KR20220157345A - 아세틸콜린 수용체 저해 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

아세틸콜린 수용체 저해 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아세틸콜린 수용체 저해 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 랜덤 펩타이드 재조합 파지를 이용하여 아세틸콜린 수용체와 결합력이 높은 파지를 스크리닝하고, 파지의 DNA를 통해 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드를 선별하였다. 선별된 펩타이드를 이용하여 아세틸콜린 수용체와의 결합력 및 아세틸콜린 수용체 작용 억제 효과를 확인하였고, 펩타이드의 변형을 통해 아세틸콜린 수용체와의 결합에 중요한 펩타이드 부위 및 서열을 확인함으로써, 본 발명의 아세틸콜린 수용체 저해 펩타이드를 이용하여 주름 개선용 화장료 조성물, 아세틸콜린 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약품 및 개선용 건강기능식품을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

아세틸콜린 수용체 저해 펩타이드 및 이의 용도{Peptide for inhibition of acetylcholine receptor and use thereof}
본 발명은 아세틸콜린 수용체 저해 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
아세틸콜린(acetylcholine)은 동물의 신경조직에 존재하는 화학물질로 신경의 말단에서 분비되며, 신경의 자극을 근육에 전달하는 역할을 한다. 신경말단으로부터 분비되는 전달물질로는 운동신경과 부교감신경에서는 아세틸콜린이, 교감신경에서는 에피네프린(아드레날린)이 알려져 있다. 아세틸콜린이 분비되면 혈압강하, 심장박동억제, 장관수축, 골격근 수축 등의 생리작용을 나타낸다. 근육이 수축하려면 신경이 근육에 수축하라는 명령을 내리고 이에 따라 근육이 수축을 하게 되는데, 그 명령은 신경과 근육이 서로 만나는 부분(신경-근 접합부)에서 신경이 아세틸콜린을 분비하고 이 물질이 근육의 아세틸콜린 수용체에 접합하여 근육은 수축을 할 수 있게 된다(Vincent, A., 1985; Lindstrom, J.M., et al., 1976). 대퇴부 골격근을 지배하는 말초의 아세틸콜린 수용체를 차단하면 근육운동의 마비가 일어나며, 호흡 또는 심장 운동을 담당하는 평활근 및 심장근의 아세틸콜린 수용체를 차단하면 호흡, 심장 운동 마비가 일어난다.
아세틸콜린 수용체는 무스카린성 아세틸콜린 수용체(muscarinic acetylcholine receptor, mAchR)와 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor, nAchR)로 분류된다. 무스카린성 아세틸콜린 수용체는 무스카린(muscarine)으로 활성화시킬 수 있는 G 단백결합 수용체(G protein-coupled receptor)이며 아형(subtype)에 따라 서로 다른 신호전달기전을 활성화시킨다. 무스카린성 아세틸콜린 수용체는 중추신경계(central nervous system)와 말초 장기(peripheral organ)를 포함하여 온 몸에 분포하고 있으며, 주로 부교감신경계(parasympathetic nervous system)의 신경절 이후 섬유에서 분비되는 아세틸콜린의 생리적 작용을 매개하는 역할을 한다.
니코틴성 아세틸콜린 수용체는 니코틴(nicotine)에 의한 약리작용을 모방하는 수용체로, 신경전달물질에 의해서 조작되는 이온 채널(ion channel)이다. 이온 채널의 개방 및 폐쇄를 통해서 나트륨, 칼륨, 칼슘 이온 등을 비선택적으로 통과시키는 비선택적 양이온 통로로서, 신경세포와 근육세포 간의 전기적 신호전달(electronic signaling)을 조절한다. 니코틴성 아세틸콜린 수용체는 발현 부위에 따라 근육형(muscle type)과 신경형(neuronal type)으로 나눌 수 있다. 근육형 니코틴성 아세틸콜린 수용체는 운동신경(motor neuron)과 골격근(skeletal muscle)이 만나는 신경근육접합부(neuromuscular junction)에 발현되어 있으며, 운동 신경에서 분비된 아세틸콜린이 골격근 세포막의 종판전압(end plate potential, EPP)을 유발하는데 기여한다. 한편, 신경형 니코틴성 아세틸콜린 수용체는 자율신경계(autonomic nervous system, ANS)의 말초 신경절(ganglia)에 발현되어 있어 신경절 이전 섬유(preganglionic fiber)에서 분비된 아세틸콜린이 신경절 이후 섬유(postganglionic fiber)를 흥분시키는데 기여한다.
아세틸콜린의 활성을 방해 혹은 저해하거나 행동을 모방하는 약물이 매우 유용하게 사용되고 있다. 아세틸콜린 수용체 작용제는 중증 근무력증과 알츠하이머 병을 치료하는데 이용된다. 중증 근무력증의 경우, 몸에서 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 항체를 생산하여 정상적인 아세틸콜린 신호 전달을 저해하여 생기는 자가면역질환으로, 아세틸콜린에스터레이스(acetylcholine esterase, AChE) 저해제를 이용하여 신경과 근육 사이의 시냅스 간극에서 아세틸콜린이 불활성화되기 전에 각 수용체와 상호작용할 수 있는 시간을 늘려주어 중증 근무력증을 치료할 수 있다.
또한, 아세틸콜린의 분비를 방해하면 근육의 수축을 억제하여 근육이 마비가 되면서 주름살이 펴지는데, 이를 이용한 것이 보톡스(botox)이다. 보톡스는 운동신경 말단에서 근육의 수축에 필수적인 물질인 아세틸콜린이 분비되는 과정을 막는다. 그 결과 근육이 움직일 수 없게 되고, 근육에 의해 유발되던 주름이 없어지게 된다. 보톡스에 의한 근-이완 효과는 3~6주 후에 점차 사라지기 때문에 반복투여를 필요로 한다.
이에 본 발명자들은, 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드를 연구하는 과정에서, 아세틸콜린 수용체와 결합력이 높은 펩타이드를 스크리닝하여 확보하였고, 이러한 펩타이드가 아세틸콜린 수용체와 결합하여 아세틸콜린 결합을 방지함으로써 아세틸콜린 수용체 작용을 억제한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
또한 상기 스크리닝된 펩타이드가 아세틸콜린 수용체와 결합하여 그 작용을 억제하는 데에 있어서 중요한 특정 아미노산의 일정한 배치순서를 확인하고, 일정한 식으로 표현되는 상기 펩타이드의 라이브러리가 전체적으로 아세틸콜린 수용체와 결합하여 그 작용을 억제하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
종래선행기술인 한국등록특허 제1216008호에는 바이오패닝을 이용하여 선별한, 아세틸콜린 수용체에 결합하는 펩타이드가 기재되어 있으나, 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 라이브러리는 기재되어 있지 않다. 또한, 한국공개특허 제2018-0028748호에는 아세틸콜린을 포함하는 신경전달물질 방출 조절 펩타이드 및 이의 주름 개선 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 아세틸콜린 수용체 결합력 및 이로 인한 아세틸콜린 수용체 작용 억제 효과는 기재되어 있지 않다. 한국공개특허 제2014-0139010호에는 경피 투과 촉진을 위한 펩타이드가 기재되어 있으나, 본 발명의 아세틸콜린 수용체 결합을 통한 작용 억제 펩타이드와는 그 구성이 차이가 있다.
한국등록특허 제1216008호, 바이포달 펩타이드 바인더, 2012. 12. 20. 등록. 한국공개특허 제2018-0028748호, 신경세포 투과성이 향상된 신경전달물질 조절 펩타이드, 2018. 03. 19. 공개. 한국공개특허 제2014-0139010호, 국소 화학탈신경계를 이용한 주름 치료 방법, 2014. 12. 04. 공개.
Lindstrom, J.M., et al., Antibody to acetylcholine receptor in myasthenia gravis: Prevalence, chlincal correlates, and diagnostic value, Neurology, 26, 1054-1059, 1976. Vincent, A., et al., Acetylcholine receptor antibody as a diagnosis test for myasthenia gravis: results in 153 validated cases and 2967 diagnostic assays, J. Neurol. Neurolsurg. Psychiatry, 48, 1246-1252, 1985.
본 발명의 목적은 아세틸콜린 수용체 저해 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드에 관한 것이다.
[화학식 1]
X L -(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-X M -(K 또는 R)-X N
상기 XL, XM, XN은 각각 독립적으로 1~8개, X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열일 수 있으며, 바람직하게는 XL , XM, XN은 각각 독립적으로 1~4개, X는 1개의 임의의 아미노산일 수 있다.
본 발명은 하기 화학식 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드에 관한 것이다.
[화학식 2]
(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-(K 또는 R)-X M-1 -(K 또는 R)
상기 XM-1은 1~3개, X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열일 수 있으며, 바람직하게는 XM-1은 3개, X는 1개의 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 200 (표 10 참조)으로 이루어진 군에서 선택되는 중 어느 하나의 서열에 의한 펩타이드일 수 있다.
본 발명은 하기 화학식 3 또는 3-1 로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드에 관한 것이다.
[화학식 3]
X L -(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-(K 또는 R)-X M-1 -(K 또는 R)
상기 XL, XM-1은 각각 독립적으로 1~3개, X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열일 수 있으며, 바람직하게는 상기 XL, XM-1은 각각 독립적으로 3개, X는 1개의 임의의 아미노산일 수 있다.
[화학식 3-1]
(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-(K 또는 R)- X M -1 -(K 또는 R)- X N
상기 XM -1, XN은 각각 독립적으로 1~3개, X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열일 수 있으며, 바람직하게는 상기 XM -1, XN은 각각 독립적으로 3개, X는 1개의 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 펩타이드는 서열번호 201 내지 400 (표 11 참조)으로 이루어진 군에서 선택되는 중 어느 하나의 서열에 의한 펩타이드일 수 있다.
본 발명은 하기 화학식 4로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드에 관한 것이다.
[화학식 4]
X L -(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-(K 또는 R)-X M-1 -(K 또는 R)-X N
상기 XL, XM-1, XN 은 각각 독립적으로 1~3개, X는 1개의 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 상기 XL, XM-1, XN은 각각 독립적으로 3개, X는 1개의 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 펩타이드는 서열번호 401 내지 600 (표 12 참조)으로 이루어진 군에서 선택되는 중 어느 하나의 서열에 의한 펩타이드인 것을 특징으로 하는 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드일 수 있다.
상기 펩타이드는 8~28개의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 바람직하게는 8~16개이며, 더 바람직하게는 8~14개이며, 더욱 바람직하게는 11~16개이며, 가장 바람직하게는 14개이다.
상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드는 상기 화학식 1로 표현되는 아미노산 서열을 중심으로 하여, 1, 3 및 8번째 아미노산인 K 또는 R 이 아세틸콜린 수용체 결합에 있어서 중요한 부위일 수 있다.
또한 상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드는 상기 화학식 2로 표현되는 아미노산 서열을 중심으로 하여, 1, 3, 4 및 8번째 아미노산인 K 또는 R 이 아세틸콜린 수용체 결합에 있어서 중요한 부위일 수 있다.
상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드의 아미노산 서열은 본 발명의 선행특허인 대한민국 등록특허 제10-1971092호에 기재된 아미노산 서열을 제외한다. 상기 대한민국 등록특허 제10-1971092호에 기재된 아미노산 서열은 WTWKGRKSLLR을 포함한다.
상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드의 아미노산 서열은 대한민국 공개특허 10-2014-0139010호에 기재된 아미노산 서열을 제외한다. 상기 대한민국 공개특허 10-2014-0139010호에 기재된 아미노산 서열은 (gly)n1-(arg)n2, (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q, (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q 상기 아래첨자 p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수이고, 상기 아래첨자 n1은 독립적으로 1 내지 8의 정수이고, 상기 아래첨자 n2는 독립적으로 7 내지 17의 홀수인 서열 펩타이드이다.
본 발명은 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단이 변형(modification)된 것을 특징으로 하는 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드에 관한 것이다.
상기 N-말단 또는 C-말단이 변형(modification)된 것은 팔미토일화(palmitoylation), 아세틸화(acetylation), 아미드화(amidation), 포르밀화(formylation) 또는 페길화(PEGylation)되거나, 또는 2-메르캅토아세트산(2-mercaptoacetic acid), 3-메르캅토프로피오닉산(3-mercaptopropionic acid), 6-메르캅토헥사노익산(6-mercaptohexanoic acid), 피로글루탐산(pyroglutamic acid), 숙신이미드산(succinimide acid), 시스트라민(cystramine), 시스테아민(cysteamine), 메틸에스테르(methyl ester), 에틸에스테르(ethyl ester), 벤질에스테르(benzyl ester) 및 지방산, 예를 들면, 미리스트산(myristic acid), 스테아르산(stearic acid), 팔미트산(palmitic acid), 콜레스테롤(cholesterole), 6-아미노 헥사노익산(6-amino hexanoic acid) 및 8-아미노 옥타노익산(8-amino octanoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 결합에 의한 것을 특징으로 하는 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드일 수 있다.
본 발명은 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "펩타이드(peptide)"란 아미드 결합 또는 펩타이드 결합으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다.
본 발명에 있어서, "아미노산(amino acid)"이란 펩타이드 분야에서 합성 펩타이드를 제조하는데 사용되는 천연 아미노산 및 기타 아미노산, 예컨대, 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 염기서열로 암호화되지 않은 아미노산 등의 L- 및 D- 이성질체를 모두 포함한다.
상기 천연 아미노산은 알라닌(alanine, Ala, A), 시스테인(cystenin, Cys, C), 아스파트산(Aspartic acid, Asp, D), 글루탐산(glutamic acid, Glu, E), 페닐알라닌(phenylalanine, Phe, F), 글리신(glycine, Gly, G), 히스티딘(histidine, His, H), 이소류신(isoleucine, Ile, I), 리신(lysine, Lys, K), 류신(leucine, Leu, L), 메티오닌(methionine, Met, M), 아스파라긴(asparagine, Asn, N), 프롤린(proline, Pro, P), 글루타민(glutamine, Gln, Q), 아르기닌(arginine, Arg, R), 세린(serine, Ser, S), 트레오닌(threonine, Thr, T), 발린(Valine, Val, V), 트립토판(tryptophan, Trp, W), 및 티로신(tyrosine, Tyr, Y)일 수 있다.
상기 기타 아미노산은 2-아미노아디픽산(2-aminoadipic acid, 2-aminohexanedioic acid), α-아스파라긴(α-asparagine), 2-아미노부타노익산(2-aminobutanoic acid), 2-아미노카프릭산(2-aminocapric acid, 2-aminodecanoic acid), α-글루타민(α-glutamine), α-아미노이소부티릭산(α-aminoisobutyric acid, α-methylalanine), 2-아미노피멜릭산(2-aminopimelic acid, 2-aminohepanedioic acid), γ-아미노-β-히드록시벤젠펜타노익산(γ-amino-β-hydroxybenzenepentanoic acid), 2-아미노수베릭산(2-aminosuberic acid, 2-aminooctanedioic acid), 2-카르복시아제티딘(2-carboxyazetidine), β-알라닌(β-alanine), β-아스파트산(β-aspartic acid), 3,6-디아미노헥사노익산(3,6-diaminohexanoic acid, β-lysine), 부타노익산(butanoic acid), 4-아미노-3-히드록시부타노익산(4-amino-3-hydroxybutanoic acid), γ-아미노-β-히드록시시클로헥산펜타노익산(γ-amino-β-hydroxycyclohexanepentanoic acid), 3-시클로헥실알라닌(3-cyclohexylalanine), N5-아미노카르보닐오르니틴(N5-aminocarbonylornithine), 3-설포알라닌(3-sulfoalanine), 2,4-디아미노프로파노익산(2,3-diaminopropanoic acid), 2,7-디아미노수베릭산(2,7-diaminosuberic acid, 2,7-diaminooctanedioic acid), S-에틸티오시스테인(S-ethylthiocysteine), γ-글루탐산(γ-glutamic acid), γ-카르복시글루탐산(γ-carboxylglutamic acid), 히드록시아세트산(hydroxyacetic acid, glycolic acid), 피로글루탐산(pyroglutamic acid), 호모아르기닌(homogrginine), 호모시스테인(homocysteine), 호모히스티딘(homohistidine), 2-히드록시이소발레릭산(2-hydroxyisovaleric acid), 호모세린(homoserine), 2-히드록시펜타노익산(2-hydroxypentanoic acid), 5-히드록시리신(5-hhydroxylysine), 4-히드록시프롤린(4-hydroxyproline), 이소발린(isovaline), 2-히드록시프로파노익산(2-hydroxypropanoic acid, lactic acid), 메르캅토아세트산(mercaptoacetic acid), 메르캅토부타노익산(mercaptobutanoic acid), 3-히드록시-4-메틸프로롤린(3-hydroxy-4-methylproline), 메르캅토프로파노익산(mercaptopropanoic acid), 3-나프틸알라닌(3-naphthylalanine), 노르류신(norleucine), 노르티로신(nortyrosine), 노르발린(norvaline), 2-카르복시옥타히드로인돌(2-carboxyoctahydroindole), 오르니틴(ornithine), 페니실라민(penicillamine, 3-mercaptovaline), 2-페닐글리신(2-phenylglycine), 2-카르복시피페리딘(2-carboxypiperidine), 사르코신(sarcosine, N-methylglycine), 1-아미노-1-카르복시시클로펜탄(1-amino-1-carboxycyclopentane), 스타틴(statin, 4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoic acid), 3-티에닐알라린(3-thienylalanine), 3-카르복시이소퀴놀린(3-carboxyisoquinoline), 3-메틸발린(3-methylvaline), ε-N-트리메틸리신(ε-N-trimethyllysine), 3-티아졸릴알라닌(3-thiazolylalanine), α-아미노-2,4-디옥소피리미딘프로파노익산(α-amino-2,4-dioxopyrimidinepropanoic acid) 등일 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당 분야에 널리 공지된 방법을 통해 획득할 수 있다. 구체적으로는 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성 방법을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다. 보다 구체적으로는 당 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들면, 자동 펩타이드 합성기로 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술로 생산할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 유전자 조작을 통하여 융합 파트너와 본 발명의 펩타이드로 이루어진 융합 단백질을 암호화 하는 유전자를 제조하고, 제조된 유전자를 숙주 미생물에 형질전환시킨 후, 숙주 미생물에서 융합 단백질 형태로 발현 시키고, 단백질 분해 효소 또는 화합물을 이용하여 융합 단백질로부터 본 발명의 펩타이드를 절단, 분리하여 원하는 펩타이드를 생산할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 염 형태로 존재할 수도 있다. 본 발명에 사용 가능한 염의 형태는 화합물의 최종 분리 및 정제 동안 또는 아미노기를 적절한 산과 반응시키는 것에 의해 만들어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 산 부가염으로 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 포르메이트, 푸마레이트, 하이드로 클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메시틸렌설포네이트, 메탄설포네이트, 나프틸렌설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 트리클로로아테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, 파라-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 산 부가염을 형성하기 위해 사용될 수 있는 산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 펩타이드는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 목적으로 고안된 아미노산 서열 추가, 표적화, 효능 증가 또는 안정성을 증가시키기 위한 항체 또는 항체절편, 인간혈청알부민(HSA) 등과의 결합 또는 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단을 변형(modification)시킬 수 있다.
상기 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 바람직하게는 상기 항체는 특정 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb), 다클론 항체(polyclonal antibody, pAb) 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다. 상기 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
상기 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2, Fv 등이 있다.
상기 펩타이드는 특정 조직으로 전달 또는 안정성 확보를 위해 나노입자, 마이크로입자, 금속입자, 세라믹입자, 하이드로겔 등에 내포 또는 고정화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 나노입자, 마이크로입자, 금속입자, 세라믹입자, 하이드로겔 등은 생체적합적이며, 독성이 없는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, "아세틸콜린 수용체(acetylcholine receptor, AchR)"는 신경의 말단에서 분비되는 아세틸콜린이 결합하는 수용체로써, 아세틸콜린에 의한 신경의 자극을 전달하는 통로 역할을 한다. 예를 들면, 근육의 수축이 필요한 경우, 신경이 근육에 수축하라는 명령을 내리면 신경과 근육이 만나는 부분에서 신경이 아세틸콜린을 분비하고, 분비된 아세틸콜린이 근육의 아세틸콜린 수용체에 결합하면 근육이 수축된다.
본 발명의 아세틸콜린 수용체는 무스카린성 아세틸콜린 수용체와 니코틴성 아세틸콜린 수용체로 분류되며, 본 발명의 아세틸콜린 수용체는 니코틴성 아세틸콜린 수용체가 바람직하다.
상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드는 아세틸콜린 수용체에 결합하여 아세틸콜린이 수용체에 결합하는 것을 방지하여 아세틸콜린 수용체 작용을 억제할 수 있다. 바람직하게는 근육의 수축을 억제하여 주름개선, 비정상적인 근육 수축 억제 효과를 나타내며, 수술시 근육의 이완을 촉진하여 수술의 편의성을 확보할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)를 제공한다. 상기 아세틸콜린 수용체에 대하여 결합 활성을 나타낼 수 있는 펩타이드를 암호화 할 수 있는 한, 상기 폴리뉴클레오티드를 이루고 있는 염기 서열과 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있다. 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, 더 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명은 또한, 상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드는 아세틸콜린 수용체 작용을 억제하여 근육의 수축이 일어나는 것을 방지하여 주름을 개선할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드 및 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 또는 염료를 함유할 수 있다.
상기 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 수 있다.
상기 주름 개선용 화장료 조성물은 추가 첨가제를 포함하여 제조할 수 있다.
상기 첨가제는 보습제(moisturizer), 기능성 원료, 점증제(thickener), 유연제, 유화제(emulsifier), 계면활성제 및 pH 조절제 등일 수 있다.
상기 보습제로는 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 히알루론산(hyaluronic acid) 및 세라마이드(ceramide) 성분 등일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 점증제로는 폴리머, 잔탄검, 구아검일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 유연제로는 미네랄 오일, 쉐아버터(shea butter), 파라핀일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 유화제로는 디메치콘, 비즈왁스 등 일 수 있다.
상기 주름 개선용 화장료 조성물은 주름 개선 효과가 있는 원료와 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 주름 개선 효과가 있는 원료는 비타민 A, 비타민 A 유도체(레티닐팔미테이트, 레티닐아세테이트 등), 아데노신, 폴리에톡실레이티드레틴아마이드일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트리젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 마스크팩, 비누, 바디클렌져, 클렌징폼, 바디오일 및 바디로션으로 이루어지 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화장료 조성물은 매일 사용할 수 있으며, 또한, 정해지지 않은 기간 동안에도 사용할 수 있고, 바람직하게는 사용자의 연령, 피부상태 또는 피부타입에 따라 사용량, 사용횟수 및 기간을 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드를 포함하는 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 아세틸콜린 수용체와 결합하여 아세틸콜린 수용체 활성화를 억제함으로써 상기 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환은 근육이 비정상적으로 과하게 수축하는 현상이 있는 질환으로, 경부근긴장이상증(cervical dystonia), 사지 긴장 이상증(limb dystonia), 체부 근육긴장이상증(truncal dystonia), 안검경련(blepharospasm, 얼굴떨림), 경직(spasticity), 반측안면경련(hemifacial spasm), 사시(strabismus), 안구떨림(nystagmus), 틱(tics), 만성 통증(chronic pain), 만성 편두통(chronic migraine), 신경인성 방광(neurogenic bladder), 배뇨근-괄약근 협동장애(detrusor-sphincter dyssynergia), 식도이완 불능증(achalasia cardia), 다한증(hyperhidrosis), 타액 분비 과다(sialorrhea), 소아 뇌성마비, 뇌졸중 후 근육강직, 요통, 전립선 비대증, 요실금, 성대 결절 및 교정, 치질, 치열 등일 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 수술시 근육의 이완을 촉진하여 수술의 편의성을 확보하는데 사용될 수 있으며, 니코틴 중독에 의한 질환의 치료제 또는 보조제, 주름 제거, 사각턱 또는 종아리 교정을 위해 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 제형에 특별한 제한을 두지는 않으나, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 겔제 및 젤 중에서 선택되는 1종의 제형을 갖는 피부 외용제로 사용될 수 있다. 경피 흡수를 증가시키는 제제, 예를 들면 비한정적인 의미로 특히 디메틸설폭사이드, 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드, 계면활성제, 알코올, 아세톤, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜을 포함할 수 있다. 도포 빈도는 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 상당히 변할 수 있으며, 도포 빈도는 매달 내지 1일 10회, 바람직하게는 매주 내지 1일 4회, 더 바람직하게는 1주당 3회 내지 1일 3회, 보다 더 바람직하게는 1일 1회 또는 2회 적용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 피부, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는 피부 투여이다.
본 발명은 또한, 상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드를 포함하는 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 나노캡슐을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드를 포함하는 의료기기용 조성물을 제공한다.
상기 의료기기용 조성물은 필러일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 "필러(filler)"란, 피부 조직을 보충할 수 있는 물질로, 얼굴의 탱탱함 복원, 윤곽 개선, 주름 완화를 위해 주입되어 채우는 것을 목적으로 한다.
상기 의료기기용 조성물은 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드에 의해 근육의 수축을 억제하여 주름을 완화할 수 있고, 윤곽 개선 효과도 나타낼 수 있으며, 상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드가 고정된 생체적합적인 마이크로입자, 나노입자, 하이드로겔 등을 주입함으로 조직을 채워줄 수 있다.
본 발명은 아세틸콜린 수용체 저해 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 랜덤 펩타이드 재조합 파지를 이용하여 아세틸콜린 수용체와 결합력이 높은 파지를 스크리닝하고, 파지의 DNA를 통해 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드를 선별하였다. 선별된 펩타이드를 이용하여 아세틸콜린 수용체와의 결합력 및 아세틸콜린 수용체 작용 억제 효과를 확인하였고, 펩타이드의 변형을 통해 아세틸콜린 수용체와의 결합에 중요한 펩타이드 부위 및 서열을 확인하였다.
또한 상기 확인된 펩타이드의 아미노산 서열을 중요한 펩타이드 부위 및 서열을 중심으로 일정한 식으로 표현하고, 상기 펩타이드의 라이브러리를 제작하였으며, 제작된 라이브러리가 전체적으로 아세틸콜린 수용체와 결합하여 그 작용을 억제하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 아세틸콜린 수용체 저해 펩타이드를 이용하여 주름 개선용 화장료 조성물, 아세틸콜린 수용체 관련 질환의 예방 또는 치료를 의한 의약품 및 개선용 건강기능식품을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 스크리닝하여 선별한 펩타이드(에스펩-1~11)의 아세틸콜린 수용체 결합력을 분석한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 TE671 세포에서 선별한 펩타이드의 아세틸콜린 수용체 작용 억제 효과를 확인한 결과로, (A~C)는 Synake와 에스펩-1, 에스펩-2, 에스펩-4, 에스펩-10펩타이드의 농도에 따른 아세틸콜린에 의한 아세틸콜린 수용체 작용 억제 효과를, (D)는 니코틴에 의한 아세틸콜린 수용체 작용 억제 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 Synake, 에스펩-1, 에스펩-2 펩타이드의 TE671 세포에 대한 세포 독성 결과를 보여주고 있다. 100 ㅅM 고농도에서도 모두 세포독성이 없음을 확인하였다.
도 4는 에스펩-2의 농도에 따른 아세틸콜린 수용체와의 결합력을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 에스펩-2의 아미노산 서열을 기반으로 양 말단이 절단된 형태의 펩타이드를 이용하여 펩타이드 크기에 따른 아세틸콜린 수용체 결합에 중요한 서열 부위를 확인한 결과로, (A)는 N-말단이 절단된 형태의 펩타이드(에스펩-2-ND1~ND5)를, (B)는 C-말단이 절단된 형태의 펩타이드(에스펩-2-CD1~CD5)를 이용하여 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 6은 (A) 에스펩-2-ND3 및 (B)에스펩-2-ND5의 아세틸콜린 수용체 결합능을 비교한 결과를 보여주고 있다. 에스펩-2-ND3 (8mer) 까지는 결합력이 별 차이가 없으나 에스펩-2-ND5(6mer)는 에스펩-2(11mer) 대비 48배 떨어짐을 확인하였다.
도 7은 (A)에스펩-1-ND3 및 (B)에스펩-2-ND3의 아미노산 서열을 기반으로 알라닌-스캐닝 방법을 이용하여 아세틸콜린 수용체 결합에 중요한 부위를 확인한 결과이다.
도 8은 Palmitoyl가 결합되어 있는 에스펩-2와 에스펩-2의 아세틸콜린 수용체와의 결합력을 비교한 결과를 보여주고 있다. 팔미테이트가 결합되면서 결합력이 향상됨을 확인 할 수 있다.
도 9는 Palmitoyl-에스펩-2가 마이셀을 형성함을 확인하였다. Pal-에스펩-2가 마이셀을 이루면서 avidity 효과에 의해 결합력이 향상되었다.
도 10은 Palmitoyl-에스펩-2를 농도별로 처리하였을 때 AchR 작용 억제 효과를 에스펩-2, Synake, 분가로톡신(Bungarotoxin)과 비교한 결과이다. Pal-에스펩-2의 결합력이 향상되면서 저해능도 에스펩-2 대비 10배 정도 향상되었다.
도 11은 Palmitoyl가 결합된 에스펩-2의 TE671 세포에 대한 독성 결과를 보여주고 있다. 10 ㅅM 고농도에서도 세포독성이 없음을 확인하였다.
도 12는 에스펩-2-ND3를 야생으로 하고, 이의 아미노산 서열 중 K는 R로, R은 K 또는 N으로 치환한 펩타이드의 표면 플라스몬 공명 분석 방법과 동일한 방법으로 AchR과의 결합력을 확인한 것이다. K나 R로 치환했을 때는 활성이 유지되나 N으로 치환시키면 활성이 현저하게 떨어짐을 확인하였다.
도 13은 아세틸콜린 수용체에 대하여 최적화 펩타이드 라이브러리인 8mer L1[(K또는 R)-X-(K 또는 R)(K 또는 R)-XXX-(K 또는 R), X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열], 11mer L2[XXX(K또는 R)-X-(K 또는 R)(K 또는 R)-XXX-(K 또는 R), X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열], 14mer L3[XXX(K또는 R)-X-(K 또는 R)(K 또는 R)-XXX-(K 또는 R)XXX, X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열], 18mer L4[XXXXX(K 또는 R)-X-(K 또는 R)(K 또는 R)-XXX-(K 또는 R)XXXXX, X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열]을 제작한 후 바이오 패닝 단계에서 스크리닝한 파지의 아세틸콜린 수용체에 대한 결합력 및 특이도를 확인한 결과를 보여주고 있다. 박스 친 부분이 첫 번째 라이브러리로써 L1(8mer), L2(11mer), L3(14mer) 라이브러리 모두 첫 번째 라이브러리 자체가 이미 아세틸콜린 수용체에 대한 결합력과 특이성이 높음을 확인할 수 있었으나 펩타이드 크기가 제일 큰 L4(18mer) 라이브러리 자체는 아세틸콜린수용체에 대한 결합력과 특이성이 없음을 확인할 수 있다.
도 14는 최적화 펩타이드 L1(8mer) 라이브러리의 바이오패닝 4,5단계에서의 아세틸콜린 수용체에 특이적인 펩타이드 파지를 스크리닝하여 스트렙트아비딘 흡광도 대비 아세틸콜린 수용체 흡광도 비율을 분석한 결과를 보여주고 있다. 컨트롤(con)로 에스펩-2를 같이 실험하였으며 모든 펩타이드들이 에스펩-2보다 결합력과 특이성이 좋음을 확인할 수 있다.
도 15는 최적화 펩타이드 L2(11mer) 라이브러리의 바이오패닝 4,5단계에서의 아세틸콜린 수용체에 특이적인 펩타이드 파지를 스크리닝하여 스트렙트아비딘 흡광도 대비 아세틸콜린 수용체 흡광도 비율을 분석한 결과를 보여주고 있다. 컨트롤(con)로 에스펩-2를 같이 하였으며 모든 펩타이드들이 에스펩-2보다 결합력과 특이성이 좋음을 확인할 수 있다.
도 16은 최적화 펩타이드 L3(14mer) 라이브러리의 바이오패닝 4,5단계에서의 아세틸콜린 수용체에 특이적인 펩타이드 파지를 스크리닝하여 스트렙트아비딘 흡광도 대비 아세틸콜린 수용체 흡광도 비율을 분석한 결과를 보여주고 있다. 컨트롤(con)로 에스펩-2를 같이 하였으며 모든 펩타이드들이 에스펩-2보다 결합력과 특이성이 좋음을 확인할 수 있다.
도 17은 최적화 펩타이드 L1(8mer)라이브러리에서 특이적으로 우수한 펩타이드를 40개 선별하여 아세틸콜린 수용체와의 결합력을 비교한 결과를 보여주고 있다. 모든 최적화 펩타이드가 에스펩-2 보다 결합력이 높음을 확인하였다.
도 18은 최적화 펩타이드 L2(11mer)라이브러리에서 특이적으로 우수한 펩타이드를 40개 선별하여 아세틸콜린 수용체와의 결합력을 비교한 결과를 보여주고 있다. 모든 최적화 펩타이드가 에스펩-2 보다 결합력이 높음을 확인하였다.
도 19는 최적화 펩타이드 L3(14mer)라이브러리에서 특이적으로 우수한 펩타이드를 40개 선별하여 아세틸콜린 수용체와의 결합력을 비교한 결과를 보여주고 있다. 모든 최적화 펩타이드가 에스펩-2 보다 결합력이 높음을 확인하였다.
도 20은 선별한 최적화 펩타이드 L1(8mer) 40개 중 높은 순으로 20개 펩타이드에 대한 아세틸콜린 수용체 억제효과를 비교한 결과를 보여주고 있다. 모든 최적화 펩타이드가 에스펩-2 보다 저해능이 좋음을 확인하였다.
도 21은 선별한 최적화 펩타이드 L2(11mer) 40개 중 높은 순으로 20개 펩타이드에 대한 아세틸콜린 수용체 억제효과를 비교한 결과를 보여주고 있다. 모든 최적화 펩타이드가 에스펩-2 보다 저해능이 좋음을 확인하였다.
도 22는 선별한 최적화 펩타이드 L3(14mer) 40개 중 높은 순으로 20개 펩타이드에 대한 아세틸콜린 수용체 억제효과를 비교한 결과를 보여주고 있다. 모든 최적화 펩타이드가 에스펩-2 보다 저해능이 좋음을 확인하였다.
도 23은 최적화 펩타이드 L1(8mer), L2(11mer), L3(14mer) 중 가장 친화력이 높은 대표 펩타이드에 대한 아세틸콜린 수용체와의 결합력을 비교한 결과를 보여주고 있다.
도 24는 에스펩-2와 선별된 대표 펩타이드의 아세틸콜린 수용체 억제효과를 농도별로 비교한 결과를 보여주고 있다.
도 25는 에스펩-2와 선별된 대표 펩타이드의 아세틸콜린 수용체 억제효과 배수를 비교한 결과를 보여주고 있다. L3-37 펩타이드가 에스펩-2보다 32배 억제능이 향상되었음을 확인하였다.
도 26은 대표 펩타이드인 L3-37 펩타이드 말단의 다양한 변형을 통한 아세틸콜린 수용체에 대한 결합력을 비교한 결과를 보여주고 있다.
도 27은 대표 펩타이드인 L3-28 펩타이드 말단의 다양한 변형을 통한 아세틸콜린 수용체에 대한 결합력을 비교한 결과를 보여주고 있다.
도 28은 대표 펩타이드인 L3-27 펩타이드 말단의 다양한 변형을 통한 아세틸콜린 수용체에 대한 결합력을 비교한 결과를 보여주고 있다.
도 29는 대표 펩타이드인 L2-110 펩타이드 말단의 다양한 변형을 통한 아세틸콜린 수용체에 대한 결합력을 비교한 결과를 보여주고 있다.
도 30은 Myristic-L3-37과 Stearic-L3-37의 마이셀을 형성한 결과를 보여주고 있다.
도 31은 Palmitoyl-L3-37, Palmitoyl-L3-28, Palmitoyl-L3-27, Palmitoyl-L2-110을 농도별로 처리하였을 때 AchR 작용 억제 효과를 분가로톡신(Bungarotoxin)과 비교한 결과이다.
도 32는 Palmitoy-L3-37의 TE671 세포에 대한 독성 결과를 보여주고 있다.
도 33는 Palmitoy-L3-28의 TE671 세포에 대한 독성 결과를 보여주고 있다.
도 34는 Palmitoy-L3-27의 TE671 세포에 대한 독성 결과를 보여주고 있다.
도 35는 Palmitoy-L2-110의 TE671 세포에 대한 독성 결과를 보여주고 있다.
도 36은 Palmitoyl-L3-37 펩타이드를 CatWalk 장비를 이용하여 동물 효능을 평가한 결과를 보여주고 있다.
도 37는 Palmitoyl-L3-37 펩타이드를 농도별로 동물 효능 평가를 하기 위해 DAS 분석법을 이용한 결과를 보여주고 있다.
도 38는 Palmitoyl-L3-37 펩타이드의 동물 효능을 DAS 분석법으로 평가한 뒤 회복 되는 결과를 보여주고 있다.
도 39은 Palmitoyl-L3-37 펩타이드의 동물 급성 독성 평가 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 바이오패닝을 통한 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드 스크리닝>
본 발명의 발명자들은 선행특허(한국 등록특허 제10-1971092호)에 기재된 방법에 따라 랜덤 펩타이드 라이브러리 DNA 제작 및 형질 전환을 통하여 랜덤 재조합 파지를 생산하고, 바이오 패닝(biopanning)을 통하여 아세틸콜린 수용체(AchR) 결합 펩타이드를 스크리닝 하였다. 이때 AchR와 결합력 및 특이성이 높은 4 및 5 회차 바이오패닝 투입 파지로부터 AchR 특이적인 펩타이드를 선별하여 서열 분석한 결과를 표 1에 나타내었다.
펩타이드 명 아미노산서열
에스펩-1 WTWKGKGTLNR
에스펩-2 WTWKGRKSLLR
에스펩-3 WTWKGEDKGKN
에스펩-4 WTWKGRDKLQM
에스펩-5 WTWKGQLGQLS
에스펩-6 WTWKGGRLSAS
에스펩-7 WTWKGRQLNNQ
에스펩-8 WTWKGDNLQNN
에스펩-9 WTWKGLYQRLG
에스펩-10 WTWKGNKQVKF
에스펩-11 WTWKGETYDSK
<실시예 2. 펩타이드의 아세틸콜린 수용체 결합력 확인>
상기 실시예 1에서 선별된 에스펩-1~11를 합성하였고, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석기기(Biacore3000, Biacore A, 스웨덴)를 이용하여 AchR과의 결합력을 비교하였다.
표면 플라스몬 공명 분석용 바이오센서 칩인 CM5 칩에 EDC/NHS를 이용하여 아세틸콜린 수용체 단백질을 고정하고, 20mM Tris(pH 7.0)의 러닝버퍼(running buffer), 속도 30㎕/분, 펩타이드(에스펩-1~11) 농도 10μM의 조건으로 수행하였으며, 최대 500초까지 결합(association) 및 해리(dissociation)를 관찰하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이때, AchR과 결합하여 주름을 감소시킨다고 알려진 Synake를 양성대조군으로 이용하였다.
도 1에서 보듯이, 에스펩-1, 2, 4 및 10의 경우, AchR과 결합한다고 알려진 Synake와 비교하면 AchR과의 결합력이 높음을 확인하였다.
<실시예 3. 펩타이드의 아세틸콜린 수용체 작용 억제 확인>
상기 실시예 2에서 아세틸콜린 수용체와 결합력이 높은 펩타이드의 AchR 작용 억제 효과를 확인하기 위해 AchR이 과발현 되어 있는 TE671세포를 이용하였다.
TE671 세포를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함되어 있는 DMEM 배지를 이용하여 4일 동안 배양하였다. 배양한 세포에 트립신(trypsin)을 처리하여 떼어낸 다음, 18㎜의 커버슬라이드를 넣은 12웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 2×14개의 세포가 되도록 분주하고 4일 동안 배양하였다. 새로운 12웰 플레이트에 세포가 배양된 커버슬라이드를 옮기고 HBSS(Hanks' balanced salt solution) 버퍼 997㎕와 Fura-2-AM(세포내 칼슘 이온 표지자) 3㎕을 넣고 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 15분간 배양하였다. 이후에 HBSS 버퍼로 3~4회 세척하여 남아 있는 Fura-2-AM을 제거한 후, HBSS 버퍼 1㎖를 넣었다. 세포가 자라있는 커버슬라이드를 현미경 관찰용 챔버(chamber)에 끼우고 HBSS 버퍼 500㎕를 넣은 후, 상기 실시예 2-3에서 선별된 펩타이드를 0.5, 5 또는 50μM이 되도록 첨가한 후 AchR과 결합하도록 3분 정도 방치하였다. 이후에 니코틴 125μM 또는 아세틸콜린 1μM을 첨가하여 세포 내 Fura-2의 형광 세기를 측정하여 AchR의 작용 여부를 확인하였으며, Synake 및 분가로톡신(bungarotoxin)을 양성대조군으로 처리하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보듯이, 아세틸콜린을 처리한 경우(A~C)에, 에스펩-1은 0.5μM에서는 5%의 AchR 작용 억제 효과를 보이나 5μM에서는 90%, 50μM에서는 100% AchR 작용 억제 효과가 나타나는 것을 확인하였고, 에스펩-2는 0.5μM에서 90%, 5μM 이상에서는 100%의 AchR 작용 억제 효과를 나타냈으며, 에스펩-4 및 10은 50μM에서 각각 17%, 47%의 AchR 작용 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 니코틴을 처리한 경우(D)에, Synake에 비해 에스펩-1 및 2가 니코틴의 아세틸콜린 수용체에 대한 작용 억제 효과가 우수함을 확인하였다.
이를 통해, 에스펩-1 및 에스펩-2가 AchR 작용 억제 효과가 우수함을 알 수 있었고, 특히나, 에스펩-2가 AchR과 결합력이 가장 높고, 이로 인한 AchR 작용 억제 효과가 가장 우수함을 알 수 있었다.
<실시예 4. Synake, 에스펩1, 에스펩-2 세포 독성 측정>
에스펩-1, 에스펩-2의 독성을 평가하기 위해서 TE671 세포에서 WST Assay를 실시하였다. 이때, Synake의 독성 평가도 함께 실시하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보듯이, 에스펩-1, 에스펩-2 및 Synake 모두 100ㅅM 처리 농도에서도 독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
<실시예 5. 가장 높은 결합력을 가진 에스펩-2 펩타이드의 아세틸콜린 수용체와의 결합능 확인>
상기 실시예 2에서 AchR과의 결합력이 가장 높은 에스펩-2를 이용하여 AchR과의 결합능을 확인하기 위해 상기 실시예 2의 표면 플라스몬 공명 분석기기를 이용하여 동일한 방법을 통해 해리상수(dissociation constant, Kd)를 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 에스펩-2의 농도는 0.12~1μM이 되도록 처리하였고, 양성대조군으로 Synake를 처리하여 해리상수를 비교하였다.
도 4에서 보듯이, 에스펩-2를 흘려주면 결합(association) 곡선이 급격히 증가하였고, 에스펩-2 처리 농도 의존적으로 결합 곡선이 증가하는 것을 확인하였다. 에스펩-2를 모두 흘려주고 난 후, 해리(dissociation)를 위해 러닝 버퍼만 흘려주어 과정에서 증가된 결합 곡선이 감소되지 않는 것을 통해 에스펩-2가 AchR와 지속적으로 결합하고 있음을 알 수 있었다.
또한, 에스펩-2의 AchR에 대한 Kd 값을 분석한 결과, 1.2μM로 Synake의 2,300μM과 대비하여 AchR과의 결합능이 약 2,000배 정도 우수함을 확인하였다.
<실시예 6. 펩타이드의 아세틸콜린 수용체 결합에 중요한 서열 부위 확인>
실시예 6-1. 말단의 아미노산의 순차적 삭제를 통한 아세틸콜린 수용체와의 결합력 확인
AchR과의 결합에 중요하게 작용하는 펩타이드의 부위를 확인하기 위해 상기 실시예 6에서 확인된 에스펩-2의 아미노산 서열을 기반으로 하여 펩타이드를 변형하고, 변형된 펩타이드를 상기 실시예 2의 표면 플라스몬 공명 분석기기에 적용하여 AchR과의 결합력을 확인하였다.
상기 에스펩-2의 아미노산 서열을 기반으로 하여 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단의 아미노산 서열을 하나씩 단계적으로 삭제하여 하기 표 2의 펩타이드를 합성하고, 합성한 펩타이드를 이용해 AchR과의 결합력을 비교하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
펩타이드 명 아미노산서열
에스펩-2 WTWKGRKSLLR
에스펩-2-ND1 TWKGRKSLLR
에스펩-2-ND2 WKGRKSLLR
에스펩-2-ND3 KGRKSLLR
에스펩-2-ND4 GRKSLLR
에스펩-2-ND5 RKSLLR
에스펩-2-CD1 WTWKGRKSLL
에스펩-2-CD2 WTWKGRKSL
에스펩-2-CD3 WTWKGRKS
에스펩-2-CD4 WTWKGRK
에스펩-2-CD5 WTWKGR
도 5에서 보듯이, 에스펩-2의 N-말단의 아미노산 서열을 단계적으로 삭제시킨 경우(A)에, 에스펩-2-ND1~3은 AchR과의 결합력이 에스펩-2에 비해 50% 정도 감소되나 여전히 AchR과의 결합이 유지되고 있는 반면에, 에스펩-2-ND4~5는 결합력이 현저히 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 에스펩-2의 C-말단의 아미노산 서열을 단계적으로 삭제시킨 경우(B)에는 C-말단의 R(Arg)이 삭제된 에스펩-2-CD1~5 모두 AchR과의 결합이 급격히 감소하는 것을 확인하였다.
이를 통해, AchR과 결합하는 에스펩-2의 아미노산 서열 중 4번째의 K(Lys)과 11번째의 R(Arg)이 AchR과의 결합에 있어서 중요한 부위임을 알 수 있었다.
실시예 6-2. 변형된 펩타이드의 아세틸콜린 수용체와의 결합능 확인
상기 실시예 6-1에서 확인된 에스펩-2의 변형된 펩타이드 중, AchR과의 결합에 필요한 가장 최소한의 서열을 가진 것으로 확인된 에스펩-2-ND3와 에스펩-2-ND3보다 더 작은 크기를 가진 에스펩-2-ND5를 이용하여 상기 실시예 2의 표면 플라스몬 공명 분석기기에 적용하여 AchR과의 결합력을 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 보듯이, (A)의 에스펩-2-ND3의 경우, (B)의 에스펩-2-ND5와 비교하면 낮은 농도에서도 AchR과의 결합력이 높은 것을 확인하였고, 해리상수를 확인한 결과, 에스펩-2-ND3는 3.1μM인 반면에, 에스펩-2-ND5는 57μM로 에스펩-2-ND3가 에스펩-2-ND5 보다 AchR과의 결합능이 현저히 우수함을 알 수 있었다.
이를 통해 11mer인 에스펩-2와 8mer인 에스펩-2-ND3는 Ach와의 결합력이 큰 차이가 나지 않는 반면에, 6mer인 에스펩-2-ND5는 Ach와의 결합력이 현저히 감소하는 것을 알 수 있었다. 또한 상기 결과를 통해 에스펩-2의 N-말단의 3개의 아미노산은 AchR와의 결합력에 크게 중요하지 않음을 확인할 수 있었다.
<실시예 7. 알라닌-스캐닝을 이용한 펩타이드의 아세틸콜린 수용체 결합에 중요한 부위 확인>
상기 실시예 6에서 확인한 펩타이드 중, 에스펩-2-ND3와 에스펩-2와 아미노산 서열 유사성이 높은 에스펩-1의 N-말단의 아미노산 3개를 삭제한 에스펩-1-ND3(KGKGTLNR)을 이용하여, 각 펩타이드의 서열 중 중요한 부분을 확인하고자 알라닌-스캐닝을 진행하였다.
에스펩-1-ND3 및 에스펩-2-ND3를 야생으로 하고, 각각의 펩타이드의 아미노산 서열을 순차적으로 알라닌(alanine, Ala, A)으로 치환한 하기 표 3의 펩타이드를 합성하여 상기 실시예 2의 표면 플라스몬 공명 분석과 동일한 방법으로 AchR과의 결합력을 비교하였다. 이때, 각 펩타이드의 농도는 20μM가 되도록 처리하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
펩타이드 명 아미노산서열 펩타이드 명 아미노산서열
에스펩-1-ND3(WT) KGKGTLNR 에스펩-2-ND3(WT) KGRKSLLR
에스펩-1-ND3(K1A) AGKGTLNR 에스펩-2-ND3(K1A) AGRKSLLR
에스펩-1-ND3(G2A) KAKGTLNR 에스펩-2-ND3(G2A) KARKSLLR
에스펩-1-ND3(K3A) KGAGTLNR 에스펩-2-ND3(R3A) KGAKSLLR
에스펩-1-ND3(G4A) KGKATLNR 에스펩-2-ND3(K4A) KGRASLLR
에스펩-1-ND3(T5A) KGKGALNR 에스펩-2-ND3(S5A) KGRKALLR
에스펩-1-ND3(L6A) KGKGTANR 에스펩-2-ND3(L6A) KGRKSALR
에스펩-1-ND3(N7A) KGKGTLAR 에스펩-2-ND3(L7A) KGRKSLAR
에스펩-1-ND3(R8A) KGKGTLNA 에스펩-2-ND3(R8A) KGRKSLLA
도 7에서 보듯이, 에스펩-1-ND3의 1번째 K, 3번째 K, 8번째 R을 A로 치환한 경우 AchR에 대한 결합력이 감소하였고(A), 에스펩-2-ND3의 1번째 K, 3번째 R, 4번째 K, 8번째 R을 A로 치환한 경우 AchR에 대한 결합력이 감소하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 에스펩-1-ND3 및 에스펩-2-ND3의 K 및 R 부분이 AchR과의 결합에 있어서 중요한 부위임을 알 수 있었다.
<실시예 8. 펩타이드 변형에 따른 지방산 유도체가 결합된 에스펩-2의 아세틸콜린 수용체와의 결합력 확인>
AchR에 결합하는 펩타이드의 변형에 따른 AchR과의 결합력 변화를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2에서 확인된 펩타이드 중, AchR에 대한 결합력이 가장 높았던 에스펩-2에 지방산 유도체인 팔미토일(palmitoyl)을 결합시킨 펩타이드(Palmitoyl-에스펩-2)를 이용하여, 상기 실시예 2의 표면 플라스몬 공명 분석 방법과 동일한 방법을 통해 AchR과의 결합력을 확인하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 이때, 에스펩-2와 AchR과의 결합력을 비교군으로 이용하였다.
도 8에서 보듯이, 에스펩-2에 비해 Palmitoyl-에스펩-2가 AchR과의 결합력이 더 강하다는 것을 확인하였다. 이유는 도 9에서 보듯이 지용성인 Palmitoyl이 안으로 모이고 수용성인 에스펩-2가 밖으로 노출되는 마이셀 구조를 형성하여 AchR의 여러 부위에 결합하는 Avidity 효과를 가지기 때문이다.
<실시예 9. Palmitoyl-에스펩-2의 아세틸콜린 수용체 작용 억제 확인>
상기 실시예 8에서 AchR과의 결합력이 우수하다고 확인된 Palmitoyl-에스펩-2의 AchR 작용 억제 효과를 확인하였다. 이때, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 AchR 작용 억제 효과를 확인하였고, Palmitoyl-에스펩-2를 농도별로 처리하였다. AchR 작용 억제 효과 비교를 위해 에스펩-2, Synake, 분가로톡신(Bungarotoxin)을 농도별로 처리하여 대조군으로 이용하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보듯이, Palmitoyl-에스펩-2가 에스펩-2에 비해 AchR에 대한 억제 효과가 더 우수하다는 것을 알 수 있었다. 더 구체적으로 각 펩타이드의 AchR에 대한 IC50 값을 살펴보면, Synake는 75ㅅM, 에스펩-2는 750nM, Palmitoyl-에스펩-2는 75nM, 분가로톡신은 7.5nM로, Pal-에스펩-2가 에스펩-2보다 AchR에 대한 작용 억제 효과가 10배 더 우수함을 확인하였다.
<실시예 10. Palmitoyl-에스펩-2 세포 독성 측정>
Palmitoyl-에스펩-2의 독성을 평가하기 위해서 TE671 세포에서 WST assay를 실시하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 보듯이, Palmitoyl-에스펩-2는 10ㅅM로 처리하더라도 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
<실시예 11. 에스펩-2-ND3의 아미노산 서열 중 K와 R의 아미노산 치환을 통한 AchR과의 결합력 변화 확인>
상기 실시예 7에서 확인된 AchR과의 결합에 있어서 중요한 부위임이 확인된 에스펩-2-ND3의 K 및 R의 아미노산을 K는 R로, R은 K 또는 N으로 치환할 경우 AchR과의 결합력에 변화가 있는지 확인하였다.
에스펩-2-ND3를 야생으로 하고, 이의 아미노산 서열 중 K는 R로, R은 K 또는 N으로 치환한 하기 표 4의 펩타이드를 합성하여 상기 실시예 2의 표면 플라스몬 공명 분석 방법과 동일한 방법으로 AchR과의 결합력을 확인하였다. 이때, 각 펩타이드의 농도는 20μM가 되도록 처리하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
펩타이드명 아미노산 서열
에스펩-2-ND3(WT) KGRKSLLR
에스펩-2-K1R RGRKSLLR
에스펩-2-R3K KGKKSLLR
에스펩-2-R3N KGNKSLLR
에스펩-2-K4R KGRRSLLR
에스펩-2-R8K KGRKSLLK
에스펩-2-K1R-R3K RGKKSLLR
에스펩-2-K1R-R3N RGNKSLLR
에스펩-2-R3N-R8N KGNKSLLN
에스펩-2-K1R-K4R RGRRSLLR
에스펩-2-K1R-R3K-K4R-R8K RGKRSLLK
도 12에서 보듯이, 에스펩-2-ND3의 K를 R로 치환한 펩타이드의 경우 AchR에 대한 결합력이 증가하였고, R을 K로 치환한 펩타이드의 경우에는 AchR에 대한 결합력이 약간 감소하였으나 큰 차이가 없는 것을 확인하였다. 반면에, R을 N으로 치환한 펩타이드의 경우에는 AchR에 대한 결합력이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.이를 통해, 에스펩-2-ND3 아미노산 중 K와 R 부분은 서로 치환하여도 AchR과의 결합에 변화가 없으나, R을 N으로 치환할 경우에는 AchR과의 결합능이 없어지는 것을 알 수 있었다.
<실시예 12. 아세틸콜린 수용체에 대한 결합력이 향상된 최적화 펩타이드 선별을 위한 펩타이드 라이브러리 제작>
실시예 12-1. 랜덤 펩타이드 라이브러리 DNA 제작 및 형질 전환
상기 실시예 6, 7, 11에서 확인한 결과를 통해 에스펩-2-ND3 펩타이드 서열을 변형하여 8mer; (K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R), 9mer; X(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R), (K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)X, 10mer; XX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R), (K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XX, X(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)X, 11mer; XXX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R), (K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XXX, X(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XX, XX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)X, 12mer; X(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XXX, XX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XX, XXX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)X, 13mer; XX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XXX, XXX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XX, 14mer; XXX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XXX 및 18mer; XXXXX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XXXXX [(K/R)은 K나 R 둘 중 하나, X는 랜덤 아미노산]의 랜덤 펩타이드 라이브러리를 제조하고 아세틸콜린 수용체 저해 효과를 확인하였다. 상기 랜덤 라이브러리는 전체적으로 아세틸콜린 수용체와의 결합력이 에스펩-2와 유사하거나 뛰어난 것을 확인하였다.
이하에서는 특히 아세틸콜린 수용체와의 결합력이 우수한 대표적인 펩타이드 서열인 8mer; (K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R), 11mer; XXX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R) 및 14mer; XXX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XXX 와 18mer; XXXXX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XXXXX [(K/R)은 K나 R 둘 중 하나, X는 랜덤 아미노산]의 랜덤 펩타이드 라이브러리를 제조하고 아세틸콜린 수용체 저해 효과를 확인한 실시예를 설명한다.
8mer; (K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R), 11mer; XXX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R), 14mer; XXX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XXX 및 18mer; XXXXX(K/R)X(K/R)(K/R)XXX(K/R)XXXXX [(K/R)은 K나 R 둘 중 하나, X는 랜덤 아미노산]의 펩타이드 라이브러리를 제조하기 위해서 하기 표 5의 DNA 라이브러리를 합성하였다(바이오니아, 한국). 이후, 합성한 표 5의 DNA 라이브러리를 주형으로, 두 개의 단일 가닥의 프라이머(TTCTATGCGGCCCAG, AACAGTTTCTGCGGC)를 이용하여 PCR을 수행하여 이중 가닥의 삽입용 DNA(insert DNA)를 증폭하였다. 증폭한 삽입용 DNA와 파지미드 벡터(phagemid vector)인 pIGT를 제한 효소인 Sfi I 및 Not I로 처리하고, 각각의 DNA 정제하였다. 정제한 삽입용 DNA와 pIGT를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 연결한 후, 에탄올로 침전시켜 얻은 침전물을 TE(Tris- EDAT) 버퍼로 용해시켜 랜덤 펩타이드 라이브러리 DNA를 제작하였다.
제작한 랜덤 펩타이드 라이브러리 DNA를 컴피턴트 세포(competent cell)에 넣어 혼합한 후, 전기천공법(electroporation)을 이용하여 형질전환 시켰다. 형질전환 시킨 세포를 20mM 글루코스가 포함된 LB(luria bertani) 액체 배지에 넣고 시험관으로 옮겨 37℃에서 200rpm으로 1시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 20mM 글루코스 및 50㎍/㎖ 암피실린이 포함된 LB 액체 배지에 넣고 30℃에서 하루 동안 배양하였다. 하루 배양 후 4℃에서 4,000×g로 20분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하여 침전된 세포들을 확보하였다. 확보한 세포에 LB 액체배지로 현탁한 후, 글리세롤을 최종 농도가 20% 이상 되도록 넣고, -80℃에 보관하여 랜덤 펩타이드 라이브러리를 확보하였다.
라이브러리 아미노산 시퀀스 염기서열

8mer (L1)		 (K또는 R)-X-(K 또는 R)(K 또는 R)-XXX-(K 또는 R) , X=random amino acids
TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC ARANNKARAARANNKNNKNNKARA GCGGCCGCAGAAACTGTT

11mer (L2)		 XXX(K또는 R)-X-(K 또는 R)(K 또는 R)-XXX-(K 또는 R), X=random amino acids
TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC NNKNNKNNKARANNKARAARANNKNNKNNKARA GCGGCCGCAGAAACTGTT

14mer (L3)		 XXX(K또는 R)-X-(K 또는 R)(K 또는 R)-XXX-(K 또는 R)XXX, X=random amino acids
TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC NNKNNKNNKARANNKARAARANNKNNKNNKARANNKNNKNNK GCGGCCGCAGAAACTGTT

18mer		 XXXXX(K또는 R)-X-(K 또는 R)(K 또는 R)-XXX-(K 또는 R)XXXXX, X=random amino acids
TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC NNKNNKNNKNNKNNKARANNKARAARANNKNNKNNKARANNKNNKNNKNNKNNK GCGGCCGCAGAAACTGTT
N : A or C or G or T
K : G or T
R : A or G
X : Random amino acids
실시예 12-2. 최적화 펩타이드 재조합 파지 생산
상기 실시예 12-1에서 확보한 랜덤 펩타이드 라이브러리를 SB 액체 배지(3% tryptone, 2% yeast extract, 1% MOPS free acid, 2% glucose)에 추가하여 20분 동안 37℃에서 200rpm으로 배양하고, 1×1010pfu 헬퍼파지(helper phage)와 최종 농도가 50㎍/㎖이 되도록 암피실린을 넣고 다시 1시간 동안 같은 조건으로 배양하였다. 배양액을 50㎍/㎖ 암피실린 및 10㎍/㎖ 카나마이신(kanamycin)이 포함된 SB 액체 배지에 옮겨 같은 조건으로 16시간 배양하여 랜덤 펩타이드 재조합 파지를 생산하였다.
생산된 랜덤 펩타이드 재조합 파지를 4℃에서 5,000rpm으로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 얻고, 상층액에 PEG(polyethylene glycol)/NaCl(20% PEG, 15% NaCl)을 5:1[v:v]로 혼합하여 얼음에 1시간 동안 방치한 후, 4℃, 13,000rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고 1㎖의 PBS(phosphate buffered saline)로 침전물을 현탁하여 랜덤 펩타이드 재조합 파지를 확보하였다.
<실시예 13. 아세틸콜린 수용체에 대한 결합력이 향상된 최적화 펩타이드 스크리닝>
실시예 13-1. 바이오패닝(biopanning) 방법
항체를 표면 발현하는 파지 라이브러리를 고정화된 항원에 처리하여 항원에 결합하는 항체 후보를 선별하는 과정을 바이오패닝(biopanning)이라 하며, 결합/세척/유리(bind/wash/elution)의 세 단계로 구성된다. 세척 과정 중 결합력이 약한 항체를 갖는 파지는 제거되고 결과적으로 결합력이 높은 항체를 발현하고 있는 파지만 남게 되는데, 이러한 과정을 3~4회 반복하면 항원 결합력과 특이도가 우수한 항체 후보들을 발굴할 수 있다. 이에, 본 발명의 아세틸콜린 수용체에 대한 결합력과 특이도가 우수한 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드를 스크리닝하기 위해 바이오패닝 방법을 이용하였다.
10㎍/㎖의 AchR α1을 96웰 플레이트의 8개 웰에 웰 당 50㎕씩 넣고, 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 다음날 200㎕ Tris(20mM pH 7)로 1회 세척 후, 2% BSA(bovine serum albumin) 200㎕를 넣고 상온에서 2시간 동안 블로킹(blocking) 시킨 뒤 용액을 모두 버리고 200㎕ Tris(20mM pH 7)로 3회 세척하였다. 상기 실시예 13-2의 PBS로 현탁한 랜덤 펩타이드 재조합 파지(투입 파지, input phage) 400㎕ 및 2% BSA 400㎕를 혼합하여 웰 당 100㎕씩 넣고 30℃에서 1시간 동안 방치하였다. 웰의 용액을 모두 제거하고 Tris(20mM pH 7)로 3회 세척한 뒤 0.2M 글리신(glycine)(pH 2.2)을 웰 당 100㎕씩 넣어 20분간 파지를 유리시킨 후, 하나의 e-튜브에 모두 모으고, 1M Tris(pH 9.0) 200㎕를 넣어 중화시켰다(산출 파지, output phage).
바이오패닝을 반복하기 위해 유리된 파지 500㎕를 5㎖의 대장균(E. coli)과 섞어 37℃에서 200rpm으로 30분 동안 배양한 후, 1×1010pfu 헬퍼 파지와 최종 농도가 50㎍/㎖이 되도록 암피실린을 첨가하여 30분 동안 추가 배양하였다. 배양액을 50㎍/㎖ 암피실린 및 10㎍/㎖ 카나마이신이 포함된 SB 액체 배지에 옮겨 같은 조건으로 하룻밤 동안 배양하여 랜덤 펩타이드 재조합 파지를 재생산하였다. 재생산한 랜덤 펩타이드 재조합 파지를 4℃에서 5,000rpm으로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 얻고, 상층액에 PEG/NaCl을 5:1[v:v]로 혼합하여 얼음에 1시간 동안 방치한 후, 4℃, 13,000rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고 1㎖의 PBS(phosphate buffered saline)로 침전물을 현탁한 다음, 2차 바이오패닝에 사용하였다.
각 바이오패닝 단계마다 상기와 동일한 방법으로 랜덤 재조합 파지를 재생산하고, 상기의 방법과 동일한 방법으로 바이오패닝을 수행하였다. 이때, 바이오패닝 단계에서 Tris(20mM pH 7)로 세척하는 과정의 횟수를 3회 또는 6회로 하여 AchR에 대하여 5회에 걸쳐 바이오패닝을 실시하였다.
각 바이오패닝마다 투입 파지(input phage) 및 산출 파지(output phage) 수를 측정하기 위해 600㎚에서의 흡광도가 0.7(OD600=0.7)인 대장균(E. coli)에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지(agar plate)에 도말하였고, 그 결과를 하기 표 6~9에 나타내었다.
8mer 바이오패닝
회차 세척 횟수 투입 파지 산출 파지 산출/투입
1st 3회 10.4 x 1011 264 x106 25.4x10-5
2nd 3회 2.752 x1011 82 x106 29.8x10-5
3rd 6회 1.024 x1011 42.8 x106 41.8x10-5
4th 6회 15.8 x1011 144 x106 9.11x10-5
5th 6회 12.96 x1011 44.8 x106 3.46x10-5
11mer 바이오패닝
회차 세척 횟수 투입 파지 산출 파지 산출/투입
1st 3회 1.14x1012 1.048x108 8.77x10-5
2nd 6회 9.28x1011 3.4x106 0.366x10-5
3rd 6회 9.4x1011 6.96x107 7.4x10-5
4th 6회 1.02x1011 2.32x107 22.74x10-5
14mer 바이오패닝
회차 세척 횟수 투입 파지 산출 파지 산출/투입
1st 3회 1.52 x 1011 112 x106 73.68 x10-5
2nd 3회 2.112 x1011 86 x106 40.72 x10-5
3rd 6회 1.0 x1011 32 x106 32 x10-5
4th 6회 12.7 x1011 192 x106 15.12 x10-5
5th 6회 17.54 x1011 29x106 1.65x10-5
18mer 바이오패닝
회차 세척 횟수 투입 파지 산출 파지 산출/투입
1st 3회 1.28 x 1012 5.36 x108 41.87x10-5
2nd 3회 1.6 x 1012 6.4 x108 40x10-5
3rd 6회 1.58 x 1012 3.92 x107 2.48x10-5
4th 6회 1.49 x 1011 9.9 x106 6.6x10-5
5th 6회 1.18 x 1012 1.16 x108 9.83x10-5
실시예 13-2. 랜덤 펩타이드 라이브러리 투입 재조합 파지(input phage)를 이용한 ELISA(enyzme-linked immunosorbent assay) 방법
상기 실시예 13-1의 바이오패닝의 각 회차별 투입 파지를 이용하여 스트렙트아비딘(stereptavidin) 및 AchR에 대해 ELISA를 수행하였다.
96웰 ELISA 플레이트에 10㎍/㎖의 AchR 또는 스트렙트아비딘을 각 웰당 50㎕씩 넣고, 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였고, 다음날 Tris(20mM pH7)로 3회 세척하고, PBS로 희석한 2% BSA를 넣고 상온에서 2시간 동안 블로킹 시킨 뒤 용액을 모두 버리고 Tris(20mM pH7)로 3회 세척하였다. 상기 실시예 13-1의 표 6~9에서의 1st, 2nd, 3rd, 4th 및 5th의 투입 파지 800㎕를 10% BSA 200㎕를 혼합하여 웰 당 100㎕씩 넣고 30℃에서 1시간 동안 방치하였다. 웰의 용액을 모두 제거하고 Tris(20mM pH7)로 3회 세척한 뒤, 1:1,000으로 희석한 HRP(horseradish peroxidase)-결합 항-M13 항체(HRP-conjugated anti-M13 Ab, GE Healthcare 사)를 각 웰 당 100㎕씩 넣고 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, Tris(20mM pH 7)로 3회 세척한 후, 각 웰에 HRP의 기질인 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine, TMB) 용액을 100㎕씩 넣고 발색 반응을 유도한 다음 100㎕의 1M HCl을 첨가하여 반응을 중지시키고, 450㎚에서 흡광도(OD450)를 측정하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에서 보듯이 바이오패닝의 투입 파지로부터 얻은 8mer, 11mer, 14mer의 랜덤 펩타이드 라이브러리는 전체적으로 스트렙트아비딘에 비해 AchR에 대한 결합 특이성이 매우 높게 나타났다. 즉, 8mer의 1, 3, 4 및 8번째 아미노산을 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로 고정하고, 2 및 5, 6, 7번째 아미노산을 임의의 아미노산으로 형성하여, 일반식: (K 또는 R)-X-(K 또는 R)-(K 또는 R)-XXX-(K 또는 R)로 표현되는 폴리펩타이드의 라이브러리는 2 및 5, 6, 7번째 아미노산(X)의 종류와 관계없이 전체적으로 AchR에 높은 특이성을 갖고 결합하였다.
11mer에서도 일반식: XXX-(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-(K 또는 R)-XXX-(K 또는 R)로 표현되는 폴리펩타이드의 라이브러리는 X로 표현되는 임의의 아미노산(1, 2, 3, 5, 8, 9 및 10번째 아미노산)의 종류와 관계없이 4, 6, 7 및 11번째의 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)인 경우, 전체적으로 AchR에 높은 특이성을 갖고 결합하였다.
14mer에서도 마찬가지로 일반식: XXX-(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-(K 또는 R)-XXX-(K 또는 R)-XXX로 표현되는 폴리펩타이드의 라이브러리는 X로 표현되는 임의의 아미노산(1, 2, 3, 5, 8, 9, 10, 12, 13 및 14번째 아미노산)의 종류와 관계없이 4, 6, 7 및 11번째의 아미노산이 리신(K) 또는 아르기닌(R)인 경우, 전체적으로 AchR에 높은 특이성을 갖고 결합하였다.
상기의 결과를 통하여 본 발명에 따른 [화학식 1], [화학식 2], [화학식 3], 또는 [화학식 4]로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드는 AchR에 높은 특이성을 갖고 결합하는 것을 확인하였다.
[화학식 1]
X L -(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-X M -(K 또는 R)-X N
(상기 XL, XM, XN은 각각 독립적으로 1~8개, X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열을 나타냄)
[화학식 2]
(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-(K 또는 R)-X M-1 -(K 또는 R)
(상기 XM-1은 1~3개, X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열을 나타냄)
[화학식 3]
X L -(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-(K 또는 R)-X M-1 -(K 또는 R)
(상기 XL, XM-1은 각각 독립적으로 1~3개, X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열을 나타냄)
[화학식 4]
X L -(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-(K 또는 R)-X M-1 -(K 또는 R)-X N
(상기 XL, XM-1, XN 은 각각 독립적으로 1~3개, X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 서열을 나타냄)
아미노산 서열을 중요한 펩타이드 부위 및 서열을 중심으로 일정한 식으로 표현하고, 상기 펩타이드의 라이브러리를 제작하였으며, 제작된 라이브러리가 전체적으로 아세틸콜린 수용체와 결합하여 그 작용을 억제하는 것을 확인하였다.
그리고, 도 13에서 보듯이 1회차 바이오패닝의 투입 파지부터 얻은 8mer, 11mer, 14mer의 랜덤 펩타이드 라이브러리는 스트렙트아비딘에 비해 AchR에 대한 결합 특이성이 높게 나온 반면에, 1회차 바이오패닝의 투입 파지로부터 얻은 18mer의 랜덤 펩타이드 라이브러리는 AchR에 대한 결합 특이성이 낮은 것을 확인하였다.
이를 통해, 8~14mer까지의 랜덤 펩타이드는 AchR에 대한 결합력이 유지되나, 18mer의 랜덤 펩타이드는 AchR과의 결합력이 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 AchR과의 결합력의 차이는 랜덤 아미노산(X)의 갯수에 의해 나타나는 것으로 예상된다.
실시예 13-3. 아세틸콜린 수용체에 대한 결합력이 향상된 최적화 펩타이드 스크리닝
상기 실시예 13-1 및 13-2에서 확인된 AchR에 대한 결합력 및 특이성이 높은 4 및 5회 차 바이오패닝 투입 파지로부터 AchR에 대한 결합력이 향상된 최적화 펩타이드를 선별하기 위한 스크리닝을 진행하였다.
상기 실시예 13-1의 4 및 5회차 바이오패닝 산출 파지를 대장균에 접종시킨 후, 플라크(plaque)가 플레이트 당 100~200개 정도가 생성되도록 아가 배지에 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크를 50㎍/㎖의 암피실린이 포함된 SB 액체 배지 1㎖에 각각 접종하여 37℃에서 5시간 동안 진탕 배양하고, 헬퍼 파지를 30㎕씩 첨가하여 37℃, 200rpm으로 하루 동안 배양하였다. 배양액을 12,000rpm으로 2분간 원심 분리하여 상층액을 회수한 후, 2% BSA를 넣어 파지 스크리닝에 이용하였다.
96웰 ELISA 플레이트에 5㎍/㎖의 AchR 또는 스트렙트아비딘을 각 웰 당 50㎕씩 넣고, 4℃에서 하루 동안 방치하였고, 다음날 각 웰의 용액을 버리고 2% BSA를 넣고 상온에서 2시간 동안 블로킹 시킨 뒤 용액을 모두 버리고 Tris(20mM pH7)로 3회 세척하였다. 상기에서 준비한 플라크로부터 얻은 각각의 파지 용액 100㎕씩을 웰에 분주하고 30℃에서 1시간 동안 방치하였다. 웰의 용액을 모두 제거하고 Tris(20mM pH7)로 3회 세척한 뒤, 1:2,000으로 희석한 HRP-결합 항-M13 항체를 각 웰 당 100㎕씩 넣고 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, Tris(20mM pH7)로 3회 세척한 후, 각 웰에 테트라메틸벤지딘 용액을 100㎕씩 넣고 발색 반응을 유도한 다음 100㎕의 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 중지시키고, 450㎚에서 흡광도(OD450)를 측정하였다. 측정한 흡광도를 이용하여 스트렙트아비딘 흡광도 대비 AchR 흡광도 비율(AchR signal/streptavidin signal)로 환산하였고, 그 결과를 도 14~16에 나타내었다.
도 14~16에서 보듯이, 파지에 따른 AchR과의 결합력이 차이가 있음을 관찰하였고, 이 중, 스트렙트아비딘 흡광도 대비 AchR 흡광도 비율이 가장 높은 파지를 선별하였다. 그 결과를 표 10~12 에 나타내었다. 8mer (L1), 11mer (L2), 14mer (L3) 최적화 펩타이드 모두 양성대조군인 에스펩-2보다 AchR과 결합력과 특이성이 높게 나옴을 확인하였다.
상기에서 선별한 파지로부터 플라스미드 DNA를 정제하고, 정제한 플라스미드 DNA와 GATTACGCCAAGCTTTGGAGC로 이루어진 염기서열 분석용 프라이머를 이용하여 펩타이드의 서열 분석을 의뢰하였고, 서열이 확인되고 AchR과의 결합 특이성이 우수한 최적화 펩타이드를 선별하였다.
또한 대한민국 공개특허 10-2014-0139010호에 기재된 아미노산 서열의 펩타이드와 비교하기 위하여 표 13과 같이 아미노산 서열의 펩타이드를 합성하여 상기와 동일한 방법으로 AchR과의 결합 특이성을 확인한 결과, 에스펩-2와 유사한 결합특이성을 확인하였다. 그러나 R이 반복된 서열, 또는 8mer의 양단으로 G가 반복된 서열은 11mer, 또는 14mer 라이브러리 전체와 비교하여 낮은 수준의 결합특이성을 나타내었다. 이는 펩타이드의 하전된 전하 또는 입체구조적 특징에 의한 것으로 사료된다.
　서열번호 펩타이드(8mer) OD Seq.
1 L1-1 0.693 KAKKIRQR
2 L1-2 0.68 KKRKGSAK
3 L1-3 0.649 RGKRQLGR
4 L1-4 0.696 KLKKFPVR
5 L1-5 0.657 RHKKSPWK
6 L1-6 0.652 RPRRTHIK
7 L1-7 0.68 KHKKLNQR
8 L1-8 0.653 RAKRMCCK
9 L1-9 0.639 RQRRNDMK
10 L1-10 0.621 KRKKDWWR
11 L1-11 0.703 RARKDAFK
12 L1-12 0.691 KWRREGFK
13 L1-13 0.73 RFRRGVRR
14 L1-14 0.755 KARRQEDK
15 L1-15 0.67 RFKRLCMK
16 L1-16 0.62 KLKRRSRR
17 L1-17 0.653 RPRRSLDR
18 L1-18 0.627 KHKKQNVR
19 L1-19 0.575 KFKRTEGR
20 L1-20 0.619 RGKKAVRK
21 L1-21 0.65 KFKKHGVK
22 L1-22 0.732 KTKKIHSK
23 L1-23 0.712 RDRKIHDK
24 L1-24 0.742 RPRRGHQK
25 L1-25 0.709 KTKKLYEK
26 L1-26 0.647 RQKKDNQK
27 L1-27 0.662 RQRKSMQR
28 L1-28 0.656 RGRRWFVK
29 L1-29 0.646 RNKRDENK
30 L1-30 0.605 RLRRWCVK
31 L1-31 0.604 RQKKPWVK
32 L1-32 0.607 RWKRSEQR
33 L1-33 0.529 RLKRAPGR
34 L1-34 0.634 KMRRAQGR
35 L1-35 0.556 KIKKAARR
36 L1-36 0.553 KNRKNLYR
37 L1-37 0.524 KCKKMTER
38 L1-38 0.514 KTRRVDLR
39 L1-39 0.509 KSRKWGWR
40 L1-40 0.424 KRRRFRWK
41 L1-41 0.613 KYKKQHTK
42 L1-42 0.695 RGRKKCGK
43 L1-43 0.601 KLRKQKLR
44 L1-44 0.59 RNRKIPLK
45 L1-45 0.597 RLRRRYRR
46 L1-46 0.637 KWRKRRIK
47 L1-47 0.54 KTKRMLAK
48 L1-48 0.519 KEKRAVHK
49 L1-49 0.504 RVRRDGHR
50 L1-50 0.583 RAKKCYHK
51 L1-51 0.66 KGKRDSNK
52 L1-52 0.56 KVRKSLWK
53 L1-53 0.78 RSKKSLYR
54 L1-54 0.569 RGKRGCER
55 L1-55 0.585 KQKKTGFR
56 L1-56 0.468 KYRRNLVR
57 L1-57 0.408 RIRRGSVR
58 L1-58 0.472 RSKRMNGK
59 L1-59 0.479 RHKKFIEK
60 L1-60 0.484 RIRRVSQR
61 L1-61 0.625 RPKKWMQK
62 L1-62 0.633 KERKHEAK
63 L1-63 0.618 KERKASAK
64 L1-64 0.589 KMRRIMYK
65 L1-65 0.585 KWKRNCTK
66 L1-66 0.605 RCKKNPEK
67 L1-67 0.593 KQRKPHGR
68 L1-68 0.55 KAKRGHFK
69 L1-69 0.474 KSKRHHEK
70 L1-70 0.668 KSRKHCNR
71 L1-71 0.618 RSKKINNK
72 L1-72 0.616 RVRRSWIR
73 L1-73 0.644 KSRRSAGK
74 L1-74 0.649 KMRKHDVR
75 L1-75 0.581 KGKKLSQR
76 L1-76 0.588 KWRREQFR
77 L1-77 0.636 KDKRWANR
78 L1-78 0.642 KHKRTAQR
79 L1-79 0.583 KPKREMHK
80 L1-80 0.631 RWKKNINK
81 L1-81 0.63 KWKKMMER
82 L1-82 0.596 RIRRWWVR
83 L1-83 0.621 RIRRHMYR
84 L1-84 0.576 KPKKPPAR
85 L1-85 0.57 RLKRGQFK
86 L1-86 0.551 KNKRTPVK
87 L1-87 0.538 KWRRAFGR
88 L1-88 0.562 KNKKCVGR
89 L1-89 0.551 RTRKCVLK
90 L1-90 0.439 KIKRDLYK
91 L1-91 0.826 REKRYMAR
92 L1-92 0.581 RVKKAETR
93 L1-93 0.616 RGRRGTMR
94 L1-94 0.496 RTKRWQLK
95 L1-95 0.535 RLRKSLGK
96 L1-96 0.494 RPKRNWAK
97 L1-97 0.546 KDRKVNSR
98 L1-98 0.54 KWRRNGQR
99 L1-99 0.543 RFKRMVWR
100 L1-100 0.737 KERKGAVR
101 L1-101 0.599 KTKRGSLK
102 L1-102 0.507 KTKRVDPK
103 L1-103 0.55 RARKLHNR
104 L1-104 0.46 RGKKPWWR
105 L1-105 0.507 KGKKYYQK
106 L1-106 0.417 RWRRSVIK
107 L1-107 0.534 RQKKDFLK
108 L1-108 0.535 RGRKPIWK
109 L1-109 0.542 KPRRPDTR
110 L1-110 0.422 KVKRLWNR
111 L1-111 0.608 KDRKGVYK
112 L1-112 0.431 RVKRFVPK
113 L1-113 0.526 KPKRDQSR
114 L1-114 0.42 KDKKQWGR
115 L1-115 0.451 RFRKMIPK
116 L1-116 0.492 KFRKHVCK
117 L1-117 0.508 RPKRSPSK
118 L1-118 0.471 RYKKVPAK
119 L1-119 0.463 RSRRCPVK
120 L1-120 0.388 RCKRCDNK
121 L1-121 0.354 RGKKQLSK
122 L1-122 0.352 KSKRPEGR
123 L1-123 0.409 KCRKTMGR
124 L1-124 0.428 RDRKNPVR
125 L1-125 0.345 KPKRSAPR
126 L1-126 0.362 KGKRTGCK
127 L1-127 0.412 RFRKPTDR
128 L1-128 0.301 RMKKFHTR
129 L1-129 0.421 KIKKYYWK
130 L1-130 0.368 RIKRNNCK
131 L1-131 0.505 RHKRMLWR
132 L1-132 0.541 KVRRVFLK
133 L1-133 0.504 KDKRPECK
134 L1-134 0.365 KTRRSACR
135 L1-135 0.479 KFRKGPYR
136 L1-136 0.392 KFKKSAPR
137 L1-137 0.458 KPRKIQGR
138 L1-138 0.373 KMRKGWDK
139 L1-139 0.456 KFRRQSTR
140 L1-140 0.381 KNRRADCR
141 L1-141 0.505 KNKRWVFK
142 L1-142 0.469 RCRKDTAR
143 L1-143 0.416 KARRVGTK
144 L1-144 0.503 KVKKIYYR
145 L1-145 0.54 KAKRDYLR
146 L1-146 0.362 KVKRLPYR
147 L1-147 0.415 RHRRANFR
148 L1-148 0.426 KPKKGGWK
149 L1-149 0.34 KEKRLYAR
150 L1-150 0.457 REKKQEVK
151 L1-151 0.479 KSRRAVFR
152 L1-152 0.484 RHRKYVDK
153 L1-153 0.625 RHKRWSGR
154 L1-154 0.633 RDRKFVQK
155 L1-155 0.618 RYRRWFYR
156 L1-156 0.589 RQRRMTPR
157 L1-157 0.585 RNKRMDGK
158 L1-158 0.605 RPKKHQER
159 L1-159 0.593 KKRKSLLR
160 L1-160 0.55 KIKRNVFK
161 L1-161 0.474 KYKREEYR
162 L1-162 0.668 KIRRVTNK
163 L1-163 0.618 KVKRVWGR
164 L1-164 0.616 RIKRDYCK
165 L1-165 0.644 RIRRAHDR
166 L1-166 0.649 RARKESHK
167 L1-167 0.581 RYKKQQYK
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169 L1-169 0.636 KLKRAMLK
170 L1-170 0.642 KARKNSIR
171 L1-171 0.583 KERKLWWK
172 L1-172 0.631 KTRKQDHR
173 L1-173 0.63 RCKRFVGK
174 L1-174 0.596 KEKKLVWK
175 L1-175 0.621 KARRNSLK
176 L1-176 0.479 KMRRVAPR
177 L1-177 0.484 RAKKIMFR
178 L1-178 0.625 KTKKAAER
179 L1-179 0.633 RGKRHWHR
180 L1-180 0.618 RTKKENVK
181 L1-181 0.589 REKKYAYK
182 L1-182 0.585 KWRRELPR
183 L1-183 0.605 KSRRMWGR
184 L1-184 0.593 KCKKDNDK
185 L1-185 0.55 KDKKMPQR
186 L1-186 0.474 RHKRQQDK
187 L1-187 0.668 RLKKHCGK
188 L1-188 0.618 KARKQEVR
189 L1-189 0.616 KMRKFYSK
190 L1-190 0.644 KMRRWWLK
191 L1-191 0.649 KQKRQWAR
192 L1-192 0.581 RSRRGIGK
193 L1-193 0.588 KDKKTPCK
194 L1-194 0.636 RIRKITWR
195 L1-195 0.642 RHKRWEVR
196 L1-196 0.583 RFRRNFHK
197 L1-197 0.631 KWKRFSQR
198 L1-198 0.63 KYKKSFTK
199 L1-199 0.596 KTRKIVMK
200 L1-200 0.621 RTKKAYVK
에스펩 -2 (con) 0.303 WTWKGRKSLLR
서열번호 펩타이드 (11mer) OD Seq.
201 L2-1 0.705 EDYKYRRQNYK
202 L2-2 0.749 GIWKFRRNQCK
203 L2-3 0.796 SPVRWKRLCLR
204 L2-4 0.757 ECYRNRKAYCR
205 L2-5 0.752 TQQRLKRVMEK
206 L2-6 0.78 PELKCKRMIGR
207 L2-7 0.753 WQMKTKKEIWK
208 L2-8 0.739 FGHRGKKEWAR
209 L2-9 0.721 ATCKPKRPWYK
210 L2-10 0.803 TSQKVRKMEAK
211 L2-11 0.791 GIPKYRRGCSR
212 L2-12 0.83 AYAKARRWGQK
213 L2-13 0.855 GGLKSKRLTTR
214 L2-14 0.746 GMWKVRKTVFR
215 L2-15 0.705 HTTRGKRCDPR
216 L2-16 0.77 VDVRNKKSNNR
217 L2-17 0.72 GLNRWRRCHHK
218 L2-18 0.753 LQSRSKKYSVK
219 L2-19 0.727 GWNRAKREESK
220 L2-20 0.675 SWQKCKKAEVR
221 L2-21 0.719 MVMKWKRWNQR
222 L2-22 0.75 MMMRHKRCQYR
223 L2-23 0.832 QTYRLKKPLQK
224 L2-24 0.812 SFWRERKNGFR
225 L2-25 0.842 RLERPRRELTK
226 L2-26 0.809 APWRLKRAPQR
227 L2-27 0.747 QGEKYRRTESK
228 L2-28 0.762 CIWKSKRSPAK
229 L2-29 0.756 AILKGKRIPNK
230 L2-30 0.746 PTLKWRKPVLR
231 L2-31 0.737 NNSRSKRFMNR
232 L2-32 0.64 LYMRCKKQAPR
233 L2-33 0.619 INYRCRKWVDK
234 L2-34 0.604 VMDRDRKWWWR
235 L2-35 0.683 NFTKLRKPGPR
236 L2-36 0.76 FIPKMRKCSPR
237 L2-37 0.66 TLWKVRKAYSR
238 L2-38 0.88 ESEKIKRLSTR
239 L2-39 0.669 LMTKNRRNSFR
240 L2-40 0.685 PEVKVRRHSMR
241 L2-41 0.568 AEVKDKKAYYK
242 L2-42 0.508 YYAKSKKYMVR
243 L2-43 0.572 LMDRTRRDMYK
244 L2-44 0.579 NMGRHKRPFLK
245 L2-45 0.584 WIYRGRKDVAK
246 L2-46 0.704 CYWKAKRYPMR
247 L2-47 0.707 IEDKGRRINPR
248 L2-48 0.629 VSTKIKKEPQR
249 L2-49 0.734 YPFKAKRPAEK
250 L2-50 0.656 SADRNKRHMTR
251 L2-51 0.653 SLYRQKRHDYK
252 L2-52 0.624 LPSRPKKPVPK
253 L2-53 0.614 PAWRCKRCQPK
254 L2-54 0.609 HHWRFKREMPR
255 L2-55 0.524 PACRSKRDWQK
256 L2-56 0.713 FICKSRKFYGK
257 L2-57 0.795 LEHKERKDDFR
258 L2-58 0.701 ANPKNRKDNLR
259 L2-59 0.69 FGVKYRRVICR
260 L2-60 0.697 HADKFRRFNMR
261 L2-61 0.688 PTIRVRKSDDR
262 L2-62 0.736 NLHKPKRDLPK
263 L2-63 0.742 IDGKWRKICTR
264 L2-64 0.683 SPFRAKRQDVR
265 L2-65 0.731 PLWKTRKIEPR
266 L2-66 0.798 PNYKWRKSRRR
267 L2-67 0.696 KTGRSKRHRWR
268 L2-68 0.721 GPDKSRRNLHR
269 L2-69 0.676 WCCKTKRAVMK
270 L2-70 0.67 QLLKMRKALSR
271 L2-71 0.651 PYLRSKRFPPR
272 L2-72 0.638 APHKWRKQEQR
273 L2-73 0.662 PPFKFRKPLGR
274 L2-74 0.651 CIMRVKRMWWK
275 L2-75 0.539 YILRDKKVPLK
276 L2-76 0.725 PWVRIRKMASR
277 L2-77 0.733 VADRQKKTAPK
278 L2-78 0.718 HHNRMKKQYHR
279 L2-79 0.689 EGAKYRRDGWR
280 L2-80 0.685 FWDRVKRNPSK
281 L2-81 0.705 TMWRQRKMSCK
282 L2-82 0.693 PDTRWKRVLFK
283 L2-83 0.65 HQQKCKKTTTK
284 L2-84 0.574 PWHKGKRDFDR
285 L2-85 0.768 VFVKWRRQMMR
286 L2-86 0.701 SQWKIRKRLIR
287 L2-87 0.716 EWHKVRRVYAK
288 L2-88 0.744 NAMRTKRMSFK
289 L2-89 0.749 PPFKFRKPLGR
290 L2-90 0.765 TSVKKRKQRLR
291 L2-91 0.517 PIDKFKRGMVR
292 L2-92 0.634 FVGRWKREYAK
293 L2-93 0.635 FNPKMRKVCLR
294 L2-94 0.642 NPGKTKRWLQR
295 L2-95 0.522 IMDKRRKPGCR
296 L2-96 0.708 ISDKAKRQHFK
297 L2-97 0.531 DVNKYRKHSHK
298 L2-98 0.626 LMLRGKRLTTK
299 L2-99 0.52 CSLRARKEEWR
300 L2-100 0.551 MNYRCKRVQER
301 L2-101 0.592 NGVRERKWQSK
302 L2-102 0.608 YTSRCKKQPRK
303 L2-103 0.571 QYNKGRKIHVR
304 L2-104 0.563 PEDRQRKTWFK
305 L2-105 0.488 IEMKPRKFGVK
306 L2-106 0.926 QRWKWRKSLAR
307 L2-107 0.681 VKHKERKCQRR
308 L2-108 0.716 QQDRPKRDIPK
309 L2-109 0.596 YPTKGKRCMIR
310 L2-110 0.831 RYAKHRKRQTR
311 L2-111 0.594 GYFRPRKETCK
312 L2-112 0.646 CFFKMRRCNTK
313 L2-113 0.64 QNDKDRKLSHR
314 L2-114 0.643 QVTKSKRVAFK
315 L2-115 0.837 VRAKHRKSSLR
316 L2-116 0.699 SHSRQRKTPLR
317 L2-117 0.607 DNGKIRRCLGK
318 L2-118 0.65 FLRRLKKVHWK
319 L2-119 0.56 FCRRSKKIGRR
320 L2-120 0.607 PAARTKRMYGR
321 L2-121 0.492 HETKPKKDGLR
322 L2-122 0.558 MGDRPRKWDSR
323 L2-123 0.473 HDTKCKKMYAK
324 L2-124 0.556 NVVRGRRLECR
325 L2-125 0.481 PADKGRREVMK
326 L2-126 0.605 AMMKYKKEFPK
327 L2-127 0.569 YIIRWKRQMTR
328 L2-128 0.516 SPWRIRRQNIR
329 L2-129 0.603 TCIKYRRAHTK
330 L2-130 0.64 GYDRARKGTLR
331 L2-131 0.462 MTLKHRRVYIK
332 L2-132 0.515 LFTRIKRLVCK
333 L2-133 0.526 DFSRDRRCLSK
334 L2-134 0.44 VWNKVKRWLER
335 L2-135 0.557 FPGKNRKYCSR
336 L2-136 0.454 YTSKNKRGCPR
337 L2-137 0.452 CACKQRRATSR
338 L2-138 0.509 IMERQRKSQHR
339 L2-139 0.528 SVLRCRKCSMK
340 L2-140 0.445 YPQKLRRTALK
341 L2-141 0.462 SSHKGKRAQSK
342 L2-142 0.512 DNPRFRKTILK
343 L2-143 0.401 AIIKFRKVQWK
344 L2-144 0.521 PYTRCRKEICK
345 L2-145 0.468 MNEKPKKNDQK
346 L2-146 0.605 LIGKFKKPFYR
347 L2-147 0.641 TWCKHKKLDMK
348 L2-148 0.604 DSNKVRKCSSK
349 L2-149 0.465 LPMKQRKCEFR
350 L2-150 0.579 EDVRVKRQTCR
351 L2-151 0.749 TQCKDRRVSDR
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354 L2-154 0.736 NPFKYKKICPK
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359 L2-159 0.696 CNQKTKKIAEK
360 L2-160 0.721 ADIRMKKWYPK
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362 L2-162 0.584 NCDRTRKHWAR
363 L2-163 0.725 PHARTRKNITK
364 L2-164 0.733 VPTKMKKYETK
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366 L2-166 0.579 QQLRLRKLCGK
367 L2-167 0.584 MFMRNKKLAWR
368 L2-168 0.725 GGAKNKKVVSR
369 L2-169 0.733 HDPRHKKTPTK
370 L2-170 0.718 QVHRNKRYTDR
371 L2-171 0.689 YGTRPKKYVSK
372 L2-172 0.685 CTWRGRRPHDK
373 L2-173 0.705 SWAKARKLVHR
374 L2-174 0.693 PLFKSRRAYVR
375 L2-175 0.65 CVMRCRRSEDK
376 L2-176 0.574 WWHKHRRAQSK
377 L2-177 0.768 LNSKPRRVEFK
378 L2-178 0.718 VPYRHRRMQFK
379 L2-179 0.716 GIAKSKRNAGR
380 L2-180 0.744 DPEKWRKFYDR
381 L2-181 0.749 PGARCRKQDVK
382 L2-182 0.681 HEQRPKKGQQK
383 L2-183 0.688 TCDRARKESFR
384 L2-184 0.736 MHQRERRNFVK
385 L2-185 0.742 FITRFRKMGEK
386 L2-186 0.683 PNWKVRRFGDK
387 L2-187 0.731 TAAKWKKIIMK
388 L2-188 0.73 CLWRLRKDNGR
389 L2-189 0.696 AHIKSRKVWSR
390 L2-190 0.721 NLVKSKKVEEK
391 L2-191 0.689 PDSRLKKHEAK
392 L2-192 0.685 EHVKLKRLDFR
393 L2-193 0.705 PALRMRRWCQK
394 L2-194 0.693 HLEKHRRCEFK
395 L2-195 0.65 CQAKTRKAEDR
396 L2-196 0.574 QNMRMKRFIQR
397 L2-197 0.768 CPYRIRRGPGK
398 L2-198 0.718 DIYKGKRTLVK
399 L2-199 0.716 EICKNRKPANR
400 L2-200 0.744 QGMKLKRIWSK
에스펩 -2 (con) 0.303 WTWKGRKSLLR
서열번호 펩타이드
(14mer) 		OD Seq.
401 L3-1 0.853 ALGRTKRLHMRVHV
402 L3-2 0.841 SFYKERKCQFRSGL
403 L3-3 0.88 SGVRYRKWWIRSVV
404 L3-4 0.905 MPQKLKKLDIRNHN
405 L3-5 0.82 NEDRGKRPHIRVLG
406 L3-6 0.77 EFVKLRKARLRGPQ
407 L3-7 0.803 EGDKFRRHDIKYNF
408 L3-8 0.777 PICRWKRAPFKWYF
409 L3-9 0.725 NCNRFRRTIVRHCH
410 L3-10 0.769 AHGKDRRYVEKLEV
411 L3-11 0.8 FMQKCKKWWDRAVF
412 L3-12 0.882 DPPKKRKSLLRRVS
413 L3-13 0.862 YCTRIRREGMKGSE
414 L3-14 0.892 FPGKSKKQWHRLWP
415 L3-15 0.859 YEPRFKRPYGKWCH
416 L3-16 0.797 DYLRSRKMEERFQE
417 L3-17 0.812 VGPKFRKNHRRQNR
418 L3-18 0.806 EYQKCKKPSFRLTM
419 L3-19 0.796 YMKKKRKSLLRTSL
420 L3-20 0.755 CCFKLKKAYNKGPF
421 L3-21 0.843 NPMKLRKAETKHNV
422 L3-22 0.83 HSLKTRKSAFKSNT
423 L3-23 0.799 QYHKVRKLWFRVEP
424 L3-24 0.846 FVRKKRKSLLRDTR
425 L3-25 0.807 CFQRKRKSLLRVLR
426 L3-26 0.802 VPMKYRRCGNRQSN
427 L3-27 0.83 RARKKRKSLLRRQV
428 L3-28 0.803 PNGKVRKRIRRRYF
429 L3-29 0.789 CASKPRRTYLRAAN
430 L3-30 0.771 WAHKCKKPGQRIPP
431 L3-31 0.763 LSDKKRKSLLRYDY
432 L3-32 0.845 CATRGKKVFSKRTM
433 L3-33 0.751 LRQRSKRVLEKLRP
434 L3-34 0.74 LGWKKRKSLLRRHV
435 L3-35 0.747 LQCKYRRGSDKQPQ
436 L3-36 0.787 AFSRIKRGVLKLLS
437 L3-37 0.69 SNVKRKRGRCKPYR
438 L3-38 0.669 TVVKSRKCSVRYNW
439 L3-39 0.654 DDVKQRKKHPRVQT
440 L3-40 0.733 ASPKGRRPTFRPQH
441 L3-41 0.81 GWLKAKRFPSRPPT
442 L3-42 0.71 ETNRTRKQCYKTTF
443 L3-43 0.93 FTHKNRRDSLRVWM
444 L3-44 0.719 PPFRLRKPLWRPQR
445 L3-45 0.735 PGNRMKKYQNRVHG
446 L3-46 0.618 SAHKKRKQTLRCSE
447 L3-47 0.558 LYEKYKKHNNREDD
448 L3-48 0.622 PHCRQKKFWIRCGT
449 L3-49 0.629 VAFKTRRRVQRQSG
450 L3-50 0.634 VFDKFRKTENRGVI
451 L3-51 0.754 NHHKTKRCSVRFNI
452 L3-52 0.757 GTFKWRKSGARQYL
453 L3-53 0.679 HCLRTKKLINKICS
454 L3-54 0.784 FFLRCRRLLGKVQV
455 L3-55 0.706 HFPRARRFEHRCML
456 L3-56 0.703 QISKLKRPSYRGDD
457 L3-57 0.674 EEIKQKKLHLRVWF
458 L3-58 0.664 SLPKWRKGGDRVFT
459 L3-59 0.659 HVYKNRRVWGKGWP
460 L3-60 0.574 EDLRCKKLELRSVI
461 L3-61 0.768 THDKCKKHNDKQAH
462 L3-62 0.766 YPERPRKLQDKSYS
463 L3-63 0.794 CPWRNRKAMIKGII
464 L3-64 0.799 HEIKQKKYFHRGHD
465 L3-65 0.731 CLEKLRKAVHRQRR
466 L3-66 0.738 YISKSKKTAGRWFW
467 L3-67 0.786 VTWKFRKAEKRWGY
468 L3-68 0.792 YSSKSRKLSPRTPR
469 L3-69 0.733 CVNRVKKSDSKGTW
470 L3-70 0.781 DHERERRLWSRFPF
471 L3-71 0.78 PLIKVKRGVGKLWN
472 L3-72 0.746 TGCRCKRSMYKNLH
473 L3-73 0.771 WTCRMRKYQLRTSE
474 L3-74 0.726 IAIRPRKMTLKIHP
475 L3-75 0.72 QIPKQKKQEQRAIS
476 L3-76 0.701 QMGKFKKISLKNTF
477 L3-77 0.688 VLIKQRKWQDRSCS
478 L3-78 0.712 FITKSRRQQFRNQG
479 L3-79 0.701 QQFKYRRECVKYGS
480 L3-80 0.589 MEGREKKSYNKGEN
481 L3-81 0.775 PTWRHRRYCAKDIG
482 L3-82 0.783 HMCRSKRVAWKNLI
483 L3-83 0.768 SYLKCKRSDYKEVP
484 L3-84 0.739 HTFKLRKLCQKLFE
485 L3-85 0.735 QLVKLRKLARRVSY
486 L3-86 0.755 SEVRPKKDHSRLFI
487 L3-87 0.743 FLEKCRKFIIRVST
488 L3-88 0.7 PETRHRKMFIRDFW
489 L3-89 0.624 EWCKNKRWHSREYP
490 L3-90 0.818 LWNRYKKLLMRIFW
491 L3-91 0.749 CWCRQRKCFHKPWI
492 L3-92 0.657 NLERTKKHGLKGYM
493 L3-93 0.7 EGGRIKRPNYRGDG
494 L3-94 0.61 PVLKLRKGRVRAQP
495 L3-95 0.657 SISRLRKAHQKFIP
496 L3-96 0.567 EWHKHRREMVRWGP
497 L3-97 0.684 WSAKGRRMGCKSTM
498 L3-98 0.685 PNGKVRKRIRRRYF
499 L3-99 0.692 PCWKFRRAQMKWGI
500 L3-100 0.572 LEERPKKHCAKNHC
501 L3-101 0.758 QPWRQKKFWCRCWG
502 L3-102 0.581 IMVKIRRCPARPLC
503 L3-103 0.676 NDWKLRKDFWRNHF
504 L3-104 0.57 ASVRDRKMGYKSDG
505 L3-105 0.601 YYEKIRRGEIKIAE
506 L3-106 0.642 DLVRKRKTMLRQLV
507 L3-107 0.658 DLSKVRRGHGKNDI
508 L3-108 0.621 ESYRLRRGTDKEQW
509 L3-109 0.613 YITKFRKFLMKDQF
510 L3-110 0.538 AWAKYKKVQPKHHT
511 L3-111 0.976 TWLRGRRWPDKQPQ
512 L3-112 0.731 ALPRVRKDSHREEI
513 L3-113 0.766 CLFKYRKSCVRLCG
514 L3-114 0.646 LQNRMRKIYWKTFD
515 L3-115 0.685 NDPRLRKHNHRCCT
516 L3-116 0.644 YGSKQRRFEEKICG
517 L3-117 0.696 CGHKNKKWHNRMDP
518 L3-118 0.69 YGIRDRRPMTKHTQ
519 L3-119 0.693 TPLKSRKYWNKHAY
520 L3-120 0.887 FLYKAKKALMRDSL
521 L3-121 0.655 CDDKPKKTVVKLTW
522 L3-122 0.691 MHPRPRKMSHKMSC
523 L3-123 0.654 PGERLKKEDHRASG
524 L3-124 0.515 GAQRARKPVLRAVG
525 L3-125 0.629 MQEKCRRCVFKGNI
526 L3-126 0.542 YVDRWRRMQYKLSI
527 L3-127 0.608 WVDRSRKFEDRNCL
528 L3-128 0.523 IVNRAKRSQIRFDV
529 L3-129 0.606 IHPRYKRHQARSCC
530 L3-130 0.531 EHSKHRKDLFRMVG
531 L3-131 0.655 YTPKFRRIFWRIID
532 L3-132 0.619 TITRVKRASHKTPS
533 L3-133 0.566 VDSREKKWRQKCQC
534 L3-134 0.653 YWFRIKRAHAKGCP
535 L3-135 0.69 NDHRMRRSVDRGET
536 L3-136 0.512 PFDRARRDLHRIMM
537 L3-137 0.565 QVVRLRRGKNRGTV
538 L3-138 0.576 TNQRPRRETAKTIE
539 L3-139 0.49 FHHRHKRIATKHPA
540 L3-140 0.607 EHCKWKKMFDKEGE
541 L3-141 0.504 FFYRLRRCLTRWWV
542 L3-142 0.502 LQCKYRRGSDKTVV
543 L3-143 0.559 QTMKFKRCCNKEMV
544 L3-144 0.578 CSYKLRRCDMRLWG
545 L3-145 0.495 MHIKMKREQVKDEE
546 L3-146 0.512 AVWRNRKDNVKASE
547 L3-147 0.562 ADHRAKKTLSKFWT
548 L3-148 0.451 MMARCRRIMCRSFN
549 L3-149 0.571 PFGKFKRLENKDEC
550 L3-150 0.518 YLSRTKRWLARYVE
551 L3-151 0.624 HTLKPKRLYPRPSE
552 L3-152 0.818 VVIKCRKWTHKMDH
553 L3-153 0.768 FHTKLRKPIPKIDM
554 L3-154 0.766 ENIKSRKYFVKLTW
555 L3-155 0.794 AWTRFRRFQCKGMS
556 L3-156 0.799 IVPRDRKQALRWTN
557 L3-157 0.731 CMLRWKRWHMRFNP
558 L3-158 0.738 FDMRDRRPNARVMP
559 L3-159 0.786 QIAKLKRDQMKEAW
560 L3-160 0.792 LTSRCKKTFQKNSE
561 L3-161 0.733 MAAKWKKDGMKSHY
562 L3-162 0.781 ANWRTRRDLAKEHV
563 L3-163 0.78 PFTKMRKQFQRMSA
564 L3-164 0.746 QINRVKKSDAKFCT
565 L3-165 0.771 YLVKLRRFWAKIDM
566 L3-166 0.629 EYVKAKRTPWKYVV
567 L3-167 0.634 AMCREKRFPYRAIY
568 L3-168 0.775 MGLRARKYEDKTLH
569 L3-169 0.783 FHMKSKKDGDKFVM
570 L3-170 0.768 CIFKFKKNMFKGYS
571 L3-171 0.629 LDTKNRRGASKWDY
572 L3-172 0.634 VTGKGRRVTFRCMN
573 L3-173 0.775 QLGKQKREATREYV
574 L3-174 0.783 SSGKWKRPHAKYIV
575 L3-175 0.768 TCHKTKRSIMRATS
576 L3-176 0.739 MIGKCRKCGTKCYA
577 L3-177 0.735 FQPKSRRAETKHSY
578 L3-178 0.755 PDLKFRKHQDRTAI
579 L3-179 0.743 YNARVKREGIKNIT
580 L3-180 0.7 QGIRPRKHLQRMPN
581 L3-181 0.624 GPCRPRRHSIRLLW
582 L3-182 0.818 FYLRERRHQLKTEF
583 L3-183 0.768 NMARSRKNECKYIA
584 L3-184 0.766 DMDKVKKWVWRSFP
585 L3-185 0.794 VLPKERRWLTRFLI
586 L3-186 0.799 YEHRHKRFFHKDMP
587 L3-187 0.731 HGHKPRRWIYRMPM
588 L3-188 0.738 DGIRDKKCCWRDLI
589 L3-189 0.786 ELVKHRRLDFRDPM
590 L3-190 0.792 VHHKLRRVHLRLDV
591 L3-191 0.739 GINRGRKVSPKDEQ
592 L3-192 0.735 NGYRARKENLKFPE
593 L3-193 0.755 AAYRARKIVEKSGW
594 L3-194 0.743 WAPRDRRNMGRDPA
595 L3-195 0.7 IEDKSKRFNCKECG
596 L3-196 0.746 IEMRYRRDCSRFVN
597 L3-197 0.771 QQIKYKRPTYRMVC
598 L3-198 0.78 LPWRERRNGGRSSE
599 L3-199 0.781 PQTRYRKYFYRPQM
600 L3-200 0.733 HMCRWRRQINKGVS
에스펩 -2 (con) 0.303 WTWKGRKSLLR
서열번호 펩타이드 O.D Seq.
601 L2-201 0.307 RRRRRRRRRRR
602 L2-202 0.314 GGGRKKRRQRR
603 L2-203 0.302 GGRKKRRQRRR
604 L3-201 0.315 GGGRKKRRQRRRGG
605 L3-202 0.301 GGRKKRRQRRRGGG
605 L2-204 0.311 GGGRRRRRRRR
에스펩-2 (con) 0.303 WTWKGRKSLLR
<실시예 14. 최적화 펩타이드의 아세틸콜린 수용체와의 결합력 확인>
상기 실시예 13-3에서 AchR과의 결합 특이성이 우수한 최적화 펩타이드를 라이브러리별 40개 펩타이드를 선별하여 합성하였고, 실시예 2의 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석 방법을 이용하여 AchR과의 결합력(Ru; Resonance Units)을 비교하였다. 이때, 최적화 펩타이드는 3μM, 10μM의 농도 조건으로 수행하였고, 그 결과를 도 17~19에 나타내었다. 이때, 에스펩-2를 양성대조군으로 이용하였다. 8mer (L1), 11mer (L2), 14mer (L3) 최적화 펩타이드 40개 모두 양성대조군인 에스펩-2보다 AchR과 결합력이 높게 나왔으며, 여기에서 각 라이브러리 마다 AchR과의 결합력이 높은 펩타이드 20개를 도출하였다.
<실시예 15. 각 최적화 펩타이드(L1, L2, L3)의 아세틸콜린 수용체 작용 억제 확인>
상기 실시예 14에서 확인된 AchR에 대한 결합력이 우수한 8mer, 11mer 및 14mer 펩타이드의 AchR 작용 억제 효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 3와 동일한 방법으로 AchR 작용 억제 효과를 확인하였다. 이때, 각 펩타이드는 20μM이 되도록 처리하였고, 대조군으로 에스펩-2을 함께 처리하였다. 또한, 최적화 펩타이드의 AchR의 저해능 우수성을 확인하기 위하여 고농도 니코닌을 400μM 또는 600μM을 첨가하였고, 그 결과를 도 20~22에 나타내었다.
도 20~22에서 보듯이, 400μM의 고농도의 니코틴을 첨가하고, 각 펩타이드를 20μM이 되도록 처리한 경우, 대조군인 에스펩-2의 AchR 작용 억제율이 약 10%로 효과가 거의 없는 반면에, 8mer, 11mer, 14mer 펩타이드의 AchR에 대한 작용 억제율은 모두 50% 이상으로 에스펩-2에 비해 억제 효과가 우수함을 확인하였다. 이중 8mer의 L1-13, 11mer의 L2-110, 14mer의 L3-27, 28, 37 펩타이드는 100%에 가까운 억제 효과를 보였다. 나아가, 펩타이드의 세포에서의 AchR의 작용 억제율은 상기 실시예 14의 각 펩타이드의 AchR과의 결합력과 거의 일치한다는 것을 확인하였다.
<실시예 16. 대표 펩타이드의 아세틸콜린 수용체 결합력 확인>
상기 실시예 15에서 확인한 대표 펩타이드 L1-13, L2-110, L3-27, L3-28, L3-37 를, 실시예 2의 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석 방법을 이용하여 AchR과의 결합력(Ru; Resonance Units)을 비교하였다. 이때, 펩타이드는 3μM의 동일한 농도 조건으로 수행하였다. 그 결과를 도 23에 나타내었다.
도 23에서 보듯이 11mer의 L2-110과 14mer의 L3-27, 28, 37이 8mer의 L1-13 보다 AchR에 대한 결합력이 더욱 높았으며, 14mer인 L3-27, 28, 37 펩타이드가 가장 높은 결합력을 보였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 화학식에 의한 펩타이드가 8mer, 11mer로 형성될 때에도 AchR과 높은 결합을 나타내며, 14mer일 때 최적의 결합력을 갖는 것을 확인하였다.
<실시예 17. 대표 펩타이드 L2-110, L3-27,28,37 아세틸콜린 수용체 작용 억제 확인>
상기 실시예 16에서 확인된 AchR에 대한 결합력이 우수한 L2-110, L3-27, L3-28, L3-37 펩타이드의 AchR 작용 억제효과를 확인하기 위해 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 AchR 작용 억제 효과를 확인하였다. 이때 각 펩타이드는 농도별로 처리하였고 대조군으로 에스펩-2를 함께 처리하였다. 그 결과를 도 24에 나타내었다.
도 24를 보듯이 400 μM 고농도 니코틴에서 에스펩-2는 80μM에서 AchR의 작용을 100% 억제하였으나 70μM의 농도에서는 억제하지 못했다. 11mer인 L2-110과 14mer인 L3-27은 10μM에서 AchR의 작용을 100% 억제하였으며, 5μM은 억제하지 못하였다. 14mer인 L3-28은 5μM에서 AchR의 작용을 100% 억제하였으며, 2.5μM에서는 억제하지 못하였다. 그리고 역시 14mer인 L3-37은 2.5μM에서 100% 억제하였고 1μM에서도 50% 까지 억제하였다.
이 결과를 토대로 도 25에 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 저해능을 배수로 나타내었다. 에스펩-2 보다 L2-110과 L3-27이 8배, L3-28이 16배, L3-37이 32배 더 저해효과가 좋았다. 최종적으로 실시예 15의 아세틸콜린 수용체 결합력과 비례하여 억제 효과도 좋게 나온 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 18. 대표 펩타이드의 각 말단의 다양한 변형에 따른 아세틸콜린 수용체와의 결합력 확인>
상기 실시예 17에서 확인된 L2-110, L3-27, L3-28, L3-37 펩타이드의 각 말단을 다양하게 변형하여 AchR과의 결합력 변화를 확인하고자 하였다. 구체적으로 상기 실시예 8과 같은 방법으로 지방산 유도체인 팔미토일을 포함하여 myristic acid, stearic acid을 붙이거나 아세틸화 (Acetylation)를 시키거나, 페길화 (PEGylation)시켜서 변형하지 않은 기본 펩타이드와 비교하였다. 그 결과를 도 26~29에 나타내었다.
도 26~29를 보듯이, 본 발명에 따른 펩타이드의 말단에 지방산 유도체를 결합시켰을 때는 모든 펩타이드가 결합력이 약 10배 가까이 증가 하였다(팔미토일-, 미리스틸-, 스테아릭-). 이때 팔미토일을 붙여 변형한 펩타이드가 다른 지방산 유도체를 붙인 것보다 높은 결합력을 보여주는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 펩타이드의 말단을 아세틸화(acetylation)한 경우, AchR과의 결합력은 각 펩타이드의 말단을 변형하지 않았을 때의 AchR과의 결합력과 비슷하였다. 그리고 각 펩타이드의 말단을 페길화(PEGylation)한 경우, 각 펩타이드의 말단을 변형하지 않았을 때에 비해 AchR과의 결합력은 약 50% 감소하였다.
또한 도 30을 보듯이, 본 발명에 따른 펩타이드의 말단에 지방산 유도체인 myristic acid, stearic acid을 붙였을 때 상기 실시예 8과 마찬가지로 팔미토일을 결합한 것처럼 마이셀 구조를 형성함을 확인하였다.
<실시예 19. Palitoyl-L2-110, Palmitoyl-L3-27, Palmitoyl-L3-28, Palmitoyl-L3-37의 아세틸콜린 수용체 작용 억제 확인>
상기 실시예 18에서 AchR에 대한 결합력이 우수한 Palmitoyl-L2-110, Palmitoyl-L3-27, Palmitoyl-L3-28, Palmitoyl-L3-37 펩타이드에 대해 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 AchR 작용 억제 효과를 확인하였다. 이때 대조군으로 분가로톡신을 함께 처리하다. 그 결과를 도 31에 나타내었다.
도 31을 보듯이, AchR과의 결합력은 palmitoyl-L3-37이 가장 높았으며, 다음으로 palmitoyl-L3-28이 좋았고, palmitoyl-L3-27과 palmitoyl-L2-110은 비슷한 수준을 나타내었다.
<실시예 20. Palitoyl-L2-110, Palmitoyl-L3-27, Palmitoyl-L3-28, Palmitoyl-L3-37 펩타이드의 세포 독성 확인>
Palitoyl-L2-110, Palmitoyl-L3-27, Palmitoyl-L3-28, Palmitoyl-L3-37 펩타이드의 독성을 평가하기 위해서 TE671 세포에서 WST assay를 실시하였고, 그 결과를 도 32~35에 나타내었다.
도 32~35에서 보듯이, 펩타이드 모두 10ㅅM로 처리하더라도 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
<실시예 21. Palmitoyl-L3-37의 in vivo 효능 분석>
상시 실시예 18에서 아세틸콜린 수용체에 대한 결합력이 가장 좋았던 Palmitoyl-L3-37를 이용하여 동물 효능 평가를 하였다. 6주령 암컷 BALB/c 마우스의 오른쪽 뒷다리 허벅지 근육에(IM) Palmitoyl-L3-37를 10mg/kg 농도로 주사하였다. 그리고 주사하기 전 마우스의 CatWalk 데이터와 주사 후 30분 경과시의 마우스의 CatWalk 데이터를 비교 분석하였고, 그 결과를 도 36에 나타내었다.
도 36에서 보듯이, Palmitoyl-L3-37의 주사 전에 비해 주사 후의 마우스 오른쪽 뒷다리의 발바닥이 바닥에 닿는 면적이 감소한 것을 확인하였고(A), 마우스의 발바닥이 바닥에 닿는 면적(B)과 면적의 최대 값의 평균 값(C)도 Palmitoyl-L3-37 주사 후에 감소하는 것을 확인하였다.
이를 통해, Palmitoyl-L3-37가 아세틸콜린수용체에 결합하여 아세틸콜린의 저해를 통해 동물의 근육 이완에 영향을 준다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 22. Palmitoyl-L3-37의 동물 효능(ED50) 및 동물 독성(LD50) 평가>
동물 효능(ED50) 평가는 DAS(Digit Abduction Score) 분석법으로 하였다. DAS 분석법은 마우스 뒷다리 골격근 근육 내(IM) 주사 된 약물의 국소 근육 약화 효능을 측정하기 위해 개발된 방법으로 보톡스도 같은 방법으로 평가한다(Aoki, 1999).
구체적으로, 상기 실시예 18의 Palmitoyl-L3-37에 대한 DAS 값을 평가 하였다. 6주령 암컷 BALB/c 마우스 45마리를 5마리씩 무작위적으로 나누어Palmitoyl-L3-37를 0.1mg/kg, 1mg/kg, 3mg/kg, 10mg/kg, 25mg/kg과 비교군으로 염류 용액(saline)(멸균된 0.9% NaCl) 또는 분가로톡신 70μg/kg을 처리할 그룹으로 구분하였다. 그 다음 Palmitoyl-L3-37와 염류용액, 분가로톡신을 상기와 같은 농도로 마우스의 뒷다리 허벅지 근육에 50μl씩 주사하였다. 이후, 1일 마다 마우스 무게 및 주사한 부분의 발바닥을 관찰하여 기록하였고, 그 결과를 도 37~39에 나타내었다.
도 37의 주사 후 7일간 관찰한 결과, 각 시료 투여 후 10분(0일차)만에 Palmitoyl-L3-37 1mg/kg 투여 그룹은 DAS 2, Palmitoyl-L3-37 3mg/kg, 10mg/kg 및 25mg/kg 투여 그룹은 효능이 DAS 4로 평가되었으며, Palmitoyl-L3-37 1mg/kg 투여 그룹과 비교군인 염류용액 또는 분가로톡신 투여 그룹은 효능이 DAS 0으로 평가되었다. 이를 통해 Palmitoyl-L3-37의 이를 통해 동물실험에서 Palmitoyl-L3-37의 효능(ED50)은 1mg/kg인 것을 알 수 있었다. 또한, 7일 간 관찰하는 동안 Palmitoyl-L3-37 25mg/kg 투여 그룹을 제외한 나머지 그룹은 DAS 값이 내려가면서 회복이 되는 것을 확인하였으나, Palmitoyl-L3-37 25mg/kg투여 그룹은 DAS 4를 유지하는 것으로 나타났다.
도 38의 Palmitoyl-L3-37 25mg/kg 투여 그룹을 투여 후 21일까지 일주일 간격으로 관찰한 결과, Palmitoyl-L3-37 25mg/kg 투여 그룹도 7일 이후에는 DAS값이 점차 감소하여 Palmitoyl-L3-37 투여 19일 이후 DAS값이 1 이하로 내려가면서 회복되는 것을 확인하였다. 이를 통해 Palmitoyl-L3-37의 효능이 가역적이라는 것을 알 수 있었다.
마지막으로 투여 후 7일 동안 1일 마다 무게를 측정하여 Palmitoyl-L3-37의 급성 독성 평가한 결과(도 39 참조), 모든 그룹에서 7일 동안 점차적으로 마우스의 무게가 증가하였고, Palmitoyl-L3-37를 처리한 그룹에서 처리 농도가 가장 높은 25mg/kg을 처리한 그룹에서도 독성이 없다는 것을 확인하였다.
<110> amicogen <120> Peptide for inhibition of acetylcholine receptor and use thereof <130> DPC-19-0077 <150> KR 10-2018-0169425 <151> 2018-12-26 <160> 606 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 1 Lys Ala Lys Lys Ile Arg Gln Arg 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 2 Lys Lys Arg Lys Gly Ser Ala Lys 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 3 Arg Gly Lys Arg Gln Leu Gly Arg 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 4 Lys Leu Lys Lys Phe Pro Val Arg 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 5 Arg His Lys Lys Ser Pro Trp Lys 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 6 Arg Pro Arg Arg Thr His Ile Lys 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial 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Glu Met Arg Tyr Arg Arg Asp Cys Ser Arg Phe Val Asn 1 5 10 <210> 597 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 597 Gln Gln Ile Lys Tyr Lys Arg Pro Thr Tyr Arg Met Val Cys 1 5 10 <210> 598 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 598 Leu Pro Trp Arg Glu Arg Arg Asn Gly Gly Arg Ser Ser Glu 1 5 10 <210> 599 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 599 Pro Gln Thr Arg Tyr Arg Lys Tyr Phe Tyr Arg Pro Gln Met 1 5 10 <210> 600 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 600 His Met Cys Arg Trp Arg Arg Gln Ile Asn Lys Gly Val Ser 1 5 10 <210> 601 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 601 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 602 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 602 Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 10 <210> 603 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 603 Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 604 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 604 Gly Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly 1 5 10 <210> 605 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 605 Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 606 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AchR binding peptide <400> 606 Gly Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10

Claims (6)

  1. 하기 화학식 3으로 표현되는 아미노산 서열로 이루어지며, 하기 XL, XM -1은 각각 3개, X는 1개의 임의의 아미노산으로 이루어진 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드를 포함하는 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서,
    상기 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환은 경부근긴장이상증(cervical dystonia), 사지 긴장 이상증(limb dystonia), 체부 근육긴장이상증(truncal dystonia), 안검경련(blepharospasm, 얼굴떨림), 경직(spasticity), 반측안면경련(hemifacial spasm), 사시(strabismus), 안구떨림(nystagmus), 틱(tics), 만성 통증(chronic pain), 만성 편두통(chronic migraine), 신경병성 통증, 피부 주름, 사각턱, 신경인성 방광(neurogenic bladder), 배뇨근-괄약근 협동장애(detrusorsphincter dyssynergia), 식도이완 불능증(achalasia cardia), 다한증(hyperhidrosis) 및 타액 분비 과다(sialorrhea)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이며,
    상기 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드는 서열번호 201 내지 400 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열의 펩타이드인 것을 특징으로 하는 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 3]
    XL-(K 또는 R)-X-(K 또는 R)-(K 또는 R)-XM -1-(K 또는 R)
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 N-말단 또는 C-말단이 변형(modification)된 것을 특징으로 하는 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 N-말단 또는 C-말단이 변형(modification)된 것은 팔미토일화(palmitoylation), 아세틸화(acetylation), 아미드화(amidation), 포르밀화(formylation) 또는 페길화(PEGylation)되거나, 또는 2-메르캅토아세트산(2-mercaptoacetic acid), 3-메르캅토프로피오닉산(3-mercaptopropionic acid), 6-메르캅토헥사노익산(6-mercaptohexanoic acid), 피로글루탐산(pyroglutamic acid), 숙신이미드산(succinimide acid), 시스트라민(cystramine), 시스테아민(cysteamine), 메틸에스테르(methyl ester), 에틸에스테르(ethyl ester), 벤질에스테르(benzyl ester), 미리스트산(myristic acid), 스테아르산(stearic acid), 팔미트산(palmitic acid), 콜레스테롤(cholesterol), 6-아미노 헥사노익산(6-aminohexanoic acid) 및 8-아미노 옥타노익산(8-amino octanoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 결합에 의한 것을 특징으로 하는 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항의 조성물에 포함된 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.
  5. 제1항의 조성물에 포함된 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환 개선용 건강기능식품 조성물에 있어서,
    상기 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환은 경부근긴장이상증(cervical dystonia), 사지 긴장 이상증(limb dystonia), 체부 근육긴장이상증(truncaldystonia), 안검경련(blepharospasm, 얼굴떨림), 경직(spasticity), 반측안면경련(hemifacialspasm), 사시(strabismus), 안구떨림(nystagmus), 틱(tics), 만성 통증(chronic pain), 만성 편두통(chronic migraine), 신경병성 통증, 피부주름, 사각턱, 신경인성 방광(neurogenicbladder), 배뇨근-괄약근협동장애(detrusor-sphincter dyssynergia), 식도이완 불능증(achalasiacardia), 다한증(hyperhidrosis) 및 타액 분비 과다(sialorrhea)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 아세틸콜린 수용체 과잉활성 관련 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 제1항의 조성물에 포함된 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 아세틸콜린 수용체 결합 펩타이드를 포함하는 필러.
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004057329A1 (en) * 2002-12-23 2004-07-08 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with muscarinic acetylcholine receptor m1 (acm1)
KR20110117038A (ko) * 2008-10-20 2011-10-26 광주과학기술원 바이포달 펩타이드 바인더
KR20130018965A (ko) * 2008-05-23 2013-02-25 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 목적 펩타이드의 혈장내 반감기 연장 작용을 가진 펩타이드
KR20140139010A (ko) 2012-03-22 2014-12-04 레반스 테라퓨틱스, 아이엔씨. 국소 화학탈신경제를 이용한 주름 치료 방법
WO2015134920A1 (en) * 2014-03-07 2015-09-11 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Non-narcotic crmp2 peptides targeting sodium channels for chronic pain
WO2016040517A1 (en) * 2014-09-09 2016-03-17 Merial Inc. Mammalian cell lines expressing functional nematode acetylcholine receptors and use thereof for high-throughput screening assays
KR20170086421A (ko) * 2016-01-18 2017-07-26 주식회사 엘지생활건강 신경세포 투과 촉진 활성의 펩타이드
KR20180028748A (ko) 2016-09-09 2018-03-19 주식회사 엘지생활건강 신경세포 투과성이 향상된 신경전달물질 조절 펩타이드
KR20190001859A (ko) * 2017-06-28 2019-01-07 한국세라믹기술원 아세틸콜린수용체 결합 펩타이드

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001255524A1 (en) * 2000-04-21 2001-11-07 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of acne vulgaris
CA2657532C (en) * 2006-07-18 2019-06-18 University Of Utah Research Foundation Methods for treating pain and screening analgesic compounds
US8946166B2 (en) * 2009-07-24 2015-02-03 Lipotec, S.A. Peptide-based compounds and compositions which inhibit muscle contraction
US20110305735A1 (en) * 2010-06-09 2011-12-15 Lipotec, S.A. Skin antiaging treatment

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004057329A1 (en) * 2002-12-23 2004-07-08 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with muscarinic acetylcholine receptor m1 (acm1)
KR20130018965A (ko) * 2008-05-23 2013-02-25 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 목적 펩타이드의 혈장내 반감기 연장 작용을 가진 펩타이드
KR20110117038A (ko) * 2008-10-20 2011-10-26 광주과학기술원 바이포달 펩타이드 바인더
KR101216008B1 (ko) 2008-10-20 2012-12-28 광주과학기술원 바이포달 펩타이드 바인더
KR20140139010A (ko) 2012-03-22 2014-12-04 레반스 테라퓨틱스, 아이엔씨. 국소 화학탈신경제를 이용한 주름 치료 방법
WO2015134920A1 (en) * 2014-03-07 2015-09-11 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Non-narcotic crmp2 peptides targeting sodium channels for chronic pain
WO2016040517A1 (en) * 2014-09-09 2016-03-17 Merial Inc. Mammalian cell lines expressing functional nematode acetylcholine receptors and use thereof for high-throughput screening assays
KR20170086421A (ko) * 2016-01-18 2017-07-26 주식회사 엘지생활건강 신경세포 투과 촉진 활성의 펩타이드
KR20180028748A (ko) 2016-09-09 2018-03-19 주식회사 엘지생활건강 신경세포 투과성이 향상된 신경전달물질 조절 펩타이드
KR20190001859A (ko) * 2017-06-28 2019-01-07 한국세라믹기술원 아세틸콜린수용체 결합 펩타이드

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lindstrom, J.M., et al., Antibody to acetylcholine receptor in myasthenia gravis: Prevalence, chlincal correlates, and diagnostic value, Neurology, 26, 1054-1059, 1976.
Vincent, A., et al., Acetylcholine receptor antibody as a diagnosis test for myasthenia gravis: results in 153 validated cases and 2967 diagnostic assays, J. Neurol. Neurolsurg. Psychiatry, 48, 1246-1252, 1985.

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