CN102094076A

CN102094076A - 沙眼衣原体感染定量检测荧光pcr试剂盒

Info

Publication number: CN102094076A
Application number: CN2009102003963A
Authority: CN
Inventors: 穆海东; 汪宁梅; 穆宇豪; 黎飒
Original assignee: SHANGHAI YULONG CLINICAL TESTING CENTER CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI YULONG CLINICAL TESTING CENTER CO Ltd
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2009-12-11
Publication date: 2011-06-15

Abstract

本发明公开了一种用于沙眼衣原体感染定量检测的荧光PCR试剂盒，属于体外核酸诊断试剂盒领域。该试剂盒包括阳性工作标准品、阳性参考品、阴性参考品、荧光聚合酶链式反应液、PCR扩增引物和特异性荧光探针、PEG沉淀液、裂解液。本发明包括以荧光PCR技术为基础的PCR体系，包含针对沙眼衣原体基因序列的正、反向引物和荧光探针，在适合的PCR条件下可以检测沙眼衣原体基因的核酸序列；可以简便快速地在临床样本中检测沙眼衣原体感染，特异性高。

Description

沙眼衣原体感染定量检测荧光PCR试剂盒

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中检测沙眼衣原体感染的荧光PCR(聚合酶链式反应)试剂盒。

背景技术

沙眼衣原体(chlamydia trachomatis，CT)为革兰阴性病原体，是一种严格的专性细胞内寄生的微生物。沙眼衣原体是常见的性传播疾病、非淋菌性尿道炎的主要病原体，它不仅会导致阴道、尿道的感染；上行的生殖道感染还可能累及子宫内膜、输卵管和邻近的盆腔结构，导致盆腔炎、输卵管损伤直至不孕。由于沙眼衣原体感染后无特异性临床表现，因此实验室检查十分重要。

荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。

荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针等，本方法涉及的是Taqman探针技术。其工作原理是：它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’→3’酶切活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM(6-羧基荧光素)，TET(四氯-6-羧基荧光素)，JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)，HEX(六氯-6-甲基荧光素)或VIC等，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)或DABCYL(4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。

发明内容

为克服传统方法(如电泳法等)对CT检测的缺点，本发明提供一种特异性高、成本低并且能够作定量检测的检测产品。技术方案如下：

一种沙眼衣原体感染定量检测荧光PCR试剂盒，包括阳性工作标准品、阴性参考品、阳性参考品、UNG酶、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR扩增引物、特异性荧光探针。

所述的阳性参考品和阳性工作标准品为含有插入沙眼衣原体特异序列的PMD18-T载体质粒，所述插入的特异序列如下：

CTGTTTGCAAACTGTTCATCGCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGGTTTTAAAAAATGTTCGACTATTTTCTTGTTTAGAAGGTTGCGCTATAGCGACTATTCCTTGAGTCATCCTGTTTAGGAATCTTGTTAAGGAAATATAGCTTGCTGCTCGAACTTGTTTAGTACCTTCGGT 175bp。

所述的阳性参考品为存放浓度为1.0×10⁶-1.0×10⁷拷贝/毫升的重组质粒。

所述阳性工作标准品分别为存放浓度为5.0×10⁴、5.0×10⁵、5.0×10⁶、5.0×10⁷拷贝/毫升的重组质粒。

所述的阴性参考品为CT阴性血清。

所述的PCR扩增引物序列如下：

扩增检测沙眼衣原体的正向引物 GCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGG 25bp；

扩增检测沙眼衣原体的反向引物 GAGCAGCAAGCTATATTTCCTTAACA 26bp。

所述的特异性荧光探针序列如下：

检测沙眼衣原体的探针 GCGACTATTCCTTGAGTCAT 20bp。

所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，可以是FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5；3’端的为一种荧光淬灭基团，可以是TAMRA、DABCYL、BHQ0、BHQ1、BHQ2。

在本发明的反应体系中，可以使用一个或者多个荧光探针，所标记的荧光报告基团可以为一种或者两种。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

①定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能实时监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；

②灵敏度和特异性高。由于采取特异性和引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到病毒的感染；

③检测速度快，加上样本提取总共仅需2-3个小时；

④步骤简单；

⑤可同时进行高通量的样本检测。

总之荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间可控制在两个半小时以内，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取代传统细胞检测或者普通PCR检测进行CT的早期诊断。

附图说明：

图1为CT阳性参考品的荧光PCR扩增曲线：曲线为阳性参考品曲线，阴性参考品曲线；

图2为CT临床样本的荧光PCR扩增曲线：所测得的四个阳性工作标准品Ct值在19～31之间，阴性参考品Ct值为Undet，阳性样本Ct值在20～38之间。

具体实施方式：

应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1：试剂盒的制备

1.引物和探针设计与合成

使用Primer Express 3.0，针对CT的基因筛选处于保守区的引物，在选择好的引物基础上设计CT的探针。引物与探针均委托专业公司(生工)合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化，探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA荧光基团。

扩增序列如表1：

表1.特异性探针与引物序列

序列名称	寡核苷酸序列(5’-3’)	碱基长度(bp)
			CT探针	GCGACTATTCCTTGAGTCAT	20
CT正向引物	GCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGG	25
			CT反向引物	GAGCAGCAAGCTATATTTCCTTAACA	26

2.CT质粒阳性模板的制备

本实施例中CT质粒作为阳性模板用于制备阳性参考品和阳性工作标准品。

使用步骤1中合成的扩增CT特异性引物扩增CT基因区靶序列，将经过纯化的PCR产物连接到购自TAKARA公司的PMD18-T载体上；然后转化至购自天根生化科技(北京)有限公司的大肠杆菌DH5α感受态细胞中；通过蓝白斑筛选，构建MG重组质粒DNA作为阳性参考品。构建的CT重组质粒经双向DNA测序鉴定。提取质粒，紫外分光光度计定量，并保存于-20℃。

3.参考品选择

使用无沙眼衣原体的阴性血清作为阴性参考品；含有沙眼衣原体基因的重组质粒(1.0×10⁶-1.0×10⁷拷贝/微升)为阳性参考品。

4.阳性工作标准品的制备

使用含有沙眼衣原体基因浓度分别为5.0×10⁴、5.0×10⁵、5.0×10⁶、5.0×10⁷拷贝/毫升的重组质粒为阳性工作标准品。

5.荧光PCR反应液组成

表2.PCR反应液组成

原料名称	工作浓度
		PCR Buffer	1×
MgCl₂	2-5mM
		dNTP	0.1-0.5mM
CT引物	0.1-0.50μM
		CT探针	0.1-0.50μM
UNG酶	0.05-1U

Taq酶	0.5-5U
		H₂O	适量
DNA模版	2μL
		总体积	50μL

实施例2：试剂盒的使用

1.样本提取

使用DNA提取液提取待测样品中的CT核酸

1)样本前处理：拭净宫颈口过多的分泌物，用生理盐水浸润的棉拭子紧贴宫颈口粘膜稍用力转动2周以取得分泌物和脱落细胞，将取样后的棉拭子放入备有1ml无菌生理盐水的EP管中充分漂洗，贴壁挤干。使用PEG沉淀，碱裂解法提取CT基因。

PEG沉淀液配方：30％ PEG8000。

裂解液配方：60mmol/L TrisHCl，pH 8.0；0.5％SDS；200mmol/L NaCl；1M/L NaOH。

2)操作步骤：取500μl分泌物与等体积PEG沉淀液震荡混匀于13000rpm离心10min，弃上清；加50μl裂解液，100℃保温20min，13000rpm离心10min，取上清2μl做PCR反应。

2.样本检测

分别取步骤1中提取的核酸，试剂盒中获得的阳性工作标准品、阳性参考品，阴性参考品，作为DNA模板，加入UNG酶、Taq聚合酶、及含有特异性PCR引物和特异性荧光探针的反应液中，组成PCR反应体系。作为样本定量判定的标准。

该体系各主要成分如下：

4.反应程序

设置收集FAM荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入荧光PCR仪(ABI7500)开始扩增，反应程序如下：

表3.PCR反应程序

5.结果判断

基线范围的Ct值(循环数)为3-15或由软件自动选择，设定阈值使之超过无规则扩增曲线的最高值。荧光PCR仪不同，所得基线范围的Ct值会有所不同。

6.参考品标准

(1)各类对照参考品判断结果如下表：

表4.参考品标准检测结果

	质控品	标准检验结果
			1	阴性参考品	Ct值≥40
2	阳性参考品	20≤Ct值≤28

图1为CT的阳性参考品及阴性参考品荧光PCR扩增曲线图。所测得的阳性参考品Ct值在20～28之间，阴性参考品Ct值为Undet.(undetect，未检出)或者Ct值为40。

7.结果报告：

图2为临床样本的CT荧光PCR扩增曲线。所测得的阳性工作标准品Ct值在19～31之间，所测得阳性样本Ct值在20～38之间。

样本结果的判断标准如下：

表4.报告样本检测结果

序列表

<110>上海裕隆临床检验中心有限公司

<120>沙眼衣原体感染定量检测荧光PCR试剂盒

<160>4

<210>1

<211>175

<212>DNA

<213>沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)

<400>1

ctgtttgcaa actgttcatc gcatctgttt ttactatttc cctggtttta aaaaatgttc 60

gactattttc ttgtttagaa ggttgcgcta tagcgactat tccttgagtc atcctgttta 120

ggaatcttgt taaggaaata tagcttgctg ctcgaacttg tttagtacct tcggt 175

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作沙眼衣原体感染定量检测荧光PCR试剂盒中扩增检测CT的正向引物。

<400>2

gcatctgttt ttactatttc cctgg 25

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>3

gagcagcaag ctatatttcc ttaaca 26

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作沙眼衣原体感染定量检测荧光PCR试剂盒中扩增检测CT的探针。

<400>4

gcgactattc cttgagtcat 20

Claims

1.一种沙眼衣原体感染定量检测荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括阳性工作标准品、阴性参考品、阳性参考品、UNG酶、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR扩增引物、特异性荧光探针。

2.如权利要求1所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的阳性参考品和阳性工作标准品为含有插入沙眼衣原体特异序列的PMD18-T载体质粒，所述插入的特异序列如下：

CTGTTTGCAAACTGTTCATCGCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGGTTTTAAAAAATGTTCG

ACTATTTTCTTGTTTAGAAGGTTGCGCTATAGCGACTATTCCTTGAGTCATCCTGTTTAGG

AATCTTGTTAAGGAAATATAGCTTGCTGCTCGAACTTGTTTAGTACCTTCGGT 175bp。

3.如权利要求1或2所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的阳性参考品为存放浓度为1.0×10⁶-1.0×10⁷拷贝/毫升的重组质粒。

4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述的阳性工作标准品为存放浓度分别为5.0×10⁴、5.0×10⁵、5.0×10⁶、5.0×10⁷拷贝/毫升的重组质粒。

5.如权利要求1所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的阴性参考品为CT阴性血清。

6.如权利要求1所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增引物序列如下：

扩增检测沙眼衣原体的正向引物GCATCTGTTTTTACTATTTCCCTGG 25bp；

扩增检测沙眼衣原体的反向引物GAGCAGCAAGCTATATTTCCTTAACA 26bp。

7.如权利要求1所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的特异性荧光探针序列如下：

检测沙眼衣原体的探针GCGACTATTCCTTGAGTCAT 20bp。

8.如权利要求1或7所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，可以是FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5；3’端的为一种荧光淬灭基团，可以是TAMRA、DABCYL、BHQ0、BHQ1、BHQ2。