CN1984678A - 用于肺炎衣原体的免疫原性组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用作自动转运抗原的多肽。本发明还涉及多肽在制备在个体中预防或治疗肺炎衣原体感染的药物或制备在个体中诊断肺炎衣原体感染的测定中的自动转运功能的方法和应用。同时，提供了通过将用作自动转运抗原的多肽给予个体而在个体中产生免疫应答的方法。

Description

用于肺炎衣原体的免疫原性组合物

本申请要求2004年3月2日提交的美国临时申请60/542,832；2005年1月12日提交的美国临时申请60/643,110；和2005年1月19日提交的美国临时申请60/644,552的优先权，将其全文纳入本文作为参考。

本文引用的所有文献都以整体引入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及免疫学和疫苗学领域。具体说，本发明涉及包含来自肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的免疫原性分子组合的免疫原性组合物。

背景技术

衣原体属(Chlamydia)的细菌(和副衣原体(Chlamydophila)，根据最近提出但仍有争论的衣原体科(Chlamydiaceae)的重分类(Bush等(2001)，Int J Syst Evol Microbiol51：203-20；Everett等(1999)Int J Syst Bacteriol 49：Pt2 415-40；Schachter等(2001)IntJ Syst Evol Microbiol 51：249，251-3)是真核细胞的专性细胞内寄生物，它们具有独特的双相生活史，包括两种多形性发育形式：细胞外、代谢惰性、孢子样感染形式(原生小体，EB)和细胞内、非感染性复制形式(网状体，RB)，RB保留在专门的胞质区室(衣原体包涵体)中。EB负责起初粘附在宿主细胞表面上并建立胞质包涵体，EB可在胞质包涵体上分化为RB并从而启动复制阶段。最后，RB转变为能够在相邻宿主细胞中开始新的复制循环的感染性EB形式。

由于衣原体感染是胞内感染，目前接受的模式是，有效的抗衣原体免疫法需要足量的T细胞应答和高血清水平的中和抗体，以及“理想的疫苗应诱导接触衣原体后可迅速应答的长效(中和)抗体和细胞介导的免疫”。几项有些矛盾的研究表明，CD4+和CD8阳性T细胞在衣原体清除中起作用(Loomis和Starnback(2002)Curr OpinMicrobiol5：87-91)。实际上，现在似乎达成了下述普遍的共识：特异性CD4+T细胞和B细胞对完全清除胞内衣原体和介导对衣原体感染的记忆免疫是非常重要的(参见Igietseme，Black和Caldwell(2002)Biodrugs 16：19-35和Igietseme等(1999)Immunology 98：510-519)。

虽然现在可能进行整个肺炎衣原体基因组的研究，但是对平行的蛋白质组鉴定来说可用信息仍然不足。例如，虽然可获得许多肺炎衣原体抗原的序列数据，但是在免疫学和/或生物学功能方面对衣原体抗原的鉴定不足。例如，虽然专利申请如WO 99/28475和WO 99/27105公开了序列信息，但没有鉴定这些序列的免疫学和/或生物学功能。相反，WO 02/02404提供了某些衣原体蛋白的免疫原性和免疫可及性(immunoaccessibility)的信息，并且强调：(i)现有基因组注释和/或(ii)基于细胞位置的预测和/或基于计算机(in-silico)分析的细胞功能可能不总是正确的。

申请人最近在进行全基因组研究(Montigiani等(2002)Infection and Immunity70：368-379)，以在可能与肺炎衣原体外膜相关的蛋白质中发现可能的疫苗候选物。在此研究中，用计算机分析预测位于衣原体细胞外围的基因编码的超过100种蛋白(重组蛋白，带有His-标签或与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合)制备小鼠抗血清。在此筛选研究中，描述了从衣原体(Chlamydophila pneumoniae(CPn))基因组获得的53种重组蛋白，它们诱导在FACS试验中能够结合于纯化的CPn细胞表面的小鼠抗体。

Montigiani研究的范围(ibid)仅限于检测小鼠对CPn抗原的重组表达抗体产生的多克隆抗血清是否能够结合于CPn细胞表面。没有进行研究来测试抗重组FACS阳性抗原的抗血清是否能够干扰EB对宿主细胞的体外感染性-即针对重组表达抗原产生的鼠抗体是否可以将CPn体外感染性抑制50％以上(这是普通实践将这种抗原认为是“中和”的特性)。

实际上，迄今为止，文献中很少描述具有‘中和’特性的肺炎衣原体抗原：值得注意的是，鉴定为76-kDa-同源蛋白的蛋白(Perez-Melgosa等(1994)Infect Immunity62：880-6)、暴露于表面的外膜蛋白MOMP(Wolf等(2001)Infect Immun69：3082-91)、PorB(Kawa等(2002)J Immunol 168：5184-91和Kubo等(2000)Mol Microbiol 38：772-80)以及最近的外膜蛋白的衣原体特异性多态性家族的Pmp21成员(A.Szczepek，个人通讯)。实际上，在以前基于FACS的筛选研究中已选择出所有这些蛋白质(Montigiani等(2002)ibid)。然而，可注意到，类似MOMP和PorB这些外膜抗原可能在重组疫苗开发计划中产生一些实际问题。例如，MOMP和PorB都是完整的膜蛋白，它们似乎需要天然构象来维持不连续和构象依赖的中和表位。这些蛋白的生产可能需要特殊的加工步骤(再折叠)，而这些加工步骤可能不合乎制备假拟疫苗的需要。其它常见问题可能来自等位基因变异的程度和不总是在所有衣原体细胞或所有衣原体分离物中表达的调节蛋白。

因此，需要提供接触肺炎衣原体蛋白后能引发免疫应答的改进型组合物。也需要提供包含两种或多种选择的CPn蛋白的一种或多种组合的改进型组合物，所述两种或多种选择的CPn蛋白具有能够提供对衣原体诱导的疾病和/或感染的免疫力(如预防性疫苗接种)或(b)消除已建立的慢性衣原体感染(如治疗性疫苗接种)的互补的免疫学和/或生物学特性。

附图和表格的简要说明

图1A.用重组衣原体蛋白的多克隆小鼠抗血清体外中和肺炎衣原体对LLC-MK2细胞的感染性的试验。

图1B显示了中和10种肺炎衣原体重组抗原50％感染性的血清滴度。在3次独立实验中评价各滴度(显示SEM值)。

图2显示用文中所述免疫血清所作肺炎衣原体EB的二维电泳图的免疫印记分析。

图3显示全身性刺激后，从免疫的和模拟物-免疫的仓鼠的等量脾样品中回收的肺炎衣原体IFU平均数。

图4显示DNA-免疫的HLA-A2转基因小鼠和非转基因小鼠的脾细胞的流式细胞术分析。

图5显示用肺炎衣原体EB感染的转基因小鼠和非转基因小鼠的脾细胞的流式细胞术分析。

图6显示7105-7110蛋白家族的蛋白比对。

图7显示Cpn0794-Cpn0799的N-末端比对。

图8显示Cpn0796编码的蛋白和约包含残基1-648的C-末端结构域。

图9显示肺炎衣原体基因Cpn0795和Cpn0796编码的蛋白的C-末端(β折叠桶)结构域的比对。

表1显示了本文所述肺炎衣原体抗原数据和特性的小结。

表2显示了假拟蛋白的仓鼠模型研究结果。

表3显示了微阵列选择的CPn EB的表达基因。

表4显示了肺炎衣原体选择肽：蛋白质来源和HLA-A2稳定性试验。

表5显示了DNA免疫的HLA-A2转基因小鼠的CD8+T细胞的ELISPOT试验。

表6显示了DNA免疫的HLA-A2转基因小鼠和非转基因小鼠的脾细胞产生的IFN-γ。

发明概述

本发明涉及用作自动转运抗原的多肽，所述多肽包含：(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79，(b)与氨基酸序列(a)具有至少50％序列相同性的氨基酸序列；或(c)含有氨基酸序列(a)的一个或多个至少7个连续氨基酸的片段或其组合的氨基酸序列。

本发明也涉及多肽在制备用于在个体中预防或治疗肺炎衣原体感染的药物。例如，可将多肽用作与感染肺炎衣原体的个体的血清反应阳性血清发生免疫应答的自动转运蛋白。

本发明还涉及在个体中引发免疫应答的方法，所述方法包括给予个体多肽，该多肽包含：(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79，(b)与氨基酸序列(a)具有至少50％序列相同性的氨基酸序列，或(c)含有氨基酸序列(a)的一个或多个至少1、2、3、4、5、6或7个氨基酸的片段或其混合物的氨基酸序列。

同时，提供了在个体中诊断免疫应答的方法，所述方法包括：(a)将获自个体的生物样品与能结合具有自动转运功能的多肽的结合剂相接触，(b)检测生物样品中结合于结合剂的多肽量；和(c)将上述多肽量与预定截止值作比较，从而确定个体中是否存在免疫应答。

也提供了在对象中引发免疫应答的组合物，所述组合物包含两种或多种肺炎衣原体自动转运蛋白或其免疫原性片段。该组合物还可包含一种或多种免疫刺激剂。

同时提供了用作自动转运抗原的多肽，所述多肽包含对应于SEQ ID NO：86的氨基酸序列，与SEQ ID NO：86具有至少50％序列相同性的氨基酸序列，或含有SEQID NO：86的一个或多个至少7个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。

本发明涉及一种组合物，其包含来自肺炎衣原体菌的第一种生物分子和来自肺炎衣原体菌的第二种生物分子。所述第一种生物分子选自SEQ ID No 1-SEQ ID No86，或SEQ ID No.1-41。

所述组合物也可含有第二种生物分子，所述第二种生物分子选自SEQ ID No1-SEQ ID No.86或SEQ ID No 1-SEQ ID No 41。

所述组合物也可包含选自SEQ ID No 1-41的两种或多种生物分子。

所述组合物也可包含选自SEQ ID No 1-41的一种或多种生物分子以及选自SEQID No 42-86的一种或多种生物分子。

如之前任一项权利要求所述的组合物还包含佐剂如ADP-核糖基化外毒素或其衍生物，或佐剂选自霍乱毒素(CT)、埃希菌热不稳定性外毒素(LT)和它们的具有佐剂活性的突变体。

也提供了包含本发明组合物的疫苗和所述疫苗的用途。所述疫苗可用于制备预防或治疗衣原体感染的药物，所述疫苗可通过(例如)粘膜、鼻内或阴道内给予。

还提供了在宿主对象中治疗衣原体感染的方法，其中所述方法包括给予安全和有效量的疫苗。

本发明另一方面提供了包含肺炎衣原体抗原组合的免疫原性组合物，该组合包括与肺炎衣原体原生小体相关的至少一种肺炎衣原体抗原和与肺炎衣原体网状体相关的至少一种肺炎衣原体抗原。

本发明另一方面提供了包含肺炎衣原体抗原组合的免疫原性组合物，该组合包括第一抗原组的至少一种肺炎衣原体抗原和第二抗原组的至少一种肺炎衣原体抗原，所述第一抗原组包括III型分泌系统(TTSS)蛋白，所述第二抗原组包括III型分泌系统(TTSS)效应器蛋白。

本发明又一方面提供了包含肺炎衣原体抗原组合的免疫原性组合物，该组合包括在至少两种血清变型上保守的至少一种肺炎衣原体抗原。

本发明又一方面提供了包含肺炎衣原体抗原组合的免疫原性组合物，该组合引发肺炎衣原体特异性TH1免疫应答和肺炎衣原体特异性TH2免疫应答。

本发明还提供监测对感染肺炎衣原体患者的疗效的方法，该方法包括将本发明免疫原性组合物给予患者后，测定患者的肺炎衣原体特异性抗体水平。

发明详述

本发明提供一种组合物，其包含来自肺炎衣原体菌的第一种生物分子和来自肺炎衣原体菌的第二种生物分子。术语″生物分子″包括蛋白质、抗原和核酸。该组合物也可包含其它生物分子(也优选来自肺炎衣原体)。就是说，所述组合物可包含两种或多种生物分子(如3、4、5、6、7、8种等)，其中至少两种来自肺炎衣原体菌(如3、4、5、6、7、8种等)。这种组合物包括含有以下组成的组合物：(i)两种或多种不同的肺炎衣原体蛋白；(ii)两种或多种不同的肺炎衣原体核酸，或(iii)一种或多种肺炎衣原体蛋白和一种或多种肺炎衣原体核酸的混合物。

本发明一方面提供了免疫原性组合物，所述组合物包含引发肺炎衣原体特异性TH1免疫应答(如细胞介导的免疫应答或细胞免疫应答)的至少一种抗原和引发肺炎衣原体特异性TH2应答(如体液或抗体应答)的至少一种抗原的组合。该免疫原性组合物还可包含TH1佐剂和TH2佐剂。

本发明另一方面提供了一种免疫原性组合物，其包含肺炎衣原体抗原组合，所述组合包括在至少两种血清变型上保守的至少一种肺炎衣原体抗原。

本发明又一个方面提供了一种免疫原性组合物，所述组合物包含引发肺炎衣原体特异性TH1免疫应答的至少一种抗原和引发肺炎衣原体特异性TH2免疫应答的至少一种抗原的组合，该组合包括在至少两种血清变型上保守的至少一种肺炎衣原体抗原。

在本发明另一方面，提供了一种免疫原性组合物，其包含引发肺炎衣原体特异性TH1免疫应答的至少一种抗原和引发肺炎衣原体特异性TH2免疫应答的至少一种抗原，优选包含肺炎衣原体抗原组合，该组合包括与肺炎衣原体EB相关的至少一种肺炎衣原体抗原和与肺炎衣原体RB相关的至少一种肺炎衣原体抗原。其它这种组合可包括来自一种血清变型的EB和/或RB抗原与来自至少一种其它血清变型的RB和/或EB抗原的混合。

本发明另一方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括肺炎衣原体抗原组合，其中至少一种肺炎衣原体抗原与肺炎衣原体EB相关，至少一种肺炎衣原体抗原与肺炎衣原体RB相关。该试剂盒还可包括TH1佐剂、TH2佐剂和说明书。

本发明还提供通过给予本发明免疫原性组合物引发衣原体特异性免疫应答的方法。

本发明还提供监测对感染肺炎衣原体对象的疗效的方法，该方法包括将本发明免疫原型组合物给予对象后，测定对象的衣原体特异性抗体或衣原体特异性效应器分子的水平。

在一个优选实施方式中，第一种和第二种生物分子来自不同肺炎衣原体种(例如，来自不同的肺炎衣原体血清变型)，但它们也可能来自相同种。组合物中的生物分子可能来自相同种的不同血清组或不同株系。第一种生物分子优选选自SEQ ID No1-86。它更优选选自SEQ ID 1-41和/或SEQ ID No 42-86。它优选为纯化或分离的生物分子。第二种生物分子优选选自SEQ ID No 1-86。它更优选选自SEQ ID 1-41和/或SEQ ID No 42-86。它优选为纯化或分离的生物分子。因此，本发明的特定组合物包括含有以下物质的组合物：选自SEQ ID No 1-41的两种或多种生物分子；选自SEQID 1-41的一种或多种生物分子以及选自SEQ ID 42-86的一种或多种生物分子。第一种和第二种生物分子中的一种或两种可以是本文未具体公开的肺炎衣原体生物分子，以及在此专利申请提交之前可能未鉴定、未发现或没有为公众所知或没有纯化的肺炎衣原体生物分子。

在另一实施方式中，提供了肺炎衣原体抗原组合，该组合包括至少一种III型分泌系统(TTSS)蛋白和至少一种III型分泌系统(TTSS)分泌或效应器蛋白或其片段。有许多鉴定TTSS蛋白(即与衣原体TTSS机器相关的TTSS蛋白)的方法。TTSS是一种复杂的蛋白质分泌和递送机器或细胞器(apparatus)，它可完全或部分位于原生小体(EB)上，允许生物体如衣原体通过将蛋白质(如细菌效应器蛋白(可用作抗宿主毒力决定簇))注入真核细胞胞浆以建立细菌感染并调节宿主细胞功能，来维持其细胞内小生境。暴露在EB表面上的TTSS蛋白可能在粘附和/或摄取入宿主细胞中起作用。

就背景信息而言，TTSS是一种复杂的蛋白质分泌和递送机器或细胞器，它可位于原生小体(EB)上，允许生物体如衣原体通过将蛋白质(如细菌效应器蛋白(可用作抗宿主毒力决定簇))注入真核细胞胞浆以建立细菌感染并调节宿主细胞功能，来维持其细胞内小生境。这些注入的蛋白(TTSS效应器蛋白)可能对宿主细胞产生各种影响，包括但不限于，操纵肌动蛋白和其它结构蛋白以及调节宿主细胞信号转导系统。注入(或转位)的蛋白或TTTS系统的底物也可被加工并由I型MHC分子递呈。

并非III型分泌系统分泌的所有蛋白质都递送入宿主细胞或具有效应器功能。虽然认为原生小体(EB)是“代谢惰性”，但已假设，位于(EB)上的衣原体TTSS系统由膜接触引发并能够释放预先形成的“有效载荷”(payload)蛋白。当前的假说是，III型分泌系统(TTSS)在衣原体复制循环的胞内相期间变得有活性，以将蛋白质分泌到宿主细胞胞质中和将衣原体蛋白(如Inc组)插入将生长的衣原体微菌落与宿主细胞胞质分开的包涵体膜中(参见Montigiani等(2002)Infection and Immunity 70(1)；386-379)。

蛋白质可在感染后2小时(早期循环)表达和分泌，而其它早期和中期循环III型特异性基因的表达直到6-12小时后(中期循环)才能检测到。16-20小时后，RB开始分化为EB，48-72小时后，包涵体中EB占大多数。宿主细胞裂解导致EB释放到胞外空间中，在这里它们可以感染更多细胞。为了本说明书的目的，早期基因是感染早期表达的基因(根据mRNA表达)，中间基因是在感染后的中期循环中表达的基因，晚期基因是RB最终转变为EB期间表达的基因。在早期、中期和晚期蛋白的表面表达及其转录和翻译特征之间可能有时滞，因为mRNA丰度可能不总是与蛋白质丰度相关。

在一个例子中，本发明可包括TTSS效应器蛋白。所述FTSS效应器蛋白与肺炎衣原体的RB形式相关，并可用(例如)免疫荧光显微镜检鉴定(参见Bannantine等，Infection and Immunity 66(12)；6017-6021)。可在肺炎衣原体感染期间的特定时间点(如早期、中期或晚期循环)将TTSS机器分泌的推定衣原体TTSS效应器蛋白的效应器抗体显微注射到宿主细胞中。然后观察与肺炎衣原体进入宿主细胞相关的宿主细胞对肺炎衣原体的反应(如肌动蛋白重塑、抑制核内体成熟、获得宿主脂质以及I型和II型MHC分子下调)。根据这些短暂(temporal)观察，可检测到TTSS效应器蛋白(RB-相关性肺炎衣原体蛋白)。

本发明的特定组合物可包含肺炎衣原体抗原组合，所述组合由第一抗原组的两种、三种、四种、五种或所有六种肺炎衣原体抗原组成，所述第一抗原组由以下物质组成：(1)pmp2；(2)pmp10；(3)烯醇酶；(4)OmpH-样蛋白；和(5)CPn特异性基因CPn0759和CPn0042的产物。本文将这些抗原称为‘第一抗原组’。

本发明组合物优选包含肺炎衣原体抗原组合，所述组合选自：(1)pmp2和pmp10；(2)pmp2和烯醇酶；(3)pmp2和OmpH-样蛋白；(4)pmp2和CPn0759；(5)pmp2和CPn0042；(6)pmp10和烯醇酶；(7)pmp10和OmpH-样蛋白；(8)pmp10和CPn0759；(9)pmp10和CPn0042；(10)烯醇酶和OmpH-样蛋白；(11)烯醇酶和CPn0759；(12)烯醇酶和CPn0042；(13)OmpH-样蛋白和CPn0759；(14)OmpH-样蛋白和CPn0042；(15)CPn0759和CPn0042；(16)pmp2和pmp10和烯醇酶；(17)pmp2和pmp10和OmpH-样蛋白；(18)pmp2和pmp10和CPn0759；(19)pmp2和pmp10和CPn0042；(20)pmp2和烯醇酶和OmpH-样蛋白；(21)pmp2和烯醇酶和Cpn0759；(22)pmp2和烯醇酶和CPn0042；(23)pmp2和OmpH-样蛋白和CPn0759；(24)pmp2和OmpH-样蛋白和CPn0042；(25)pmp2和Cpn0759和CPn0042；以及(26)pmp10和烯醇酶和OmpH-样蛋白；(27)pmp10和烯醇酶和CPn0759；(28)pmp10和烯醇酶和CPn0042；(29)烯醇酶和OmpH-样蛋白和CPn0759；(30)烯醇酶和OmpH-样蛋白和CPn0042；(31)OmpH-样蛋白和CPn0759和CPn0042。

肺炎衣原体抗原的组合物优选由pmp2、pmp10、烯醇酶、OmpH-样蛋白和CPn0759组成。

肺炎衣原体抗原的组合物优选由pmp2、pmp10、烯醇酶、OmpH-样蛋白和CPn0042组成。

肺炎衣原体抗原的组合物优选由pmp2、pmp10、烯醇酶、OmpH-样蛋白和CPn0759和CPn0042组成。

本发明也提供了特别适合于免疫目的(尤其是组合使用时)的12种肺炎衣原体抗原的稍大组。(此第二抗原组包括第一抗原组的六种肺炎衣原体抗原)。这12种肺炎衣原体抗原形成第二抗原组：(1)pmp2；(2)pmp1O；(3)烯醇酶；(4)OmpH-样蛋白；(5)CPn0759；(6)CPn0042；(7)ArtJ；(8)HtrA；(9)AtoS；(10)OmcA；(11)CPn0498；和(12)CPn0525。本文将这些抗原称为‘第二抗原组’。

因此，本发明提供了包含肺炎衣原体抗原组合的组合物，所述组合选自所述第二抗原组的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种肺炎衣原体抗原。该组合优选选自所述第二抗原组的两种、三种、四种或五种肺炎衣原体抗原。该组合更优选由所述第二抗原组的六种肺炎衣原体抗原组成。下面更详细地描述所述第一和第二抗原组的各肺炎衣原体抗原。

(1)Pmp10(CPn0449)

pmp10蛋白的一个例子是下面的SEQ ID NO：1(GenBank登录号GI：14195016)。用于本发明的pmp10蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：1有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：1的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些pmp2蛋白包括SEQ ID NO：1的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：1的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：1的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失了信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQIDNo 1

 1  MKSQFSWLVL SSTLACFTSC STVFAATAEN IGPSDSFDGS TNTGTYTPKN TTTGIDYTLT

 61 GDITLQNLGD SAALTKGCFS DTTESLSFAG KGYSLSFLNI KSSAEGAALS VTTDKNLSLT

121 GFSSLTFLAA PSSVITTPSG KGAVKCGGDL TFDNNGTILF KQDYCEENGG AISTKNLSLK

181 NSTGSISFEG NKSSATGKKG GAICATGTVD ITNNTAPTLF SNNIAEAAGG AINSTGNCTI

241 TGNTSLVFSE NSVTATAGNG GALSGDADVT ISGNQSVTFS GNQAVANGGA IYAKKLTLAS

301 GGGGGISFSN NIVQGTTAGN GGAISILAAG ECSLSAEAGD ITFNGNAIVA TTPQTTKRNS

361 IDIGSTAKIT NLRAISGHSI FFYDPITANT AADSTDTLNL NKADAGNSTD YSGSIVFSGE

421 KLSEDEAKVA DNLTSTLKQP VTLTAGNLVL KRGVTLDTKG FTQTAGSSVI MDAGTTLKAS

481 TEEVTLTGLS IPVDSLGEGK KVVIAASAAS KNVALSGPIL LLDNQGNAYE NHDLGKTQDF

541 SFVQLSALGT ATTTDVPAVP TVATPTHYGY QGTWGMTWVD DTASTPKTKT ATLAWTNTGY

601 LPNPERQGPL VPNSLWGSFS DIQAIQGVIE RSALTLCSDR GFWAAGVANF LDKDKKGEKR

661 KYRHKSGGYA IGGAAQTCSE NLISFAFCQL FGSDKDFLVA KNHTDTYAGA FYIQHITECS

721 GFIGCLLDKL PGSWSHKPLV LEGQLAYSHV SNDLKTKYTA YPEVKGSWGN NAFNMMLGAS

781 SHSYPEYLHC FDTYAPYIKL NLTYIRQDSF SEKGTEGRSF DDSNLFNLSL PIGVKFEKFS

841 DCNDFSYDLT LSYVPDLIRN DPKCTTALVI SGASWETYAN NLARQALQVR AGSHYAFSPM

901 FEVLGQFVFE VRGSSRIYNV DLGGKFQF

(2)Pmp2＝多态性外膜蛋白G家族(CPn 0013)

pmp2蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：139和140。{GenBank登录号：gi|4376270|gb|AAD18172.1‘CPn0013’；下述SEQ ID NO：2}。用于本发明的pmp2蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：2有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：1的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些pmp2蛋白包括SEQ ID NO：2的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：1的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：2的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失了信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 2

  1 MKIPLRFLLI SLVPTLSMSN LLGAATTEEL SASNSFDGTT STTSFSSKTS

 51 SATDGTNYVF KDSVVIENVP KTGETQSTSC FKNDAAAGDL NFLGGGFSFT

101 FSNIDATTAS GAAIGSEAAN KTVTLSGFSA LSFLKSPAST VTNGLGAINV

151 KGNLSLLDND KVLIQDNFST GDGGAINCAG SLKIANNKSL SFIGNSSSTR

201 GGAIHTKNLT LSSGGETLFQ GNTAPTAAGK GGAIAIADSG TLSISGDSGD

251 IIFEGNTIGA TGTVSHSAID LGTSAKITAL RAAQGHTIYF YDPITVTGST

301 SVADALNINS PDTGDNKEYT GTIVFSGEKL TEAEAKDEKN RTSKLLQNVA

351  FKNGTVVLKG DVVLSANGFS QDANSKLIMD LGTSLVANTE SIELTNLEIN

401  IDSLRNGKKI KLSAATAQKD IRIDRPVVLA ISDESFYQNG FLNEDHSYDG

451  ILELDAGKDI VISADSRSID AVQSPYGYQG KWTINWSTDD KKATVSWAKQ

501  SFNPTAEQEA PLVPNLLWGS FIDVRSFQNF IELGTEGAPY EKRFWVAGIS

551  NVLHRSGREN QRKFRHVSGG AVVGASTRMP GGDTLSLGFA QLFARDKDYF

601  MNTNFAKTYA GSLRLQHDAS LYSVVSILLG EGGLREILLP YVSKTLPCSF

651  YGQLSYGHTD HRMKTESLPP PPPTLSTDHT SWGGYVWAGE LGTRVAVENT

701  SGRGFFQEYT PFVKVQAVYA RQDSFVELGA ISRDFSDSHL YNLAIPLGIK

751  LEKRFAEQYY HVVAMYSPDV CRSNPKCTTT LLSNQGSWKT KGSNLARQAG

801  IVQASGFRSL GAAAELFGNF GFEWRGSSRS YNVDAGSKIK F*

(3)烯醇酶(Cpn0800)

‘Eno’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：93和94。{GenBank登录号：gi|4377111|gb|AAD18938.1|‘Cpn0800’；下述SEQ ID NO：3}。用于本发明的Eno蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：2有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：2的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些Eno蛋白包括SEQ ID NO：3的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：3的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：3的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失了信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 3

  1 MFEAVIADIQ AREILDSRGY PTLHVKVTTS TGSVGEARVP SGASTGKKEA

 51 LEFRDTDSPR YQGKGVLQAV KNVKEILFPL VKGCSVYEQS LIDSLMMDSD

101 GSPNKETLGA NAILGVSLAT AHAAAATLRR PLYRYLGGCF ACSLPCPMMN

151 LINGGMHADN GLEFQEFMIR PIGASSIKEA VNMGADVFHT LKKLLHERGL

201 STGVGDEGGF APNLASNEEA LELLLLAIEK AGFTPGKDIS LALDCAASSF

251 YNVKTGTYDG RHYEEQIAIL SNLCDRYPID SIEDGLAEED YDGWALLTEV

301 LGEKVQIVGD DLFVTNPELI LEGISNGLAN SVLIKPNQIG TLTETVYAIK

351 LAQMAGYTTI ISHRSGETTD TTIADLAVAF NAGQIKTGSL SRSERVAKYN

401 RLMEIEEELG SEAIFTDSNV FSYEDSEE*

(4)OmpH-样外膜蛋白(CPn0301)

‘OmpH-样’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：77和78。{GenBank登录号：gi|4376577|gb|AAD18450.1|‘CPn0301’；下述SEQ ID NO：4}。用于本发明的优选OmpH-样蛋白包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：4有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：3的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些OmpH-样蛋白包括SEQ ID NO：4的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：4的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：4的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多；优选19或更多，以去除信号肽)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失上述信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No4

  1  MKKLLFSTFL LVLGSTSAAH ANLGYVNLKR CLEESDLGKK ETEELEAMKQ

 51 QFVKNAEKIE EELTSIYNKL QDEDYMESLS DSASEELRKK FEDLSGEYNA

101 YQSQYYQSIN QSNVKRIQKL IQEVKIAAES VRSKEKLEAI LNEEAVLAIA

151 PGTDKTTEII AILNESFKKQ N*

(5)CPn0042(假拟)

假拟蛋白的一个例子是下面所列的SEQ ID NO：5。

GenBank登录号：gi|4376296|gb|AAD18195.1。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：5有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：5的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ IDNO：5的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：5的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：5的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多；优选19或更多，以去除信号肽)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失上述信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 5

  1 MEEVSEYLQQ VENQLESCSK RLTKMETFAL GVRLEAKEEI ESIILSDVVN RFEVLCRDIE

 61 DMLSRVEEIE RMLRMAELPL LPIKEALTKA FVQHNSCKEK LTKVEPYFKE SPAYLTSEER

121 LQSLNQTLQR AYKESQKVSG LESEVRACRE QLKDQVRQFE TQGVSLIKEE ILFVTSTFRT

181 KFSYHSFRLH VPCMRLYEEY YDDIDLERTR ARWMAMSERY RDAFQAFQEM LKEGLVEEAQ

241 ALRETEYWLY REERKSKKKH

(6)CPn0795(假拟）

假拟蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：63和64。{GenBank登录号：gi|4377106|gb|AAD18933.1|‘CPn0795’；下述SEQ ID NO：6}。正如实施例所证明，我们第一次证明了CPn0795和Cpn0794-Cpn0799组中的相关蛋白具有分泌型自动转运功能。已证明，通过自动转运分泌机制分泌的蛋白质具有总体一致的结构，包括氨基末端前导肽(用于穿过内膜的分泌)、分泌型成熟蛋白(或过客(passenger)结构域)和专有C-末端结构域，它在外膜中形成孔，过客结构域通过该孔抵达细胞表面。穿过外膜分泌的要求可能是包含在单分子中，分泌是能量依赖性过程。考虑到可能施加于分泌的生物物理限制，蛋白质的结构特性可能受孔大小的限制。

自动转运，或V型分泌系统是专有蛋白易位机制，它允许生物体将蛋白分泌至和分泌出细菌表面。该分泌机制和仅通过一次重组事件产生新自动转运蛋白的能力使细菌有很大机会提高发展为周质或转运出的(exported)毒力因子的蛋白质的分泌效率。

在自动转运(V型)分泌机制的一个模型中，通过自动转运分泌机制转运出蛋白质并翻译为具有聚蛋白的结构域。这些自动转运蛋白具有含有以下三个功能结构域的总体一致的结构：氨基末端前导序列、分泌型成熟蛋白(过客结构域)和形成β折叠孔以分泌过客蛋白的羧基末端(β-)结构域。前导序列指导通过sec细胞器分泌，该序列在内膜上被信号肽酶切割，将该分子的剩余部分释放到周质中。一旦进入周质后，β-结构域呈现生物物理上较佳的形态，其特征是β-折叠桶形结构，将其自身插入外膜中形成孔。插入外膜后，过客结构域易位到细菌细胞表面，在此它可保持完整或进行加工。加工的蛋白可能被释放到细胞外环境中，或保持连接在细菌细胞表面上。(Henderson和Nataro，“自动转运蛋白的毒力作用”(Virulence Functions ofAutotransporter Proteins)，Infection and Immunity，第69卷，第3期，2001年3月，1231-1243页)。

用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：6有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：6的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：6的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：6的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：6的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多；优选19或更多，以去除信号肽)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失上述信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。如实施例所证明，我们第一次说明CPn0795似乎存在于感染性EB形式的表面上并可获得其抗体，这使此蛋白成为免疫原性组合物或疫苗的良好组分。

本申请的表1证明，Cpn特异性假拟蛋白Cpn0795(SEQ ID NO：6)是FACS阳性蛋白，它在肺炎衣原体感染的仓鼠脾模型中具有显著的免疫保护活性。我们发现有证据证明，现在发现Cpn特异性假拟蛋白组中的其它Cpn蛋白具有分泌型自动转运功能。这些蛋白(在沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)中不存在)包括：gi/4377105(Cpn0794)、gi/4377106(Cpn0795)、gi/4377107(Cpn0796)、gi/4377108(Cpn0797)、gi/4377109(CPn0798)、gi/4377110(Cpn0799)。

SEQ ID No 6

  1 MKDLGTLGGT SSTAKTVSPD GKVIMGRSQI ADGSWHAFMC HTDFSSNNVL

 51 FDLDNTYKTL RENGRQLNSI FNLQNMMLQR ASDHEFTEFG RSNIALGAGL

101 YVNALQNLPS NLAAQYFGIA YKIRPKYRLG VFLDHNFSSH VPNNFNVSHN

151 RLWMGAFIGW QDSDALGSSV KVSFGYGKQK ATITREQLEN TEAGSGESHF

201  EGVAAQIEGR YGKSLGGHVR VQPFLGLQFV HITRKEYTEN AVQFPVHYDP

251  IDYSTGVVYL GIGSHIALVD SLHVGTRMGM EQNFAAHTDR FSGSIASIGN

301  FVFEKLDVTH TRAFAEMRVN YELPYLQSLN LILRVNQQPL QGVMGFSSDL

351  RYALGF*

(7)ArtJ精氨酸周质-结合蛋白(CPn0482)

‘ArtJ’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：73和74。{GenBank登录号：gi|4376767|gb|AAD18622.1|‘CPn0482’；下述SEQ ID NO：7}。用于本发明的ArtJ蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：7有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：7的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些ArtJ蛋白包括SEQ ID NO：7的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：7的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：7的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。ArtJ蛋白可结合于小分子如精氨酸或另一种氨基酸。

SEQ ID No 7

  1 MIKQIGRFFR AFIFIMPLSL TSCESKIDRN RIWIVGTNAT YPPFEYVDAQ

 51 GEVVGFDIDL AKAISEKLGK QLEVREFAFD ALILNLKKHR IDAILAGMSI

101 TPSRQKEIAL LPYYGDEVQE LMVVSKRSLE TPVLPLTQYS SVAVQTGTFQ

151 EHYLLSQPGI CVRSFDSTLE VIMEVRYGKS PVAVLEPSVG RVVLKDFPNL

201 VATRLELPPE CWVLGCGLGV AKDRPEEIQT IQQAITDLKS EGVIQSLTKK

251 WQLSEVAYE*

(8)HtrA DO丝氨酸蛋白酶(CPn0979)

‘HrtA’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：111和112。{GenBank登录号：gi|4377306|gb|AAD19116.1|‘CPn0979’；下述SEQ ID NO：8}。用于本发明的HrtA蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：8有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：8的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些HrtA蛋白包括SEQ ID NO：8的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：8的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：8的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多；优选至少16个以去除信号肽)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失上述信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。与SEQ ID NO：8相比，不同区域是以下残基：1-16；17-497；128-289；290-381；394-485和394-497。

SEQ ID No 8

  1 MITKQLRSWL AVLVGSSLLA LPLSGQAVGK KESRVSELPQ DVLLKEISGG

 51 FSKVATKATP AVVYIESFPK SQAVTHPSPG RRGPYENPFD YFNDEFFNRF

101 FGLPSQREKP QSKEAVRGTG FLVSPDGYIV TNNHVVEDTG KIHVTLHDGQ

151 KYPATVIGLD PKTDLAVIKI KSQNLPYLSF GNSDHLKVGD WAIAIGNPFG

201 LQATVTVGVI SAKGRNQLHI ADFEDFIQTD AAINPGNSGG PLLNIDGQVI

251 GVNTAIVSGS GGYIGIGFAI PSLMANRIID QLIRDGQVTR GFLGVTLQPI

301 DAELAACYKL EKVYGALVTD VVKGSPADKA GLKQEDVIIA YNGKEVDSLS

351 MFRNAVSLMN PDTRIVLKVV REGKVIEIPV TVSQAPKEDG MSALQRVGIR

401 VQNLTPETAK KLGIAPETKG ILIISVEPGS VAASSGIAPG QLILAVNRQK

451 VSSIEDLNRT LKDSNNENIL LMVSQGDVIR FIALKPEE*

(9)AtoS双组分调节系统传感组氨酸激酶蛋白(CPn0584)

‘AtoS’蛋白的一个例子是WO 02/02606中公开的SEQ ID NO：105和106。{GenBank登录号：gi|4376878|gb||AAD18723.1|‘CPn0584’；下述SEQ ID NO：9}。用于本发明的AtoS蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：9有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：9的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些AtoS蛋白包括SEQ ID NO：9的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：9的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：9的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 9

  1  MNVPDSKNLH PPAYELLEIK ARITQSYKEA SAILTAIPDG ILLLSETGHF

 51  LICNSQAREI LGIDENLEIL NRSFTDVLPD TCLGFSIQEA LESLKVPKTL

101  RLSLCKESKE KEVELFIRKN EISGYLFIQI RDRSDYKQLE NAIERYKNIA

151  ELGKMTATLA HEIRNPLSGI VGFASILKKE ISSPRHQRML SSIISGTRSL

201  NNLVSSMLEY TKSQPLNLKI INLQDFFSSL IPLLSVSFPN CKFVREGAQP

251  LFRSIDPDRM NSVVWNLVKN AVETGNSPIT LTLHTSGDIS VTNPGTIPSE

301  IMDKLFTPFF TTKREGNGLG LAEAQKIIRL HGGDIQLKTS DSAVSFFIII

351  PELLAALPKE RAAS*

(10)OmcA 9kDa-富含半胱氨酸的脂蛋白(Cpn0558)

‘OmcA’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：9和10。{GenBank登录号：gi|4376850|gb|AAD18698.1|‘CPn0558’、‘OmcA’、‘Omp3’；下述SEQ ID NO：10}。用于本发明的OmcA蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：10有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQID NO：10的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些OmcA蛋白包括SEQ ID NO：10的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：10的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：10的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多；优选18或更多以去除信号肽)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失上述信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。该蛋白质可脂化(如通过N-酰基二甘油酯)，从而可具有N-末端半胱氨酸。

SEQ ID No 10

1   MKKAVLIAAM FCGVVSLSSC CRIVDCCFED PCAPSSCNPC EVIRKKERSC

51  GGNACGSYVP SCSNPCGSTE CNSQSPQVKG CTSPDGRCKQ *

(11)CPn0498(假拟)

假拟蛋白的一个例子是下面所列的SEQ ID NO：11。

(GenBank登录号GI：4376784；AAD18638.1)。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：11有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多；和/或(b)是SEQ ID NO：11的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：11的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：11的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：11的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多；优选18或更多以去除信号肽)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失上述信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。该蛋白质可脂化(如通过N-酰基二甘油酯)，从而可具有N-末端半胱氨酸。

SEQ ID No 11

  1 MNRRKARWVV ALFAMTALIS VGCCPWSQAK SRCSIDKYIP VVNRLLEVCG LPEAENVEDL

 61 IESSSAWVLT PEERFSGELV SICQVKDEHA FYNDLSLLHM TQAVPSYSAT YDCAVVFGGP

121 LPALRQRLDF LVREWQRGVR FKKIVFLCGE RGRYQSIEEQ EHFFDSRYNP FPTEENWESG

181 NRVTPSSEEE IAKFVWMQML LPRAWRDSTS GVRVTFLLAK PEENRVVANR KDTLLLFRSY

241 QEAFPGRVLF VSSQPFIGLD ACRVGQFFKG ESYDLAGPGF AQGVLKYHWA PRICLHTLAE

301 WLKETNGCLN ISEGCFG

(12)CPn0525(假拟)

‘Cpn0525’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：117和118。{GenBank登录号：gi|4376814|gb|AAD18665.1|‘CPn0525’，下述SEQ ID NO：12}。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：12有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：12的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些OmcA蛋白包括SEQ ID NO：12的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：12的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：12的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多；优选18或更多以去除信号肽)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失上述信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 12

  1 MHDALLSILA IQELDIKMIR LMRVKKEHQK ELAKVQSLKS DIRRKVQEKE

 51 LEMENLKTQI RDGENRIQEI SEQINKLENQ QAAVKKMDEF NALTQEMTTA

101 NKERRSLEHQ LSDLMDKQAG GEDLIVSLKE SLASTENSSS VIEKEIFESI

151 KKINEEGKAL LEQRTELKHA TNPELLSIYE RLLNNKKDRV VVPIENRVCS

201 GCHIVLTPQH ENLVRKKDRL IFCEHCSRIL YWQESQVNAQ ENSTAKRRRR

251 RAAV*

第三抗排原组

可通过与来自第一抗原组或第二抗原组的两种或多种肺炎衣原体抗原组合来提高其它肺炎衣原体抗原的免疫原性。所述其它肺炎衣原体抗原包括由(1)LcrE、(2)DnaK、(3)Omp85同源物、(4)Mip样、(5)OmcB、(6)MurG、(7)Cpn0186和(8)fliY组成的第三抗原组。本文中将这些抗原称为“第三抗原组”。

(13)LcrE低钙效应E.蛋白(CPn0324)

‘LcrE’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：29和30。{GenBank登录号：gi|4376602|gb|AAD18473.1|‘CPn0324’；下述SEQ ID NO：13}。用于本发明的LcrE蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：13有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：13的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些LcrE蛋白包括SEQ ID NO：13的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：13的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：13的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 13

  1 MAASGGTGGL GGTQGVNLAA VEAAAAKADA AEVVASQEGS EMNMIQQSQD

 51 LTNPAAATRT KKKEEKFQTL ESRKKGEAGK AEKKSESTEE KPDTDLADKY

101 ASGNSEISGQ ELRGLRDAIG DDASPEDILA LVQEKIKDPA LQSTALDYLV

151 QTTPPSQGKL KEALIQARNT HTEQFGRTAI GAKNILFASQ EYADQLNVSP

201 SGLRSLYLEV TGDTHTCDQL LSMLQDRYTY QDMAIVSSFL MKGMATELKR

251 QGPYVPSAQL QVLMTETRNL QAVLTSYDYF ESRVPILLDS LKAEGIQTPS

301 DLNFVKVAES YHKIINDKFP TASKVEREVR NLIGDDVDSV TGVLNLFFSA

351 LRQTSSRLFS SADKRQQLGA MIANALDAVN INNEDYPKAS DFPKPYPWS*

(14)DnaK热激蛋白70(侣伴蛋的)(CPn0503)

‘DnaK’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：103和104。{GenBank登录号：gi|4376790|gb|AAD18643.1|‘CPn0503’；下述SEQ ID NO：14。用于本发明的DnaK蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：14有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：14的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些DnaK蛋白包括SEQ ID NO：14的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：14的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：14的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 14

  1 MSEHKKSSKI IGIDLGTTNS CVSVMEGGQA KVITSSEGTR TTPSIVAFKG

 51 NEKLVGIPAK RQAVTNPEKT LGSTKRFIGR KYSEVASEIQ TVPYTVTSGS

101 KGDAVFEVDG KQYTPEEIGA QILMKMKETA EAYLGETVTE AVITVPAYFN

151 DSQRASTKDA GRIAGLDVKR IIPEPTAAAL AYGIDKVGDK KIAVFDLGGG

201 TFDISILEIG DGVFEVLSTN GDTLLGGDDF DEVIIKWMIE EFKKQEGIDL

251 SKDNMALQRL KDAAEKAKIE LSGVSSTEIN QPFITMDAQG PKHLALTLTR

301 AQFEKLAASL IERTKSPCIK ALSDAKLSAK DIDDVLLVGG MSRMPAVQET

351 VKELFGKEPN KGVNPDEVVA IGAAIQGGVL GGEVKDVLLL DVIPLSLGIE

401 TLGGVMTTLV ERNTTIPTQK KQIFSTAADN QPAVTIVVLQ GERPMAKDNK

451 EIGRFDLTDI PPAPRGHPQI EVSFDIDANG IFHVSAKDVA SGKEQKIRIE

501 ASSGLQEDEI QRMVRDAEIN KEEDKKRREA SDAKNEADSM IFRAEKAIKD

551 YKEQIPETLV KEIEERIENV RNALKDDAPI EKIKEVTEDL SKHMQKIGES

601 MQSQSASAAA SSAANAKGGP NINTEDLKKH SFSTKPPSNN GSSEDHIEEA

651 DVEIIDNDDK*

(15)Omp85同源物(Cpn0300)

Omp85同源蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：147和148。{GenBank登录号：gi|4376576|gb|AAD18449.1|‘CPn0300’；下述SEQ ID NO：15}。Preferred Omp85蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：15有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：15的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些DnaK蛋白包括SEQ ID NO：15的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：15的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：15的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 15

  1 MLIMRNKVIL QISILALIQT PLTLFSTEKV KEGHVVVDSI TIITEGENAS

 51 NKHPLPKLKT RSGALFSQLD FDEDLRILAK EYDSVEPKVE FSEGKTNIAL

101 HLIAKPSIRN IHISGNQVVP EHKILKTLQI YRNDLFEREK FLKGLDDLRT

151 YYLKRGYFAS SVDYSLEHNQ EKGHIDVLIK INEGPCGKIK QLTFSGISRS

201 EKSDIQEFIQ TKQHSTTTSW FTGAGLYHPD IVEQDSLAIT NYLHNNGYAD

251 AIVNSHYDLD DKGNILLYMD IDRGSRYTLG HVHIQGFEVL PKRLIEKQSQ

301 VGPNDLYCPD KIWDGAHKIK QTYAKYGYIN TNVDVLFIPH ATRPIYDVTY

351 EVSEGSPYKV GLIKITGNTH TKSDVILHET SLFPGDTFNR LKLEDTEQRL

401 RNTGYFQSVS VYTVRSQLDP MGNADQYRDI FVEVKETTTG NLGLFLGFSS

451 LDNLFGGIEL SESNFDLFGA RNIFSKGFRC LRGGGEHLFL KANFGDKVTD

501 YTLKWTKPHF LNTPWILGIE LDKSINRALS KDYAVQTYGG NVSTTYILNE

551 HLKYGLFYRG SQTSLHEKRK FLLGPNIDSN KGFVSAAGVN LNYDSVDSPR

601 TPTTGIRGGV TFEVSGLGGT YHFTKLSLNS SIYRKLTRKG ILKIKGEAQF

651 IKPYSNTTAE GVPVSERFFL GGETTVRGYK SFIIGPKYSA TEPQGGLSSL

701 LISEEFQYPL IRQPNISAFV FLDSGFVGLQ EYKISLKDLR SSAGFGLRFD

751 VMNNVPVMLG FGWPFRPTET LNGEKIDVSQ RFFFALGGMF *

(16)Mip样FKBP型肽基-脯氨酰基顺反子(Cpn0661)

Mip样蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：55和56。{GenBank登录号：gi|4376960|gb|AAD18800.1|‘CPn0661’；下述SEQ ID NO：16}。用于本发明的Mip样蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：16有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：16的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些Mip样蛋白包括SEQ ID NO：16的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：16的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：16的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 16

 1 MNRRWNLVLA TVALALSVAS CDVRSKDKDK DQGSLVEYKD NKDTNDIELS

51 DNQKLSRTFG HLLARQLRKS EDMFFDIAEV AKGLQAELVC KSAPLTETEY

101 EEKMAEVQKL VFEKKSKENL SLAEKFLKEN SKNAGVVEVQ PSKLQYKIIK

151 EGAGKAISGK PSALLHYKGS FINGQVFSSS EGNNEPILLP LGQTIPGFAL

201 GMQGMKEGET RVLYIHPDLA YGTAGQLPPN SLLIFEINLI QASADEVAAV

251 PQEGNQGE*

(17)OmcB60kDa富含半胱氨酸的OMP(CPn0557)

OmcB蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：47和48。{GenBank登录号：gi|4376849|gb|AAD18697.1|‘CPn0557’；下述SEQ ID NO：17}。用于本发明的OmcB蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：17有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：17的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些OmcB蛋白包括SEQ ID NO：17的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：17的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：17的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 17

  1 MSKLIRRVVT VLALTSMASC FASGGIEAAV AESLITKIVA SAETKPAPVP

 51 MTAKKVRLVR RNKQPVEQKS RGAFCDKEFY PCEEGRCQPV EAQQESCYGR

101 LYSVKVNDDC NVEICQSVPE YATVGSPYPI EILAIGKKDC VDVVITQQLP

151 CEAEFVSSDP ETTPTSDGKL VWKIDRLGAG DKCKITVWVK PLKEGCCFTA

201 ATVCACPELR SYTKCGQPAI CIKQEGPDCA CLRCPVCYKI EVVNTGSAIA

251 RNVTVDNPVP DGYSHASGQR VLSFNLGDMR PGDKKVFTVE FCPQRRGQIT

301 NVATVTYCGG HKCSANVTTV VNEPCVQVNI SGADWSYVCK PVEYSISVSN

351 PGDLVLHDVV IQDTLPSGVT VLEAPGGEIC CNKVVWRIKE MCPGETLQFK

401 LVVKAQVPGR FTNQVAVTSE SNCGTCTSCA ETTTHWKGLA ATHMCVLDTN

451 DPICVGENTV YRICVTNRGS AEDTNVSLIL KFSKELQPIA SSGPTKGTIS

501 GNTVVFDALP KLGSKESVEF SVTLKGIAPG DARGEAILSS DTLTSPVSDT

551  ENTHVY*

(18)MurG肽聚糖转移酶蛋白(CPn0904)

‘MurG’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：107和108。{GenBank登录号：gi|4377224|gb|AAD19042.1|‘CPn0904’；下述SEQ ID NO：18}。用于本发明的MurG蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：18有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：18的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些MurG蛋白包括SEQ ID NO：18的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：18的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：18的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失上述信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。例如，可用十一异戊二烯脂质化MurG。

SEQ ID No 18

  1 MMKKIRKVAL AVGGSGGHIV PALSVKEAFS REGIDVLLLG KGLKNHPSLQ

 51 QGISYREIPS GLPTVLNPIK IMSRTLSLCS GYLKARKELK IFDPDLVIGF

101 GSYHSLPVLL AGLSHKIPLF LHEQNLVPGK VNQLFSRYAR GIGVNFSPVT

151 KHFRCPAEEV FLPKRSFSLG SPMMKRCTNH TPTICVVGGS QGAQILNTCV

201 PQALVKLVNK YPNMYVHHIV GPKSDVMKVQ HVYNRGEVLC CVKPFEEQLL

251 DVLLAADLVI SRAGATILEE ILWAKVPGIL IPYPGAYGHQ EVNAKFFVDV

301 LEGGTMILEK ELTEKLLVEK VTFALDSHNR EKQRNSLAAY SQQRSTKTFH

351 AFICECL*

(19)CPn0186(假拟)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：19。

(GenBank登录号GI：4376456；AAD18339.1)。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：19有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：19的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：19的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：19的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：19的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 19

  1 MSSPVNNTPS APNIPIPAPT TPGIPTTKPR SSFIEKVIIV AKYILFAIAA TSGALGTILG

 61 LSGALTPGIG IALLVIFFVS MVLLGLILKD SISGGEERRL REEVSRFTSE NQRLTVITTT

121 LETEVKDLKA AKDQLTLEIE AFRNENGNLK TTAEDLEEQV SKLSEQLEAL ERINQLIQAN

181 AGDAQEISSE LKKLISGWDS KVVEQINTSI QALKVLLGQE WVQEAQTHVK AMQEQIQALQ

241 AEILGMHNQS TALQKSVENL LVQDQALTRV VGELLESENK LSQACSALRQ EIEKLAQHET

301 SLQQRIDAML AQEQNLAEQV TALEKMKQEA QKAESEFIAC VRDRTFGRRE TPPPTTPVVE

361 GDESQEEDEG GTPPVSQPSS PVDRATGDGQ

(20)FliY 谷胺酰胺结合蛋白(CPn0604)

假拟蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO：11和12。{GenBank登录号：gi|4376900|gb|AAD18743.1|‘CPn0604’；下述SEQ ID NO：20}。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：20有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：20的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：20的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：20的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：20的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 20

 1  MKIKFSWKVN FLICLLAVGL IFFGCSRVKR EVLVGRDATW FPKQFGIYTS

 51 DTNAFLNDLV SEINYKENLN INIVNQDWVH LFENLDDKKT QGAFTSVLPT

101 LEMLEHYQFS DPILLTGPVL VVAQDSPYQS IEDLKGRLIG VYKFDSSYLV

151 AQNIPDAVIS LYQHVPIALE ALTSNCYDAL LAPVIEVTAL IETAYKGRLK

201 IISKPLNADG LRLAILKGTN GDLLEGFNAG LVKTRRSGKY DAIKQRYRLP

可通过与来自第一抗原组或第二抗原组或第三抗原组的两种或多种肺炎衣原体抗原组合来提高其它肺炎衣原体抗原的免疫原性。所述其它肺炎衣原体抗原包括由PMP家族的一个或多个成员组成的第四抗原组。本文中将这些抗原称为“第四抗原组”。以下详细描述第四抗原组的各个肺炎衣原体抗原。

第四抗原组

(21)多态性膜蛋白(PMP)

已鉴定了有21个肺炎衣原体基因的基因家族，这些基因编码预测的多态性膜蛋白(PMP)(pmpl-pmp21)。

Pmpl(CPn0005)

Pmpl蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO：41和42。{GenBank登录号：gi|4376260|gb|AAD18163.1‘CPn0005’；下述SEQ ID NO：21}。

SEQ ID No 21

  1  MRFSLCGFPL VFSFTLLSVF DTSLSATTIS LTPEDSFHGD SQNAERSYNV

 51 QAGDVYSLTG DVSISNVDNS ALNKACFNVT SGSVTFAGNH HGLYFNNISS

101 GTTKEGAVLC CQDPQATARF SGFSTLSFIQ SPGDIKEQGC LYSKNALMLL

151 NNYVVRFEQN QSKTKGGAIS GANVTIVGNY DSVSFYQNAA TFGGAIHSSG

201 PLQIAVNQAE IRFAQNTAKN GSGGALYSDG DIDIDQNAYV LFRENEALTT

251 AIGKGGAVCC LPTSGSSTPV PIVTFSDNKQ LVFERNHSIM GGGAIYARKL

301 SISSGGPTLF INNISYANSQ NLGGAIAIDT GGEISLSAEK GTITFQGNRT

351 SLPFLNGIHL LQNAKFLKLQ ARNGYSIEFY DPITSEADGS TQLNINGDPK

401 NKEYTGTILF SGEKSLANDP RDFKSTIPQN VNLSAGYLVI KEGAEVTVSK

451 FTQSPGSHLV LDLGTKLIAS KEDIAITGLA IDIDSLSSSS TAAVIKANTA

501 NKQISVTDSI ELISPTGNAY EDLRMRNSQT FPLLSLEPGA GGSVTVTAGD

551 FLPVSPHYGF QGNWKLAWTG TGNKVGEFFW DKINYKPRPE KEGNLVPNIL

601 WGNAVDVRSL MQVQETHASS LQTDRGLWID GIGNFFHVSA SEDNIRYRHN

651 SGGYVLSVNN EITPKHYTSM AFSQLFSRDK DYAVSNNEYR MYLGSYLYQY

701 TTSLGNIFRY ASRNPNVNVG ILSRRFLQNP LMIFHFLCAY GHATNDMKTD

751 YANFPMVKNS WRNNCWAIEC GGSMPLLVFE NGRLFQGAIP FMKLQLVYAY

801 QGDFKETTAD GRRFSNGSLT SISVPLGIRF EKLALSQDVL YDFSFSYIPD

851 IFRKDPSCEA ALVISGDSWL VPAAHVSRHA FVGSGTGRYH FNDYTELLCR

901 GSIECRPHAR NYNINCGSKF RF*

Pmp4(CPn0017)

Pmp4蛋白的一个例子指定为SEQ ID NO：22。pmp4蛋白序列可参见AE001587.1 GI：4376271。

Pmp6(CPn0444)

Pmp6蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 31和32。{GenBank登录号：gi|4376727|gb|AAD18588.1|‘CPn0444’；下述SEQ ID NO：23}。

SEQ ID No 23

  1  MKYSLPWLLT SSALVFSLHP LMAANTDLSS SDNYENGSSG SAAFTAKETS

 51 DASGTTYTLT SDVSITNVSA ITPADKSCFT NTGGALSFVG ADHSLVLQTI

101 ALTHDGAAIN NTNTALSFSG FSSLLIDSAP ATGTSGGKGA ICVTNTEGGT

151 ATFTDNASVT LQKNTSEKDG AAVSAYSIDL AKTTTAALLD QNTSTKNGGA

201 LCSTANTTVQ GNSGTVTFSS NTATDKGGGI YSKEKDSTLD ANTGVVTFKS

251 NTAKTGGAWS SDDNLALTGN TQVLFQENKT TGSAAQANNP EGCGGAICCY

301 LATATDKTGL AISQNQEMSF TSNTTTANGG AIYATKCTLD GNTTLTFDQN

351 TATAGCGGAI YTETEDFSLK GSTGTVTFST NTAKTGGALY SKGNSSLTGN

401 TNLLFSGNKA TGPSNSSANQ EGCGGAILAF IDSGSVSDKT GLSIANNQEV

451 SLTSNAATVS GGAIYATKCT LTGNGSLTFD GNTAGTSGGA IYTETEDFTL

501 TGSTGTVTFS TNTAKTGGAL YSKGNNSLSG NTNLLFSGNK ATGPSNSSAN

551 QEGCGGAILS FLESASVSTK KGLWIEDNEN VSLSGNTATV SGGAIYATKC

601 ALHGNTTLTF DGNTAETAGG AIYTETEDFT LTGSTGTVTF STNTAKTAGA

651 LHTKGNTSFT KNKALVFSGN SATATATTTT DQEGCGGAIL CNISESDIAT

701 KSLTLTENES LSFINNTAKR SGGGIYAPKC VISGSESINF DGNTAETSGG

751 AIYSKNLSIT ANGPVSFTNN SGGKGGAIYI ADSGELSLEA IDGDITFSGN

801 RATEGTSTPN SIHLGAGAKI TKLAAAPGHT IYFYDPITME APASGGTIEE

 851 LVINPVVKAI VPPPQPKNGP IASVPVVPVA PANPNTGTIV FSSGKLPSQD

 901 ASIPANTTTI LNQKINLAGG NVVLKEGATL QVYSFTQQPD STVFMDAGTT

 951 LETTTTNNTD GSIDLKNLSV NLDALDGKRM ITIAVNSTSG GLKISGDLKF

1001 HNNEGSFYDN PGLKANLNLP FLDLSSTSGT VNLDDFNPIP 8SMAAPDYGY

1051 QGSWTLVPKV GAGGKVTLVA EWQALGYTPK PELRATLVPN SLWNAYVNIH

1101 SIQQEIATAM SDAPSHPGIW IGGIGNAFHQ DKQKENAGFR LISRGYIVGG

1151 SMTTPQEYTF AVAFSQLFGK SKDYVVSDIK SQVYAGSLCA QSSYVIPLHS

1201 SLRRHVLSKV LPELPGETPL VLHGQVSYGR NHHNMTTKLA NNTQGKSDWD

1251 SHSFAVEVGG SLPVDLNYRY LTSYSPYVKL QVVSVNQKGF QEVAADPRIF

1301 DASHLVNVSI PMGLTFKHES AKPPSALLLT LGYAVDAYRD HPHCLTSLTN

1351 GTSWSTFATN LSRQAFFAEA SGHLKLLHGL DCFASGSCEL RSSSRSYNAN

1401 CGTRYSF*

Pmp7(CPn0445)

Pmp7蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 153和154。{GenBank登录号：gi|4376728|gb|AAD18589.1|‘CPn0445’；下述SEQ ID NO：24}。

SEQ ID No 24

  1 MKSSVSWLFF SSIPLFSSLS IVAAEVTLDS SNNSYDGSNG TTFTVFSTTD

 51 AAAGTTYSLL SDVSFQNAGA LGIPLASGCF LEAGGDLTFQ GNQHALKFAF

101 INAGSSAGTV ASTSAADKNL LFNDFSRLSI ISCPSLLLSP TGQCALKSVG

151 NLSLTGNSQI IFTQNFSSDN GGVINTKNFL LSGTSQFASF SRNQAFTGKQ

201 GGVVYATGTI TIENSPGIVS FSQNLAKGSG GALYSTDNCS ITDNFQVIFD

251 GNSAWEAAQA QGGAICCTTT DKTVTLTGNK NLSFTNNTAL TYGGAISGLK

301 VSISAGGPTL FQSNISGSSA GQGGGGAINI ASAGELALSA TSGDITFNNN

351 QVTNGSTSTR NAINIIDTAK VTSIRAATGQ SIYFYDPITN PGTAASTDTL

401 NLNLADANSE IEYGGAIVFS GEKLSPTEKA IAANVTSTIR QPAVLARGDL

451 VLRDGVTVTF KDLTQSPGSR ILMDGGTTLS AKEANLSLNG LAVNLSSLDG

501 TNKAALKTEA ADKNISLSGT IALIDTEGSF YENHNLKSAS TYPLLELTTA

551 GANGTITLGA LSTLTLQEPE THYGYQGNWQ LSWANATSSK IGSINWTRTG

601 YIPSPERKSN LPLNSLWGNF IDIRSINQLI ETKSSGEPFE RELWLSGIAN

651 FFYRDSMPTR HGFRHISGGY ALGITATTPA EDQLTFAFCQ LFARDRNHIT

701  GKNHGDTYGA SLYFHHTEGL FDIANFLWGK ATRAPWVLSE ISQIIPLSFD

751  AKFSYLHTDN HMKTYYTDNS IIKGSWRNDA FCADLGASLP FVISVPYLLK

801  EVEPFVKVQY IYAHQQDFYE RHAEGRAFNK SELINVEIPI GVTFERDSKS

851  EKGTYDLTLM YILDAYRRNP KCQTSLIASD ANWMAYGTNL ARQGFSVRAA

901  NHFQVNPHME IFGQFAFEVR SSSRNYNTNL GSKFCF*

Pmp8(CPn0446)

Pmp8蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 45和46。{GenBank登录号：gi|4376729|gb|AAD18590.1|‘CPn0446’；下述SEQ ID NO：25}。

SEQ ID No 25

  1  MKIPLHKLLI SSTLVTPILL SIATYGADAS LSPTDSFDGA GGSTFTPKST

 51 ADANGTNYVL SGNVYINDAG KGTALTGCCF TETTGDLTFT GKGYSFSFNT

101 VDAGSNAGAA ASTTADKALT FTGFSNLSFI AAPGTTVASG KSTLSSAGAL

151 NLTDNGTILF SQNVSNEANN NGGAITTKTL SISGNTSSIT FTSNSAKKLG

201 GAIYSSAAAS ISGNTGQLVF MNNKGETGGG ALGFEASSSI TQNSSLFFSG

251 NTATDAAGKG GAIYCEKTGE TPTLTISGNK SLTFAENSSV TQGGAICAHG

301 LDLSAAGPTL FSNNRCGNTA AGKGGAIAIA DSGSLSLSAN QGDITFLGNT

351 LTSTSAPTST RNAIYLGSSA KITNLRAAQG QSIYFYDPIA SNTTGASDVL

401 TINQPDSNSP LDYSGTIVFS GEKLSADEAK AADNFTSILK QPLALASGTL

451 ALKGNVELDV NGFTQTEGST LLMQPGTKLK ADTEAISLTK LVVDLSALEG

501 NKSVSIETAG ANKTITLTSP LVFQDSSGNF YESHTINQAF TQPLVVFTAA

551 TAASDIYIDA LLTSPVQTPE PHYGYQGHWE ATWADTSTAK SGTMTWVTTG

601 YNPNPERRAS VVPDSLWASF TDIRTLQQIM TSQANSIYQQ RGLWASGTAN

651 FFHKDKSGTN QAFRHKSYGY IVGGSAEDFS ENIFSVAFCQ LFGKDKDLFI

701 VENTSHNYLA SLYLQHRAFL GGLPMPSFGS ITDMLKDIPL ILNAQLSYSY

751 TKNDMDTRYT SYPEAQGSWT NNSGALELGG SLALYLPKEA PFFQGYFPFL

801 KFQAVYSRQQ NFKESGAEAR AFDDGDLVNC SIPVGIRLEK ISEDEKNNFE

851 ISLAYIGDVY RKNPRSRTSL MVSGASWTSL CKNLARQAFL ASAGSHLTLS

901 PHVELSGEAA YELRGSAHIY NVDCGLRYSF *

Pmp9(CPn04447)

Pmp9蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 33和34。{GenBank登录号：gi|4376731|gb|AAD18591.1|‘CPn0447’；下述SEQ ID NO：26}。

SEQ ID No 26

  1  MKSSLHWFLI SSSLALPLSL NFSAFAAVVE INLGPTNSFS GPGTYTPPAQ

 51 TTNADGTIYN LTGDVSITNA GSPTALTASC FKETTGNLSF QGHGYQFLLQ

101 NIDAGANCTF TNTAANKLLS FSGFSYLSLI QTTNATTGTG AIKSTGACSI

151 QSNYSCYFGQ NFSNDNGGAL QGSSISLSLN PNLTFAKNKA TQKGGALYST

201 GGITINNTLN SASFSENTAA NNGGAIYTEA SSFISSNKAI SFINNSVTAT

251 SATGGAIYCS STSAPKPVLT LSDNGELNFI GNTAITSGGA IYTDNLVLSS

301 GGPTLFKNNS AIDTAAPLGG AIAIADSGSL SLSALGGDIT FEGNTVVKGA

351 SSSQTTTRNS INIGNTNAKI VQLRASQGNT IYFYDPITTS ITAALSDALN

401 LNGPDLAGNP AYQGTIVFSG EKLSEAEAAE ADNLKSTIQQ PLTLAGGQLS

451 LKSGVTLVAK SFSQSPGSTL LMDAGTTLET ADGITINNLV LNVDSLKETK

501 KATLKATQAS QTVTLSGSLS LVDPSGNVYE DVSWNNPQVF SCLTLTADDP

551 ANIHITDLAA DPLEKNPIHW GYQGNWALSW QEDTATKSKA ATLTWTKTGY

601 NPNPERRGTL VANTLWGSFV DVRSIQQLVA TKVRQSQETR GIWCEGISNF

651 FHKDSTKINK GFRHISAGYV VGATTTLASD NLITAAFCQL FGKDRDHFIN

701 KNRASAYAAS LHLQHLATLS SPSLLRYLPG SESEQPVLFD AQISYIYSKN

751 TMKTYYTQAP KGESSWYNDG CALELASSLP HTALSHEGLF HAYFPFIKVE

801 ASYIHQDSFK ERNTTLVRSF DSGDLINVSV PIGITFERFS RNERASYEAT

851 VIYVADVYRK NPDCTTALLI NNTSWKTTGT NLSRQAGIGR AGIFYAFSPN

901 LEVTSNLSME IRGSSRSYNA DLGGKFQF*

Pmp11(CPn0451)

Pmp11蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 115和116。{GenBank登录号：gi|4376733|gb|AAD18593.1|‘CPn0451’；下述SEQ ID NO：27)。

SEQ ID No 27

  1  MKTSIPWVLV SSVLAFSCHL QSLANEELLS PDDSFNGNID SGTFTPKTSA

 51 TTYSLTGDVF FYEPGKGTPL SDSCFKQTTD NLTFLGNGHS LTFGFIDAGT

101 HAGAAASTTA NKNLTFSGFS LLSFDSSPST TVTTGQGTLS SAGGVNLENI

151 RKLVVAGNFS TADGGAIKGA SFLLTGTSGD ALFSNNSSST KGGAIATTAG

201 ARIANNTGYV RFLSNIASTS GGAIDDEGTS ILSNNKFLYF EGNAAKTTGG

251 AICNTKASGS PELIISNNKT LIFASNVAET SGGAIHAKKL ALSSGGFTEF

301 LRNNVSSATP KGGAISIDAS GELSLSAETG NITFVRNTLT TIGSTDTPKR

351 NAINIGSNGK FTELRAAKNH TIFFYDPITS EGTSSDVLKI NNGSAGALNP

401 YQGTILFSGE TLTADELKVA DNLKSSFTQP VSLSGGKLLL QKGVTLESTS

451 FSQEAGSLLG MDSGTTLSTT AGSITITNLG INVDSLGLKQ PVSLTAKGAS

501 NKVIVSGKLN LIDIEGNIYE SHMFSHDQLF SLLKITVDAD VDTNVDISSL

551 IPVPAEDPNS EYGFQGQWNV NWTTDTATNT KEATATWTKT GFVPSPERKS

601 ALVCNTLWGV FTDIRSLQQL VEIGATGMEH KQGFWVSSMT NFLHKTGDEN

651 RKGFRHTSGG YVIGGSAHTP KDDLFTFAFC HLFARDKDCF IAHNNSRTYG

701 GTLFFKHSHT LQPQNYLRLG RAKFSESAIE KFPREIPLAL DVQVSFSHSD

751 NRMETHYTSL PESEGSWSNE CIAGGIGLDL PFVLSNPHPL FKTFIPQMKV

801 EMVYVSQNSF FESSSDGRGF SIGRLLNLSI PVGAKFVQGD IGDSYTYDLS

851 GFFVSDVYRN NPQSTATLVM SPDSWKIRGG NLSRQAFLLR GSNNYVYNSN

901 CELFGHYAME LRGSSRNYNV DVGTKLRF*

Pmp12(CPn0452)

Pmp12蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 51和52。{GenBank登录号：gi|4376735|gb|AAD18594.1‘CPn0452’；下述SEQ ID N0：28)。

SEQ ID No 28

  1  MTILRNFLTC SALFLALPAA AQVVYLHESD GYNGAINNKS LEPKITCYPE

 51 GTSYIFLDDV RISNVKHDQE DAGVFINRSG NLFFMGNRCN FTFHNLMTEG

101 FGAAISNRVG DTTLTLSNFS YLAFTSAPLL PQGQGAIYSL GSVMIENSEE

151 VTFCGNYSSW SGAAIYTPYL LGSKASRPSV NLSGNRYLVF RDNVSQGYGG

201 AISTHNLTLT TRGPSCFENN HAYHDVNSNG GAIAIAPGGS ISISVKSGDL

251 IFKGNTASQD GNTIHNSIHL QSGAQFKNLR AVSESGVYFY DPISHSESHK

301 ITDLVINAPE GKETYEGTIS FSGLCLDDHE VCAENLTSTI LQDVTLAGGT

351 LSLSDGVTLQ LHSFKQEASS TLTMSPGTTL LCSGDARVQN LHILIEDTDN

401 FVPVRIRAED KDALVSLEKL KVAFEAYWSV YDFPQFKEAF TIPLLELLGP

451 SFDSLLLGET TLERTQVTTE NDAVRGFWSL SWEEYPPSLD KDRRITPTKK

501 TVFLTWNPEI TSTP*

Pmp13(CPn0453)

Pmp13蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 3和4。{GenBank登录号：gi|4376736|gb|AAD18595.1‘CPn0453’；SEQ ID NO：29 below}。

SEQ ID No 29

  1  MKTSIRKFLI STTLAPCFAS TAFTVEVIMP SENFDGSSGK IFPYTTLSDP

 51 RGTLCIFSGD LYIANLDNAI SRTSSSCFSN RAGALQILGK GGVFSFLNIR

101 SSADGAAISS VITQNPELCP LSFSGFSQMI FDNCESLTSD TSASNVIPHA

151 SAIYATTPML FTNNDSILFQ YNRSAGFGAA IRGTSITIEN TKKSLLFNGN

201 GSISNGGALT GSAAINLINN SAPVIFSTNA TGIYGGAIYL TGGSMLTSGN

251 LSGVLFVNNS SRSGGAIYAN GNVTFSNNSD LTFQNNTASP QNSLPAPTPP

301 PTPPAVTPLL GYGGAIFCTP PATPPPTGVS LTISGENSVT FLENIASEQG

351 GALYGKKISI DSNKSTIFLG NTAGKGGAIA IPESGELSLS ANQGDILFNK

401 NLSITSGTPT RNSIHFGKDA KFATLGATQG YTLYFYDPIT SDDLSAASAA

451 ATVVVNPKAS ADGAYSGTIV FSGETLTATE AATPANATST LNQKLELEGG

501 TLALRNGATL NVHNFTQDEK SVVIMDAGTT LATTNGANNT DGAITLNKLV

551 INLDSLDGTK AAVVNVQSTN GALTISGTLG LVKNSQDCCD NHGMFNKDLQ

601 QVPILELKAT SNTVTTTDFS LGTNGYQQSP YGYQGTWEFT IDTITHTVTG

651 NWKKTGYLPH PERLAPLIPN SLWANVIDLR AVSQASAADG EDVPGKQLSI

701 TGITNFFHAN HTGDARSYRH MGGGYLINTY TRITPDAALS LGFGQLFTKS

751 KDYLVGHGHS NVYFATVYSN ITKSLFGSSR FFSGGTSRVT YSRSNEKVKT

801 SYTKLPKGRC SWSNNCWLGE LEGNLPITLS SRILNLKQII PFVKAEVAYA

851 THGGIQENTP EGRIFGHGHL LNVAVPVGVR FGKNSHNRPD FYTIIVAYAP

901 DVYRHNPDCD TTLPINGATW TSIGNNLTRS TLLVQASSHT SVNDVLEIFG

951 HCGCDIRRTS RQYTLDIGSK LRF*

Pmp14(CPn0454)

Pmp14蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 35和36。{GenBank登录号：gi|4376737|gb|AAD18596.1‘CPn0454’；下述SEQ ID NO：30}。

SEQ ID No 30

  1  MPLSFKSSSF CLLACLCSAS CAFAETRLGG NFVPPITNQG EEILLTSDFV

 51 CSNFLGASFS SSFINSSSNL SLLGKGLSLT FTSCQAPTNS NYALLSAAET

101 LTFKNFSSIN FTGNQSTGLG GLIYGKDIVF QSIKDLIFTT NRVAYSPASV

151 TTSATPAITT VTTGASALQP TDSLTVENIS QSIKFFGNLA NFGSAISSSP

201 TAVVKFINNT ATMSFSHNFT SSGGGVIYGG SSLLFENNSG CIIFTANSCV

251 NSLKGVTPSS GTYALGSGGA ICIPTGTFEL KNNQGKCTFS YNGTPNDAGA

301  IYAETCNIVG NQGALLLDSN TAARNGGAIC AKVLNIQGRG PIEFSRNRAE

351  KGGAIFIGPS VGDPAKQTST LTILASEGDI AFQGNMLNTK PGIRNAITVE

401  AGGEIVSLSA QGGSRLVFYD PITHSLPTTS PSNKDITINA NGASGSVVFT

451  SKGLSSTELL LPANTTTILL GTVKIASGEL KITDNAVVNV LGFATQGSGQ

501  LTLGSGGTLG LATPTGAPAA VDFTIGKLAF DPFSFLKRDF VSASVNAGTK

551  NVTLTGALVL DEHDVTDLYD MVSLQTPVAI PIAVFKGATV TKTGFPDGEI

601  ATPSHYGYQG KWSYTWSRPL LIPAPDGGFP GGPSPSANTL YAVWNSDTLV

651  RSTYILDPER YGEIVSNSLW ISFLGNQAFS DILQDVLLID HPGLSITAKA

701  LGAYVEHTPR QGHEGFSGRY GGYQAALSMN YTDHTTLGLS FGQLYGKTNA

751  NPYDSRCSEQ MYLLSFFGQF PIVTQKSEAL ISWKAAYGYS KNHLNTTYLR

801  PDKAPKSQGQ WHNNSYYVLI SAEHPFLNWC LLTRPLAQAW DLSGFISAEF

851  LGGWQSKFTE TGDLQRSFSR GKGYNVSLPI GCSSQWFTPF KKAPSTLTIK

901  LAYKPDIYRV NPHNIVTVVS NQESTSISGA NLRRHGLFVQ IHDVVDLTED

951  TQAFLNYTFD GKNGFTNHRV STGLKSTF*

Pmp15(CPn0466)

Pmp15蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 5和6。{GenBank登录号：gi|4376751|gb|AAD18608.1‘CPn0466’；下述SEQ ID NO：31}。

SEQ ID No 31

  1  MRFFCFGMLL PFTFVLANEG LQLPLETYIT LSPEYQAAPQ VGFTHNQNQD

 51 LAIVGNHNDF ILDYKYYRSN GGALTCKNLL ISENIGNVFF EKNVCPNSGG

101 AIYAAQNCTI SKNQNYAFTT NLVSDNPTAT AGSLLGGALF AINCSITNNL

151 GQGTFVDNLA LNKGGALYTE TNLSIKDNKG PIIIKQNRAL NSDSLGGGIY

201 SGNSLNIEGN SGAIQITSNS SGSGGGIFST QTLTISSNKK LIEISENSAF

251 ANNYGSNFNP GGGGLTTTFC TILNNREGVL FNNNQSQSNG GAIHAKSIII

301 KENGPVYFLN NTATRGGALL NLSAGSGNGS FILSADNGDI IFNNNTASKH

351 ALNPPYRNAI HSTPNMNLQI GARPGYRVLF YDPIEHELPS SFPILFNFET

401 GHTGTVLFSG EHVHQNFTDE MNFFSYLRNT SELRQGVLAV EDGAGLACYK

451 FFQRGGTLLL GQGAVITTAG TIPTPSSTPT TVGSTITLNH IAIDLPSILS

501 FQAQAPKIWI YPTKTGSTYT EDSNPTITIS GTLTLRNSNN EDPYDSLDLS

551 HSLEKVPLLY IVDVAAQKIN SSQLDLSTLN SGEHYGYQGI WSTYWVETTT

601 ITNPTSLLGA NTKHKLLYAN WSPLGYRPHP ERRGEFITNA LWQSAYTALA

651 GLHSLSSWDE EKGHAASLQG IGLLVHQKDK NGFKGFRSHM TGYSATTEAT

701 SSQSPNFSLG FAQFFSKAKE HESQNSTSSH HYFSGMCIEN TLFKEWIRLS

751 VSLAYMFTSE HTHTMYQGLL EGNSQGSFHN HTLAGALSCV FLPQPHGESL

801 QIYPFITALA IRGNLAAFQE SGDHAREFSL HRPLTDVSLP VGIRASWKNH

851 HRVPLVWLTE ISYRSTLYRQ DPELHSKLLI SQGTWTTQAT PVTYNALGIK

901 VKNTMQVFPK VTLSLDYSAD ISSSTLSHYL NVASRMRF*

Pmp16(CPn0467)

Pmp16蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 7和8。{GenBank登录号：gi|4376752|gb|AAD18609.1|‘CPn0467’；下述SEQ ID NO：32}。

SEQ ID No 32

  1 MFGMTPAVYS LQTDSLEKFA LERDEEFRTS FPLLDSLSTL TGFSPITTFV

 51 GNRHNSSQDI VLSNYKSIDN ILLLWTSAGG AVSCNNFLLS NVEDHAFFSK

101 NLAIGTGGAI ACQGACTITK NRGPLIFFSN RGLNNASTGG ETRGGAIACN

151 GDFTISQNQG TFYFVNNSVN NWGGALSTNG HCRIQSNRAP LLFFNNTAPS

201 GGGALRSENT TISDNTRPIY FKNNCGNNGG AIQTSVTVAI KNNSGSVIFN

251 NNTALSGSIN SGNGSGGAIY TTNLSIDDNP GTILFNNNYC IRDGGAICTQ

301 FLTIKNSGHV YFTNNQGNWG GALMLLQDST CLLFAEQGNI AFQNNEVFLT

351 TFGRYNAIHC TPNSNLQLGA NKGYTTAFFD PIEHQHPTTN PLIFNPNANH

401 QGTILFSSAY IPEASDYENN FISSSKNTSE LRNGVLSIED RAGWQFYKFT

451 QKGGILKLGH AASIATTANS ETPSTSVGSQ VIINNLAINL PSILAKGKAP

501 TLWIRPLQSS APFTEDNNPT ITLSGPLTLL NEENRDPYDS IDLSEPLQNI

551 HLLSLSDVTA RHINTDNFHP ESLNATEHYG YQGIWSPYWV ETITTTNNAS

601 IETANTLYRA LYANWTPLGY KVNPEYQGDL ATTPLWQSFH TMFSLLRSYN

651 RTGDSDIERP FLEIQGIADG LFVHQNSIPG APGFRIQSTG YSLQASSETS

701 LHQKISLGFA QFFTRTKEIG SSNNVSAHNT VSSLYVELPW FQEAFATSTV

751 LAYGYGDHHL HSLHPSHQEQ AEGTCYSHTL AAAIGCSFPW QQKSYLHLSP

801 FVQAIAIRSH QTAFEEIGDN PRKFVSQKPF YNLTLPLGIQ GKWQSKFHVP

851 TEWTLELSYQ PVLYQQNPQI GVTLLASGGS WDILGHNYVR NALGYKVHNQ

901 TALFRSLDLF LDYQGSVSSS TSTHHLQAGS TLKF*

Pmp18(CPn0471)

Pmp18蛋白的一个例子是以下列出的SEQ ID No 33{GenBank登录号：gi|4376753|gb|AAD18610.1|‘CPn0471’。

SEQ ID No 33

  1 MQNNRSLSKS SFFVGALILG KTTILLNATP LSDYFDNQAN QLTTLFPLID TLTNMTPYSH

 61 RATLFGVRDD TNQDIVLDHQ NSIESWFENF SQDGGALSCK SLAITNTKNQ ILFLNSFAIK

121 RAGAMYVNGN FDLSENHGSI IFSGNLSFPN ASNFADTCTG GAVLCSKNVT ISKNQGTAYF

181 INNKAKSSGG AIQAAIINIK DNTGPCLFFN NAAGGTAGGA LFANACRIEN NSQPIYFLNN

241 QSGLGGAIRV HQECILTKNT GSVIFNNNFA MEADISANHS SGGAIYCISC SIKDNPGIAA

301 FDNNTAARDG GAICTQSLTI QDSGPVYFTN NQGTWGGAIM LRQDGACTLF ADQGDIIFYN

361 NRHFKDTFSN HVSVNCTRNV SLTVGASQGH SATFYDPILQ RYTIQNSIQK FNPNPEHLGT

421 ILFSSTYIPD TSTSRDDFIS HFRNHIGLYN GTLALEDRAE WKVYKFDQFG GTLRLGSRAV

481 FSTTDEEQSS SSVGSVININ NLAINLPSIL GNRVAPKLWI RPTGSSAPYS EDNNPIINLS

541 GPLSLLDDEN LDPYDTADLA QPIAEVPLLY LLDVTAKHIN TDNFYPEGLN TTQHYGYQGV

601 WSPYWIETIT TSDTSSEDTV NTLHRQLYGD WTPTGYKVNP ENKGDIALSA FWQSFHNLFA

661 TLRYQTQQGQ IAPTASGEAT RLFVHQNSNN DAKGFHMEAT GYSLGTTSNT ASNHSFGVNF

721 SQLFSNLYES HSDNSVASHT TTVALQINNP WLQERFSTSA SLAYSYSNHH IKASGYSGKI

781 QTEGKCYSTT LGAALSCSLS LQWRSRPLHF TPFIQAIAVR SNQTAFQESG DKARKFSVHK

841 PLYNLTVPLG IQSAWESKFR LPTYWNIELA YQPVLYQQNP EINVSLESSG SSWLLSGTTL

901 ARNAIAFKGR NQIFIFPKLS VFLDYQGSVS SSTTTHYLHA GTTFKF

Pmp19(CPn0539)

Pmp19蛋白的一个例子是以下列出的SEQ ID No 34{GenBank登录号：gi|4376829|gb|AAD18679.1‘CPn0539’；下述SEQ ID NO：34}。

SEQ ID No 34

  1 MKQMRLWGFL FLSSFCQVSY LRANDVLLPL SGIHSGEDLE LFTLRSSSPT KTTYSLRKDF

 61 IVCDFAGNSI HKPGAAFLNL KGDLFFINST PLAALTFKNI HLGARGAGLF SESNVTFKGL

121 HSLVLENNES WGGVLTTSGD LSFINNTSVL CQNNISYGPG GALLLQGRKS KALFFRDNRG

181 TILFLKNKAV NQDESHPGYG GAVSSISPGS PITFADNQEI LFQENEGELG GAIYNDQGAI

241 TFENNFQTTS FFSNKASFGG AVYSRYCNLY SQWGDTLFTK NAAAKVGGAI HADYVHIRDC

301 KGSIVFEENS ATAGGAIAVN AVCDINAQGP VRFINNSALG LNGGAIYMQA TGSILRLHAN

361 QGDIEFCGNK VRSQFHSHIN STSNFTNNAI TIQGAPREFS LSANEGHRIC FYDPIISATE

421 NYNSLYINHQ RLLEAGGAVI FSGARLSPEH KKENKNKTSI INQPVRLCSG VLSIEGGAIL

481 AVRSFYQEGG LLALGPGSKL TTQGKNSEKD KIVITNLGFN LENLDSSDPA EIRATEKASI

541 EISGVPRVYG HTESFYENHE YASKPYTTSI ILSAKKLVTA PSRPEKDIQN LIIAESEYMG

601 YGYQGSWEFS WSPNDTKEKK TIIASWTPTG EFSLDPKRRG SFIPTTLWST FSGLNIASNI

661 VNNNYLNNSE VIPLQHLCVF GGPVYQIMEQ NPKQSSNNLL VQHAGHNVGA RIPFSFNTIL

721 SAALTQLFSS SSQQNVADKS HAQILIGTVS LNKSWQALSL RSSFSYTEDS QVMKHVFPYK

781 GTSRGSWRNY GWSGSVGMSY AYPKGIRYLK MTPFVDLQYT KLVQNPFVET GYDPRYFSSS

841 EMTNLSLPIG IALEMRFIGS RSSLFLQVST SYIKDLRRVN PQSSASLVLN HYTWDIQGVP

901 LGKEALNITL NSTIKYKIVT AYMGISSTQR EGSNLSANAH AGLSLSF

如实施例所证明，我们和其他人用流式细胞术(FACS)分析和Western印迹分析证明PMP19似乎不暴露在表面(Grimwood等(2001)，Infection and Immunity 69(4)，2383-2389)。然而，在pmp19(CPn0539)的基因微阵列分析中观察到高水平mRNA表达。

Pmp20(CPn0540)

Pmp20蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 119和120。{GenBank登录号：gi|4376830|gb|AAD18680.1‘CPn0540’；下述SEQ ID NO：35}。

SEQ ID No 35

  1  MKWLPATAVF AAVLPALTAF GDPASVEIST SHTGSGDPTS DAALTGFTQS

 51 STETDGTTYT IVGDITFSTF TNIPVPVVTP DANDSSSNSS KGGSSSSGAT

101 SLIRSSNLHS DFDFTKDSVL DLYHLFFPSA SNTLNPALLS SSSSGGSSSS

151 SSSSSSGSAS AVVAADPKGG AAFYSNEANG TLTFTTDSGN PGSLTLQNLK

201 MTGDGAAIYS KGPLVFTGLK NLTFTGNESQ KSGGAAYTEG ALTTQAIVEA

251 VTFTGNTSAG QGGAIYVKEA TLFNALDSLK FEKNTSGQAG GGIYTESTLT

301 ISNITKSIEF ISNKASVPAP APEPTSPAPS SLINSTTIDT STLQTRAASA

351 TPAVAPVAAV TPTPISTQET AGNGGAIYAK QGISISTFKD LTFKSNSASV

401 DATLTVDSST IGESGGAIFA ADSIQIQQCT GTTLFSGNTA NKSGGGIYAV

451 GQVTLEDIAN LKMTNNTCKG EGGAIYTKKA LTINNGAILT TFSGNTSTDN

501 GGAIFAVGGI TLSDLVEVRF SKNKTGNYSA PITKAASNTA PVVSSSTTAA

551 SPAVPAAAAA PVTNAAKGGA LYSTEGLTVS GITSILSFEN NECQNQGGGA

601 YVTKTFQCSD SHRLQFTSNK AADEGGGLYC GDDVTLTNLT GKTLFQENSS

651 EKHGGGLSLA SGKSLTMTSL ESFCLNANTA KENGGGANVP ENIVLTFTYT

701 PTPNEPAPVQ QPVYGEALVT GNTATKSGGG IYTKNAAFSN LSSVTFDQNT

 751 SSENGGALLT QKAADKTDCS FTYITNVNIT NNTATGNGGG IAGGKAHFDR

 801 IDNLTVQSNQ AKKGGGVYLE DALILEKVIT GSVSQNTATE SGGGIYAKDI

 851 QLQALPGSFT ITDNKVETSL TTSTNLYGGG IYSSGAVTLT NISGTFGITG

 901 NSVINTATSQ DADIQGGGIY ATTSLSINQC NTPILFSNNS AATKKTSTTK

 951 QIAGGAIFSA AVTIENNSQP IIFLNNSAKS EATTAATAGN KDSCGGAIAA

1001 NSVTLTNNPE ITFKGNYAET GGAIGCIDLT NGSPPRKVSI ADNGSVLFQD

1051 NSALNRGGAI YGETIDISRT GATFIGNSSK HDGSAICCST ALTLAPNSQL

1101 IFENNKVTET TATTKASINN LGAAIYGNNE TSDVTISLSA ENGSIFFKNN

1151 LCTATNKYCS IAGNVKFTAI EASAGKAISF YDAVNVSTKE TNAQELKLNE

1201 KATSTGTILF SGELHENKSY IPQKVTFAHG NLILGKNAEL SVVSFTQSPG

1251 TTITMGPGSV LSNHSKEAGG IAINNVIIDF SEIVPTKDNA TVAPPTLKLV

1301 SRTNADSKDK IDITGTVTLL DPNGNLYQNS YLGEDRDITL FNIDNSASGA

1351 VTATNVTLQG NLGAKKGYLG TWNLDPNSSG SKIILKWTFD KYLRWPYIPR

1401 DNHFYINSIW GAQNSLVTVK QGILGNMLNN ARFEDPAFNN FWASAIGSFL

1451 RKEVSRNSDS FTYHGRGYTA AVDAKPRQEF ILGAAFSQVF GHAESEYHLD

1501 NYKHKGSGHS TQASLYAGNI FYFPAIRSRP ILFQGVATYG YMQHDTTTYY

1551 PSIEEKNMAN WDSIAWLFDL RFSVDLKEPQ PHSTARLTFY TEAEYTRIRQ

1601 EKFTELDYDP RSFSACSYGN LAIPTGFSVD GALAWREIIL YNKVSAAYLP

1651 VILRNNPKAT YEVLSTKEKG NVVNVLPTRN AARAEVSSQI YLGSYWTLYG

1701 TYTIDASMNT LVQMANGGIR FVF*

Pmp21(CPn0963)

Pmp21蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO 83和84。{GenBank登录号：gi|4377287|gb|AAD19099.1|‘CPn0963’；下述SEQ ID NO：36}。

SEQ ID No 36

  1  MVAKKTVRSY RSSFSHSVIV AILSAGIAFE AHSLHSSELD LGVFNKQFEE

 51 HSAHVEEAQT SVLKGSDPVN PSQKESEKVL YTQVPLTQGS SGESLDLADA

101 NFLEHFQHLF EETTVFGIDQ KLVWSDLDTR NFSQPTQEPD TSNAVSEKIS

151 SDTKENRKDL ETEDPSKKSG LKEVSSDLPK SPETAVAAIS EDLEISENIS

201 ARDPLQGLAF FYKNTSSQSI SEKDSSFQGI IFSGSGANSG LGFENLKAPK

251 SGAAVYSDRD IVFENLVKGL SFISCESLED GSAAGVNIVV THCGDVTLTD

301 CATGLDLEAL RLVKDFSRGG AVFTARNHEV QNNLAGGILS VVGNKGAIVV

 351 EKNSAEKSNG GAFACGSFVY SNNENTALWK ENQALSGGAI SSASDIDIQG

 401 NCSAIEFSGN QSLIALGEHI GLTDFVGGGA LAAQGTLTLR NNAVVQCVKN

 451 TSKTHGGAIL AGTVDLNETI SEVAFKQNTA ALTGGALSAN DKVIIANNFG

 501 EILFEQNEVR NHGGAIYCGC RSNPKLEQKD SGENINIIGN SGAITFLKNK

 551 ASVLEVMTQA EDYAGGGALW GHNVLLDSNS GNIQFIGNIG GSTFWIGEYV

 601 GGGAILSTDR VTISNNSGDV VFKGNKGQCL AQKYVAPQET APVESDASST

 651 NKDEKSLNAC SHGDHYPPKT VEEEVPPSLL EEHPVVSSTD IRGGGAILAQ

 701 HIFITDNTGN LRFSGNLGGG EESSTVGDLA IVGGGALLST NEVNVCSNQN

 751 VVFSDNVTSN GCDSGGAILA KKVDISANHS VEFVSNGSGK FGGAVCALNE

 801 SVNITDNGSA VSFSKNRTRL GGAGVAAPQG SVTICGNQGN IAFKENFVFG

 851 SENQRSGGGA IIANSSVNIQ DNAGDILFVS NSTGSYGGAI FVGSLVASEG

 901 SNPRTLTITG NSGDILFAKN STQTAASLSE KDSFGGGAIY TQNLKIVKNA

 951 GNVSFYGNRA PSGAGVQIAD GGTVCLEAFG GDILFEGNIN FDGSFNAIHL

1001 CGNDSKIVEL SAVQDKNIIF QDAITYEENT IRGLPDKDVS PLSAPSLIFN

1051 SKPQDDSAQH HEGTIRFSRG VSKIPQIAAI QEGTLALSQN AELWLAGLKQ

1101 ETGSSIVLSA GSILRIFDSQ VDSSAPLPTE NKEETLVSAG VQINMSSPTP

1151 NKDKAVDTPV LADIISITVD LSSFVPEQDG TLPLPPEIII PKGTKLHSNA

1201 IDLKIIDPTN VGYENHALLS SHKDIPLISL KTAEGMTGTP TADASLSNIK

1251 IDVSLPSITP ATYGHTGVWS ESKMEDGRLV VGWQPTGYKL NPEKQGALVL

1301 NNLWSHYTDL RALKQEIFAH HTIAQRMELD FSTNVWGSGL GVVEDCQNIG

1351 EFDGFKHHLT GYALGLDTQL VEDFLIGGCF SQFFGKTESQ SYKAKNDVKS

1401 YMGAAYAGIL AGPWLIKGAF VYGNINNDLT TDYGTLGIST GSWIGKGFIA

1451 GTSIDYRYIV NPRRFISAIV STVVPFVEAE YVRIDLPEIS EQGKEVRTFQ

1501 KTRFENVAIP FGFALEHAYS RGSRAEVNSV QLAYVFDVYR KGPVSLITLK

1551 DAAYSWKSYG VDIPCKAWKA RLSNNTEWNS YLSTYLAFNY EWREDLIAYD

1601 FNGGIRIIF*

用于本发明的PMP蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与上述pmp蛋白所列多肽序列之一有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是上述多肽序列之一的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些PMP蛋白包括上述多肽序列的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自上述多肽序列之一的表位。其它优选片段缺少上述多肽序列之一的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

第五抗原组

可通过与来自第一抗原组或第二抗原组或第三抗原组或第四抗原组的两种或多种肺炎衣原体抗原组合提高其它肺炎衣原体抗原的免疫原性。所述其它肺炎衣原体抗原包括由一种或多种细胞暴露在表面的蛋白组成的第五抗原组。本文中将这些抗原称为“第五抗原组”。以下详细描述第五抗原组的各个肺炎衣原体抗原。

(37)PorB外膜蛋白B(CPn0854)

PorB蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO：67和68。{GenBank登录号：gi|4377170|gb|AAD18992.1|‘CPn0854’；下述SEQ IDNO：37}。本发明所用PorB蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：37有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：37的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些PorB蛋白包括SEQ ID NO：37的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：37的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：37的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 37

  1  MNSKMLKHLR LATLSFSMFF GIVSSPAVYA LGAGNPAAPV LPGVNPEQTG

 51 WCAFQLCNSY DLFAALAGSL KFGFYGDYVF SESAHITNVP VITSVTTSGT

101 GTTPTITSTT KNVDFDLNNS SISSSCVFAT IALQETSPAA IPLLDIAFTA

151 RVGGLKQYYR LPLNAYRDFT SNPLNAESEV TDGLIEVQSD YGIVWGLSLQ

201  KVLWKDGVSF VGVSADYRHG SSPINYIIVY NKANPEIYFD ATDGNLSYKE

251  WSASIGISTY LNDYVLPYAS VSIGNTSRKA PSDSFTELEK QFTNFKFKIR

301  KITNFDRVNF CFGTTCCISN NFYYSVEGRW GYQRAINITS GLQF*

(38)76kDa蛋白同源物(Cp0728)

76kDa蛋白同源物蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO：13和14。{GenBank登录号：gi|4377033|gb|AAD18867.1|‘CPn0728’；下述SEQ ID NO：38}。76kDa蛋白同源物优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：38有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：21的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些76kDa蛋白同源物包括SEQ ID NO：38的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：38的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：38的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 38

  1 MVNPIGPGPI DETERTPPAD LSAQGLEASA ANKSAEAQRI AGAEAKPKES

 51 KTDSVERWSI LRSAVNALMS LADKLGIASS NSSSSTSRSA DVDSTTATAP

101 TPPPPTFDDY KTQAQTAYDT IFTSTSLADI QAALVSLQDA VTNIKDTAAT

151 DEETAIAAEW ETKNADAVKV GAQITELAKY ASDNQAILDS LGKLTSFDLL

201 QAALLQSVAN NNKAAELLKE MQDNPVVPGK TPAIAQSLVD QTDATATQIE

251 KDGNAIRDAY FAGQNASGAV ENAKSNNSIS NIDSAKAAIA TAKTQIAEAQ

301 KKFPDSPILQ EAEQMVIQAE KDLKNIKPAD GSDVPNPGTT VGGSKQQGSS

351 IGSIRVSMLL DDAENETASI LMSGFRQMIH MFNTENPDSQ AAQQELAAQA

401 RAAKAAGDDS AAAALADAQK ALEAALGKAG QQQGILNALG QIASAAVVSA

451 GVPPAAASSI GSSVKQLYKT SKSTGSDYKT QISAGYDAYK SINDAYGRAR

501 NDATRDVINN VSTPALTRSV PRARTEARGP EKTDQALARV ISGNSRTLGD

551 VYSQVSALQS VMQIIQSNPQ ANNEEIRQKL TSAVTKPPQF GYPYVQLSND

601 STQKFIAKLE SLFAEGSRTA AEIKALSFET NSLFIQQVLV NIGSLYSGYL

651  Q*

(39)OmpA保守外膜蛋白(Cp0695)

OmpA保守外膜蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO：59和60。{GenBank登录号：gi|4376998|gb|AAD18834.1|‘CPn0695’；下述SEQ ID NO：39}。ompA蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：39有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：39的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：39的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：39的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：39的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 39

  1  MKKLLKSALL SAAFAGSVGS LQALPVGNPS DPSLLIDGTI WEGAAGDPCD

 51 PCATWCDAIS LRAGFYGDYV FDRILKVDAP KTFSMGAKPT GSAAANYTTA

101 VDRPNPAYNK HLHDAEWFTN AGFIALNIWD RFDVFCTLGA SNGYIRGNST

151 AFNLVGLFGV KGTTVNANEL PNVSLSNGVV ELYTDTSFSW SVGARGALWE

201 CGCATLGAEF QYAQSKPKVE ELNVICNVSQ FSVNKPKGYK GVAFPLPTDA

251 GVATATGTKS ATINYHEWQV GASLSYRLNS LVPYIGVQWS RATFDADNIR

301 IAQPKLPTAV LNLTAWNPSL LGNATALSTT DSFSDFMQIV SCQINKFKSR

351 KACGVTVGAT LVDADKWSLT AEARLINERA AHVSGQFRF*

(40)PepA(CPn0385)

PepA蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO：99和100。{GenBank登录号：gi|4376664|gb|AAD18529.1‘CPn0385’；下述SEQ ID NO：40}。PepA蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：40有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：40的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些PepA蛋白包括SEQ ID NO：40的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)；(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：40的表位。其它优选片段缺少SEQ IDNO：40的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 40

  1 MVLFHAQASG RNRVKADAIV LPFWHFKDAK NAASFEAEFE PSYLPALENF

 51 QGKTGEIELL YSSPKAKEKR IVLLGLGKNE ELTSDVVFQT YATLTRVLRK

101 AKCSTVNIIL PTISELRLSA EEFLVGLSSG ILSLNYDYPR YNKVDRNLET

151 PLSKVTVIGI VPKMADAIFR KEAAIFEGVY LTRDLVNRNA DEITPKKLAE

201 VALNLGKEFP SIDTKVLGKD AIAKEKMGLL LAVSKGSCVD PHFIVVRYQG

251 RPKSKDHTVL IGKGVTFDSG GLDLKPGKSM LTMKEDMAGG ATVLGILSAL

301 AVLELPINVT GIIPATENAI DGASYKMGDV YVGMSGLSVE ICSTDAEGRL

351 ILADAITYAL KYCKPTRIID FATLTGAMVV SLGEEVAGFF SNNDVLAEDL

401 LEASAETSEP LWRLPLVKKY DKTLHSDIAD MKNLGSNRAG AITAALFLQR

451 FLEESSVAWA HLDIAGTAYH EKEEDRYPKY ASGFGVRSIL YYLENSLSK*

(41)保守外膜蛋白(Cpn0278)

保守外膜蛋白的一个例子是以下列出的SEQ ID NO：41。GenBank登录号GI：4376552；AAD18427.1。保守外膜蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：41有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：41的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些保守外膜蛋白包括SEQ ID NO：41的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：41的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：41的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 41

  1 MKKKLSLLVG LIFVLSSCHK EDAQNKIRIV ASPTPHAELL ESLQEEAKDL GIKLKILPVD

 61 DYRIPNRLLL DKQVDANYFQ HQAFLDDECE RYDCKGELVV IAKVHLEPQA IYSKKHSSLE

121 RLKSQKKLTI AIPVDRTNAQ RALHLLEECG LIVCKGPANL NMTAKDVCGK ENRSINILEV

181 SAPLLVGSLP DVDAAVIPGN FAIAANLSPK KDSLCLEDLS VSKYTNLVVI RSEDVGSPKM

241 IKLQKLFQSP SVQHFFDTKY HGNILTMTQD NG

第六抗原组

可通过与来自第一抗原组、或第二抗原组、或第三抗原组、或第四抗原组、或第五抗原组的两种或多种肺炎衣原体抗原组合来提高其它肺炎衣原体抗原的免疫原性。所述其它肺炎衣原体抗原包括由一种或多种FACS阳性CPn抗原组成的第六抗原组。本文中将这些抗原称为“第六抗原组”。以下详细描述第六抗原组的各个肺炎衣原体抗原。

（42)预测的Omp(CPn0020)

预测的Omp蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO：91和92。{GenBank登录号 gi|4376272|gb|AAD18173.1：‘CPn0020’；下述SEQ ID NO：42}。Omp蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：42有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：42的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些Omp蛋白包括SEQ ID NO：42的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：42的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：42的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 42

  1  MKRCFLFLAS FVLMGSSADA LTHQEAVKKK NSYLSHFKSV SGIVTIEDGV

 51 LNIHNNLRIQ ANKVYVENTV GQSLKLVAHG NVMVNYRAKT LVCDYLEYYE

101 DTDSCLLTNG RFAMYPWFLG GSMITLTPET IVIRKGYIST SEGPKKDLCL

151 SGDYLEYSSD SLLSIGKTTL RVCRIPILFL PPFSIMPMEI PKPPINFRGG

201 TGGFLGSYLG MSYSPISRKH FSSTFFLDSF FKHGVGMGFN LHCSQKQVPE

251 NVFNMKSYYA HRLAIDMAEA HDRYRLHGDF CFTHKHVNFS GEYHLSDSWE

301 TVADIFPNNF MLKNTGPTRV DCTWNDNYFE GYLTSSVKVN SFQNANQELP

351 YLTLRQYPIS IYNTGVYLEN IVECGYLNFA FSDHIVGENF SSLRLAARPK

401 LHKTVPLPIG TLSSTLGSSL IYYSDVPEIS SRHSQLSAKL QLDYRFLLHK

451 SYIQRRHIIE PFVTFITETR PLAKNEDHYI FSIQDAFHSL NLLKAGIDTS

501 VLSKTNPRFP RIHAKLWTTH ILSNTESKPT FPKTACELSL PFGKKNTVSL

551 DAEWIWKKHC WDHMNIRWEW IGNDNVAMTL ESLHRSKYSL IKCDRENFIL

601 DVSRPIDQLL DSPLSDHRNL ILGKLFVRPH PCWNYRLSLR YGWHRQDTPN

651 YLEYQMILGT KIFEHWQLYG VYERREADSR FFFFLKLDKP KKPPF*

(43)预测的Omp(CPn0021)

预测的Omp蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO：49和50。{GenBank登录号gi|4376273|gb|AAD18174.1：‘CPn0021’；下述SEQ ID NO：43}。Omp蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：43有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：43的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：43的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：43的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：43的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 43

  1  MGLFHLTLFG LLLCSLPISL VAKFPESVGH KILYISTQST QQALATYLEA

 51 LDAYGDHDFF VLRKIGEDYL KQSIHSSDPQ TRKSTIIGAG LAGSSEALDV

101 LSQAMETADP LQQLLVLSAV SGHLGKTSDD LLFKALASPY PVIRLEAAYR

151 LANLKNTKVI DHLHSFIHKL PEEIQCLSAA IFLRLETEES DAYIRDLLAA

201 KKSAIRSATA LQIGEYQQKR FLPTLRNLLT SASPQDQEAI LYALGKLKDG

251  QSYYNIKKQL QKPDVDVTLA AAQALIALGK EEDALPVIKK QALEERPRAL

301  YALRHLPSEI GIPIALPIFL KTKNSEAKLN VALALLELGC DTPKLLEYIT

351  ERLVQPHYNE TLALSFSKGR TLQNWKRVNI IVPQDPQERE RLLSTTRGLE

401  EQILTFLFRL PKEAYLPCIY KLLASQKTQL ATTAISFLSH TSHQEALDLL

451  FQAAKLPGEP IIRAYADLAI YNLTKDPEKK RSLHDYAKKL IQETLLFVDT

501  ENQRPHPSMP YLRYQVTPES RTKLMLDILE TLATSKSSED IRLLIQLMTE

551  GDAKNFPVLA GLLIKIVE*

(44)寡肽结合蛋白Oppa-1脂蛋白(CPn0195)

寡肽结合蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO：23和24。{GenBank登录号gi|4376466|gb|AAD18348.1：‘CPn0195’；下述SEQ ID NO：44}。寡肽结合蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：44有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：44的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：44的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：44的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：44的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 44

  1  MRKISVGICI TILLSLSVVL QGCKESSHSS TSRGELAINI RDEPRSLDPR

 51 QVRLLSEISL VKHIYEGLVQ ENNLSGNIEP ALAEDYSLSS DGLTYTFKLK

101 SAFWSNGDPL TAEDFIESWK QVATQEVSGI YAFALNPIKN VRKIQEGHLS

151 IDHFGVHSPN ESTLVVTLES PTSHFLKLLA LPVFFPVHKS QRTLQSKSLP

201 IASGAFYPKN IKQKQWIKLS KNPHYYNQSQ VETKTITIHF IPDANTAAKL

251 FNQGKLNWQG PPWGERIPQE TLSNLQSKGH LHSFDVAGTS WLTFNINKFP

301 LNNMKLREAL ASALDKEALV STIFLGRAKT ADHLLPTNIH SYPEHQKQEM

351 AQRQAYAKKL FKEALEELQI TAKDLEHLNL IFPVSSSASS LLVQLIREQW

401 KESLGFAIPI VGKEFALLQA DLSSGNFSLA TGGWFADFAD PMAFLTIFAY

451 PSGVPPYAIN HKDFLEILQN IEQEQDHQKR SELVSQASLY LETFHIIEPI

501 YHDAFQFAMN KKLSNLGVSP TGVVDFRYAK EN*

(45)CHLPS43kDa蛋白同源物-1(CPn0562)

CHLPS蛋白的一个例子是以下列出的SEQ ID NO：45。GenBank登录号GI：4376854；AAD18702.1。CHLPS蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：45有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：45的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些CHLPS蛋白包括SEQ ID NO：45的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：45的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：45的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1 5、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 45

  1 MSIAIAREQY AAILDMHPKP SIAMFSSEQA RTSWEKRQAH PYLYRLLEII WGVVKFLLGL

 61 IFFIPLGLFW VLQKICQNFI LLGAGGWIFR PICRDSNLLR QAYAARLFSA SFQDHVSSVR

121 RVCLQYDEVF IDGLELRLPN AKPDRWMLIS NGNSDCLEYR TVLQGEKDWI FRIAEESQSN

181 ILIFNYPGVM KSQGNITRNN VVKSYQACVR YLRDEPAGPQ ARQIVAYGYS LGASVQAEAL

241 SKEIADGSDS VRWFVVKDRG ARSTGAVAKQ FIGSLGVWLA NLTHWNINSE KRSKDLHCPE

301 LFIYGKDSQG NLIGDGLFKK ETCFAAPFLD PKNLEECSGK KIPVAQTGLR HDHILSDDVI

361 KEVAGHIQRH FDN

(46)YscJ(Yop易位J蛋白)(CPn0828)

YscJ蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO：109和110。{GenBank登录号gi|4377140|gb|AAD18965.1|‘CPn0828’；下述SEQ ID NO：46}。YscJ蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：46有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：46的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些YscJ蛋白包括SEQ ID NO：46的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：46的表位。其它优选片段缺少SEQ IDNO：46的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 46

  1  MVRRSISFCL FFLMTLLCCT SCNSRSLIVH GLPGREANEI VVLLVSKGVA

 51  AQKLPQAAAA TAGAATEQMW DIAVPSAQIT EALAILNQAG LPRMKGTSLL

101 DLFAKQGLVP SELQEKIRYQ EGLSEQMAST IRKMDGVVDA SVQISFTTEN

151 EDNLPLTASV YIKHRGVLDN PNSIMVSKIK RLIASAVPGL VPENVSVVSD

201 RAAYSDITIN GPWGLTEEID VVSVWGIILA KSSLTKFRLI FYVLILILFV

251 ISCGLLWVIW KTHTLIMTMG GTKGFFNPTP YTKNALEAKK AEGAAADKEK

301 KEDADSQGES KNAETSDKDS SDKDAPEGSN EIEGA*

(47)假拟(CPn0415)

假拟蛋白的一个例子是WO 02/02606所列的SEQ ID NO：101和102。{GenBank登录号gi|4376696|gb|AAD18559.1|‘CPn0415’；下述SEQ ID NO：47}。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：47有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：47的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：47的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：47的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：47的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 47

  1  MTLIFVIIIV WCNAFLIKLC VIMGLQSRLQ HCIEVSQNSN FDSQVKQFIY

 51 ACQDKTLRQS VLKIFRYHPL LKIHDIARAV YLLMALEEGE DLGLSFLNVQ

101 QYPSGAVELF SCGGFPWKGL PYPAEHAEFG LLLLQIAEFY EESQAYVSKM

151 SHFQQALFDH QGSVFPSLWS QENSRLLKEK TTLSQSFLFQ LGMQIHPEYS

201 LEDPALGFWM QRTRSSSAFV AASGCQSSLG AYSSGDVGVI AYGPCSGDIS

251 DCYYFGCCGI AKEFVCQKSH QTTEISFLTS TGKPHPRNTG FSYLRDSYVH

301 LPIRCKITIS DKQYRVHAAL AEATSAMTFS IFCKGKNCQV VDGPRLRSCS

351 LDSYKGPGND IMILGENDAI NIVSASPYME IFALQGKEKF WNADFLINIP

401 YKEEGVMLIF EKKVTSEKGR FFTKMN*

(48)假拟(CPn0514)

假拟蛋白的一个例子是WO 02/02606所列的SEQ ID NO：87和88。{GenBank登录号gi|4376802|gb|AAD18654.1|‘CPn0514’；下述SEQ ID NO：48}。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：48有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：48的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：48的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：48的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：48的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 48

  1  MSNQLQPCIS LGCVSYINSF PLSLQLIKRN DIRCVLAPPA DLLNLLIEGK

 51 LDVALTSSLG AISHNLGYVP GFGIAANQRI LSVNLYAAPT FFNSPQPRIA

101 ATLESRSSIG LLKVLCRHLW RIPTPHILRF ITTKVLRQTP ENYDGLLLIG

151 DAALQHPVLP GFVTYDLASG WYDLTKLPFV FALLLHSTSW KEHPLPNLAM

201 EEALQQFESS PEEVLKEAHQ HTGLPPSLLQ EYYALCQYRL GEEHYESFEK

251 FREYYGTLYQ QARL*

(49)假拟(CPn0668)

假拟蛋白的一个例子是WO 02/02606所列的SEQ ID NO：57和58。{GenBank登录号gi|4376968|gb|AAD18807.1‘CPn0668’；下述SEQ ID NO：49}。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：49有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：49的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：49的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：49的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：49的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 49

  1  MKFLLYVPLL LVLVSTGCDA KPVSFEPFSG KLSTQRFEPQ HSAEEYFSQG

 51 QEFLKKGNFR KALLCFGIIT HHFPRDILRN QAQYLIGVCY FTQDHPDLAD

101 KAFASYLQLP DAEYSEELFQ MKYAIAQRFA QGKRKRICRL EGFPKLMNAD

151 EDALRIYDEI LTAFPSKDLG AQALYSKAAL LIVKNDLTEA TKTLKKLTLQ

201 FPLHILSSEA FVRLSEIYLQ QAKKEPHNLQ YLHFAKLNEE AMKKQHPNHP

251 LNEVVSANVG AMREHYARGL YATGRFYEKK KKAEAANIYY RTAITNYPDT

301 LLVAKCQKRL DRISKHTS*

(50)假拟(CPn0791)

假拟蛋白的一个例子是WO 02/02606所列的SEQ ID NO：123和124。{GenBank登录号gi|4377101|gb|AAD18929.1|‘CPn0791’；下述SEQ ID NO：50}。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：50有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：50的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：50的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：50的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：50的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 50

  1 MYSCYSKGIS HNYLLHPMSR LDIFVFDSLI ANQDQNLLEE IFCSEDTVLF

 51 KAYRTTALQS PLAAKNLNIA RKVANYILAD NGEIDTVKLV EAIHHLSQCT

101 YPLGPHRHNE AQDREHLLKM LKALKENPKL KESIKTLFVP SYSTIQNLIR

151 HTLALNPQTI LSTIHVRQAA LTALFTYLRQ DVGSCFATAP AILIHQEYPE

201 RFLKDLNDLI SSGKLSRIVN QREIAVPINL SGCIGELFKP LRILDLYPDP

251 LVKLSSSPGL KKAFSAANLI ETLGDSEAQI QQLLSHQYLM QKLQNVHETL

301 TANDIIKSTL LHYYQLQEST VRAIFFKEGL FSKEQVAFST QHPRELSEIQ

351 RVYHYLHAYE EAKSAFIHDT QNPLLKAWEY TLATLADASQ PTISNHIRLA

401 LGWKSEDPHS LVSLVTHFVE EEVENIRILV QQCEQTYHEA RSQLEYIEGR

451 MRNPLNNQDS QILTMDHMRF RQELNKALYE WDSAQEKAKK FLHLPEFLLS

501 FYTKQIPLYF RSSYDAFIQE FAHLYANAPA GFRILFTHGR THPNTWSPIY

551 SINEFIRFLS EFFTSTESEL LGKHAVINLE KETSRLVHNI TAMLHTDVFQ

601 EALLTRILEA YQLPVPPSIL NHLDQLSQTP WVYVSGGTVD TLLLDYFESS

651 EPLTLTEKHP ENPHELAAFY ADALKDLPTG IKSYLEEGSH SLLSSSPTHV

701 FSIIAGSPLF REAWDNDWYS YTWLRDVWVK QHQDFLQDTI LPQLSIYAFI

751 ENFCNKYALQ HVVHDFHDFC SDHSLTLPEL YDKGSRFLSS LFTKDKTVAL

801 IYIRRLLYLM VREVPYVSEQ QLPEVLDNVS SYLGISSRIT YEKFRSLIEE

851 TIPKMTLLSS ADLRHIYKGL LMQSYQKIYT EEDTYLRLTT AMRHHNLAYP

901 APLLFADSNW PSIYFGFILN PGTTEIDLWK FNYAGLQGQP LDNIQELFAT

951 SRPWTLYANP IDYGMPPPPG YRSRLPKEFF *

(51)假拟(CPn0792)

假拟蛋白的一个例子是WO 02/02606所列的SEQ ID NO：61和62。{GenBank登录号gi|4377102|gb|AAD18930.1|‘CPn0792’；下述SEQ ID NO：51}。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：51有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：51的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：51的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：51的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：51的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 51

  1  MKHTFTKRVL FFFFLVIPIP LLLNLMVVGF FSFSAAKANL VQVLHTRATN

 51 LSIEFEKKLT IHKLFLDRLA NTLALKSYAS PSAEPYAQAY NEMMALSNTD

101 FSLCLIDPFD GSVRTKNPGD PFIRYLKQHP EMKKKLSAAV GKAFLLTIPG

151 KPLLHYLILV EDVASWDSTT TSGLLVSFYP MSFLQKDLFQ SLHITKGNIC

201 LVNKYGEVLF CAQDSESSFV FSLDLPNLPQ FQARSPSAIE IEKASGILGG

251 ENLITVSINK KRYLGLVLNK IPIQGTYTLS LVPVSDLIQS ALKVPLNICF

301 FYVLAFLLMW WIF皮肤TKL NKPLQELTFC MEAAWRGNHN VRFEPQPYGY

351 EFNELGNIFN CTLLLLLNSI EKADIDYHSG EKLQKELGIL SSLQSALLSP

401 DFPTFPKVTF SSQHLRRRQL SGHFNGWTVQ DGGDTLLGII GLAGDIGLPS

451 YLYALSARSL FLAYASSDVS LQKISKDTAD SFSKTTEGNE AVVAMTFIKY

501 VEKDRSLELL SLSEGAPTMF LQRGESFVRL PLETHQALQP GDRLICLTGG

551 EDILKYFSQL PIEELLKDPL NPLNTENLID SLTMMLNNET EHSADGTLTI

601 LSFS*

(52)假似(CPn0820)

假拟蛋白的一个例子是WO 02/02606所列的SEQ ID NO：113和114。{GenBank登录号gi|4377132|gb|AAD18958.1|‘CPn0820’；下述SEQ ID NO：52}。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：52有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：52的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：52的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：52的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：52的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 52

  1  MCNSIAMKKQ KRGFVLMELL MSFTLIALLL GTLGFWYRKI YTVQKQKERI

 51 YNFYIEESRA YKQLRTLFSM SLSSSYEEPG SLFSLIFDRG VYRDPKLAGA

101 VRASLHHDTK DQRLELRICN IKDQSYFETQ RLLSHVTHVV LSFQRNPDPE

151 KLPETIALTI TREPKAYPPR TLTYQFAVGK *

(53)假拟(CPn0126)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：53。GenBank登录号GI：4376390；AAD18279.1。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：53有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：53的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：53的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：53的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：53的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 53

  1 MVFSYYCMGL FFFSGAISSC GLLVSLGVGL GLSVLGVLLL LLAGLLLFKI QSMLREVPKA

 61 PDLLDLEDAS ERLRVKASRS LASLPKEISQ LESYIRSAAN DLNTIKTWPH KDQRLVETVS

121 RKLERLAAAQ NYMISELCEI SEILEEEEHH LILAQESLEW IGKSLFSTFL DMESFLNLSH

181 LSEVRPYLAV NDPRLLEITE ESWEVVSHFI NVTSAFKKAQ ILFKNNEHSR MKKKLESVQE

241 LLETFIYKSL KRSYRELGCL SEKMRIIHDN PLFPWVQDQQ KYAHAKNEFG EIARCLEEFE

301 KTFFWLDEEC AISYMDCWDF LNESIQNKKS RVDRDYISTK KIALKDRART YAKVLLEENP

361 TTEGKIDLQD AQRAFERQSQ EFYTLEHTET KVRLEALQQC FSDLREATNV RQVRFTNSEN

421 ANDLKESFEK IDKERVRYQK EQRLYWETID RNEQELREEI GESLRLQNRR KGYRAGYDAG

481 RLKGLLRQWK KNLRDVEAHL EDATMDFEHE VSKSELCSVR ARLEVLEEEL MDMSPKVADI

541 EELLSYEERC ILPIRENLER AYLQYNKCSE ILSKAKFFFP EDEQLLVSEA NLREVGAQLK

601 QVQGKCQERA QKFAIFEKHI QEQKSLIKEQ VRSFDLAGVG FLKSELLSIA CNLYIKAVVK

661 ESIPVDVPCM QLYYSYYEDN EAVVRNRLLN MTERYQNFKR SLNSIQFNGD VLLRDPVYQP

721 EGHETRLKER ELQETTLSCK KLKVAQDRLS ELESRLSRR

(54)假拟(CPn0794)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：54。GenBank登录号GI：4377105；AAD18932.1。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：54有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：54的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：54的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：54的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：54的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 54

  1 MSLYQKWWNS QLKKSLCYST VAALIFMIPS QESFADSLID LNLGLDPSVE CLSGDGAFSV

 61 GYFTKAGSTP VEYQPFKYDV SKKTFTILSV ETANQSGYAY GISYDGTITV GTCSLGAGKY

121 NGAKWSADGT LTPLTGITGG TSHTEARAIS KDTQVIEGFS YDASGQPKAV QWASGATTVT

181 QLADISGGSR SSYAYAISDD GTIIVGSMES TITRKTTAVK WVNNVPTYLG TLGGDASTGL

241 YISGDGTVIV GAANTATVTN GNQESHAYMY KDNQMKD

(55)假拟(CPn0796)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：55。GenBank登录号GI：4377107；AAD18934.1。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：55有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：55的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：55的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：55的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：55的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。Cpn0796可由肺炎衣原体分泌，并位于幼稚(young)包含体的衣原体膜中，而Cpn0796的N-末端部分后来分泌到宿主细胞胞质中。有人提出，Cpn0796是自动转运蛋白，它是分泌到提出的衣原体自动转运蛋白的宿主细胞胞质中的第一个例子。在宿主细胞胞质中发现Cpn0796表明，在包涵体膜上易位存在着未知转运机制(Vandahl，“肺炎衣原体的蛋白质组分析-在衣原体-宿主细胞界面上的蛋白”(Proteome analysis of Chlamydia pneumoniae-Proteins at the Chlamydia-host cellInterface，”Abstract of PhD Dissertation，Dan Med Bull 2004：51：306)。

SEQ ID No 55

  1 MQPCLNMSIV RNSALPLPCL SRSETFKKVR SHMKFMKVLT PWIYRKDLWV TAFLLTAIPG

 61 SFAHTLVDIA GEPRHAAQAT GVSGDGKIVI GMKVPDDPFA ITVGFQYIDG HLQPLEAVRP

121 QCSVYPNGIT PDGTVIVGTN YAIGMGSVAV KWVNGKVSEL PMLPDTLDSV ASAVSADGRV

181 IGGNRNINLG ASVAVKWEDD VITQLPSLPD AMNACVNGIS SDGSIIVGTM VDVSWRNTAV

241 QWIGDQLSVI GTLGGTTSVA SAISTDGTVI VGGSENADSQ THAYAYKNGV MSDIGTLGGF

301 YSLAHAVSSD GSVIVGVSTN SEHRYHAFQY ADGQMVDLGT LGGPESYAQG VSGDGKVIVG

361 RAQVPSGDWH AFLCPFQAPS PAPVHGGSTV VTSQNPRGMV DINATYSSLK NSQQQLQRLL

421 IQHSAKVESV SSGAPSFTSV KGAISKQSPA VQNDVQKGTF LSYRSQVHGN VQNQQLLTGA

481 FMDWKLASAP KCGFKVALHY GSQDALVERA ALPYTEQGLG SSVLSGFGGQ VQGRYDFNLG

541 ETVVLQPFMG IQVLHLSREG YSEKNVRFPV SYDSVAYSAA TSFMGAHVFA SLSPKMSTAA

601 TLGVERDLNS HIDEFKGSVS AMGNFVLENS TVSVLRPFAS LAMYYDVRQQ QLVTLSVVMN

661 QQPLTGTLSL VSQSSYNLSF

用于本发明的一种优选蛋白质包含Cpn0796的N-末端肽，它可经分泌暴露于细菌细胞表面的，也可通过蛋白水解事件而脱附。在一个实施方式中，Cpn0796的N-末端肽可形成β-螺旋桨构象。Cpn0796的N-末端肽的一个例子是以下列出的SEQ IDNO：86。用于本发明的Cpn0796的N-末端肽可包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ IDNO：86有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：86的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：86的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID N0：86的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：86的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。

SEQ ID NO：86

HTLVDIAGEPRHAAQATGVSGDGKIVIGMKVPDDPFAITVGFQYIDGHLQPLE

AVRPQCSVYPNGITPDGTVIVGTNYAIGMGSVAVKWVNGKVSELPMLPDTLD

SVASAVSADGRVIGGNRNINLGASVAVKWEDDVITQLPSLPDAMNACVNGISS

DGSIIVGTMVDVSWRNTAVQWIGDQLSVIGTLGGTTSVASAISTDGTVIVGGS

ENADSQTHAYAYKNGVMSDIGTLGGFYSLAHAVSSDGSVIVGVSTNSEHRYH

AFQYADGQMVDLGTLGGPESYAQGVSGDGKVIVGRAQVPSGDWHAFLC

(56)假拟(CPn0797)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：56。GenBank登录号GI：4377108；AAD18935.1。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：56有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：56的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：56的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：56的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：56的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 56

  1 MSKKIKVLGH LTLCTLFRGV LCAAALSNIG YASTSQESPY QKSIEDWKGY TFTDLELLSK

 61 EGWSEAHAVS GNGSRIVGAS GAGQGSVTAV IWESHLIKHL GTLGGEASSA EGISKDGEVV

121 VGWSDTREGY THAFVFDGRD MKDLGTLGAT YSVARGVSGD GSIIVGVSAT ARGEDYGWQV

181 GVKWEKGKIK QLKLLPQGLW SEANAISEDG TVIVGRGEIS RNHIVAVKWN KNAVYSLGTL

241 GGSVASAEAI SANGKVIVGW STTNNGETHA FMHKDETMHD LGTLGGGFSV ATGVSADGRA

301 IVGFSAVKTG EIHAFYYAEG EMEDLTTLGG EEARVFDISS EGNDIIGSIK TDAGAERAYL

361 FHIHK

(76)寡肽结合蛋白Oppa-2脂蛋白(Cpn0196)

寡肽结合蛋白的一个例子是WO 02/02606列出的SEQ ID NO：127和128。{GenBank登录号GI：4376467；AAD18349.1‘CPn0196’；下述SEQ ID NO：76}。寡肽结合蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：76有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ IDNO：76的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或more)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO 76的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：76的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：76的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 76

  1 mlrffavfis tlwlitsgcs psqsskgifv vnmkemprsl dpgktrliad qtlmrhlyeg

 61 lveehsqnge ikpalaesyt isedgtrytf kiknilwsng dpltaqdfvs swkeilkeda

121 ssVYlyaf1p iknaraifdd tespenlgvr a1dkrhleiq letpcahflh fltlpiffpv

181 hetlrnysts feempitcga frpvslekgl rlhleknpmy hnksrvklhk iivqfisnan

241 taailfkhkk ldwqgppwge pippeisasl hqddqlfslp gasttwllfn iqkkpwnnak

301 lrkalslaid kdmltkvvyq g1aeptdhil hprlypgtyp erkrqneril eaqqlfeeal

361 delqmtredl eketltfstf sfsygricqm lreqwkkvlk ftipivgqef ftiqknfleg

421 nysltvnqwt aafidpmsyl mifanpggis pyhlqdshfq tllikitqeh kkhlrnqlii

481 ealdylehch ileplchpnl rialnknikn fnlfvrrtsd frfiekl

第七抗原组

可通过与来自第一抗原组、或第二抗原组、或第三抗原组、或第四抗原组、或第五抗原组、或第六抗原组的两种或多种肺炎衣原体抗原组合，来提高其它肺炎衣原体抗原的免疫原性。所述其它肺炎衣原体抗原包括由一种或多种假拟蛋白(即(例如)没有已知细胞位置和/或功能的蛋白质)组成的第七抗原组。本文中将这些抗原称为“第七抗原组”。以下详细描述第七抗原组的各个肺炎衣原体抗原。

(57)假拟(CPn0331)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：57。GenBank登录号GI：4376609；AAD18480.1。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：57有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：57的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：57的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：57的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：57的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 57

  1 MAVSGGGGVQ PSSDPGKWNP ALQGEQAEGP SPLKESIFSE TKQASSAAKQ ESLVRSGSTG

 61 MYATESQINK AKYRKAQDRS STSPKSKLKG TFSKMRASVQ GFMSGFGSRA SRVSAKRASD

121 SGEGTSLLPT EMDVALKKGN RISPEMQGFF LDASGMGGSS SDISQLSLEA LKSSAFSGAR

181 SLSLSSSESS SVASFGSFQK AIEPMSEEKV NAWTVARLGG EMVSSLLDPN VETSSLVRRA

241 MATGNEGMID LSDLGQEEVS TAMTSPRAVE GKVKVSSSDS PEANPTGIPN SNTLERAEKE

301 AEKQESREQL SEDQMMLARA MAGLLTGAAP QEVLSNSVWS GPSTVFPPPK FSGTLPTQRS

361 GDKSKHKSPG IEKSTNHTNF SPLREGTVKS AEVKSLPHPE SMYRFPKDSI VSREEPEAVV

421 KESTAFKNPE NSSQNFLPIA VESVFPKESG TGGALGSDAV SSSYHFLAQR GVSLLAPLPR

481 ATDDYKEKLE AHKGPGGPPD PLIYQYRNVA VEPPIVLRSP QPFSGSSRLS VQGKPEAASV

541 HDDGGGGNSG GFSGDQRRGS SGQKASRQEK KGKKLSTDI

(58)假拟(CPn0234)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：58。GenBank登录号gi|4376508|gb|AAD18387.1。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：58有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：21的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：58的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：58的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：58的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 58

  1 MLQSCKKALL SIVVSILAFH PIPGMGVEAK SGFLGKVKGW FSKKEIQEEA RILPVKDSLS

 61 WKRYDYTSSS GFSVEFPGEP DHSGQIVEVP QSEITIRYDT YVTETHPDNT VYVVSVWEYP

121 EKVDISRPEL NLQEGFSGMM QALPESQVLF MQARQIQGHK ALEFWIVCED VYFRGMLISV

181 NHTLYQVFMV YKNKNPQALD KEYEAFSQSF KITKIREPRT IPSSVKKKVS L

(59)假拟(CPn0572)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：59。Genbank登录号gi|4376866|gb|；AAD18712.1。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：59有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：59的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、1 0、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：59的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：59的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：59的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 59

  1 MAAPINQPST TTQITQTGQT TTTTTVGSLG EHSVTTTGSG AAAQTSQTVT LIADHEMQEI

 61 ASQDGSAVSF SAEHSFSTLP PETGSVGATA QSAQSAGLFS LSGRTQRRDS EISSSSDGSS

121 ISRTSSNASS GETSRAESSP DLGDLDSLSG SERAEGAEGP EGPGGLPEST IPHYDPTDKA

181 SILNFLKNPA VQQKMQTKGG HFVYVDEARS SFIFVRNGDW STAESIKVSN AKTKENITKP

241 ADLEMCIAKF CVGYETIHSD WTGRVKPTME ERSGATGNYN HLMLSMKFKT AVVYGPWNAK

301 ESSSGYTPSA WRRGAKVETG PIWDDVGGLK GINWKTTPAP DFSFINETPG GGAHSTSHTG

361 PGTPVGATVV PNVNVNLGGI KVDLGGINLG GITTNVTTEE GGGTNITSTK STSTDDKVSI

421 TSTGSQSTIE EDTIQFDDPG QGEDDNAIPG TNTPPPPGPP PNLSSSRLLT ISNASLNQVL

481 QNVRQHLNTA YDSNGNSVSD LNQDLGQVVK NSENGVNFPT VILPKTTGDT DPSGQATGGV

541 TEGGGHIRNI IQRNTQSTGQ SEGATPTPQP TIAKIVTSLR KANVSSSSVL PQPQVATTIT

601 PQARTASTST TSIGTGTEST STTSTGTGTG SVSTQSTGVG TPTTTTRSTG TSATTTTSSA

661 STQTPQAPLP SGTRHVATIS LVRNAAGRSI VLQQGGRSQS FPIPPSGTGT QNMGAQLWAA

721 ASQVASTLGQ VVNQAATAGS QPSSRRSSPT SPRRK

第八抗原组

可通过与来自第一抗原组、或第二抗原组、或第三抗原组、或第四抗原组、或第五抗原组、或第六抗原组、或第七抗原组的两种或多种肺炎衣原体抗原组合，来提高其它肺炎衣原体抗原的免疫原性。所述其它肺炎衣原体抗原包括由一种或多种FACS阳性CPn抗原组成的第八抗原组。本文中将这些抗原称为“第八抗原组”。以下详细描述第八抗原组的各个肺炎衣原体抗原。

(60)低钙效应蛋白H(CPn0811)

低钙效应蛋白H的一个例子是以下列出的SEQ ID NO：60。Genbank登录号GI：4377123；AAD18949.1。低钙效应蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：60有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：60的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些低钙效应蛋白包括SEQ ID NO：60的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：60的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：60的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 60

  1 mskpsprnan qpqkpsasfn kktrsrlael aaqkkakadd leqvhpvpte eeikkalgni

 61 feglsngldl qqilglsdyl leeiytvayt fysqgkynea vglfqllaaa qpqnykymlg

121 lsscyhqlhl yneaafgffl afdaqpdnpi ppyyiadsll klqqpeesnn fldvtmdicg

181 nnpefkilke rcqimkqsie kqmagetkka ptkkpagksk tttnkksgkk r

(61)Yop蛋白易位蛋白T(CPn0823)

Yop蛋白易位蛋白T的一个例子是以下列出的SEQ ID NO：61。Genbank登录号GI：4377135；AAD18960.1。Yop蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：61有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：61的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些Yop蛋白包括SEQ ID NO：61的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：61的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：61的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 61

  1 mgis1pelfs nlgsayldyi fqhppayvws vfllllarll pifavapflg aklfpspiki

 61 gislswlaii fpkvladtqi tnymdnnlfy vllvkemiig ivigfvlafp fyaaqsagsf

121 itnqqgiqgl egatslisie qtsphgilyh yfvtiifwlv gghrivisll lqtlevipih

181 sffpaemmsl sapiwitmik mcqlclvmti qlsapaalam lmsdlflgii nrmapqvqvi

241 yllsalkafm gllfltlaww fiikqidyft lawfkevpim llgsnpqvl

(62)Yop蛋白易位蛋白J

Yop蛋白易位蛋白J的一个例子是以下列出的SEQ ID NO：62。Genbank登录号GI：4377140；AAD18965.1。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：62有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：62的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：62的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：62的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：62的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 62

  1 mvrrsisfcl fflmtllcct scnsrslivh glpgreanei vvllvskgva aqklpqaaaa

 61 tagaateqmw diavpsaqit ealailnqag lprmkgtsll dlfakqglvp selqekiryq

121 eglseqmast irkmdgvvda svqisftten ednlpltasv yikhrgvldn pnsimvskik

181 rliasavpgl vpenvsvvsd raaysditin gpwglteeid yvsvwgiila kss1tkfrli

241 fyvlililfv iscgllwviw kthtlimtmg gtkgffnptp ytknaleakk aegaaadkek

301 kedadsqges knaetsdkds sdkdapegsn eiega

(63)OmpA(CPn0695)

OmPA编码(MOMP)蛋白的一个例子是以下列出的SEQ ID NO：63。Genbank登录号GI：4376998；AAD18834.1。OmpA蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQID NO：63有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：63的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些OmpA蛋白包括SEQ ID NO：63的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQID NO：63的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：63的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 63

  1 mkkllksall saafagsvgs lqalpvgnps dpsllidgti wegaagdpcd pcatwcdais

 61 lragfygdyv fdrilkvdap ktfsmgakpt gsaaanytta vdrpnpaynk hlhdaewftn

121 agfialniwd rfdvfctlga sngyirgnst afnlvglfgv kgttvnanel pnvslsngvv

181 elytdtsfsw svgargalwe cgcatlgaef qyaqskpkve elnvicnvsq fsvnkpkgyk

241 gvafplptda gvatatgtks atinyhewqv gaslsyrlns lvpyigvqws ratfdadnir

301 iaqpklptav lnltawnpsl lgnatalstt dsfsdfmqiv scqinkfksr kacgvtvgat

361 lvdadkwslt aearlinera ahvsgqfrf

(64)假拟(CPn0210)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：64。Genbank登录号GI：4376482；AAD18363.1。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：64有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：64的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：64的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：64的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：64的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 64

  1 mlvelealkr efahlkdqkp tsdqeitsly qcldhlefvl lglgqdkflk atededvlfe

 61 sqkaidawna lltkardvlg lgdigaiyqt ieflgaylsk vnrrafcias eihflktair

121 dlnayylldf rwplckieef vdwgndcvei akrklctfek etkelnesll reehamekcs

181 iqdlqrklsd iiie1hdvsl fcfsktpsqe eyqkdclyqs rlryvlllye ytllcktstd

241 fqeqarakee firekfslle lekgikqtke lefaiakskl ergclvmrky eaaakhslds

301 mfeeetvksp rkdte

(65)低钙效应基因座蛋白H(CPn1021)

低钙效应蛋白H的一个例子是以下列出的SEQ ID NO：65。Genbank登录号GI：4377352；AAD19158.1。低钙效应蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：65有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：65的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些低钙效应蛋白包括SEQ ID NO：65的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：65的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：65的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 65

  1 mshlnyllek iaasskedfp fpddlesyle gyvpdknial dtyqkifkis sedlekvyke

 61 gyhayldkdy aksitvfrwl vffnpfvskf wfs1gaslhm seqysqalha ygvtavlrdk

121 dpyphyyayi cytltnehee aekalemawv raqhkplyne 1keeildirk hk

第九抗原组

可通过与来自第一抗原组、或第二抗原组、或第三抗原组、或第四抗原组、或第五抗原组、或第六抗原组、或第七抗原组、或第八抗原组的两种或多种肺炎衣原体抗原组合，来提高其它肺炎衣原体抗原的免疫原性。所述其它肺炎衣原体抗原包括第九抗原组。本文中将这些抗原称为“第九抗原组”。以下详细描述第九抗原组的各个肺炎衣原体抗原。

(66)低钙效应蛋白D(CPn0323)

低钙效应蛋白D的一个例子是以下列出的SEQ ID NO：66。Genbank登录号GI：4376601；AAD18472.1。低钙效应蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：66有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：66的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些低钙效应蛋白包括SEQ ID NO：66的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：66的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：66的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQIDNo 66

  1 mnkllnfvsr tlggdtalnm inkssdlila lwmmgvvlmi iiplpPpivd lmitinlsis

 61 vfllmvalyi psalqlsvfp slllittmfr lginisssrq illkayaghv iqafgdfvvg

121 gnyvvgfiif liitiiqfiv vtkgaervae vaarfrldam pgkqmaidad lragmidatq

181 ardkraqiqk eselygamdg amkfikgdvi agivislini vggltigvam hgmdlaqaah

241 vytllsigdg lvsqipslli altagivttr vssdkntnlg keistqlvke pralllagaa

301 tlgvgffkgf plwsfsilal ifvalgilll tkksaagkkg ggsgasttvg aagdgaatvg

361 dnpddysltl pvilelgkdl skliqhktks gqsfvddmip kmrqalyqdi girypgihvr

421 tdspslegyd ymillnevpy vrgkipphhv ltnevednls rynlpfityk naaglpsawv

481 sedakailek aaikywtple viilhlsyff hkssqeflgi qevrsmiefm ersfpdlvke

541 vtrliplqkl teifkrlvqe qisikdlrti leslsewaqt ekdtvlltey vrsslklyis

601 fkfsqgqsai svylldpeie emirgaikqt sagsylaldp dsvnlilksm rntitptpag

661 gqppvlltai dvrryvrkli etefpdiavi syqeilpeir iqplgriqif

(67)CHLPS43kDa蛋白同源物-1(CPn0062)

CHLPS43kDa蛋白同源物-1的一个例子是以下列出的SEQ ID NO：67。Genbank登录号GI：4376318；AAD18215.1。CHLPS蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQID NO：67有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：67的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些CHLPS蛋白包括SEQ ID NO：67的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQID NO：67的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：67的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 67

  1 mmsskrtski avlsilltft hsigfanans svglgtvyit sevvkkpqkg serkqakkep

 61 rarkgylvps srtlsaraqk mknssrkess ggcneisans tprsvklrrn kraeqkaakq

121 gfsafsnltl ksllpklpsk qktsiherek atsrfvnesq lssarkryct pssaapslfl

181 eteivrapve rtkelqdnei hipvvqvqtn pkeqntkttk qlasqasiqq segteqslre

241 laqgaslpvl vrsnpevsvq rqkeellkel vaerrqckrk svrqalears ltkkvarggs

301 vtstlrydpe kaaeiksrrn ckvspeareq kyssckrdar angkqdkttp sedasqeeqq

361 tgaglvrktp ksqvasnaqn fyrnskntni dsyltanqys csseetdwpc sscvskrrth

421 nsisvctmvv tviamivgal iianatesqt tsdptpptpt p

(68)假拟(Cpnn0169)

CHLPS43kDa蛋白同源物-1的一个例子是以下列出的SEQ ID NO：68。Genbank登录号GI：4376437；AAD18322.1。CHLPS蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQID NO：68有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：68的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些CHLPS蛋白包括SEQ ID NO：68的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQID NO：68的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：68的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 68

  1 mknvgsecsq plvmelntqp lrnlcesrlv kitsf小瓶l alvggitlta lagagilsfl

 61 pwlvlgivlv vlcalfllfs ykfcpikelg vvyntdsqih qwfqkqrnkd lekatenpel

121 fgenraednn rsarsqvket lrdcdgnvlk kiyernldvl lfmnwvpktm ddvdpvseds

181 irtviscykl ikackpefrs lisellramq sglgllsrcs ryqeraktvs hkdaplfcpt

241 hsyyrdgylt plragpryii nrai

(69)PmpD家族(Cpn0963)

PmpD蛋白的一个例子是以下列出的SEQ ID NO：69。Genbank登录号GI：4377287；AAD19099.1。PmpD蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：69有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：69的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些PmpD蛋白包括SEQ ID NO：69的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：69的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：69的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 69

  1 mvakktvrsy rssfshsviv ailsagiafe ahslhsseld lgvfnkqfee hsahveeaqt

 61 svlkgsdpvn psqkesekvl ytqvpltqgs sgesldlada nflehfqhlf eettvfgidq

121 klvwsdldtr nfsqptqepd tsnavsekis sdtkenrkdl etedpskksg lkevssdlpk

181 spetavaais edleisenis ardplqglaf fykntssqsi sekdssfqgi ifsgsgansg

241 lgfenlkapk sgaavysdrd ivfenlvkgl sfiscesled gsaagvnivv thcgdvtltd

301 catgldleal rlvkdfsrgg avftarnhev qnnlaggils vvgnkgaivv eknsaeksng

361 gafacgsfvy snnentalwk enqalsggai ssasdidiqg ncsaiefsgn qslialgehi

421 gltdfvggga laaqgtltlr nnavvqcvkn tskthggail agtvdlneti sevafkqnta

481 altggalsan dkviiannfg eilfeqnevr nhggaiycgc rsnpkleqkd sgeniniign

541 sgaitflknk asvlevmtqa edyagggalw ghnvlldsns gniqfignig gstfwigeyv

601 gggailstdr vtisnnsgdv vfkgnkgqcl aqkyvapqet apvesdasst nkdekslnac

661 shgdhyppkt veeevppsll eehpvvsstd irgggailaq hifitdntgn lrfsgnlggg

721 eesstvgdla ivgggallst nevnvcsnqn vvfsdnvtsn gcdsggaila kkvdisanhs

781 vefvsngsgk fggavcalne svnitdngsa vsfsknrtrl ggagvaapqg svticgnqgn

841 iafkenfvfg senqrsggga iianssvniq dnagdilfvs nstgsyggai fvgslvaseg

 901 snprtltitg nsgdilfakn stqtaaslse kdsfgggaiy tqnlkivkna gnvsfygnra

 961 psgagvqiad ggtvcleafg gdilfegnin fdgsfnaihl cgndskivel savqdkniif

1021 qdaityeent irglpdkdvs plsapslifn skpqddsaqh hegtirfsrg vskipqiaai

1081 qegtlalsqn aelwlaglkq etgssivlsa gsilrifdsq vdssaplpte nkeetlvsag

1141 vqinmssptp nkdkavdtpv ladiisitvd lssfvpeqdg tlplppeiii pkgtklhsna

1201 idlkiidptn vgyenhalls shkdiplisl ktaegmtgtp tadaslsnik idvslpsitp

1261 atyghtgvws eskmedgrlv vgwqptgykl npekqgalvl nnlwshytdl ralkqeifah

1321 htiaqrmeld fstnvwgsgl gvvedcqnig efdgfkhhlt gyalgldtql vedfliggcf

1381 sqffgktesq sykakndvks ymgaayagil agpwlikgaf vygninndlt tdygtlgist

1441 gswigkgfia gtsidyryiv nprrfisaiv stvvpfveae yvridlpeis eqgkevrtfq

1501 ktrfenvaip fgfalehays rgsraevnsv qlayvfdvyr kgpvslitlk daayswksyg

1561 vdipckawka rlsnntewns ylstylafny ewredliayd fnggiriif

第十抗原组

可通过与来自第一抗原组、或第二抗原组、或第三抗原组、或第四抗原组、或第五抗原组、或第六抗原组、或第七抗原组、或第八抗原组、或第九抗原组的两种或多种肺炎衣原体抗原组合，来提高其它肺炎衣原体抗原的免疫原性。所述其它肺炎衣原体抗原包括第十抗原组。以下详细描述第十抗原组的各个肺炎衣原体抗原。

(70)OmpH-样外膜蛋白(CPn0301)

‘OmpH-样’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：77和78。{GenBank登录号：gi|4376577|gb|AAD18450.1|‘CPn0301’；下述SEQ ID NO：70和上述SEQ ID No 4}。用于本发明的优选OmpH-样蛋白包含以下氨基酸序列：(a)与SEQID NO：4有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：3的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些OmpH-样蛋白包括SEQ ID NO：4的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQID NO：4的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：4的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多；优选19或更多，以去除信号肽)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失上述信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 70

  1  MKKLLFSTFL LVLGSTSAAH ANLGYVNLKR CLEESDLGKK ETEELEAMKQ

 51 QFVKNAEKIE EELTSIYNKL QDEDYMESLS DSASEELRKK FEDLSGEYNA

101 YQSQYYQSIN QSNVKRIQKL IQEVKIAAES VRSKEKLEAI LNEEAVLAIA

151 PGTDKTTEII AILNESFKKQ N*

(71)L7/L12核糖体蛋白(CPn0080)

L7/L12核糖体蛋白的一个例子是以下列出的SEQ ID No 71{GenBank登录号：GI：4376338；AAD18233.1}。‘CPn0080’；下述SEQ ID NO：71。L7/L12蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：71有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：71的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些L7/L12核糖体蛋白包括SEQ ID NO：71的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：71的表位。其它优选片段缺少SEQID NO：71的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多；优选19或更多，以去除信号肽)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 71

  1 mttesletlv eklsnltvle lsqlkkllee kwdvtasapv vavaagggge apvaaeptef

 61 avtledvpad kkigvlkvvr evtglalkea kemteglpkt vkektsksda edtvkklqda

121 gakasfkgl

(72)AtoS双组分调节系统传感组氨酸激酶蛋白(CPn0584)

‘AtoS’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：105和106。{GenBank登录号：gi|4376878|gb|AAD18723.1|‘CPn0584’；下述SEQ ID NO：72和上述SEQ IDNo 9}。AtoS蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：72有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：72的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、1O、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些AtoS蛋白包括SEQ ID NO：72的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：72的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：72的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 72

  1 MNVPDSKNLH PPAYELLEIK ARITQSYKEA SAILTAIPDG ILLLSETGHF

 51 LICNSQAREI LGIDENLEIL NRSFTDVLPD TCLGFSIQEA LESLKVPKTL

101 RLSLCKESKE KEVELFIRKN EISGYLFIQI RDRSDYKQLE NAIERYKNIA

151 ELGKMTATLA HEIRNPLSGI VGFASILKKE ISSPRHQRML SSIISGTRSL

201 NNLVSSMLEY TKSQPLNLKI INLQDFFSSL IPLLSVSFPN CKFVREGAQP

251 LFRSIDPDRM NSVVWNLVKN AVETGNSPIT LTLHTSGDIS VTNPGTIPSE

301 IMDKLFTPFF TTKREGNGLG LAEAQKIIRL HGGDIQLKTS DSAVSFFIII

351 PELLAALPKE RAAS*

(73)OmcA9kDa-富含半胱氨酸的脂蛋白(CPn0558)

‘OmcA’蛋白的一个例子是WO 02/02606公开的SEQ ID NO：9和10。{GenBank登录号：gi|4376850|gb|AAD18698.1|‘CPn0558’，‘OmcA’，‘Omp3’；下述SEQ ID NO：73和上述SEQ ID No 10}。OmcA蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：73有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：73的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些OmcA蛋白包括SEQ ID NO：73的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：73的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：73的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多；优选18或更多以去除信号肽)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失上述信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。该蛋白质可脂化(如通过N-酰基二甘油酯)，从而可具有N-末端半胱氨酸。

SEQ ID No 73

 1   MKKAVLIAAM FCGVVSLSSC CRIVDCCFED PCAPSSCNPC EVIRKKERSC

51  GGNACGSYVP SCSNPCGSTE CNSQSPQVKG CTSPDGRCKQ *

(74)假拟(CPn0331)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：74和以上所列SEQ ID No 57。Genbank登录号GI：4376609；AAD18480.1。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：74有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：74的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、1 8、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：74的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：74的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：74的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID NO 74

  1 mavsggggvq pssdpgkwnp alqgeqaegp splkesifse tkqassaakq eslvrsgstg

 61 myatesqink akyrkaqdrs stspksklkg tfskmrasvq gfmsgfgsra srvsakrasd

121 sgegtsllpt emdvalkkgn rispemqgff ldasgmggss sdisqlslea lkssafsgar

181 slslsssess svasfgsfqk aiepmseekv nawtvarlgg emvsslldpn vetsslvrra

241 matgnegmid lsdlgqeevs tamtaprave gkvkvsssds peanptgipn sntleraeke

301 aekqesreql sedqmmlara maglltgaap qevlsnsvws gpstvfpppk fsgtlptqrs

361 gdkskhkspg iekstnhtnf splregtvks aevkslphpe smyrfpkdsi vsreepeavv

421 kestafknpe nssqnflpia vesvfpkesg tggalgsdav sssyhflaqr gvsllaplpr

481 atddykekle ahkgpggppd pliyqyrnva veppivlrsp qpfsgssrls vqgkpeaasv

541 hddggggnsg gfsgdqrrgs sgqkasrqek kgkklstdi

(75)PmpD家族(CPn0963)

PmpD蛋白的一个例子是以下所列SEQ ID NO：75。Genbank登录号GI：4377287；AAD19099.1。PmpD蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：75有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：75的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：75的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：75的表位。其它优选片段缺少C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 75

  1  mvakktvrsy rssfshsviv ailsagiafe ahslhsseld lgvfnkqfee hsahveeaqt

  61 svlkgsdpvn psqkesekvl ytqvpltqgs sgesldlada nflehfqhlf eettvfgidq

 121 klvwsdldtr nfsqptqepd tsnavsekis sdtkenrkdl etedpskksg lkevssdlpk

 181 spetavaais edleisenis ardplqglaf fykntssqsi sekdssfqgi ifsgsgansg

 241 lgfenlkapk sgaavysdrd ivfenlvkgl sfiscesled gsaagvnivv thcgdvtltd

 301 catgldleal rlvkdfsrgg avftarnhev qnnlaggils vvgnkgaivv eknsaeksng

 361 gafacgsfvy snnentalwk enqalsggai ssasdidiqg ncsaiefsgn qslialgehi

 421 gltdfvggga laaqgtltlr nnavvqcvkn tskthggail agtvdlneti sevafkqnta

 481 altggalsan dkviiannfg eilfeqnevr nhggaiycgc rsnpkleqkd sgeniniign

 541 sgaitflknk asvlevmtqa edyagggalw ghnvlldsns gniqfignig gstfwigeyv

 601 gggailstdr vtisnnsgdv vfkgnkgqcl aqkyvapqet apvesdasst nkdekslnac

 661 shgdhyppkt veeevppsll eehpvvsstd irgggailaq hifitdntgn lrfsgnlggg

 721 eesstvgdla ivgggallst nevnvcsnqn vvfsdnvtsn gcdsggaila kkvdisanhs

 781 vefvsngsgk fggavcalne svnitdngsa vsfsknrtrl ggagvaapqg svticgnqgn

 841 iafkenfvfg senqrsggga iianssvniq dnagdilfvs nstgsyggai fvgslvaseg

 901 snprtltitg nsgdilfakn stqtaaslse kdsfgggaiy tqnlkivkna gnvsfygnra

 961 psgagvqiad ggtvcleafg gdilfegnin fdgsfnaihl cgndskivel savqdkniif

1021 qdaityeent irglpdkdvs plsapslifn skpqddsaqh hegtirfsrg vskipqiaai

1081 qegtlalsqn aelwlaglkq etgssivlsa gsilrifdsq vdssaplpte nkeetlvsag

1141 vqinmssptp nkdkavdtpv ladiisitvd lssfvpeqdg tlplppeiii pkgtklhsna

1201 idlkiidptn vgyenhalls shkdiplisl ktaegmtgtp tadaslsnik idvslpsitp

1261 atyghtgvws eskmedgrlv vgwqptgykl npekqgalvl nnlwshytdl ralkqeifah

1321 htiaqrmeld fstnvwgsgl gvvedcqnig efdgfkhhlt gyalgldtql vedfliggcf

1381 sqffgktesq sykakndvks ymgaayagil agpwlikgaf vygninndlt tdygtlgist

1441 gswigkgfia gtsidyryiv nprrfisaiv stvvpfveae yvridlpeis eqgkevrtfq

1501 ktrfenvaip fgfalehays rgsraevnsv qlayvfdvyr kgpvslitlk daayswksyg

1561 vdipckawka rlsnntewns ylstylafny ewredliayd fnggiriif

(76)假拟(CPn0798)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：78。GenBank登录号GI：4377109；AAD18936。假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：78有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：78的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：78的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：78的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：78的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 78

  1 mkktccqnyr sigvvfsvvl fvlttqtlfa ghfidigtsg lyswargvsg dgrvvvgyeg

 61 gnafkyvdge kflleglvpr sealvfkasy dgsviigisd qdpscravkw vngalvdlgi

121 fsegmqsfae gvssdgktiv gclysddtet nfavkwdetg mvvlpnlped rhscawdase

181 dgsvivgdam gseeiakavy wkdgeqhlls nipgakrssa havskdgsfi vgefiseene

241 vhafvyhngv ikdigtlggd ysvatgvsrd gkvivghstr tdgeyrafky vdgrmidlgt

301 lggsasfafg vsddgktivg kfetelgech afiyldd

(77)假拟(Cpn0799)

假拟蛋白的一个例子是以下所列的SEQ ID NO：79。GenBank登录号GI：15618708；AAD18937。用于本发明的假拟蛋白优选包含以下氨基酸序列：(a)与SEQID NO：79有50％或更多相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)的氨基酸序列；和/或(b)是SEQ ID NO：79的至少n个连续氨基酸片段的氨基酸序列，其中n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些假拟蛋白包括SEQ ID NO：79的变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、侧向同源物、突变体等)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：79的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO：79的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或其N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。其它片段缺失了该蛋白的一个或多个结构域(如缺失信号肽、胞质结构域、跨膜结构域或胞外结构域)。

SEQ ID No 79

  1  maaikqilrs mlsqsslwmv lfslyslsgy cyvitdkped dfhsssavkw dhwgkttlsr

 61  lsnkkasaka vsgtgattvg fikdtwsrty avrwnywgtk elptsswvkk skatgissdg

121  siiagivene lsqsfavtwk nnemyllpst wavqskaygi ssdgsvivgs akdawsrtfa

181  vkwtgheaqv lpvgwavksv ansvsangsi ivgsvqdasg ilyavkwegn tithlgtlgg

241  ysaiakavsn ngkvivgrse tyygevhafc hkngvmsdlg tlggsysaak gvsatgkviv

301  gmsttangkl hafkyvggrm idlgeyswke acanavsidg eiivgvqse

本发明组合物优选包含选自下组的CPn抗原组.合：(1)CPn0301和CPn0080；(2)CPn 0584和CPn 0558；和(3)CPn 0331和CPn 0963。该组合物优选包含(1)、(2)和(3)中任何一组或多组的组合。

本发明组合物更优选包含选自下组的CPn抗原组合：(1)CPn0385、CPn0324、CPn0503、CPn0525和CPn0482。优选在明矾和/或cPG的存在下给予该组合物。

因此，本发明包括含有肺炎衣原体抗原组合的组合物，所述组合物选自第一抗原组的两种、三种、四种、五种或六种肺炎衣原体抗原和第二抗原组的两种、三种、四种、五种或六种肺炎衣原体抗原。该组合优选选自第一抗原组的三种、四种、五种或六种肺炎衣原体抗原和第二抗原组的三种、四种、五种或六种肺炎衣原体抗原。该组合更优选由第一抗原组的六种肺炎衣原体抗原和第二抗原组的三种、四种、五种或六种肺炎衣原体抗原组成。

本发明还包括含有肺炎衣原体抗原组合的组合物，所述组合物选自第二抗原组的两种、三种、四种、五种或六种肺炎衣原体抗原和第三抗原组的两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种肺炎衣原体抗原。该组合优选选自第二抗原组的三种、四种、五种或六种肺炎衣原体抗原和第三抗原组的三种、四种、五种、六种、七种或八种肺炎衣原体。该组合更优选由第二抗原组的六种肺炎衣原体抗原和第三抗原组的三种、四种、五种、六种、七种或八种肺炎衣原体抗原组成。

本发明组合物中肺炎衣原体抗原的数量有上限。本发明组合物中肺炎衣原体抗原的数量优选小于20、小于19、小于18、小于17、小于16、小于15、小于14、小于13、小于12、小于11、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4或小于3。本发明组合物中肺炎衣原体抗原的数量更优选小于6、小于5或小于4。用于本发明的肺炎衣原体抗原优选是从天然情况下发现该分子的整体生物中分离的，即单独和离散的，或者当此多核苷酸或多肽不是天然形式时，其不含其它生物大分子，从而足以使此多核苷酸或多肽可用于其预计目的。

在任一上述组合中，所述组合物优选包含包括porB的第四抗原组的一种或多种肺炎衣原体抗原。或者，在任一上述组合中，第四抗原组的肺炎衣原体抗原优选包括pmp3家族的一个或多个成员。

所附权利要求书和以下说明书和附图中说明了本发明的其它方面。这些方面以单独章节标题表示。然而应理解，各章节的内容不必限于具体的章节标题。

在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于具体举例的分子，同样，方法参数当然也可能改变。也应理解，本文所用术语仅为了描述本发明的具体实施方式，不旨在限制。此外，本发明的实施使用(除非另有说明)病毒学、微生物学、分子生物学、重组DNA技术和免疫学的常规方法，所有这些方法都在本领域一般技术人员的知识范围内。文献中完整地解释了这些方法。参见例如，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)(第二版，1989)；《DNA克隆：实用方法》(DNA Cloning：APracticalApproach)，第I卷和第II卷(D.Glover编)；《寡核苷酸合成》(Oligo核苷酸Synthesis)(N.Gait编，1984)；《分子克隆实用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)(1984)；和《基础病毒学》(FundamentalVirology)，第二版，第I卷和第II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)。

将本文引用的所有出版物、专利、专利申请(上文或下文中)全文纳入本文作为参考。必须注意，用于本说明书和所附权利要求书中的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非文中明确指出不是这样。用于本申请的所有科技术语具有本领域常用的含义，除非另有说明。本申请所用的以下词语或短语具有特定含义。

术语“包含”指“包括”以及“由...组成”，如“包含”X的组合物可仅由X组成或可包括一些附加组分如X+Y。

在提到数值x时术语“约”指(例如)x±10％。

两个氨基酸序列之间的序列相同性百分数指，比对时，在两个序列的比较中此百分数的氨基酸相同。可用本领域已知的软件程序，如《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等编，1987)，增刊30，第7.7.18节所述的软件程序测定此比对和百分数同源性或序列相同性。通过Smith-Waterman同源性搜索算法用仿射间隔搜索，其中缺口开放罚分12，缺口延伸罚分2，BLOSUM矩阵62来确定优选比对。Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489中揭示了Smith-Waterman同源性搜索算法。

免疫应答

免疫系统控制疾病的机制包括通过体液免疫诱导中和抗体，和通过细胞免疫产生T-细胞应答。本文所用术语对于抗原的“免疫应答”指在宿主哺乳动物对象中产生对于该抗原的体液和/或细胞免疫应答。

本文所用术语“体液免疫应答”指抗体分子介导的免疫应答。体液免疫产生的抗体主要对细胞外感染物有效。

本发明组合物中SEQ ID No 1-86可被结合于蛋白的抗体补充或替代。该抗体可为单克隆或多克隆抗体。

本文所用术语“细胞介导的免疫(CMI)应答”指T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。当抗原在后来的某个时间出现时，记忆性T-细胞被激活导致CMI应答破坏在细胞表面上有对应抗原或其部分的靶细胞，并从而破坏感染病原体，因为CMI机制以这种方式引发T细胞，因此CMI免疫机制通常在对抗细胞内感染和疾病时更为有效。CMI应答集中于通过效应器细胞(通过细胞-细胞直接接触来破坏宿主受感染的细胞)介导和/或通过释放细胞因子等具有抗病毒活性的分子介导来摧毁感染源。因此以特异性T淋巴细胞应答为特征的CMI应答对于产生对癌症、病毒、病原体和其它细胞内微生物的抗性至关紧要。

本发明一方面提供了免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含引发肺炎衣原体特异性Th1免疫应答(如细胞介导的或细胞免疫应答)的至少一种抗原和引发肺炎衣原体特异性Th2应答(如体液或抗体应答)的至少一种抗原的组合。免疫原性组合物还可包含Th1佐剂和Th2佐剂。

在一个实施方式中，本发明提供一种组合物，该组合物包含至少引发肺炎衣原体特异性Th1免疫应答的肺炎衣原体抗原组合。例如，肺炎衣原体抗原组合可包含至少一种肺炎衣原体网状体(RB)相关抗原，包括但不限于表达、暴露于或转位入、通过或穿过包含体膜的抗原，表达、分泌、释放或转位入宿主细胞浆的抗原，或于宿主细胞浆中加工、降解的抗原和/或于宿主细胞表面表达、暴露或递呈的抗原。本发明的组合物优选同时引发细胞介导的免疫应答和体液免疫应答以便有效对抗衣原体细胞内感染。免疫应答优选诱导接触衣原体后可快速应答的长效(如中和)抗体和细胞介导的免疫。

本发明也包括含有一种或多种免疫调节剂的免疫原性组合物。一种或多种免疫调节剂优选包含佐剂。佐剂可选自Th1佐剂和Th2佐剂的一种或多种，下文进一步讨论。佐剂可选自无机盐如铝盐和含有CpG基序的寡核苷酸。免疫原性组合物最优选包含铝盐和含有CpG基序的寡核苷酸。使用无机盐如铝盐和含CpG基序的寡核苷酸的组合能增强免疫应答。这种免疫应答的增强完全是出乎意料的，也不可从任一单独试剂的应用来预测。因此本发明包括含有CpG基序的寡核苷酸、矿物盐如铝盐、和抗原如肺炎衣原体抗原。

参与CMI应答的T细胞

起始和/或增强CMI和体液应答需要至少两种特殊类型的T细胞。表达CD4共受体的T细胞特定亚组上的抗原性受体可以是T辅助(Th)细胞或CD4 T细胞(下文称为T辅助细胞)，它们识别结合MHC II型分子的抗原肽。相反，表达CD8共受体的T细胞特定亚组上的抗原性受体称作细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或CD8+T细胞(下文称为CD8+T细胞)，并与MHC I型分子上展示的抗原反应。

辅助T细胞

辅助T细胞或CD4+细胞还可分为两种功能不同的亚型：Th1和Th2，它们的细胞因子和效应器功能不同。Th1和Th2应答不仅被正向调节也被负向调节，如Th1细胞应答被Th1细胞因子如IL-2、IL-12和IFN-γ增强并被Th2细胞因子如IL-4和IL-10降低。相反，抗体应答被Th2细胞因子如IL-4和IL-10增强，却被Th1细胞因子如IFN-γ和另一个细胞因子IL-12(由单核细胞产生，增强IFN-γ)下调。因此，经典的Th1细胞因子如IFN-γ、IL-2和IL-12被认为是诱导有效炎症反应的免疫辅因子。相反，经典的Th2细胞因子如IL-4和IL-10被认为是抑制严重炎症反应的细胞因子。

CD8+T细胞

CD8+T细胞可通过一种以上方式发挥作用。CD8+T细胞最著名的作用是杀伤或裂解携带MHC I型分子肽抗原的靶细胞。这是这些细胞常被称作细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的原因。然而，也许在某些感染中与其保护作用相关更大的另一功能是CD8+T细胞分泌干扰素γ(IFN-γ)的能力。裂解活性测定和IFN-γ释放的测定在测量CD8+T细胞免疫应答中都具有价值(如下文列举的ELISPOT试验)。感染性疾病中有证据表明CD8+T细胞可在尚未产生任何疾病症状的疾病早期通过杀死包含感染性抗原的感染物进行保护。

增强CMI应答

本发明涉及能够在宿主对象中增强和/或调节针对靶抗原的CMI应答的方法、工艺和组合物。本文所用术语“增强”包括在CMI应答的所有方面的提高，包括但不限于刺激和/或增加和/或增强和/或上调对抗原或编码感兴趣抗原的核苷酸序列的CMI应答的数量和/或持续时间和/或质量。例如，CMI应答可由以下途径增强：(i)增强识别靶抗原的CD8+T细胞的激活和/或产生和/或增殖，和/或(ii)将Th2型CMI应答改变为Th1型应答。Th1相关应答的增强在对胞内感染的应答反应中特别有价值，因为如前所述，激活的Th1(如IFN-γ诱导的)细胞能增强CMI应答。

此类增强免疫应答的特征通常是生产干扰素的CD4⁺和/或CD8⁺T淋巴细胞滴度增加，抗原特异性CD8+T细胞活性增加和针对感兴趣抗原的T辅助细胞1样免疫应答(Th1)(其特征为一般与细胞免疫相关的亚型抗原特异性抗体滴度增加(如IgG2a)，通常伴随一般与体液免疫(而非T辅助细胞2样免疫应答(Th2))相关的亚型抗体滴度减少(如IgGl))。

CMI应答增强可通过许多熟知的方法测定，如通过淋巴增殖(淋巴细胞激活)试验、CD8+T细胞试验或测定对致敏对象的表位特异的T-淋巴细胞(参见例如，Erickson等，(1993)J.Immunol.151：4189-4199；和Doe等，(1994)Eur.J.Immunol.24：2369-2376)或用于测定干扰素γ产量的CD8+T细胞ELISPOT试验(Miyahara等PNAS(USA)(1998)95：3954-3959)。

增强的T-细胞应答

本文所用术语“增强的T-细胞应答”包括在T-细胞应答的所有方面的提高，包括但不限于刺激和/或增加和/或增强和/或上调对抗原(可重复给予)或编码抗原的核苷酸序列的T-细胞应答的数量和/或持续时间和/或质量。抗原可为衣原体抗原，优选肺炎衣原体抗原。例如，T-细胞应答可由以下途径增强：增强诱导的T-细胞的激活和/或产生和/或分布和/或增殖，和/或增强对T-细胞诱导/调节抗原或编码抗原的核苷酸序列的T-细胞应答的时间。在宿主对象中增强T-细胞应答可能与宿主对象中Th1免疫应答的增强和/或调节相关。

T-细胞应答的增强可通过许多熟知试验测定，如通过淋巴增殖(淋巴细胞激活)试验、CD8+T细胞细胞毒试验或测定对致敏对象的表位特异的T-淋巴细胞(参见例如，Erickson等，(1993)J.Immunol.151：4189-4199；和Doe等，(1994)Eur.J.Immunol.24：2369-2376)或用于测定干扰素γ产量的CD8+T细胞ELISPOT试验(Miyahara等PNAS(USA)(1998)95：3954-3959)。

激活的Th1细胞增强细胞免疫(包括抗原特异性CTL产量的增加)，因此在胞内感染的应答反应中特别有价值。激活的Th1细胞可分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β的一种或多种。通过激活巨噬细胞、NK(自然杀伤)细胞和CD8细胞毒性T细胞(CTL)，Th1免疫应答可导致局部炎症反应。通过IL-12刺激B和T细胞生长，Th1免疫应答也可用于扩展免疫应答。Th1刺激的B细胞可分泌IgG2a。

激活的Th2细胞增强抗体生产从而在胞外感染应答中具有价值。激活的Th2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。Th2免疫应答可产生未来要保护的IgGl、IgE、IgA和记忆性B细胞。

抗原

任何致病剂和疾病状态都有相关的抗原或抗原上的免疫优势表位，免疫优势表位对宿主免疫识别并最终消除或控制致病剂和疾病状态有重要作用。为引发对特定疾病的体液和/或细胞免疫应答，宿主免疫系统必须与疾病状态相关的抗原或抗原上的免疫优势表位接触。

本文所用术语″抗原″指可以在个体中引发免疫应答的任何物质，通常为大分子。术语“抗原”可与术语“免疫原”互换使用。免疫应答可分为B-和/或T-淋巴细胞的免疫应答。该术语可用于指单个大分子或抗原性大分子的均质或不均质群体。本文所用“抗原”指包含一个或多个抗原性决定簇或表位的蛋白质分子或其部分。本文所用术语“抗原”意为包含能够诱导对感染性衣原体病原体的CMI应答的一个或多个表位的感兴趣免疫原性肽或蛋白质。抗原可包括但不限于自动抗原(auto-antigen)、自身抗原、交叉反应抗原、同种抗原、耐受原、过敏原、半抗原、免疫原或其部分以及它们的任意组合。

表位

本文所用术语″表位″通常指抗原上被T-细胞受体和/或抗体识别的位点。它优选为来源于蛋白抗原或作为其一部分的短肽。然而该术语也旨在包括具有糖肽和糖表位的肽。一个抗原分子可携带数种不同表位。术语“表位”也包括氨基酸或糖的修饰序列，其能够刺激识别整个有机体的应答。所选表位为引起感染性疾病的感染物如衣原体菌的表位时比较有利。

本发明组合物中SEQ ID No 1-86可被包含SEQ ID No 1-86片段的分予补充或替代。此片段可包含来自分子的至少n个连续单体，根据具体的序列，n是，(i)对于蛋白质分子而言n为7或更多(如8、18、20或更多)，优选使该片段包含该序列的表位，或(ii)对于核酸分子n为10或更多(如15、18、20、25、30、35、40或更多)。

表位来源

无须进行过多试验，可从肽或多肽的氨基酸和相应DNA序列，以及从特定氨基酸的特性(如尺寸、电荷等)或密码子字典产生表位。参见例如，Ivan Roitt，《免疫学要论》(Essential Immunology)，1988；Kendrew，同上；Janis Kuby，《免疫学》，1992，如79-81页。一些确定蛋白是否会激发应答的指导原则，包括：肽长度-优选8或9个氨基酸长的肽适合MHC I型复合物，约13-25个氨基酸长的肽适合MHC II型复合物。该长度是结合MHC复合物的最小肽长度。优选长于这些长度的肽，因为细胞可能切割肽。肽可包含合适的锚定基序使其能够以足够高的特异性与各种I型或II型分子结合，产生免疫应答(参见Bocchia，M等，白血病癌基因融合蛋白肽与HLA I型分自的特异性结合(Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Pentidesto HLA Class I Molecules)，Blood 85：2680-2684；Englehard，VH，与I型和II型MHC分白结合的肽的结构(Structure of peptides associated with class I and class II MHCmolecules)Ann.Rev.Immunol.12：181(1994))。可通过比较感兴趣蛋白序列和公开的与MHC分子结合的肽结构完成此过程，而不需进行过多试验。因此，本领域技术人员可通过将蛋白序列与蛋白数据库中列举的序列作比较来确证感兴趣的表位。

T细胞表位

本发明中一种或多种抗原优选包含一个或多个T细胞表位。本文所用术语″T细胞表位″通常指能够诱导T细胞应答的肽结构特征。在这方面，本领域接受的是：T细胞表位包含线性肽决定簇，设想该线性肽决定簇在MHC分子的肽结合口中呈现长形(extended)构象(Unanue等，(1987)，Science 236：551-557)。本文所述T细胞表位通常为包含至少3-5个氨基酸残基的肽，优选包含至少5-10个或更多氨基酸残基。然而，本文所用术语“T细胞表位”包括任何MHC I型或MHC II型限制性肽。可通过许多熟知的试验测定特定T细胞表位刺激/增强CMI应答的能力，如淋巴增殖(淋巴细胞激活)试验、CD8+T细胞细胞毒细胞试验或测定对致敏对象的表位特异的T-淋巴细胞(参见例如，Erickson等，(1993)J.Immunol.151：4189-4199；和Doe等，(1994)Eur.J.Immuno1.24：2369-2376)或用于测定干扰素γ产量的CD8+T细胞ELISPOT试验(Miyahara等PNAS(USA)(1998)95：3954-3959)。

CD8+T-细胞表位

本发明抗原优选包含CD8+T细胞诱导型表位。CD8+T-细胞诱导型表位能够在特定CD8+T细胞给予宿主对象后刺激其形成或增加其活性。CD8+T-细胞表位可由各种不同形式提供，如一种或两种或多种表位的重组串。已鉴定到并且可从文献中发现用于许多不同疾病的CD8+T-细胞表位。可能通过设计表位串以产生针对包含此类CD8+T-细胞表位的任何所选抗原的CD8+T-细胞应答。CD8+T-细胞诱导型表位宜通过多个表位的串提供，这些表位相互连接且没有间隔序列从而避免不必需的核酸物质。

T辅助表位

本发明抗原优选包含辅助性T淋巴细胞表位。可用不同方法鉴定适合用于本发明的T辅助细胞表位。例如，已知肽序列的两亲性会影响其作为T辅助细胞诱导物的能力。关于T辅助细胞-诱导型表位的完整讨论参见美国专利5,128,319，纳入本文作为参考。

B细胞表位

本发明抗原优选包含CD8+T-细胞表位和B细胞表位的混合物。本文所用术语“B细胞表位”通常指特异性抗体分子结合的抗原上的位点。利用本领域熟知技术不难完成对能够引发抗体应答的表位的鉴定。参见例如，Geysen等，(1984)Proc.Natl.Acad，Sci.USA 81：3998-4002(快速合成肽以测定给定抗原免疫原性表位位置的常用方法)；美国专利号4,708,871(鉴定并化学合成抗原表位的步骤)；和Geysen等，(1986)Molecular Immunology 23：709-715(鉴定与给定抗体具有高亲和力的肽的技术)。

表位组合

在本发明的一个优选实施方式中，抗原或抗原组合包含CD8+T-细胞-诱导型表位和T辅助细胞-诱导型表位的混合物。

如本领域所熟知，T和B细胞诱导型表位常常互不相同且可包含不同肽序列。因此蛋白肽链的某些区域可具有T细胞或B细胞表位。因此，除CD8+T-细胞表位外，优选包括T辅助细胞识别的一个或多个表位，从而增强CD8+T-细胞表位产生的免疫应答。

T辅助细胞诱导剂在体内增强CD8+T-细胞诱导应答的机制尚未完全明了。然而，不局限于理论，有可能是由于增强剂能够诱导T辅助细胞，所以增强剂导致那些在辅助特异性CD8+T细胞克隆扩张和传播中必需的细胞因子水平增高。无论可能机制如何，可预见的是使用本发明中辅助性T细胞和CD8+T细胞-诱导型抗原组合的混合物将有助于CMI应答的增强。特别合适的T辅助表位是在不同的HLA类型个体中有活性的表位，例如来自破伤风的T辅助表位(大多数个体已经对它产生免疫)。包括用于刺激B细胞应答和抗体产生的B细胞表位同样有用。也可构建合成的核苷序列，以产生两种类型的免疫应答：仅T细胞的应答和T细胞与B细胞组合应答。

免疫优势表位

当利用抗原或抗原组合或编码靶抗原多个表位的核苷酸序列或核苷序列组合免疫个体时，在许多情况下，大多数应答T淋巴细胞对来自该靶抗原的一个或多个线性表位特异，和/或大多数应答B淋巴细胞对该抗原或抗原组合的一个或多个线性或构象表位特异。那么，为了本发明目的，将这些表位称为″免疫优势表位″。在具有几个免疫优势表位的抗原中，一个表位可能在启动特定T或B细胞应答中最有效。

正如实施例所示，本发明中至少16种肽被实际上由于细菌感染而扩展的IFN-γ阳性CD8+T细胞群体所识别。

佐剂

本发明组合物可与其它免疫调节剂联合给予。具体说，本发明组合物可与佐剂联合给予。

包括佐剂，具体是包括遗传佐剂，可用于进一步增强或调节CMI应答。佐剂可通过提高共同给予的抗原在免疫对象中的免疫原性，以及诱导对共同给予的抗原的Th1-样免疫应答而增强CMI应答，这对疫苗生产有益。

可通过将佐剂加入抗原组合或编码抗原组合的核苷酸序列，来调节免疫应答，特别是CMI应答，这导致能引发长效和持续的增强CMI应答的特别有效的组合物。

本文所用术语″佐剂″指能够特异性或非特异性改变、增强、定向、再定向、加强或启动抗原特异性免疫应答的任何物质或组合物。

术语“佐剂”包括但不限于：细菌ADP-核糖基化外毒素，生物活性因子，免疫调节分子，生物效应调节物或免疫刺激分子如细胞因子、白介素、趋化因子或配体或表位(如辅助性T细胞表位)及其任选组合，相对于仅给予抗原或抗原组合后产生的CMI应答，与佐剂与该抗原一起给予时，抗原组合物或编码所述抗原的核苷酸序列提高或加强或调节CMI应答。佐剂可以是本领域已知适合人用和动物用的任何佐剂。

免疫调节分子如细胞因子(TNF-α、IL-6、GM-CSF和IL-2)以及共同刺激和辅助分子(B7-1、B7-2)可以各种组合用作佐剂。在一个实施方式中，在给药方案之前、期间或之后不将GM-CSF给予对象。在表达感兴趣抗原的位点，同时产生感兴趣的免疫调节分子和抗原可提高特异性效应器的产生(可帮助增强CMI应答)。CMI应答的增强程度可依赖于所用的特定免疫刺激分子和/或佐剂，因为不同免疫刺激分子可引发不同机制来增强和/或调节CMI应答。例如，不同效应器机制/免疫调节分子包括但不限于增加辅助信号(IL-2)、征集专门的APC(GM-CSF)、增加T细胞频率(IL-2)、影响抗原加工途径和MHC表达(IFN-γ和TNF-α)以及将免疫应答从Th1应答转移到Th2应答(LTB)(参见WO 97/02045)。含有寡核苷酸的去甲基化CpG(参见WO 96/02555)也是Th1应答的优选诱导物，并且适合用于本发明。

不受限于理论，包括佐剂是有益的，因为佐剂能通过将Th2应答转移到Th1应答而有助于增强对表达的抗原的CMI应答和/或对表达的表位的特异性效应器相关机制，然后产生并维持增强的CMI应答(参见例如，WO 97/02045的内容)。

抗原或编码该抗原的核苷酸序列中包含佐剂也是有益的，因为这可使得在给予抗原或编码该抗原的核苷酸序列的对象中获得所需CMI应答所必需的抗原/抗原组合的剂量较低或给药次数较少，或者这可定性和/或定量地导致对象的免疫应答不同。可同时将佐剂与抗原或仅将抗原给予动物并用本领域熟知的标准测定如放射性免疫测定、ELISA、CD8+T细胞测定等比较这两组的抗体和/或细胞介导的免疫，从而测定佐剂的有效性。通常，佐剂是与抗原分离的部分，但单个分子(例如CTB)可同时具有佐剂和抗原特性。

本文所用术语″遗传佐剂″指核苷酸序列编码的佐剂，相对于仅给予抗原后产生的CMI应答，与该抗原与佐剂一起给予时，该佐剂能增强CMI应答。

细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明佐剂。该蛋白质优选获自大肠杆菌(E.Coli)(即大肠杆菌热不稳定性肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。

在一个优选实施方式中，该遗传佐剂是细菌ADP-核糖基化外毒素。

ADP-核糖基化细菌毒素是相关细菌外毒素的一个家族，包括白喉毒素(DT)，百日咳毒素(PT)，霍乱毒素(CT)，大肠杆菌热不稳定性毒素(LT1和LT2)，假单胞菌内毒素A，假单胞菌外毒素S，蜡状芽孢杆菌(B.cereus)胞外酶，球形芽孢杆菌(B.sphaericus)毒素，肉毒梭菌(C.botulinum)C2和C3毒素，泥渣梭菌(C.limosum)胞外酶，以及来自产气荚膜梭菌(C.perfringens)、螺状梭菌(C.spiriforma)和艰难梭菌(C.difficile)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)EDIN和ADP-核糖基化细菌毒素突变体如CRM₁₉₇、无毒白喉毒素突变体的毒素(参见例如，Bixler等(1989)Adv.Exp.Med.Biol. 251：175；和Constantino等(1992)Vaccine)。大多数ADP-核糖基化细菌毒素组织为A:B多聚体的形式，其中A亚基具有ADP-核糖基转移酶活性，B亚基用作结合部分。优选用于本发明组合物的ADP-核糖基化细菌毒素包括霍乱毒素和大肠杆菌热不稳定性毒素。

霍乱毒素(CT)和相关的大肠杆菌热不稳定性肠毒素(LT)是各自肠毒性菌株的分泌产物，它们是强效免疫原，全身、口腔或粘膜给予时具有强毒性。已知CT和LT通过肌肉内或口服途径给予时能为抗原提供佐剂作用。在毒性所需剂量以下观察到这些佐剂作用。这两种毒素是极其相似的分子，在氨基酸水平上至少约70-80％同源。

遗传佐剂优选为霍乱毒素(CT)、产肠毒素大肠杆菌的热不稳定性毒素(LT)或保持佐剂性质的CT或LT的衍生物、亚基或片段。在更优选的实施方式中，该遗传佐剂是LT。在另一优选实施方式中，该遗传佐剂可以是CTB或LTB。

肠毒素优选为无毒性肠毒素。

WO 95/17211中描述了用解毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂，WO98/42375描述了将其用作胃肠道外佐剂。毒素或类毒素优选为包含A和B亚基的全毒素形式。A亚基优选含有解毒突变；B亚基优选未突变。佐剂优选为解毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LTR192G。将ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，具体是LT-K63和LT-R72用作佐剂的应用可参见以下参考文献(特别将各文献全文纳入本文作为参考)(Beignon等，Infection and Immunity(2002) 70(6)：3012-3019；Pizza等，Vaccine(2001) 19：2534-2541；Pizza等，Int.J.Med.Microbiol(2000) 290(4-5)：455-461；Scharton-Kersten等，Infection and Immunity(2000) 68(9)：5306-5313；Ryan等Infectionand Immunity(1999) 67(12)：6270-6280；Partidos等，Immunol.Lett.(1999) 67(3)：209-216；Peppoloni等，Vaccine(2003)2(2)：285-293；和Pine等，J.Control Release(2002)85(1-3)：263-270)。氨基酸取代的数字编号优选基于特别以全文纳入本文作为参考的Domenighini等，Mol.Microbiol(1995) 15(6)：1165-1167列出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基的比对。

还例如，可对至少一个肠毒素亚基编码区进行遗传修饰以使其编码的亚基肽解毒，例如对截短的A亚基编码区进行遗传修饰以破坏或失活该亚基肽表达产物的ADP-核糖基转移酶活性(参见例如，WO 03/004055)。

因此，这些结果证明，当需要更强的CMI应答时尤其需要这种遗传佐剂。其它需要的遗传佐剂包括但不限于：编码IL-10、IL-12、IL-13、干扰素(IFN)(如IFN-α、IFN-ss和IFN-γ)及其优选组合的核苷酸序列。本领域技术人员不难选择增强CMl应答的其它这种生物活性因子，用已知技术就能构建含有所述核苷酸序列的合适质粒载体。

优选的其它佐剂包括但不限于：一种或多种以下所列物质：

含有矿物质的组合物

适合用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括无机盐如铝盐和钙盐。本发明包括无机盐如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等。{参见例如参考文献Bush和Everett(2001)Int J Syst Evol Microbiol 51：203-220的第8章和第9章}，或不同无机化合物的混合物，这些化合物取任何合适形式(如凝胶、结晶、无定形等)，优选具有吸附特性。含有矿物质的组合物也可制成金属盐颗粒。参见WO 00/23105。

本发明的免疫原性组合物和/或疫苗中可包括铝盐，使Al³⁺的剂量为每剂0.2-1.0mg。

佐剂优选为明矾，优选铝盐如氢氧化铝(Al0H)或磷酸铝或硫酸铝。佐剂更优选为氢氧化铝(AlOH)。

无机盐如铝盐优选与另一种佐剂如含有CpG基序的寡核苷酸或ADP核糖基化毒素混合。无机盐更优选与含有CpG基序的寡核苷酸混合。

油乳剂

适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括鲨烯-水乳剂如MF59(5％鲨烯，0.5％吐温80和0.5％Span 85，用微量流化床制成亚微米颗粒)。参见WO90/14837。也参见Frey等，“比较以MF59-为佐剂的流感疫苗和无佐剂的流感疫苗在非老年成年人中的安全性、耐受性和免疫原性”(Comparison of the safety，tolerability，andimmunogenicity of a MF59-adjuvanted influenza vaccine and a non-a djuvanted influenzavaccine in non-elderly adults)，Vaccine(2003) 21：4234-4237。MF59在FLUADTM流感病毒三价亚基疫苗中用作佐剂。

用于本发明组合物的尤其优选的佐剂是亚微米水包油乳剂。本发明所用的优选亚微米水包油乳剂是任选含有不同量的MTP-PE的鲨烯/水乳剂，如亚微米水包油乳剂含有4-5％w/v鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80^TM(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)和/或0.25-1.0％Span 85^TM(山梨糖醇酐三油酸酯)，和任选的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基(phosphophoryloxy))-乙胺(MTP-PE)，例如，称为″MF59″的亚微米水包油乳剂(国际公开号WO 90/14837；美国专利号6,299,884和6,451,325，全文纳入本文作为参考；和Ott等，“MF59-人疫苗的安全强效佐剂的设计和评价”(MF59-Design and Evaluationofa Safe and Potent adjuvant for Human Vaccine)《疫苗设计：亚基和佐剂策略》(VaccineDesign：The Subunit and Adjuvant Approach)(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)PlenumPress，New York，1995，277-296页)。MF59含有4-5％w/v鲨烯(如4.3％)、0.25-0.5％w/v吐温80^TM和0.5％w/v Span 85^TM，并任选地含有不同量的MTP-PE，用微量流化床如110Y型微量流化床(Microfluidics，Newton，MA)制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE的用量可以是约0-500μg/剂，更优选0-250μg/剂，最优选0-100μg/剂。本文所用术语″MF59-0″指不含MTP-PE的上述亚微米水包油乳剂，而术语MF59-MTP指含有MTP-PE的制剂。例如，″MF59-100″每剂含有100μgMTP-PE，等等。本发明所用的另一种亚微米水包油乳剂MF69含有4.3％w/v鲨烯、0.25％w/v吐温80^TM和0.75％w/vSpan 85^TM和任选的MTP-PE。另一种亚微米水包油乳剂是MF75，也称为SAF，它含有10％鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，也微流化成亚微米乳剂。MF75-MTP指包含MTP如每剂100-400μgMTP-PE的MF75制剂。

以全文纳入本文作为参考的国际公开号WO 90/14837和美国专利号6,299,884和6,451,325详述了用于本发明组合物的亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂如胞壁酰肽。完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可用作本发明佐剂。

皂角苷制剂

皂角苷制剂也可用作本发明佐剂。皂角苷是在大量植物种的皮、叶、茎、根甚至花中发现的固醇苷和三萜苷的杂合基团。广泛地研究了作为佐剂的来自莫利那(Molina)皂树树皮的皂角苷。皂角苷也可来自购得的丽花菝葜(smilax ornata)(菝葜)、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂角苷佐剂剂型包括纯化剂型如QS21，以及脂质剂型如ISCOM。用高效薄层层析(HP-LC)和反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化了皂角 苷组合物。用这些方法鉴定了获得的特定纯化组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂角苷优选是QS21。美国专利号5,057,540中揭示了生产QS21的方法。皂角苷制剂也可包含固醇，如胆固醇(参见W0 96/33739)。

可用皂角苷和胆固醇的组合形成独特的颗粒，称为免疫刺激复合物(ISCOM)。ISCOM一般也包括磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂角苷都可用于ISCOM。ISCOM优选包括Quil A、QHA和QHC的一种或多种。EPO109942、WO 96/11711和WO 96/33739中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOMS可不含附加去垢剂。参见W O00/07621。

基于皂角苷的佐剂的开发的综述见Barr等，Advanced Drug DeliveryReviews(1998)32：247-271。也参见Sjolander等，Advanced Drug DeliveryReviews(1998)32：321-338。

D.病毒体和病毒样颗粒(VLP)

病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明佐剂。这些结构通常含有任选地与磷脂组合或配制的来自病毒的一种或多种蛋白。它们通常是非致病性、不复制的，一般不含有任何天然病毒基因组。病毒蛋白可重组生产，或分离自完整病毒。这些适合用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括来源于流感病毒(如HA或NA)、乙型肝炎病毒(如核心或衣壳蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳突瘤病毒、HIV、RNA噬菌体、QB噬菌体(如包被蛋白)、GA噬菌体、fr噬菌体、AP205噬菌体和Ty(如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白。WO 03/024480、WO 03/024481和Niikura等，Virology(2002)293：273-280；Lenz等，Journal of Immunology(2001)5246-5355；Pinto等，Journal of InfectiousDiseases(2003)188：327-338；和Gerber等，Journal of Virology(20(01)75(10)：4752-4760中进一步讨论了VLP。例如在Gluck等，Vaccine(2002)20：B10-B16中进一步讨论了病毒体。

细菌或微生物衍生物

适合用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如：

肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物

这种衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基化的MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基化的单磷酰基脂质与4、5或6酰基化链的混合物。EP 0689 454中揭示了3脱-O酰基化的单磷酰基脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”很小，足以通过0.22微米膜过滤除菌(参见EP 0689454)。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物例如RC-529。参见Johnson等(1999)Bioorg Med Chem Lett 9：2273-2278。

脂质A衍生物

脂质A衍生物包括来自大肠杆菌如OM-174的脂质A的衍生物。例如，Meraldi等，Vaccine(2003)21：2485-2491；Pajak等，Vaccine(2003)21：836-842中描述了OM-174。

免疫刺激性寡核苷酸

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含非甲基化胞嘧啶，然后是鸟苷并通过磷酸键连接的序列)的核苷酸序列。含有回文或多(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也已显示具有免疫刺激。

CpG可包括核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸修饰，它可以是双链或单链的。任选地，可用类似物如2’-脱氧-7-脱氮鸟苷代替鸟苷。参见Kandimalla等，NucleicAcidsResearch(2003)31(9)：2393-2400；WO 02/26757和WO 99/62923提出可能的类似物取代的例子。Krieg，Nature Medicine(2003)9(7)：831-835；McCluskie，等，FEMSImmunology and Medical Microbiology(2002)32：179-185；WO 98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116和美国专利号6,429,199中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂效果。

CpG序列可能导向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kalman等(1999)(Nature Genetics 21：385-389)。CpG序列可对诱导Th1免疫应答特异，如CpG-AODN，或它可对诱导B细胞应答更特异，如CpG-B ODN。Blackwell等，J.Immunol.(2003)170(8)：4061-4068；Krieg BBRC(2003) 306：948-953和WO 01/95935中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。

优选的是，构建CpG寡核苷酸使其5′端能够被受体识别。任选地，两个CpG寡核苷酸序列可在它们的3’端连接，形成“免疫聚体(immunomer)”。参见例如Kandimalla等(2003)31(第3部分)：664-658；Bhagat等BBRC(2003) 300：853-861和WO 03/035836。

佐剂优选是CpG。佐剂更优选是明矾和含有CpG基序的寡核苷酸或AlOH和含有CpG基序的寡核苷酸。

人用免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人用免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物。

细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明佐剂。该蛋白优选来源于大肠杆菌(即大肠杆菌热不稳定性肠毒素“LT”)、霍乱(″CT″)或百日咳(″PT″)。W0 95/17211中描述了将解毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，W0 98/42375中将其用作胃肠道外佐剂。佐剂优选是解毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LTR192G。在下面的参考文献中可以发现将ADP-糖基化毒素及其解毒衍生物，具体是LT-K63和LT-R72用作佐剂，各自特别以整体纳入本文作为参考：Beignon等，“大肠杆菌的热不稳定性肠毒素的LTR72突变体提高了肽抗原在共同应用于裸露皮肤后引发CD4+T细胞和分泌γ干扰素的能力(The LTR72 mutant of Heat-Labile Enterotoxin ofEscherichia Coli Enahnces the Ability of Peptide antigen to Elicit CD4+T Cells andSecrete Gamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin)”，Infection andImmunity(2002)70(6)：3012-3019；Pizza等，“粘膜疫苗：LT和CT的无毒衍生物用作粘膜佐剂(Mucosal vaccines：non toxic derivatives of LT and CT as mucosaladjuvants”，Vaccine(2001)19：2534-2541；Pizza等，“LTK63和LTR72，两种准备进行临床试验的粘膜佐剂(LTK63 and LTR72，two mucosal adjuvants ready for clinicaltrials)”Iht.J.Med.Microbiol(2000)290(4-5)：455-46l；Scharton-Kersten等，“用细菌ADP-核糖基化肠毒素、亚基和不相关佐剂进行经皮免疫(Transcutaneous Immunizationwith Bacterial ADP-Ribosylaing Exotoxins，Subunits and Unrelated adjuvants)”，Infection and Immunity(2000)68(9)：5306-5313；Ryan等，“大肠杆菌热不稳定性毒素的突变体用作有效的粘膜佐剂以经鼻递送非细胞百日咳疫苗：Th1和Th2细胞中无毒AB复合物和酶活性的不同效果(Mutants of Escherichia Coli Heat-Labile Toxin Act asEffective Mucosal A djuvants for Nasal Delivery of an Acellular Pertussis Vaccine：Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity on Th1 and Th2Cells)”Infection and Immunity(1999)67(12)：6270-6280；Partidos等，“大肠杆菌的热不稳定性肠毒素及其定位突变体LTK63提高增殖和细胞毒性T细胞对鼻内共同免疫的合成肽的反应(Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia Coli and its site-directed mutantLTK63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cell responses to intranasallyco-immunized synthetic peptide)”，Immunol.Lett.(1999)67(3)：209-216；Peppoloni等，“大肠杆菌热不稳定性肠毒素的突变体作为安全和强效佐剂用于鼻内递送疫苗(Mutants of the Escherichia Coli Heat-Labile Enterotoxin as safe and strong adjuvants forintranasally delivery of vaccines)”，Vaccines(2003)2(2)：285-293；和Pine等，(2002)“用流感疫苗和来自大肠杆菌(LTK63)的热不稳定性肠毒素的解毒突变体鼻内免疫(Intranasal immunization with influenza vaccine and a detoxified mutant of heat-labileenterotoxin from Escherichia Coli(LTK63))”J.Control Release(2002)85(1-3)：263-270。氨基酸取代的数值编号优选基于特别以整体引入本文作为参考的Domenighini等，Mol.Microbiol(1995)15(6)：1165-1167中所列的ADP核糖基化毒素的A和B亚基的序列对比。

佐剂优选是ADP核糖基化毒素和含有CpG基序的寡核苷酸(参见例如，WO01/34185)。

佐剂优选是解毒的ADP核糖基化毒素和含有CpG基序的寡核苷酸。

解毒的ADP核糖基化毒素优选是LTK63或LTK72。

佐剂优选是LTK63。佐剂优选是LTK72。

佐剂优选是LTK63和含有CpG基序的寡核苷酸。

佐剂优选是LTK72和含有CpG基序的寡核苷酸。

生物粘合剂和粘液粘合剂

生物粘合剂和粘液粘合剂也可用作本发明佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化透明质酸微球(Singh等(2001)J.Cont.Rele.70：267-276)，或粘液粘合剂如聚丙烯酸的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明佐剂。参见例如W0 99/27960。

微粒

微粒也可用作本发明佐剂。优选由可生物降解和无毒的材料(如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等)和聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微粒(即直径～100纳米至～150微米的颗粒，更优选直径～200纳米至～30微米，最优选直径～500纳米至～10微米)，任选地处理使其具有负电的表面(如用SDS)或带正电的表面(如用阳离子去垢剂如CTAB)。

脂质体

美国专利号6,090,406、美国专利号5,916,588和EP 0626169中描述了适合用作佐剂的脂质体剂型的例子。

聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯剂型

适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯(W0 99/52549)。这些剂型还包括与辛苯昔醇组合的聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂(WO 01/21207)以及与至少一种附加非离子表面活性剂如辛苯昔醇组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO 01/21152)。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂基醚(月桂基醇聚氧乙烯9醚)，聚氧乙烯-9-硬脂酰醚，聚氧乙烯-8-硬脂酰醚，聚氧乙烯-4-月桂基醚，聚氧乙烯-35-月桂基醚，和聚氧乙烯-23-月桂基醚。

聚磷腈(PCPP)

例如，Andrianov等，Biomaterials(1998)19(1-3)：109-115和Payne等，Adv.Drug.Delivery Review(1998)31(3)：185-196中描述了PCPP剂型。

胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。

咪唑喹诺酮(Imidazoquinolone)化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑喹诺酮化合物的例子包括米喹莫特(Imiquamod)及其同系物，Stanley,“米喹莫特和咪唑喹诺酮：作用机制和治疗潜力”(Imiquimod and theimidazoquinolones：mechanism of action and therapeutic potential)Clin ExpDermatol(2002)27(7)：571-577和Jones，雷西喹莫特3M(“Resiquimod 3M”)，Curr OpinInvestig Drugs(2003)4(2)：214-218中作了进一步描述。

本发明也可包含一种或多种上述佐剂的组合。例如，本发明可使用下述佐剂组成：

(1)皂角苷和水包油乳剂(W0 99/11241)；

(2)皂角苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)(参见W0 94/00153)；

(3)皂角苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；

(4)皂角苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+固醇)(W0 98/57659)；

3dMPL与，例如QS21和/或水包油乳剂的组合(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；

(5)SAF，含有10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳剂或涡旋产生较大粒度的乳剂。

(6)Ribi^TM佐剂体系(RAS)，(RibiImmunochem)含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，该组分选自单磷酰基脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；和

一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dPML)；

(7)3dMPL与，例如QS21和/或水包油乳剂的组合(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；

(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dPML)；和

(9)一种或多种无机盐(如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(如包括CpG基序的核苷酸序列)。

铝盐和MF59是优选的胃肠道外免疫佐剂。突变的细菌毒素是优选的粘膜佐剂。细菌毒素和生物粘合剂是用于粘膜递送疫苗如鼻疫苗的优选佐剂。

本组合物可包含抗生素。

本发明组合物优选与明矾和/或CpG序列一起给予。

核酸

本发明中抗原或表位可以编码抗原或表位的核苷酸序列的形式给药。本文所用术语“核苷酸序列”指编码用于本发明组合物或组合的一种或多种表位的一种或多种核苷酸序列。术语“核苷酸序列(NOI)”为″多核苷酸″或“核酸”的同义词。NOI可为基因组或合成或重组来源的DNA或RNA。NOI可为双链或单链，无论其代表正义链或反义链或其组合。某些应用中，NOI优选为DNA。某些应用中，优选利用DNA重组技术制备NOI(如重组DNA)。某些应用中，NOI优选为cDNA。某些应用中，优选与天然存在形式相同的NOI。

术语“核酸”包括DNA和RNA及其类似物，如包含修饰的主链(如硫代磷酸酯等)，和肽核酸(PNA)等。本发明包括那些包含与上述序列互补的序列的核酸(如用于反义或探测目的)。

可以多种方式制备本发明核酸(如化学合成、来源于基因组或cDNA文库、来源于生物体本身等)，并且可以取不同形式(如单链、双链、载体、探针等)。优选制备基本纯净的形式(即基本不含其他衣原体或宿主细胞核酸)。

本发明提供了生产本发明核酸的方法，包括利用基于引物的扩增方法(如PCR)来扩增核酸的步骤。

本发明提供了生产本发明核酸的方法，包括利用化学方法来合成至少部分核酸的步骤。

载体

在本发明的一个实施方式中，可直接将抗原或抗原组合或编码它们的NOI给予宿主对象。在本发明的另一个实施方式中，将包含NOI的载体给予宿主对象。优选用遗传载体制备和/或给予NOI。如本领域所熟知，载体是允许或有助于实体从一个环境转移到另一环境的工具。依照本发明，例如，为了复制包含本发明NOI的载体和/或表达该NOI编码的本发明抗原或表位，用于重组DNA技术的一些载体允许将实体，如DNA节段(如异源DNA节段，如异源cDNA节段)转移到宿主和/或靶细胞中。用于重组DNA技术的载体例子包括但不限于：质粒、染色体、人造染色体或病毒。术语“载体”包括表达载体和/或转化载体。术语“表达载体”指能够在体内和或体外/离体表达的构建物。术语“转化载体”指能够由一个物种转移到另一物种的构建物。

裸露DNA

包含本发明NOI的载体可直接以“裸露核酸构建物”的形式给药，优选还包含与宿主细胞基因组同源的侧翼序列。本文所用术语″裸露DNA″指包含本发明NOI和用以控制其产生的短启动子区的质粒。称之为“裸露”DNA是因为质粒不由任何递送载体携带。当此类DNA质粒进入宿主细胞如真核细胞时，其编码的蛋白在胞内被转录并翻译。

病毒载体

或者，利用本领域所知的各种病毒技术，如利用重组病毒载体如逆转录病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒进行感染，可将包含本发明NOI的载体引入合适的宿主细胞。载体可为重组病毒载体。合适的重组病毒载体包括但不限于：腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、痘病毒载体或细小病毒载体(参见Kestler等，1999 Human Gene Ther 10(10)：1619-32)。在病毒载体的情况下，通过病毒感染靶细胞介导NOI给药。

靶载体

术语“靶载体”指一种载体，其感染或转染或转导细胞或在宿主和/或靶细胞中表达的能力仅限于宿主对象的某些细胞类型，通常这些细胞具有共同或相似的表型。

表达载体

插入载体的本发明NOI优选操作性连接于能使宿主细胞表达所述抗原或表位的控制序列，即载体为表达载体。根据NOI和/或所用载体，宿主细胞产生的物质可被分泌或包含在细胞内。如本领域技术人员所理解，包含NOI的表达载体经设计可含有信号序列，该信号序列能指导通过特定的原核或真核细胞膜分泌EOI。

融合蛋白

本发明使用的肺炎衣原体抗原可作为单独分离多肽存在于组合物中，但优选至少两(即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个抗原表达为同一条多肽链(‘杂交’多肽)。杂交多肽有两个主要优点：第一，可通过加入合适的杂交伴侣来帮助自身不稳定或表达差的多肽克服该问题；第二，由于为生产两个抗原性有用的多肽仅需使用一次表达和纯化，所以简化了商业制造。

杂交多肽可包含两种或多种来自第一抗原组的多肽序列。因此，本发明包括含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的组合物，其中所述第一和第二氨基酸序列选自衣原体菌，优选第一抗原组的肺炎衣原体抗原或其片段。杂交多肽中第一和第二氨基酸序列优选包含不同表位。

杂交多肽可包含来自第二抗原组的两种或多种多肽序列。因此，本发明包括含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的组合物，其中所述第一和第二氨基酸序列选自第二抗原组的肺炎衣原体或其片段。杂交多肽中的第一和第二氨基酸序列优选包含不同表位。

杂交多肽可包含来自第一抗原组的一种或多种多肽序列和来自第二抗原组的一种或多种多肽序列。因此，本发明包括含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的组合物，所述第一氨基酸序列选白第一抗原组的肺炎衣原体抗原或其片段，所述第二氨基酸序列选自衣原体菌，优选第二抗原组的肺炎衣原体抗原或其片段。杂交多肽中的第一和第二氨基酸序列优选包含不同表位。

杂交多肽可包含来自第一抗原组的一种或多种多肽序列和来自第三、或第四、或第五、或第六、或第七、或第八、或第九、或第十抗原组的一种或多种多肽序列。因此，本发明包括含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的组合物，其中所述第一氨基酸序列选自第一抗原组的肺炎衣原体抗原或其片段，所述第二氨基酸序列选自第三、或第四、或第五、或第六、或第七、或第八、或第九、或第十抗原组的肺炎衣原体抗原或其片段。杂交多肽中的第一和第二氨基酸序列优选包含不同表位。

杂交多肽可包含来自第二抗原组的一种或多种多肽序列和来自第三、或第四、或第五、或第六、或第七、或第八、或第九、或第十抗原组的一种或多种多肽序列。因此，本发明包括含有第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的组合物，其中所述第一氨基酸序列选自第二抗原组的肺炎衣原体抗原或其片段，所述第二氨基酸序列选自第三、或第四、或第五、或第六、或第七、或第八、或第九、或第十抗原组的肺炎衣原体抗原或其片段。杂交多肽中的第一和第二氨基酸序列优选包含不同表位。

优选由来自两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种肺炎衣原体抗原的氨基酸序列组成的杂交体。具体说，优选由来自两种、三种、四种或五种肺炎衣原体抗原的氨基酸序列组成的杂交体。不同的杂交多肽可混合于单一制剂中。在这些组合中，肺炎衣原体抗原可出现在一种以上杂交多肽中和/或作为非杂交多肽出现。然而，抗原优选以杂交体或非杂交体形式出现，但不以两种形式存在。

本发明所用双抗原杂交体可包括任一上述组合。

杂交多肽可由式NH₂-A-{-X-L-}_n-B-COOH代表，其中：X是来自第一 、第二、或第三、或第四、或第五、或第六、或第七、或第八、或第九、或第十抗原组的肺炎衣原体抗原或其片段的氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N-末端氨基酸序列；B是任选的C-末端氨基酸序列；n是2、3、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。

如果-X-部分的野生型形式中具有先导肽序列，这可在杂交蛋白中包括或省去。在一些实施方式中，先导肽会缺失，除非-X-部分位于杂交蛋白的N末端，即X₁的先导肽将被保留，但X₂...X_n的先导肽将被省去。这相当于缺失所有先导肽，将X₁的先导肽用作-A-部分。

在{-X-L-}的各个n情况下，可以存在或不存在接头氨基酸序列-L-。例如，当n＝2时，杂交体可以是NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH，NH₂-X₁-X₂-COOH，NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH，NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH等。接头氨基酸序列-L-一般较短(如20个或更少的氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有助于克隆的短肽序列、多甘氨酸接头(即包含Gly_n，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)和组氨酸标记(即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合适的接头氨基酸序列对于本领域技术人员是显而易见的。一个有用接头是GSGGGG(SEQ ID 77)，从一个BamHI限制性位点形成了Gly-Ser二肽，从而有助于克隆和操作，(Gly)₄四肽是典型的多甘氨酸接头。

-A-是任选的N-末端氨基酸序列。它一般较短(如40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、2 1、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白运输的先导序列，或有助于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标记即His_n，其中＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合适的N-末端氨基酸序列对于本领域技术人员是显而易见的。如果X₁缺少其自身的N末端甲硫氨酸，-A-优选为提供N末端甲硫氨酸的寡肽(如具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)。

-B-是任选的C-末端氨基酸序列。它一般较短(如40个或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白运输的序列、有助于克隆或纯化的短肽序列(如包含组氨酸标记即His_n，其中＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)或提高蛋白稳定性的序列。其它合适的C-末端氨基酸序列对于本领域技术人员是显而易见的。最优选n是2或3。

本发明还提供编码本发明杂交多肽的核酸。而且，本发明提供优选在“高度严格”条件下(如65℃，在0.1xSSC，0.5％SDS溶液中)可与此核酸杂交的核酸。

本发明NOI可表达为融合蛋白，其包含与本发明抗原和/或表位融合以进一步提高或增加获得的CMI应答的佐剂和/或生物反应改良剂和/或免疫调节剂。生物反应改良剂在普遍刺激CMI应答的意义上可用作佐剂。抗原或表位可连接于生物改良剂的氨基或羧基末端。

制备方法

本发明多肽可通过各种方法(如重组表达、从细胞培养物中纯化、化学合成等)并以不同形式(如天然、融合、非糖基化、脂化形式等)制备。优选制备成基本纯净的形式(即基本不含其它衣原体或宿主细胞蛋白质)。

本发明还提供了生产本发明多肽的方法，包括在诱导多肽表达的条件下培养转化有本发明核酸的宿主细胞的步骤。本发明提供了生产本发明多肽的方法，包括以化学方法合成至少部分多肽的步骤。本发明还提供了根据本发明生产组合物的方法，包括将SEQ ID 1-86中的一个或多个与SEQ ID 1-86中的另外一个或多个组合的步骤。

菌株

本发明多肽优选包含在肺炎衣原体血清变型或一种或多种流行病学上常见的血清变型中发现的氨基酸序列。当使用杂交多肽时，杂交体内的单个抗原(如单个-X-部分)可来自一种或多种菌株。例如当n＝2时，X₂可与X₁来自同一菌株或不同菌株。当n＝3  时，该菌株可为(i)X₁＝X₂＝X₃(ii)X₁＝X₂≠X₃(iii)X_i≠X₂＝X₃(iv)X₁≠X₂≠X₃或(v)X₁＝X₃≠X₂等。

异源宿主

虽然本发明多肽可在衣原体中表达时，但本发明优选利用异源宿主。异源宿主可为原核(如细菌)或真核。优选大肠杆菌(大肠杆菌)，但其它合适宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cineria)、分枝杆菌(Mycobacteria)(如结核分支杆菌(Mtuberculosis))、酵母等。

可在相关国际申请如WO 00/37494、WO 02/02606和WO 03/049762和WO03/068811中找到有关如何产生和利用组成SEQ ID 1-86的分子的细节，这些细节无需在此重复。当组合物包含以不同的初生和成熟形式存在的蛋白时，优选成熟形式的蛋白。例如，可用缺少信号肽的肺炎衣原体蛋白成熟形式。

给药

通常将本发明组合物直接给予病人。可通过胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或注入组织的间质间隙)，或经直肠、口腔(如片剂、喷雾剂)、阴道、局部、透皮(参见例如WO 99/27961)或经皮(参见例如WO 02/074244和WO 02/064162)、鼻内(参见例如WO 03/028760)、眼、耳、肺或其他粘膜给药完成直接递送。本发明可用于引发全身性和/或粘膜免疫。

可通过各种不同途径将本发明组合物单独或作为组合物的一部分给予对象。为了产生更有效的免疫应答，优选CMI应答，或为了降低诱发副作用的可能，或为了易于给药，某些组合物可能优选某些途径。

例如，可通过全身性途径、或粘膜途径、或透皮途径给予本发明组合物，或者可直接给予特定组织。本文所用术语“全身性给药”包括但不限于胃肠道外给药途径。具体说，胃肠道外给药包括但不限于：皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内或胸内注射，静脉内、动脉内或肾透析输注技术。全身性胃肠道外给药优选为肌肉内注射。

在该方法的一个优选实施方式中，通过透皮途径给予本发明组合物。虽然相信可采用任何接受的免疫方式和途径，且用这些方式和途径获得了一些优点，但以下实施例证明透皮NOI给药特别有好处。在此方面，不受限于理论，相信可优选透皮给予组合物，因为它能更有效地激活免疫系统的细胞介导免疫(CMI)部分。

术语“透皮”递送指皮内(如进入真皮或表皮)、透皮(如“经皮”)和透粘膜给药，即通过使药物通过或进入皮肤或粘膜组织来递送。参见例如，《透皮药物递送：发展问题和研究起点》(Transdermal Drug Delivery ： Developmental Issues and ResearchInitiatives)，Hadgraft and Guy(编)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；《控制药物递送：基础和应用》(Controlled Drug Delivery：Fundamentals and Applications)，Robinson和Lee(编)，Marcel Dekker Inc.,(1987)；和《透皮药物递送》(Transdermal Delivery ofDrugs)，第1-3卷，Kydonieus和Berner(编)，CRC Press，(1987)。因此，该术语包括用如美国专利号5,630,796所述的颗粒递送装置(如无针注射器)递送药物，以及用如美国专利号5,865,796所述的颗粒介导的递送装置递送。

本文所用术语“粘膜给药”包括但不限于：口腔、鼻内、阴道内、直肠内、气管内、肠内和眼内给药。

优选通过粘膜途径，具体是鼻内、气管内和眼内途径对天然暴露于环境病原体如RSV、流感病毒和感冒病毒或者变应原如草和豚草花粉和屋尘螨产生保护。免疫应答优选CMI应答的增强将增强对后来遇到的靶抗原如变应原或微生物物质的保护作用。

在本发明的另一优选实施方式中，可将本发明组合物给予分离自宿主对象的细胞。在此优选实施方式中，优选将该组合物给予专门的抗原递呈细胞(APC)，如树突细胞。APC可获自宿主对象，经离体修饰使其表达感兴趣抗原，然后将其转移回宿主对象内以诱导增强的CMI应答。相信树突细胞是刺激增强CMI应答的最有效APC，因为必须获得、加工感兴趣抗原的表达表位并由专门APC递呈到T细胞(Th1和Th2辅助细胞以及CD8+T细胞)，以诱导增强的CMI应答。

颗粒给药

本领域已知递送本发明组合物的颗粒介导的方法。因此，一旦制备并合适地纯化后，可用本领域已知的各种技术将上述抗原或编码它的NOI涂覆在核心运载体颗粒上。运载体颗粒选自在由基因枪设备进行细胞内递送的一般粒度范围中的、密度合适的材料。当然，最优运载体粒度将取决于靶细胞的直径。

“核心运载体”指涂覆有外来抗原或外来核酸(如DNA、RNA)的运载体，目的是赋予确定的粒度以及足够高的密度以获得穿透细胞膜所需的动力，以便可用颗粒介导的技术递送该外来分子(参见例如，美国专利号5,100,792)。核心运载体一般包括材料如钨、金、铂、铁素体、聚苯乙烯和胶乳。参见例如，Particle BombardmentTechnology for Gene Transfer，(1994)Yang，N.编，Oxford University Press，New York，NY，10-11页。优选钨和金颗粒。容易获得的钨颗粒的平均直径是0.5-2.0微米。金颗粒或微晶金(如金粉A1570，购自Engelhard Corp.，East Newark，NJ)也可用于本发明。金颗粒提供的大小一致(购自Alpha Chemicals，粒度为1-3微米，或购自Degussa，South Plainfield，NJ，粒度范围包括0.95微米)。微晶金提供不同的粒度分布，一般在0.5-5微米的范围中。然而，微晶金的不规则表面积提供了高度有效的核酸涂覆性能。已知并已描述了将NOI涂覆或沉淀在金或钨颗粒上的许多方法。大部分这些方法一般包括预定量的金或钨与质粒DNA、CaCl₂和亚精胺混合。在涂覆过程中连续涡旋得到的溶液以保证反应混合物的均一性。沉淀NOI后，可将涂覆的颗粒转移到合适的膜上并使其干燥待用，涂覆在样品模块或盒的表面上，或者装载到递送盒中用于特定基因枪设备。

用与剂型相容的方式将该颗粒组合物或涂覆颗粒给予个体，其用量能有效实现本发明目的。递送的组合物量(如约0.1mg-1mg，更优选1-50μg抗原或过敏原)取决于受试个体。所需的准确量因受试个体的年龄和总体状况而变化，本领域技术人员在阅读本说明书后不难确定合适的有效量。

宿主哺乳动物对象

本文所用术语“宿主哺乳动物对象”指cordata亚门的任何成员，包括但不限于：人和其它灵长类，包括非人灵长类如黑猩猩和其它猿和猴种类；家畜如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养动物如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养、野生和捕猎鸟类如鸡、火鸡和其它鸡形目鸟类、鸭、鹅等。该术语不指具体年龄。因此，旨在覆盖成年和新生个体。本文所述方法旨在用于任何上述脊椎动物种类，因为所有这些脊椎动物的免疫系统的运作方式相似。如果是哺乳动物，该对象优选是人，但也可以是家畜、实验室对象或玩赏动物。

哺乳动物优选为人。当疫苗作预防性使用时，人优选为儿童(如初学走路的儿童或婴儿)或青少年；当疫苗作治疗性使用时，人优选为青少年或成年人。用于儿童的疫苗也可给予成年人，如用于评价安全性、剂量、免疫原性等。

预防和/或治疗

本发明也提供本发明组合物在制造刺激哺乳动物的免疫应答的药物中的应用。该药物优选为疫苗，(本发明也涉及)制备预防和/或治疗与衣原体菌相关的疾病的疫苗。应理解，本发明所提到的所有治疗包括治愈性、缓解性和预防性治疗。

给予本发明抗原组合或包含编码抗原组合的NOI的组合物的目的可以是“预防”或“治疗”。本文所用术语“治疗性”或“治疗”包括以下含义：预防感染或再感染；减轻或消除症状；和减少或完全清除病原体。治疗可起预防性(感染前)或治疗性(感染后)作用。

预防或疗法包括但不限于：引发有效的免疫应答，优选CMI免疫应答和/或缓解、减轻、治愈或至少部分停滞由T细胞介导的免疫失调产生的症状和/或并发症。当用于预防性目的时，一般在产生任何症状之前提供本发明组合物。预防性给予本发明组合物是为了预防或改善任何后续的感染或疾病。当用于治疗性目的时，一般在感染或疾病的症状开始(或开始后不久)时提供本发明组合物。因此，可在预期暴露于疾病引发物质之前、或疾病状态中、或感染或疾病开始后提供本发明组合物。

预防或治疗性给予(单独或作为组合物的一部分)哪个更合适通常取决于疾病性质。例如，本发明的免疫治疗组合物可用于免疫治疗方案，以通过接种疫苗主动诱导免疫。优选后一种治疗形式，因为它延长了免疫。另一方面，疫苗组合物优选(但不必须)用于预防，以诱导有效的CMI应答来对抗与靶抗原相关的随后遇到的抗原或其部分(如表位)。

这些应用和方法优选用于预防和/或治疗衣原体引起的疾病(如沙眼、盆腔炎疾病、附睾炎、婴儿肺炎、动脉硬化、心血管疾病等)。该组合物也可有效对抗肺炎衣原体。

预防或治疗或免疫有效量

在本发明内容中，给予宿主对象的组合物剂量应该足以在对象中随时间产生有益的预防性或治疗性免疫应答，优选CMI应答。

本发明也提供了一种刺激哺乳动物的免疫应答的方法，该方法包括给予有效量的本发明组合物的步骤。免疫应答优选为保护性的，并优选包括抗体和/或细胞介导的免疫。该方法可产生加强应答。

本文所用术语“预防或治疗有效剂量”指足以引发对一种或多种抗原或表位的增强的免疫应答，优选CMI应答和/或缓解、减轻、治愈或至少部分停滞由T细胞介导的免疫失调产生的症状和/或并发症的剂量。

用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及所需的任何其它组分。‘免疫有效量’指向个体以单剂量或作为一系列剂量的一部分给予该量，能够有效治疗或预防。此量随待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类学地位(如非人灵长类、灵长类等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗剂型、治疗医生对医学状况的评价和其它相关因素而改变。预计该量将属于可通过常规试验确定的相对宽的范围中。

哺乳动物优选为人。当疫苗作预防性使用时，人优选为儿童(如初学走路的儿童或婴儿)或青少年；当疫苗作治疗性使用时，人优选为青少年或成年人。用于儿童的疫苗也可给予成年人，如用于评价安全性、剂量、免疫原性等。人优选为青少年。人更优选为青春期前的青少年。人更优选为青春期前的女性或男性。青春期前的男性或女性优选约为9-12岁。

评价本发明免疫原性组合物的蛋白组分的免疫原性的一种方式是重组表达该蛋白并通过免疫印迹或通过蛋白质或DNA微阵列筛选患者血清或粘膜分泌物。该蛋白和患者血清之间发生阳性反应表明该患者之前对所述蛋白产生过免疫应答-即，该蛋白是免疫原。该方法也可用于鉴定免疫优势蛋白。

检查治疗性治疗的效力的一种方式包括给予本发明组合物后监测衣原体感染。检查预防性治疗的效力的一种方式包括给予本发明组合物后监测对本发明组合物中的衣原体抗原如肺炎衣原体抗原的免疫应答。例如，检查预防性治疗的效力可包括给予本发明组合物后监测对本发明组合物中肺炎衣原体抗原的全身性免疫应答(如监测产生IgG1和IgG2a的水平)和粘膜免疫应答(如监测产生IgA的水平)。一般在免疫后刺激前测定血清衣原体特异性抗体应答，而在免疫后和刺激后测定粘膜衣原体特异性抗体应答。

这些应用和方法优选用于预防和/或治疗肺炎衣原体引起的疾病(如肺炎、支气管炎、咽炎、鼻窦炎、结节性红斑、哮喘、动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞、冠心病等)。

在给予宿主如人之前，可在体外和体内动物模型中评价本发明疫苗组合物。例如，Peterson等(1988)的体外中和适合用于测定涉及衣原体、优选肺炎衣原体的疫苗组合物。

这种体外检测的一个例子如下所述。将超免疫抗血清稀释在含有5％豚鼠血清的PBS中，作为补充来源。将肺炎衣原体(10⁴IFU；包含体形成单位)加入该抗血清稀释液。将此抗原-抗体混合物在37℃赋予孵育45分钟，接种到铺满Hep-2或HeLa细胞单层的两个玻璃瓶(如15×45mm)中，在接种前用PBS洗涤玻璃瓶两次。通过1000×g离心1小时、然后在37℃静置孵育1小时感染单层细胞。将感染的单层孵育48或72小时，固定，并用衣原体特异性抗体，如抗-MOMP染色。在200X放大的10个视野中计数携带包含体的细胞。中和滴度指定为与对照单层/IFU相比产生50％抑制的稀释度。

也可通过用免疫原性组合物体内刺激肺炎衣原体感染的动物模型(如豚鼠或小鼠)来测定免疫原性组合物的效力。免疫原性组合物可以或可以不衍生自与刺激性血清变型相同的血清变型。免疫原性组合物优选衍生自与刺激性血清变型相同的血清变型。本发明血清变型更优选获自临床分离物或或培养物保藏中心如美国组织培养物保藏中心(ATCC)。

体内效力模型包括但不限于：(i)采用人肺炎衣原体血清型的鼠感染模型：(ii)鼠疾病模型，它是一种鼠模型，采用小鼠-适应性肺炎衣原体菌株，如肺炎衣原体小鼠肺炎(MoPn)菌株也称为小鼠肺炎衣原体(Chlamydia muridarum)；和(iii)采用人肺炎衣原体分离物的灵长动物模型。MoPn菌株是小鼠病原体，而人肺炎衣原体血清型是人病原体(参见例如，Brunham等(2000)J Infect Dis 181(Suppl3)S538-S543；Murdin等(2000)J Infect Dis 181(增刊3)S544-S551和Read等(2000)NAR 28(6)；1397-1406)。如实施例所证明，人肺炎衣原体血清型可用于小鼠模型，但它们通常需要大量接种或用孕酮预处理。通常采用孕酮是因为它似乎能使上皮更易于感染衣原体(参见Pal等，2003 Vaccine 21：1455-1465)。另一方面，认为最初分离自小鼠组织的MoPn是天然的鼠病原体，因此为宿主-病原体相互作用的分析提供了进化上适应的病原体。虽然认为MoPn血清变型与人衣原体血清变型具有高度DNA同源性，它也可具有一些独特的特性(参见例如，Pal等(2002)Infection and Immunity 70(9)；4812-4817。

例如，可在肺炎衣原体的鼠模型中进行体内疫苗组合物刺激研究(Morrison等1995)。此类方法的一个例子如下所述。7-12周龄的雌性小鼠在阴道感染的10天和3天前皮下接受2.5 mg狄波普维拉。接种疫苗后，用5ml蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐缓冲液pH7.4中所含的1,500包含体形成单位的肺炎衣原体感染小鼠的生殖道。通过以下方法监测感染过程：用肺炎衣原体特异性抗血清通过间接免疫荧光测定携带包含体的细胞的百分数，或者采用从感染小鼠生殖道刮下的物质的吉姆萨染色涂片。用酶联免疫吸附试验测定小鼠血清中存在的抗体滴度。可用许多不同的免疫途径，例如但不限于：肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、鼻内(i.n.)、皮下(s.c)或经皮(t.c)途径给予本发明免疫原性组合物。通常，可采用任何给药途径，只要能在所需粘膜表面或表面上实现所需免疫应答。同样，可通过许多不同途径给予刺激性血清变型。一般通过粘膜给予刺激性血清变型，例如但不限于鼻内(i.n.)刺激。

或者，体内效力模型包括豚鼠模型。例如，可在肺炎衣原体感染的豚鼠模型中进行体内疫苗组合物刺激研究。以下描述了这种方法的一个例子。在12小时光照-黑暗循环的环境控制室内饲养重450-500g的雌豚鼠，通过各种免疫途径用疫苗组合物进行免疫。疫苗接种后，用在HeLa或McCoy细胞中产生的豚鼠包含体结膜炎(GPIC)试剂感染豚鼠的生殖道(Rank等(1988))。各动物接受0.05ml蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐缓冲液pH7.4中所含的约1.4×10⁷包含体形成单位(IFU)(Schacter，1980)。通过以下方法监测感染过程：用GPIC特异性抗血清通过间接免疫荧光测定携带包含体的细胞的百分数，或者采用从生殖道刮下的物质的吉姆萨染色涂片(Rank等1988)。用酶联免疫吸附试验测定血清中的抗体滴度。

本发明组合物通常直接给予患者。可通过以下方式完成直接递送：胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、或注射到组织间隙)，或通过粘膜如直肠、口腔(如片剂、喷雾剂)、阴道、局部、透皮(参见例如WO 99/27961)或经皮(参见例如WO 02/074244和WO 02/064162)、鼻内(参见例如WO 03/028760)、眼内、耳内、肺部或其它粘膜给药。

剂量

可通过在一个时间点或多个时间点上单一直接给药完成预防或治疗。也可给予一个或多个部位。一些给药途径，如通过滴眼剂粘膜给药可能需要较高剂量。本领域技术人员可调节剂量和浓度以适应具体的递送途径。

剂量治疗可以是一次剂量方案或多次剂量方案。多次剂量可用于初级免疫方案和/或加强免疫方案。在多次剂量方案中，可通过相同或不同途径如胃肠道外致敏和粘膜加强，粘膜致敏和胃肠道外加强等给予各种剂量。

同源物

可用包含与SEQ ID NO 1-86同源(即共享序列相同性)的序列的分子补充或取代本发明组合物中的SEQ ID 1-86。

用于本发明的蛋白(包括蛋白抗原)(如NOI编码的蛋白)可能与天然产生形式具有同源性和/或序列相同性。能够表达这些蛋白的编码相似的序列通常与天然产生序列具有同源性和/或序列相同性。测定核酸和氨基酸″序列相同性″的技术也是本领域已知的。这些技术一般包括测定某基因的mRNA的核苷酸序列和/或测定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二种核苷酸或氨基酸序列比较。

通常，″相同性″指两个多核苷酸或多肽序列的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸分别准确对应。可通过测定″相同性百分数″比较两个或多个序列(多核苷酸或氨基酸)。两个序列的相同性百分数(无论核酸或氨基酸序列)是这两个比序列之问准确匹配的数目除以较短序列的长度并乘以100。

通过Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics2：482-489(1981)的局部同源性算法对核酸序列进行大约比对。通过采用Dayhoff，Atlas of ProteinSequence and Structure，M.O.Dayhoff编，增刊5，3：353-358，国家生物医学研究基金会(National Biomedical Research Foundation)，Washington，D.C.，USA开发的评分矩阵，并用Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763 1986)标准化，此算法可应用于氨基酸序列。Genetics Computer Group(Madison，WI)在″最佳拟合″实际应用中示范性执行此算法以测定序列相同性百分数。本方法的默认参数参见Wisconsin序列分析程序包手册，第8版(1995)(购自Genetics Computer Group，Madison，WI)。在本发明中确立相同性百分数的优选方法是采用爱丁堡大学享有版权、John F.Collins和Shane S.Sturrok开发、IntelliGenetics，Inc分销的MPSRCH程序包。(Mountain View，CA)。通过此程序包，可使用Smith-Waterman算法，将默认参数用于计分表(例如，缺口开口罚12分，缺口延伸罚1分，一个缺口 6分)。通过产生的数据，“匹配”值反映了″序列相同性″。通常，本领域已知计算序列之间的相同性或相似性百分数的其它合适程序，例如，另一比对程序是BLAST，使用默认参数。例如，可采用BLASTN和BLAST，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝双链；截止值＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；分选标准＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详细内容可参见以下互联网网址： http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。

或者，可通过以下方法测定同源性：在能在同源区之间形成稳定双链体的条件下杂交多核苷酸，然后用单链特异性核酸酶消化，测定消化片段的大小。如上述方法所测定，当该分子的确定长度上序列的序列相同性至少约为80％-85％，优选至少约为90％，最优选至少约为95％-98％时，两个DNA或两个多肽序列互相″基本同源″。

本文所用基本同源或同源也指与特定DNA或多肽序列完全相同的序列。可在Southern杂交实验中，以(例如)为该特定系统定义的严格条件下，鉴定基本同源或同源的DNA序列。例如，严格的杂交条件可包括50％甲酰胺，5×Denhardt’s溶液，5×SSC，0.1％SDS和100pg/ml变性的鲑鱼精子DNA，洗涤条件可包括2×SSC，0.1％SDS，37℃，然后是1×SSC，0.1％SDS，68℃。本领域技术人员能够确定合适的杂交条件。

相同性程度优选大于50％(如65％、80％、90％或更高)，包括突变体和等位基因变体。优选用MPSRCH程序(Oxford.Molecular)中执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，采用仿射缺口搜索(参数：缺口开口罚分＝12，缺口延伸罚分＝1)确定蛋白质的序列相同性。

可用与衣原体核酸(优选在″高度严格的″条件(65℃，0.1×SSC，0.5％SDS溶液)下)杂交的核酸补充或取代本发明组合物中的SEQ ID 1-86，。

假拟蛋白

本文所用术语“假拟蛋白”指没有已知细胞位置或已知细胞功能的蛋白质。假拟蛋白一般不与已知的良好表征的蛋白显著同源。

组合物

本发明也提供用作药物(如免疫原性组合物或疫苗)或用于检测宿主对象的衣原体感染的诊断试剂的本发明组合物。本发明也提供了该组合物在制备以下药物或试剂中的应用：(i)治疗或预防肺炎衣原体菌引起的感染的药物：(ii)检测肺炎衣原体菌或对肺炎衣原体菌产生的抗体的存在的诊断试剂；和/或(iii)可产生对肺炎衣原体菌的抗体的试剂。

本发明也提供了治疗患者的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的本发明组合物。

本发明提供了可用于预防和/或治疗T细胞介导的免疫失调的组合物。在一个实施方式中，该组合物是药物组合物。在另一优选实施方式中，该组合物是免疫治疗组合物。在又一优选实施方式中，该组合物是疫苗组合物。该组合物也可包含运载体如药学上或免疫学可接受的运载体。药学上可接受的运载体或免疫学可接受的运载体部分地由给予的具体组合物以及用于给予该组合物的具体方法决定。因此，本发明的药物组合物或疫苗组合物或免疫治疗组合物有各种合适剂型。

免疫原性组合物和药物

本发明组合物优选免疫原性组合物，更优选疫苗组合物。该组合物的pH优选为6-8，优选约7。可用缓冲液维持该pH。该组合物可以是无菌和/或无热原的。该组合物可以与人体等渗。

本发明疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)的，但一般是预防性的。因此，本发明包括治疗性或预防性治疗易于感染衣原体的动物的肺炎衣原体感染的方法，该方法包括给予所述动物治疗或预防量的本发明免疫原性组合物。该免疫原性组合物优选包含肺炎衣原体抗原组合，所述组合选自第一抗原组的两种、三种、四种、五种或所有六种肺炎衣原体抗原。该组合更优选由第一抗原组的所有六种肺炎衣原体抗原组成。

或者，该免疫原性组合物包含肺炎衣原体抗原组合，所述组合选自第一抗原组和第二抗原组的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种肺炎衣原体抗原。所述组合优选选自第二抗原组的三种、四种或五种肺炎衣原体抗原。所述组合更优选由第二抗原组的五种肺炎衣原体抗原组成。

或者，该免疫原性组合物包含肺炎衣原体抗原组合，所述组合选自第一抗原组的两种、三种、四种或五种肺炎衣原体抗原和第三抗原组的一种、两种、三种、四种、五种或六种肺炎衣原体抗原。所述组合优选由第一抗原组的三种、四种或五种肺炎衣原体抗原和第三抗原组的一种、两种、三种、四种、五种或六种肺炎衣原体抗原组成。

或者，该免疫原性组合物包含肺炎衣原体抗原组合，所述组合选自第一抗原组和第二抗原组的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种肺炎衣原体抗原和第三抗原组的一种、两种、三种、四种、五种或六种肺炎衣原体抗原。所述组合优选选自第二抗原组的三种、四种或五种肺炎衣原体抗原和第三抗原组的三种、四种或五种肺炎衣原体。所述组合更优选由第二抗原组的五种肺炎衣原体抗原和第三抗原组的三种、四种或五种肺炎衣原体抗原组成。

在某些实施方式中，该组合物包含来自不同衣原体种类的分子。在一些实施方式中，该组合物可包含来自相同衣原体种类的不同血清组和/或菌株的分子。另一些实施方式包含来自不同菌株的一种或多种衣原体分子的混合物。

在沙眼衣原体和肺炎衣原体的不同种类、血清组和菌株之间许多蛋白相对保守。为保证最大的跨菌株识别和反应性，在不同衣原体种类、血清组和菌株之间保守的蛋白区域可用于本发明组合物。因此，本发明提供的蛋白质包含大部分衣原体菌株共有的氨基酸序列片段。因此，该组合物优选包含含有肺炎衣原体蛋白片段的蛋白质(优选为来自SEQ ID NO 1-86的蛋白，或更优选来自SEQ ID NO 1-41，其中所述片段由n个连续的保守氨基酸组成。

其它抗原

除沙眼衣原体之外，本发明组合物还可包含来自一种或多种性传播疾病的抗原。抗原优选来源于一种或多种下述性传播疾病：淋球奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae){如¹、²、³、⁴}；人乳突瘤病毒；梅毒密螺旋体(Treponema)；单纯疱疹病毒(HSV-1或HSV-2)；HIV(HIV-1或HIV-2)和杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)。

优选的组合物包含：(1)至少t个来自第一抗原组或第二抗原组的肺炎衣原体抗原，其中t是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13，t优选是五；(2)一种或多种来自另一性传播疾病的抗原。性传播疾病优选选自单纯疱疹病毒，优选HSV-1和/或HSV-2；人乳突瘤病毒；淋球奈瑟氏菌；梅毒密螺旋体和杜氏嗜血菌。因此，这些组合物可提供防止感染下述性传播疾病的保护：衣原体、生殖器疱疹、生殖器疣、淋病、梅毒和软下疳(参见Stephens等(1998)Science 282：754-759)。

当使用糖或糖抗原时，优选将其偶联于载体蛋白，以提高免疫原性(参见例如Ramsay等(2001)Lancet 357(9251)：195-196；Lindberg(1999)Vaccine 17增刊2：S28-36；Buttery和Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34：163-168；Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13：113-133；Goldblatt(1998)J.Med.Microbio1.47：563-567；欧洲专利0477508；美国专利号5,306,492；国际专利申请WO98/42721；《偶联疫苗》(Coniugate Vaccines)(Cruse等编)ISBN 3805549326，具体是第10卷：48-114；和Hermanson(1996)《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)ISBN：0123423368或012342335X)。

优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。尤其优选CRM₁₉₇白喉类毒素(Research Disclosure，453077(2002年1月))。其它载体多肽包括脑膜炎奈氏球菌外膜蛋白(EP-A-0372501)、合成肽(EP-A-0378881和EP-A-0427347)、热激蛋白(WO 93/17712和WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668和EP-A-0471177)、来自流感嗜血菌的蛋白D(参见WO 00/56360)、细胞因子(WO 91/01146)、淋巴因子、激素、生长因子、来自艰难梭菌(C.Difficile)的毒素A或B(参见WO 00/61761)、摄铁蛋白(WO 01/72337)等。当混合物包含来自血清型A和C的荚膜糖时，MenA糖：MenC糖的比例(w/w)可优选大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。可将不同糖偶联到相同或不同类型的载体蛋白上。需要时，可以任何合适接头采用任何合适的偶联反应。

需要时，可解毒毒蛋白抗原，如通过化学和/或遗传方法解毒百日咳毒素。当组合物中包括白喉抗原时，也优选包括破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，当包括破伤风抗原时，也优选包括白喉和百日咳抗原。类似地，当包括百日咳抗原时，也优选包括白喉和破伤风抗原。

组合物中各抗原存在的浓度一般至少是1微克/毫升。通常，任何给定抗原的浓度足以引发抗该抗原的免疫应答。作为在本发明组合物中使用蛋白抗原的替代方法，也可使用编码抗原的核酸，参见例如Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology9：271-283；Donnelly等(1997)Annu Rev Immunol 15：617-648；Scott-Taylor和Dalgleish(2000)Expert Opin Investig Drugs 9：471-480；Apostolopoulos 和Plebanski(2000)Curr Opin Mol Ther 2：441-447；llan(1999)Curr Opin Mol Ther1：116-120；Dubensky等(2000)Mol Med 6：723-732；Robinson和Pertmer(2000)Adv VirusRes 55：1-74；Donnelly等(2000)Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2)：S190-193和Davis(1999)Mt.SinaiJ.Med.66：84-90。因此，可用编码某蛋白的核酸(优选DNA，例如质粒形式的DNA)替代本发明组合物的某蛋白组分。

疾病状况

本发明组合物可用于预防和/或治疗以下疾病，例如但不限于：肺炎、心血管疾病、动脉粥样硬化、支气管炎、咽炎、喉炎、鼻窦炎、阻塞性肺病、哮喘、慢性阻塞性肺病、活动性关节炎、中耳炎、腹主动脉瘤、结节性红斑、莱特尔综合征、结节病、阿耳茨海默病、多发性硬化、性病淋巴肉芽肿、沙眼、盆腔炎疾病、包涵体性结膜炎、生殖器沙眼衣原体感染、婴儿肺炎、早期沙眼、角膜炎、乳突状肥大、角膜浸润、外阴阴道炎、粘脓性鼻炎、输卵管炎、宫颈炎、宫颈滤泡、前列腺炎、直肠炎、尿道炎、腹股沟淋巴肉芽肿、气候性腹股沟淋巴结炎、热带腹股沟淋巴结炎和/或女阴蚀疮。

制剂

衣原体感染影响身体的各个区域，因此可将本发明组合物制备成各种形式。例如，该组合物可制备成注射剂(液体溶液或悬液)。也可制备成适合于注射前在液体载体中形成溶液或悬液的固体形式(如冻干组合物)。可将该组合物制备成用于局部给药的形式，如软膏、乳膏或粉末。可将该组合物制备成用于口服给药的形式，如片剂或胶囊、喷雾或糖浆(任选调味)。可将该组合物制备成用于肺部给药的形式，如采用细粉或喷雾的吸入器。可将该组合物制备成栓剂或阴道栓。可将该组合物制备成用于鼻内、耳内或眼内给药的形式，如滴剂。该组合物可以设计为药盒形式，以使混合的组合物在给予患者之前重建。这种药盒可包含液体形式的一种或多种抗原和一种或多种冻干抗原。

组合物的其它组分

除上述组分外，本发明组合物一般包含一种或多种‘药学上可接受的载体’，包括本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载体，合适载体一般是大的、代谢慢的大分子，如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(如油液滴或脂质体)。本领域技术人员熟知这些载体。疫苗也可包含稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。在Gennaro(2000)《雷明顿：药剂学的科学和实践》(Remington：TheScience and Practice of Pharmacy)第20版，ISBN：0683306472中充分讨论了药学上可接受的赋形剂。

可将本发明生物分子配制到药物组合物或免疫治疗组合物或疫苗组合物中。这种剂型包含生物分子，以及药学上可接受的运载体，如无菌水或无菌等渗盐水。可以适合推注给药或连续给药的形式制备、包装或出售这种制剂。可以单位剂型，如在含有防腐剂的安瓿或多剂量容器中制备、包装或出售可注射剂型。剂型包括但不限于：悬浮剂、溶液剂、油性或水性载体中的乳剂、贴剂和可植入的缓释或可生物降解的剂型。这种剂型还可包含一种或多种附加成分，包括但不限于：悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于胃肠道外给药的剂型的一个实施方式中，以干燥形式(如粉末或颗粒)提供活性成分，在胃肠道外给予该组合物之前以合适的载体(如无菌无热原的水)重建。可以无菌可注射水性或油性悬液或溶液的形式制备、包装或出售该药物组合物。可根据本领域已知知识配制此悬液或溶液，该溶液或悬液中除了活性成分以外还可包含额外成分，如本文所述的分散剂、湿润剂或悬浮剂。可用无毒的胃肠道外-可接受的稀释剂或溶剂，如水或1，3-丁二醇制备这种无菌可注射剂型。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于：林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发性油如合成的甘油单酯或甘油二酯。其它有用的可胃肠道外给予的剂型包括所含活性成分是微晶形式、在脂质体制剂中或作为可生物降解的聚合物体系的剂型。用于缓释或植入的组合物可包含药学上可接受的聚合材料或疏水材料，如乳剂、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶的盐。

试剂盒

本发明也包括用于增强对本发明生物分子的CMI应答的试剂盒。这种试剂盒可包含抗原组合物或编码它的核苷酸序列。该试剂盒也可包含佐剂和如何给予该生物分子的说明书，所述佐剂优选可与生物分子一起给药或作为生物分子的一部分的遗传佐剂。该试剂盒的其它优选组件包括给予该生物分子的施放器。本文所用术语″施放器″指任何装置，包括但不限于皮下注射器，基因枪，颗粒加速装置，喷雾器，点滴器，支气管镜，栓剂，浸渍或涂渍的阴道插入型材料如棉条，灌洗制剂，阴道冲洗溶液，保留灌肠制剂，栓剂，或者用于冲洗直肠或结肠的溶液，以给宿主对象全身或粘膜或透皮施用NOI。

本发明也提供了包含肺炎衣原体抗原组合的试剂盒。该肺炎衣原体抗原组合可以是一种或多种本发明免疫原性组合物。该试剂盒还可包含第二种组件，该组件包括以下组件的一种或多种：说明书、注射器或其它递送装置、佐剂或药学上可接受的配制溶液。本发明也提供预先装满本发明免疫原性组合物的递送装置。

实施例

现仅以举例的方式参照附图进一步描述本发明。提出以下实施例仅为了说明本发明，并且帮助本领域普通技术人员制备和使用本发明。这些实施例许不打算以任何方式限制本发明范围。努力保证所用数字的准确性(如数量、温度等)，但是当然应该允许试验误差和偏差。

图1A.利用重组衣原体蛋白的多克隆小鼠抗血清检测体外中和肺炎衣原体对LLC-MK2细胞的感染性的试验。当用抗血清处理的感染性EB感染单层时，获得与未处理EB给出的包含体数目相比，包含体数目降低的结果。降低百分数与相应血清稀释度的倒数作图。对于每个稀释度，用预免疫血清的相应稀释度中观察到对感染性的背景抑制修正包含体计数。该图显示了用连续稀释的抗“中和”抗原 “非中和性”FACS-阳性抗原(v)和仅用于融合构建物的GST多肽(σ)的抗体获得的结果。

图1B显示中和本文所述十种肺炎衣原体重组抗原50％感染性所用的血清滴度。各滴度由三次独立试验评价(显示了SEM值)。

图2显示了免疫印迹分析，即用本文所述免疫血清获得的肺炎衣原体EB的二维电泳图。免疫印迹获自两块EB凝胶中的任一块(顶部的图A和B)，它们覆盖了不同的pH间隔，因此这两块凝胶使我们能够最佳地检测给定抗原。HtrA免疫印迹中的箭头指具有凝胶中的相应染色点(图A中的箭头)的信号，对其进行MALDI-TOF鉴定。HtrA印迹中的这两种模式都提示典型的电泳‘串’由同一蛋白的单电荷变体组成。

图3显示由经全身刺激的免疫和模拟物免疫的仓鼠的等量脾样品中回收的肺炎衣原体IFU平均数。在柱上表示出标准差。在诱导显著保护的抗原的相应柱上用星形特别标注。所有抗原都用弗氏佐剂递送。n.i.＝未免疫的对照

图4显示DNA免疫的HLA-A2转基囚和非转基因小鼠脾细胞的流式细胞术分析。用50μg表达肺炎衣原体低钙效应蛋白H的质粒DNA肌肉内免疫4只小鼠的组3次。在用肽CH-6(10μg/ml)刺激(pulse)6小时(离体)或6天(再刺激)后监测脾细胞产生的IFN-γ。用LSRII FACS系统(Becton Dickinson)获得数量相等的门控活淋巴细胞，用DIVA软件(Becton Dickinson)计算产生IFN-γ的CD8⁺T细胞的百分数。

图5显示感染肺炎衣原体EB的转基因和非转基因小鼠脾细胞的流式细胞术分析。(A)用5×10⁵肺炎衣原体FB/96 EB鼻内感染HLA-A2转基因小鼠两次，在相关肽存在下刺激脾细胞6天，然后测定CD8⁺T细胞产生的IFN-γ，如图4的图例中所述。(B)用相同的EB制剂一起转染HLA-A2转基因和非转基因小鼠，对CD8⁺T细胞进行FACS分析，如(A)所述。

表1显示了本文所述肺炎衣原体抗原的数据和特性的小结。报告的中和滴度是在体外感染性试验中使包含体数目减少50％的抗血清稀释度的倒数。对于仓鼠模型数据而言，用双尾斯氏t检验评价结果的统计学意义：用星号特别标出显著性数据(p≤0.05)。ND＝未检测。

表2显示了假拟蛋白的仓鼠模型研究结果。

表3显示了用微阵列选出的CPn EB的表达基因。

表4显示了肺炎衣原体选择肽：蛋白质来源和HLA-A2稳定试验。

表5显示了用DNA免疫的HLA-A2转基因小鼠的CD8+T细胞进行的ELISPOT试验。

表6显示DNA免疫的HLA-A2转基因和非转基因小鼠的脾细胞产生的IFN-γ。

方法和材料(实施例1-4)(参见参考文献部分1)

肺炎衣原体EB纯化

在接种到六孔塑料板各孔中的LLC-MK2细胞中培养获自意大利博洛尼亚的Sant’Orsola综合性医院的肺炎患者的临床分离物-肺炎衣原体FB/96(7)。感染后72小时用无菌橡皮(sterile rubber)收获细胞，超声破碎细胞，如(26)所述用梯度离心纯化原生小体(EB)。将纯化的衣原体重悬于蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)转运缓冲液，以0.5ml等份储存，-80℃待用。需要时，可在储存前通过在56℃孵育3小时使EB感染性热失活。

表达和纯化重组蛋白

用PCR将选自肺炎衣原体CWL029基因组序列(16)的开放阅读框(ORf)克隆入质粒表达载体，从大肠杆菌培养物中纯化，基本如以前所述(25)。在大肠杆菌BL21(Novagen)中用pGEX-KG衍生载体(12)获得作为GST融合蛋白的重组衣原体蛋白。设计PCR引物以扩增没有N-末端信号肽编码序列的基因。当信号肽或加工位点不能明确地预测时，如Kalman和同事(16)所述克隆ORF序列。在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(500ml)中培养重组大肠杆菌细胞，在37℃培养至OD₆₀₀＝0.5，然后用1mM IPTG诱导。诱导3小时后通过离心收集细胞，在French Press(SLMAminco，Rochester，NY)中破碎。30,000g离心后，将上清上到谷胱甘肽琼脂糖4B柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，用50mM Tris-HCl，10mM还原性谷胱甘肽，pH8.0洗脱柱上结合的蛋白质。用Bradford法测定样品中的蛋白质浓度。

制备小鼠抗血清

在第1天用溶于完全弗氏佐剂(CFA)中的20μg蛋白腹膜内免疫4只5/6-周龄CD1雌性小鼠(Charles River，Como，Italy)的组，在第15天和第28天用溶于不完全弗氏佐剂(IFA)中的20μg重组蛋白加强免疫。从第0天、第27天和第42天收集的血样制备免疫前血清和免疫血清。为了减少污染的大肠杆菌抗原可能引起的抗体量，将免疫血清与硝酸纤维素条带4℃孵育过夜，该条带吸附大肠杆菌BL21的总蛋白提取物。

流式细胞术测定

基本如前所述(25)进行分析。将肺炎衣原体FB/9的梯度纯化的、热灭活的EB(2×10₅细胞)重悬于磷酸盐水缓冲液(PBS)，0.1％牛血清白蛋白(BSA)中，与特异性小鼠抗血清(标准稀释1∶400)4℃孵育30分钟。离心后，用200μl PBS-0.1％BSA洗涤，将该样品与山羊抗小鼠IgG 4℃孵育30分钟，该抗体是与R-藻红蛋白偶联的F(ab)’2-特异性抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.)。用PBS-0.1％BSA洗涤样品，重悬于150μl PBS-0.1％BSA，用FACSCalibur设备(Becton Dickinson，Mountain View，CA)进行流式细胞术分析。类似地制备对照样品。阳性对照抗体是：i)市售的抗肺炎衣原体特异性单克隆抗体(Argene Biosoft，Varilhes，France)和，ii)用梯度纯化的肺炎衣原体EB免疫小鼠获得的小鼠多克隆血清。背景对照血清获自用融合构建物所用的纯化GST肽免疫的小鼠(GST融合物对照)。用Cell Quest软件(Becton Dickinson，Mountain View，CA)分析FACS数据。将背景对照图和免疫血清测定图之间的差异用作抗体结合于EB细胞表面的量度。在两个重叠图上进行Kolmorov-Smirnov(K-S)双样品测定(44)。D/s(n)值(两条曲线的不相似指数)报告为表1中的“K-S评分”。

免疫血清的2维Western印迹分析和质谱

用5mM Tris-HCl pH 7.5，0.1mM EDTA，10％甘油洗涤梯度纯化的肺炎衣原体EB，13000xg离心15分钟，将沉淀重悬于再膨胀溶液(7M尿素，2M硫脲，2％(w/v)CHAPS，(2％w/v)ASB14，2％(v/v)IPG缓冲液pH3-10NL，或pH4-7，2 mMTBP，65mM DTT)。蛋白样品(考马斯蓝染色的参比凝胶，200μg蛋白质；或者需要为免疫印迹进行加工的凝胶，20μg蛋自质)在Immobiline DryStrips(7cm，pH3-10NL，或pH4-7)上吸附过夜。用IPGphor等电聚焦单元(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)进行等电聚焦。如(15)所述使聚焦的条带平衡，并加在9-16.5％聚丙烯酰胺线性梯度凝胶(7×4cm，1.5 Mm厚)上，在Mini ProteanIII小室(Bio-Rad，Hercules，CA)中进行SDS-PAGE分离。凝胶用胶体考马斯蓝(Novex，San Diego，CA)染色(4)，用个人扫描仪SI(Molecular Dynamics)以12bit和50mm/像素扫描如此获得的蛋白质图。

对于Western印迹分析，用Protean III装置(BioRad，Hercules，CA)通过30伏过夜将2DE图中分离的蛋白质转移到硝酸纤维索膜上。膜用0.05％(w/v)CPTS(铜(II)酞菁-3，4’，4”，4-四磺酸四钠盐)的12mM HCl溶液染色，外围用8个印皮墨汁点标记，以锚定图像进行后续叠印和匹配。扫描和获得图像后，用0.5M NaHC0₃使膜脱色。与待分析小鼠血清(免疫前或特异性免疫血清，1∶1000稀释)一起孵育，然后与过氧化酶-偶联的抗-小鼠抗体(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)孵育。用PBS，0.1％吐温-20洗涤后，用Opti-4CN底物试剂盒(Biorad，Hercules，CA)显色，如上所述再次获得免疫染色点的图像。用计算机程序Image Master 2D Elite，4.01版(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)分析图像。如下所述叠印和匹配Western印迹膜和考马斯蓝染色的凝胶。首先，用外围标记点叠加CPTS-染色的膜图像和免疫染色的印迹图像。然后，用CPTS染色的CPn蛋白作为锚点将如此获得的加成图像与考马斯蓝染色的蛋白质图叠加。从用于蛋白质鉴定的制备凝胶上剪下考马斯蓝染色图上对应于印迹上的免疫染色点的区域。用真空离心干燥蛋白样品，在100mM碳酸氢氨溶液中用过量猪胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)37℃消化凝胶中的蛋白样品2小时。用Zip-Tip(Millipore，Bedford，MA)使胰酶肽脱盐并浓缩。直接用2，5-二羟基苯甲酸(5g/l)的50％乙腈、0.1％三氟乙酸溶液洗脱肽，并加到SCOUT 384孔锚定芯片多探针板(400um，Bruker Daltonics，Bremen，Germany)上。用Bruker Bifiex III衬质辅助激光解吸-电离-飞行时间(MALDI-TOF)装置获得图谱。得到的单一同位素峰的值可用于用Mascot软件进行数据库检索(32)，Mascot软件可在 http://www.matrixscience.com/网站上获得。

体外中和试验

对LLC-MK2(猕猴肾)上皮细胞培养物进行体外中和试验。用蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐缓冲液(SPG)连续4倍稀释小鼠免疫血清和相应的免疫前血清。全部EB的小鼠多克隆血清用作中和的阳性对照，而单独的SPG缓冲液用作中和的阴性对照(感染对照)。用SPG缓冲液稀释肺炎衣原体FB/96的纯化感染性EB，使其含有2.5×10⁷IFU/ml，将10μl EB悬液加入各血清稀释液中，使最终体积为100μl。使抗体-EB在缓慢摇动的平台上37℃相互作用30分钟。在24孔组织培养板中用100μl各样品的反应混合物接种经PBS洗涤的LLC-MK2汇合单层(各血清稀释液一式三份)，37℃805×g离心1小时。离心后，加入含有Earle盐、20％胎牛血清和1μg/ml环己酰亚胺的Eagle极限基础培养基。在37℃ 5％CO₂中孵育感染的培养物72小时。用甲醇固定该单层，用荧光素偶联的小鼠抗-衣原体单克隆抗体(Merifiuor Chlamydia，Meridian Diagnostics，Inc.)染色以检测衣原体包含体，以40X放大计数10视野/孔来定量。将由于EB与免疫血清的相互作用而对感染性的抑制计算为与SPG(仅缓冲液)/EB对照相比平均IFU数的降低百分数。在此计算中，用由于相应的免疫前小鼠血清对感染产生的背景抑制修正用免疫血清获得的IFU计数。根据一般实践，如果血清使感染性降低50％或更多，就认为该血清是“中和性的”。相应的中和滴度定义为观察到感染性降低50％时的血清稀释度。由各重组抗原的三次滴定试验计算测定的标准差(SEM)，从而评价试验的变化性，如图1B所示。

体内筛选

如前所述(34)，用全身感染的仓鼠模型进行体内评价。基本上，用感染性Cpn原生小体(EB)全身刺激先前用重组疫苗候选物免疫的成年(10-11周龄)Syrian仓鼠(Morini，S.PoloD’Enza，意大利)。通过测定从脾脏回收的活EB的水平，与未免疫动物相比来评价保护。用双尾斯氏t检验评价结果的统计学意义。

在第0、7和21天用重组抗原皮下免疫8只仓鼠的组，或仅用缓冲液免疫对照组。在各免疫中，注射了用弗氏完全佐剂(第一次剂量)和弗氏不完全佐剂(加强剂量)1∶1稀释的20μg蛋白。在感染后第35天，用氯胺酮麻醉仓鼠，腹膜内和鼻内各接种0.1ml肺炎衣原体EB悬液(1.0x10⁸)。感染7天后处死动物。称重脾脏，在研钵中匀浆，获得10％(重量/体积)在冰冷SPG缓冲液中的悬液。组织悬液在300×g4℃离心10分钟以去除粗碎片。将澄清的匀浆物(0.2ml)接种到种在24孔板塑料单孔中的LLC-MK2细胞上，一式两份，37℃孵育72小时，用丙酮固定，然后用免疫荧光显微镜检测并对每孔中衣原体包含体的数量计数。该方法经博洛尼亚大学的伦理委员会批准。

实施例1(体外研究)

根据体外中和特性筛选抗血清

在基因组范围内筛选可能位于肺炎衣原体细胞表面上的蛋白质后，我们最近报道了(25)53种重组衣原体抗原的抗血清在FACS试验中能够结合于衣原体细胞表面。为了检测一些FACS阳性抗原能否干扰EB的体外感染性，我们制备了抗重组FACS阳性阳原的小鼠抗血清，并评价各抗血清对于纯化的EB对LLC-MK2细胞单层的感染性的影响。首先，将感染性EB与抗血清一起孵育，然后用于感染24孔多孔滴定板中的细胞单层，类似地处理对照样品，其中EB：i)仅用缓冲液处理，或ii)用相同稀释的相应免疫前小鼠血清处理。

结果I

用此试验，迄今证明10个血清样品有效中和体外感染性的程度大于50％，如果具有这种特性，一般实践就将这种抗原称为“中和性”抗原(图1)。这10种血清是用衍生自以下肺炎衣原体基因的重组蛋白免疫小鼠获得的：

·pmp10和pmp2，编码多态性膜蛋白的异源性衣原体PMP家族的两个成员；

·artJ，编码氨基酸转运系统的推定胞外溶质(可能是精氨酸)结合蛋白；

·eno，编码与可在细菌表面上发现的细菌烯醇酶、糖酵解酶同源的蛋白；

·htrA，编码具有热激诱导的蛋白酶活性的推定侣伴蛋白；

·Cpn0301“假拟”基因，编码与细菌蛋白的ompH家族同源的蛋白，其中一些成员经证明是参与外膜生物合成的侣伴蛋白；

·两种Cpn-特异性“假拟”基因Cpn0795和Cpn0042；

·omcA，编码注释为外膜蛋白的7-9kDa蛋白；和

·atoS，转运系统的推定传感器成员。

如图1和表1所示，OmpH、烯醇酶和Cpn0795看来能诱导滴度最高的中和血清，滴度大于400。相反，Pmp2、ArtJ和Cpn0042诱导的滴度等于或小于100，而其余4种抗原Pmp10、HtrA、AtoS和OmcA显示的滴度居中。

实施例2(体内研究)

通过2D免疫印迹分析评价Cpn蛋白提取物的抗血清特异性

为了研究LLC-MK2细胞单层的体外感染中观察到的中和活性实际上是否由于抗体与选择的肺炎衣原体蛋白结合，而不是与其它抗原可能的交叉反应，我们通过EB蛋白的二维电泳图的免疫印记分析评价抗血清的特异性。

具体说，对EB总蛋白2D图中可见的六种抗原(Pmp2、Pmp10、Eno、ArtJ、HtrA和OmpH-样抗原)进行此分析(Montigiani等，2002 Infection and Immunity 70：368-379)。用两个不同的pH间隔(分别是pH3-10非线性，pH4-7)通过2D电泳分析EB总蛋白，因为以前有实验证明用一个而非另一个上述pH区间能更好地检测研究中的一些蛋白。在各pH间隔下平行运行四块凝胶。一块凝胶用考马斯蓝染色以使蛋白质点显色，将而其它凝胶印迹到硝酸纤维素滤膜上，并用所选血清之一以1000倍稀释染色。然后，将免疫染色印迹的图像 (图2，c-h)与相应的考马斯蓝染色的凝胶叠加，以鉴定与给定抗血清发生反应的点。剪下匹配的蛋白质点，通过加工用MALDI-TOF分析法来鉴定肽。

结果2

在所有六张图中，发现剪下的凝胶区域中免疫反应性蛋白种类含有预期的衣原体蛋白的肽。即使当该血清与一种以上电泳蛋白种类反应时，可在考马斯蓝染色2DE图中检测到的所有点的质谱总是与表现为多种电泳种类的同一多肽一致。

有趣的是，用HtrA抗血清获得的免疫印迹显示两组的4个点，在两个不同分子量处排列为两个典型的电泳‘串’。在考马斯蓝染色的凝胶上，可能鉴定到4个相应点，3个在较高的串中，1个在较低Mw组中。MS分析将它们都鉴定为Cpn HtrA基因的产物。有趣的是，较低Mwt种类缺失了在较高Mw点中检测到的3个N-术端胰酶肽，它们在ORF的最先100个氨基酸内。这些结果表明，HtrA可以完整htrA产物和缺少短N-末端肽的离散物质、也可能以一些翻译后加工的产物存在于EB蛋白样品中。

结果2的讨论

在基于多克隆抗体反应性的数据分析中，应该认为由于表位模拟产生的交叉反应总是难于避免。在此研究中通过2D免疫印迹和用质谱分析鉴定反应的电泳物质，解决了抗血清特异性的问题。此方法可能用于1O个抗血清中的6个，即与之前通过对肺炎衣原体EB蛋白2D电泳图的质谱(MALDI-TOF)分析鉴定的蛋白质相对应的抗血清(25，42)(表1和图2)。通过免疫印迹分析的结果最大程度减少不相关衣原体蛋白种类之间发生偶然性交叉反应的概率，上述结果显示图中约300个蛋白点中，与检测的抗血清反应的所有蛋白都与预期的抗血清特异性一致。显然，由于在2-D电泳期间构象表位通常丢失，所以在此类型的分析中不能排除结构依赖性交叉反应。

实施例3

在全身感染的仓鼠模型中体内评价体外中和性抗原

我们最近描述了全身肺炎衣原体感染的新型仓鼠模型，其中复制的衣原体通过巨噬细胞传播，并且在脾中累积(34)。因此，我们提出这样一个问题，即我们鉴定的体外中和抗原在此模型中是否也具有体内保护活性。为此，用10种体外中和重组抗原在3周期间3次皮下注射免疫8只仓鼠，两周后用2×10⁸Cpn EB刺激。刺激7天后评价脾感染。用从对照动物中回收的感染性衣原体的平均数量与从重组衣原体抗原免疫的动物中回收的衣原体数量之差来衡量由推定的疫苗候选物特异性诱导的保护。

结果3

在重复实验中观察到各种抗原的脾保护的结果，如图3所示，在表1中报告为百分数值。10种抗原中的六种：Pmp2、Pmp10、烯醇酶、OmpH-样蛋白以及肺炎衣原体特异性基因Cpn0759和Cpn0042的产物显示出统计学显著性保护活性，从免疫动物的脾脏回收的IFU比模拟物免疫的对照降低了80％以上。

仓鼠模型的局限性在于，因为缺少免疫试剂，不能评价体液和细胞介导的免疫的相对贡献。然而，我们提出一个问题，即重组抗原是否也可在仓鼠中产生滴度足够高的中和抗体。因此，我们在体外中和试验中测定了从用两种最具保护性的抗原Pmp2和烯醇酶免疫的仓鼠中获得的血清。这两种抗原的中和滴度约为100(数据未显示)。

结果3的小结

总之，相当一部分(60％)体外中和抗原在仓鼠体内模型中也具有保护作用，我们的数据表明，抗体介导的中和至少在此全身感染模型中起到作用。

结果3的讨论

除了测定所选10个FACS-阳性抗原的亚组的体外中和特性之外，我们还评价了这些抗原在最近描述的仓鼠全身感染模型中抵抗肺炎衣原体感染的保护性能(34)。此评价证实了(address)，在全身感染的模型中，重组抗原具有诱导抵抗天然复制的衣原体(而非由人工条件下培养的体外培养物纯化的EB)的保护反应的能力。实际上，我们所用的仓鼠模型虽然未模拟被认为是肺炎衣原体感染人的主要途径的一般呼吸道感染，但它模拟了可能在肺炎衣原体慢性感染的建立之前发生的全身侵入状况，有几个作者认为，肺炎衣原体慢性感染的建立与心血管疾病和其它慢性退行性疾病的发展或进展相关。值得注意的是，任何仓鼠模型的局限性是现在缺少可以分析细胞介导的免疫应答的仓鼠特异性免疫试剂。然而，在全身感染的情况下，通过普通分析说明中和抗体可能具有保护作用。10种‘体外中和’抗原中的6种也在体内具有＞80％的保护作用以及在免疫仓鼠的血清中发现可检测的中和活性的发现表明，特异性抗体介导的免疫至少可产生一部分本文所述的动物保护作用。

实施例4

两种‘假拟’蛋白6784和6814(由ORF Cpn0498和Cpn0525编码)产生FACS-阳性血清，然而，该血清不能在体外中和宿主细胞感染。然而，这些抗原在仓鼠脾试验中表现非常好。

表2

基  因  /CWL029中的ORF ID	蛋白ID	重组融合类型	注释	50％中和滴度的倒数	仓鼠脾试验中的保护％(参考34)
						Cpn0498	4376784	GST	假拟蛋白	0	94
CPn0525	4376814	GST	假拟蛋白(类似于CT398)	0	97
						CPn0324		HIS	低钙效应元件(LcrE)		16只动物中8只完全保护，8只阳性动物感染性滴度降低

结果4的讨论

有趣的是，当CPn0525的抗血清产生阴性体外结果(即没有中和活性)时，CPn0525蛋白在体内仓鼠免疫试验中对脾感染产生97％的保护(即阳性体内结果)。同样，当Cpn0498的抗血清产生阴性体外结果(即没有中和活性)时，CPn0498蛋白在体内仓鼠免疫试验中对脾感染产生94％的保护。因此，FACS试验中获得的阳性信号不能保证相应的阳性体外中和活性，反言之，阴性中和活性并不意味着可以排除阳性体内结果。

结果1-4的总讨论

感兴趣的肺炎衣原体抗原的鉴定方案

一个方案是基于以下实验步骤：1)分析衣原体基因组序列以选择推定的膜相关抗原，2)克隆、表达和纯化所选抗原，3)通过用纯化抗原免疫小鼠制备抗原特异性血消，4)用小鼠血清对衣原体EB进行FACS分析以鉴定表面暴露抗原，5)“体外中和”试验，测定给定抗原产生的抗体可否干扰真核细胞感染过程，和6)用合适的动物模型来测定所选抗原产生抵抗衣原体刺激的保护的能力。

如最近Montigiani等((2002)Infection and Immunity 70：368-379)所述，通过初筛肺炎衣原体基因组，制备了针对基因或“开放阅读框”编码的170种以上重组His-标记蛋白或GST-融合蛋白(大约预计这些蛋白位于衣原体细胞外围)的一组小鼠血清。当用FACS试验测定这些抗体结合于纯化肺炎衣原体EB表面的能力时，获得了一系列的53种“FACS-阳性”血清。然后进一步评价相应的推定表面抗原诱导中和抗体的能力。此部分工作包括测定哪种血清含有能够干扰上皮细胞培养物的体外感染过程的抗体。在体外“中和”试验中，将纯化的感染性EB与连续稀释的免疫血清一起孵育，平行地，分别与相应的免疫前血清的稀释液和抗非衣原体对照抗原的血清稀释液一起孵育。

在环己酰亚胺的存在下感染细胞培养物，环己酰亚胺抑制宿主细胞蛋白合成并有助于衣原体的胞内生长，然后形成可用衣原体特异性荧光标记的单克隆抗体染色并用紫外线显微镜计数的典型胞质包含体。通过采用合适的病原体-宿主细胞比率，可合理地认为，检测到的胞质包涵体的数量与原始样品中感染性衣原体的数量成比例。因此，相对于用对照血清获得的包涵体数量，抗原特异性抗血清引起的包涵体数量下降衡量了给定抗原引发可抑制衣原体感染过程中一些阶段的抗体的能力。根据常识，当感染性降低等于或大于50％时，可将该抗血清称为‘中和性’抗血清，使感染性降低50％的血清稀释度称为50％终点中和滴度。

用肺炎衣原体体外中和试验筛选重组抗原获得的一些结果证实，根据发表的文献数据，可合理地预期，一些所列抗原如异源多态性膜蛋白(PMP)家族的成员是表面暴露的和可能诱导中和抗体的抗原。然而，也有迄今仅可认为是假拟蛋白的蛋白，和仅根据现有功能注释根本不能预计能在细菌表面上发现的蛋白。采用体外中和试验，迄今发现10种CPn抗原的血清有效中和体外感染性的程度大于50％，如果具有这种特性，一般实践就将这种抗原称为“中和性”抗原(图1)。这10种血清是用衍生自下列肺炎衣原体基因的重组蛋白免疫小鼠获得的。

采用最近描述的全身感染体内模型(仓鼠模型)，用CPn EB刺激时，与未免疫对照相比，以6种体外中和抗原免疫的仓鼠的脾感染降低了80％以。

10种CPn蛋白的表征

本研究鉴定的蛋白可分为3组：

·蛋白的注释与以下相容(可合理地预期其具有)：预期/预测暴露于衣原体细胞表面，并且抗体与它们的结合实际上可能干扰宿主细胞粘附和进入(即可能诱导中和抗体的蛋白)

·通过与其它革兰阴性菌的同源性可预计是周质暴露(即根本不能预计能在细菌细胞表面上发现)的蛋白；和

·仍被冠以‘假拟’(即细胞定位和/或细胞功能未知)的蛋白

第1组

(Pmp蛋白(pmp2和pmp10)、OmcA和OnpH)

Pmp蛋白(pmp2和pmp10)

第一组包括2种多态性外膜蛋白(Pmp蛋白)Pmp2和Pmp10(10、11、14、30)、外膜蛋白OmpH-样和OmcA，其被注释(衣原体基因组计划，http://chlamydia-www.berkeley.edu：4231/)为“预测的9-kD富含半胱氨酸的外膜蛋白，脂蛋白”。通常认为衣原体特异性蛋白的Pmp家族包括可能的致病性因子，具有自动分泌能力(自动转运蛋白)，对粘附于宿主细胞很重要，并且通常认为该家族是有希望的疫苗候选物。然而，除了最近关于Pmp21的未发表结果，这是第一次报道重组Pmp的抗血清具有中和特性。

OmcA

OmcA是与60 kDa OmcB富含半胱氨酸的蛋白在同一操纵子中共同转录的基因产物，该富含半胱氨酸的蛋白是衣原体外膜的主要结构组分和人沙眼衣原体感染的主要免疫原。OmcB和OmcA可能与一些未知的外膜结构相互作用，因此OmcA抗体可能干扰EB感染性。

OmpH

最后，衣原体OmpH可能是OmpH(Skp)蛋白家族的成员，已报道该蛋白家族在其它细菌中具有对正确的生物合成非常重要的侣伴蛋白活性。在此功能中，这些蛋白似乎能与HtrA合作(见下)。实际上，在大肠杆菌中OmpH(Skp)或HtrA(DegP)的单KO突变体仍然可以存活，但双突变体不能生长(37)。应该指出，即使衣原体(所有肺炎衣原体和沙眼衣原体或豚鼠衣原体(C.caviae)变体)OmpH-样蛋白的氨基酸序列与其余细菌OmpH蛋白对整(1ine-up)得非常好，它们是唯一的酸性蛋白，而该家族的其余成员主要包括碱性很强的蛋白质(包括至少在体外具有组蛋白样行为的一些蛋白)。可以推测，如果ompH样衣原体蛋白也维持侣伴蛋白活性，这可能与一些衣原体特性相关。

第二组所选蛋白

(ArtJ、AtoS、HtrA和烯醇酶)

第二组代表了有些令人惊讶的发现，该组包括ArtJ、AtoS、HtrA和烯醇酶。如果现有注释(通过与其它细菌的同源基因的相似性判断)是正确的，预计所有这些蛋白在革兰阴性菌中都定位于周质，仅在革兰阳性菌中暴露于表面。由于其非典型生活史，可能需要从休眠的芽孢样状态(FB)有效转化为需要快速适应宿主细胞对侵入的反应的活性形式，衣原体实际上直接在其感染形式的外表面上展示一些感受器。

ArtJ

在ArtJ的情况下-对于它我们有数据支持抗原表达和血清特异性-由目前对衣原体基因组的分析产生的异常基因结构支持了对衣原体特异的非典型状况的假设。通过与含有组织成两个操纵子(24)(负责精氨酸转运的artPIQM和artJ)的5个基因的大肠杆菌ART转运系统的相似性注释ArtJ。然而在Cpn中，没有artPIQM基因，因此，似乎衣原体ArtJ以不同于大肠杆菌模型的分子机制发挥作用，并且必须对此种类特异。

HtrA

在其它细菌中具有复杂的六聚体结构的HtrA(DegP)已被描述为具有多种功能(3、5、18、19、27、38)：有助于正确的外膜生物合成的侣伴蛋白、用于清除错误折叠的膜蛋白的可诱导性蛋白酶以及‘应激’条件的感受器。在衣原体中，所有这些特性仍未得到证实，然而我们发现在纯化EB中，HtrA以两种形式存在，其中一种似乎通过失去N末端片段而加工。如果与来自海栖热袍菌(Thermologa maritima)的同源性HtrA序列比对(18)，此片段包含用作控制实现蛋白酶活性的结构盖的预测的环。因此，进行以下推测似乎是非常有趣的：HtrA可具有相似的蛋白酶活性，并且 2-D图上鉴定的两种形式代表活性和无活性种类。有趣的是，衣原体生殖器感染的患者的人血清识别沙眼衣原体HtrA直向同源物(35)，类似地，HtrA是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)免疫蛋白质组中的抗原之一(13)。而且，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)中的同源蛋白是菌血症的被动新生大鼠模型和中耳炎的主动栗鼠模型中的保护抗原(23)。

烯醇酶

在第二蛋白质组中，预计位于细胞表面以外的其它地方的蛋白是Cpn烯醇酶。此蛋白与熟知的保守糖基化酶家族序列配对(align)，该家族主要是胞质酶，但在链球菌烯醇酶中证明它也具有细胞表面定位和胞外基质结合特性(1、28、29))。有趣的是，Gaston和同事们(8)也证明，在沙眼衣原体诱导的活动性关节炎患者中，烯醇酶诱导特异性CD4⁺T细胞应答。而且，对烯醇酶沙眼衣原体直向同源物起反应的克隆也对肺炎衣原体EB起反应，并且，由于用真菌或哺乳动物烯醇酶没有观察到增殖反应，本研究的作者得出结论：CD4T细胞刺激性表位肯定是衣原体特异性的。

第三蛋白组

(胞定位和/或细胞功能未知，Cpn0795、CPn0042)

仅仅是为了方便讨论，我们打算分为这3组中的第三组，10种上述中和抗原包括两种蛋白，这两种蛋白在公众衣原体数据库中注释为两种CPn-特异性基因Cpn0759和Cpn0042的假拟产物。Cpn0759基因是恰好在烯醇酶基因上游的6种Cpn特异性假拟基因(Cpn0794-Cpn0799)簇中的第二个基因。除了Cpn0759，该基因簇中的所有其它基因的产物在氨基酸长臂上的相似性为30-40％。Cpn0042基因编码具有4个卷曲螺旋域的假拟蛋白，它被描述为超变外膜蛋白的新家族的成员(33)。有趣的是，这些蛋白的超变性可能是由于相应基因的编码区内存在聚(C)臂诱导的链-滑动机制，已描述Pmp家族中的pmp10基因也具有这一机制(30)。然而，如其注释所述，这些蛋白的功能仍然未知，我们的观察结果提供了涉及衣原体感染过程的可能功能的第一个实验性结果。

本申请的表1证明，Cpn特异性假拟蛋白Cpn0795(SEQ ID NO：6)是FACS阳性蛋白，它在肺炎衣原体感染的仓鼠脾模型中具有显著的免疫保护活性。我们发现有证据证明，现在发现该组Cpn特异性假拟蛋白中的其它Cpn蛋白具有分泌性自动转运蛋白功能。这些蛋白(在沙眼衣原体中不存在)包括：gi/4377105(Cpn0794)、gi/4377106(Cpn0795)、gi/4377107(Cpn0796)、gi/4377108(Cpn0797)、gi/4377109(CPn0798)、gi/4377110(Cpn0799)。

图6显示了7105-7110蛋白家族中的蛋白的比对。该比对显示了预计构成可能在Cpn表面上递送或由V型(自动转运蛋白)分泌机制分泌的抗原系统的新蛋白家族。该比对的产生如下：

鉴定不完美重复，它能够比对基因。分子建模也证明，可预计7106和7107的C-末端折叠在β-折叠桶结构中，该结构可形成用于跨外膜分泌的易位孔。

Cpn0794＝7105＝FACS阳性

Cpn0795＝7106FACS阳性

Cpn0796＝7107＝FACS阳性

Cpn0797＝7108＝FACS阳性

Cpn0798＝7109＝无可用数据

Cpn0799＝7110＝无可用数据

(FACS阳性数据的参考文献＝Montigiani等(2002)Infect Immun70(1)368-79)

操纵子1＝0794、0795、0796操纵子2＝0797、0798

Cpn0795和Cpn0796具有可形成跨膜孔的C末端(参见比对，图9)。CPn0794、Cpn0797、Cpn0798和Cpn0799具有N末端，说明所有蛋白都具有N末端和C末端。

图7显示了Cpn0794-Cpn0799的比对。通过鉴定认为，基因Cpn0794、Cpn0795、Cpn0796和Cpn0797编码的蛋白很可能暴露于衣原体细胞表面并且可能是疫苗候选物。证明这些蛋白实际上是Cpn在体内表达的(WB数据和FACS数据)。在Cpn0797的情况下，我们也证明CPn EB中的表达水平足够高，以致于能够通过对蛋白提取物的2DE图进行质谱分析而检测到(参见Montigiani等)。

根据这些观察结果，观察到Cpn0794、Cpn0796和Cpn0797蛋白编码的蛋白可根据其氨基酸序列中存在的一组不完美重复进行比对(见图7)，而CPn0795的推定产物大多数与Cpn0796蛋白的C末端部分配对。

而且，也可根掘根据上述重复序列基序将基因Cpn0798或Cpn0799编码的蛋白与上述蛋白比对(见图7)。

6个基因的总体比对证明，该基因编码了功能相关的蛋白家族。

而且，Cpn0796编码的蛋白的计算机分析(包括该家族中所有蛋白的全部比对)证明具有以下氨基酸序列的功能前体：

SEQ ID NO：80

MKFMKVLTPWIYRKDLWVTAFLLTAIPGSFAHTLVDIAGEPRHAAQATGVSGDGKIVIGMKVPDDPFAITVGF

QYIDGHLQPLEAVRPQCSVYPNGITPDGTVIVGTNYAIGMGSVAVKWVNGKVSELPMLPDTLDSVASAVSAD

GRVIGGNRNINLGASVAVKWEDDVITQLPSLPDAMNACVNGISSDGSIIVGTMVDVSWRNTAVQWIGDQLSV

IGTLGGTTSVASAISTDGTVIVGGSENADSQTHAYAYKNGVMSDIGTLGGFYSLAHAVSSDGSVIVGVSTNS

EHRYHAFQYADGQMVDLGTLGGPESYAQGVSGDGKVIVGRAQVPSGDWHAFLCPFQAPSPAPVHGGSTVVTS

QNPRGMVDINATYSSLKNSQQQLQRLLIQHSAKVESVSSGAPSFTSVKGAISKQSPAVQNDVQKGTFLSYRS

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SHIDEFKGSVSAMGNFVLENSTVSVLRPFASLAMYYDVRQQQLVTLSVVMNQQPLTGTLSLVSQSSYNLSF

帮助多肽从胞质中分泌出来并释放到周质中的加工位点位于氨基酸31之后(根据PSORT预测)和/或位于氨基酸47之后，类似于在其它细菌自动转运蛋白分子(如百日咳杆菌(B.pertussis)的BrkA)中经实验测定的加工位点。因此，Cpn0796产物的成熟形式如下：

SEQ ID NO：81

HTLVDIAGEPRHAAQATGVSGDGKIVIGMKVPDDPFAITVGFQYIDGHLQPLEAVRPQCSVYPNGITPD

GTVIVGTNYAIGMGSVAVKWVNGKVSELPMLPDTLDSVASAVSADGRVIGGNRNINLGASVAVKWEDDVITQ

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PFASLAMYYDVRQQQLVTLSVVMNQQPLTGTLSLVSQSSYNLSF

或

SEQ ID NO：82

TGVSGDGKIVIGMKVPDDPFAITVGFQYIDGHLQPLEAVRPQCSVYPNGITPDGTVIVGTNYAIGMGSVAVK

WVNGKVSELPMLPDTLDSVASAVSADGRVIGGNRNINLGASVAVKWEDDVITQLPSLPDAMNACVNGISSDG

SIIVGTMVDVSWRNTAVQWIGDQLSVIGTLGGTTSVASAISTDGTVIVGGSENADSQTHAYAYKNGVMSDIG

TLGGFYSLAHAVSSDGSVIVGVSTNSEHRYHAFQYADGQMVDLGTLGGPESYAQGVSGDGKVIVGRAQVPSG

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MGAHVFASLSPKMSTAATLGVERDLNSHIDEFKGSVSAMGNFVLENSTVSVLRPFASLAMYYDVRQQQLVTL

SVVMNQQPLTGTLSLVSQSSYNLSF

Cpn0796编码蛋白的计算机分析也证明C末端结构域约包含残基1-648。图8显示了Cpn0796。如图8所示，Cpn0796形成3-折叠桶结构，能够形成跨细菌外膜(OM)的孔。作为典型的‘自动转运蛋白’分子，通过N末端信号肽机制跨过细菌内膜分泌到周质中后，该分子可在OM中形成孔，N末端结构域可通过该孔(‘过客’结构域)到细菌细胞外。同时，这些分子可保持锚定在细菌表面上或经蛋白水解将‘过客结构域’或其部分释放到环绕细菌细胞的培养基中，例如以下序列代表的例子：

SEQ ID NO：83

MKFMKVLTPWIYRKDLWVTAFLLTAIPGSFAHTLVDIAGEPRHAAQATGV

SGDGKIVIGMKVPDDPFAITVGFQYIDGHLQPLEAVRPQCSVYPNGITPD

GTVIVGTNYAIGMGSVAVKWVNGKVSELPMLPDTLDSVASAVSADGRVIG

GNRNINLGASVAVKWEDDVITQLPSLPDAMNACVNGISSDGSIIVGTMVD

VSWRNTAVQWIGDQLSVIGTLGGTTSVASAISTDGTVIVGGSENADSQTH

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GQMVDLGTLGGPESYAQGVSGDGKVIVGRAQVPSGDWHAFLCPFQAPSPA

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GRYDFNLGETVVLQPFMGIQVLHLSREGYSEKNVRFPVSYDSVAYSAATS

FMGAHVFASLSPKMSTAATLGVERDLNSHIDEFKGSVSAMGNFVLENSTV

SVLRPFASLAMYYDVRQQQLVTLSVVMNQQPLTGTLSLVSQSSYNLSF

如图8所示，氨基酸残基365-385代表跨越β-折叠桶孔的α螺旋构象。

可通过特异性蛋白水解作用从锚定在膜上的孔结构中切下N末端过客结构域。包含肽序列PSPAPV(SEQ ID NO：84)的接头结构域(如以下序列中粗体所示)表明可以切割N末端过客结构域的位点：

SEQ ID NO：85

HTLVDIAGEPRHAAQATGVSGDGKIVIGMKVPDDPFAITVGFQYIDGHLQPLEAVRPQCSVYPNGITPDGTV

IVGTNYAIGMGSVAVKWVNGKVSELPMLPDTLDSVASAVSADGRVIGGNRNINLGASVAVKWEDDVITQLPS

LPDAMNACVNGISSDGSIIVGTMVDVSWRNTAVQWIGDQLSVIGTLGGTTSVASAISTDGTVIVGGSENADS

QTHAYAYKNGVMSDIGTLGGFYSLAHAVSSDGSVIVGVSTNSEHRYHAFQYADGQMVDLGTLGGPESYAQGV

SGDGKVIVGRAQVPSGDWHAFLCPFQAPSPAPVHGGSTVVTSQNPRGMVDINATYSSLKNSQQQLQRLLIQH

SAKVESVSSGAPSFTSVKGAISKQSPAVQNDVQKGTFLSYRSQVHGNVQNQQLLTGAFMDWKLASAPKCGFK

VALHYGSQDALVERAALPYTEQGLGSSVLSGFGGQVQGRYDFNLGETVVLQPFMGIQVLHLSREGYSEKNVR

FPVSYDSVAYSAATSFMGAHVFASLSPKMSTAATLGVERDLNSHIDEFKGSVSAMGNFVLENSTVSVLRPFA

SLAMYYDVRQQQLVTLSVVMNQQPLTGTLSLVSQSSYNLSF

N末端肽可通过分泌暴露于细菌细胞表面，也可通过上述蛋白水解脱附。该肽可形成称为β-螺旋桨的结构构象，如以下序列所示：

SEQ ID NO：86

HTLVDIAGEPRHAAQATGVSGDGKIVIGMKVPDDPFAITVGFQYIDGHLQPLEAVRPQCSVYPNGITPDGTV

IVGTNYAIGMGSVAVKWVNGKVSELPMLPDTLDSVASAVSADGRVIGGNRNINLGASVAVKWEDDVITQLPS

LPDAMNACVNGISSDGSIIVGTMVDVSWRNTAVQWIGDQLSVIGTLGGTTSVASAISTDGTVIVGGSENADS

QTHAYAYKNGVMSDIGTLGGFYSLAHAVSSDGSVIVGVSTNSEHRYHAFQYADGQMVDLGTLGGPESYAQGV

SGDGKVIVGRAQVPSGDWHAFLC

而且，N末端过客结构域也可具有特异性蛋白酶活性，如丝氨酸蛋白酶样活性。除了作用于各种底物之外，蛋白酶活性还可作用于该分子的膜锚定形式，以便从衣原体细胞表面上切下N末端过客结构域。三个足够间隔的氨基酸残基(即H、D和S)的丝氨酸蛋白酶共有序列的存在支持了丝氨酸蛋白酶样活性，所述足够间隔的氨基酸残基可以位于在一组实验测定的模板上建模的‘过客’结构域的虚拟结构上，如1nrO(PDB鉴定码)。

根掘上述分析，Cpn0796基因编码促进其自身分泌到EB表面上、也可能介导或促进其自身释放到周围的培养基中的蛋白。分泌的过客肽具有几种活性，包括：

1.肌动蛋白结合肽，衣原体表面层的一部分，有助于宿主细胞感染的建立过程

2.宿主细胞胞质内的特异性蛋白酶活性，有助于感染的衣原体在细胞内存活。

3.宿主细胞胞质内的特异性活性，通过抑制转录和/或抑制翻译(m-RNA降解)下调所选基因表达

4.与基因Cpn0794、0795、0797、0798、0799的产物合作

5.上述N末端β螺旋桨结构域的另一功能是调节/调控宿主细胞胞浆蛋白酶的活性，目的是改变宿主细胞特性以利于衣原体发展、存活或维持。参见Fulop V，Bocskei Z，PolgarL.《脯氨酰寡肽酶：不寻常的3螺旋桨结构域调节蛋白水解》(Prolyloligopeptidase：an unusual beta-propeller domain regulates proteolysis)CGell.1998 Jul24；94(2)：161-70。

Cpn0794、Cpn0797、Cpn0798、Cpn0799编码的蛋白-都包含上述Cpn0796结构的变体-也提供了β螺旋桨结构，其活性类似于和/或补充了上述活性。

因此，蛋白家族通过以下方式补充(cooperate)普通功能：产生(通过位点特异性重组)结构和活性类似于上述Cpn0796产物的新分子，或独立地产生(contribute)需要几种相关组分的联合作用的多蛋白结构。

图9说明了肺炎衣原体基因Cpn0795和Cpn0796编码蛋白的C末端结构域的比对。如图9所示，Cpn0795或Cpn0796的β折叠桶结构域包括MKDLGTLGG(SEQ IDNO：87)、SXDGK(SEQ ID NO：88)、VIVG(SEQ ID NO：89)、VIXG(SEQ ID NO：90)或HAF(SEQ ID NO：91)。

第四蛋白组

Cpn0498

因此在这种情况下，通过三重平行筛选(其中两个是阳性结果，  一个是阴性结果)评价鉴定了(根据现有知识)在疫苗候选物的抗原功能方面仅具有所需基本特性的以前未知的抗原(即生物功能未知的抗原)。

Cpn抗原数据的进一步表征包括在Finco等，“通过多重筛选鉴定肺炎衣原体的新型潜在疫苗候选物”(Identification of New Potential Vaccine Candidates AgainstChlamydia Pneumoniae by Multiple Screenings)，Vaccine，23(2005)1178-1188中，以全文纳入本文。

实施例5

背景

衣原体生命周期的主要阶段是：

(i)结合于宿主细胞表面并通过细胞外称为原生小体的孢子样感染形式以专化的空泡(衣原体内含体)进入胞质；和

(ii)EB变换为称为网状体(RB)的非感染复制形式，并在内含体内以二元分裂的形式复制数次以产生微克隆。

在衣原体生命周期不同阶段表达的几组基因以及触发世代从一个阶段到另一阶段的信号大部分还不了解，尚需研究。

蛋白质微阵列检测蛋白并监测其表达水平可用于高通量蛋白质分析。通过使用蛋白质微阵列，可平行进行数千个蛋白及蛋白相互作用的复杂筛选。蛋白质微阵列一般包括表面，如玻璃、膜、微量滴定孔、质谱板、珠子或其它微粒用以结合配体、蛋白质或抗体。例如，抗体可结合微阵列以形成捕获阵列。捕获阵列可与生物学样品接触以定量生物学样品中的蛋白质。同样，蛋白质微阵列可用于诊断，其间可平行进行多个免疫实验，从而可量化并比较不同样品中的蛋白质水平以应用于疾病治疗或诊断。

例如，在捕获阵列中，抗体结合于微阵列并与生物学样品接触。通过直接标记结合的蛋白可检测结合于抗体阵列的蛋白质及配体。如需更高敏感度或特异性，可采用数对抗体与同一蛋白配体结合的夹心技术。当要检测蛋白的量很低或蛋白经过修饰时，该技术尤其有用。此外，通过提供双重水平的靶点识别，即为阵列中每个位点提供两级特异性，采用夹心实验可使高度多元实验中交叉反应的风险降至最低。或者，结合的蛋白可通过无标记方法检测，如包括质谱、表面等离振子共振和原子力显微术。当为了避免蛋白修饰或改变时，该方法有用。

同样，包含大量固化纯化蛋白的大规模功能性芯片可用于检测大范围的生化功能，如与其它蛋白的蛋白相互作用、药物-靶点相互作用、酶-底物等。例如可从表达库中纯化此类蛋白，蛋白阵列用以筛选文库以选择特异性结合伙伴，包括抗体、合成架构、多肽和适体等。以此方式，可进行“文库抗文库”筛选，如在组合化合物文库中抗筛选自基因组计划鉴定的蛋白靶点阵列来筛选候选药物。

蛋白质微阵列技术可分析蛋白本身而非推断蛋白功能、相互作用和mRNA表达特征。许多情况下，mRNA表达与蛋白丰度并非精确吻合。而且，mRNA表达分析不能为蛋白-蛋白相互作用或翻译后修饰提供充分信息。因此，由于可提供不能通过检测mRNA表达而获得的蛋白质、以及蛋白和蛋白相互作用的更精确信息，通过蛋白质微阵列直接分析蛋白具有优势。

目前DNA微阵列技术允许在mRNA水平上相对细胞阶段进行基因表达特征的分析。由此可鉴定其上调或下调与细胞特定阶段相关的基因或基因簇，也可鉴定治疗性相关靶点。利用此技术，代表属于给定生物体所有基因的特定部分的DNA片段(这些片段可来源于cDNA文库或通过PCR或化学合成获得)，可以高密度和有序的方式结合于固相支持物(芯片)的表面。目前可在一平方厘米的芯片表面点印多至10,000个DNA片段或250,000个寡核苷酸。然后用DNA芯片鉴定哪个点印基因在特殊细胞群体中有翻译活性。所以，制备RNA并以荧光染料进行标记，最后与固定于芯片表面的DNA片段杂交。利用合适的计算机辅助荧光检测器，激光束激发时每个点发射的荧光信号被仔细量化以检测所有阵列基因的转录活性。

已开发了CPn DNA微阵列，用于体外和体内实验检测给定CPn病原体与宿主细胞接触时发生的转录事件。可在短时内制备携带特定细菌(如 CPn细菌)整个基因组的DNA芯片，从而进行整个基因组的表达分析。

实验方法

具体说，采用基因组DNA(开放阅读框探针)微阵列方法检测CPn细菌基因表达。在这点上，根据发表的全基因组注释，可制备用于分析CPn生命周期的阵列。衣原体DNA芯片携带约1000个PCR起源的DNA片段，其平均尺寸为400-700bp并对应于所有CPn注释基因的内在部分。

结果5

表3(i)-(xi)显示微阵列所选Cpn EB表达基因的转录活性。表3(i)-(iv)数据表示不同mRNA，以它们在感染性“空泡样”形式细胞中的丰度顺序显示。表3(v)-(xi)数据与CPn基因的mRNA表达水平相关并对其进行了概括。所用细胞处于周期末端，这时其基因表达可能最高。小于大约10000的值可能是背景，而信号强度更大的最高的一组蛋白质(大约前30)可能为最感兴趣的蛋白。

表达基因值的分析表明FACS阳性CPn抗原中的三个(CPn0331(假拟)、CPn0234(假拟)和CPn0572(假拟)均为高表达基因。

表3(v)-(xi)显示微阵列所选Cpn EB表达基因的转录活性。该表显示不同mRNA，以它们在感染性“空泡样”形式细胞中的丰度顺序显示。所用细胞处于周期末端，这时其基因表达可能最高。表3(i)-(iv)和(v)-(xi)的分析表明CPn抗原CPn0558(OmcA)、CPn0331(假拟)、CPn0539(Pmp19)、CPn0234(假拟)和CPn0572(假拟)均为相对高表达的基因。

可能时，将表3(v)-(xi)公开的转录活性放在衣原体发育周期中。在这点上.，衣原体晚期基因产物比早期基因产物被更频繁得描述。这主要是因为，晚期基因产物出现于EB而非RB，并且研究EB比研究RB容易。

此外，晚期基因功能似乎主要是在RB回至EB的终末分化中相关的功能(Shaw等，Mol Microbiology 37(4)，2000，913-925)。晚期基因产物似乎在细菌细胞分裂终止时发挥作用，并且组成结构组分和重塑活性，它们参与在新宿主细胞贴壁和侵袭中发挥作用的交联外膜复合物的形成。例如，次级分化过程中(RB至感染性EB)的重要方面是编码形成高度二硫键交联的细菌外膜(OM)复合物的蛋白质的基因的表达。据认为，数个晚期周期基因编码在OM复合物的形成和成熟(感染性EB发育中的关键步骤)中有潜在作用的蛋白(参见Belland等，PNAS(USA)100(14)，2003，8478-83)。晚期基因omcA和omcB编码两个富含半胱氨酸的OM蛋白，它们与主要OM蛋白(OmpA)相互作用形成此复合物。已发现，OM复合物的关键蛋白组分-OmcB蛋白经过翻译后蛋白酶解加工。我们发现OmcB和OmcA表现高水平的转录活性(参见表3(ii)上部)。已证明，Cpn0384(其CT等价物为CT046(hctB))与RB到EB的分化相关(参见Belland等，PNAS(USA)100(14)，2003，8478-83)。我们也发现Cpn0384有相对高水平的转录活性(参见表3(v)-(xi)上部)。发现其它被认为参与III型分泌系统的Cpn抗原在转录活性方面具有中等表达水平。这些发现与发表的观点相吻合，即认为尽管两个推定的III型分泌系统结构组分(yscJ和yscN(Cpn669))的转录开始于(细胞)中期，但效应分子的输出可能在(细胞)发育阶段的另一个不同时期。

表3(v)-(xi)表明，观察到与98Kda、称为PmpA或Pmp19的蛋白对应的Cpn0539(CT412)的高转录活性。尽管Pmp19蛋白有相对“高”水平的转录活性，这个结果是有趣的，因为pmp9的mRNA丰度似乎与其蛋白丰度无关。以这点看来，我们实验室的结果表明(i)在2D图、western印迹或FACS分析中未检测到Pmp19，表明尽管有高水平mRNA表达，但pmp19蛋白未暴露于表面，或者(ii)Pmp19蛋白表达，但蛋白酶消化加工或降解使其无法被免疫印迹分析检测到。其它实验室证实了我们实验室的结果。在这点上，Grimwood等(2001)Infection and Immunity69(4)2383-2389表明检测到肺炎衣原体21个Pmp基因各自的转录特征，表明所有pmp基因在感染中均转录。既然每个Pmp基因均转录，Grimwood等(2001)用多肽特异性抗血清免疫印迹检测肺炎衣原体CWL029 EB裂解物评价了蛋白质表达。有趣的是，尽管有高度抗多肽反应性，但是免疫印迹没有检测到PmpA(Pmp19)或PmpB/C和PmpD基因血清的Pmp-特异性反应。这些结果表明这些蛋白不稳定或未被翻译。这些发现表明，对于被预测位于细菌外膜的肺炎衣原体家族的21种多态性膜蛋白(Pmp)，其Pmp表达似乎有变化性。衣原体Pmp功能未知，但是基于序列预测和实验检测，这些Pmp被认为是表面蛋白质，因此，这些pmp可能对衣原体毒性至关重要。与内含体(Inc)膜蛋白相似，Pmp蛋白目前被认为是衣原体家族特有的(参见Rockey等(2000)Infection and Immunity 69(10)5473-5479)。本文公开的结果和诸如Grimwood等的其它结果显示，衣原体生物体似乎在Pmp转录如Pmp19转录上消耗大量的代谢成本，但是可能缺乏功能性Pmp蛋白，如Pmp19蛋白的生产。

材料和方法(实施例6-8)(参考文献第II部分)

T细胞表位预测和肽合成

利用BIMAS算法[24]，基于肺炎衣原体CWL029菌株(登录号 NC 000922或AE001363)的基因组序列，进行T细胞表位预测。合成肽(纯度＞80％)由PrimmSri(Milan，Italy)合成，悬于100％DMSO，使用前贮存于-20℃。

RMA-S/A2细胞系和HLA-A2转基因和非转基因小鼠

HLA-A2(RMA-S/A2，H-2^b，TAP2-）稳定转染的T细胞淋巴瘤鼠细胞系RMA-S由意大利罗马Università degli Studi“La Sapienza’的Bamaba博士惠赠，37℃培养于补充有热失活10％FCS、100IU/ml青霉素/链霉素、2mM/L谷胺酰胺(GIBCO)和5×10-5M2-ME(Sigma)的RPMI-1640(GIBCO)中。H2-b HLA-A2转基因小鼠[35]饲养于无病原体环境中，利用BB7.2抗-A2 mAb，在全血样本上进行FCM，以筛选HLA-A2表达[48]。只用A2表达细胞高于70-80％的小鼠进行DNA免疫和肺炎衣原体感染实验。无HLA-A2表达的动物交配以获得HLA-A2非转基因种群，用作实验对照。

表位稳定性实验

RMA-S/A2细胞(3-5×10⁵/孔)接种于补充有人β2球蛋白(3μg/ml，Sigma)的无血清RPMI培养基，添加或者不添加测试肽(10μM)。26℃ 5％CO₂孵育过夜后，将细胞转移到37℃培养2h，然后用BB7.2抗-A2 mAb和PE-偶联的抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)检测细胞表面的HLA-A2表达水平。活细胞无法掺入碘化丙锭，FCM分析其荧光强度。相应不添加肽样本和添加肽但仅用抗鼠二抗处理的样本用作对照。

HLA-A2转基因和非转基因小鼠的感染和DNA免疫

用50μl PBS稀释5×10⁵肺炎衣原体FB/96EB[4]，转基因小鼠以一个月间隔经鼻免疫两次。利用PCR从FB/96基因组DNA中扩增肺炎衣原体抗原编码基因，克隆入质粒pcmvKaSF2120中[49]并经DNA序列分析检验。50μg无内毒素重组质粒DNA，用Dulbecco磷酸盐缓冲液(GIBCO)稀释后，于第0、21和35天注射入小鼠胫骨肌肉。

CD8+T细胞分离和ELISpot实验检测IFN-γ

第三次免疫后一周，利用Cell Strainer(Falcon)滤器从DNA免疫的小鼠中制备脾细胞。红细胞裂解后，利用CD8a(Ly-2)微珠经磁性细胞分选(MACS-Miltenyi Biotec)正选择富集脾细胞悬液中的CD8⁺T细胞。FMC检测CD8⁺T细胞纯度高于90％。用5μg/ml抗小鼠IFN-γ抗体(R4-6A2，PharMingen)的100μl碳酸盐缓中液(pH 9.2)包被大量筛选(Multiscreen)96孔硝酸纤维素板(Millipore)。4℃孵育过夜后，用200μlBSA(1％)的PBS溶液在37℃饱和板2小时。加入纯化的CD8⁺(5×10⁴)使总体积为200μl/孔，其中含有经辐射的(3,000 rad)脾细胞(2x10⁵/孔)、10μg/ml肽和10U/ml人r-IL-2(ChironCorporation)，这种脾细胞来自非免疫的HLA-A2转基因小鼠，是抗原递呈细胞的来源。37℃、50％CO₂孵育20小时后，洗板并依次与生物素化抗鼠IFN-γ(XMB 1.2，PharMingen)、ExtrAvidin-碱性磷酸酶和底物BCIP/NBT(Sigma)水溶液孵育，以显影结合的IFN-γ。利用解剖显微镜对各孔计数。含有不相关肽或不含肽的培养基作为隐性对照，而ConA(5μg/ml)处理的CD8⁺T细胞作为阳性对照。

体外培养和流式细胞术分析来源于肺炎衣原体感染的转基因和非转基因小鼠的脾细胞

肺炎衣原体Eb第二次感染一周后收集来自感染小鼠的脾细胞。在对IFN-γ产量的离体分析中，在测试肽(10μg/ml)和抗小鼠CD28抗体(1μg/ml，PharMingen)作为共刺激因子存在下，将2×10⁶个脾细胞种板。37℃，5％CO₂孵育2小时后，加入Brefeldin A(10μg/ml，Sigma)后再孵育4小时。PBS冲洗两次后，通透细胞、固定并利用抗鼠IFN-γ-(PE)、抗鼠CD8(APC)、抗鼠CD69(FITC)及对应同种型染色。对于细胞因子的产量，阳性对照在抗-小鼠CD3和CD28抗体(1μg/ml，PharMingen)刺激的细胞上进行。在没有肽存在的条件下或在HepB阴性对照肽刺激的条件下培养的细胞作为阴性对照。利用FACS LSRII流式细胞仪(Becton Dickinson)分析所有样品。对于短期T细胞系的IFN-γ生产，5-10×10⁶来自于感染小鼠的脾细胞在测试肽(20μg/ml)存在下培养6天，培养最初的两天后加入rIL-2(10μg/ml)。孵育末期，用RPMI冲洗细胞两次，再次在测试肽(10μg/ml)存在下刺激培养6小时，来自HLA-A2转基因小鼠(经3000 rad辐射)的CD8耗尽的新鲜制备的1×10⁵个抗原递呈细胞和抗小鼠CD28抗体(1μg/ml，PharMingen)作为共刺激因子。37℃，5％CO₂孵育两小时后加入BrefeldinA(10μg/ml，Sigma)，再孵育4小时，利用FCM检测IFN-γ产量。

实施例6

计算机分析肺炎衣原体基因组并预测HLA-A2T细胞表位

用肺炎衣原体CWL029菌株的基因组预测与I类HLA-A2分子结合可能性高的9mer肽序列。利用来白NIH生物信息学和分子分析部门网络服务器( http://bimas.cit.nih.gov/)的预测算法进行分析，可根据肽/MHC复合物预测的半数解离对潜在MHC结合物评分[24]。虽然有报道称某些衣原体蛋白可诱导自身免疫应答[25-28]，但我们的研究仅限于衣原体属中一个特殊的蛋白亚组，该亚组由鉴定为III型分泌系统成员的13种蛋白、17种多态性膜蛋白(PMP)和另外19种蛋白组成，其中5种被鉴定为EB表面抗原[4]。用获自良好表征的HIV-1p17gag表位⁷⁷SLYNTVATL⁸⁵预测的结合分数157.22[29]作为肽选择的任意(arbitrary)截止值。总共鉴定了55种肺炎衣原体起源的T细胞表位，它们属于31种不同蛋白(表1)，它们的预测结合分数范围为156.77-42,485.263。

肽与HLA-A2的体外结合

利用MHC I类体外稳定实验评价所选肽与HLS-A2的结合能力，该实验利用与人I类A2基因稳定转染的抗原加工(TAP)缺陷型细胞系RMA-S/A2相关的鼠转运子进行。37℃培养时，MHCI类分子不稳定表达于TAP-缺陷型细胞表面[30-32]。结合肽存在时37℃培养细胞，导致形成更稳定的MHC/肽复合物，该复合物可被流式细胞术分析监测。因此，RMA-S/A2在测试肽存在下于26℃培养过夜，转换到37℃培养2小时，利用抗-HLA-A2特异性mAb直接染色来定量稳定的A2分子的表面水平。两个已知HLA-A2限制性CTL表位作为与A2结合的阳性对照：HIV-1p17gag肽[29]和流感基质M1蛋白质肽FluMP58[33]。而乙肝病毒包膜抗原肽HbenvAg125(HepB)作为阴性对照[34]。

结果6

所获结合情况的结果列于表4，允许鉴定净荧光强度(Net MFI)高于92.3的15个肽，对应HIV-1p17gag阳性对照肽所获值，净MFI介于92.3和63.1之间的8个肽，利用两个阳性对照肽获得，净MFI介于29.6和63之间的12肽。计算机预测的肽中有15个(27.2％)并未赋予A2分子稳定性，表现出净MFI低于14，利用HepB阴性对照肽获得。

实施例7

一些HLA-A2结合蛋白被来自DNA免疫的转基因小鼠的CD8⁺T细胞识别。

使用RMA-S/A2细胞的体外试验可定义一组能将HLA-A2分子结合和稳定在细胞表面的肽。为得到预测的表位确实可以在体内通过它们起源的抗原加工生成的可能性的信息，在相关抗原在细胞内表达并在体内递呈的条件下，研究CD8⁺T细胞对肽的识别。全长ORF序列编码13种衣原体蛋白，总共包括24个预测肽，克隆入合适的DNA表达载体，用各重组质粒免疫不同组的转基因小鼠，这些小鼠表达由HLA-0201的α1和α2结构域和H-2K^b的α3结构域、跨膜区和胞质区组成的I型嵌合分[35]。

从包含一种或多种体外试验阳性表位、或者阳性或阴性表位组合中选择ORF序列。此分析包括对应外膜蛋白A(OMPA、CPn 0695)的ORF序列，因为已有报道称沙眼衣原体中有该蛋白人MHC-I-限制性表位[18；36]。选择了与基因CPn 0131相关的一个编码序列，它包括在体外稳定实验中均表现为阴性的四个表位。三个免疫循环后，处死转基因小鼠，分离脾CD8⁺T细胞，用相应肽刺激20小时，利用酶联免疫点(ELISpot)实验评价离体IFN-γ产量。

结果7

包括肽CH-6(CPn 0811)、CH-7(CPn 0623)、CH-10(CPn 0828)、CH-13(CPn 0695、OMPA)和CH-37(CPn 0210)等ORF的DNA-介导的表达与点形成细胞(SFC)数目相关，其显著高于那些获自与HepB不相关的肽的数目，然而-些与基因CPn0131、CPn0323、和CPn0026编码的抗原相关的肽诱导的SFC值仅比HepB对照肽高2-3倍(表5)。与基因CPn 0132、CPn 0322、CPn 0325、CPn 0415和CPn 0728编码的抗原相关的某些肽不诱导任何IFN-γ产生(数据未显示)。

实施例8

为检测肽体外扩增特异性CD8⁺T细胞种群的能力，用其中一些质粒重复DNA免疫实验，并离体和在相关肽存在下刺激6天后利用流式细胞术检测CD8⁺T细胞内IFN-γ的产量。尝试在CD8⁺T细胞IFN-γ产量和HLA-A2特异性限制间确立直接联系，实验同时采用转基因和非转基因小鼠。所用质粒含有基因CPn 0695、CPn 0811和CPn0823以及基因CPn 0323，CPn 0695、CPn 0811和CPn 0823分别包括肽CH-13、CH-6和CH-7，它们在体外结合实验和ELISpot实验中呈现高度阳性，CPn 0323包括6个不同的肽，它们的ELISpot值比背景稍高。

结果8

表6小结了实验结果，而图4为流式细胞术分析肽CH-6刺激的脾细胞的代表性点图。当利用测试肽刺激DNA-免疫的转基因小鼠的新鲜脾细胞时，仅CH-6或CH-7诱导的相对倍数增长(RFI)值比通过用HepB阴性对照肽刺激相同细胞获得的值高约5倍(表6，分别为4.58和5.2 RFI)。

当采用短期T细胞系(TCL)代替新鲜脾细胞时，更多肽能够引发CD8⁺T细胞产生显著更多的IFN-γ(表6)。实际上，除了肽CH-6和CH-7以外，还有肽CH-13、CH-44、CH-45和CH-46被CD8⁺T细胞群体识别，它们诱导的RFI显著高于用HepB肽刺激相同细胞诱导的RFI(RFI＞5)。重要的是，由于当用非转基因小鼠进行相同实验时，获得的RFI值可靠地较低(表6)，肽诱导产生IFN-γ似乎主要是HLA-A2依赖性的。用多克隆刺激(抗CD3/抗CD28)有效活化非转基因和转基因脾细胞的事实支持以下假没：非转基因小鼠中CD8⁺T细胞诱导较低是由于缺少肽与人HLA-A2分子之间的相互作用。

用肺炎衣原体感染的转基因小鼠的CD8⁺T细胞在体内识别HLA-A2结合蛋白

最近证明，用肺炎衣原体感染小鼠引发病原体-特异性鼠I型-限制性免疫应答[22]。因此，我们提出一个问题：在肺炎衣原体感染细胞中针对相应天然抗原产生免疫应答期间克隆选择的特异性CD8⁺T细胞是否可识别任何A2体外结合蛋白。

为了解决这个问题，用非致死剂量的肺炎衣原体EB鼻内感染HLA-A2转基因小鼠，一个月后用相等剂量的细菌刺激，然后处死小鼠获得脾细胞，用获得的脾细胞测定CD8⁺T细胞产生的IFN-γ。由于如果直接离体测定感染小鼠的脾细胞(数据未显示)，观察不到可测定的IFN-γ产量，所以将脾细胞与各肽或HepB不相关肽一起培养6天。然后再用相同的肽刺激得到的短期TCL6小时，评价CD8⁺T细胞产生的胞内IFN-γ产量。用40种测试肽获得的结果见图5A。16种肽(CH-2、CH-7、CH-8、CH-10、CH-13、CH-15、CH-20、CH-21、CH-28、CH-35、CH-37、CH-45、CH-46、CH-47、CH-50和CH-55)引发的CD8⁺反应最强(1-7.1％产生IFN-γ的CD8⁺T细胞)，而19种肽引发的反应低但很一致(CD8⁺/IFN-γ⁺T细胞的百分数为0.3-0.9)。5种肽诱导产生IFN-γ的CD8⁺T细胞的百分数并不显著高于在对HepB对照肽的反应中观察到的百分数。

当再用反应性最高的肽中的8种刺激感染肺炎衣原体的转基因和非转基因小鼠脾细胞时，只有转基因小鼠中的特异性CD8⁺/IFN-γ⁺T细胞群体识别其中7种，而两种小鼠组中的CD8⁺T细胞者都识别肽CH-7(图5B)。

实施例6-8的结果的总讨论

在此项工作中，我们描述了衍生自肺炎衣原体抗原的肽，鉴定为推定的T细胞表位，它能被普通人I型MHCA2单倍型识别。

理解肺炎衣原体特异性CD8⁺T细胞介导的免疫应答和设计保护性疫苗得依赖鉴定CD8⁺T细胞识别的细菌抗原或表位的可能性。然而，响应于细胞胞浆中复制的病原体的CTL-依赖性免疫应答的诱导是可预测的，这些病原体提供可进入细胞MHC-I递呈途径的抗原，在衣原体的情况下，并不能马上看出哪种抗原是蛋白酶体可用的以及它们如何到达胞浆，因为这些细菌在感染细胞内有严谨的空泡内定位。

我们选择了基于HLA-A2转基因小鼠的体内系统，来测定用单独的抗原编码基因进行DNA免疫或用肺炎衣原体感染后，哪个预测的肽能够被特异性CD8⁺T细胞识别。以前发表的数掘支持了我们选择鼠模型。Wizel等[22]最近报道了第一项证据来证明，在感染的小鼠中诱导了对肺炎衣原体抗原特异的CD8⁺T细胞，并且鉴定了细菌衍生的鼠MHC-I-限制性T细胞表位，这些表位能够引发肺炎衣原体感染细胞的裂解或体外抑制病原体的胞内生长。这些结果看起来证实了一些肺炎衣原体抗原确实可到达感染细胞的胞浆并进入MHC-I递呈途径，即在衣原体复制期间发生重塑时或发育中的细菌颗粒的自溶后[22]。

而且，Kuon等[42]最近报道，鉴定了11种沙眼衣原体衍生的HLA-B27-限制性肽，它们能够刺激获自衣原体诱导的活动性关节炎患者的CD8⁺T细胞。重要的是，其中8种与通过分析感染沙眼衣原体的HLA-B27转基因小鼠的脾细胞选择的抗原重叠，这说明可用鼠动物模型重现抗原加工，但是假定鼠和人抗原加工之间的差异和T细胞库(repertoires)的差异[43]。

我们用感染肺炎衣原体的A2转基因小鼠进行的实验揭示出，至少16种肽被IFN-γ阳性CD8⁺T细胞群体识别，由于我们不能检测到用相同的肽刺激的非感染转基因小鼠受刺激的脾细胞产生的IFN-γ(数据未显示)，这16种肽实际上因为细菌感染而扩展。这些结果表明，相应的衣原体抗原可能进入MHC-I递呈途径。通过DNA免疫单独表达对应蛋白时这些肽中许多也可被特异性CD8⁺T细胞识别，该发现强烈支持以下假设：用感染小鼠观察到的反应对计算机预测的肽表位和其相应抗原确实是特异性的。重要的是，对用DNA免疫或感染肺炎衣原体的A2转基因和非转基因小鼠中肽诱导的IFN-γ阳性CD8⁺T细胞的比较说明该识别事件主要是A2特异的。

然而，我们不能排除一些受试肽也能与鼠I型MHC分子相互作用的可能性，如以下结果所提示：在感染的非转基因小鼠中用CH-7获得的结果(图5)和在DNA免疫的非转基因小鼠中用CH-7、CH-8和CH-13获得的RFI值(表6)。

通过DNA免疫和细菌感染，我们都能证明OMPA衍生的CH-13肽诱导A2转基因小鼠的特异性CD8⁺T细胞反应。这些结果看来证实了对此动物模型的选择，因为OMPA可进入MHC-I递呈途径的发现与以前分别在沙眼衣原体[18]和肺炎衣原体[23]的OMPA蛋白中鉴定到HLA-A2限制性表位和鼠MHC-I-限制性表位相关。除了CH-13和CH-17，感染小鼠的CD8⁺T细胞识别的所有其它肽属于肺炎衣原体抗原，在这些肽上没有鉴定到人或鼠T细胞表位[22；23]。有趣的是，一对阳性反应肽(CH-50和CH-55)属于多态性外膜蛋白组[44；45]，而大部分其它肽是III型分泌系统相关蛋白组的一部分[45；46]。肽CH-7和CH8(均包括在耶尔森菌外蛋白(Yop)系统的T蛋白中[47])和CH-10(包括在蛋白J中，蛋白J是相同易位系统的一部分)，看来在感染小鼠试验中特别有活性(图5A)。

对于涉及III型分泌系统的抗原所包括的其它肽也是这样，如低钙效应蛋白D中的CH-45、CH-46和CH-47。令人感兴趣的是，当通过DNA免疫表达相应抗原时，在感染小鼠试验中反应性最高的CH-8似乎不能被特异性T细胞群体识别(表5和6)。这可能是由于不同因素，即注射的DNA体内表达水平低或蛋白构象改变。

另一方面，我们也应该考虑到以下可能性：用肺炎衣原体感染小鼠后，此肽被CD8⁺T细胞群体识别，该细胞群体对衍生自序列密切相关的未鉴定的肺炎衣原体抗原的表位特异。与CH-8相反，用肽CH-6刺激来自感染的转基因小鼠的脾细胞并不能检测到IFN-γ⁺/CD8⁺T细胞(图5A)，但很清楚的是，在DNA免疫试验中相同的肽有反应活性(表5和6)。这可能说明，对于细胞蛋白酶体来说低钙效应蛋白H不可用，但我们也可假设，MHC递呈机器所用的肽量不足以诱导可用我们的试验检测到的细胞反应，或者反应性CD8⁺T细胞群体没有扩大到我们试验的检测限度内。

整体来说，本文提出的结果可以鉴定可用于肺炎衣原体感染过程中蛋白酶体介导的加工的许多抗原，这些抗原是HLA-A2依赖性细胞免疫应答的可能靶点。需要进一步分析来证实特异性诱导的CD8⁺T细胞是否能够识别和诱导肽刺激的或肺炎衣原体感染的哺乳动物细胞裂解，以及是否可能将鉴定的T细胞表位与肺炎衣原体感染患者中天然诱导的CD8⁺T细胞群体相关联。重要的是，用不同抗原的DNA介导表达获得的结果可代表对一大类(significant set)肺炎衣原体HLA-A2限制性表位进行限定的最初步骤，这些表位最终可以在尝试诱导CTL依赖性抗衣原体的保护性免疫应答中与DNA小基因组合。

实施例9

用第一抗原组组合免疫

如实施例1-4的材料和方法部分所述制备第一抗原组的五种抗原(OmpH-样蛋白、pmp10、pmp2、烯醇酶、OmpH-样、CPn0042和CPn00795)。表达并纯化这些抗原。然后，制备抗原组合的组合物，每种组合物中含有五种抗原(每种细合物中含有15μg各抗原)。

将CD1小鼠分为7组(1-4组中每组5-6只小鼠：5、6和7组中每组3-4只小鼠)，免疫方案如下：

组	免疫组合物	递送途径
			1	5种抗原的混合物(各15μg)+CFA	腹膜内
2	5种抗原的混合物(各15μg)+AlOH(200μg)	腹膜内
			3	5种抗原的混合物(各15μg)+Al0H(200μg)+CpG(10μg)	腹膜内
4	完全弗氏佐剂(CFA)	腹膜内
			5	5种抗原的混合物(各5μg)+LTK63(5μg)	鼻内
6	AlOH(200μg)+CpG(10μg)	腹膜内
			7	LTK63(5μg)	鼻内

以两周间隔免疫小鼠。最后一次免疫两周后，通过阴道内感染肺炎衣原体血清变型刺激所有小鼠。

用另一组CPn抗原重复实验9。这些抗原是：

CPn0385(PepA)、CPn0324(LcrE)、CPn0503(DnaK)、CPn0525(假拟)和CPn0482(ArtJ)。组合这些抗原，给药时包含或不包含明矾和CpG，如实验9所述。

小结

申请人鉴定了具有所需免疫学和/或生物学特性的许多CPn蛋白。具体说，鉴定了能够诱导产生抗体的至少12种CPn蛋白，所述抗体在体外细胞培养物中可以剂量依赖性方式中和肺炎衣原体的感染性。诱导中和抗体很重要，因为它防止感染性EB侵入人组织。而且，这些CPn蛋白中至少六种也能在体内仓鼠模型中减轻衣原体(肺炎衣原体)感染。此外，这些CPn蛋白中的一些不仅能诱导足量T细胞反应，而且能诱导高血清水平的中和抗体。

除了最近未发表的关于pmp21的结果，这是第一次报道重组pmp(pmp2和pmp10)的抗血清具有中和特性。有趣的是，虽然CPn0525的抗血清产生阴性体外结果(即没有中和活性)，CPn0525蛋白在体内仓鼠免疫试验中对脾感染产生97％的保护(见表2)(即阳性体内结果)。同样，虽然CPn0498的抗血清产生阴性体外结果(即没有中和活性)，CPn0498蛋白在体内仓鼠免疫试验中对脾感染产生94％的保护(即阳性体内结果)。因此，FACS试验中获得的阳性信号不能保证相应的阳性体外中和活性，反言之，阴性中和活性并不意味着可以排除阳性体内结果。

通过用肺炎衣原体体外中和实验筛选一组重组抗原获得的一些结果见表2。仅仅粗略地看一眼‘现有注释’柱，就可观察到表1和2中所列抗原就像异源多态性膜蛋白(PMP)家族的成员一样，根据发表的文献数据，可合理地预期它们是表面暴露的并且可能诱导中和抗体，然而，也有迄今仅可认为是假拟蛋白的蛋白，和仅根据现有功能注释根本不能预计能在细菌表面上发现的蛋白。

第一次根据在一组筛选测定中的中和特性和不同的评分情况表征一些CPn蛋白是对本领域的重要贡献，因为它有助于选择具有特定免疫学和生物学特性的CPn抗原组合。

总之，本文描述了可在体外诱导抑制肺炎衣原体的感染性的抗体并在体内具有保护作用的重组抗原组。

将以上说明书提到的所有出版物纳入本文作为参考。本领域技术人员显然了解对本发明所述方法和系统的各种修改和变化，而不背离本发明范围和精神。虽然将本发明与特定优选实施方式联系起来描述，应理解，如权利要求所限定的本发明不应过度受限于这些特定实施方式。实际上，本发明旨在包括分子生物学或相关领域技术人员显然了解的对实施本发明的所述方式作出的各种修改。

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基因ID	蛋白ID	现有注释	预测的信号肽(氨基酸残基)	实验Mw(成熟)	实验pl	FACSK-S评分	2D免疫印迹	2DE图中的MSID	50％体外中和滴度(倒数)	仓鼠脾保护(％)	p值
												CPn044gCPn0013CPn0482CPn0800CPn0979CPn301CPn0042CPn0795CPn0584CPn0558	0010-GST6270-GST6767-GST7111-GST7306-GST6577-GST6296-GST7106-GST6878-GST6850-GST	Pmp10，多态性外膜蛋白家族Pmp2，多态性外膜蛋白家族ArtJ，精氨酸结合蛋白？Eno，烯醇酶HtrA，侣伴蛋白，丝氨酸蛋白酶OmpH样外膜蛋白Cpn特异性假拟蛋白，几种可能的侧向同源物，包括FACS+Cpn0126Cpn特异性假拟蛋白AtoS；双组分传感组氨酸激酶，AtoS相关OmcA-预测的9kD富含半胱氨酸的外膜蛋白，脂蛋白？	1-251-19？(*)无1-201-21无无无脂蛋白？	94503874592907046104501421726431.139.540.47.4	5.225.845.454.666.394.755.407.507.507.56	40.2434.9920.1611.6428.6710.0522.7714.8414.6120.45	图2图2图2图2图2图2NDNDNDND	是是是是是是否否否否	2878710541324984780487270197	9292438908484897464	0.0340*0.0338*0.29180.0005*0.98330.0067*0.0002*0.0109*0.34570.2061

表1

表3(i)

微阵列选择的肺炎衣原体EB的表达基因

CPN基因	注释	CMedia
			ON1+2CPn0322omcBomcAompACPn0678hctBCPn0331lcrH_1CPn0474CPn0443CPn0808groEL_1CPn0499yvyDCPn0677ON9+10CPn0333CPn0369CPn0473pmp_19CPn0728CPn0809CPn0676CPn0524CPn1016CPn0234CPn0588CPn0065ftsHCPn0498CPn0370CPn0810CPn0875CPn0472ytfFCPn0537CPn0667rpsDartJCPn0329yccA_2CPn0572CPn0796dagA_2xerDCPn0726pgithrSCPn0720CPn0589CPn1004CPn0383accDCPn1005CPn0933clpP_1CPn0064CPn0538pmp_15yscNyscNtlyC_2dnaKsecD/secFvacBpmp_2recAarcDdsbDpmp_6	1CHLTR T2蛋白omcB 60 kDa富含半胱氨酸的OMPomcA 9 kDa富含半胱氨酸的脂蛋白ompA主要外膜蛋白假拟蛋白hctB组蛋白样蛋白2CT082假拟蛋白lcrH_1低钙效应蛋白HCT365假拟蛋白CT005假拟蛋白CT579假拟蛋白groEL_1热激蛋白60假拟蛋白yvyD保守假拟蛋白假拟蛋白LtuB蛋白CT058假拟蛋白假拟蛋白pmp_19多态性膜蛋白A家族CHLPN 76 kDa同源物_1(CT622)CT578假拟蛋白类似于CT695假拟蛋白CT858假拟蛋白CPAF蛋白酶1CT181假拟蛋白CT469假拟蛋白CT288假拟蛋白ftsH ATP依赖性锌蛋白酶假拟蛋白CT058假拟蛋白CT577假拟蛋白CT734假拟蛋白假拟蛋白ytfF阳离子氨基酸转运蛋白CT814.1假拟蛋白假拟蛋白rpsD Sigma-28/VVhiG家族artJ精氨酸周质结合蛋白磷脂酶D超家族yccA_2转运通透酶CT456假拟蛋白假拟蛋白FACS+dagA_2 D-丙氨酸/甘氨酸通透酶xerD整合酶/重组酶CT620假拟蛋白pgi葡萄糖-6-P异构酶thrS苏氨酰tRNA合成酶CT659假拟蛋白CT470假拟蛋白CT847假拟蛋白CT047假拟蛋白accD AcCoA羧化酶/转移酶βCT848假拟蛋白预测的二硫键异构酶clpP_1 CLP蛋白酶假拟蛋白CT814假拟蛋白pmp_15多态性外膜蛋白E家族yscN Yop N(鞭毛型ATP酶)yscN Yop N(鞭毛型ATP酶)tlyC_2 CBS结构域(溶血素同源物)dnaK热激蛋白70secD/secF蛋白外运蛋白secD/secF(融合)vacB核糖核酸酶家族pmp_2多态性外膜蛋白G家族recA RecA重组蛋白arcD精氨酸/鸟氨酸反向转运蛋白dsbD硫：二硫互换蛋白pmp_6多态性外膜蛋白G/l家族	56951.6252466.9043304.2242530.1640478.1034457.0633501.6933219.3627994.2826041.6625788.7825269.0425020.2923843.9323573.2922986.9122691.5622416.0321736.2121552.7819039.9018847.9518822.27174308014635.0614296.8714240.8414094.7113905.7013661.2712804.3212727.9912334.9611123.8510901.1410803.4210288.4510234 679680.569553.609017.138825.558664.888663.748448.788202.458175.838055.557987.457766.327758.097735.457292.227137.787135.447119.737029.076960.166882.666837.116752.806752.806692.526667.156650.816535.306452.216369.576360.196356.906321.42

表3(ii)

nqrAgyrB_2CPn0001mdhClcrDygcAda9A_1CPn0105porBychFCPn0708glyAglyAgpdACPn0814pmp_12CPn0507pmp_7yscCglgBCPn1057CPn0925yscJCPn0512pmp_8gltXCPn1029rl3fliNCPn0497talldhfablCPn0017yzeBftsYpmp_21CPn0727pmp_13clpCCPn0107CPn0927clpBdacFCPn0243ahpCproSgp6DyagECPn0590CPn0822CPn0807CPn0929dnlJfolDrl1rl1CPn0483clpP_2rpoAfabHfusACPn0220yebCCPn1032gapAdppDCPn0404pmp_14CPn0753CPn0462CPn0381CPn0374

nqrA泛醌氧化还原酶，αgyrB_2 DNA促旋酶亚基BCT001假拟蛋白mdhC苹果酸脱氢酶lcrD低钙效应DygcA rRNA甲基转移酶dagA_1 D-Ala/Gly通透酶CT016假拟蛋白ompB外膜蛋白B(porB！)ychF GTP结合蛋白CT668假拟蛋白glyA丝氨酸羟甲基转移酶glyA丝氨酸羟甲基转移酶gpdA甘油-3-P脱氢酶CT573假拟蛋白pmp_12多态性外膜蛋白(截短)A/l家族CT421.1假拟蛋白pmp_7多态性外膜蛋白G家族yscC Yop/Gen分泌蛋白DglgB葡聚糖分支酶CT356假拟蛋白CT779假拟蛋白yscJYop转运JCT425假拟蛋白pmp_8多态性外膜蛋白G家族gltX谷氨酰-tRNA合成酶假拟蛋白rl3 L3核糖体蛋白fliN鞭毛运动开关结构域/YscQ家族CT388假拟蛋白tal转醛酶ldh亮氨酸脱氢酶fabl烯酰基-酰基-运载体蛋白还原酶yzeB ABC转运蛋白通透酶ftsY细胞分裂蛋白FtsYpmp_21推定外膜蛋白D家族CT619假拟蛋白pmp_13多态性外膜蛋白G家族clpC ClpC蛋白酶CT058假拟蛋白CHLPS 43 kDa蛋白同源物_2clpB Clp蛋白酶ATP酶dacF D-Ala-D-Ala羧肽酶假拟蛋白ahpC巯基-特异性抗氧化蛋白(TSA)过氧化酶proS脯氨酰基tRNA合成酶gp6D CHLTR质粒侧向同源物yagE YagE家族CT471假拟蛋白CT565假拟蛋白CT580假拟蛋白CHLPS 43 kDa蛋白同源物_4dnlJ DNA连接酶folD亚甲基四氢叶酸脱氢酶rl1L1核糖体蛋白rl1L1核糖体蛋白假拟蛋白clpP_2 CLP蛋白酶亚基rpoARNA聚合酶αfabH氧酰基(oxoacyl)载体蛋白合酶IIIfusA延长因子G假拟蛋白yebC YebC家族假拟蛋白CT373假拟蛋白gapA甘油醛-3-P脱氢酶dppD ABC ATP酶二肽转运假拟蛋白pmp_14多态性外膜蛋白H家族假拟蛋白假拟蛋白CT326类似CT056假拟蛋白

6319.396257.926197.906185.136173.296160.836131.946102.596032.946024.476020.135973.375973.375957.935949.065943.775893.305881.745874.565860.935800.475795.975794.035771.005763.895753.535743.245696.595691.865674.365654.135644.615629.905609.255608.135606.915604.245599.195583.845577.875564.975564.935558.205557.255542.025528.775528.375527.115514.155498.935498.315497.595497.455470.605469.265468.395468.395434.745418.105409.045408.475403.235400.775399.505396.915377.305345.315322.625296.755290.015289.165285.395269.65

表3(iii)

CPn0799        假拟蛋白                                              5269.61

CPn0062        CT289假拟蛋白                                         5249.79

alaS           alaS丙氨酰tRNA合成酶                                  5243 95

CPn0126        假拟蛋白                                              5240.36

rs4            rs4 S4核糖体蛋白                                      5239.14

CPn0623        CT504假拟蛋白                                         5234.03

glgC           glgC葡萄糖-1-P腺苷酰转移酶                            5214.97

CPn0362        假拟蛋白                                              5195.21

CPn0458        假拟蛋白                                              5178.06

CPn0066        假拟蛋白                                              5136.84

CPn0742        CT635假拟蛋白                                         5133.02

CPn0481        假拟蛋白                                              5118.37

sohB           sohB蛋白酶                                            5106.34

CPn0675        CT696假拟蛋白                                         5104.52

CPn0405        CT105假拟蛋白                                         5095.20

lpxA           lpxA酰基-载体UDP-GlcNAc O-酰基转移酶                  5072.96

pmp_17.3       pmp_17.3多态性外膜蛋白(CPn0469移码)                   5068.28

pepF           pepF寡肽酶                                            5065.00

uhpC           uhpC己糖磷酸转运                                      5064.37

CPn0705        CT671假拟蛋白                                         5063.25

CPn0874        CT733假拟蛋白                                         5047.64

pepA           pepA亮氨酰氨基肽酶A                                   5044.06

lipA           lipA硫辛酸酯合成酶                                    5008.60

CPn0514        CT427假拟蛋白                                         5007.93

ribA/ribB      ribA/ribB GTP环化水合酶和DHBP合酶                     5005.81

dut            dut dUDP核苷水解酶                                    4982.57

CPn0928        CHLPS 43 kDa蛋白同源物_3                              4982.06

CPn0794        由Rita选择的假拟蛋白FACS+？                           4965.51

CPn0798        假拟蛋白                                              4957.17

pnp            pnp多核糖核苷酸核苷酸转移酶                           4954.15

fabG           fabG氧酰基(载体蛋白)还原酶                            4947.36

CPn0513        Fe-S氧化还原酶                                        4935.65

folP           folP二氢蝶酸酯合酶                                    4934.67

ybhl           ybhl二羧化酶易位蛋白                                  4929.02

pdhA/pdhB      pdhA/pdhB(丙酮酸)氧代异戊酸酯脱氢酶α和β融合         4916.85

pyrH           pyrH UMP激酶                                          4914.40

abcX           abcX ABC转运蛋白ATP酶                                 4897.52

sucA           sucA氧代戊二酸酯脱氢酶                                4895.62

yacE           yacE预测的磷酸酯酶/激酶                               4888.84

CPn0595        CT476假拟蛋白                                         4877.72

CPn0014                                                              4876.89

phnP           phnP金属依赖性水解酶                                  4866.38

tyrP_2         tyrP_2酪氨酸转运                                      4861.62

CPn0559        CT444.1假拟蛋白                                       4860.36

CPn0878        SET结构域蛋白                                         4858.94

ygo4           ygo4磷酸通透酶                                        4856.29

tufA           tufA延长因子Tu                                        4842.50

lpdA           lpdA硫辛酰胺脱氢酶                                    4831.72

CPn0397        PP2C磷酸酯酶家族                                      4831.19

fliY           fliY谷氨酸结合蛋白                                    4828.17

phoH           phoH ATP酶                                            4814.17

gltT           gltT谷氨酸同向转运                                    4807.24

lepA           lepA GTP酶                                            4801.42

rho            rho转录终止因子                                       4800.55

ychM           ychM硫酸转运蛋白                                      4793.79

pmp_16         pmp_16多态性外膜蛋白E家族                             4791.71

adt_2          adt_2 ADP/ATP转位酶                                   4773.25

CPn0486        假拟脯氨酸通透酶                                      4763.62

trxB           trxB硫氧还蛋白还原酶                                  4749.81

aroG           aroG脱氧庚酮酸酯醛缩酶                                4747.65

yqeV           yqeV假拟蛋白                                          4722.09

cysS           cysS半胱氨酰tRNA合成酶                                4700.25

CPn0690        ABC转运膜蛋白                                         4695.46

nqr2           nqr2 NADH(泛醌)脱氢酶                                 4691.83

pmp_11         pmp_11多态性外膜蛋白G家族                             4690.71

CPn0035        CT339假拟蛋白                                         4686.43

CPh0797        Rita选择的假拟蛋白FACS+？                             4681.52

yaeT           yaeT Omp85类似物                                      4680.61

greA           greA转录延长因子                                      4676.81

cdsA           cdsA磷脂酸胞苷酰转移酶                                4673.11

CPn0803        CT584假拟蛋白                                         4667.94

CPn0021        预测的OMP[先导肽]                                     4639.48

tsp            tsp尾特异性蛋白酶                                     4639.10

表3(iv)

rl6grpEfabFmgtEhimDCPn0422CPn0692CPn0415aspCdcdCPn0010.1atoCgatBCPn0827yCeAmetGatpACPn1054rl5xseACPn0859CPn0449nqr5CPn0041accAoppA_2valSCPn0456CPn0681dnaA_2CPn0007yscTrs3

rl6 L6核糖体蛋白grpE HSP-70辅因子fabF酰基载体蛋白台酶mgtE Mg++转运蛋白(CBS结构域)himD整合宿主因子αCT273假拟蛋白ABC转运蛋白CT266假拟蛋白aspC天冬氨酸氨基转移酶dcd dCTP脱氨酶CPn0010移码atoC 2-组分调节蛋白gatB(Pet112)Glu tRNA Gln氨基转移酶(B亚单位)CT560假拟蛋白yceA YceA假拟蛋白metG甲硫氨酰-tRNA合成酶atpA ATP合酶亚基A假拟蛋白rl5 L5核糖体蛋白xseA外切脱氧核糖核酸酶VllCT718假拟蛋白pmp_10(移码)nqr5 NADH(泛醌)还原酶5假拟蛋白accA AcCoA羧化酶/转移酶αoppA_2寡肽结合蛋白valS缬氨酰tRNA合成酶假拟蛋白CT691假拟蛋白dnaA_2复制起始因子假拟蛋白yscT YopT转运Trs3 S3核糖体蛋白

4636.734635.784633.094611.864600.924600.344591.164586.284534.974533.884530.444528.674510.594507.664491.464490.294483.964483.874482.914469.214460.544458.004453.914453.054443.854442.364442.144436.514426.134424.214423.424421.694418.77

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微阵列表达的基因表

15-9-04和17-12-04

表3(v)-(xi)

CPn	CT	蛋白功能	MRNA水平	衣原体发育周期的阶段	参考文献(参见图例)	EB表面暴露	RB分泌
									CT081	CHLTRT2蛋白		非常晚期	Nicholson
0557	CT443	OmcB	43304.22	晚期基因	BellandShaw	EB表面暴露
								0558	CT444	OmcA	42530.16	晚期基因	Belland	是，FACS阳性与CT467-起实现体内保护
0695	CT681	MOMP		中晚期II		FACS阳性
0384	CT046	hctB		晚期基因	Belland
								0331	CT082	假拟	33219.36	晚期	Nicholson	FACS阳性
0811	CT576	LcrH		晚期基因	Belland
								0474	CT365	假拟		立即/早期	Belland
0443	CT005
								0808	CT579	假拟		晚期基因	Belland		III型分泌簇(WO02/0820910
0134	CT110	GroEL热激蛋白(Hsp-60)		立即早期基因周期中段中晚期I	(参见Belland等，2003的表1)Nicholson	FACS阳性
								0499		Cpn假拟蛋白
		Yyd保守的假拟蛋白
										CPn特异性蛋白
								0333	CT080	ltuB		晚期基因	Belland
0369	CT058
0539	CT412	Pm p19	19039.90			FACS阳性
								0728	CT622
0809	CT578			晚期基因	Belland
								0676	CT695
								1016	CT858	预测的含有IRBP的蛋白酶					分泌蛋白(WO02/082091)表位
0234	CT181	假拟				FACS阳性
								0588	CT469	假拟
0065	CT288
								0998	CT841						表位(WO02/082091)

衣原体补充提交材料/

微阵列表达的基因表

15-9-04和17-12-04

表3(v)-(xi)

0369	CT058
								0810	CT577	假拟					III型分泌簇(WO02/082091)
0875	CT734	假拟		立即早期	Belland		分泌蛋白(WO02/082091)
0127	CT034
								0538	CT814			晚期	Belland
0482	CT381	ArtJ				FACS阳性
								0329	CT154-158	CT157磷脂酶D超家族				FACS阳性
								0572	CT456	假拟(现在是TarP)	8664.88			FACS阳性	衣原体通过III型分泌系统分泌CT456(TTSS)(clifton等，2004)，然后CT456被转运到宿主细胞的胞浆中。指定的新功能＝Tarp＝转运的征集肌动蛋白的磷蛋白cT456基因在衣原体发育周期的中期-晚期转录CT456可能在各血清变型中不同，因为它具有串联重复序列
								0876	CT735
1024	CT864
								0726	CT620
1025	CT378
								0482	CT581
0720	CT659			晚期	Belland
								0589	CT470
1004	CT847			晚期	Belland
								0383	CT047
0058	CT293
								1005	CT848
0933	CT783	预测的二硫键异构酶					分泌型蛋白(可能是III分泌蛋白)(WO02/082091)
								0520	CT431

衣原体补充提交材料/

微阵列表达的基因表

15-9-04和17-12-04

表3(v)-(xi)

0538	CT814
								0466	CT869	PmpE				FACS阳性
0707	CT669	yscN					III型分泌蛋白
								0707	CT669	yscN		周期中段	Shaw
								0503	CT396	DnaK	6667.15	晚期	Nicholson	FACS阳性
0564	CT448
								0504	CT397
0453	CT871	PmpG		晚期	Belland	FACS阳性
								0762	CT650	recA					分泌型蛋白(WO02/082091)
1031	CT374
								0786	CT595
								0743	CT634
0715	CT661
								0001	CT001			晚期	Nicholson
1028	CT376
								0323	CT090
0885	CT742
								0876	CT735
0105	CT016	假拟				FACS阳性	分泌型蛋白(参见WO02/48185)，36页(即由III型细胞器分泌)
								0854	CT713	PorB		中晚期II	Nicholson	FACS阳性
0321	CT092
								0708	CT668	假拟					分泌型蛋白(WO02/082091)
0520	CT432
								0521	CT432
0855	CT714
								0814	CT573
								0506	CT421
								0702	CT674
0475	CT866
								1057	CT356
0925	CT779
								0828	CT559	YscJ				FACS阳性
0512	CT425
0560	CT445
0647	CT528
								0704	CT672			中晚期I	Nicholson
0497	CT388
								0083	CT313

衣原体补充提交材料/

微阵列表达的基因表

15-9-04和17-12-04

表3(v)-(xi)

0919	CT773
								0406	CT104
								1012	CT854
0880	CT739
								0963	CT812	PmpD				FACS阳性
0727	CT619
0437	CT286	ClpC					分泌型蛋白(WO02/0820910
								0369	CT058
0134	CT110	Hsp-60(omp2)侣伴蛋白		立即早期基因周期中段中晚期I	(参见Belland等，2003的表1)Nicho1son	FACS阳性
0672	CT551
0778	CT603
								0500	CT393
0804	CT583
0590	CT471
								0822	CT565
0807	CT580
0149	CT146
								0335	CT078
0078	CT318
								0078	CT318
								0520	CT431
0626	CT507
								0298	CT239			中晚期	Nicholson
0550	CT437
0573	CT457
								1032	CT373
0624	CT505
								0682	CT690
0381	CT326
								0374	CT056
								0062	CT289
0598	CT479
0733	CT626
								0623	CT504
0607	CT489

衣原体补充提交材料/

微阵列表达的基因表

15-9-04和17-12-04

表3(v)-(xi)

								0742	CT635	假拟				FACS阳性
								0613	CT494			中晚期II	Nicholson
0675	CT696
								00405	CT105
0650	CT531
0136	CT112
								0665	CT544
0705	CT671	假拟				FACS阳性	WO 02/48185CT671＝分泌型蛋白36页(即由III型细胞器分泌)表位
								0874	CT733
0385	CT045	PepA	5044.06	中晚期I	Nicholson	FACS阳性
								0832	CT558
0514	CT427
								0904	CT761	MurG	5005.81	参见生物基因组文献2004-在血清变型中一致地选择MurG		FACS阳性
0059	CT292	dut					分泌型蛋白(WO02/082091)
								0999	CT842
0296	CT237
								0513	CT426
0758	CT613
								0207	CT204
0304	CT245
								0698	CT678
0191	CT130
								0378	CT054
0611	CT492
								0584	CT467	AtoS	4877.72	CT和CPn毒株之间的交叉反应即CT467及其CPn同源物可中和其各自的种类，但也可交叉保护		FACS阳性
0479	CT380
								0970	CT818
0558	CT444	OmcA		晚期基因(参见Belland等，2003的表1		FACS阳性与CT444和CT467实现体内保护作用
								0878	CT737
0680	CT692

衣原体补充提交材料/

微阵列表达的基因表

15-9-04和17-12-04

表3(v)-(xi)

0074	CT322
								0833	CT557
0793	CT588
								0604	CT486
0106	CT015
								0528	CT401
0359	CT064
								0610	CT491			中晚期II	Nicholson
1014	CT856
								0466	CT869？
0351	CT065	ADP/ATP转位酶
0314	CT099
								0484	CT382
								0932	CT782
0690	CT686
								0427	CT278
0453	CT871	pmpG		晚期基因	(参见BelIand等，2003的表1)	FACS阳性
								0035	CT339
								0300	CT241
0741	CT636
								0567	CT451
0803	CT584
0555	CT441
								0633	CT514
0502	CT395
								0916	CT770
0286	CT194
								0416	CT267
0422	CT273
								0692	CT684
0415	CT266	假拟				FACS阳性
								0495	CT390
0392	CT039
0586	CT468
								0004	CT004
0827	CT560	假拟蛋白					III型分泌簇(WO02/082091)
								0734	CT627
0122	CT032
								0657	CT537
								0635	CT516
1062	CT329
								0859	CT718

衣原体补充提交材料/

微阵列表达的基因表

15-9-04和17-12-04

表3(v)-(xi)

0430	CT281
0414	CT265	AccA					分泌型蛋白(WO02/082091)
								0599	CT480	寡肽结合脂蛋白(Oppa)		立即早期基因	(参见Belland等，2003的表1)	FACS阳性
0094	CT302
								0681	CT691	假拟					分泌型蛋白(WO02/082091)表位
0309	CT250
								0823	CT564
0641	CT522

表4.肺炎衣原体选择的肽：蛋白来源和HLA-A2稳定性试验

肽	序列    CPn8)		蛋白	组b)	评分c)	净MFId)
							HepBGAGIMaCH1CH2CH3CH4CH5CH6CH7CH8CH10CH12CH13CH14CH15CH16CH17CH18CH19CH20CH21CH22CH24CH28CH29CH30CH31CH32CH33CH34CH35CH36CH37CH38CH39CH41CH42CH43CH44CH45CH46CH47CH48CH49CH50CH51CH52CH53CH54CH55CH56CH57CH58CH59CH60CH61CH62	125TAFHQTLQD133 77SLYNTVATL85 58GILGFVFTL66 315QLLDEGKEL323 433ILLNEVPYV441 343VLNLFFSAL351 7QLLESLAPL15 271SILELLQFV279 79YLLEEIYTV87 83YMDNNLFYV91 254FLTLAWWFI262 214GLTEEIDYV222 79WLVFFNPFV87 69YVFDRlLKV77 406VMLIFEKKV414 1270YLTSYSPYV1278 1530VQLAYVFDV1538 308ILQEAEQMV316 71IALLVIFFV79 1327LLLTLGYAV1335 146ALMLLNNYV154 614TLWGSFVDV622 1566WLFDLRFSV1574 490LIQETLLFV498 45RLLEIIWGV53 288YLMQKLQNV296 520FLQRGESFV528 401WLLRDDWLL409 187KLWEWLGYL198 68LLMLAISLV75 201KLLKDHFDL209 56ILSFLPWLV64 149LLLIFNNYL157 126YLLDFRWPL134 374NLLKRWQFV382 378FLLRHLSSV386 162KLSEQLEAL170 214KVLLGQEWV222 315NLAEQVTAL323 123YVGFIIFL131 32WMMGWLMI40 56NLSISVFLL64 110VIQAFGDFV118 635YLALDPDSV643 149KMSHFQQAL157 1187SLCAQSSYV1195 1360NLSRQAFFA1368 678SLLEEHPVV686 1302NLWSHYTDL1310 377ALWKENQAL385 568ALWGHNVLL576 333NLAGGILSV341 86FVSKFWFSL94 73SITVFRWLV81 58YLVFVLTI66 42VMLFIGLGV50 76VLFLLIRSV84 397FLFQLGMQI405	0322032303240325070208110823082308281021069504150444096307280186044400050447054000210062079107920009004101310132016901700210035203550186018601860323032303230323032304150444044409630963096309630963102110210131013101310415	乙肝病毒包膜抗原HIV-1 gag流感病毒基质M1Yop蛋白转运蛋白U低钙效应蛋白D低钙效应蛋白E分泌侣伴蛋白可能的Yop蛋白转运蛋白C低钙效应蛋白HYop蛋白转运蛋白TYop蛋白转运蛋白TYop蛋白转运蛋白J低钙效应基因座蛋白H外膜蛋白ACT2 66假拟蛋白多态性外膜蛋白G/I家族推定外膜蛋白D家族76 kDa同源物_1类似于CT119 IncA多态性外膜蛋白G/I家族多态性外膜蛋白G家族多态性外膜蛋白G/I家族多态性膜蛋白B家族预测OMPCHLPS 43 kDa蛋白同源物_1CT 590假拟蛋白CT 589假拟蛋白假拟假拟假拟假拟假拟假拟假拟假拟假拟类似于CT119 IncA类似于CT119 IncA类似于CT119 IncA低钙效应蛋白D低钙效应蛋白D低钙效应蛋白D低钙效应蛋白D低钙效应蛋白DCT2 66假拟蛋白多态性外膜蛋白G/I家族多态性外膜蛋白G/I家族推定外膜蛋白D家族推定外膜蛋白D家族推定外膜蛋白D家族推定外膜蛋白D家族推定外膜蛋白D家族低钙效应基因座蛋白H低钙效应基因座蛋白H假拟假拟假拟CT2 66假拟蛋白	III型III型III型III型III型III型III型III型III型III型Ch特异性Cpn特异性PmpPmpCh特异性Ch特异性PmpPmpPmpPmpCh特异性Cpn特异性Ch特异性Ch特异性Cpn特异性Cpn特异性Cpn特异性Cpn特异性Cpn特异性Ch特异性Cpn特异性Cpn特异性Cpn特异性Ch特异性Ch特异性Ch特异性III型III型III型III型III型Cpn特异性PmpPmpPmpPmpPmpPmpPmpIII型III型Cpn特异性Cpn特异性Cpn特异性Ch特异性	＝＝＝＝＝＝157.22550.92324.065534.14262.20745.351835.221162.996781.363365.361767.586686.72976.761200.641759.66591.70484.77445.80437.481415.381096.8328150.17843.2118200.542722.68759.662726.914184.211006.201604.53886.782808.3242485.262406.152722.68345.48212.39201.44413.32294.95284.97166.49156.77205.19382.53158.47432.59265.96177.30177.30159.97322.16272.55419.44315.95201.24177.56	14.0±24.492.4±23.863.1±18.174.0±22.6140.5±36.140.1±23.1120.1±25.285.5±34.4148.5±38.9164.1±24.3144.1±22.1144.0±37.950.1±22.2139.0±36.774.1±20.2138.1±23.548.1±19.1202.1±24.246.1±22.356.1±21.6142.5±38.6121.1±18.068.5±11.0105.1±20.899.5±15.0108.5±12.1105.1±8.1101.1±16.372.1±12.018.0±1.485.1±4.990.6±5.741.0±19.897.1±17.764.1±13.488.1±6.451.6±27.616.0±37.571.6±34.625.0±16.38.1±18.418.0±26.223.0±32.574.6±34.429.0±33.945.1±22.625.0±34.543.6±21.91.6±24.745.6±21.947.6±29.029.6±29.016.0+0.130.0±20.529.0±10.628.0±2.814.0±2.830.0±12.0

^a)基因序列名称如Cpn毒株CWL029的基因组序列所述(http://chlarnydia-www berkeley.edu：4231)

^b)III型：III型分泌系统；Ch和Cpn特异性：衣原体和肺炎衣原体特异性；Pmp：多态性膜蛋白

^c)用BIMAS算法计算

^d)根据三次试验计算的含有肽的细胞的平均荧光强度-没有肽的细胞的平均荧光强度±标准差

表5.用DNA免疫的HLA-A2转基因小鼠的CD8⁺T细胞进行的ELISpot试验

蛋白	基因	肽	SFCa)
				假拟假拟LCR蛋白DCHLPS 43 kDaOMP ALCR蛋白HYop pt蛋白TYop pt蛋白J	CPn 0131CPn 0210CPn 0323CPn 0062CPn 0695CPn 0811CPn 0823CPn 0828	培养基HepBCH 33CH 59CH 60CH 61培养基HepBCH 37培养基HepBCH 2CH 44CH 45CH 46CH 47CH 48培养基HepBCH 28培养基HepBCH 13培养基HepBCH 6培养基HepBCH 7CH 8培养基HepBCH 10	134733538040713120272793808740806033279313337271327213747493532060247

^a)SFC＝斑点形成集落/10⁶CD8细胞

表6.DNA免疫的HLA-A2转基因小鼠和非转基因小鼠的脾细胞产生的IFN-Y

			离体RFIa)		stTCLsb)RFla)
							蛋白	基因	肽	A2-c)	A2+c)	A2-c)	A2+c)
LCR蛋白DOMP ALCR蛋白HYop pt蛋白T	CPn 0323CPn 0695CPn 0811CPn 0823	CH 2CH 44CH 45CH 46CH 47CH 48CD3+CD28CH 13CD3+CD28CH 6CD3+CD28CH 7CH 8CD3+CD28	0,053,301,000,901,001,30134,003,29248,711,00290,831,202,00247,60	1,111,781,561,441,781,6790,552,5473,234,5896,105,201,6091,00	0,790,730,470,411,170,1123,421,5311,6916,81	2,576,864,719,001,141,29209,8131,5694,5728,21

^a)相对增加倍数：用受试肽(或CD3/CD28共同刺激)与HepB阴性对照肽获得的IFN-Y⁺/CD8⁺细胞的百分数的比值

^b)短期T细胞系

^c)HLA-A2非转基因小鼠和转基因小鼠

Claims (31)

1.一种用作自动转运抗原的多肽，所述多肽包含：

(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79，

(b)与氨基酸序列(a)有至少50％序列相同性的氨基酸序列；或

(c)含有氨基酸序列(a)的一个或多个至少7个连续氨基酸的片段或其组合的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽用作产生肺炎衣原体特异性免疫应答的抗原。

3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽用作在感染肺炎衣原体的个体中产生全身性免疫应答。

4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽通过V型自动转运分泌系统机制分泌到宿主细胞的胞质中。

5.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：78和SEQ IDNO：79并共享选自G、DG、VG、G、AV、G、IVG、GTLGG、S、IVG和M的一种或多种共有N-末端序列基序。

6.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述共有N-末端序列基序选自GTLGG、S、IVG和M。

7.如权利要求1-3中任一项所述的多肽用于诊断。

8.如权利要求1-3中任一项所述的多肽在制备在个体中预防或治疗肺炎衣原体感染的药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是与感染肺炎衣原体的个体的血清阳性血清发生免疫应答的自动转运蛋白的应用。

10.如权利要求1-3中任一项所述的多肽在制备在个体中诊断肺炎衣原体感染的测定中的应用。

11.一种在个体中引发免疫应答的方法，所述方法包括将包含以下序列的多肽给予个体：

(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79，

(b)与氨基酸序列(a)有至少50％序列相同性的氨基酸序列，或

(c)含有氨基酸序列(a)的一个或多个至少1、2、3、4、5、6或7个氨基酸的片段或其混合物的氨基酸序列。

12.一种在个体中诊断免疫应答的方法，所述方法包括：

(a)将获自个体的生物样品与结合于权利要求1-3中任一项所述多肽的结合剂接触；

(b)检测所述生物样品中结合于结合剂的多肽的量；和

(c)将所述多肽量与预定截止值作比较，从而确定所述个体中是否存在免疫应答。

13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述多肽是如权利要求1-3中任一项所述定义的。

14.如权利要求11所述的方法或权利要求2-6或8-9中任一项所述的应用，其特征在于所述多肽。

15.一种引发免疫应答的组合物，所述组合物包含一种或多种肺炎衣原体自动转运蛋白或其免疫原性片段和一种或多种免疫刺激剂。

16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述肺炎衣原体自动转运蛋白或其免疫原性片段包含：

(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：79；

(b)与氨基酸序列(a)有至少50％序列相同性的氨基酸序列；或

(c)含有氨基酸序列(a)的一个或多个至少1、2、3、4、5、6或7个氨基酸的片段或其组合的氨基酸序列。

17.如权利要求15或16所述的组合物，其特征在于，所述蛋白或其免疫原性片段是如权利要求1-3中任一项所述定义的。

18.一种引发对象的免疫应答的组合物，所述组合物包含两种或多种肺炎衣原体自动转运蛋白或其免疫原性片段。

19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述肺炎衣原体自动转运蛋白或其免疫原性片段包含：

(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：79；

(b)与氨基酸序列(a)有至少50％序列相同性的氨基酸序列；或

(c)含有氨基酸序列(a)的一个或多个至少1、2、3、4、5、6或7个氨基酸的片段或其组合的氨基酸序列。

20.如权利要求18或19所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含一种或多种免疫刺激剂。

21.一种制备如权利要求15或16所述组合物的方法，其特征在于，所述方法包括将一种或多种肺炎衣原体自动转运蛋白或其免疫原性片段与一种或多种免疫刺激剂混合。

22.一种制备如权利要求18或19所述组合物的方法，其特征在于，所述方法包括混合两种或多种肺炎衣原体自动转运蛋白或其免疫原性片段。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法包括将一种或多种免疫刺激剂加入肺炎衣原体自动转运蛋白或其免疫原性片段中。

24.一种选自Cpn0794、Cpn0795、Cpn0796、Cpn0797、CPn0798和Cpn0799或其免疫原性片段肺炎衣原体自动转运蛋白，其中，所述自动转运蛋白包括含有IVG、A、LGG和S的氨基酸基序。

25.如权利要求24所述的自动转运蛋白，其特征在于，所述重复氨基酸基序含有IVG、A、LGG和S。

26.一种用作自动转运抗原的多肽，所述多肽包含对应于SEQ ID NO：86的氨基酸序列，与SEQ ID NO：86有至少50％序列相同性的氨基酸序列，或含有SEQ IDNO：86的一个或多个至少7个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。

27.如权利要求26所述的多肽，其中所述多肽用作产生肺炎衣原体特异性免疫应答的抗原。

28.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽用作在感染肺炎衣原体的个体中产生全身性免疫应答。

29.如权利要求26-28中任一项所述的多肽在制备用于预防或治疗个体肺炎衣原体感染的药物中的应用。

30.一种在个体中产生免疫应答的方法，所述方法包括将多肽给予所述个体，所述多肽包含：对应于SEQ ID NO：86的氨基酸序列，与SEQ ID NO：86有至少50％序列相同性的氨基酸序列，或含有SEQ ID NO：86的一个或多个至少7个连续氨基酸的片段的氨基酸序列。

31.一种诊断个体免疫应答的方法，所述方法包括：

(a)将获自个体的生物样品与结合于权利要求26-28中任一项所述多肽的结合剂接触；

(b)检测所述样品中结合于结合剂的多肽的量；和

(c)将所述多肽量与预定截止值作比较，从而确定所述个体中是否存在免疫应答。

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