CN101238146A - 砂眼衣原体的免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供各砂眼衣原体血清变型的变体LcrE序列和/或变体LcrE序列的组合。各砂眼衣原体血清变型LcrE基因型的这种变异可能对应于LcrE表型的变异，特别是免疫原性的变异。本发明还提供围绕氨基酸取代位点或与之相关的肽，特别是围绕高频率突变氨基酸位点或超变区或与之相关的肽，这些突变氨基酸位点或超变区可能是能引发衣原体特异性免疫应答的B细胞和/或T细胞表位区域。变体LcrE序列和/或变体LcrE序列的组合和/或与变体LcrE序列相关的表位区域可用作免疫原和/或用于制备预防和/或治疗和/或诊断衣原体感染的免疫原性组合物。

Description

砂眼衣原体的免疫原性组合物
本申请要求2005年5月12日提交的美国临时申请60/680,725的优先权，该申请全文纳入本文作为参考。
本申请纳入两份副本CD-ROM各自的内容作为参考。各CD-ROM含有相同的名为“Sequence Listing for 2441_199.txt”的95kB文件，该文件含有本申请的序列表。这些CD-ROM于2006年5月3日制作。
本文引用的所有文件全文纳入作为参考。
技术领域
本发明属于免疫学和疫苗学(vaccinology)领域。具体地说，涉及源自的砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的抗原和这些抗原在免疫接种中的应用。
背景技术
衣原体(Chlamydiae)是真核细胞的专性胞内寄生物，其导致地方性性传播感染和各种其它疾病综合征。它们单独占据真细菌系统发生树的一个分支，与任何其它已知的生物没有近亲关系。衣原体的特定特征是它们独特的生命周期，在其生命周期中该细菌在两种不同的形态学形式：胞外感染形式(原生小体，EB)和胞内非感染形式(网状体，RB)之间转换。随着RB重新组织成EB完成其生命周期，离开被其破话的宿主细胞从而能感染其它细胞。
历史上，将衣原体分类为其自己的目(衣原体目(Chlamydiales))，该目由一个科(衣原体科(Chlamydiaceae))构成，该科进而含有一个属(衣原体属(Chlamydia)，也称为嗜衣体属(Chlamydophila))。近年来，将该目分为至少4个科，包括砂眼衣原体科(Chlamydia trachomatisceae)、副砂眼衣原体科(ParaChlamydiatrachomatisceae)、华诊体科(Waddiaceae)和芯卡体科(Simkaniaceae)。在该最近的分类中，衣原体科包括嗜衣体属和砂眼衣原体属，砂眼衣原体是衣原体属中的一个种。参见参考文献1。
目前已知至少5种砂眼衣原体和嗜衣体种的基因组序列-砂眼衣原体(C.trachomatis)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)、鼠肺炎衣原体(C.muridarum)、猫心衣原体(C.pecorum)和鹦鹉热衣原体(C.psittaci)(见参考文献2，8)。根据与多克隆或单克隆抗血清的血清学反应性(即，“血清变型(serovar)”)可对各种砂眼衣原体菌株进行分类，目前有至少18种血清变型。由于砂眼衣原体的MOMP(主要外膜蛋白)中的差异，通常可检测到这些血清学差异。
可将砂眼衣原体的人血清变体(serovariant)(“血清变型”)分成两种生物变体(biovariant)(“生物变型”)。血清变型L1、L2和L3是侵袭性性病性淋巴肉芽肿(LGV)的致病因子，该病是一种性传播的全身性感染。LGV在工业化国家中不常见，但在非洲、亚洲、澳洲和南美洲频发。它主要影响淋巴组织，但也可以发生急性有症状感染而不明显涉及感染部位的淋巴结或组织反应。据报道，急性LGV在男性中的发病率超过女性5倍。砂眼衣原体的其它生物类型包括血清变型A、B、Ba和C，这些血清变型与砂眼(一种眼睛的可传播疾病)有关。
血清变型A-K(D、E、F、G、H、I、J和K)通常与生殖道疾病有关。
具体地说，血清变型D、E、F、H和K几乎占生殖道感染的85％(参见，例如WO 02/065129)。血清变型A-K主要引发眼组织(A-C)或泌尿生殖道(D-K)的上皮感染。目前的研究还表明在美国和欧洲引起性传播感染或疾病(STI或STD)的4种血清变型(或血清型)是D-K，首先是D、E、F和I。
每年单在美国便诊断到超过4百万的衣原体性传播感染新病例(8)，估计每年的治疗费用达40亿美元，80％是女性感染和疾病(9)。
虽然，衣原体感染本身可导致疾病，但认为一些患者症状的严重程度实际上是因宿主免疫应答异常或改变引起，这些异常或改变可能是由于(i)侵入的衣原体微生物的性质(其血清变型之间可能不同)或(ii)所侵入对象的性质(例如患者生活型(patient profile)的性质)所致。未能清除感染导致持久的免疫刺激而不是帮助宿主，从而造成伴有严重后果的慢性感染，包括不育和失明。见参考文献9。此外，天然衣原体感染所赋予的保护作用通常不完全，具有暂时性和菌株特异性。
虽然可用几种抗生素治疗衣原体感染，但大多数女性感染无症状，抗微生物治疗可能滞后，或者不足以预防长期后遗症，特别是在卫生条件不好的国家。衣原体的多抗生素耐药性菌株也已有报道(Somani等，2000)。此外，有人提出抗生素治疗可导致砂眼衣原体形成异常或改变形式，随后重新激活(Hammerschlag M.R.2002，The intracellular life of Chlamydia trachomatis(砂眼衣原体的胞内周期)，Semin.Pediatr.Infect.Dis.13：239-248)。
不幸的是，衣原体致病机理的大多数决定因素复杂，目前尚不清楚，这主要是因为研究该病原体存在固有难度和缺乏足够的方法对其进行遗传操作。特别是对原生小体表面的抗原组成知之甚少，该表面是病原体-宿主相互作用的主要区室，可能携带能引发保护性免疫应答的抗原。
由于该疾病的严重性质，需要提供合适的免疫原性组合物，例如疫苗来对付，如侵入的衣原体菌株的等位基因变体和/或衣原体侵入菌株的异常或改变形式所致的宿主细胞免疫应答异常或改变。这些免疫原性组合物可用于(a)免疫接种来抵御衣原体感染或抵御衣原体诱导的疾病(预防性疫苗接种)或(b)根除已有的慢性衣原体感染(治疗性疫苗接种)。然而，作为胞内寄生物，该细菌通常能逃脱抗体介导的免疫应答。
砂眼衣原体的各种抗原性蛋白质已见报道，特别是其细胞表面已成为详细研究的靶标。参见，例如参考文献10。这些蛋白质(抗原)包括，例如Pgp3(参考文献11、12和13)、MOMP(参考文献14)、Hsp60(GroEL)(参考文献15)和Hsp70(DnaK-样)(参考文献16)。然而不是所有蛋白质(抗原)均证明是有效的疫苗，已鉴定了其它候选蛋白质(抗原)。见参考文献17。
抵御病原体，例如乙肝、白喉和破伤风病毒的疫苗通常只含有一种蛋白质抗原(例如，HBV表面抗原或破伤风类毒素)。相反，无细胞百日咳疫苗通常含有至少3种百日咳芽孢杆菌(B.pertussis)蛋白质，PrevnarTM肺炎球菌疫苗含有7种不同的偶联糖抗原。其它疫苗，例如细胞百日咳疫苗、麻疹疫苗、灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和脑膜炎球菌OMV疫苗就其本质是许多抗原的复杂混合物。因此，单一抗原、少数成分明确的抗原或成分不明确抗原的复杂混合物能否引发保护作用取决于所述的病原体。
本发明的一个目的是提供改进的其它免疫原性组合物来提供抵御衣原体疾病和/或感染的免疫力。具体地说，本发明的一个目的是提供改进的免疫原性组合物来提供抵御衣原体血清变型异常或改变的菌株(例如，等位基因变体菌株)的免疫力。
本发明的免疫原性组合物是基于一种或多种(例如，两种或多种)砂眼衣原体抗原的组合。该免疫原性组合物可包括不同砂眼衣原体血清变型的一种或多种相同的砂眼衣原体抗原和/或不同砂眼衣原体血清变型的一种或多种相同或不同的砂眼衣原体抗原。
发明概述
在参考文献5所述砂眼衣原体基因组(编码)的约900种蛋白质中，申请人首次证明感染性EB形式的表面存在低钙反应元件(lcrE)蛋白，并且抗体可接近该蛋白，因此该蛋白质可能成为候选疫苗。当时，申请人假设若能有效阻断三型区段(TypeThree Section)或TTS细胞器(LcrE是其一部分)就可通过“冷冻”该LcrE负调节物进而抑制感染过程(参见Montigiani等，Infection and Immunity(2002)70(1)；368-379)。随后申请人证明LcrE蛋白的确能在砂眼衣原体感染的仓鼠模型中诱导明显的保护性免疫应答(参见Sambri等，(2004)22(9-10)1131-7)。他人(参见，例如WO 03/41560中的实施例9)也证实了LcrE的这些免疫保护性结果，这些结果指出了LcrE作为预防和/或治疗和/或诊断砂眼衣原体感染良好候选抗原的价值。
在评价代表8种不同砂眼衣原体血清变型的14株砂眼衣原体临床分离物LcrE基因的等位基因变体的过程中，申请人确认与以下序列相比，在各砂眼衣原体血清变型中观察到LcrE抗原高于预计数目的单个氨基酸取代：(i)血清变型D的参比砂眼衣原体LcrE序列和(ii)其它免疫原性砂眼衣原体抗原中发现的那些序列。
这一极其出乎意料且令人惊奇的发现提示：
(i)LcrE蛋白经受的免疫学压力可能大于其它免疫原性砂眼衣原体抗原；和
(ii)围绕所述氨基酸取代(位点)的肽可能是表位区域(参与抗体-抗原(Ab-Ag)相互作用的B细胞表位和/或能引发衣原体特异性细胞介导应答的T细胞表位)。
由于这些基因分型研究所用的衣原体分离物得自两个截然不同的免疫学来源，它们从两个不同的大陆(北美洲和欧洲)并在不同时期(至少30年前与5-8年前)分离，因此申请人的发现愈发令人惊奇。
鉴于不是最近分离的ATCC血清变型E的LcrE序列的突变数目与最近分离的意大利血清变型E的LcrE序列相同出乎意料，那么在两种来源的两种LcrE序列中有8个突变的性质相同就更出乎意料了。两种LcrE血清变型E突变体序列相同的事实指出，与随机或任意突变相反，这8个突变是真实而实在的突变。可利用这些突变定制针对特异性靶群体的LcrE免疫原性组合物。
申请人还在各血清变型的LcrE序列中鉴定到氨基酸残基64和162两个高频率突变点或超变区。在14株不同的衣原体分离物中，有7株在氨基酸残基64处有甘氨酸(G)向谷氨酸(G)的突变，而还有7株在氨基酸残基162处有苏氨酸(T)向丙氨酸(A)的突变。存在两个高频率突变点或超变区(例如，LcrE序列的残基64和162)是出乎意料的，可能与存在能引发对象免疫原性应答的T和/或B细胞表位区域有关。可利用这些高频率突变来定制针对特异性靶群体的LcrE免疫原性组合物。
申请人还在各砂眼衣原体血清变型中鉴定到其它变体衣原体抗原序列和/或变体衣原体抗原序列的组合。这些衣原体抗原包括但不限于：OmpH-样(CT242)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、假定的(CT398)和PepA(CT045)抗原。在各砂眼衣原体血清变型中，这些衣原体抗原基因型中观察到的氨基酸变化可能对应于衣原体抗原表型的变化，特别是免疫原性的变化。围绕所述氨基酸取代(位点)或与之相关的肽，特别是围绕高频率突变氨基酸位点或超变区或与之相关的肽可能是表位区域，可能是参与抗体-抗原(Ab-Ag)相互作用的B细胞表位和/或能引发衣原体特异性免疫原性应答，特别是细胞介导免疫应答的T细胞表位。
序列简述
下表简单描述了在13株分离的砂眼衣原体血清变型中发现的砂眼衣原体LcrE序列(SEQ ID No 1-13)。在这些血清变型中，7株血清变型得自ATCC，6株血清变型得自意大利(Cevenini)保藏所。还提供了LcrE序列的14×30聚体的共有序列(SEQ ID No 14-SEQ ID No 27)。SEQ ID No 28对应于在各砂眼衣原体LcrE血清变型中发现的含有10个突变点(64、126、157、162、179、207、217、220、275和420)的LcrE序列。SEQ ID No 29-45对应于在突变型序列中发现的已鉴定表位区域。SEQ ID No 46是用作与其它序列比较的血清变型D/UW-3/CX的参比LcrE血清变型D序列。SEQ ID No 181、182、183和184对应于残基64和162处高频率突变点相关的表位区域。
表1
  抗原   血清变型   序列ID号
  血清变型D/UW-3/CX的LcrE参比序列(gi：15604717)(Stephens等，(1998)Science282(5389)754-759   血清变型D的LcrE参比序列   SEQ ID No46
  LcrE   ATCC血清变型E   SEQ ID No 1
  LcrE   ATCC血清变型F   SEQ ID No 2
  LcrE   ATCC血清变型G   SEQ ID No 3
  LcrE   ATCC血清变型H   SEQ ID No 4
  LcrE   ATCC血清变型I   SEQ ID No 5
  LcrE   ATCC血清变型J   SEQ ID No 6
  LcrE   ATCC血清变型K   SEQ ID No 7
  LcrE   Cev 1＝血清变型J   SEQ ID No 8
  LcrE   Cev 2＝血清变型G   SEQ ID No 9
  LcrE   Cev 4＝血清变型H   SEQ ID No10
  LcrE   Cev 5＝血清变型E   SEQ ID No11
  LcrE   Cev 8＝血清变型D   SEQ ID No12
  LcrE   G086＝血清变型D   SEQ ID No13
  LcrE   30聚体的共有序列I-14   SEQ ID No14-27
  LcrE   D/UW-3/CX的含鉴定的10个突变点的LcrE血清变型D参比序列   SEQ ID No28
  LcrE   表位肽序列1-17   SEQ ID No29-45
  含有表位序列的肽   SEQ ID No47-98和99-180
  LcrE   与LcrE序列中的两个高频率突变点64和162相关的表位序列   SEQ ID No181、182、183和184
  LcrE   D/UW-3/CX的LcrE血清变型D参比序列，含有以X1-X10列出的鉴定的10个突变点   SEQ ID No185
表7
Figure A20068002429300131
本发明各方面的概述
本发明涉及在各砂眼衣原体血清变型中发现的砂眼衣原体LcrE序列的变异。相对于砂眼衣原体LcrE血清变型D/UW-3/CX序列(SEQ ID No 46)检测各砂眼衣原体血清变型中砂眼衣原体LcrE序列的变异。以下段落(para)列出了本发明的各方面。随附的内容中提供了其它细节：
本发明提供了以下各方面：
1.一种由SEQ ID NO：46所示氨基酸序列构成的蛋白质，除了该氨基酸序列含有一个或多个突变，其中所述一个或多个突变涉及选自64、126、157、162、179、207、217、220、275和/或420位的氨基酸残基。
2.如段落1所述的蛋白质，其特征在于，所述突变独立为取代、插入或缺失，优选含有表7所列的一个或多个突变。
3.如段落1或2所述的蛋白质，其特征在于，所述一个或多个突变改变了该蛋白质的免疫原性。
4.如段落1-3中任一段所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质含有选自SEQID No 1、4、6、8、11、12、13、16、18、19、20、21、23和/或27的一条或多条突变序列。
5.如段落4所述的蛋白质，其含有SEQ ID No 11、4或6。
6.如段落4所述的蛋白质，其含有SEQ ID No 13或8。
7.如段落4所述的蛋白质，其含有SEQ ID No 12或1。
8.如段落2所述的蛋白质，其在氨基酸残基64和/或162处含有突变。
9.如段落4所述的蛋白质，其含有SEQ ID No 16、18、19、20、21、22、23或27。
10.一种蛋白质，其含有以上段落中任一段所述蛋白质的氨基酸序列或以上段落中任一段所述蛋白质的至少7个毗连氨基酸的一个或多个片段。
11.如段落10所述的蛋白质，其特征在于，所述一个或多个片段含有选自64、126、157、162、179、207、217、220、275和/或420位的氨基酸残基的一个或多个突变。
12.一种抗体，其与如段落1-11中任一段所述蛋白质结合。
13.一种核酸，其编码如段落1-11中任一段所述蛋白质。
14.一种载体，其含有如段落13所述的核酸。
15.一种宿主细胞，其用如段落14所述载体转化。
16.用作药物的如段落1-11中任一段所述的蛋白质，如段落12所述的抗体或如段落13所述核酸。
17.用作免疫原的如段落16所述的蛋白质或核酸。
18.用作诊断试剂的如段落1-11中任一段所述的蛋白质，如段落12所述的抗体或如段落13所述的核酸。
19.如段落1-11中任一段所述的蛋白质，如段落12所述的抗体或如段落13所述的核酸在制备预防或治疗砂眼衣原体感染的药物中的应用。
20.如段落1-11中任一段所述的蛋白质，如段落12所述的抗体或如段落13所述核酸在制备检测是否存在砂眼衣原体或产生的抗砂眼衣原体抗体的诊断试剂中的应用。
21.如段落1-11中任一段所述的蛋白质，如段落12所述的抗体或如段落13所述核酸在制备能产生抗砂眼衣原体抗体的试剂中的应用。
22.一种治疗对象的方法，其包括给予该对象治疗有效量的段落1-11中任一段所述的蛋白质，段落12所述的抗体或如段落13所述的核酸。
23.一种制备如段落1-11中任一段所述蛋白质，如段落12所述抗体或如段落13所述核酸的方法，其包括在诱导蛋白质表达的条件下培养如段落15所述宿主细胞的步骤。
24.一种制备如段落1-11中任一段所述蛋白质，如段落12所述抗体或如段落13所述核酸的方法，其中所述蛋白质或核酸部分或完全采用化学方法合成。
25.一种检测如段落13所述核酸的方法，其包括以下步骤：(a)在杂交条件下使核酸探针与生物学样品接触以形成双螺旋和(b)检测所述双螺旋。
26.一种检测如段落1-11中任一段所述蛋白质的方法，其包括以下步骤：(a)在适合形成抗体-抗原复合物的条件下使如段落12所述的抗体与生物学样品接触和(b)检测所述复合物。
27.一种检测如段落12所述抗体的方法，其包括以下步骤：在适合形成抗体-抗原复合物的条件下使如段落1-11中任一段所述的蛋白质与生物学样品接触和(b)检测所述复合物。
28.一种试剂盒，其装有适用于如段落25-28中任一段所述方法的试剂。
29.一种免疫原性组合物，其含有如段落1-11中任一段所述的蛋白质，如实施例12所述的抗体或如实施例13所述的核酸和免疫学上可接受的赋形剂。
30.如段落29所述的组合物，其特征在于，还含有一种或多种抗原。
31.如段落29或30所述的组合物，其特征在于，还含有一种或多种佐剂。
32.用作药物的如段落29-31中任一段所述的组合物。
33.如段落29-31中任一段所述组合物在制备预防或治疗或诊断细菌感染的药物中的应用。
34.如段落33所述的应用，其特征在于，所述细菌感染是砂眼衣原体感染。
35.一种免疫原性组合物，其含有选自SEQ ID No 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45、49-98、99-180、181、182、183和/或184所示序列的至少两种蛋白质。
36.如段落35所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有SEQ ID No 1和SEQ ID No 12。
37.如段落36所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有SEQ ID No 13和SEQ ID No 46。
38.如段落35-37中任一段所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有(a)一种或多种其它抗原和/或(d)一种或多种其它佐剂。
39.用作药物的如段落35-38中任一段所述组合物。
40.如段落35-38中任一段所述的组合物在制备预防或治疗或诊断细菌感染的药物中的应用。
41.如实施例40所述的应用，其特征在于，所述细菌感染是砂眼衣原体感染。
42.一种引发对象免疫应答的方法，其中该方法包括给予对象如段落29-31或35-38中任一段所述组合物。
43.一种多肽，其含有选自SEQ 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45、47-98、99-180、55、66、109、110、111、181、182、183和/或184的至少7个毗连氨基酸，优选至少9个毗连氨基酸的一个或多个片段。
44.如段落35所述的组合物，其特征在于，所述组合物具有包含SEQ ID NO：1、12、13、45和7的蛋白质。
46.一种免疫原性组合物，其包含选自SEQ ID No 54、66、109、110、111、181、182、183和184的一种或多种肽。
47.一种免疫原性组合物，其包含选自SEQ ID No 181、182、183和/或184的一种或多种肽。
48.用作免疫原的如段落43所述多肽或如段落46或47所述组合物。
49.如段落48所述的多肽，其特征在于，其用作免疫原来产生体液和/或细胞毒性T细胞淋巴细胞应答，所述应答足以防止或治疗衣原体所致疾病和/或感染。
50.一种在哺乳动物中产生免疫应答的方法，其包括给予该哺乳动物如段落43所述多肽或段落46或47所述免疫原性组合物的步骤。
51.如段落50所述的方法，其特征在于，所述免疫应答防止或治疗衣原体所致疾病和/或感染。
52.用作诊断试剂的如段落43所述的多肽或如段落46或47所述的组合物。
53一种诊断患者中衣原体感染的方法，其包括培育患者的T细胞与段落43或46或47所述的多肽和随后检测是否存在T-细胞增殖。
54.如段落43所述的多肽或如段落46或47所述的组合物在制备预防或治疗细菌感染，优选衣原体感染的药物中的应用。
55.一种蛋白质或免疫原性组合物，其含有SEQ ID No 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27。
56.一种蛋白质或免疫原性组合物，其含有SEQ ID No 185，其中X1位的氨基酸残基选自甘氨酸(G)或谷氨酸(E)；残基X2处的氨基酸选自天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)或天冬酰胺(N)；残基X3处的氨基酸选自甘氨酸(G)或精氨酸(R)；残基X4处的氨基酸选自苏氨酸(T)或丙氨酸(A)；残基X5处的氨基酸选自缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)；残基X6处的氨基酸选自苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)；残基X7处的氨基酸选自丙氨酸(A)或天冬氨酸(D)；残基X8处的氨基酸选自组氨酸(H)或精氨酸
Figure A20068002429300171
残基X9处的氨基酸选自天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)和X10位的氨基酸残基选自丝氨酸(S)或脯氨酸(P)，其中所述蛋白质不是SEQ ID No 46。
57.如段落16-27中任一段使用的如段落56所述的蛋白质或免疫原性组合物。
附图简述
参考附图对以下发明的进一步描述只是举例。给予以下实施例只是说明本发明并协助普通技术人员实施和使用本发明。这些实施例绝非以任何方式限制本发明的范围。已努力确保所用数值(例如，数量、温度等)的精确性，但当然应允许有一定的实验误差和偏差。
图1显示了在砂眼衣原体的不同临床分离物中发现的LcrE等位基因的氨基酸序列。将这些序列与报道的经全长测序的血清变型-D菌株UW-3/Cx的基因组参比序列作比较。因此，与参比血清变型D序列相比，将此氨基酸的变异随意鉴定为等位基因-1。
图2显示了对应于8种不同衣原体血清变型的14株衣原体分离物的LcrE序列与参比衣原体LcrE血清变型D(D/UW-3/CX)的排列对比。各30聚体排列对比上方的“主要”序列对应于“共有”序列。如果有含有相同数目取代的超变区(例如，氨基酸残基64和162处的7/14个取代)，则该高频率突变点以“星号＝*”而不是“或(either or)”取代表示。
表3显示了包括8种不同血清变型的14株砂眼衣原体临床分离物中6种基因的等位基因变异。
LcrE序列变体详述
下文更详细地描述了SEQ ID No 1-46中的各条：
SEQ ID No 46＝血清变型D(D-UW-3/CX)砂眼衣原体LcrE(CT089)参比序列
参考文献17中披露的SEQ ID NO：61和62为未突变的LcrE蛋白{GenBank登录号：AAC67680，GI：3328485；“CT089”；下文的SEQ ID NO：46}。
SEQ ID NO：46
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRFTEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPSSLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP
(SEQ ID No 1)基因组：ATCC-E(8个突变：等位基因-5)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组ATCC-E(血清变型E)LcrE序列(SEQ ID No 1)含有8个突变。基因组ATCC-E与血清变型E相关。SEQ ID NO：1(见下文)为公开的基因组ATCC-E的序列。
SEQ ID No 1：
Figure A20068002429300181
基因组ATCC-E与LcrE砂眼衣原体抗原的排列对比如下所示：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRF.............E
TEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLI.........................E
QTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPS......R....A
SLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEG......L.........D..R
PSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSL........................D
TTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
(2)基因组：ATCC-F(无突变：等位基因-1)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组ATCC-F(血清变型F)LcrE序列(SEQ ID No 2)无突变。
基因组ATCC-F与血清变型F相关。SEQ ID NO：2(见下文)我公开的基因组ATCC-F的序列。
SEQ ID No 2：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRFTEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPSSLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
(3)基因组：ATCC-G(无突变：等位基因-1)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组ATCC-G(血清变型G)LcrE无突变。
基因组ATCC-G与血清变型G相关。SEQ ID NO：3(见下文)为公开的基因组ATCC-G的序列。
SEQ ID No 3：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRFTEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPSSLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
(4)基因组：ATCC-H(3个突变：等位基因-4)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组ATCC-H LcrE序列含有3个突变。基因组ATCC-H与血清变型H相关。SEQ ID NO：4(见下文)为公开的基因组ATCC-H的序列。
SEQ ID No 4：
Figure A20068002429300201
基因组ATCC-H与LcrE砂眼衣原体抗原的排列对比如下所示：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRF.............E
TEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPS...........A
SLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
...................P
(5)基因组：ATCC-I(无突变：等位基因-1)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组ATCC-I LcrE序列无突变。
基因组ATCC-I与血清变型I相关。SEQ ID NO：5(见下文)为公开的基因组ATCC-I的序列。
SEQ ID No 5：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRFTEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPSSLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
(6)基因组：ATCC-J(3个突变：等位基因-4，Cev-5)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组ATCC-J LcrE序列含有3个突变。
基因组ATCC-J与血清变型J相关。SEQ ID NO：6(见下文)为公开的基因组ATCC-J的序列。
SEQ ID No 6：
Figure A20068002429300211
基因组ATCC-J与LcrE砂眼衣原体抗原的排列对比如下所示：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRF.............E
TEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPS...........A
SLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
...................P
(7)基因组：ATCC-K(无突变：等位基因-1)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组ATCC-I LcrE序列无突变。
基因组ATCC-I与血清变型I相关。SEQ ID NO：7(见下文)为公开的基因组ATCC-I的序列。
SEQ ID No 7：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRFTEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPSSLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
(8)基因组：Cev-1，serJ(4个突变：等位基因-3)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组Cev-1(血清变型J)序列含有4个突变。
基因组Cev-1与血清变型J相关。SEQ ID NO：8(见下文)为公开的基因组Cev-1的序列。
SEQ ID No 8：
Figure A20068002429300221
基因组Cev-1与LcrE砂眼衣原体抗原的排列对比如下所示：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRF.............E
TEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPS...........A................I
SLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
...................P
(9)基因组：Cev-2，serG(无突变：等位基因-1)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组Cev-2(血清变型G)序列无突变。
基因组Cev-2与血清变型G相关。SEQ ID NO：9(见下文)为公开的基因组Cev-2的序列。
SEQ ID No 9：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRFTEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPSSLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
(10)基因组：Cev-4，serH(无突变：等位基因-1)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组Cev-4 LcrE序列无突变。
基因组Cev-4与血清变型H相关。SEQ ID NO：10(见下文)为公开的基因组Cev-4的序列。
SEQ ID No 10：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRFTEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPSSLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
(11)基因组：Cev-5，serJ(3个突变：等位基因-4)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组Cev-5序列含有3个突变。
基因组Cev-5与血清变型J相关。SEQ ID NO：11(见下文)为公开的基因组Cev-5的序列。
SEQ ID No 11：
Figure A20068002429300231
基因组Cev-5与LcrE砂眼衣原体抗原的排列对比如下所示：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRF.............E
TEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPS...........A
SLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
...................P
(12)基因组：Cev-8，serE(8个突变：等位基因-5)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组Cev-8序列含有8个突变。
基因组Cev-8与血清变型E相关。SEQ ID NO：12(见下文)为公开的基因组Cev-8的序列。
SEQ ID No 12：
Figure A20068002429300241
基因组Cev-8与LcrE砂眼衣原体抗原的排列对比如下所示：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRF.............E
TEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLI.........................E
QTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPS......R....A
SLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEG......L.........D..R
PSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSL........................D
TTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
(13)基因组：GO/86serD(4个突变：等位基因-2)
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，基因组GO/86序列含有4个突变。
基因组GO/86与血清变型D相关。SEQ ID NO：13(见下文)为公开的基因组GO/86的序列。
SEQ ID No 13：
Figure A20068002429300242
基因组GO/86与LcrE砂眼衣原体抗原的排列对比如下所示：
基因组：GO/86serD(4个突变：等位基因-2)
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRF.............E
TEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLI.........................N
QTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPS...........A
SLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP＊
...................P
共有序列(SEQ ID Nos 14-27)
以30聚体肽区段测定LcrE砂眼衣原体抗原的主要或共有序列。
下述SEQ ID NO：14披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第一区段(残基1-30)：
SEQ ID No 14：
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDA
下述SEQ ID NO：15披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第二区段(残基31-60)：
SEQ ID No 15：
QEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRI
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，在SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15中未鉴定到突变。
下述SEQ ID NO：16披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第三区段(残基61-90)：
SEQ ID No 16：
KKKXEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEE
在所观察的一半分离物中，SEQ ID NO：16的4位氨基酸残基是谷氨酸(E)，在所观察的另一半分离物中是甘氨酸(G)。因此，在本文中LcrE抗原的共有序列的61-90残基区段中4位氨基酸残基(即，共有序列全长中的总残基64＝高频率突变点)标注为X。
下述SEQ ID NO：17披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第四区段(残基91-120)：
SEQ ID No 17：
KGDTPLEDRFTEDLSEVSGEDFRGLKNSFD
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，在分离物砂眼衣原体的LcrE区段中，残基91-120的序列部分中未观察到突变。
下述SEQ ID NO：18披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第五区段(残基121-150)：
SEQ ID No 18：
DDSSP
Figure A20068002429300261
EILDALTSKFSDPTIKDLALDYLI
13株分离物中有10个的此共有序列残基121-150区段中6位氨基酸残基(总残基＝126)是天冬氨酸，13株分离物中有2个是谷氨酸，13株分离物中有1个是天冬酰胺。
下述SEQ ID NO：19披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第六区段(残基151-180)：
SEQ ID No 19：
QTAPSD
Figure A20068002429300262
KLKSXLIQAKHQLMSQNPQAI
Figure A20068002429300263
G
在所观察的一半分离物中，SEQ ID NO：19中12位氨基酸残基(总残基＝64＝高频率突变点)是丙氨酸(A)，在所观察的另一半分离物中是苏氨酸(T)。因此，在本文中LcrE砂眼衣原体抗原的共有序列151-180残基区段中12位氨基酸残基(即，共有序列的总残基162)标注为X。
下述SEQ ID NO：20披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第七区段(残基181-210)：
SEQ ID NO：20
GRNVLLASETFASRANTSPSSLRSLY
Figure A20068002429300264
QVT
14株分离物中有2个的此共有序列残基181-210区段中27位氨基酸残基(总残基＝207)是苯丙氨酸(F)，14株分离物中有2个是亮氨酸(L)。
下述SEQ ID NO：2 1披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第八区段(残基211-240)：
SEQ ID NO：21
SSPSNCNL
Figure A20068002429300266
QMLASYLPSEKTAVMEFLVN
在该共有序列全长的残基211-240的此共有序列区段(SEQ ID No 21)中217和220位观察到两个突变。
下述SEQ ID NO：22披露了该共有序列中30个氨基酸残基的第九区段(残基241-270)：
SEQ ID NO：22
GMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQA
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，在SEQ ID NO：22中未鉴定到突变。
下述SEQ ID NO：23披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第十区段(残基271-300)：
SEQ ID NO：23
LHSV
Figure A20068002429300271
SFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSL
14株分离物中有12个的残基271-300共有序列区段中5位氨基酸残基(总残基＝275)是天冬酰胺(N)，14个分离物中有2个是天冬氨酸(D)。
下述SEQ ID NO：24披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第十一区段(残基301-330)：
SEQ ID NO：24
TTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNEL
下述SEQ ID NO：25披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第十二区段(残基331-360)：
SEQ ID NO：25
VGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGA
下述SEQ ID NO：26披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第十三区段(残基361-390)：
SEQ ID NO：26
EKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDF
与血清变型D LcrE参比序列(SEQ ID No 46)相比，在SEQ ID NO：24、25或26中未鉴定到突变。
下述SEQ ID NO：27披露了该共有序列中含30个氨基酸残基的第十四区段(残基391-420)：
SEQ ID NO：27
PRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPP
Figure A20068002429300272
14株分离物中有9个的残基391-420共有序列区段中30位(即，总共有序列的420位)氨基酸残基是丝氨酸(S)，14株分离物中有5个是脯氨酸(P)。
在观察到的所有分离物中，421位氨基酸残基是脯氨酸。
砂眼衣原体菌株D/UW-3/CX的LcrE参比序列见SEQ ID NO：28(下文)，其还总结了在各种砂眼衣原体血清变型分离物中检测到的所有等位基因突变点：SEQ ID No 28中围绕此种点突变下划线标出的区域可能对应于B和/或T细胞表位肽区域。
SEQ ID NO：28
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCED LINPAAATRIKKK
Figure A20068002429300281
EKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRF
Figure A20068002429300282
TTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALN GCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPP HAPVPQSEIPTSPTSTQPP
Figure A20068002429300283
P
SEQ ID NO：185
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCED LINPAAATRIKKK
Figure A20068002429300284
EKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRF
Figure A20068002429300285
TTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALN GCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPP HAPVPQSEIPTSPTSTQPP
Figure A20068002429300286
P
表2显示了砂眼衣原体LcrE蛋白质的17个抗原决定簇(或如SEQ ID Nos29-45所示的表位肽)
Figure A20068002429300287
Figure A20068002429300291
发明详述
在详述本发明之前，应该知道本发明不限于具体示例的分子或方法参数，因为这些当然可以变化。还应知道本文所用的术语只是为了描述本发明的具体实施方式，不是限制性的。此外，除非另有表述，实施本发明可采用本领域普通技术人员已知的病毒学、微生物学、分子生物学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。参考文献中全面解释了这种技术。参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，(第二版，1989)；DNA Cloning：A Practical Approach(《DNA克隆：一种实用方法》)，第I和II卷，(D.Glover编)；Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》)(N.Gait编，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(《分子克隆实践指南》)(1984)；和Fundamental Virology(《基础病毒学》)，第二版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请(无论是上文或下文)均全文纳入本文作为参考。必须注意，除非另有明确表述，本说明书和附加的权利要求书中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式。除非另有指明，本说明书所用的所有科技术语的意义与本领域共同使用的相同。本说明书中使用的以下词语或短语具有指定的意义。
术语“含有”表示“包含”以及“由……构成”，例如“含有”X的组合物可仅由X构成或可包含其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。
述及两条氨基酸序列之间的序列相同性百分比表示，当排列时，两条序列相比较的相同氨基酸百分比。可利用本领域已知的软件程序，例如CurrentProtocols in Molecular Biology(《分子生物学最新方法》)，(F.M.Ausubel等编，1987)，增刊30的第7.7.18部分中所述的那些来程序来测定该排列对比的同源性或序列相同性百分比。优选的排列对比可用仿射(affine)空位检索通过Smith-Waterman同源性检索算法测定，其中空位开放罚分为12，空位延伸罚分为2，BLOSUM矩阵为62。Smith-Waterman同源性检索算法公开于Smith和Waterman，(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489。
下文提供了IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母氨基酸符号以及三字母密码，提供这些也是为参考目的。
A  Ala  丙氨酸
C  Cys  半胱氨酸
D  Asp  天冬氨酸
E  Glu  谷氨酸
F  Phe  苯丙氨酸
G  Gly  甘氨酸
H  His  组氨酸
I  Ile  异亮氨酸
K  Lys  赖氨酸
L  Leu  亮氨酸
M  Met  甲硫氨酸
N  Asn  天冬酰胺
P  Pro  脯氨酸
Q  Gln  谷氨酰胺
R  Arg  精氨酸
S  Ser  丝氨酸
T  Thr  苏氨酸
V  Val  缬氨酸
W  Trp  色氨酸
Y  Tyr  酪氨酸
除非另有指出，本文所用的术语具有本领域技术人员所理解的常规意义。为有助于理解本发明，本文使用许多明确的术语来指明本发明的具体原理。当如此使用时，应具有以下含意：
也如上所述，在评价代表8种不同砂眼衣原体血清变型的14株砂眼衣原体临床分离物LcrE基因的等位基因变体的过程中，申请人确认与以下序列相比，在各砂眼衣原体血清变型中观察到LcrE抗原高于预计数目的单个氨基酸取代：(i)血清变型D的参比砂眼衣原体LcrE序列和(ii)其它免疫原性砂眼衣原体抗原中发现的那些序列。
这一极其出乎意料且令人惊奇的发现提示：
(i)LcrE蛋白经受的免疫学压力可能大于其它免疫原性砂眼衣原体抗原；和
(ii)围绕所述氨基酸取代(位点)的肽可能是表位区域(参与抗体-抗原(Ab-Ag)相互作用的B细胞表位和/或能引发衣原体特异性细胞介导应答的T细胞表位)。
由于这些基因分型研究所用的衣原体分离物得自截然不同的两个免疫学来源，它们从两个不同的大陆(北美洲和欧洲)和不同的时期(至少30年前与5-8年前)分离，因此申请人的发现愈发令人惊奇。
等位基因变体
本文所用的术语“等位基因变体”指染色体上占据相同位置(基因座)的一系列两种或多种不同基因中的任一种。例如，本文提供了核酸序列的核酸分子或区域的“等位基因变体”是基本上在另一或第二分离物的基因组中同一基因座处发生突变的核酸分子或区域，因诸如突变或重组导致的天然变异而具有相似但不相同核酸序列的核酸分子或区域。与和其相比较的基因所编码的蛋白质相比，编码区等位基因变体可编码生物学活性相似，但免疫学活性不一定相同的蛋白质。如下文所述，基因型中突变或变异的性质可影响得到的生物学和/或免疫学表型的功能作用(functional effect)或变化。等位基因变体还可包含在该基因的5’或3’非翻译区域，例如调控区中的变异(例如，参见美国专利5,753,235)。
突变体
本文所用的术语“突变体”指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入。突变体可以具有或不具有功能作用。例如，与参比SEQ ID No 46相比，如果本发明等位基因变体或突变体中的一个或多个差异包括保守性氨基酸取代，例如用具有相关侧链的另一氨基酸取代一个氨基酸，则与该参比序列相比，该突变序列可能不显示具有生物学功能作用。在这方面，遗传编码的氨基酸通常分成4个家族：(1)酸性，即天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)无电荷极性，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时一起分类为芳族氨基酸。这些家族内的单个氨基酸取代通常对生物学或免疫学活性不具主要影响。
另一方面，与参比SEQ ID No 46相比，如果本发明等位基因变体或突变体中的一个或多个差异包括非保守性氨基酸取代，则该取代可能具有功能作用，从而导致，例如表型改变，如抗原序列(如LcrE)的免疫原性改变。例如，对蛋白质实验测定的抗原位点数据分析提示，如果蛋白质表面存在疏水性残基Cys、Leu和Val，则它们最可能是抗原位点的一部分(参见，Kolaskar和Tongaonkar，(1990)FEBS Lett 276(1-2)172-4)。在本发明SEQ ID No 28和SEQID No 185的10个加亮显示突变中，4个突变视作“保守性”，6个突变视作“非保守性”(例如参见，实施例4的表4)。鉴于保守性或非保守性突变的性质不一致(例如，，与氨基酸侧链的性质和各种进化标准相比，物理或化学特征不同)，申请人用存在高频率突变(例如，LcrE序列的64和162位)作为序列内超变区有用标记的一个例子，该序列可能与存在能引发对象免疫原性应答，例如体液和/或细胞介导免疫应答的T和/或B细胞表位区域相关。
作为进一步的说明，申请人已在LcrE血清变型序列中的氨基酸残基64和162处鉴定了两个高频率突变点或超变区。在14株衣原体分离物中，有七株氨基酸残基64处有从甘氨酸(G)到谷氨酸(E)的突变，而在14株衣原体分离物中也有7株的162位有从苏氨酸(T)到丙氨酸(A)的突变。存在两个高频率突变点或超变区(例如，参比序列的残基64和162处)是极其令人惊奇和出乎意料的发现，可能与存在能引发对象免疫原性应答改变的表位区域相关。
砂眼衣原体菌株D/UW-3/CX的LcrE参比序列见SEQ ID NO：46和SEQ IDNo 28及SEQ ID No 185。后一序列还总结了在各种砂眼衣原体血清变型分离物中检测到的所有等位基因突变点或等位基因变异：SEQ ID No 28和SEQ ID No185中围绕所述点突变的下划线标出区域可能对应于B和/或T细胞表位肽区域。
表位
本文所用的术语“表位”通常指抗原上能被T细胞受体和/或抗体识别的位点。优选源自蛋白质抗原或其一部分的短肽。然而，该术语也包括含糖肽和碳水化合物表位的肽。一个抗原性分子可携带几个不同表位。术语“表位”也包括氨基酸或碳水化合物的修饰序列，其能刺激识别整个生物的应答。如果选择的表位是能导致传染性疾病的传染因子，例如砂眼衣原体细菌的表位是理想的。
可从肽或多肽的已知氨基酸和相应DNA序列以及特定氨基酸的性质(例如，大小、电荷等)和密码子字典(codon dictionary)产生表位而无需过多实验。参见，例如Ivan Roitt，Essential Immunoloqy(《基础免疫学》)，1988；Kendrew，同上；Janis Kuby，Immunology(《免疫学》)，1992，例如第79-81页。确定某蛋白质是否刺激了应答的一些准则包括：肽的长度-肽优选长约8或9个氨基酸以适合I类MHC复合物，约13-25个氨基酸长以适合II类MHC复合物。该长度是肽与MHC复合物结合的最短长度。这些肽最好比所述长度长，因为细胞可能切割肽。此种肽可含有能使其高度特异性结合各种I类或II类MHC分子的合适锚定基序，从而能产生免疫应答(参见Bocchia，M.等，Specific Binding ofLeukemia Oncogene Fusion Protein Pentides to HLA Class I Molecules(白血病致癌基因融合蛋白与I类HLA分子的特异性结合)，Blood 85：2680-2684；Englehard，VH，Structure of peptides associated with class I and class II MHCmolecules(I类和II类MHC分子相关肽的结构)，Ann.Rev.Immunol.12：181(1994))。这可通过比较感兴趣蛋白质的序列与MHC分子相关肽的已公布结构来实现，而无需过多实验。因此，技术人员可通过比较该蛋白质序列与蛋白质数据库中所列的序列来确定感兴趣的表位。
T细胞表位
本发明抗原，特别是本发明的LcrE抗原优选含有一个或多个T细胞表位。
本文所用的术语“T细胞表位”通常指能诱导T细胞应答的肽结构中的那些特征序列。就此而言，本领域公认T细胞表位在MHC分子的肽结合裂隙中含有延展构象的线形肽决定簇(Unanue等，(1987)Science 236：551-557)。
本文所用的T细胞表位通常是至少含有约3-5个氨基酸残基的肽，优选至少5-10或更多个毗连的氨基酸残基，优选至少8-10个毗连的氨基酸残基，优选至少10-14个毗连的氨基酸残基，更优选至少9个毗连的氨基酸残基。
然而，本文所用的术语“T细胞表位”包括任何I类MHC或II类MHC分子限制性肽(restricted peptide)。可通过许多熟知的试验，例如淋巴细胞增殖(淋巴细胞激活)试验、CD8+T细胞细胞毒性细胞试验或通过检测致敏对象某表位的特异性T淋巴细胞来测定该特定T细胞表位刺激/提高或改变CMI应答的能力。参见，例如Erickson等，(1993)J.Immunol.151：4189-4199；和Doe等，(1994)Eur.J.Immunol.24：2369-2376，或检测干扰素γ产生的CD8+T-细胞ELISPOT试验(Miyahara等，PNAS(USA)(1998)95：3954-3959)。
CD8+T细胞表位
本发明抗原，特别是本发明单独LcrE抗原优选含有一个或多个CD8+T细胞诱导型表位。CD8+T细胞诱导型表位是给予宿主对象后能刺激特异性CD8+T细胞形成、增加其活性或改变其活性的表位。
本文所用的CD8+T细胞表位通常是至少含有约3-5个氨基酸残基、优选至少5-10个或更多个毗连氨基酸残基、优选至少8-10个毗连氨基酸残基、优选至少10-14个毗连氨基酸残基、更优选至少8个或至少9个毗连氨基酸残基的肽。
可提供各种不同形式的CD8+T细胞表位，例如一个或两个或多个表位的重组串。已鉴定了许多不同疾病的CD8+T细胞表位，这些表位见参考文献。可能设计表位串来产生抵御含有这种CD8+T细胞表位的任何所选抗原的CD8+T细胞应答。可用多表位串来提供CD8+T细胞诱导型表位，所述多个表位连接在一起而无间插序列，因而避免了不必要的核酸物质。
T辅助表位
本发明LcrE抗原优选含有一个或多个辅助T淋巴细胞表位。可采用各种方法鉴定适用的T辅助细胞表位。例如，已知某肽序列的两亲性会影响其用作T辅助细胞诱导物的能力。纳入本文作为参考的美国专利5,128,319全面讨论了T辅助细胞诱导型表位，下文进一步讨论了这些表位。
本文所用的辅助(或CD4+)T细胞表位通常是至少含有约3-5个氨基酸残基、优选至少5-10个或更多个毗连氨基酸残基、优选至少8-10个氨基酸残基、优选至少9个毗连氨基酸残基的肽。更优选至少10-14个毗连氨基酸残基。
表位的组合
本发明抗原，特别是本发明LcrE抗原优选包含CD8+T细胞表位和B细胞表位。本文所用的术语“B细胞表位”通常指抗原上能与特异性抗体分子结合的位点。
本文所用的B细胞表位通常是至少含有约3-5个毗连氨基酸残基、优选至少5-10个或更多个毗连氨基酸残基、优选至少8-10个毗连氨基酸残基、优选至少10-14个毗连氨基酸残基、更优选至少8个或至少9个毗连氨基酸残基的肽。
采用本领域熟知的技术不难鉴定能引发抗体应答的表位。参见，例如Geysen等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002(快速合成肽来测定某给定抗原中免疫原性表位的通用方法)；美国专利号4,708,871(鉴定和化学合成抗原表位的方法)；和Geysen等，(1986)Molecular Immunology(《分子免疫学》)23：709-715(鉴定对某给定抗体具有高亲和力的肽的技术)。
在本发明一优选实施方式中，本发明抗原，特别是本发明的LcrE抗原或LcrE抗原混合物含有CD8+T细胞-诱导型表位和T辅助细胞诱导型表位的混合物。本领域熟知T和B诱导型表位彼此常不同，可包含不同肽序列。因此，蛋白质肽链的某些区域可含有T细胞或B细胞表位。因此，除CD8+T细胞表位之外，优选包含一个或多个T辅助细胞能识别的表位，从而能提高CD8+T-细胞表位产生的免疫应答。
优势免疫表位
当用抗原或抗原组合或编码靶抗原的多个表位的核酸序列或核酸序列组合免疫个体时，在许多情况中，产生的主要应答T淋巴细胞对该靶抗原的一种或多种线形表位具有特异性和/或主要应答B淋巴细胞对该抗原或抗原组合的一种或多种线形或构象表位具有特异性。故而为本发明的目的，这种表位称为“优势免疫表位”。在含有几种优势免疫表位的抗原中，就控制特异性T和/或B细胞应答而言，一种表位可能最具优势。
含有本发明T-细胞和/或B-细胞表位的肽
本发明提供含有选自SEQ ID No 1-184的氨基酸序列的多肽。
该多肽的长度优选少于80个氨基酸(例如，少于75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10等)。
本发明的一些细胞表位(例如，SEQ ID No 181、182、183和184)鉴定为9聚体，但熟知较短的肽可以高亲和力与HLA分子相互作用，因此，本发明还提供的多肽中含有选自SEQ ID 1-184的氨基酸序列的至少7或8个氨基酸的片段。该多肽的长度优选少于80个氨基酸(例如，小于75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11等)。例如，表2给出了至少两个7聚体片段和至少1个8聚体片段。
如果需要，可按照本发明使用这些7聚体和8聚体序列。
类似地，表2给出了至少3个10聚体片段。如果需要，可按照本发明使用这些10聚体片段。
本发明优选提供含有选自SEQ ID No 29-45所示氨基酸序列的多肽。
本发明优选提供含有选自SEQ ID No 47-98所示氨基酸序列的多肽。
本发明优选提供含有选自SEQ ID No 99-184所示氨基酸序列的多肽。
本发明更优选提供含有选自SEQ ID No 54、109、110和111所示氨基酸序列的多肽。
甚至还要优选含有序列IKKKGEKFE(SEQ ID No 181)或IKKKEEKFE(SEQ ID No 182)的多肽。
特别优选这些9聚体和15聚体多肽，因为它们含有的N-末端区段围绕血清变型D的LcrE序列(SEQ ID No 54)和血清变型E的LcrE序列(SEQ ID No109、110和111)中64位残基处的第一高频率突变点或超变区，或在图2所示血清变型序列排列对比中发现的其它血清变型分离物的等价区域或与这些区域相连。
本发明更优选提供含有SEQ No 66、129和130所示氨基酸序列的多肽。
甚至更优选这些多肽含有序列KLKSTLIQA(SEQ ID No 183)或KLKSALIQA(SEQ ID No 184)。
特别优选这些9聚体或15聚体多肽，因为它们含有血清变型D的LcrE序列(SEQ ID No 66)和血清变型E的LcrE序列(SEQ ID No 129和130)中162位残基处的超变区和图2所示在血清变型序列排列对比中发现的其它血清变型分离物的等价区域。
Th1/Th2免疫应答
如上所述，围绕本发明抗原序列，例如LcrE序列中氨基酸取代(位点)的肽可能是表位区域(参与(Ab-Ag相互作用的B细胞表位和/或能引发砂眼衣原体特异性细胞介导免疫应答，例如Th1或Th2细胞免疫应答的T细胞表位)。单用这些区域的相关B-细胞表位和/或T-细胞表位或与其它抗原和/或免疫调节剂联用优选能引发增强的免疫应答。
因为砂眼衣原体感染是胞内感染，目前接受的范例是有效的抗砂眼衣原体免疫接种要求充分的T-细胞应答和中和抗体的血清水平高，“理想的疫苗应能诱导接触砂眼衣原体后持久的(中和)抗体和快速起反应的细胞介导免疫力”。几种有时矛盾的研究表明CD4+和CD8阳性T细胞在衣原体清除中有作用(Loomis和Starnback，(2002)Curr Opin Microbiol 5：87-91)。实际上，目前普遍的共识是特异性CD4+T细胞和B细胞对于完全清除胞内砂眼衣原体和介导抗砂眼衣原体感染的回忆免疫力(recall immunity)至关重要(参见Igietseme，Black和Caldwell，(2002)Biodrugs 16：19-35和Igietseme等，(1999)Immunology 98：510-519)。然而，最近提出的占据表明T细胞疫苗，例如含有一个或多个T细胞表位的免疫原性组合物也可行(参见，例如Webster等，(2005)PNAS 102(13)4836-4841)。
T细胞
本发明提供能与本发明T细胞表位结合的T细胞。本文所用的术语“T-细胞”指在胸腺中成熟并能表达CD3和T-细胞受体的淋巴细胞。其包括原初细胞、记忆细胞和效应细胞。T细胞产生的能与本发明表位特异性结合并由这种相互作用而激活的细胞群有两种类型：效应细胞和记忆细胞。本发明表位激活效应细胞，从而产生细胞因子并杀伤受感染的细胞。一定比例的效应细胞能存活，成为记忆细胞。记忆细胞寿命较长，当再次接触此表位(通过再次给予本发明表位或受衣原体感染)时，可诱导产生新的效应细胞群。产生本发明表位特异性记忆细胞和效应T细胞群可能需要辅助T细胞参与，这些辅助T细胞能提供它们生长和分化所需的因子(例如，细胞因子，如白介素-2)。可采用许多标准方法激活辅助T-细胞。例如，可将本发明表位与一个或多个辅助T细胞表位相连或可共同递送辅助T细胞表位(例如，由核酸载体递送)。
通常认为两种类型的T细胞，辅助T细胞(或CD4+细胞)和细胞毒性(T细胞)(或CD8+细胞)是启动和/或增强细胞介导免疫力和体液免疫力所必需。细胞毒性T-细胞表达CD8共同受体，它们通常称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或CD8+细胞。细胞毒性T-细胞具有T-细胞受体，其能识别由靶细胞呈递的I类MHC蛋白中的T-细胞表位，从而导致能在I类MHC分子内展示本发明T-细胞表位的靶细胞裂解。细胞毒性T-细胞可位于体外或体内。可采用这种T-细胞向宿主内的转移来传递免疫力(“过继免疫疗法”)。可采用各种方法获得和/或检测本发明T-细胞。
CD4 T细胞能表达CD4共同受体，通常称为T辅助细胞。CD4 T细胞能识别与II类MHC分子结合的抗原性肽。与II类MHC分子相互作用后，CD4细胞能分泌如细胞因子等因子。这些分泌的细胞因子能激活B细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞和参与免疫应答的其它细胞。可将辅助T细胞或CD4+细胞进一步分为两种功能不同的亚组：在细胞因子和效应功能上不同的TH1表型和TH2表型。
激活的TH1细胞能增强细胞免疫力(包括抗原特异性CTL的产生增加)，因此在对胞内感染的反应中特别有价值。激活的TH1细胞可分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β的一种或多种。TH1免疫应答可通过激活巨噬细胞、NK(天然杀伤)细胞和CD8细胞毒性T细胞(CTL)导致局部炎性反应。TH1免疫应答也可通过用IL-12刺激B细胞和T细胞生长起到扩大免疫应答的作用。TH1激活的B细胞可分泌IgG2a。
激活的TH2细胞能提高抗体产生，因此在对胞外感染的反应具有价值。激活的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答可导致IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞产生而提供保护力。
免疫应答可包括TH1免疫应答和TH2免疫应答的一种或多种。
TH1免疫应答可包括以下一种或多种情况：CTL增强、一种或多种TH1免疫应答相关细胞因子(例如，IL-2、IFN-γ和TNF-β)分泌增强、激活的巨噬细胞增强、NK活性增加或IgG2a的产生增加。增强的TH1免疫应答偏向包括IgG2a的产生增加。
TH2免疫应答可包括以下一种或多种情况：一种或多种TH2免疫应答相关细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)分泌增加，或IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞的产生增加。增强的TH2免疫应答偏向包括IgG1的产生增加。
利用T辅助细胞诱导剂引发体内CD8+T细胞诱导应答的机制尚未完全清楚。然而，不想局限于理论，但免疫激活剂因其能诱导T辅助细胞而可能导致有助于特异性CD8+T-细胞克隆扩增(clonal expansion)和传播的所需细胞因子水平提高。无论潜在的机制，可以预见联用辅助T细胞和本发明的CD8+T-细胞诱导型抗原组合的混合物有助于引发CMI应答。特别合适的T辅助细胞表位是在HLA类型不同的个体中有活性的那些表位，例如破伤风的T辅助表位(大多数个体已对其致敏)。也可用包含B细胞表位来刺激B细胞应答和抗体产生也是。也可构建合成的核苷酸序列来产生两种类型的免疫应答：只是T细胞应答和联合的T细胞与B细胞应答。
本发明免疫原性组合物，特别是含有一种或多种本发明LcrE抗原的免疫原性组合物可以单独使用或与其它LcrE抗原和/或其它衣原体抗原或性传播疾病(STD)相关的其它抗原联用，任选与能引发Th1和/或Th2应答的免疫调节剂联用。
本发明还包括含有一种或多种免疫调节剂，例如矿物盐，如铝盐和含有CpG基序的寡核苷酸的免疫原性组合物。免疫原性组合物最优选包含铝盐和含有CpG基序的寡核苷酸。或者，免疫原性组合物包含ADP核糖基化毒素，例如脱毒的ADP核糖基化毒素和含CpG基序的寡核苷酸。一种或多种免疫调节剂优选包含佐剂。佐剂可以选自下文进一步描述的TH1佐剂和TH2佐剂。佐剂可以选自。
本发明组合物优选能引发细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答，从而能有效克服砂眼衣原体的胞内感染。该免疫应答优选接触砂眼衣原体后能诱导持久的(例如，中和性)抗体和快速反应的细胞介导免疫力。
实施例中进一步讨论了使用矿物盐，例如铝盐和含有CpG基序的寡核苷酸的混合物能增强免疫应答。使用这种免疫调节剂组合能增强免疫应答完全出乎意料，这不能从单独使用的各免疫调节剂预见。因此，本发明包括含有CpG基序的寡核苷酸，矿物盐，例如铝盐，和性传播疾病(STD)相关抗原，例如砂眼衣原体抗原，如LcrE抗原。下文和实施例中进一步讨论了衣原体抗原的其它例子，例如但不限于CT242、CT381、CT396、CT398和/或CT045和/或性传播疾病(STD)相关抗原。
本发明还提供用作药物的本发明组合物。所述药物优选能在哺乳动物中产生免疫应答(免疫原性组合物)，更优选疫苗。本发明还提供本发明组合物在制备用于在哺乳动物中产生免疫应答的药物中的应用。所述药物优选疫苗。
上述免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答的一种或两种。免疫应答优选提供增强的TH1应答和增强的TH2应答中的一种或两种。
上述免疫应答可以是提高的或增强的或改变的免疫应答。
上述免疫应答可以是全身性或粘膜免疫应答中的一种或两种。上述免疫应答优选提供增强或改变的全身性免疫应答和增强或改变的粘膜免疫应答中的一种或两种。粘膜免疫应答优选TH2免疫应答。粘膜免疫应答优选包括IgA的产生增加。
本发明还提供装有第一组件(component)的试剂盒，该第一组件装有砂眼衣原体抗原，特别是LcrE抗原的混合物。砂眼衣原体抗原的混合物可以是一种或多种本发明免疫原性组合物。该试剂盒还可装有第二组件，该第二组件装有一种或多种以下事物：使用说明书、注射器或其它递送装置、佐剂或药学上可接受的配制溶液。
本发明还提供预填充了本发明免疫原性组合物的递送装置。
本发明还提供在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包括给予有效量的本发明组合物的步骤。此免疫应答优选保护性的，优选包括抗体和/或细胞介导的免疫力。此免疫应答优选包括TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或两种。该方法可引起加强应答。
哺乳动物优选人。当预防性使用疫苗时，所述人优选儿童(例如，幼童或婴儿)或青少年；当治疗性使用疫苗时，所述人优选青少年或成年人。打算用于儿童的疫苗也可给予成年人，例如来评估安全性、剂量、免疫原性等。所述人优选青少年。所述人更优选青春期前的青少年。所述人甚至更优选青春期前的女性和男性。所述青春期前的男性或女性优选约9-12岁。青春期男性或女性优选约15-19岁。所述男性或女性优选约20-49岁。所述男性或女性优选49岁以上。靶患者生活型优选同性恋或性工作者(例如，娼妓)。
测定免疫应答效力的测试
评估本发明免疫原性组合物中蛋白质组分的免疫原性的一种方法是重组表达蛋白质并通过免疫印迹筛检患者血清或粘膜分泌物。蛋白质和患者血清之间的阳性反应表明患者以前对所述蛋白质产生过免疫应答，即该蛋白质是免疫原。该方法还可用于鉴定优势免疫蛋白和/或表位。
检测治疗性治疗效力的另一种方法包括给予本发明组合物后监测砂眼衣原体感染。检测预防性治疗效力的一种方法是给予组合物后监测抗本发明组合物中砂眼衣原体抗原的全身性(例如，监测IgG1和IgG2a产生的水平)和粘膜(例如，监测IgA产生的水平)免疫应答。通常在免疫接种后但在攻击前测定血清砂眼衣原体特异性抗体应答，而在免疫接种后和攻击后测定粘膜砂眼衣原体特异性抗体应答。
这些应用和方法优选用于预防和/或治疗砂眼衣原体所致疾病(例如，砂眼、盆腔炎性疾病、附睾炎、婴儿肺炎等)。这些组合物也可有效抵御肺炎衣原体(C.pneumoniae)感染。
在给予宿主，例如人之前可在体外和体内动物模型中评估本发明疫苗组合物。例如，Peterson等(1988)所述的体外中和适合于测试针对砂眼衣原体的疫苗组合物。
下文描述了这种体外测试的一个例子。用含5％豚鼠血清的PBS稀释超免疫抗血清作为补体来源。向抗血清稀释液中加入砂眼衣原体(104IFU；包涵体形成单位(inclusion-forming unit))。37℃温育抗原-抗体混合物45分钟，一式两份接种于装在玻璃小瓶(例如，15×45mm)中的汇合Hep-2或HeLa细胞单层，所述小瓶在接种前用PBS洗涤两次。先以1000×g离心1小时，然后在37℃静止温育1小时来感染单层细胞。感染的单层温育48或72小时，固定并用砂眼衣原体特异性抗体，例如抗-MOMP染色。放大200×计数10个视野中携带含包涵体的细胞。按照与对照单层/IFU相比得到50％抑制的稀释度指定为中和滴度。
也可通过用免疫原性组合物接种以砂眼衣原体感染进行攻击的动物模型，例如豚鼠或小鼠从而测定本发明免疫原性组合物的体内效力。免疫原性组合物可以源自或不源自用作攻击血清变型的同一血清变型。免疫原性组合物优选源自用作攻击血清变型的同一血清变型。免疫原性组合物和/或攻击血清变型更优选源自生殖道血清变型：D、E、F、H、I和K和/或它们的组合。免疫原性组合物和/或攻击血清变型甚至更优选源自生殖道血清变型：D、E、F和I。免疫原性组合物和/或攻击血清变型甚至更优选源自生殖道血清变型：D、E和F。在妇女中，血清型D和F与无症状感染相关，而血清型E与有症状和无症状感染相关。通常与男性感染相关的其它可能的血清变型包括LGV血清变型。本发明的血清变型可得自临床分离物或培养物保藏所，例如美国组织培养物保藏所(ATCC)。
体内效力模型包括但不限于：(i)利用人砂眼衣原体血清型，例如血清型D、E、F、H、I和K的鼠科感染模型；(ii)鼠科疾病模型，该模型是利用适应小鼠的砂眼衣原体菌株，例如砂眼衣原体小鼠肺炎(MoPn)菌株(也称为鼠肺炎衣原体)的鼠科模型；和(iii)利用人砂眼衣原体分离物的灵长类模型。MoPn菌株是小鼠病原体，而人砂眼衣原体血清型，例如血清型D、E、F、H、I和K是人病原体(参见，例如Brunham等，(2000)J Infect Dis 181(增刊3)S538-S543；Murdin等，(2000)J Infect Dis 181(增刊3)S544-S551和Read等，(2000)NAR 28(6)；1397-1406)。如实施例所述，人砂眼衣原体血清型，例如血清变型D可用于小鼠模型中，虽然通常它们需要的接种物多或要用孕酮预处理。一般使用孕酮，因为似乎孕酮能使生殖道上皮对衣原体感染更敏感(参见Pal等，2003 Vaccine21：1455-1465)。在另一方面，认为从小鼠组织原始分离的MoPn是天然鼠科病原体，因而能提供进化上适应的病原体来分析宿主-病原体相互作用。虽然认为MoPn血清变型与人衣原体血清变型具有高度DNA同源性，但其还具有一些独特的特性(参见，例如Pal等，(2002)Infection and Immunity 70(9)；4812-4817)。
例如，可用砂眼衣原体的鼠科模型进行体内疫苗组合物攻击研究(Morrison等，1995)。下文描述了该类方法的一个例子。7-12周龄的雌性小鼠在阴道感染的前10天和3天皮下接受2.5mg甲羟孕酮醋酸酯(depoprovera)。疫苗接种后，在生殖道中用5ml蔗糖-磷酸-谷氨酸缓冲液(pH 7.4)中所含的1,500个包涵体形成单位的砂眼衣原体感染小鼠。通过使用砂眼衣原体特异性抗血清的间接免疫荧光法测定携带包涵体的细胞百分比，或通过受感染小鼠生殖道刮除物涂片的吉姆萨染色来监测感染过程。通过酶联免疫吸附测定来检测小鼠血清中的抗体滴度。可利用许多不同的免疫接种途径，例如但不限于肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、鼻内(i.n.)、皮下(s.c)或经皮(t.c)途径给予本发明免疫原性组合物。通常可采用任何给药途径，只要能在所需的粘膜表面产生预期的免疫应答。类似地，可通过许多不同途径给予攻击血清变型。攻击血清变型通常粘膜给药，例如但不限于生殖道攻击或鼻内(i.n)攻击。
其它体内效力模型包括豚鼠模型。例如，可用砂眼衣原体感染的豚鼠模型进行体内疫苗组合物攻击研究。下文描述了该类方法的一个例子。将体重450-500g的雌性豚鼠以12小时白天-黑夜周期关在环境受控的房间内，经各种免疫接种途径用疫苗组合物免疫。疫苗接种后，经生殖道用在HeLa或McCoy细胞中生长的豚鼠包涵体性结膜炎(GPIC)物质感染小鼠(Rank等，(1988))。每只豚鼠接受0.05ml蔗糖-磷酸-谷氨酸缓冲液(pH 7.4)中所含的约1.4×107包涵体形成单位(IFU)(Schacter，1980)。通过使用GPIC特异性抗血清的间接免疫荧光法测定携带包涵体的细胞百分比，或通过生殖道刮除物涂片的吉姆萨染色来监测感染过程(Rank等，1988)。通过酶联免疫吸附测定来检测血清抗体滴度。
或者，可用砂眼衣原体的鼠科模型进行体内疫苗组合物攻击研究(Morrison等，1995)。下文描述了该类方法的一个例子。7-12周龄的雌性小鼠在阴道感染前10天和3天皮下接受2.5mg甲羟孕酮醋酸酯。疫苗接种后，经生殖道用5ml蔗糖-磷酸-谷氨酸缓冲液(pH 7.4)中所含的1,500个包涵体形成单位的砂眼衣原体感染小鼠。通过使用砂眼衣原体特异性抗血清的间接免疫荧光法测定携带包涵体的细胞百分比，或通过受感染小鼠生殖道刮除物涂片的吉姆萨染色来监测感染过程。通过酶联免疫吸附测定来检测小鼠血清抗体滴度。
表位作图
如下所示制作血清变型变体(serovar variant)，例如但不限于LcrE血清变型变体的表位图谱：利用WO 05/002619所述的生殖道感染小鼠模型。所有血清变型变体，例如LcrE变体表达为重组蛋白质，WO 05/002619也描述了该方法。用重组LcrE变体免疫接种小鼠(用或不用砂眼衣原体攻击)。然后分离受免疫小鼠(用或不用砂眼衣原体攻击)的脾细胞，用CT LcrE特异性肽(实施例2所示的SEQ ID No 29-45，实施例3所示的SEQ ID No 47-98和实施例4所示的SEQ IDNo 99-180、181、182、183和/或184)脉冲。然后根据是否存在脾细胞增殖、介体细胞应答(mediator response)(例如通过上述各种测试检测Th1或Th2细胞应答)评估脾细胞对各CT LcrE特异性肽的应答。
本发明组合物通常直接给予患者。可通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或注射到组织的间质间隙)，或粘膜给药，例如直肠、口服(例如，片剂、喷剂)、阴道、局部、透皮(参见例如WO99/27961)或经皮(参见例如WO02/074244和WO02/064162)、鼻内(参见例如WO03/028760)、眼部、耳部、肺部或其它粘膜给药实现直接递送。
可利用本发明引发全身性和/或粘膜免疫力，优选引发增强的全身性和/或粘膜免疫力。
增强的全身性和/或粘膜免疫力优选反映为增强的TH1和/或TH2免疫应答。增强的免疫应答优选包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA产生的增加。
剂量治疗可以是单剂量方案(single dose schedule)或多剂量方案(multipledose schedule)。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各种剂量，例如胃肠外致敏和粘膜加强，粘膜致敏和胃肠外加强等。
衣原体感染可影响身体的各区域，因此可将本发明组合物制备成各种形式。例如，可将组合物制备成注射剂，例如液体溶液或混悬液。还可制备适合于在注射前用液体载体溶解或悬浮的固体形式(例如，冻干组合物或喷雾冷冻干燥组合物)。可将组合物制备为局部给药剂型，例如软膏、乳膏或粉末。可将组合物制备为口服给药剂型，例如片剂或胶囊、喷剂或糖浆(任选加入调味剂)。可将组合物制备为用于肺部给药，例如利用细粉的吸入剂或喷雾剂。可将组合物制备为栓剂或阴道栓剂。可将组合物制备为鼻部、耳部或眼部给药剂型，例如滴剂。组合物可以是试剂盒形式，所述试剂盒设计成可在给予患者之前重建的混合组合物。这种试剂盒可装有一种或多种液体形式的抗原以及一种或多种冻干抗原。
用作疫苗的免疫原性组合物含有免疫有效量的抗原以及所需的任何其它组分。“免疫有效量”指给予个体的用量对于治疗或预防有效，所述量可以是单剂量或者是一系列剂量中的一部分。这种用量根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类(例如，非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配方、治疗医生对病情的判断以及其它有关因素而有所不同。预计这种用量将处于可通过常规试验确定的相对较宽范围内。
组合物的其它组分
除上述组分外，本发明组合物通常含有一种或多种“药学上可接受的载体”，其包括本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的运载体一般是大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。这种运载体是本领域普通技术人员熟知的。疫苗也可含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。药学上可接受的赋形剂的详尽讨论见参考文献18。
免疫调节剂
本发明疫苗可与其它免疫调节剂联合给予。具体地说，组合物通常包含一种佐剂。本发明所用的佐剂包括但不限于以下一种或多种：
A.含矿物质的组合物
适合用作本发明佐剂的含矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(如过氧化物(oxyhydroxide))、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等(如参见Vaccine Design(《疫苗设计》)的第8和9章，(1995)，Powell和Newman编，ISBN：030644867X.Plenum.)，或不同矿物质化合物的混合物(例如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选磷酸盐过量)，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，这些盐优选、(具有)吸附性。含有矿物质的组合物也可配制为金属盐颗粒(WO00/23105)。
本发明疫苗中可包含铝盐，Al3+的剂量在0.2-1.0mg/剂之间。
优选的佐剂是铝佐剂，优选AlOH。
B.油乳剂
适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59(利用微流化仪配制成亚微米颗粒的5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85)。参见WO90/14837。也参见Frey等，“Comparison of the safety，tolerability，andimmunogenicity of a MF59-adjuvanted influenza vaccine and a non-adjuvantedinfluenza vaccine in non-elderly adults”(在非老年成年人中比较加入MF59佐剂的流感疫苗和未加入佐剂的流感疫苗的安全性、耐受性和免疫原性)，Vaccine(2003)21：4234-4237。MF59在FLUADTM流感病毒三价亚单位疫苗中用作佐剂。
特别优选用于组合物中的佐剂是亚微米水包油乳剂。本文所用的优选亚微米水包油乳剂是任选含有不同含量的MTP-PE的角鲨烯/水乳剂，例如含4-5％w/v角鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80TM(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)和/或0.25-1.0％司盘85TM(失水山梨醇三油酸酯)和任选的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂，例如称为“MF59”的亚微米水包油乳剂(全文纳入本文作为参考的国际公布号WO90/14837；美国专利号6,299,884和6,451,325；和Ott等，“MF59--Design and Evaluation of a Safe and PotentAdjuvant for Human Vaccines”(MF59-人用疫苗的一种安全而强效佐剂的设计与评估)，刊于Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(《疫苗设计：亚单位和佐剂方法》)(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)，Plenum Press，纽约，1995，第277-296页)。MF59含有4-5％w/v角鲨烯(如4.3％)、0.25-0.5％w/v吐温80TM和0.5％司盘85TM，并任选含有各种含量的MTP-PE，用微流化仪，例如110Y型微流化仪(微射流公司(Microfluidics)，Newton，MA)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE的含量可以是约0-500μg/剂，更优选0-250μg/剂，最优选0-100μg/剂。本文所用的术语“MF59-0”指不含MTP-PE的以上亚微米水包油乳剂，而术语“MF59-MTP”表示含有MTP-PE的制剂。例如，“MF59-100”含有100μg MTP-PE/剂，等等。MF69是本文所用的另一种亚微米水包油乳剂，其含有4.3％w/v角鲨烯、0.25％w/v吐温80TM和0.75％w/v司盘85TM和任选的MTP-PE。还有另一种亚微米水包油乳剂MF75，也称为SAF，其含有10％角鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，也微流化成亚微米乳剂。MF75-MTP表示含有MTP的MF75制剂，例如100-400μg MTP-PE/剂。
全文纳入本文作为参考的国际公布号WO90/14837和美国专利号6,299,884和6,45 1,325详细描述了用于组合物中的亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂，例如胞壁酰肽。完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可用作本发明佐剂。
C.皂苷制剂
皂苷制剂也可用作本发明佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologous group)。皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮中的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可商品化获自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata)(婚纱花(brides veil))和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根(soap root))。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。
也可利用高效薄层色谱(HP-LC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化皂苷组合物。已经鉴定了用这些技术专门纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。美国专利号5,057,540披露了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇(参见WO96/33739)。
可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM一般也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选含有QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。EP0109942、WO96/11711和WO96/33739进一步描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它洗涤剂。参见WO00/07621。
皂苷佐剂开发的综述见Barr等，“ISCOMs and other saponin basedadjuvants”(ISCOM和其它皂苷佐剂)，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32：247-271。也参见Sjolander等，“Uptake and adjuvant activity of orallydelivered saponin and ISCOM vaccines”(口服递送皂苷和ISCON疫苗的摄入和佐剂活性)，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32：321-338。
D.病毒体和病毒样颗粒
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种任选与磷脂混合或用磷脂配制的病毒蛋白质。它们通常无致病性、不能复制，通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP中的这些病毒蛋白包括源自以下的蛋白质：流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白p1)。WO03/024480、WO03/024481和Niikura等，“Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-LikeParticles as an Oral Vaccine Vehicle Presenting Foreign Epitopes”(嵌合型重组戊肝病毒样颗粒作为口服疫苗载体呈递的外来表位)，Virology(2002)293：273-280；Lenz等，“Papillomarivurs-Like Particles Induce Acute Activation ofDendritic Cells”(乳头瘤病毒样颗粒诱导树突状细胞的急性激活)，Journal ofImmunology(2001)5246-5355；Pinto等，“Cellular Immune Responses to HumanPapillomavirus(HPV)-16 L1 Healthy Volunteers Immunized with RecombinantHPV-16 L1 Virus-Like Particles”(用重组HPV-16 L1病毒样颗粒免疫健康志愿者对人乳头瘤病毒(HPV)-16 L1的细胞免疫应答)，Journal of Infectious Diseases(2003)188：327-338；和Gerber等，“Human Papillomavrisu Virus-Like ParticlesAre Efficient Oral Immunogens when Coadministered with Escherichia coliHeat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG”(与大肠杆菌热不稳定肠毒素突变体R192G或CpG共同给予时人乳头瘤病毒样颗粒是有效的口服免疫原)，Journal of Virology(2001)75(10)：4752-4760进一步讨论了VLP。例如，Gluck等，“New Technology Platforms in the Development of Vaccines for the Future”(未来疫苗开发的新技术平台)，Vaccine(2002)20：B10-B16进一步讨论了病毒体。鼻内三价INFLEXALTM产品{Mischler和Metcalfe，(2002)Vaccine 20，增刊5：B17-23}和INFLUVAC PLUSTM产品中使用免疫增强型重建流感病毒体(IRIV)作为亚单位抗原递送系统。
E.细菌或微生物衍生物
适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如：
(1)肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物
这种衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是含有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。EP 0 689 454公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”足够小从而可经0.22μm膜无菌过滤(参见EP 0 689 454)。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529。参见Johnson等，(1999)Bioorg Med Chem Lett9：2273-2278。
(2)脂质A衍生物
脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A的衍生物，例如OM-174。例如，Meraldi等，“OM-174，a New Adjuvant with a Potential for Human Use，Induces aProtective Response with Administered with the Synthetic C-Terminal Fragment242-310 from the circumsporozoite protein of Plasmodium berghei”(一种可能应用于人类的新佐剂OM-174与柏格氏鼠疟原虫的环孢子蛋白的合成C-末端片段242-310一起给予能诱导保护性应答)，Vaccine(2003)21：2485-2491；和Pajak等，“The Adjuvant OM-174 induces both the migration and maturation of murinedendritic cells in vivo”(佐剂OM-174能诱导小鼠树突状细胞的体内迁移和成熟)，Vaccine(2003)21：836-842描述了OM-174。
(3)免疫刺激性寡核苷酸
适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键与鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。
CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰并且可以是双链或单链。可任选用类似物，例如2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。可能的类似物取代可参见Kandimalla等，“Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern：design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotideagents with distinct cytokine induction profiles”(趋异性合成核苷酸基序识别模式：具有不同细胞因子诱导模式的强效免疫调节性寡脱氧核糖核苷酸的设计与开发)，Nucleic Acids Research(2003)31(9)：2393-2400；WO02/26757和WO99/62923。Krieg，“CpG motifs：the active ingredient in bacterial extracts？”(CpG基序：细菌提取物中的活性成分？)，Nature Medicine(2003)9(7)：831-835；McCluskie等，“Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategies inmice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA”(乙肝表面抗原和CpG DNA的小鼠胃肠外和粘膜致敏-加强免疫方案)，FEMS Immunology and MedicalMicrobiology(2002)32：179-185；WO98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116和美国专利号6,429,199进一步讨论了CpG寡核苷酸作为佐剂的作用。
CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla等，“Toll-like receptor 9：modulation of recognition and cytokine induction bynovel synthetic CpG DNAs”(Toll样受体9：通过新型的合成CpG DNA调节识别和细胞因子诱导)，Biochemical Society Transactions(2003)31(部分3)：654-658。CpG序列，例如CpG-A ODN能特异性诱导Th1免疫应答，或者，例如CpG-B ODN能更特异地诱导B细胞应答。Blackwell等，“CpG-A-InducedMonocyte IFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulated byPlasmacytoid Dendritic Cell Derived IFN-alpha”(浆细胞样树突状细胞衍生的IFN-α调节CpG-A-诱导的单核细胞IFN-γ-可诱导蛋白质-10产生)，J.Immunol.(2003)170(8)：4061-4068；Krieg，“From A to Z on CpG”(CpG从A到Z)，TRENDS in Immunology(2002)23(2)：64-65和WO01/95935讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选CpG-A ODN。
优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。任选将两条CpG寡核苷酸序列在它们的3’端相连以形成“免疫聚体”(immunomer)。参见，例如Kandimalla等，“Secondary structures in CpG oligonucleotides affectimmunostimulatory activity”(CpG寡核苷酸中的二级结构影响免疫刺激活性)，BBRC(2003)306：948-953；Kandimalla等，“Toll-like receptor 9：modulation ofrecognition and cytokine induction by novel synthetic GpG DNAs”(Toll样受体9：通过新型的合成CpG DNA调节识别和细胞因子诱导)，Biochemical SocietyTransactions(2003)31(部分3)：664-658；Bhagat等，“CpG penta-andhexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents”(CpG五和六脱氧核糖核苷酸是强效的免疫调节剂)，BBRC(2003)300：853-861和WO03/035836。
此类佐剂优选CpG。佐剂更优选明矾和CpG或AlOH和CpG。
(4)ADP-核糖基化毒素和它们的脱毒衍生物
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选源自大肠杆菌(即，大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)、霍乱(弧菌)(“CT”)或百日咳(杆菌)(“PT”)。WO95/17211描述了脱毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，WO98/42375描述了其作为胃肠外佐剂的应用。佐剂优选脱毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见以下参考文献，各篇参考文献的内容全文纳入本文作为参考：Beignon等，“The LTR72 Mutant ofHeat-Labile Enterotoxin of Escherichia coli Enahnces the Ability of PeptideAntigens to Elicit CD4+T Cells and Secrete Gamma Interferon after Coapplicationonto Bare Skin”(共同施用于裸露皮肤上后大肠杆菌的热不稳定肠毒素的LTR72突变体能增强肽抗原引发CD4+T细胞和分泌γ干扰素的能力)，Infection andImmunity(2002)70(6)：3012-3019；Pizza等，“Mucosal vaccines：non toxicderivatives of LT and CT as mucosal adjuvants”(粘膜疫苗：作为粘膜佐剂的LT和CT的无毒衍生物)，Vaccine(2001)19：2534-2541；Pizza等，“LTK63 andLTR72，two mucosal adjuvants ready for clinical trials”(LTK63和LTR72，两种准备进行临床试验的粘膜佐剂)，Int.J.Med.Microbiol(2000)290(4-5)：455-461；Scharton-Kersten等，“Transcutaneous Immunization with BacterialADP-Ribosylating Exotoxins，Subunits and Unrelated Adjuvants”(用细菌ADP-核糖基化内毒素、亚单位和无关佐剂进行经皮免疫接种)，Infection and Immunity(2000)68(9)：5306-5313；Ryan等，“Mutants of Escherichia coli Heat-Labile ToxinAct as Effective Mucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Acellular PertussisVaccine：Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity onTh1 and Th2 Cells”(大肠杆菌热不稳定毒素用作鼻部递送非细胞百日咳疫苗的有效粘膜佐剂：无毒AB复合物与酶活性对Th1和Th2细胞的差别作用)，Infection and Immunity(1999)67(12)：6270-6280；Partidos等，“Heat-labileenterotoxin of Escherichia coli and its site-directed mutant LTK63 enhance theproliferative and cytotoxic T-cell responses to intranasally co-immunized syntheticpeptides”(大肠杆菌的热不稳定肠毒素及其定点突变体LTK63能增强针对鼻内共同免疫接种的合成肽的增殖性和细胞毒性T-细胞应答)，Immunol.Lett.(1999)67(3)：209-216；Peppoloni等，“Mutants of the Escherichia coli heat-labileenterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasal delivery of vaccines”(大肠杆菌热不稳定肠毒素的突变体作为鼻内递送疫苗的安全和强效佐剂)，Vaccines(2003)2(2)：285-293；和Pine等，(2002)，“Intranasal immunization with influenzavaccine and a detoxified mutant of heat labile enterotoxin from Escherichia coli(LTK63)”(用流感疫苗和大肠杆菌热不稳定肠毒素的脱毒突变体(LTK63)进行鼻内免疫接种)，J.Control Release(2002)85(1-3)：263-270。氨基酸取代的数字基准优选以Domenighini等，Mol.Microbiol(1995)15(6)：1165-1167所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基排列对比为基础，该文献专门全文纳入本文作为参考。
此类佐剂优选LTK63。佐剂也优选LTK72。
F.生物粘合剂和粘膜粘合剂
生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球(Singh等，(2001)J.Cont.Rele.70：267-276)，或者粘膜粘合剂，例如聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂。例如，WO99/27960。
G.微粒
微粒也可用作本发明的佐剂。可从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选用聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直径约100nm到150μm，优选约200nm到约30μm，最优选约500nm到约10μm的颗粒)，任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。
H.脂质体
适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于美国专利号6,090,406；美国专利号5,916,588和EP 0 626 169。
I.聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯制剂
适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。WO99/52549。这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂(WO01/21207)以及联用至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)。
优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
J.聚磷腈(PCPP)
PCPP制剂描述于，例如Andrianov等，“Preparation of hydrogelmicrospheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions”(通过聚磷腈水溶液的凝聚制备水凝胶微球)，Biomaterials(1998)19(1-3)：109-115和Payne等，“Protein Release from Polyphosphazene Matrices”(聚磷腈基质的蛋白质释放)，Adv.Drug.Delivery Review(1998)31(3)：185-196。
K.胞壁酰肽
适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
L.咪唑并喹诺酮化合物
适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括Stanley，“Imiquimod and the imidazoquinolones：mechanism of action and therapeuticpotential”(咪喹莫特和咪唑并喹诺酮：作用机制和治疗潜力)，Clin Exp Dermatol(2002)27(7)：571-577和Jones，“Resiquimod 3M”(瑞喹莫德3M)，Curr OpinInvestig Drugs(2003)4(2)：214-218中进一步描述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物。
本发明也包括联用一种或多种以上鉴定的佐剂的各方面。例如，以下佐剂组合物可用于本发明：
(1)皂苷和水包油乳剂(WO99/11241)；
(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO94/00153)；
(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；
(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)(WO98/57659)；
(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂混合物(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；
(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化成亚微米乳剂或旋振(vortex)产生较大粒度的乳剂；
(7)RibiTM佐剂系统(RAS)，(Ribi免疫化学公司(Ribi Immunochem))，其含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种由单磷酸酰脂质A(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)组成的细菌细胞壁组分；和
(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(例如3dMPL)。
铝盐和MF59是可注射流感疫苗所用的优选佐剂。细菌毒素和生物粘合剂是粘膜递送疫苗，例如鼻疫苗的优选佐剂。
M.人免疫调节剂
适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
融合蛋白
本发明所用的砂眼衣原体抗原可作为单独的不同多肽存在于组合物中。本发明的重组融合蛋白通常制备为GST-融合蛋白和/或含His-标签的融合蛋白。
然而，这些抗原中的至少两种(即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)优选表达为一条多肽链(“杂交”多肽)。杂交多肽有两种主要优点：第一，不稳定或本身表达不佳的多肽可通过加入合适的杂交伴侣来克服该问题；第二，工业生产得到简化，因为只需采用一次表达和纯化即可制备均可用作抗原的两种多肽。
在下文讨论中，血清变型E作为第一血清变型群(serovar group)，血清变型D作为第二血清变型群，血清变型K作为第三血清变型群，血清变型F作为第四血清变型群，血清变型G作为第五血清变型群，血清变型H作为第六血清变型群，血清变型I作为第七血清变型群和血清变型J作为第八血清变型群。
该杂交多肽可含有第一血清变型群的两条或多条多肽序列。因此，本发明包括含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的组合物，其中所述第一和第二氨基酸序列选自第一血清变型群的砂眼衣原体抗原或其片段，例如LcrE抗原。该杂交多肽中的第一和第二氨基酸序列优选含有不同表位。
该杂交多肽可含有第二血清变型群的两条或多条多肽序列。因此，本发明包括含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的组合物，其中所述第一和第二氨基酸序列选自第二血清变型群的砂眼衣原体抗原或其片段，例如LcrE抗原。该杂交多肽中的第一和第二氨基酸序列优选含有不同表位。
该杂交多肽可含有第一血清变型群的一种或多种多肽序列和第二血清变型群的一种或多种多肽序列。因此，本发明包括含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的组合物，所述第一氨基酸序列选自第一血清变型群的砂眼衣原体抗原或其片段，例如LcrE抗原，所述第二氨基酸序列选自第二血清变型群的砂眼衣原体抗原或其片段，例如LcrE抗原。该杂交多肽中的第一和第二氨基酸序列优选含有不同表位。
该杂交多肽可含有本发明的一种或多种抗原，例如砂眼衣原体各血清变型的LcrE多肽序列。因此，本发明包括含有第一LcrE氨基酸序列和第二LcrE氨基酸序列的组合物，所述第一氨基酸序列选自血清变型E的砂眼衣原体抗原或其片段，所述第二氨基酸序列选自血清变型D的砂眼衣原体抗原或其片段。该杂交多肽中的第一和第二氨基酸序列优选含有不同表位。
该杂交体优选由两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种LcrE砂眼衣原体抗原的氨基酸序列构成。杂交体特别优选由两种、三种、四种或五种LcrE砂眼衣原体抗原的氨基酸序列构成。
不同杂交多肽可以混合在一种制剂中。在这种组合中，砂眼衣原体可以可以存在于多种杂交多肽中和/或作为非杂交多肽存在。然而，抗原优选以杂交体或非杂交体存在，但不同时以杂交体和非杂交体存在。
杂交多肽可以式NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH表示，其中：X是第一血清变型群、第二血清变型群或第三血清变型群的砂眼衣原体抗原或其片段的氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N-末端氨基酸序列；B是任选的C-末端氨基酸序列；n是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
如果-X-部分含有野生型形式的前导肽序列，则其(前导肽序列)可以包含在杂交蛋白中或省去。一些实施方式删除了此前导肽，除了-X-部分的前导肽位于该杂交蛋白的N-末端，即保留了X1前导肽，但删去了X2...Xn前导肽。这样等同于删除所有前导肽和使用X1前导肽作为部分-A-。
对于{-X-L-}中n的各种实例，接头氨基酸序列-L-可以存在或不存在。例如，当n＝2时，此杂交体可以是NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-通常较短(例如，20个或更少的氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括有助于克隆的短肽序列，聚甘氨酸接头(即，含有Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)，和组氨酸标签(即，Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。本领域技术人员知道其它合适的接头氨基酸序列。一种有用的接头是GSGGGG(SEQ ID 1)，其中Gly-Ser二肽由BamHI限制性位点形成，而有助于克隆和操作，(Gly)4四肽是典型的聚甘氨酸接头。
-A-是任选的N-末端氨基酸序列。其通常较短(例如，40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括引导蛋白质转运(trafficking)的前导序列，或有助于克隆或纯化的短肽序列(例如，组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。本领域技术人员知道其它合适的N-末端氨基酸序列。如果X1缺乏其自身的N-末端甲硫氨酸，-A-优选是提供N-末端甲硫氨酸的寡肽(例如，含1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)。
-B-是任选的C-末端氨基酸序列。其通常较短(例如，40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括引导蛋白质转运的序列，或有助于克隆或纯化的短肽序列(例如，含有组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)或能增强蛋白质稳定性的序列。本领域技术人员知道其它合适的C-末端氨基酸序列。最优选n是2或3。
本发明还提供编码本发明杂交多肽的核酸。此外，本发明提供能与该核酸杂交的核酸，优选在“高严格性”条件下(例如，65℃，0.1×SSC，0.5％SDS溶液)。
可通过各种方法(例如，重组表达、从细胞培养物纯化、化学合成等)将本发明多肽制备成各种形式(例如，天然的、融合的、非糖基化的、脂质化的等)。优选将它们制备成基本纯形式(即，基本上不含其它衣原体或宿主细胞蛋白)。
可通过各种方法(例如，化学合成、从基因组或cDNA文库制备、从生物体本身制备等)将本发明核酸制备成各种形式(例如，单链、双链、载体、探针等)。优选将它们制备成基本纯形式(即，基本上不含其它衣原体或宿主细胞核酸)。
术语“核酸”包括DNA和RNA，也包括它们的类似物，例如含有修饰的骨架(例如，硫代磷酸酯等)的那些类似物，还包括肽核酸(PNA)等。本发明包括含有上述核酸的互补序列的核酸(例如，为反义或检测目的)。
制备本发明产物的方法
本发明还提供制备本发明多肽的方法，包括在能诱导多肽表达的条件下培养用本发明核酸转化的宿主细胞的步骤。
本发明提供制备本发明多肽的方法，包括通过化学方法合成该多肽至少一部分的步骤。
本发明提供制备本发明核酸的方法，其中通过化学合成制备(至少一部分)所述核酸。
本发明提供制备本发明核酸的方法，包括采用引物扩增方法(例如，PCR)扩增核酸的步骤。
本发明提供制备本发明蛋白质复合物的方法，包括使I类MHC蛋白与本发明多肽或其片段接触的步骤。
本发明提供制备本发明蛋白质复合物的方法，包括给予对象本发明多肽或其片段的步骤。该方法可包括从对象纯化复合物的其它步骤。
本发明提供制备组合物的方法，包括将本发明多肽和/或核酸与药学上可接受的载体或稀释剂混合。
本发明多肽的总体特征
可将本发明多肽制备成各种形式(例如，天然的、融合的、糖基化的、非糖基化的等)。
本发明多肽可以与固体支持物相连。
本发明多肽可含有可检测标记(例如，放射性或荧光标记或生物素标记)。
除了T细胞表位，本发明多肽可含有B细胞表位。
菌株
优选的本发明多肽含有在砂眼衣原体血清变型E或一种或多种流行病学上流行的血清型中发现的LcrE氨基酸序列。
优选的本发明多肽含有在砂眼衣原体血清变型D或一种或多种流行病学上流行的血清型中发现的LcrE氨基酸序列。
优选的本发明多肽含有在砂眼衣原体血清变型K或一种或多种流行病学上流行的血清型中发现的LcrE氨基酸序列。
使用杂交多肽时，该杂交体中的各抗原(即，各-X-部分)可来自一种或多种菌株。例如，当n＝2时，X2可以来自与X1相同或不同的菌株。当n＝3时，这些菌株可以是(i)X1＝X2＝X3(ii)X1＝X2≠X3(iii)X1≠X2＝X3(iv)X1≠X2≠X3或(v)X1＝X3≠X2等。
异源宿主
虽然可以在砂眼衣原体中表达本发明多肽，本发明优选利用异源宿主。异源宿主可以是原核(例如，细菌)或真核的。优选大肠杆菌，但其它合适的宿主包括枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如，(结核分枝杆菌)M.tuberculosis)、酵母菌等。
免疫原性组合物和药物
本发明组合物优选免疫原性组合物，更优选疫苗组合物。该组合物的pH优选6-8之间，优选约7。可使用缓冲液维持该pH。该组合物可以是无菌和/或无热原的。该组合物对于人可以是等渗的。
本发明疫苗可以是预防性的(即，防止感染)或治疗性的(即，治疗感染)，但通常是预防性的。因此，本发明包括治疗性或预防性治疗对易受衣原体感染的动物中砂眼衣原体感染的方法，包括给予所述动物治疗性或预防性用量的本发明免疫原性组合物。此免疫原性组合物优选包含砂眼衣原体变异突变体的组合，所述组合选自在不同砂眼衣原体血清变型中发现的两种、三种、四种、五种、六种、七种或所有八种砂眼衣原体LcrE抗原突变体。该组合还要优选由在不同砂眼衣原体血清变型中发现的所有八种砂眼衣原体LcrE抗原变体或突变体构成。
例如，本发明组合物可包含砂眼衣原体抗原的组合，所述组合含有选自以下的至少一种LcrE抗原：(1)基因组GO/86；(2)基因组Cev-1；(3)基因组Cev2；(4)基因组Cev4；(5)基因组Cev5；(5)基因组Cev8；(6)基因组ATTC-E；(7)基因组ATTC-F；(8)基因组ATTC-G；(9)基因组ATTC-H；(10)基因组ATTC-I；(11)基因组ATTC-J和(12)基因组ATTC-K。该组合还可与一种或多种免疫调节剂，例如明矾和CpG或AlOH和CpG混合。除了砂眼衣原体，本发明组合物还可包含源自一种或多种性传播疾病的抗原。所述抗原优选源自一种或多种以下性传播疾病，例如淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)、人乳头瘤病毒、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、单纯疱疹病毒(HSV-1或HSV-2)、HIV(HIV-1或HIV-2)或杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)。
在一优选的实施方式中，本发明提供的免疫原性组合物可涵盖某抗原，例如各血清变型的砂眼衣原体LcrE的突变范围而不是对某具体突变定制的免疫原性组合物。例如，砂眼衣原体LcrE血清变型E免疫原性组合物包含的LcrE序列可含有血清变型E的所有5种等位基因的全部8种突变体。或者，不同砂眼衣原体血清变型等位基因的突变混合物可涵盖血清变型E和除血清变型E以外的血清变型中的突变，因而能赋予交叉血清变型保护作用。例如，8种氨基酸取代可包括J血清变型中所见的4种氨基酸取代。
在一特别优选的实施方式中，该免疫原性组合物包含能引发中和抗体应答的一种或多种衣原体抗原和能引发细胞介导免疫应答的一种或多种衣原体抗原。以此方式，中和抗体应答能防止或抑制初始衣原体感染，而细胞介导免疫应答能引发增强的Th1细胞应答，该应答能防止感染加重和/或扩散。该免疫原性组合物优选包含一种或多种表面抗原和一种或多种胞质抗原。该免疫原性组合物优选包含一种或多种LcrE抗原等和能引发Th1细胞应答的一种或多种其它抗原，例如胞质抗原，如pgp3等。
其它抗原
除了砂眼衣原体外，本发明组合物还含有源自一种或多种性传播疾病的抗原。所述抗原优选源自一种或多种以下性传播疾病：淋病奈瑟菌{例如，19、20、21、22}；人乳头瘤病毒；苍白密螺旋体；单纯疱疹病毒(HSV-1或HSV-2)；HIV(HIV-1或HIV-2)；杜克雷嗜血杆菌。可包含的其它抗原可以是，例如：
-脑膜炎奈瑟菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，例如参考文献23披露的血清群C寡糖{也参见参考文献24}或参考文献25所述的寡糖。
-幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)抗原，如CagA{26-29}，VacA{30，31}，NAP{32，33，34}，HopX{例如，35}，HopY{例如，35}和/或脲酶。
-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)糖抗原{例如，36，37，38}。
-肺炎链球菌的蛋白质抗原{例如，39}。
-甲肝病毒抗原，如灭活的病毒{例如，40，41}。
-乙肝病毒抗原，如表面和/或核心抗原{例如，41，42}。
-丙肝病毒抗原{例如，43}。
-白喉抗原，如白喉类毒素{例如，参考文献44的第3章}，例如，CRM197突变体{例如，45}。
-破伤风抗原，如破伤风类毒素{例如，参考文献44的第4章}。
-百日咳博德特菌抗原，如百日咳全毒素(PT)和百日咳博得特菌丝状血凝素(FHA)，也任选与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3联用{例如，参考文献46和47}；也可使用全细胞百日咳抗原。
-流感嗜血杆菌B(Haemophilus influenzae B)糖抗原{例如，24}。
-脊髓灰质炎病毒抗原{例如，48，49}，如OPV，或优选IPV。
-淋病奈瑟菌抗原{例如，50，51，52，53}(例如Ng13、Ng576(肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(PPIase)或Mip)或NgpIIII)。
-(参见，例如WO 99/57280、WO 00/66791、WO 02/79243和WO 04/112832)
-脑膜炎奈瑟菌血清群B的蛋白质抗原，{例如，参考文献54-65}。
-脑膜炎奈瑟菌血清群B的外膜囊泡(OMV)制品，如参考文献66、67、668、69中所述的那些，等等。
-砂眼衣原体或肺炎衣原体抗原{例如，参考文献70-76}
-(例如Cpn0324，其是肺炎砂眼衣原体(Chlamydia trachomatispneumonia)LcrE等价物)
-牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原{例如，77}。
-苍白密螺旋体抗原.
-狂犬病病毒抗原{例如，78}，如冻干灭活的病毒{例如，79，RabAvertTM}。
-麻疹、流行性腮腺炎和/或风疹抗原{例如，参考文献44的第9、10和11章}。
-流感病毒抗原{例如，参考文献44的第19章}，如血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
-副粘病毒如呼吸道合胞体病毒(RSV{80，81})和/或副流感病毒(PIV3{82})抗原。
-粘膜炎莫拉菌抗原{例如，83}。
-酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)抗原{例如，84，85，86}。
-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)抗原{例如，87}。
-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原{例如，88}。
-炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)抗原{例如，89，90，91}。
-乳头瘤病毒抗原，例如任何HPV类型的。
-单纯疱疹病毒抗原，例如HSV-1或HSV-2的。
-黄病毒科(黄病毒属)病毒抗原，如黄热病毒、日本脑炎病毒、登革病毒的四种血清型、蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒抗原。
-HIV的抗原，例如HIV-1或HIV-2。
-呼肠孤病毒抗原。
-瘟病毒抗原，如来自经典猪发热病毒、牛病毒性腹泻病毒和/或边界病(border disease)病毒。
-细小病毒抗原，例如，来自细小病毒B19。
-冠状病毒抗原，例如SARS冠状病毒的。
-癌抗原，如参考文献92的表1或参考文献93的表3和4中列出的那些。
该组合物可含有这些其它抗原中的一种或多种。该组合物可包含至少一种其它细菌抗原和/或至少一种其它病毒抗原。优选抗原的组合应基于共有特征，例如，呼吸道疾病相关抗原、肠病相关抗原、性传播疾病相关抗原，等等。
优选的组合物包含：(1)第一血清变型群或第二血清变型群的砂眼衣原体抗原的至少t种，其中t是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13，优选t是5；(2)另一种性传播疾病的一种或多种抗原。所述性传播疾病优选选自：单纯疱疹病毒，优选HSV-1和/或HSV-2；人乳头瘤病毒；淋病奈瑟菌；苍白密螺旋体；和杜克雷嗜血杆菌。因此，这些组合物可提供抵御以下性传播疾病的保护作用：砂眼衣原体、生殖器疱疹、生殖器疣、淋病、梅毒和软下疳(参见，参考文献94)。
使用糖或碳水化合物抗原时，优选与载体蛋白偶联，从而能增强免疫原性{例如，参考文献95-104}。优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素。例如白喉或破伤风类毒素。特别优选CRM197白喉类毒素{105}。其它载体多肽包括脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白{106}、合成肽{107，108}、热激蛋白{109，110}、百日咳蛋白{111，112}、流感嗜血杆菌D蛋白{113}、细胞因子{114}、淋巴因子、激素、生长因子、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B{115}、铁摄取蛋白(iron-uptakeprotein){116}等。当混合物包含血清群A和C荚膜糖时，MenA糖：MenC糖的比例(w/w)优选大于1(例如，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，10∶1或更高)。不同糖类可偶联于相同或不同类型的载体蛋白。可采用任何合适的偶联反应和任何需要的合适接头。
需要时可将毒性蛋白质抗原脱毒，例如通过化学和/或遗传性方法使百日咳毒素脱毒。
当该组合物中包含白喉抗原时，还优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，包含破伤风抗原时，优选也包含白喉和百日咳抗原。类似地，包含百日咳抗原时，优选也包含白喉和破伤风抗原。
该组合物中各抗原的浓度通常是至少1μg/ml。任何给定抗原的浓度通常足以引发抗该抗原的免疫应答。
将蛋白质抗原用于本发明组合物的备选方法可使用编码抗原的核酸{例如，参考文献117-125}。因此可用编码蛋白质的核酸(优选DNA，例如质粒形式的DNA)代替本发明组合物中的蛋白质组分。
组合疗法
可联合抗生素治疗方案给予本发明免疫原性组合物。在一个实施方式中，先给予抗生素，再给予本发明抗原或含有本发明抗原的组合物，例如LcrE免疫原性组合物。在另一实施方式中，先给予本发明抗原或含有本发明抗原的组合物，例如LcrE免疫原性组合物，再给予抗生素。适用于治疗砂眼衣原体的抗生素例子包括但不限于：WO 98/17280所述的阿奇霉素或其衍生物或WO04/047759所述的环孢菌素。
该免疫原性组合物优选包含一种或多种变体砂眼衣原体三型分泌系统(Type Three Secretion System)(TTSS)蛋白。
该免疫原性组合物优选包含一种或多种变体砂眼衣原体三型分泌系统(TTSS)蛋白，其含有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID No 29-45或SEQ ID No1-13或SEQ ID No 17-45或SEQ ID No 47-180或SEQ ID No 54、109、110或111或SEQ ID No 66、129或130或SEQ ID No 181、182、183和/或184。
由背景信息可知，TTSS是位于原生小体(EB)上的复杂蛋白质分泌和递送机构或装置，能将蛋白质，例如细菌效应蛋白(可用作抗宿主毒力的决定因子)注入真核细胞的胞质溶胶中以造成细菌感染及改变宿主细胞功能，从而使生物体，例如砂眼衣原体维持的胞内小环境(intracellular niche)中。这些注入的蛋白质(TTSS效应蛋白)对宿主细胞可具有各种作用，包括但不限于操纵肌动蛋白和其它结构蛋白，修饰宿主细胞信号转导系统。也可加工注入的(或易位的)TTSS系统蛋白质或底物并由I类MHC分子呈递。
不是III型分泌系统分泌的所有蛋白质均递送入宿主细胞或具有效应作用。例如，几种III型蛋白质参与分泌过程本身、调节该过程或效应蛋白经过宿主细胞膜的易位。例如，CT089也称为低钙反应元件(lcrE)或CoPn--YopN的衣原体外部蛋白(outer protein)同源物，认为其在没有合适信号存在时用作阻止宿主细胞分泌(可能的前合成蛋白)外周相关调节物(peripherally associated regulator)。它有效“阻塞”了分泌系统的终端直至接收到诱导信号。虽然认为原生小体(EB)“在代谢上是惰性的”，但有假设说膜接触激发了位于(EB)上的衣原体TTS系统，其能释放预先形成的“有效负载”蛋白质。目前的假说是III型分泌系统(TTSS)在衣原体复制周期的胞内阶段被活化，将蛋白质分泌入宿主细胞胞质中和衣原体蛋白质(例如Inc set)插入包涵体膜中使生长中的衣原体微菌落与宿主细胞胞质隔开(参见Montigiani等，(2002)Infection and Immunity 70(1)；386-379)。
例如，据认为LcrE(CT089)蛋白用作某种类型的“分子注射器”，其使效应蛋白穿过细菌和真核细胞膜而直接注射到靶细胞胞质中。因为衣原体细菌寄居在与膜结合的液泡(称为包涵体)中，也有假说认为衣原体TTSS可能将蛋白质易位进入、穿过或经过此液泡膜(即包涵体膜)以及质膜(参见例如Stephens等，1998 Science(282)；754-759)。免疫印迹分析表明感染20小时后，CopN(CT089)和Scc1(CT088)同时存在于衣原体发育形式(developmental form)和全培养物裂解液(whole-culture lysate)中。通过间接免疫荧光法分析感染的单层显示CopN定位于细菌和包涵体膜，而只在衣原体中检测到Scc1。根据这些观察结果可知，看起来虽然CoPn与衣原体直接结合，但它也可分泌并与包涵体膜结合(参见Fields和Hackstadt(2000)Molecular Microbiology 38(5)；1048-1060)。
实施例
本发明只由实施例解释。应该知道实施例只是描述了本发明，可以作出改进而仍维持在本发明的范围和构思中。
实施例1
实施例1的目的：
(i)为评估可能的衣原体候选疫苗在对应于8种不同衣原体血清变型的13株衣原体临床分离物中的等位基因变异程度；和
(ii)为评估迄今为止只根据主要外膜蛋白(MOMP)变体分类的衣原体分离物中的抗原变异程度。
检测的分离物
8株分离物得自ATCC(美国模式培养物保藏所)
根据ATCC目录，这些菌株是1959-1974年在美国从患者的生殖器或眼部拭子中分离。
还检测了属于5种不同流行性衣原体血清变型的6株意大利分离物。这些衣原体菌株从具有与衣原体感染相符的炎症症状的患者分离，这些患者大约于1998-2001年期间在Policlinico St.Orsola，博洛尼亚，意大利接受检查。
通过所述的RFLP(限制性片段长度多态性)方法对这些分离物进行血清分型，该方法评估编码蛋白质MOMP(主要外膜蛋白)的基因omp1中的序列变异。
如上所述，MOMP是砂眼衣原体(CT)感染的主要免疫原，其提供了CT菌株血清型或血清变型分类的基础。
方法
从EB或CT感染的细胞提取基因组DNA，PCR扩增估计含有待研究基因的DNA区段。纯化扩增的区段，按照常规的DNA测序方法用自动DNA测序仪测序。使用各种专业软件，例如GCG软件包。
将如此获得的这些序列编码的蛋白质序列与公用数据库获得的唯一进行全长测序的砂眼衣原体血清变型-D基因组(D/UW-3/CX)多报道的那些序列作比较。
将各基因编码蛋白质中的氨基酸取代，按照唯一全长测序的砂眼衣原体基因组，即血清型-D菌株UW-3/Cx的参比基因组中相应的等位基因进行评分。
血清型排列对比
除利用RFLP技术，主要通过单克隆抗体分型进行血清分型。如上所述，单克隆抗体分型(即，标准血清型特异性单克隆分型)是在用PCR技术之前使用的主要血清分型方法。
结果
表3说明对于不同砂眼衣原体抗原，各血清变型之间也能发现等位基因变异。例如，表3说明了包括8种不同血清变型的14株不同CT临床分离物中6种基因的等位基因变异的评估。如表3所示，发现大多数等位基因变异见于E血清变型中的LcrE(CT089)，其中421氨基酸序列中发现了5个等位基因含有最多8个氨基酸取代点。在两株分离物(Cev8血清变型E和ATCC E)中发现等位基因5同样含8个氨基酸取代，这是极其令人惊奇和出乎意料的发现，因为这两种E血清变型(欧洲和美国)的来源截然不同。
最低的等位基因变异见于OmpH-样(CT242)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)和假定的(CT398)抗原，只发现了两个等位基因含最多1-2个氨基酸取代点。中等等位基因变异见于PepA(CT045)，在499氨基酸序列中发现3个等位基因含最多4个氨基酸取代点。
结果小结
对不同保藏所(ATCC保藏所和意大利(Cevenini)保藏所)的血清变型进行基因分型。ATCC和Cevenini保藏所在来源或时间上没有联系(ATCC保藏所约有30-40年，而Cevenini保藏所约有5年历史)。由于该两个保藏所在空间和时间上的差异，发现ATCC血清变型E的LcrE氨基酸序列(SEQ ID NO：1)中所含的8个突变与LcrE意大利(Cevenini)血清变型E(cev-8)的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)中所见的相同是令人惊奇和出乎意料的。
发现来源和时期不同的氨基酸序列在接触不同免疫学压力下在LcrE血清变型E序列中产生一组相同的8个突变是完全出乎意料的。还发现ATCC血清变型J的LcrE(SEQ ID NO：6)含有的3个突变与LcrE意大利(Cevenini)血清变型J(cev-5)(SEQ ID NO：11)中所见的相同。类似地，发现ATCC血清变型H的LcrE(SEQ IDNO：4)含有的3个突变与ATCC血清变型J(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11)中所见的相同。虽然这些序列的来源、时期和免疫学压力不同，但在各配对中的突变相同。甚至不含相同突变的序列也相似。例如，GO 86血清变型D和意大利(Cevenini)血清变型J(cev-1)的LcrE4个突变中有3个出乎意料地匹配。
在ATCC血清变型F、G、I、K、Cev-2(血清变型G)、Cev-4(血清变型H)的LcrE，或共有序列SEQ ID NO：14、15、17、22、24、25和26中没有发现突变。鉴于不同序列在不同地理位置和不同时期中也接触不同的免疫学压力，该发现也是出乎意料的。
结果总述
总之，对应于8种不同衣原体血清变型的13株分离物的6种衣原体抗原基因分型结果显示氨基酸序列的保守程度高(特别是同一血清变型中)，含有等位基因变异，因为独特的单个氨基酸取代数量有限。
然而，以LcrE(CT089)为例，观察到单氨基酸取代的数量高于预计数量，表明LcrE蛋白质经历的免疫学压力可能高于所评估的其它衣原体抗原(这些抗原是CT242、CT381、CT396、CT398和CT045)，围绕这些氨基酸取代(位点)的肽可能是表位区域(参与Ab-Ag相互作用的B细胞表位和/或能引发砂眼衣原体特异性细胞介导免疫应答的T细胞表位)。具体地说，LcrE序列的残基64和162处存在两个高频率突变位点令人惊奇和出乎意料，可能与存在能引发对象免疫原性应答的表位区域相关。
可利用免疫原性的血清变型特异性变异为不同患者生活型(例如，包括但不限于青少年女孩、性工作者(如娼妓)、同性恋等)定制特异性诊断性或治疗性(例如，免疫学)治疗方案。
实施例2：LCRE表位作图
砂眼衣原体菌株D/UW-3/CX的LcrE参比序列见SEQ ID NO：28(下文)，该序列集合了各种砂眼衣原体血清变型分离物中检测到的所有等位基因突变点：SEQID No 28中围绕这些突变点的下划线标示区域对应于B细胞和/或T细胞表位肽区域。残基64处的第一突变点(以下表位区域KKKGEK中以下划线标示的)对应于高频率突变点或超变区，其也可能与T细胞和/或B细胞表位区域相关。
SEQ ID NO：28
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCED LINPAAATRIKKKEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRFTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALN GCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPP HAPVPQSEIPTSPTSTQPP
Figure A20068002429300673
P
因此，在这些分离物中64、126、157、162、179、207、217、220、275和420位检测到突变点(见表7)。根据这些分离物中观察到的突变，采用Kolaskar和Tongaonkar(Kolaskar等，“A semi-empirical method for prediction of antigenicdeterminants on protein antigens”(预测蛋白质抗原上的抗原决定簇的半经验方法)，FEBS Lett.1990年12月10日；276(1-2)：172-4)方法测定抗原性肽，该文献全文纳入本文。简言之，根据反映通过实验方法知晓的区段表位(segmentalepitope)中氨基酸残基(突变)发生率的表格进行预测。只报道含最少8个残基的区段。该方法报道的精确度约为75％。如上表2所总结的，采用该方法测定到LcrE砂眼衣原体抗原序列中的17个抗原决定簇。
表7
Figure A20068002429300674
Figure A20068002429300681
实施例3：衣原体(例如LcRE)抗原的表位作图
如下所示制作所有LcrE血清变型变体的表位图谱：利用上文和WO05/002619所述的生殖道感染小鼠模型。所有LcrE变体表达为重组蛋白质，WO05/002619也描述了该方法。用重组LcrE变体免疫接种小鼠(用或不用砂眼衣原体攻击)。然后分离免疫小鼠(用或不用砂眼衣原体攻击)的脾细胞，用LcrE特异性肽(如下文SEQ ID No 47-98所示)脉冲。然后根据是否存在脾细胞增殖、介提细胞应答(例如通过上述各种测试检测Th1或Th2细胞应答)评估脾细胞对各LcrE特异性肽的应答。用于脉冲脾细胞和评估对象中体液和细胞免疫应答的特别优选的肽如下文SEQ ID No 54所示。该15聚体肽包含的区域对应于围绕第一高频率(7/14)突变点或超变区的N-末端区段，所述突变点或超变区在评估13种衣原体血清变型时在LcrE氨基酸序列中残基64处鉴定到。第二种用于脉冲脾细胞和评估对象中体液和细胞免疫应答的特别优选的肽如下文SEQ ID No66所示。该15聚体肽包含的区域对应于围绕第二高频率(7/14)突变点或超变区的区段，所述突变点或超变区在评估13种衣原体血清变型时在LcrE氨基酸序列中残基162处鉴定到。其它特别优选的肽包括含有SEQ ID No 29-45(见表2)和SEQ ID No 181、182、183和/或184所示表位的那些肽。
这些肽，特别是SEQ ID No 54和/或SEQ ID No 66和/或SEQ ID No 181、182、183和/或184可用于实施例5所述的免疫接种方案来评估它们的预防和治疗效力，当然也可用于诊断目的。类似的方法可应用于其它衣原体抗原的图谱表位，例如但不限于：CT242、CT381、CT396、CT398和CT045。
用于表位作图的LcrE肽
血清变型D/UW-3/CX的LcrE血清型D参比菌株(等位基因1)
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKGEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRFTEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPDEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDGKLKSTLIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPSSLRSLYFQVTSSPSNCANLHQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVNSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP(421个氨基酸)
可通过改变各肽的长度和重叠程度，采用几种方法将LcrE序列分成制作表位图谱的肽。根据公布的CT LcrE参比序列，选用按序移换8个氨基酸残基的重叠15聚体的一个例子如下所示：
以移换8个残基分成51个重叠的15聚体加上1个末端-14聚体
1.MTASGGAGGLGSTQT(SEQ ID No 47)
2.GLGSTQTVDVARAQA(SEQ ID No 48)
3.DVARAQAAAATQDAQ(SEQ ID No 49)
4.AATQDAQEVIGSQEA(SEQ ID No 50)
5.VIGSQEASEASMLKG(SEQ ID No 51)
6.EASMLKGCEDLINPA(SEQ ID No 52)
7.EDLINPAAATRIKKK(SEQ ID No 53)
8.ATRIKKKGEKFESLE(SEQ ID No 54)
9.EKFESLEARRKPTAD(SEQ ID No 55)
10.RRKPTADKAEKKSES(SEQ ID No 56)
11.AEKKSESTEEKGDTP(SEQ ID No 57)
12.EEKGDTPLEDRFTED(SEQ ID No 58)
13.EDRFTEDLSEVSGED(SEQ ID No 59)
14.SEVSGEDFRGLKNSF(SEQ ID No 60)
15.RGLKNSFDDDSSPDE(SEQ ID No 61)
16.DDSSPDEILDALTSK(SEQ ID No 62)
17.LDALTSKFSDPTIKD(SEQ ID No 63)
18.SDPTIKDLALDYLIQ(SEQ ID No 64)
19.ALDYLIQTAPSDGKL(SEQ ID No 65)
20.APSDGKLKSTLIQAK(SEQ ID No 66)
21.STLIQAKHQLMSQNP(SEQ ID No 67)
22.QLMSQNPQAIVGGRN(SEQ ID No 68)
23.AIVGGRNVLLASETF(SEQ ID No 69)
24.LLASETFASRANTSP(SEQ ID No 70)
25.SRANTSPSSLRSLYF(SEQ ID No 71)
26.SLRSLYFQVTSSPSN(SEQ ID No 72)
27.VTSSPSNCANLHQML(SEQ ID No 73)
28.ANLHQMLASYLPSEK(SEQ ID No 74)
29.SYLPSEKTAVMEFLV(SEQ ID No 75)
30.AVMEFLVNGMVADLK(SEQ ID No 76)
31.GMVADLKSEGPSIPP(SEQ ID No 77)
32.EGPSIPPAKLQVYMT(SEQ ID No 78)
33.KLQVYMTELSNLQAL(SEQ ID No 79)
34.LSNLQALHSVNSFFD(SEQ ID No 80)
35.SVNSFFDRNIGNLEN(SEQ ID No 81)
36.NIGNLENSLKHEGHA(SEQ ID No 82)
37.LKHEGHAPIPSLTTG(SEQ ID No 83)
38.IPSLTTGNLTKTFLQ(SEQ ID No 84)
39.LTKTFLQLVEDKFPS(SEQ ID No 85)
40.VEDKFPSSSKAQKAL(SEQ ID No 86)
41.SKAQKALNELVGPDT(SEQ ID No 87)
42.ELVGPDTGPQTEVLN(SEQ ID No 88)
43.PQTEVLNLFFRALNG(SEQ ID No 89)
44.FFRALNGCSPRIFSG(SEQ ID No 90)
45.SPRIFSGAEKKQQLA(SEQ ID No 91)
46.EKKQQLASVITNTLD(SEQ ID No 92)
47.VITNTLDAINADNED(SEQ ID No 93)
48.INADNEDYPKPGDFP(SEQ ID No 94)
49.PKPGDFPRSSFSSTP(SEQ ID No 95)
50.SSFSSTPPHAPVPQS(SEQ ID No 96)
51.HAPVPQSEIPTSPTS(SEQ ID No 97)
52.IPTSPTSTQPPSP(SEQ ID No 98)
实施例4：衣原体(例如LcrE)抗原的表位作图
如下所示制作所有LcrE血清变型变体的表位图谱：利用上文和WO 05/002619所述的生殖道感染小鼠模型。所有LcrE变体表达为重组蛋白质，WO 05/002619也描述了该方法。用重组LcrE变体免疫接种小鼠(用或不用砂眼衣原体攻击)。然后分离免疫小鼠(用或不用砂眼衣原体攻击)的脾细胞，用LcrE特异性肽(如下文SEQ ID No 99-180所示)脉冲。然后根据是否存在脾细胞增殖、介体细胞应答(例如通过上述各种测试检测Th1或Th2细胞应答)评估脾细胞对各LcrE特异性肽的应答。用于脉冲脾细胞和评估对象中体液和细胞免疫应答的三种特别优选的肽如下文SEQ ID No 109、110和111所示。该15聚体肽包含的区域对应于围绕第一高频率(7/14)突变点或超变区的N-末端区段，所述突变点或超变区在评估13种衣原体血清变型时在LcrE氨基酸序列中残基64处鉴定到。用于脉冲脾细胞和评估对象中体液和细胞免疫应答的特别优选的其它肽如下文SEQ ID No 129和130所示。这些15聚体肽包含的区域对应于围绕第二高频率(7/14)突变点或超变区的区段，所述突变点或超变区在评估13种衣原体血清变型时在LcrE氨基酸序列中残基162处鉴定到。其它特别优选的肽包括含有SEQ ID No 29-45(见表2)和SEQ ID No 181、182、183和/或184所示表位的那些肽。
这些肽，特别是SEQ ID No 109、110和111和/或SEQ ID No 129、130和/或SEQ ID No 181、182、183和/或184可用于实施例5所述免疫接种方案来评估它们的预防和治疗效力，当然也可用于诊断目的。类似的方法可应用于其它衣原体抗原的图谱表位，例如但不限于：CT242、CT381、CT396、CT398和CT045。
用于serE作图的LcrE肽
在血清型E菌株中发现的LcrE(LcrE等位基因5)
与公布的血清变型D测序基因组的LcrE相比，等位基因5含有8个氨基酸取代。
同样，这些改变中的2个认为是“保守性的”，而这些改变中的6个认为是“非保守性的”(见下表4)。
在血清型E菌株中发现的LcrE(LcrE等位基因5)
MTASGGAGGLGSTQTVDVARAQAAAATQDAQEVIGSQEASEASMLKGCEDLINPAAATRIKKKEEKFESLEARRKPTADKAEKKSESTEEKGDTPLEDRFTEDLSEVSGEDFRGLKNSFDDDSSPEEILDALTSKFSDPTIKDLALDYLIQTAPSDRKLKSALIQAKHQLMSQNPQAIVGGRNVLLASETFASRANTSPSSLRSLYLQVTSSPSNCDNLRQMLASYLPSEKTAVMEFLVNGMVADLKSEGPSIPPAKLQVYMTELSNLQALHSVDSFFDRNIGNLENSLKHEGHAPIPSLTTGNLTKTFLQLVEDKFPSSSKAQKALNELVGPDTGPQTEVLNLFFRALNGCSPRIFSGAEKKQQLASVITNTLDAINADNEDYPKPGDFPRSSFSSTPPHAPVPQSEIPTSPTSTQPPSP(421 aa)
以下例子显示了通过选用按序移换5个氨基酸残基的重叠15聚体将血清变型-E LcrE序列分成制作表位图谱的肽。
以移换5个残基分成81个重叠的15聚体加上1个末端-16聚体
1.MTASGGAGGLGSTQT(SEQ ID No 99)
2.GAGGLGSTQTVDVAR(SEQ ID No 100)
3.GSTQTVDVARAQAAA(SEQ ID No 101)
4.VDVARAQAAAATQDA(SEQ ID No 102)
5.AQAAAATQDAQEVIG(SEQ ID No 103)
6.ATQDAQEVIGSQEAS(SEQ ID No 104)
7.QEVIGSQEASEASML(SEQ ID No 105)
8.SQEASEASMLKGCED(SEQ ID No 106)
9.EASMLKGCEDLINPA(SEQ ID No 107)
10.KGCEDLINPAAATRI(SEQ ID No 108)
11.LINPAAATRIKKKEE(SEQ ID No 109)
12.AATRIKKKEEKFESL(SEQ ID No 110)
13.KKKEEKFESLEARRK(SEQ ID No 111)
14.KFESLEARRKPTADK(SEQ ID No 112)
15.EARRKPTADKAEKKS(SEQ ID No 113)
16.PTADKAEKKSESTEE(SEQ ID No 114)
17.AEKKSESTEEKGDTP(SEQ ID No 115)
18.ESTEEKGDTPLEDRF(SEQ ID No 116)
19.KGDTPLEDRFTEDLS(SEQ ID No 117)
20.LEDRFTEDLSEVSGE(SEQ ID No 118)
21.TEDLSEVSGEDFRGL(SEQ ID No 119)
22.EVSGEDFRGLKNSFD(SEQ ID No 120)
23.DFRGLKNSFDDDSSP(SEQ ID No 121)
24.KNSFDDDSSPEEILD(SEQ ID No 122)
25.DDSSPEEILDALTSK(SEQ ID No 123)
26.EEILDALTSKFSDPT(SEQ ID No 124)
27.ALTSKFSDPTIKDLA(SEQ ID No 125)
28.FSDPTIKDLALDYLI(SEQ ID No 126)
29.IKDLALDYLIQTAPS(SEQ ID No 127)
30.LDYLIQTAPSDRKLK(SEQ ID No 128)
31.QTAPSDRKLKSALIQ(SEQ ID No 129)
32.DRKLKSALIQAKHQL(SEQ ID No 130)
33.SALIQAKHQLMSQNP(SEQ ID No 131)
34.AKHQLMSQNPQAIVG(SEQ ID No 132)
35.MSQNPQAIVGGRNVL(SEQ ID No 133)
36.QAIVGGRNVLLASET(SEQ ID No 134)
37.GRNVLLASETFASRA(SEQ ID No 135)
38.LASETFASRANTSPS(SEQ ID No 136)
39.FASRANTSPSSLRSL(SEQ ID No 137)
40.NTSPSSLRSLYLQVT(SEQ ID No 138)
41.SLRSLYLQVTSSPSN(SEQ ID No 139)
42.YLQVTSSPSNCDNLR(SEQ ID No 140)
43.SSPSNCDNLRQMLAS(SEQ ID No 141)
44.CDNLRQMLASYLPSE(SEQ ID No 142)
45.QMLASYLPSEKTAVM(SEQ ID No 143)
46.YLPSEKTAVMEFLVN(SEQ ID No 144)
47.KTAVMEFLVNGMVAD(SEQ ID No 145)
48.EFLVNGMVADLKSEG(SEQ ID No 146)
49.GMVADLKSEGPSIPP(SEQ ID No 147)
50.LKSEGPSIPPAKLQV(SEQ ID No 148)
51.PSIPPAKLQVYMTEL(SEQ ID No 149)
52.AKLQVYMTELSNLQA(SEQ ID No 150)
53.YMTELSNLQALHSVD(SEQ ID No 151)
54.SNLQALHSVDSFFDR(SEQ ID No 152)
55.LHSVDSFFDRNIGNL(SEQ ID No 153)
56.SFFDRNIGNLENSLK(SEQ ID No 154)
57.NIGNLENSLKHEGHA(SEQ ID No 155)
58.ENSLKHEGHAPIPSL(SEQ ID No 156)
59.HEGHAPIPSLTTGNL(SEQ ID No 157)
60.PIPSLTTGNLTKTFL(SEQ ID No 158)
61.TTGNLTKTFLQLVED(SEQ ID No 159)
62.TKTFLQLVEDKFPSS(SEQ ID No 160)
63.QLVEDKFPSSSKAQK(SEQ ID No 161)
64.KFPSSSKAQKALNEL(SEQ ID No 162)
65.SKAQKALNELVGPDT(SEQ ID No 163)
66.ALNELVGPDTGPQTE(SEQ ID No 164)
67.VGPDTGPQTEVLNLF(SEQ ID No 165)
68.GPQTEVLNLFFRALN(SEQ ID No 166)
69.VLNLFFRALNGCSPR(SEQ ID No 167)
70.FRALNGCSPRIFSGA(SEQ ID No 168)
71.GCSPRIFSGAEKKQQ(SEQ ID No 169)
72.IFSGAEKKQQLASVI(SEQ ID No 170)
73.EKKQQLASVITNTLD(SEQ ID No 171)
74.LASVITNTLDAINAD(SEQ ID No 172)
75.TNTLDAINADNEDYP(SEQ ID No 173)
76.AINADNEDYPKPGDF(SEQ ID No 174)
77.NEDYPKPGDFPRSSF(SEQ ID No 175)
78.KPGDFPRSSFSSTPP(SEQ ID No 176)
79.PRSSFSSTPPHAPVP(SEQ ID No 177)
80.SSTPPHAPVPQSEIP(SEQ ID No 178)
81.HAPVPQSEIPTSPTS(SEQ ID No 179)
82.QSEIPTSPTSTQPPSP(SEQ ID No 180)
IKKKGEKFE(SEQ ID No 181)
IKKKEEKFE(SEQ ID No 182)
KLKSTLIQA(SEQ ID No 183)
KLKSALIQA(SEQ ID No 184)
表4
  LcrE氨基酸(AA)残基号   LcrE D血清变型中的AA   LcrE E血清变型中的AA   突变的性质
  64   G   E   非保守性
  126   D   E   保守性
  157   G   R   非保守性
  162   T   A   非保守性
  207   F   L   非保守性
  217   A   D   非保守性
  220   H   R   非保守性
  275   N   D   保守性
实施例5：用LcrE抗原或其组合免疫接种
单用LcrE及与不同砂眼衣原体血清变型的LcrE联用和/或与其它砂眼衣原体蛋白质联用和/或一种或多种其它STD抗原来免疫接种，用或不用免疫调节剂。
以下实施例描述了在小鼠模型中用CT LcrE抗原的各种组合免疫接种。采用，例如WO 05/002619和Finco等，(2005)Vaccine 23；1178-1188及Sambri等，(2004)Vaccine 22(9-10)；1131-7所述的方法制备和表征重组CT LcrE抗原。
本实施例显示用如上所述制备的不同砂眼衣原体血清变型的1或2或3或4或5种LcrE抗原组合免疫接种。表达并纯化各抗原。然后制备每份组合物含有1或2或3或4或5种LcrE抗原(每份组合物中含有15μg的各抗原)组合的组合物。
将CD1小鼠分成7组(组1-6中每组5-6只小鼠；第5、6、7、8和9组中各3-4只小鼠)，如下所示进行免疫：
表5：实施例5的免疫接种方案
  组   免疫组合物   递送途径
  1   1或2或3或4或5种LcrE抗原(15μg/各抗原)+CFA的混合物   腹膜内或鼻内
  2   1或2或3或4或5种抗原(15μg/各抗原)+AlOH(200μg)的混合物   腹膜内或鼻内
  3   1或2或3或4或5种抗原(15μg/各抗原)+CpG(10ug)的混合物   腹膜内或鼻内
  4   1或2或3或4或5种抗原(15μg/各抗原)+AlOH(200μg)+CpG(10μg)的混合物   腹膜内或鼻内
  5   完全弗氏佐剂(CFA)   腹膜内或鼻内
  6   1或2或3或4或5种抗原(5μg/各抗原)+LTK63(5μg)的混合物   腹膜内或鼻内
  7   AlOH(200μg)+CpG(10μg)   腹膜内或鼻内
  8   CpG(10μg)   腹膜内或鼻内
  9   LTK63(5μg)   腹膜内或鼻内
小鼠间隔两周免疫一次。最后一次免疫接种两周后，用合适的衣原体血清变型，例如但不限于砂眼衣原体血清变型D，通过阴道内感染攻击所有小鼠。当采用粘膜免疫接种(例如，鼻内)时，也通过粘膜攻击动物模型来测试粘膜免疫原的保护作用。
实施例6：用LcrE抗原或其组合免疫接种
以下实施例显示了单用LcrE及与不同砂眼衣原体血清变型的LcrE联用和/或与其它砂眼衣原体蛋白质联用来免疫接种，用或不用免疫调节剂。
在本实施例中，具体显示用如上所述制备的不同砂眼衣原体血清变型的1或2或3或4或5种LcrE抗原组合免疫接种。表达并纯化各抗原。然后制备每份组合物含有1或2或3或4或5种抗原(每份组合物中含有15μg的各抗原)组合的组合物。
表6：实施例6的免疫接种方案
  组   免疫组合物   免疫调节剂   递送途径
  1(测试组)   如上所述制备不同砂眼衣原体血清变型的1种或2种或3种或4种或5种LcrE抗原的组合。表达并纯化各抗原。然后制备每份组合物含有5种抗原(每份组合物中含有15μg各抗原)组合的组合物。(15ug/各CT抗原)   CFA   腹膜内(i.p.)
  2(测试组)   与测试1相同(15ug/各CT抗原)   AlOH(200ug)和CpG(10ug)   腹膜内(i.p.)
  3(测试组)   与测试1相同(15ug/各CT抗原)   单用AlOH(200ug)   腹膜内(i.p.)
  4(测试组)   与测试1相同(15ug/各CT抗原)   单用CpG(10ug)   腹膜内(i.p.)
  5(阴性对照)   单用完全氟氏佐剂(CFA)   腹膜内(i.p.)
  6(阴性对照)   AlOH(200μg)+CpG(10μg)   腹膜内(i.p.)
  7(阳性对照)(保护作用对照)   砂眼衣原体的活原生小体(EB)(两次-预攻击+攻击)   腹膜内(i.p.)
  8(感染对照)   砂眼衣原体的活原生小体(EB)(只是一次-攻击)   腹膜内(i.p.)
体内筛选CT保护性抗原的小鼠模型：利用砂眼衣原体生殖道感染小鼠模型来测定CT抗原的体内保护作用(砂眼衣原体初次感染消退)。所用模型如下所述：使用4-6周龄的Balb/c雌性小鼠。用上表5或6所示的1种或2种或3种或4种或5种重组CT抗原(例如但不限于LcrE)的混合物腹膜内(ip)免疫小鼠。这些CT抗原经测定为FACS阳性和/或中和性。以每剂15ug的浓度给予3剂量的1种或2种或3种或4种或5种LcrE抗原混合物。先给予小鼠激素治疗，5天后用2.5mg DepoProvera(甲羟孕酮醋酸酯)攻击。
测试攻击：在给予最后一次免疫接种剂量2周后，用105 IFU的纯EB(血清变型D)阴道内攻击这些小鼠。攻击后每7天读数阴道拭子直至第28天。对攻击前血清也进行了以下试验：血清学分析、FACS、WB、中和试验和ELISA。用各重组抗原包被平板，测试用1种或2种或3种或4种或5种CT LcrE抗原组合免疫的各只小鼠攻击前免疫血清的反应。数据表示为以平均ELISA单位表示的各组计算平均值。检测免疫接种后但攻击前血清的砂眼衣原体特异性抗体类型(IgG、IgA等)和同种型。血清研究的目的是测定小鼠对各CT LcrE抗原组合免疫接种的反应。阴道灌洗的目的是测定小鼠对砂眼衣原体细菌攻击的反应。也根据抗体类型(IgG和IgA)和抗体亚型分析了阴道灌洗液的砂眼衣原体特异性抗体。
阴性对照：所用的阴性对照是单用免疫调节剂(例如，CFA或AlOH和/或CpG)。
阳性“活”EB对照：所用的阳性对照是活砂眼衣原体原生小体(EB)的提取物。此时，在给予测试CT组合抗原的同时用活的砂眼衣原体EB感染小鼠。感染“活”EB阳性对照小鼠约1.5个月(即，6周)，因为3次剂量的CT抗原组合每2周给予一次(即，总共6周)。用“活”EB感染的动物(小鼠)产生了天然免疫力，感染消退(因为小鼠衣原体感染是暂时感染)。当用CT抗原组合疫苗接种小鼠然后用“活”EB攻击时，也再攻击阳性对照“活”EB小鼠(即给予它们第二剂量的“活”EB)。由于“活”EB阳性对照组产生了天然免疫力，它们快速清除了第二次再攻击。
感染对照：在该组中，在“再攻击阳性活EB对照和攻击测试CT组”的同时只用“活”EB攻击小鼠。该对照组的目的是检测阴性对照组(即，单用免疫调节剂免疫的组)的可能保护作用。
实施例7：选择诱导CD4 Th1应答的抗原的体外模型
有人提出Th1-型细胞因子，例如IL-12和IFN-□对于使衣原体感染消退至关重要。实际上，IFN-□缺陷的小鼠不能控制阴道中的衣原体感染，因为衣原体播散至全身部位[126、127]。
设计了两种免疫学筛选方法来鉴定能在1)用砂眼衣原体感染实验性小鼠后，和2)用衣原体重组蛋白免疫接种小鼠后诱导产生衣原体特异性IFN-□的CD4+T细胞的衣原体抗原。这些抗原是赋予CD4+-介导保护作用的最有希望的候选对象。
在第一种方法中：EB(原生小体)感染后的CD4 Th1刺激：筛选不含LPS的纯化重组表面抗原刺激产生CD4+/IFN-γ的T淋巴细胞的能力，小鼠的该T淋巴细胞使初次Ct感染消退从而保护小鼠免受进一步感染。该方法能鉴定在天然感染期间能诱导CD4 Th1应答的抗原。
在第二种方法中：用CT重组抗原免疫接种后诱导CD4 Th1：用纯化的重组抗原免疫小鼠，通过用Ct EB和不含LPS的抗原刺激脾细胞来离体分析抗原特异性CD4 T细胞应答。该方法能使可能参与识别EB的体内抗原特异性CD4-Th1细胞致敏。
在第一种方法中，提前5天用2.5mg甲羟孕酮醋酸酯(Depo-Provera)预处理6-7周龄的雌性BALB/c小鼠，然后在第0天通过沉积含有106 IFU的砂眼衣原体血清变型D的15ml SPG(250mM蔗糖、10mM磷酸钠、5mM L-谷氨酸)进行阴道内感染。感染后7天中通过采集阴道穹窿(vaginal vault)拭子并采用间接免疫荧光法测定LL-CMK2细胞单层上回收的IFU数量来监测感染过程。
从砂眼衣原体感染的小鼠(感染10天后)和未感染对照的脾脏制备脾细胞。合并各组小鼠的脾脏，手工分散细胞。用补加了以下成分的RPMI 1640培养基培养脾细胞：25mM HEPES缓冲液、100UI/ml青霉素、100ug/ml链霉素、50uM 2-巯基乙醇、0.15mM L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、维生素、非必需氨基酸混合物和2.5％热灭活的胎牛血清。
在圆底96孔板中，在有1ug/ml抗-CD28存在下用20ug/ml各种砂眼衣原体重组抗原刺激感染小鼠和未感染对照小鼠的新鲜制备脾细胞4小时。使用1ug/ml抗-CD3和10ug/ml热灭活的完整砂眼衣原体原生小体刺激的脾细胞作为阳性对照。为分析抗原诱导的胞内细胞因子表达，加入2.5ug/ml布雷菲德菌素A(西格马公司(Sigma))过夜。刺激期结束时，用2％多聚甲醛固定细胞，然后用PBS-1％BSA-0.5％皂苷渗透处理(permeabilize)。室温下用以下抗体染色固定的细胞30分钟：抗CD4-FITC、抗CD8-PerCp、抗IFNg-APC和抗IL5-PE(均购自BD法马金公司(BD Pharmingen))。
用LSRII细胞计数器和DIVA软件分析染色细胞产生的细胞因子。
在第二种方法中，在第1、14和28天用含合适佐剂的一组重组衣原体蛋白肌肉内免疫小鼠。最后一次免疫一周后，如上所述收集脾脏分离PBMC并在同系基因经照射的APC存在下进行评估。使用完整的砂眼衣原体EB和不含LPS的抗原进行离体刺激24小时。刺激后，如上所述分析细胞产生的细胞因子(IFN-□和IL-5)。
对于第二种方法，从重组抗原(3剂量20ug，含AlOH+CpG)免疫的小鼠和佐剂免疫的小鼠的脾脏制备脾细胞。合并各组小鼠的脾脏，手工分散细胞。用补加了以下成分的RPMI 1640培养基培养脾细胞：25mM HEPES缓冲液、100UI/ml青霉素、100ug/ml链霉素、50uM 2-巯基乙醇、0.15mM L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、维生素、非必需氨基酸混合物和2.5％热灭活的胎牛血清。
对于第二种方法，用与第一种方法相同的方式进行抗原诱导细胞因子表达的流式细胞术分析，除了用Ct EB和不含LPS的抗原刺激脾细胞离体分析抗原特异性CD4 T细胞应答。
两种筛选均进行多参数FACS分析来评估抗原特异性Th1-细胞的细胞因子表达模式。
第一种方法的结果表明70种测试抗原中有13种是CD4-Th1诱导物(CT681、CT823、CT043、CT587、CT153、CT480、CT016、CT341、CT372、CT396、CT600、CT601、CT711)。在这些CT4-Th1诱导性抗原中值得注意的是CT396。
第二种方法的结果表明CT396和CT381能诱导强烈的抗原特异性和衣原体特异性应答。
第一和第二种方法的结果表示为与佐剂免疫小鼠获得的相比，用EB或抗原本身刺激后，抗原(用LTK63+CpG作为佐剂配制)免疫小鼠的脾细胞衍生的10000个CD4+细胞中EB-特异性和抗原-特异性CD4-IFNγ+T淋巴细胞的频率。
对于CT381，EB-特异性和CT381-特异性CD4-IFNγ+T淋巴细胞的频率分别是450(佐剂免疫小鼠是131)和190(佐剂免疫小鼠是17)。
对于CT396，EB-特异性和CT396-特异性CD4-IFNγ+T淋巴细胞的频率分别是612(佐剂免疫小鼠是309)和488(佐剂免疫小鼠是17)。
这些结果表明ArtJ(CT381)和DnaK(CT396)均是能高频率地产生细胞(能产生IFN-γ)的衣原体抗原的例子。
总述
本发明提供各砂眼衣原体血清变型的变体LcrE序列和/或变体LcrE序列的组合。各砂眼衣原体血清变型LcrE基因型的这种变异可能对应于LcrE表型的变异，特别是免疫原性的变异。本发明还提供围绕所述氨基酸取代(位点)或与之相关的肽，特别是围绕高频率突变氨基酸位点或超变区或与之相关的肽，这些突变氨基酸位点或超变区可能是能引发衣原体特异性细胞介导的免疫应答的B细胞和/或T细胞表位区域。变体LcrE序列和/或变体LcrE序列的组合和/或与变体LcrE序列相关的表位区域可用作免疫原和/或用于制备预防和/或治疗和/或诊断衣原体感染的免疫原性组合物。
本发明还提供各砂眼衣原体血清变型的变体Omp-H-样序列和/或变体Omp-H-样序列的组合。各砂眼衣原体血清变型Omp-H-样基因型的这种变异可能对应于Omp-H-样表型的变异，特别是免疫原性的变异。本发明还提供围绕所述氨基酸取代(位点)或与之相关的肽，特别是围绕高频率突变氨基酸位点或超变区或与之相关的肽，这些突变氨基酸位点或超变区可能是能引发衣原体特异性免疫应答的B细胞和/或T细胞表位区域。变体Omp-H-样序列和/或变体LcrE序列的组合和/或与变体Omp-H-样序列相关的表位区域可用作免疫原和/或用于制备预防和/或治疗和/或诊断衣原体感染的免疫原性组合物。
本发明还提供各砂眼衣原体血清变型的变体PepA序列和/或变体PepA序列的组合。各砂眼衣原体血清变型PepA基因型的这种变异可能对应于PepA表型的变异，特别是免疫原性的变异。本发明还提供围绕所述氨基酸取代(位点)或与之相关的肽，特别是围绕高频率突变氨基酸位点或超变区或与之相关的肽，这些突变氨基酸位点或超变区可能是能引发衣原体特异性免疫应答的B细胞和/或T细胞表位区域。变体PepA序列和/或变体PepA序列的组合和/或与变体PepA序列相关的表位区域可用作免疫原和/或用于制备预防和/或治疗和/或诊断衣原体感染的免疫原性组合物。
本发明还提供各砂眼衣原体血清变型的变体ArtJ序列和/或变体ArtJ序列的组合。各砂眼衣原体血清变型的ArtJ基因型的这种变异可能对应于ArtJ表型的变异，特别是免疫原性的变异。本发明还提供围绕所述氨基酸取代(位点)或与之相关的肽，特别是围绕高频率突变氨基酸位点或超变区或与之相关的肽，这些突变氨基酸位点或超变区可能是能引发衣原体特异性免疫应答的B细胞和/或T细胞表位区域。变体ArtJ序列和/或变体ArtJ序列的组合和/或与变体ArtJ序列相关的表位区域可用作免疫原和/或用于制备预防和/或治疗和/或诊断衣原体感染的免疫原性组合物。
本发明还提供各砂眼衣原体血清变型的变体DnaK序列和/或变体DnaK序列的组合。各砂眼衣原体血清变型DnaK基因型的这种变异可能对应于DnaK表型的变异，特别是免疫原性的变异。本发明还提供围绕所述氨基酸取代(位点)或与之相关的肽，特别是围绕高频率突变氨基酸位点或超变区或与之相关的肽，这些突变氨基酸位置或超变区可能是能引发衣原体特异性免疫应答的B细胞和/或T细胞表位区域。变体DnaK序列和/或变体DnaK序列的组合和/或与变体DnaK序列相关的表位区域可用作免疫原和/或用于制备预防和/或治疗和/或诊断衣原体感染的免疫原性组合物。
本发明还提供各砂眼衣原体血清变型的假定的变体(CT398)序列和/或变体DnaK序列的组合。各砂眼衣原体血清变型假定的(CT398)基因型的这种变异可能对应于假定的(CT398)表型的变异，特别是免疫原性的变异。本发明还提供围绕所述氨基酸取代(位点)或与之相关的肽，特别是围绕高频率突变氨基酸位点或超变区或与之相关的肽，这些突变氨基酸位点或超变区可能是能引发衣原体特异性免疫应答的B细胞和/或T细胞表位区域。变体序列和/或假定的变体(CT398)序列的组合和/或与假定的变体(CT398)序列相关的表位区域可用作免疫原和/或用于制备预防和/或治疗和/或诊断衣原体感染的免疫原性组合物。
以上说明书中提及的所有出版物纳入本文作为参考。本领域技术人员明显知道本发明所述方法和系统的各种改进和改变而不会脱离本发明的范围和构思。虽然结合优选的具体实施方式描述了本发明，但应该知道所述发明不应过分局限于这些具体实施方式。实际上，本发明应包括分子生物学或相关领域技术人员明显知道的实施本发明的所述模式的各种改进形式。
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Claims (56)

1. 一种由SEQ ID NO：46所示但含有一个或多个突变的氨基酸序列构成的蛋白质，其中所述一个或多个突变涉及选自64、126、157、162、179、207、217、220、275或420的氨基酸残基。
2. 如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述突变独立为取代、插入或缺失，优选含有一个或多个表7所列的突变。
3. 如权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于，所述一个或多个突变改变了该蛋白质的免疫原性。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质含有选自SEQ ID No 1、4、6、8、11、12、13、16、18、19、20、21、23和/或27的一条或多条突变序列。
5. 如权利要求4所述的蛋白质，其含有SEQ ID No 11、4或6。
6. 如权利要求4所述的蛋白质，其含有SEQ ID No 13或8。
7. 如权利要求4所述的蛋白质，其含有SEQ ID No 12或1。
8. 如权利要求2所述的蛋白质，其在氨基酸残基64和/或162处含有突变。
9. 如权利要求4所述的蛋白质，其含有SEQ ID No 16、18、19、20、21、22、23或27。
10. 一种蛋白质，其含有以上权利要求中任一项所述蛋白质的氨基酸序列或以上权利要求中任一项所述蛋白质的至少7个毗连氨基酸的一个或多个片段。
11. 如权利要求10所述的蛋白质，其特征在于，所述一个或多个片段含有涉及选自64、126、157、162、179、207、217、220、275和/或420位氨基酸残基的一个或多个突变。
12. 一种抗体，其与如权利要求1-11中任一项所述蛋白质结合。
13. 一种核酸，其编码如权利要求1-11中任一项所述蛋白质。
14. 一种载体，其含有如权利要求13所述核酸。
15. 一种宿主细胞，其用如权利要求14所述载体转化。
16. 用作药物的如权利要求1-11中任一项所述的蛋白质，如权利要求12所述的抗体或如权利要求13所述的核酸。
17. 用作免疫原的如权利要求16所述的蛋白质或核酸。
18. 用作诊断试剂的如权利要求1-11中任一项所述的蛋白质，如权利要求12所述的抗体或如权利要求13所述的核酸。
19. 如权利要求1-11中任一项所述的蛋白质，如权利要求12所述的抗体或如权利要求13所述的核酸在制备预防或治疗砂眼衣原体感染的药物中的应用。
20. 如权利要求1-11中任一项所述的蛋白质，如权利要求12所述的抗体或如权利要求13所述的核酸在制备检测是否存在砂眼衣原体或产生的抗砂眼衣原体抗体的诊断试剂中的应用。
21. 如权利要求1-11中任一项所述的蛋白质，如权利要求12所述的抗体或如权利要求13所述的核酸在制备能产生针对砂眼衣原体的抗体的试剂中的应用。
22. 一种治疗对象的方法，其包括给予该对象治疗有效量的权利要求1-11中任一项所述的蛋白质，如权利要求12所述的抗体或如权利要求13所述的核酸。
23. 一种制备如权利要求1-11中任一项所述蛋白质，如权利要求12所述抗体或如权利要求13所述核酸的方法，其包括在诱导蛋白质表达的条件下培养如权利要求15所述宿主细胞的步骤。
24. 一种制备如权利要求1-11中任一项所述蛋白质，如权利要求12所述抗体或如权利要求13所述核酸的方法，其中所述蛋白质或核酸部分或完全采用化学方法合成。
25. 一种检测如权利要求13所述核酸的方法，其包括以下步骤：(a)在杂交条件下使核酸探针与生物学样品接触以形成双螺旋和(b)检测所述双螺旋。
26. 一种检测如权利要求1-11中任一项所述蛋白质的方法，其包括以下步骤：(a)在适合形成抗体-抗原复合物的条件下使如权利要求12所述的抗体与生物学样品接触和(b)检测所述复合物。
27. 一种检测如权利要求12所述抗体的方法，其包括以下步骤：在适合形成抗体-抗原复合物的条件下使如权利要求1-11中任一项所述的蛋白质与生物学样品接触和(b)检测所述复合物。
28. 一种试剂盒，其装有适用于如权利要求25-28中任一项所述方法的试剂。
29. 一种免疫原性组合物，其含有如权利要求1-11中任一项所述的蛋白质，如实施例12所述的抗体或如实施例13所述的核酸和免疫学上可接受的赋形剂。
30. 如权利要求29所述的组合物，其特征在于，还含有一种或多种抗原。
31. 如权利要求29或30所述的组合物，其特征在于，还含有一种或多种佐剂。
32. 用作药物的如权利要求29-31中任一项所述的组合物。
33. 如权利要求29-31中任一项所述组合物在制备预防或治疗或诊断细菌感染的药物中的应用。
34. 如权利要求33所述的应用，其特征在于，所述细菌感染是砂眼衣原体感染。
35. 一种免疫原性组合物，其含有选自SEQ ID No 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、49-98、99-180、181、182、183和/或184所示序列的至少两种蛋白质。
36. 如权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有SEQ ID No 1和SEQ ID No 12。
37. 如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有SEQ ID No 13和SEQ ID No 46。
38. 如权利要求35-37中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有(a)一种或多种其它抗原和/或(d)一种或多种其它佐剂。
39. 用作药物的如权利要求35-38中任一项所述的组合物。
40. 如权利要求35-38中任一项所述的组合物在制备预防或治疗或诊断细菌感染的药物中的应用。
41. 如权利要求40所述的应用，其特征在于，所述细菌感染是砂眼衣原体感染。
42. 一种引发对象免疫应答的方法，其中该方法包括给予对象如权利要求29-31或35-38中任一项所述的组合物。
43. 一种多肽，其含有选自SEQ 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45、47-98、99-180、55、66、109、110、111、181、182、183和/或184的至少7个毗连氨基酸，优选至少9个毗连氨基酸的一个或多个片段。
44. 如权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述组合物具有包含SEQ IDNO：1、12、13、45和7所示的蛋白质。
46. 一种免疫原性组合物，其包含选自SEQ ID No 54、66、109、110、111、181、182、183和184所示的一种或多种肽。
47. 一种免疫原性组合物，其包含选自SEQ ID No 181、182、183和/或184所示的一种或多种肽。
48. 用作免疫原的如权利要求43所述的多肽或如权利要求46或47所述的组合物。
49. 如权利要求48所述的多肽，其特征在于，其用作免疫原来产生体液和/或细胞毒性T细胞淋巴细胞应答，所述应答足以防止或治疗衣原体所致疾病和/或感染。
50. 一种在哺乳动物中产生免疫应答的方法，其包括给予该哺乳动物如权利要求43所述的多肽或权利要求46或47所述的免疫原性组合物的步骤。
51. 如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述免疫应答防止或治疗衣原体所致疾病和/或感染。
52. 用作诊断试剂的如权利要求43所述的多肽或如权利要求46或47所述的组合物。
53. 一种诊断患者衣原体感染的方法，其包括培育患者的T细胞与权利要求43或46或47所述的多肽和随后检测是否存在T-细胞增殖。
54. 如权利要求43所述的多肽或如权利要求46或47所述的组合物在制备预防或治疗细菌感染，优选衣原体感染的药物中的应用。
55. 一种蛋白质或免疫原性组合物，其含有SEQ ID No 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27。
56. 一种蛋白质或免疫原性组合物，其含有SEQ ID No 185，其中X1位的氨基酸残基选自甘氨酸(G)或谷氨酸(E)；残基X2处的氨基酸选自天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)或天冬酰胺(N)；残基X3处的氨基酸选自甘氨酸(G)或精氨酸(R)；残基X4处的氨基酸选自苏氨酸(T)或丙氨酸(A)；残基X5处的氨基酸选自缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)；残基X6处的氨基酸选自苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)；残基X7处的氨基酸选自丙氨酸(A)或天冬氨酸(D)；残基X8处的氨基酸选自组氨酸(H)或精氨酸(R)；残基X9处的氨基酸选自天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)和X10位的氨基酸残基选自丝氨酸(S)或脯氨酸(P)，其中所述蛋白质不是SEQ ID No 46。
57. 如权利要求16-27中任一项使用的如权利要求56所述的蛋白质或免疫原性组合物。
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