리하였다. 4-1BBL 단백질을 항-4-1BBL 항체를 사용하여 면역블로팅에 의해 분석하였다. GAPDH 를 로딩 대조군으로서 사용하였다. 결과는, LPS 가 대식세포에서 4-1BBL 의 빠른 발현을 유도하며 이는 4 시간째에 피크를 이룬다는 것을 지시한다 (도 7A, 모든 패널의 좌측 1-5 또는 1-6). 4-1BBL 유도의 시점은 4-1BBL 녹아웃 대식세포에서 손상된 지속적인 TNF 생성과 서로 연관이 있다 (도 3B). LPS-유도 4-1BBL 발현은 TLR4-, MyD88-, 및 TRIF-의존성인데, 그 이유는 상기 발현이 TLR4-/-, MyD88-/-, 및 TRIF-/- 대식세포에서 손상되기 때문이다 (도 7A). 4-1BBL 발현은 IL-1β 을 제외하고 모든 테스트된 TLR 리간드에 의해 유도되었다 (도 8A-F). 4-1BBL 은 합성 후에 번역 후 개질되는 것으로 보이는데 (아마도 글리코실화에 의해), 그 이유는 이동된 단백질 밴드가 SDS-PAGE 상에 나타났기 때문이다 (도 7A).

4-1BBL 을 암호화하는 유전자의 프로모터는 많은 NF-κB-결합 부위를 함유하 고, LPS-유도 4-1BBL mRNA 는 NF-κB 억제제 술파살라진 (도 7B) 또는 프로테아좀 억제제 MG-132 (데이타 나타나지 않음) 에 의해 효과적으로 억제되었다. p38 억제제 SB203580, Jnk 억제제 SP600125, 및 Mek 억제제 PD98059 는 또한, 4-1BBL 발현에 있어서 어느 정도 억제 효과를 가졌다 (도 7B). LPS-유도 4-1BBL mRNA (T_{1 /2} = 67 분) 는 비-자극된 대식세포에서 아데노바이러스 벡터에 의해 발현된 4-1BBL mRNA 보다 더욱 안정하였고 (T_{1 /2} = 33 분), 이는 mRNA 안정성에 있어서 LPS-유도 변경이 또한 LPS-유도 4-1BBL 발현에 관여하였음을 지시한다 (도 7C).

야생형 마우스의 LPS-처리 복막 대식세포에서의 4-1BBL 발현은 항-4-1BBL 항체를 사용하여 유세포분석에 의해 분석하였다. 아이소타입 항체를 대조군으로서 사용하였다. 0.1% 사포닌을 사용한 침투화를 사용하여 총 4-1BBL 을 측정하였다. 결과는, 대부분의 LPS-유도 4-1BBL 이 세포 표면 상에 위치함을 지시한다 (도 7D).

TNF 의 발현을 조절하기 위해 새로 합성된 4-1BBL 이 세포 표면 상에 있을 필요가 있는지 알아보기 위해, 복막 대식세포를 브레펠딘 A (3 μg/mL) 와 함께 또는 없이 1 시간 동안 예비인큐베이션한 다음, LPS 로 지시된 시간 동안 처리하였다. 항-4-1BBL 항체를 사용하여 면역염색을 하였다. 4-1BBL 및 TNF mRNA 를 준정량적 PCR 에 의해 분석하였다. GAPDH 를 대조군으로서 사용하였다. 브레펠딘 A 는 단백질이 소포체에서 골지체로 전위하는 것을 억제시킴으로써 단백질이 세포 표면으로 전위하는 것을 방지하는 특이적 억제제이다 (Klausner 등, J. Cell Biol. 1 16: 1071-1080 (1992)) (도 7E). 새로 합성된 4-1BBL 이 세포 표면으로 전위하는 것을 방지하는 것은 LPS-유도 4-1BBL mRNA 증가에 영향을 주지 않았다 (도 7F). 브레펠딘 A 처리는 1 시간 후 LPS-유도 TNF mRNA 에 영향을 미치지 못하였으나, 2, 4, 및 6 시간째에 TNF mRNA 를 감소시켰으며 (도 7F), 이는 4-1BBL 의 유도뿐만 아니라 세포 표면 위치화가 지속적인 TNF 생성에 필요함을 제시한다.

실시예 7 - 4-1 BBL 의 발현 및 가교는 TNF 생성을 유도한다.

4-1BBL 의 유도가 LPS-처리 대식세포에서의 지속적인 TNF 생성에 필요하기 때문에, 4-1BBL 의 과발현이 TNF 생성을 유도할 수 있는지 실험하였다. 4-1BBL 은 [Bukczynski 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 :1291-1296 (2004)] 에서 기술된 바와 같이 아데노바이러스-매개 유전자 전달에 의해 대식세포에서 발현되었다. 간략하게는, 아무것도 없음 (대조군) 또는 4-1BBL 을 암호화하는 상이한 투여량의 아데노바이러스로 대식세포를 감염시키고, 항-4-1BBL 항체를 사용한 면역블로팅에 의해 4-1BBL 의 발현을 측정하였다. 바이러스 감염 후 24 시간 째에 배지 내 TNF 수준을 측정하였다. 결과는, 4-1BBL 발현은 투여량-의존성 방식으로 TNF 생성을 유도하였다 (도 9A). TNF 유도는 4-1BBL 특이적이었는데, 대조군 바이러스로 감염된 세포의 배지 내에 검출가능한 TNF 가 없었기 때문이다. 4-1BBL-발현에 의한 TNF 유도는 4-1BB 를 필요로 하지 않았는데, TNF 생성이 4-1BBL 을 암호화하는 아데노바이러스로 감염된 4-1BB-결핍 및 야생형 대식세포에서 유사하였기 때문이다 (도 9B).

4-1BBL 과발현에 의해 매개되는 TNF 생성이 TLR4-, MyD88-, 및 TRIF-의존성인지 알아보기 위해, 야생형, TLR4-/- 및 TRIF-/- 대식세포를 대조군, 또는 4-1BBL 발현 바이러스로 감염시키고, 세포 내 4-1BBL 수준 및 배지 내 TNF 수준을 측정하였다. 결과는, 4-1BBL 발현에 의한 TNF 생성의 유도가 TLR4-/- 마우스로부터 단리된 대식세포에서 부분적으로 손상되었음을 지시하고 (도 9C), 이는 TLR4 외에도, 4-1BBL 과 상호작용할 수 있는 다른 TLR 이 또한 4-1BBL-매개 TNF 생성에 참여할 수 있음을 제시한다. 실제로, 4-1BBL 은 TLR2 및 다른 TLR 이 293T 세포에서 공동-발현되었을 때 이들과 상호작용하고 (도 6A), 4-1BBL 과발현에 의해 유도되는 TNF 생성은 TLR2-결핍 대식세포에서 감소하였다 (도 9D). 이는 다수의 TLR 이 4-1BBL-매개 TNF 생성에 참여한다는 해석을 지지한다. TLR 의 관여에도 불구하고, TRIF 결핍은 4-1BBL-유도 TNF 생성에 아무런 영향을 미치지 못하였다 (도 9E). MyD88 마우스에서 단리한 대식세포가 아데노바이러스에 의해 효율적으로 감염될 수 없기 때문에, 4-1BBL-유도 TNF 생성에 있어서 MyD88 의 요구는 또다른 방법에 의해 다루어져야 (addressed) 한다 (하기 참조).

4-1BBL 은 TNF 슈퍼패밀리 구성원이다 ([Watts, T.H., Annu. Rev. Immunol. 23:23-68 (2005)] 참조). 삼량체 형성이 그의 기능에 필요하다는 점은 상기 슈퍼패밀리 내 다른 구성원에게도 유사할 수 있다 ([Rabu 등, J. Biol. Chem. 280:41472-41481 (2005)] 참조). 이러한 가능성을 테스트하기 위해, 야생형 대식세포를 4-1BB-Fc 키메라 (4-1BB 의 이황화-연결된 단독이량체) 로, 항-Fc 항체로, 또는 4-1BB-Fc 와 항-Fc 로 함께 처리하고, 배지 내 TNF 수준을 측정하였다. 더욱 구체적으로, 대식세포를 염소 항-인간 Fc 항체 (항-Fc, 1.5 μg/mL) 로, 마우스 4-1BB-인간 Ig-Fc 도메인 융합 단백질 (4-1BB-Fc, 5 μg/mL) 로, 4-1BB-Fc 및 항-Fc 로 함께, 또는 비처리 배양 배지로 처리하였다. 배지 내 TNF 수준을 24 시간 후에 측정하였다. 결과는, 4-1BB-Fc 가 2 개의 4-1BBL 분자를 가교할 수있으나, 그것이 TNF 생성을 유도하지는 않았음을 지시한다 (도 9F). 4-1BB-Fc 가 항-Fc 항체와 추가로 가교되는 것이 TNF 생성을 유도하였으며, 한편 항-Fc 항체 단독으로는 어떠한 효과를 가지지 못하였다 (도 9F). 2 개 초과의 4-1BBL 분자의 가교가 TNF 생성을 유도하는데 필요한 것으로 보인다. 가교 유도 TNF 생성에서의 4-1BBL 의 필요성은 4-1BBL KO 세포를 사용하여 확인하였다 (도 9F).

4-1BBL 신호화가 MyD88 및 TRIF 를 필요로 하는지 알아보기 위해, MyD88-/- 및 TRIF-/- 대식세포를 4-1BB-Fc, 항-Fc 항체, 및 4-1BB-Fc 와 항-Fc 항체 둘 다로 처리하고, 배지 내 TNF 수준을 측정하였다. 결과는, 4-1BBL 이교-매개 TNF 생성이 MyD88- 및 TRIF-독립적임을 지시하였다 (도 9F). 반대로, 4-1BBL 이교에 의해 유도된 TNF 생성은 야생형 대식세포에서와 비교해, TLR2-결핍 및 TLR4-결핍 대식세포에서 통계적으로 유의한 경계 (margin) 만큼 감소되었다 (도 9F).

이들 데이타에 대한 해석 중 하나는 4-1BBL 의 세포 표면 상에서의 발현 및 후속한 올리고머화가 MyD88- 및 TRIF-독립적 TNF 생성을 유도한다는 것이다. TLR4 및 다른 TLR 이 4-1BBL 과 상호작용하기 때문에 (도 1A, 1B, 1D 및 6A), 그리고 TLR 이 이량체를 형서하기 때문에 ([Medzhitov 등, Nature 388:394-397 (1997)] 참조), 4-1BBL 과발현에 의해 매개되는 TNF 생성에 있어서 TLR4 의 부분적인 의존 성 (도 9C) 은 4-1BBL-TLR4 상호작용에 의한 것이고, 이는 4-1BBL 의 가교에 기여하는 것이 가능하다. 이는 4-1BBL 과발현-매개 TNF 생성이 TLR4 또는 TLR2 의 소실에 의해 부분적으로 억제된다는 발견에 의해 지지된다 (도 9C ~ F).

4-1BB-Fc 및 항-4-1BBL 만이 2 개의 4-1BBL 분자에 결합하고, 4-1BBL 과의 결합이 4-1BBL 올리고머화를 억제하거나 또는 4-1BBL 이 TLR 과 같은 다른 분자와상호작용하는 것을 방지할 것이기 때문에, 이들을 사용하여 상기 가정을 테스트하였다. 하기와 같이, 4-1BB-Fc 또는 항-4-1BBL 항체의 존재 하에 LPS 로 대식세포를 자극시켰다. 대식세포를 LPS, 4-1BB-Fc + LPS, 0, 2, 또는 5 μg/mL 항-4-1BBL 항체 + LPS, 또는 비처리 배양 배지와 함께 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 결과는, 4-1BB-Fc 및 항-4-1BBL 항체 둘 다 LPS-유도 TNF 생성을 억제시켰음을 지시한다 (도 9G).

4-1BBL 이 많은 TLR 리간드에 의해 유도되었기 때문에 (도 8A ~ F), TLR2 리간드 (Pam3), TLR3 리간드 (폴리I:C), TLR4 리간드 (LPS), TLR7,8 리간드 (R848) 및 TLR9 리간드 (CpG) 로 자극받은 4-1BBL-결핍 대식세포에 의한 TNF 생성을 시험하였다. TNF 생성의 감소가 관찰되었다 (도 6B). 이들 데이타는 상이한 TLR 에 의해 매개되는 TNF 생성에 있어서 4-1BBL 이 관여함을 지시한다. TLR9 와 같이, 엔도좀 또는 소포체 (ER) 에 위치한 TLR 은 원형질막에 위치한 4-1BBL 과 상호작용하지 않기 때문에, TLR9-유도 4-1BBL 의 신호화는 세포 표면 상의 다른 TLR 과 4-1BBL 과의 상호작용에 의존할 수 있다. 이는, 낮은 투여량의 CpG (1 μg/mL) 를 사용하였을 때, TLR4 결핍 대식세포에서 TLR9-유도 TNF 생성이 작지만 통계적으로 유의하게 감소된 것이 검출된 것과 일치한다 (도 6C ~ D). 그러나, 4-1BBL 과 세포 표면 TLR 간의 상호작용 이외의 기작(들) 은 4-1BBL 신호화에 관여할 수 있는데, 그 이유는 세포가 높은 투여량의 CpG 로 자극받았을 때 TLR4-소실에 의한 감소가 유의하지 않았기 때문이다.

실시예 8 - 2 개의 연속적인 TLR4 복합체

4-1BBL 유도가 TLR/MyD88/TRIF 경로에 의존하고, 4-1BBL-매개 신호화가 MyD88 및 TRIF 에 독립적이나 TLR 과의 상호작용과 연결되어 있기 때문에, LPS-처리 대식세포에서 연속적인 TLR4 신호화 복합체가 있는지를 하기와 같이 실험하였다. 대식세포를 LPS 로 0.5, 1 , 2, 4, 8 및 12 시간 동안 처리하였다. 총 세포 파쇄물을 (1) 항-4-1BBL, 항-TLR4, 및 항-MyD88 로 면역블로팅 ; (2) 항-TLR4 항체로 면역침전시킨 다음 항-TLR4, 항-4-1BBL, 및 항-MyD88 로 면역블로팅 ; (3) 항-MyD88 항체로 면역침전시킨 다음 항-MyD88, 항-TLR4, 및 항-4-1BBL 로 면역블로팅 ; 또는 (4) 항-4-1BBL 로 면역침전시킨 다음 항-4-1BBL, 항-TLR4, 및 항-MyD88 로 면역블로팅하였다. 아이소타입 항체를 모든 면역침전에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다. 4-1BBL 또는 MyD88 에 대한 면역블로팅을 위한 양성 대조군은 지시된 상자에 나타내었다. 결과는, LPS 가 2 내지 8 시간의 노출 시간 사이에 4-1BBL 발현을 유도하였으나, TLR4 또는 MyD88 의 단백질 수준에는 영향을 미치지 못하였음을 지시한다 (도 1OA, 세포 파쇄물). TLR4 는 30 분 내지 1 시간의 LPS 노출 시간 사이에 MyD88 과 연관있었으나, 이후에는 연관이 없었고, 한편, 2 내지 12 시간의 LPS 노출 시간 사이에 TLR4-4-1BBL 복합체가 나타났다 (도 1OA, IP:TLR4). TLR4-MyD88 복합체는 MyD88 의 면역침전에 의해 확인되었다 (도 1OA, IP: MyD88). MyD88 은 4-1BBL 을 감쇠시킬 수 (pull down) 없었는데, 이는 MyD88 및 4-1BBL 이 동일한 TLR4 복합체에 있지 않음을 지시한다. 4-1BBL 의 면역침전은 2 ~ 12 시간의 LPS-처리 세포에서 TLR4 를 감쇠시켰으나, MyD88 을 감쇠시킬 수는 없었고, 이는 MyD88 및 4-1BBL 이 동일한 복합체에 있지 않음을 지시한다 (도 1OA, IP: 4-1BBL). 따라서, LPS-처리 대식세포 내 2 개의 연속적인 TLR4 복합체가 있으며, 하나는 초기 세포성 반응을 책임지는 MyD88 복합체이고, 두번째 복합체는 지속적인 TNF 생성에 관여하는 4-1BBL-TLR4 복합체이다.

MyD88 이 4-1BBL 과 상호작용할 수 없음을 확인하기 위해, AU1-태깅된 MyD88 을 하기와 같이 flag-4-1BBL 또는 flag-TLR4 를 사용해 과발현시켰다. 293T 세포를 flag-4-1BBL 또는 flag-TLR4 발현 벡터와 함께 MyD88-AU1 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24 시간째에 세포를 파쇄하고, 세포 파쇄물을 항-AU1 항체를 사용해 면역침전시키고, 이어서 항-flag 및 항AU1 항체를 사용해 면역블로팅하였다. 결과는, flag-4-1BBL 이 아닌 Flag-TLR4 가 MyD88 에 의해 감쇠되었음을 지시한다 (도 10B).

4-1BBL 과 상호작용하는 단백질을 찾기 위해, 4-1BBL 과 TRAF2 및 TRAF6 와의 상호작용을 하기와 같이 실험하였다. 293T 세포를 TRAF2-myc 또는 TRAF6-myc 발현 벡터와 함께 HA-4-1BBL 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다. 세포 파쇄물을 항-HA 항체를 사용해 면역침전시키고, 항-myc 및 항-HA 항체를 사용해 면역블로팅하였다. 결과는, 4-1BBL 이 TRAF2 가 아닌 TRAF6 와 상호작용함을 지시한다 (도 10C).

4-1BBL 과 TRAF6 간의 상호작용 때문에, TRAF6 가 4-1BBL-매개 TNF 생성에 필요한지 시험하였다. SiRNA 를 사용하여 하기와 같이 RAW264.7 대식세포에서 TRAF6 을 녹다운시켰다. TRAF6-siRNA#1 또는 #2, 또는 대조군 siRNA (C) 를 사용하여 대식세포를 트랜스펙션시키고, TRAF6 단백질 수준을 TRAF6 에 대한 면역블로팅에 의해 분석하였다. 대조군 siRNA-, TRAF6-siRNA#1- 또는 TRAF6-siRNA#2-트랜스펙션 세포에서의 TNF 생성 수준을, 항-Fc, 4-1BB-Fc, 4-1BB-Fc 및 항-Fc 와 함께, LPS, 폴리I:C (25 μg/mL), IL-1β (10 ng/mL), 또는 비처리 배양 배지로 인큐베이션한 후 24 시간째에 측정하였다. 세포를 배지, LPS, 또는 TNF (10 ng/mL) 로 처리하였을 때, IL-6 수준을 측정하였다. siRNA 둘 다 RAW264.7 세포에서 TRAF6 단백질 수준을 효과적으로 감소시켰다 (도 10D). TRAF6 녹다운 및 대조군 세포를 4-1BB-Fc 로, 항-Fc 항체로, 또는 4-1BB-Fc 와 항-Fc 항체로 함께 처리하고, 배지 내 TNF 수준을 측정하였다. TRAF6 를 녹다운시키는 것은 4-1BBL 이교-매개 TNF 생성을 방지하였다 (도 10D). 예상된 바와 같이, TRAF6 의 녹다운은 LPS, 폴리I:C, 및 IL-1β 유도 사이토카인 생성에 손상을 주었으나, TNF-유도 IL-6 생성에는 아무런 영향을 주지 못하였다 (도 10D).

4-1BBL 에 의해 유도되는 하류 사건을 밝히기 위해, 전사 인자 활성화를 시험하였다. 4-1BBL 의 발현은 NF-κB 가 아닌 CREB 및 C/EBP 를 활성화시켰고 (도 10E), 이는 4-1BBL 소실이 LPS-유도 NF-κB 활성화에 아무런 영향을 미치지 못하였으나 CREB 및 C/EBP 활성화에 손상을 주었다는 관찰과 일치한다 (도 3F). 유사하게는, IκBα 분해가 4-1BBL 을 과발현하는 세포에서 관찰되지 않았다 (도 10F). 4-1BBL 의 발현은 p38, Jnk, 및 Erk 의 어느 정도의 인산화를 유도하였고 (도 10F), p38, Jnk, 및 Erk (NF-κB 는 아님) 의 억제는 4-1BBL-매개 TNF 생성을 감소시켰으며 (도 10G), 이는 MAP 키나아제 경로가 4-1BBL-매개 TNF 생성에 관여함을 제시한다. 4-1BBL 신호화 경로는 TnfmRNA 에 영향을 미치는 것으로 보였는데, 그 이유는 4-1BBL 소실이 후기 시간에서 LPS-유도 TnfmRNA 전사를 감소시키고 (도 3E), 4-1BBL 과발현이 TnfmRNA 양을 증가시켰기 때문이다 (도 10H). 4-1BBL 을 과발현하는 세포 및 LPS 로 처리한 세포에서 TnfmRNA 의 반감기를 비교하였고 ; Tnf 전사체가 유사한 반감기를 나타내었다 (도 10H). LPS 는 TnfmRNA 를 안정화시키는 것으로 알려져 있고, 4-1BBL 소실은 LPS-유도 TnfmRNA 의 안정성을 감소시켰으며 (도 3F), 4-1BBL 은 LPS-유도 TnfmRNA 안정화의 매개자인 것으로 보였다. 종합하면, 본원에서 기술된 데이타는, 대식세포에서의 TNF 발현의 초기 활성화 및 지속적인 TNF 생성이 초기 및 후기 신호화 경로에 의해 조절됨을 보여준다 (도 10H).

전염증성 사이토카인의 발현은 유전화 활성화 및 비활성화 기작에 의해 엄격하게 조절된다. 본원에서 기술된 연구는 TNF 발현의 초기 활성화 및 지속적인 TNF 생성이 초기 및 후기 신호화 경로에 의해 조절됨을 보여준다 (도 10I). 잘-알려진 신호 경로인 TLR4/MyD88/TRIF 는 염증 유전자의 발현 개시 및 초기 발현을 책임진다. 4-1BBL 은 초기에 유도되는 단백질 중의 하나이고, 세포 활성화의 초기에만 유도된다. 새로 합성된 4-1BBL 은 세포 표면 상에 전위되어, 지속적 인 TNF 생성을 위한 신호화의 새로운 기 (phase) 를 일으킨다. 4-1BBL 과 TLR 과의 상호작용은 제 2 기 신호화의 발생에 관여하고, 연속한 신호화 복합체에서의 TLR 의 기능은 대부분 4-1BBL 의 올리고머화를 돕는 것인 것 같다. 4-1BBL 복합체의 신호화 기작은 초기 TLR4 신호화 기작과는 상이한데, 그 이유는 MyD88 및 TRIF 와는 독립적이기 때문이다. 그러나, 상기 신호화의 두 가지 기 (phase) 모두는 TRAF6 를 필요로 한다.

염증 사이토카인의 생성은 염증 과정의 일부로서, 초기 기간, 및 염증이 삭아 없어지는 것이 유도되는 경우 보통 끝나게 되는 지속 기간을 특징으로 한다 ([Triantafilou and Triantafilou, Trends Immunol. 23:301-304 (2002)] 참조). 종종, 지속적인 염증 반응의 종료 시에 염증 조절이 실패되기도 하고, TNF 생성이 연장되어 지속되는 것이 많은 염증 질환의 병리학과 종종 연관되기도 한다 ([ Vassalli, P., Annu. Rev. Immunol. 10:41 1-452 (1992)] 참조). 따라서, 지속적인 TNF 생성에 있어서 주요 조절자로서 4-1BBL 을 규명하는 것은 염증 질환에 대한 새로운 개입의 개발을 위한 새로운 치료 표적을 제공한다.

실시예 9 - 4-1 BBL 은 IL -6 유도에 있어서 역할을 한다.

IL-6 는 염증에 관여하는 사이토카인이다. 증가된 IL-6 발현은 류마티스 관절염 (RA), 전신적으로 발병된 유년성 만성 관절염 (JCA), 골다공증, 및 건선을 포함한 다수의 질환 진행의 병리학에 관여한다. 4-1BBL 이 IL-6 유도에 참여한다는 것을 보여주기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 우선, 4-1BBL-/- 및 야생형 마우스에 0.5 mg 의 LPS 를 복강 내 주사하였다. 다음, 0, 2 및 6 시간째에 혈청을 수합하고, IL-6 수준을 측정하였다. 결과는, 4-1BBL-/- 마우스가 야생형 마우스보다 LPS 에 반응하여 IL-6 를 유의하게 적게 생성함을 지시하였다 (도 11A). 4-1BBL-/- 및 야생형 마우스의 복막 대식세포를 LPS (100 ng/mL) 로 처리하고, 배양 배지 내 IL-6 의 수준을 3, 9 및 18 시간째에 시험하였을 때, 그 결과, 야생형 마우스의 대식세포가 4-1BBL-/- 마우스의 대식세포보다 유의하게 더 많은 IL-6 를 생성함을 확인하였다 (도 11B). 이들 결과를, 야생형 및 4-1BBL-/- 대식세포를 Pam3 (1 μg/mL), 폴리I:C (25 μg/mL), LPS (100 ng/mL), R848 (100 nM), CpG (5 μg/mL), IL-1β (10 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL), 또는 비처리 배양 배지 (주입물 없음) 로 처리한 후 24 시간째의 IL-6 생성 수준과 비교하였다. Pam3, 폴리I:C, LPS, R848, 및 CpG 로 처리한 야생형 대식세포는 4-1BBL-/- 대식세포보다 유의하게 더 많은 IL-6 를 생성하였다 (도 11C). 대조적으로, 야생형 및 4-1BBL-/- 대식세포에 의한 IL-6 생성의 수준은 유사하였다.

대식세포를 LPS, LPS + 4-1BB-Fc, LPS + 0, 2, 또는 5 μg/mL 항-4-1BBL 항체, 또는 비처리 배양 배지와 함께 24 시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 배지 내 IL-6 수준을 측정하였을 때, 그 결과, LPS 및 4-1BB-Fc 와 함께 인큐베이션한 대식세포가 LPS 로만 인큐베이션한 대식세포보다 유의하게 더 적은 IL-6 를 생성한 것으로 나타났다 (도 11D). LPS 및 증가하는 농도의 항-4-1BBL 항체와 함께 인큐베이션한 대식세포 또한 감소하는 수준의 IL-6 생성을 나타내었다 (도 11D).

IL-6 생성에 있어서 4-1BBL 의 역할을 확인하기 위해, RAW 264.7 세포를 대조군 siRNA, 또는 4-1BBL-siRNA#1 또는 #2 를 함유하는 p억제자로 안정하게 트랜스 펙션시켰다. LPS 로 3, 9 및 24 시간 동안 처리한 4-1BBL 녹다운 세포에서의 IL-6 생성을 측정하고, 대조군 세포의 것과 비교하였다. 결과는, 4-1BBL 발현이 녹다운된 RAW264.7 세포가 대조군 siRNA 로 트랜스펙션된 RAW264.7 세포보다 유의하게 더 적은 IL-6 를 생성함을 지시하였다 (도 11E). 이들 결과는 펩티도글리칸 (PG, 10 μg/mL), 폴리I:C (25 μg/mL), LPS (100 ng/mL), CpG (5 μg/mL), 또는 비처리 배양 배지 (주입물 없음) 로 24 시간 동안 처리한 대조군 및 4-1BBL 녹다운 세포에서 보여진 결과와 일치하였다 (도 11F).

언급된 문서

기타 구현예

본원에서 참조 또는 언급된 모든 특허 및 공개물은 본 발명이 속한 당업자의 기술 수준을 가리키는 지표이고, 각각의 그러한 참조된 특허 또는 공개물은 그 전체가 개별적으로 참조로써 삽입되었거나 또는 그 전체가 본원에 나타낸 바와 동일한 범위로 참조로써 본원에 삽입된다. 출원인은 상기 언급된 특허 또는 공개물의 임의의 그리고 모든 물질 및 정보를 본 명세서에 물리적으로 삽입할 권리를 보존한다.

본원에 기술된 구체적인 방법 및 조성물은 바람직한 구현예의 대표적인 것이고, 실례를 드는 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 다른 목적, 측면 및 구현예가 본 명세서의 고려 하에 당업자에게 일어날 것이고, 청구항의 범주에 의해 정의된 본 발명의 취지 내에 포함된다. 당업자는 치환 및 개질을 다양하게 하는 것이 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 본원에 공개된 본 발명에 행할 수 있음을 쉽게 알게 될 것이다. 본원에서 예시적으로 기술된 본 발명은 적합하게는 임의의 원소(들) 또는 제한(들) 의 부재 하에, 수행될 수 있으며, 본질적으로 본원에서 구체적으로 공개되지는 않는다. 본원에서 예시적으로 기술된 방법 및 과정은 적합하게는 단계의 순서를 달리해서 수행될 수 있고, 본원 또는 청구항에서 지시된 단계의 순서에 본질적으로 제한되지는 않는다. 본원 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 달리 명확하게 지시되지 않는 한 복수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항체" 는 그러한 항체의 다수 (예를 들어, 항체 용액 또는 일련의 항체 제제) 를 포함한다. 어떠한 경우에도, 본 특허가 구체적으로 본원에 개시된 구체적 실시예 또는 구현예 또는 방법에 제한을 두는 것으로 해석될 수 없다. 어떠한 경우에도, 특허 및 상표의 실험자 또는 다른 사무 또는 고용자에 의한 언급 (이러한 언급이 출원인에 의한 응답에 표현적으로 채택된 품질 또는 보존이 없고 구체적이지 않는 한) 에 의해 해석되는 특허 언어가 제한될 수 없다.

사용된 용어 및 표현은 설명을 위해 사용된 것이고 제한을 두려는 것은 아니며, 그러한 용어 및 표현을 사용하는데 있어서 보여지고 기술된 특징 또는 그의 일 부에 상응하는 것을 배제하려는 의도는 없으나, 다양한 변형이 청구된 바와 같은 본 발명의 범주 내에서 가능함을 인지한다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구현예 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시되었다 하더라도, 본 발명자는 본원에서 개시된 개념에 관한 변형 및 변화를 줄 수 있고, 그러한 변형 및 변화는 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 내에 있는 것임을 이해하게 될 것이다.

본 발명은 본원에서 광범위하고 일반적으로 기술되었다. 일반 공개물 내에 속하는 더 좁은 종 및 하위유전적 그룹의 각각은 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 삭제된 물질이 본원에서 구체적으로 언급되는지의 여부와는 상관없이, 속 (genus) 의 개체를 삭제하는 단서 또는 부정적인 제한과 함께, 본 발명의 일반적인 상세한 설명을 포함한다.

다른 구현예는 하기 청구항 내에 있다. 또한, 본 발명의 특징 또는 측면은 마쿠시 군 (Markush group) 으로 기재되고, 당업자는 본 발명이 마쿠시 군의 또한 개별 구성원 또는 구성원의 하위군으로 기술되기도 한다는 것을 알게 될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> The Scripps Research Institute Kang, Young Jun Han, Jiahuai <120> 4-1 BB LIGAND IN INFLAMMATORY DISEASES <130> 1361.078WO1 <140> Unknown <141> 2007-10-16 <150> 60/852,022 <151> 2006-10-16 <150> 60/917,561 <151> 2007-05-11 <160> 60 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 309 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Asp Gln His Thr Leu Asp Val Glu Asp Thr Ala Asp Ala Arg His 1 5 10 15 Pro Ala Gly Thr Ser Cys Pro Ser Asp Ala Ala Leu Leu Arg Asp Thr 20 25 30 Gly Leu Leu Ala Asp Ala Ala Leu Leu Ser Asp Thr Val Arg Pro Thr 35 40 45 Asn Ala Ala Leu Pro Thr Asp Ala Ala Tyr Pro Ala Val Asn Val Arg 50 55 60 Asp Arg Glu Ala Ala Trp Pro Pro Ala Leu Asn Phe Cys Ser Arg His 65 70 75 80 Pro Lys Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Ile Ala 85 90 95 Ala Cys Val Pro Ile Phe Thr Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr 100 105 110 Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln 115 120 125 Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln 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110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 7 <211> 163 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys 1 5 10 15 Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile 20 25 30 Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe 35 40 45 Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser 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90 95 Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg 100 105 110 Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly 115 120 125 Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser 130 135 140 Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly 145 150 155 160 His Ser Pro <210> 9 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 9 uucaagaga 9 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 10 aagacggcgc aggcggcagc g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 11 aagaggccgg cgggatcgtc g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 12 atagtagact ccagccttgg c 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 13 attccgacct cggtgaaggg 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 14 gctctatggc ctagtcgct 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 15 gcaaagcctc aggtagatg 19 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 16 acctgtagct tgggaacatt t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 17 aatacaatcc agtctgcaag a 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 18 ggaucaucaa guacauugut t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 19 gggcuacgau guggaguuut t 21 <210> 20 <211> 186 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln 20 25 30 Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro 35 40 45 Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys 50 55 60 Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr 65 70 75 80 His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro 85 90 95 Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr 100 105 110 Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn 115 120 125 Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg 130 135 140 Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu 165 170 175 Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val 180 185 <210> 21 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro 180 185 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 22 aagaggccgg cgggaucguc g 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 23 auaguagacu ccagccuugg c 21 <210> 24 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 24 auuccgaccu cggugaaggg 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 25 cgctgccgcc tgcgccgtct t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 26 cgacgatccc gccggcctct t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 27 gccaaggctg gagtctacta t 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 28 cccttcaccg aggtcggaat 20 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 29 cgcugccgcc ugcgccgucu u 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 30 cgacgauccc gccggccucu u 21 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 31 gccaaggcug gagucuacua u 21 <210> 32 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 32 cccuucaccg aggucggaau 20 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 33 gcucuauggc cuagucgcu 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 34 gcaaagccuc agguagaug 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 35 agcgactagg ccatagagc 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 36 catctacctg aggctttgc 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 37 agcgacuagg ccauagagc 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 38 caucuaccug aggcuuugc 19 <210> 39 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 39 accuguagcu ugggaacauu u 21 <210> 40 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 40 aauacaaucc agucugcaag 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 41 aaatgttccc aagctacagg t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 42 tcttgcagac tggattgtat t 21 <210> 43 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 43 aaauguuccc aagcuacagg u 21 <210> 44 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 44 ucuugcagac uggauuguau u 21 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 45 aagacggcgc aggcggcagc gtt 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 46 aagaggccgg cgggaucguc gtt 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 47 auaguagacu ccagccuugg ctt 23 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 48 auuccgaccu cggugaaggg tt 22 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 49 cgcugccgcc ugcgccgucu utt 23 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 50 cgacgauccc gccggccucu utt 23 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 51 gccaaggcug gagucuacua utt 23 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 52 cccuucaccg aggucggaau tt 22 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 53 gcucuauggc cuagucgcut t 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 54 gcaaagccuc agguagaugt t 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 55 agcgacuagg ccauagagct t 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 56 caucuaccug aggcuuugct t 21 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 57 accuguagcu ugggaacauu utt 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 58 aauacaaucc agucugcaag att 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 59 aaauguuccc aagcuacagg utt 23 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <223> A combined DNA/RNA <400> 60 ucuugcagac uggauuguau utt 23

Claims (62)

1. 4-1BBL 차단제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물로서, 여기서, 4-1BBL 차단제가 (a) 4-1BBL 에 특이적인 안타고니스트성 항체 ; (b) 세포 내에서 4-1BBL 핵산의 발현을 감소시키기에 효과적인 올리고뉴클레오타이드 ; 및 (c) 용해성 4-1BB 로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 안타고니스트성 항체가 4-1BBL 에 특이적인 키메라성 또는 인간화된 항체인 약학적 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 4-1BBL 이 SEQ ID NO: 1 또는 2 로 나타낸 서열을 갖는 약학적 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 SEQ ID NO: 10 ~ 15, 22 ~ 38, 및 45 ~ 56 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 약학적 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 (a) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 186 ; (b) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 23 내지 아미노산 186 ; (c) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 187 ; 또는 (d) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 24 내지 아미노산 187 에 상응하는 서열을 갖는 약학적 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 SEQ ID NO: 7, 8, 20 또는 21 로 나타낸 서열을 갖는 약학적 조성물.
7. 담체, 제 1 항의 4-1BBL 차단제, 및 항염증 약물인 제 2 약제를 포함하는 약학적 조합물.
8. 제 7 항에 있어서, 항염증 약물이 종양 괴사 인자에 특이적인 항체인 약학적 조합물.
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 안타고니스트성 항체가 4-1BBL 에 특이적인 키메라성 또는 인간화된 항체인 약학적 조합물.
10. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 4-1BBL 이 SEQ ID NO: 1 또는 2 로 나타낸 서열을 갖는 약학적 조성물.
11. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 SEQ ID NO: 10 ~ 15, 22 ~ 38, 및 45 ~ 56 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 약학적 조성물.
12. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 (a) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 186 ; (b) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 23 내지 아미노산 186 ; (c) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 187 ; 또는 (d) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 24 내지 아미노산 187 에 상응하는 서열을 갖는 약학적 조성물.
13. 제 12 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 SEQ ID NO: 7 ~ 8 및 20 ~ 21 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 약학적 조성물.
14. 4-1BBL 에 특이적인 키메라성 또는 인간화된 항체.
15. 제 14 항에 있어서, SEQ ID NO: 1 또는 2 를 포함하는 4-1BBL 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체.
16. SEQ ID NO: 10 ~ 15, 22 ~ 38, 및 45 ~ 56 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 4-1BBL 차단제.
17. (a) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 186 ; (b) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 23 내지 아미노산 186 ; (c) 마우스 4-1BB 폴리펩 타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 187 ; 또는 (d) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 24 내지 아미노산 187 에 상응하는 서열을 갖는 용해성 4-1BB.
18. 제 17 항에 있어서, SEQ ID NO: 7, 8, 20 또는 21 의 서열을 갖는 용해성 4-1BB.
19. 4-1BBL 차단제를 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 염증 사이토카인의 생성을 감소시키는 방법으로서, 여기서, 4-1BBL 차단제가 (a) 4-1BBL 에 특이적인 안타고니스트성 항체 ; (b) 세포에서 4-1BBL 핵산의 발현을 감소시키기에 효과적인 올리고뉴클레오타이드 ; 및 (c) 용해성 4-1BB 로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 4-1BBL 차단제를 투여하기 전에, 염증 상태를 앓고 있거나 또는 앓을 위험이 있는 포유류를 규명하는 것을 추가로 포함하는 방법.
21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 염증 사이토카인이 종양 괴사 인자 또는 IL-6 인 방법.
22. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
23. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 안타고니스트성 항체가 4-1BBL 에 특이적인 키메라성 또는 인간화된 항체인 방법.
24. 제 19 항, 제 20 항 또는 제 23 항에 있어서, 4-1BBL 이 SEQ ID NO: 1 또는 2 의 서열을 갖는 방법.
25. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 4-1BBL 차단제가 SEQ ID NO: 10 ~ 15, 22 ~ 38, 및 45 ~ 56 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 방법.
26. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 (a) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 186 ; (b) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 23 내지 아미노산 186 ; (c) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 187 ; 또는 (d) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 24 내지 아미노산 187 에 상응하는 서열을 갖는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 SEQ ID NO: 7, 8, 20 또는 21 의 서열을 갖는 방법.
28. 포유류 세포를 4-1BBL 차단제와 접촉시키는 것을 포함하는, 포유류 세포에 의한 염증 사이토카인의 생성을 감소시키는 방법으로서, 여기서, 4-1BBL 차단제가 (a) 4-1BBL 에 특이적인 안타고니스트성 항체 ; (b) 세포에서 4-1BBL 핵산의 발현을 감소시키기에 효과적인 올리고뉴클레오타이드 ; 및 (c) 용해성 4-1BB 로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
29. 제 28 항에 있어서, 염증 사이토카인이 종양 괴사 인자 또는 IL-6 인 방법.
30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
31. 제 28 항, 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 안타고니스트성 항체가 4-1BBL 에 특이적인 키메라성 또는 인간화된 항체인 방법.
32. 제 28 항, 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 4-1BBL 이 SEQ ID NO: 1 또는 2 의 서열을 갖는 방법.
33. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 4-1BBL 차단제가 SEQ ID NO: 10 ~ 15, 22 ~ 38, 및 45 ~ 56 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 방법.
34. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 (a) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 186 ; (b) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 23 내지 아미노산 186 ; (c) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아 미노산 187 ; 또는 (d) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 24 내지 아미노산 187 에 상응하는 서열을 갖는 방법.
35. 제 34 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 SEQ ID NO: 7, 8, 20 또는 21 의 서열을 갖는 방법.
36. 4-1BBL 차단제를 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 염증을 감소시키는 방법으로서, 4-1BBL 차단제가 (a) 4-1BBL 에 특이적인 안타고니스트성 항체 ; (b) 세포에서 4-1BBL 핵산의 발현을 감소시키기에 효과적인 올리고뉴클레오타이드 ; 및 (c) 용해성 4-1BB 로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
37. 제 36 항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
38. 제 36 항에 있어서, 염증이 류마티스 관절염, 유년성 류마티스 관절염, 건선 관절염, 건선, 강직성 척추염, 크론병, 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 유년성 만성 관절염, 골다공증, 또는 과민성 장 증후군과 연관있거나 또는 이로부터 생기는 방법.
39. 제 36 항에 있어서, 4-1BBL 이 SEQ ID NO: 1 또는 2 의 서열을 갖는 방법.
40. 제 36 항에 있어서, 안타고니스트성 항체가 4-1BBL 에 특이적인 키메라성 또는 인간화된 항체인 방법.
41. 제 36 항에 있어서, 4-1BBL 차단제가 SEQ ID NO: 10 ~ 15, 22 ~ 38, 및 45 ~ 56 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 방법.
42. 제 36 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 (a) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 186 ; (b) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 23 내지 아미노산 186 ; (c) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 187 ; 또는 (d) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 24 내지 아미노산 187 에 상응하는 서열을 갖는 방법.
43. 제 42 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 SEQ ID NO: 7, 8, 20 또는 21 의 서열을 갖는 방법.
44. 4-1BBL 차단제를 함유하는 용기, 및 염증 사이토카인의 생성을 감소시키는 4-1BBL 차단제의 사용 지침을 포함하는 제조 물품으로서, 여기서, 4-1BBL 차단제가 (a) 4-1BBL 에 특이적인 안타고니스트성 항체 ; (b) 세포에서 4-1BBL 핵산의 발현을 감소시키기에 효과적인 올리고뉴클레오타이드 ; 및 (c) 용해성 4-1BB 로 이루어진 군으로부터 선택되는 물품.
45. 제 44 항에 있어서, 4-1BBL 차단제의 사용 지침이 염증 상태의 치료에 있어서의 4-1BBL 차단제의 사용 지침을 포함하는 물품.
46. 제 45 항에 있어서, 염증 상태가 류마티스 관절염, 유년성 류마티스 관절염, 건선 관절염, 건선, 강직성 척추염, 크론병, 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 유년성 만성 관절염, 골다공증, 또는 과민성 장 증후군인 물품.
47. 제 44 항, 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 염증 사이토카인이 종양 괴사 인자 또는 IL-6 인 물품.
48. 제 44 항, 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 4-1BBL 이 SEQ ID NO: 1 또는 2 의 서열을 갖는 물품.
49. 제 44 항, 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 안타고니스트성 항체가 4-1BBL 에 특이적인 키메라성 또는 인간화된 항체인 물품.
50. 제 44 항, 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 4-1BBL 차단제가 SEQ ID NO: 10 ~ 15, 22 ~ 38, 및 45 ~ 56 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 물품.
51. 제 44 항, 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 (a) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 186 ; (b) 인간 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 23 내지 아미노산 186 ; (c) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 아미노산 187 ; 또는 (d) 마우스 4-1BB 폴리펩타이드의 아미노산 24 내지 아미노산 187 에 상응하는 서열을 갖는 물품.
52. 제 44 항, 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 용해성 4-1BB 가 SEQ ID NO: 7, 8, 20 또는 21 의 서열을 갖는 방법.
53. 하기 단계를 포함하는, 4-1BBL 차단제의 스크리닝 방법 :

    (a) 4-1BBL 발현 세포를 후보 제제와 접촉시키는 단계 ; 및

    (b) 상기 후보 제제가 염증 사이토카인의 생성을 감소시키는지, 또는 후보 제제가 4-1BBL 올리고머화를 방지하는지를 측정하는 단계로서, 여기서, 상기 후보 제제가 염증 사이토카인의 생성을 감소시키거나 또는 4-1BBL 올리고머화를 방지한다면 그것이 4-1BBL 차단제임.
54. 제 53 항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
55. 제 53 항에 있어서, 세포가 대식세포인 방법.
56. 제 55 항에 있어서, 세포가 RAW264.7 세포인 방법.
57. 하기 단계를 포함하는, 4-1BBL 차단제의 검사 방법 :

    (a) 포유류에 후보 제제를 투여하는 단계 ; 및

    (b) 상기 후보 제제가 염증을 감소시키거나 또는 염증 사이토카인의 생성을 감소시키는지 측정하는 단계로서, 여기서, 상기 후보 제제가 포유류에서 염증을 감소시키거나 또는 염증 사이토카인의 생성을 감소시킨다면 그것이 4-1BBL 차단제인 방법.
58. 제 57 항에 있어서, 염증이 류마티스 관절염, 유년성 류마티스 관절염, 건선 관절염, 건선, 강직성 척추염, 크론병, 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 유년성 만성 관절염, 골다공증, 또는 과민성 장 증후군과 연관있거나 또는 이로부터 생기는 방법.
59. 제 53 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 염증 사이토카인이 종양 괴사 인자 또는 IL-6 인 방법.
60. 제 53 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 염증 사이토카인의 생성이 20%, 25%, 30% 또는 30% 초과 감소되는 방법.
61. 제 53 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 4-1BBL 이 SEQ ID NO: 1 또는 2 의 서열을 갖는 방법.
62. 제 57 항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.

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